ES2348166T3 - Preparación de una solución de eritropoyetina estabilizada con leucina o ácido glutámico. - Google Patents

Abstract

Un método para estabilizar una preparación en solución de eritropoyetina, que comprende la adición de un estabilizante que consiste en uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en leucina, ácido glutámico y sus sales, a la preparación en solución de eritropoyetina, donde la concentración del aminoácido es de 0,1 a 40 mg/ml, la preparación en solución no incluye urea, y la preparación en solución no contiene una proteína como un estabilizante.

Description

Esta invención se refiere a un método para estabilizar una preparación en solución de eritropoyetina.

La eritropoyetina (más adelante en el presente documento denominada como EPO) es una hormona glicoproteína ácida que promueve la diferenciación y proliferación de células progenitoras eritroides. Esta hormona se segrega principalmente por el riñón. Los eritrocitos están presentes abundantemente en la sangre durante ciertos periodos, y después los destruye el bazo, etc. (su vida media en seres humanos es de aproximadamente 120 días). Sin embargo, los glóbulos rojos los suministra constantemente la médula ósea, de manera que el recuento de eritrocitos totales periféricos se mantiene constante en un estado normal. EPO desempeña un papel central en el mantenimiento de dicha homeostasis de eritrocitos en el organismo vivo.

Se obtuvo EPO urinaria humana de alta pureza mediante la purificación de un gran volumen de orina procedente de pacientes con anemia aplásica. Esto permitió la clonación del gen EPO humano. Hoy día, se ha hecho posible producir una gran cantidad de EPO humano recombinante en células animales por tecnología de ingeniería genética. El solicitante de esta invención ha tenido éxito en la producción de una preparación (preparación liofilizada) de la EPO purificada y la suministra al mercado en forma de agentes para aliviar la anemia renal y otras.

El diseño de fármacos para suministrar al mercado con preparaciones de EPO estables requiere que se supriman los cambios químicos (hidrólisis, reacción de intercambio de disulfuro, etc.) o los cambios físicos (desnaturalización, aglutinación, adsorción, etc.) observados con EPO. Los productos que están ahora en el mercado contienen albúmina sérica humana o gelatina purificada que generalmente se usa como un estabilizante. Estas sustancias se han añadido en estos productos para suprimir los cambios químicos o físicos. Debido a que la albúmina sérica humana es un producto sanguíneo que depende de la donación de sangre para su suministro, se ha cuestionado la necesidad de su adición. Con respecto a la adición de una proteína diferente a la albúmina o la gelatina como un estabilizante, es difícil evitar completamente el riesgo de contaminación viral.

Los fármacos peptídicos a menudo se liofilizan para la estabilización. Sin embargo, la liofilización aumenta los costes de fabricación e implica un riesgo aumentado debido a problemas mecánicos.

Por las razones anteriores, está aumentando la demanda de una preparación de EPO como una alternativa a una preparación liofilizada, estando la preparación de EPO libre de la inclusión de una proteína como un estabilizante y estable durante el almacenamiento a largo plazo.

Para satisfacer la demanda anterior, los inventores han llevado a cabo estudios extensos. Como resultado, se ha descubierto que EPO puede transformarse en una preparación en solución de EPO estable sin albúmina sérica humana y gelatina purificada añadiendo un determinado aminoácido como un estabilizante. Este hallazgo ha conducido a la compleción de la presente invención.

Es decir, la presente invención proporciona una preparación en solución de eritropoyetina que contiene un aminoácido como un agente de estabilización

o estabilizante.

En esta memoria descriptiva "estabilizar; que estabiliza" se refiere al almacenamiento o la preparación en solución de eritropoyetina, por ejemplo, durante más de 2 años a 10°C o durante más de 6 meses a 25°C o durante más de 2 semanas a 40°C mientras que se mantiene la tasa residual de eritropoyetina al 90% o más alta, preferiblemente al 95% o más alta, más preferiblemente al 98% o más alta.

