TWI240627B - Erythropoietin solution preparation - Google Patents

Description

1240627 (1) 捌、發明說明 一、 發明所屬之技術領域 本發明係關於紅血球生成素溶液製劑。 二、 先前技術 紅血球生成素溶液製劑（以下亦稱爲E p 〇 )係促進 紅血球系則驅細胞之分化，增殖之酸性糖蛋白質荷爾蒙， 主由腎臟產生，血液中存在最豐富的紅血球，在一段時間 後被脾臟所破壞（在人體中平均壽命約1 2 〇日），因由 骨髓所源源不絕地供應，故在正常狀態，末梢的全紅血球 數經常地保持於一定。E P 0則是在維持此等生體紅血球 之恆常性擔任重要角色。 自從由大量再生不良性貧血患者的尿精製未自尙純度 人尿之E P 0以來，以此爲契機，始完成人e p〇基因之 選殖’目前則是以基因工程的方法，由動物細胞大量生產 重組人E P〇。又，本案申請人則將此精製之e P〇予以 製劑化（凍結乾燥製劑），以腎性貧血改善劑等之製品供 應市場。 在市面所售安定E P〇製劑之處方設計，有必要抑制 E P〇所常見的化學變化（水解，二硫化物交換反應等） 或物理變化（變性、凝集、吸著等）。在目前市售之製品 上’爲抑制該等化學’物理變化，有添加一般作爲安定化 劑使用之人血淸白蛋白或精製明膠。其中，人血淸白蛋白 蛋白爲輸血所需之血液製劑，從醫藥品之正當使用而言， -6- (2) 1240627 其可否添加仍屬問題。又，關於來自生體以外之蛋白質做 爲安定化劑而添加，欲完全迴避病毒污染等之危險性有所 困難。 又，爲謀求肱醫藥品製劑之安定化，則以實施凍結乾 燥之情形較多，但凍結乾燥在工業上會招致生產成本之大 增，進而伴隨機械故障所致危險性之增大。 由上述理由，不含蛋白質做爲安定化劑，而且長期保 存亦爲安定的凍結乾燥製劑可予替代之E P ◦製劑爲所期 望。 三、發明內容 爲達成上述目的，本發明人等經潛心硏究，結果發現 添加某種爲安定化劑之胺基酸，可得到不含人血淸白蛋白 或精製明膠之安定的E P ◦溶液製劑，因而完成本發明。 亦即’本發明係提供含有胺基酸作爲安定化劑之紅血 球生成素溶液製劑。 本說明書中安定化係表示，使紅血球生成素溶液製劑 在例如1 0 °C下保存2年以上，或者2 5 °C下，保存6個 月以上’此時係表不保持紅血球生成素溶液製劑之殘有率 9〇％以上，較佳是9 5%以上，更佳是9 8%以上。 本發明溶液製劑所使用之E P〇，具有與哺乳動物， 尤其是人E P ◦實質上相同之生物學活性，含有天然由來 者，及由基因重組法所得者。由基因重組法所得之E p〇 S有與天然之E P 〇與胺基酸序列相同，或者該胺基酸序 -7- (3) 1240627 列的一個或多個麩失，取代，附加者，而具有前述生物學 活性者。本發明之E P〇可以任何方法製造，以各種方法 由人尿抽出以分離精製，以基因工程之方法由大腸菌、酵 母囷、中國Ham Stoii卵巢細胞等產生，可使用以各種方 法抽出、分離精製者。 本發明中作爲安定化劑添加之胺基酸，可含有游離之 胺基酸及其鈉鹽、鉀鹽、鹽酸鹽等之鹽。本發明之溶液製 劑可添加該等胺基酸之一種或二種以上之組合。較佳之胺 基酸有D — ' L -及D L -體之白胺酸、色胺酸、絲胺酸 、麩胺酸、精胺酸、組織胺酸與離胺酸及其鹽，較佳爲L 一白胺酸、L 一色胺酸、L 一麩胺酸、L 一精胺酸、L — 組織胺酸及L -離胺酸與其鹽。更佳者爲、l -精胺酸、 L -組織胺酸及L -離胺酸與其鹽。最佳爲L -組織胺酸 與其鹽。 本發明之溶液製劑較佳是安定化劑實質上不含蛋白質 。添加於本發明溶液製劑之胺基酸之添加量，依使用之胺 基酸種類，可使用後述之試驗方法而限定於較佳之範圍。 一般爲0 . 0 0 1〜5 0 m g /m < ，精胺酸較佳爲 0 · 1〜4〇mg/mZ ，更佳爲1〜l〇mg/m《， 離胺酸較佳爲0 · 5〜1 0 m g /m z ，更佳爲1 一 1 0 m g / m ^ ，組織胺酸較佳爲〇 · 5〜1 〇 m g /m < ， 更佳爲1 · 0〜4 · 0 m g /m < ，最佳爲1 · 0〜 2 · 0 m g / m < 。如後述，在L 一精胺酸鹽酸鹽及L 一 離胺酸之場合，換算成游離之胺基酸約1〜5 m g / m < -8 - (4) 1240627 ，而在L 一組織胺酸鹽酸鹽之場合，4 0 °C〜2週之加速 試驗換算成游離之胺基酸爲1〜1 0 m g / m < ，又在 2 5 °C〜6個月加速試驗在0 . 5〜5 m g / m <之範圍 顯示最高之E P〇殘有率。 