JP2004196824A - エリスロポエチン溶液製剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 尿素を含まず、安定化剤として、ロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸及びアルギニンならびにその塩から選択される1または2以上のアミノ酸を含む、エリスロポエチン溶液製剤。
【選択図】 なし
Description
(1)尿素を含まず、安定化剤として、ロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸及びアルギニンならびにその塩から選択される1または2以上のアミノ酸を含む、エリスロポエチン溶液製剤。
(2)安定化剤が、L−ロイシン、L−トリプトファン、L−セリン、L−グルタミン酸及びL−アルギニンならびにその塩から選択される1または2以上のアミノ酸である、前記(1)に記載の溶液製剤。
(3)安定化剤が、トリプトファン及び/又はその塩である、前記(1)に記載の溶液製剤。
(4)安定化剤が、アルギニン及び/又はその塩である、前記(1)に記載の溶液製剤。
(5)安定化剤として、さらにヒスチジンを含む、前記(1)〜(4)のいずれかに記載の溶液製剤。
(6)安定化剤として、さらにL−ヒスチジンを含む、前記(1)〜(4)のいずれかに記載の溶液製剤。
(7)アミノ酸の濃度が0.1〜40mg/mlである、前記(1)〜(6)のいずれかに記載の溶液製剤。
(8)アルギニンの濃度が1〜5mg/mlである、前記(1)、(2)及び(4)〜(7)のいずれかに記載の溶液製剤。
(9)安定化剤として、実質的にタンパク質を含まない、前記(1)〜(8)のいずれかに記載の溶液製剤。
(10)界面活性剤をさらに含む、前記(1)〜(9)のいずれかに記載の溶液製剤。
(11)界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルである、前記(10)に記載の溶液製剤。
(12)界面活性剤がポリソルベート20及び/又は80である、前記(11)に記載の溶液製剤。
(13)塩をさらに含む、前記(1)〜(12)のいずれかに記載の溶液製剤。
(14)塩が塩化ナトリウムである、前記(13)に記載の溶液製剤。
(15)緩衝液に溶解されている、前記(1)〜(14)のいずれかに記載の溶液製剤。
(16)緩衝液がリン酸及び/又はクエン酸である、前記(15)に記載の溶液製剤。
(17)尿素を含まず、ロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸及びアルギニンならびにその塩から選択される1または2以上のアミノ酸を含む、安定化剤をエリスロポエチン溶液製剤に添加することを含む、エリスロポエチン溶液製剤の安定化方法。
本発明の溶液製剤に添加するアミノ酸の添加量は使用するアミノ酸の種類により、後述する試験方法を用いて好ましい範囲を定めることができる。一般には0.001〜50mg/ml、アルギニンでは好ましくは0.1〜40mg/ml、さらに好ましくは1〜10mg/mlであり、リジンでは好ましくは0.5〜10mg/ml、さらに好ましくは1〜10mg/mlであり、ヒスチジンでは好ましくは0.5〜10mg/ml、さらに好ましくは1.0〜4.0mg/ml、最も好ましくは1.0〜2.0mg/mlである。後述するように、L−アルギニン塩酸塩の場合ならびにL−リジン塩酸塩の場合には、遊離のアミノ酸に換算して約1〜5mg/ml、L−ヒスチジン塩酸塩の場合には、40℃−2週間加速試験では遊離のアミノ酸に換算して1〜10mg/mlで、また25℃−6ヶ月加速試験では0.5〜5mg/mlの範囲で最も高いEPO残存率を示した。
調剤溶液1ml中に以下の成分:
EPO 1500国際単位
非イオン性界面活性剤 0.05mg
(ポリソルベート80:日光ケミカル社製)
塩化ナトリウム 8.5mg
アミノ酸(Sigma社製) 0〜40mg
を含み、10mMリン酸緩衝溶液(和光純薬社製)にてpH6.0に調整した溶液を、5mlのガラスバイアルに1ml充填し、打栓、密封し、溶液製剤に供した。加速試験は同製剤を40℃の恒温槽内に2週間放置した。製剤の評価は、RP−HPLC分析法(WATERS社製)およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析法により行った。
実施例1:各種アミノ酸添加のEPO残存率に及ぼす効果
以下に記載の各種アミノ酸を添加した溶液製剤を上述の試験方法により調製し、40℃−2週間加速試験を行った後のEPO残存率をRP−HPLC法により算出した。得られた結果を表1に示す。