La Fig.1 es un gráfico que muestra la relación entre la concentración de hidrocloruro de L-arginina y la tasa residual de eritropoyetina; La Fig. 2 es un gráfico que muestra la relación entre la concentración de hidrocloruro de L-lisina y la tasa residual de eritropoyetina; La Fig. 3 es un gráfico que muestra la relación entre la concentración de hidrocloruro de L-histidina y la tasa residual de eritropoyetina; y La Fig. 4 muestra un patrón de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida que ilustra el efecto de supresión del producto de degradación de preparaciones en las que se han añadido diversos aminoácidos (un electroforetograma) en el cual: carril 1: marcador de peso molecular, carril

2: preparación sin aminoácidos, carril 3: preparación que contiene Lleucina, carril 4: preparación que contiene L-fenilalanina, carril 5: preparación que contiene L-triptófano, carril 6: preparación que contiene Lserina, carril 7: preparación que contiene L-cisteína, carril 8: preparación

que contiene L-glutamato monosódico monohidrato, carril 9: preparación

que contiene hidrocloruro de L-arginina y carril 10: preparación que

contiene hidrocloruro de L-histidina.

La EPO que su uso en la preparación en solución de la presente invención tiene sustancialmente la misma actividad biológica que la de los mamíferos, especialmente, la EPO humana e incluye EPO de procedencia natural y EPO obtenido por recombinación genética. La EPO procedente de recombinación genética incluye EPO que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la EPO de procedencia natural o EPO con esta secuencia de aminoácidos en la que se ha eliminado uno o más de los aminoácidos o en la que se ha sustituido uno o más de los aminoácidos o en la que se ha añadido uno o más aminoácidos, y que, sin embargo, retiene la actividad biológica mencionada anteriormente. La EPO en la presente invención se puede producir mediante cualquiera de los métodos, por ejemplo, un método que comprende extracción a partir de la orina humana, seguida de la separación y purificación, de diversas maneras; y un método que implica la producción en E. coli, levadura o células de ovario de hámster chino, seguida de la extracción, separación y purificación de diversas maneras.

El aminoácido añadido como un estabilizante en la presente invención incluye aminoácidos libres y sus sales tales como las sales sódicas, sales potásicas e hidrocloruros. La preparación en solución de la presente invención tiene uno de estos aminoácidos. Los aminoácidos son formas D-, L-y DL-de leucina o ácido glutámico y sus sales.

La preparación en solución de la presente invención, está libre de proteína como un estabilizante.

Para la cantidad de aminoácido añadido a la preparación en solución, de la presente invención, puede establecerse un intervalo preferido mediante un método de ensayo (a describir más adelante) dependiendo del tipo de aminoácido usado. La cantidad de aminoácido añadido es de 0,1 a 40 mg/ml. Como se describirá más adelante, la mayor tasa residual de EPO se obtuvo cuando se añadieron hidrocloruro de L-arginina e hidrocloruro de L-lisina en una cantidad para cada uno de aproximadamente 1 a 5 mg/ml como aminoácido libre o cuando se añadió hidrocloruro de L-histidina en una cantidad, como aminoácido libre, de 1 a 10 mg/ml en un ensayo acelerado realizado durante dos semanas a 40ºC o 0,5 a 5 mg/ml en un ensayo acelerado de 6 meses a 25°C.

La cantidad de EPO contenida en la preparación en solución de la presente invención se puede determinar de acuerdo con el tipo de enfermedad a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad del paciente y así sucesivamente. Generalmente, su cantidad es de 100 a 500.000 lU/ml, preferiblemente de 200 a 100.000 lU/ml, más preferiblemente de 750 a 72.000 lU/ml. La preparación en solución de la presente invención se administra normalmente por una vía parenteral, por ejemplo, mediante inyección (subcutánea o intravenosa) o por vía percutánea, transmucosa o transnasal, pero también es posible la administración oral.