本發明之溶液製劑中所含之E P〇量，依治療之疾患 種類，疾患之重症度，患者的年齡等而決定，一般爲 1〇0〜500000 IU/mZ ，較佳是200〜 100000 IU/m< ，更佳是75〇〜72000 I U / m <。本發明之溶液製劑通常是不經口服，例如可 以注射劑（皮下或靜脈注射）、經皮、經粘膜、經鼻等投 與，經口投與亦可行。 本發明之溶液製劑除了 E P 0，胺基酸以外，亦可含 有聚乙二醇；葡聚糖、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、葡萄 糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖 等之糖類；氯化鈉、氯化鉀、氯化錦、磷酸鈉、磷酸鉀、 碳酸氫鈉等之無機鹽；檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、乙酸鈉等之 有機鹽；及視情形添加於谷胱甘咀、硫辛酸、酼基乙酸鈉 、硫甘鈉、α -單硫甘油、硫代硫酸鈉等含硫還原劑等之 溶液製劑中。較佳之鹽爲氯化鈉。再者，在本發明之溶液 製劑可添加聚環氧乙烷山梨糖醚酐烷酯等之防吸著劑。更 佳之聚環氧乙烷山梨糖醇酐烷酯爲聚山梨酸酯2 〇、2 1 、4〇、6〇、65、80、81、85，最佳爲聚山梨 酸酯2 0及/或8 0。聚山梨酸酯2 0及/或8 0之較佳 添加量爲〇· 0 1〜1 m g / m《，更佳爲〇 · 〇 5〜 -9- (5) 1240627 〇· 1 m g / m 之。 本發明之溶液製劑係將該等成份在磷酸及/或檸檬酸 緩衝液等之溶液製劑之領域，藉溶解於公知之水性緩衝液 而調製。磷酸緩衝液，以磷酸一氫化鈉一磷酸二氧化鈉系 較佳，檸檬酸緩衝液以檸檬酸鈉之緩衝液較佳。本發明之 溶液製劑之p Η以5 · 〇〜8 . 〇 ，較佳爲6 . 0〜 7 ·〇° 在曰本特開昭6 4 - 7 1 8 1 8揭示含有尿素、胺基 酸' 非離子性濕潤劑爲其特徵之人蛋白質製劑。但是本發 明之溶液製劑較佳是不含尿素。尿素是否與例如紅血球生 成素般之糖鏈蛋白質之長期安定化有關，並不明確，而尿 素分離產生之生成物卻對製劑會有不良影響。再者，一般 在製劑中之添加成份愈少愈佳。 本發明之溶液製劑通常係收容於密封、滅菌之塑膠或 玻璃容器中。容器可以安瓿、管瓶或可丟棄注射器之規定 用量形狀供給、或者以注射用包或瓶之大用量形狀供給。 調製含各種胺基酸之Ε Ρ〇溶液製劑，實施4 0 °C〜 2週之加速試驗，試驗後製劑中之e P ◦含量係藉r p 一 Η P L C法（逆相高性能液體層析法）測定其添加效果。 其結果’與不添加胺基酸之溶液製劑比較，可知L 一白胺 酸、L 一色胺酸、l 一麩胺酸鈉、L 一精胺酸鹽酸鹽、L 〜組織胺酸及L -離胺酸鹽酸鹽之溶液製劑中ε Ρ 0殘有 率高。又，由S D S -聚丙烯醯胺凝膠電泳分析之結果可 確認L -精胺酸鹽酸鹽及l -組織胺酸、具有在加速試驗 -10- (6) 1240627 後之製劑中所認定之E P 〇分解物之生成抑制效果。 再者，在可認定添加效果之胺基酸中，關於L -精胺 酸鹽酸鹽、L -離胺酸鹽酸鹽及組織胺酸、檢討與製劑安 定化有關之添加濃度之影響。調製以各種L -精胺酸鹽酸 鹽、L -離胺酸鹽酸鹽或組織胺酸濃度添加之製劑，在進 行4 0 °C — 2週之加速試驗後之製劑中之Ε Ρ〇殘有率， 在L -精胺酸鹽酸鹽、L -離胺酸鹽酸鹽之任一場合中， 濃度在約1〜5 m g / m <間會有變得極大之傾向，而在 L 一組織胺酸鹽酸鹽於1〜1 0 m g / m <之範圍顯示最 高Ε P 0殘存率。又，調製以各種濃度添加L -組織胺酸 鹽酸鹽之製劑、進行2 5 t - 6個月加速實驗後之Ε P〇 殘存率爲0 . 5〜5 m g /m <之範圍顯示極大。由此可 知，在L -精胺酸鹽酸鹽、L -離胺酸鹽酸鹽及L -組織 胺酸鹽酸鹽存在有最適之添加濃度。 本發明之Ε P〇製劑並不含人血淸白蛋白或精製明膠 等之異種蛋白質，又爲無病毒等污染之虞的安全製劑。又 ，胺基酸與習知之安定化劑比較爲廉價，且製造所需之成 本比凍結乾燥製劑便宜，經濟上爲極有利之製劑。再者， 本發明之溶液製劑，因不溶解於緩衝液即可使用，與凍結 乾燥製劑比較使用時之步驟可大幅節省。由該種種優點， 可知本發明產業上之利用性極大。 本發明可由以下之實施例詳細說明，但本發明之範圍 並不限於此。 (7) 1240627 四、實施方式 試驗方法 在調劑溶液1 m轅中含有以下之成分：