実施例2:アミノ酸添加濃度のEPO残存率に及ぼす効果
以下に示す各種濃度でL−アルギニン塩酸塩を添加した溶液製剤を上述の試験方法により調製し、40℃−2週間加速試験を行った後のEPO残存率をRP−HPLC法により算出した。得られた結果を表2に示す。
この結果から、L−アルギニン塩酸塩は約1〜5mg/mlの範囲で、極大のEPO残存率を示した。
この結果から、L−リジン塩酸塩の場合も約1〜5mg/mlの範囲で、極大のEPO残存率を示した。
さらに、以下に示す各種濃度でL−ヒスチジン塩酸塩を添加した溶液製剤を上述の試験方法により調製し、25℃−6ヶ月加速試験を行った後のEPO残存率をRP−HPLC法により算出した。得られた結果を表5に示す。
実施例3:各種アミノ酸添加のEPO分解物に及ぼす効果
各種アミノ酸を添加した溶液製剤を上述の試験方法により調製し、40℃−2週間加速試験を行った後のEPO分解物の生成をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析法により検討した。
1)試料の調製
EPO溶液製剤(実施例1の表1で記載した濃度の各アミノ酸を含む)に上記加速試験後、SDS、グリセリンおよびブロムフェノールブルーを含む1Mトリス−塩酸緩衝液(pH6.8)を加え、60℃で15分加熱し、試料溶液とする。
2)泳動法
試料溶液10μlについて以下の操作条件で泳動を行う。
b)泳動ゲル:SDS−PAGEmini8−16(ポリアクリルアミド濃度8−16%の濃度勾配ゲル)(テフコ製)
c)泳動温度:25℃
d)泳動条件:25mA定電流(/ゲル)
3)染色法(ウェスタンブロット法)
泳動したゲルをポリビニリデンジフルオリド膜へ転写後、抗EPOウサギ抗血清、ビオチン標識抗ウサギIgGヤギ抗体およびビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼを用い、3,3’−ジアミノビンジジン−過酸化水素を基質として発色させる。
4)結果
得られた結果を図4に示す。アミノ酸無添加製剤(レーン2)に比べ、L−グルタミン酸ナトリウム添加製剤(レーン8)、L−アルギニン塩酸塩添加製剤(レーン9)、L−ヒスチジン塩酸塩添加製剤(レーン10)において、分解物生成抑制の顕著な効果が示された。
[発明の効果]
Claims (17)
- 尿素を含まず、安定化剤として、ロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸及びアルギニンならびにその塩から選択される1または2以上のアミノ酸を含む、エリスロポエチン溶液製剤。
- 安定化剤が、L−ロイシン、L−トリプトファン、L−セリン、L−グルタミン酸及びL−アルギニンならびにその塩から選択される1または2以上のアミノ酸である、請求項1に記載の溶液製剤。
- 安定化剤が、トリプトファン及び/又はその塩である、請求項1に記載の溶液製剤。
- 安定化剤が、アルギニン及び/又はその塩である請求項1に記載の溶液製剤。
- 安定化剤として、さらにヒスチジンを含む、請求項1〜4のいずれかに記載の溶液製剤。
- 安定化剤として、さらにL−ヒスチジンを含む、請求項1〜4のいずれかに記載の溶液製剤。
- アミノ酸の濃度が0.1〜40mg/mlである請求項1〜6のいずれかに記載の溶液製剤。
- アルギニンの濃度が1〜5mg/mlである、請求項1、2及び4〜7のいずれかに記載の溶液製剤。
- 安定化剤として、実質的にタンパク質を含まない、請求項1〜8のいずれかに記載の溶液製剤。
- 界面活性剤をさらに含む請求項1〜9のいずれかに記載の溶液製剤。
- 界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルである、請求項10に記載の溶液製剤。
- 界面活性剤がポリソルベート20及び/又は80である、請求項11に記載の溶液製剤。
- 塩をさらに含む、請求項1〜12のいずれかに記載の溶液製剤。
- 塩が塩化ナトリウムである、請求項13に記載の溶液製剤。
- 緩衝液に溶解されている、請求項1〜14のいずれかに記載の溶液製剤。
- 緩衝液がリン酸及び/又はクエン酸である、請求項15に記載の溶液製剤。
- 尿素を含まず、ロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸及びアルギニンならびにその塩から選択される1または2以上のアミノ酸を含む、安定化剤をエリスロポエチン溶液製剤に添加することを含む、エリスロポエチン溶液製剤の安定化方法。
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