La preparación en solución de la presente invención puede contener, además de EPO y el aminoácido, ingredientes que se añaden normalmente a una preparación en forma de una solución, tales como polietilenglicol; azúcares, por ejemplo, dextrano, manitol, sorbitol, inositol, glucosa, fructosa, lactosa, xilosa, manosa, maltosa, sacarosa y rafinosa; sales inorgánicas, por ejemplo, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, fosfato sódico, fosfato potásico e hidrogenocarbonato sódico; sales orgánicas, por ejemplo, citrato sódico, citrato potásico y acetato sódico; y, si se desea, agentes reductores que contienen azufre, por ejemplo, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato sódico, tioglicerol, α-monotioglicerol y tiosulfato sódico. La sal preferida es cloruro sódico. También se prefiere añadir un agente que evite la adsorción, tal como un éster alquílico de polioxietilén sorbitan, a la preparación en solución de la presente invención. Los esteres alquílicos de polioxietilén sorbitan particularmente preferidos son polisorbato 20, 21, 40, 60, 65, 80, 81 y 85, y más preferiblemente, polisorbato 20 y/o 80. La cantidad preferida de polisorbato 20 y/o 80 añadido es 0,01 a 1 mg/ml, más preferiblemente 0,05 a 0,1 mg/ml.

La preparación en solución de la presente invención se puede preparar disolviendo los componentes anteriormente mencionados en un tampón acuoso públicamente conocido en el campo de las preparaciones en solución, tal como tampón fosfato y/o citrato. El tampón de fosfato preferido es un tampón fosfato monohidrógeno de sodiofosfato dihidrógeno de sodio, mientras que el tampón de citrato preferido es un tampón de citrato sódico. El pH de la preparación en solución de la presente invención es de 5,0 a 8,0, preferiblemente de 6,0 a 7,0.

La publicación de patente japonesa sin examinar Nº 64-71.818 describe una preparación de proteína humana caracterizada porque contiene urea, un aminoácido y un agente humectante no iónico. Sin embargo, la preparación en solución de la presente invención no contiene urea, porque no está claro que la urea contribuya a la estabilización a largo plazo de una glucoproteína tal como la eritropoyetina. También se sabe que tiene lugar una reacción entre los productos de degradación de la urea y la proteína (Protein Chemistry 3, Kyoritsu Shuppan, Capítulo 12), que puede afectar adversamente a la preparación. Además, cuantos menos ingredientes se añadan a la preparación, mejores resultados se pueden esperar.

La preparación en solución de la presente invención normalmente está contenida en un recipiente sellado de plástico o vidrio esterilizado. La preparación en solución se puede administrar como una dosis prescrita en una ampolla, vial o jeringa desechable o en una forma de dosificación múltiple tal como una bolsa o botella para inyección.

Se prepararon preparaciones en solución de EPO que contenían diversos aminoácidos y se sometieron a un ensayo acelerado llevado a cabo durante dos semanas a 40°C. Se midió el contenido de EPO en cada una de las preparaciones después del ensayo se midió por RP-HPLC (cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa) para investigar el efecto de la adición de aminoácidos en este contenido. Como resultado, se encontró que la tasa residual de EPO era más alta en las preparaciones en solución que contenían L-leucina, L-triptófano, L-glutamato monosódico monohidrato, hidrocloruro de Larginina, hidrocloruro de L-histidina e hidrocloruro de L-lisina que en las preparaciones en solución que no contenían aminoácidos. Los resultados de la electroforesis en gel SDS-poliacrilamida demostraron que el hidrocloruro de Larginina y el hidrocloruro de L-histidina eran eficaces en la supresión de la formación de los productos de degradación de EPO que se observó en la preparación después del ensayo acelerado.