Ep〇 15〇0國際單位 非離子性界面活性劑 0 . 0 5 m g (聚山梨酸酯80:日光化學製） 氯化鈉 8 · 5 m g 胺基酸（Sigma公司製） 0〜40 mg 於1 〇 m Μ磷酸緩衝溶液（和光純藥公司製），將調 整至ρ Η 6 · 0之溶液，在5 m ζ之玻璃管瓶充塡至1 m < ，打栓、密封、供溶液製劑用。加速試驗係將該製劑 放置於4 0 C之恆溫槽內2週。製劑之評價係由r p 一 Η P L C分析法（WATERS公司製）及SDS —聚丙烯醯 胺凝膠電泳分析法進行。 實施例1 :各種胺基酸添加對E P 〇殘存率之效果 由上述之忒驗方法調製添加有以下所記載各種胺基酸 之m液製劑，進行4 0 C - 2週加速試驗後之E p〇殘存 率係由R P - Η P L C法算出。所得結果如表i所示。 -12- (8) 1240627 表1 添加各種溶液製劑在加速§式驗後之E P 〇 c Η殘存率 胺基酸 添加量 4 0 °C _2週加速試驗後紅血球 (mg/ml) 生成素殘存率（對初期含量） 無添加 0 8 3.9% L -白胺酸 10 9 1.6% L-苯胺基丙酸 10 5 7.8% L -色胺酸 5 9 7.0% L -絲胺酸 10 8 5.2% L-半胱胺酸 10 4 7.1% L-麩胺酸鈉 10 9 3.9% L-精胺酸鹽酸鹽 10 9 3.6% L-組織胺酸鹽酸鹽 10 9 9.7% L-離胺酸鹽酸鹽 10 9 5.8%