De los aminoácidos que demostraron así ser eficaces cuando se añadieron, se examinaron el hidrocloruro de L-arginina, el hidrocloruro de Llisina y el hidrocloruro de L-histidina para el efecto de sus concentraciones en la estabilización de la preparación. Es decir, se produjeron preparaciones de EPO a las que se les añadió hidrocloruro de L-arginina, hidrocloruro de L-lisina e hidrocloruro de L-histidina en diversas concentraciones y se llevó a cabo un ensayo acelerado de 2 semanas a 40°C de estas preparaciones. Tras completarse el ensayo, las tasas residuales de EPO en las preparaciones tendieron al máximo a concentraciones de aproximadamente 1 a 5 mg/ml en el caso del hidrocloruro de L-arginina y el hidrocloruro de L-lisina. Con hidrocloruro de L-histidina, la tasa máxima residual de EPO se alcanzó a una concentración de 1 a 10 mg/ml. También se llevó a cabo un ensayo acelerado de 6 meses a 25°C en preparaciones de EPO a las que se añadió hidrocloruro de L-histidina en diversas concentraciones. La tasa residual de EPO fue máxima a concentraciones de 0,5 a 5 mg/ml. Estos hallazgos mostraron que el hidrocloruro de L-arginina, el hidrocloruro de L-lisina y el hidrocloruro de Lhistidina tenían la concentración óptima de adición.

La preparación en solución de EPO de la presente invención es una preparación segura libre de proteínas extrañas tales como albúmina sérica humana o gelatina purificada y sin el riesgo de contaminación viral. El aminoácido añadido a ella es más barato que estos estabilizantes convencionales y el coste incurrido durante el procedimiento de fabricación también es más bajo que para un producto liofilizado. Así, la preparación de esta invención es económicamente ventajosa. Además, la preparación en solución de la presente invención no necesita disolverse en un tampón, ya que puede usarse como tal. Esto reduce el trabajo al usarla en comparación con una preparación liofilizada. Debido a estas diversas ventajas, la aplicabilidad industrial de la presente invención es grande.

La presente invención se describirá ahora con mayor detalle por referencia a los siguientes ejemplos, pero no por ello se restringe su alcance. Ejemplos Método de ensayo

Un vial de vidrio de 5 ml se cargó con 1 ml de una disolución de administración que contenía los siguientes componentes/ml y que estaba ajustada a pH 6,0 con un tampón fosfato 10 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.):

EPO 1.500 IU

Tensioactivo no iónico (polisorbato 80, Nikko Chemical Co., 0,05 mg

Ltd.)

Cloruro sódico 8,5 mg

Aminoácido (Sigma Chemical Company) 0 a 40 mg

El vial lleno se cerró, sello y se usó como una preparación en solución. Como un ensayo acelerado, la preparación se mantuvo durante dos semanas en una cámara termostática a 40°C. Después, la preparación se evaluó por análisis RP-HPLC (WATERS) y análisis por electroforesis en gel SDS

5 poliacrilamida. Ejemplo 1: Efecto de la adición de diversos aminoácidos en la tasa residual de EPO

De acuerdo con el método de ensayo anterior, se produjeron preparaciones en solución que contenían diversos aminoácidos tabulados

10 anteriormente y se sometieron a un ensayo acelerado de 2 semanas a 40°C. Después, se determinaron sus tasas residuales de EPO mediante el método de RP-HPLC. Los resultados se muestran en la Tabla 1 TABLA 1 tasas residuales de EPO después del ensayo acelerado de diversas preparaciones en solución que contenían aminoácidos

Aminoácido

Cantidad añadida (mg/ml) Tasa residual de EPO después del ensayo(mg/ml) acelerado de 2 semanas a 40°C(% del contenido inicial)

No añadido

0 83,9

L-leucina

10 91,6

L-fenilalanina

10 57,8

L-triptófano

5 97,0

L-serina

10 85,2

L-cisteína

10 47,1

L-glutamato monosódico monohidrato

10 93,9

Hidrocloruro de L-arginina

10 93,6

Hidrocloruro de L-histidina

10 99,7

Hidrocloruro de L-lisina

10 95,8

15 Como se muestra anteriormente, la L-leucina, el L-triptófano, el Lglutamato monosódico monohidrato, el hidrocloruro de L-arginina, el hidrocloruro de L-histidina y el hidrocloruro de L-lisina condujeron unas tasas residuales de EPO particularmente acusadas. Ejemplo de Referencia 2: Efecto de la adición de un aminoácido en diversas