L 一白胺酸、L 一色胺酸、L 一麩胺酸鈉、L 一精胺 酸鹽酸鹽、L -組織胺酸鹽酸鹽及L -離胺酸鹽酸鹽顯示 特別顯著之E P ◦殘存率。 實施例2 :胺基酸添加濃度對E P ◦殘存率之效果 在以下所示各種濃度，以上述之試驗方法調製添加有 L -精胺酸鹽酸鹽之溶液製劑，進行4 0 °C - 2週加速試 驗後之E P〇殘存率是以R P - Η P L C法算出。所得結 果如表2所示。 -13- (9) 1240627 表2添加L-精胺酸鹽酸鹽製劑在加速試驗後之EPOCH 殘存率 胺基酸 添加量 4 0 °C -2週加速試驗後紅血球 (mg/ml) 生成素殘存率（對初期含量） 無添加 0 8 9.6% L_精胺酸鹽酸鹽 0.1 9 2.7% 1 9 6.7% 5 9 6.1% 10 9 3.6% 20 9 2.0% 40 1 9 1.6% 又，其結果示於圖1 。 由此結果，L —精胺酸鹽酸鹽約在1〜5 m g / m < 之範圍，顯示極大之殘存率。 其次，在表3顯示使用L -離胺酸進行同樣的試驗時 ，L -離胺酸鹽酸鹽添加量及加速試驗後之E P ◦殘存率 -14- (10) 1240627 表3添加L-離胺酸鹽酸鹽製劑之加速試驗後EPOCH殘 存率： 胺基酸 添加量 4 (TC -2週加速試驗後紅血球 (mg/ml) 生成素殘存率（對初期含量） 無添加 0 8 8.7% L-精胺酸鹽酸鹽 0.5 9 3.1% 1 9 5.8% 5 9 6.3% 10 9 0.2%

又，其結果示於圖2。 由結果可知，L -離胺酸鹽酸鹽之場合約在1〜5 m g / m <之範圍，顯示極大之E P〇殘有率。 其次表4顯示使用L -組織胺酸鹽酸鹽進行同樣試驗 時，L -組織胺酸鹽酸鹽添加量及加速試驗後E P 0之殘 存率。 -15- (11) 1240627 表4添加L -組織胺酸鹽酸鹽製劑之加速試驗後E P O C Η 殘存率： 胺基酸 添加量 4 0 °C - 2週加速試驗後紅血球 (mg/ml) 生成素殘存率（對初期含量） 無添加 0 9 1.5% . L-精胺酸鹽酸鹽 0.5 9 5.5% .... 1 9 7.3% 5 9 8.1% 10 9 9.7%

又’此結果係示於圖3。在L -組織胺酸鹽酸鹽於1 〜1 0 m g / m <之範圍，顯示最高之e P〇殘存率。 再者’於以下所示之各種濃度依上述之試驗方法調製 添加L -組織胺酸鹽酸鹽之溶液製劑，進行2 5 °C〜6個 月加速試驗後之E P〇殘存率係以r p 一 η P L C法算出 。所得結果示於表5。 -16- (12) 1240627 表5添加L-組織胺酸鹽酸鹽製劑在加速試驗後EPOCH 殘存率： ----- 胺基酸 添加量 4〇°C·6個月加速試驗後紅血球 '~~----- (mg/ml) 生成素殘存率（對初期含量） 無添加 0 9 3.2% L-精胺酸鹽酸鹽 0.5 9 9.3% 1 9 9.9% 5 9 7.9% 10 9 4.1%