20 concentraciones en la tasa residual de EPO. De acuerdo con el método de ensayo anterior, se produjeron preparaciones en solución de EPO que contenían hidrocloruro de L-arginina a diversas concentraciones indicadas a continuación y se sometieron al mismo ensayo acelerado de 2 semanas a 40°C. Después, se determinaron sus tasas residuales de EPO mediante el método de RP-HPLC. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 Tasas residuales de EPO después del ensayo acelerado de preparaciones que contenían hidrocloruro de L-arginina

Aminoácido

Cantidad añadida (mg/ml) Tasa residual de EPO después del ensayo(mg/ml) acelerado de 2 semanas a 40°C(% del contenido inicial)

No añadido

0 89,6

Hidrocloruro de L-arginina

0,1 92,7

1

96,7

5

96,1

10

93,6

20

92,0

40

91,6

Los resultados anteriores se representan como un gráfico en la Fig. 1. Como se muestra anteriormente, el hidrocloruro de L-arginina produjo 10 unas tasas máximas residuales de EPO en un intervalo de concentraciones de aproximadamente 1 a 5 mg/ml.

Después, se llevó a cabo el mismo ensayo usando hidrocloruro de Llisina. Las cantidades de hidrocloruro de L-lisina añadidas y las tasas residuales de EPO después del ensayo acelerado se muestran en la Tabla 3.

15 Tabla 3 Tasas residuales de EPO después del ensayo acelerado de preparaciones que contenían hidrocloruro de L-lisina

Aminoácido

Cantidad añadida (mg/ml) Tasa residual de EPO después del ensayo(mg/ml) acelerado de 2 semanas a 40°C (% del contenido inicial)

No añadido

0 88,7

Hidrocloruro de L-lisina

0,5 93,1

1

95,8

5

96,3

10

90,2

Los resultados anteriores se representan en un gráfico en la Fig. 2.

Como se muestra anteriormente, el hidrocloruro de L-lisina produjo unas

tasas máximas de EPO residual en un intervalo de concentraciones de

aproximadamente 1 a 5 mg/ml.

Después, se llevó a cabo el mismo ensayo usando hidrocloruro de L

histidina. Las cantidades de hidrocloruro de L-histidina añadidas y las tasas

residuales de EPO después del ensayo acelerado se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4 Tasas residuales de EPO después del ensayo acelerado de preparaciones que contenían hidrocloruro de L-histidina

Aminoácido

Cantidad añadida (mg/ml) Tasa residual de EPO después del ensayo (mg/ml) acelerado de 2 semanas a 40°C (% del contenido inicial)

No añadido

0 91,5

Hidrocloruro de L-histidina

0,5 95,5

1

97,3

5

98,1

10

99,7

Los resultados anteriores se representan en un gráfico en la Fig. 3.

10 Como se muestra anteriormente, el hidrocloruro de L-histidina produjo unas tasas máximas de EPO residual en un intervalo de concentraciones de aproximadamente 1 a 10 mg/ml. De acuerdo con el método de ensayo anteriormente mencionado, se produjeron preparaciones en solución de EPO que contenían hidrocloruro de L

15 histidina a diversas concentraciones indicadas a continuación y se sometieron a un ensayo acelerado de 6 meses a 25°C. Después, se determinaron sus tasas residuales de EPO mediante el método de RP-HPLC. Los resultados se muestran en la Tabla 5. TABLA 5 Tasas residuales de EPO después del ensayo acelerado de

20 preparaciones que contenían hidrocloruro de L-histidina

Aminoácido

Cantidad añadida (mg/ml) Tasa residual de EPO después del ensayo (mg/ml) acelerado de 6 meses a 25°C (% del contenido inicial)

No añadido

0 93,2

Hidrocloruro de L-histidina

0,5 99,3

1

99,9

5

97,9

Aminoácido

Cantidad añadida Tasa residual de EPO después del ensayo

(mg/ml)

(mg/ml) acelerado de 6 meses a 25°C (%

del contenido inicial)

10

94,1

Como se muestra anteriormente, el hidrocloruro de L-histidina produjo unas tasas máximas residuales de EPO en un intervalo de concentraciones de aproximadamente 0,5 a 5 mg/ml, especialmente, a una concentración de 1 mg/ml.

5 Ejemplo 3: Efecto de la adición de diversos aminoácidos en los productos de la degradación de EPO

De acuerdo con el método de ensayo anteriormente mencionado, se produjeron preparaciones en solución de EPO que contenían diversos aminoácidos y se sometieron a un ensayo acelerado de 2 semanas a 40°C.

10 Después, se investigó la formación de los productos de la degradación de EPO por el método de análisis de electroforesis en gel SDS-poliacrilamida. 1) Preparación de la muestra

Después del ensayo acelerado, se añadió un tampón TRIS-clorhidrato 1M (pH 6,8) que contenía SDS, glicerina y azul de bromofenol a cada una de

15 las preparaciones en solución de EPO que contenían cada uno de los diversos aminoácidos indicados en la Tabla 1 del Ejemplo 1. La mezcla se calentó durante 15 minutos a 60°C para su uso como una solución de muestra. 2) Electroforesis

La misma disolución (10 μl) se sometió a electroforesis en las siguientes

20 condiciones de operación: a) Equipamiento: Aparato de electroforesis en gel Slab (Bio-Rad Laboratories). b) Gel de electroforesis:

SDS-PAGEmini8-16 (gel de gradiente de concentración en

25 concentraciones de poliacrilamida de 8 a 16%, Tefco) c) Temperatura de electroforesis: 25°C d) Condiciones de electroforesis:

Corriente constante 25 mA/gel 3) Método de tinción (transferencia de western) 30 El gel sometido a electroforesis se transfirió a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Después, se usaron antisuero de conejo anti-EPO,

anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo marcado con biotina y peroxidasa de rábano biotinilada para el desarrollo del color con 3,3'-diaminobencidinaperóxido de hidrógeno como sustrato. 4) Resultados

5 Los resultados obtenidos se muestran en la Fig. 4. En comparación con la preparación sin aminoácidos (carril 2), la preparación que contenía Lglutamato monosódico monohidrato (carril 8), la preparación que contenía hidrocloruro de L-arginina (carril 9) y la preparación que contenía hidrocloruro de L-histidina (carril 10) mostraron el efecto acusado de la supresión de la

10 formación de los productos de degradación de EPO.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para estabilizar una preparación en solución de eritropoyetina, que comprende la adición de un estabilizante que consiste en uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en leucina, ácido glutámico y sus sales, a la preparación en solución de eritropoyetina, donde la concentración del aminoácido es de 0,1 a 40 mg/ml, la preparación en solución no incluye urea, y la preparación en solución no contiene una proteína como un estabilizante.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, en el que la preparación en solución además contiene un tensioactivo.

3. 3.

   El método de la reivindicación 2, en el que el tensioactivo es un éster alquílico de polioxietilén sorbitan.

4. 4.

   El método de la reivindicación 2, en el que el tensioactivo es un polisorbato 20 y/u 80.

5. 5.

   El método de la reivindicación 1 ó 4, en el que la preparación en solución además contiene una sal.

6. 6.

   El método de la reivindicación 5, en el que la sal es cloruro sódico.

7. 7.

   El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la preparación en solución se ha disuelto en un tampón.

8. 8.

   El método de la reivindicación 7, en el que el tampón es un tampón fosfato y/o tampón citrato.

9. 9.

   Uso de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en leucina, ácido glutámico y sus sales, como un estabilizante para una preparación en solución de eritropoyetina, donde la concentración del aminoácido es de 0,1 a 40 mg/ml, la preparación en solución no incluye urea, y

   13 la preparación en solución no contiene una proteína como estabilizante.