由此結果’在〇 . 5〜5 m g / m <之範圍，尤其在 1 m g / m <顯示極大之e P〇殘存率。 實施例3 :各種胺基酸添加對e P 〇分解物之效果 依上述之試驗方法調製添加以下記載之各種胺基酸的 溶液製劑’進行4 〇 t：〜2週加速試驗後之e P ◦分解物 的生成係藉s D S〜聚丙烯醯胺凝膠電泳分析法來檢討。 1 )試料之調製 在E P 〇添加含實施例1表丨所記載濃度之各胺基酸 ，S D S ，甘油及溴代苯酚的1 M三鹽酸緩衝液（ρ η 6.8)，在6 0 °c下加熱1 5分，成爲試料液。 -17- (13) 1240627 2 )泳動法 就試料溶液1 〇 //轅在以下操作條件進行泳動。 a )使用機器·· slab電泳裝置 b )泳動凝膠：s D S — P A G E mini 8 — 16 (聚丙烯醯胺濃度8 - 1 6 %之濃度等級凝膠）（Jefco 製） ·_ c )泳動溫度：2 5它 _ d )泳動條件：2 5 m A定電流（/凝膠） Φ 3 )染色法（Western Block 法） 將泳動之凝膠轉印至聚偏氟二氯乙烯膜後，使用抗 E P〇兔子抗血淸、生物素標識抗兔子I g G山羊抗體及 生物素化西洋山葵過氧化麟，使3 ，3 / -二氨過氧化氫 作爲基質發色。 4 )結果 _ 所得結果如圖4所示。與胺基酸無添加之製劑（第2 行）比較’ L 一添加麩胺酸鈉製劑（第8行）、L 一添加 ’ 精胺酸鹽酸鹽製劑（第9行）、L -添加組織胺酸鹽酸鹽 ' 製劑（第1 0行）中，顯示分解物生成抑制之顯著效果。 - 五、圖式簡單說明 圖1係表示L -精胺酸鹽酸鹽濃度與紅血球生成素殘 有率之關係圖。 -18- (14) 1240627 圖2係表示L -離胺酸鹽酸鹽濃度與紅血球生成素殘 存率之關係圖。 圖3係表示L -組織胺酸鹽酸鹽濃度與紅血球生成素 殘有率之關係圖。 圖4係表示添加各種胺基酸製劑之分解物抑制效果之 S D S -聚丙醯胺凝膠之電泳圖案（電泳照片）。第1行 :分子量標記、第2行：不添加胺基酸製劑、第3行··添 加白胺酸製劑、第4行：添加苯胺基丙酸製劑、第5行： 添加色胺酸製劑、第6行：添加絲胺酸製劑、第7行：添 加半胱胺酸製劑、第8行：添加麩胺酸鈉製劑、第9行： 添加精胺酸鹽酸鹽製劑、第1 〇行：添加L 一組織胺酸鹽 製劑。 -19-

Claims (1)

1240627 Γ ； bn !___________ 拾、申請專利範圍 第91 133042號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國94年6月17日修正 1 * 一種紅血球生成素溶液製劑，其爲含有作爲安定 化劑的精胺酸或其鹽，其特徵爲精胺酸的濃度爲〇 . i〜 4 0 m g / m 1 〇 2 ·如申請專利範圍第1項之溶液製劑，其中安定化 劑中未含蛋白質。 3 ·如申請專利範圍第2項之溶液製劑，其中更含有 界面活性劑、鹽、緩衝劑或這些的組合物。 4 ·如申請專利範圍第3項之溶液製劑，其中界面活 性劑爲聚環氧乙烷山梨聚糖烷酯。 5 ·如申請專利範圍第4項之溶液製劑，其中界面活 性劑爲聚山梨酸酯20及/或聚山梨酸酯80。 6 .如申請專利範圍第3項之溶液製劑，其中鹽爲氯 化鈉。 7 ·如申請專利範圍第3項之溶液製劑，其中緩衝液 爲磷酸及/或檸檬酸之緩衝液。 8 ·如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之溶液 製劑，其不含尿素。