KR20030027077A

KR20030027077A - 장기 안정화 용액 제제

Info

Publication number: KR20030027077A
Application number: KR10-2003-7002698A
Authority: KR
Inventors: 사또야스시
Original assignee: 쥬가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2000-09-01
Filing date: 2001-09-03
Publication date: 2003-04-03
Also published as: CA2420850A1; EP1329224A4; CN1449292A; CN1204921C; AU8260701A; US20040037803A1; HK1057168A1; AU2001282607B2; US7998929B2; WO2002017957A1; EP1930024A3; EP1329224A1; NZ524482A; AU2006235962A1; EP1930024A2

Abstract

본 발명은 안정화제로서 실질적으로 단백질을 함유하지 않고, 또한 안정화제로서 1 종류 이상의 아미노산 또는 그 염을 함유하는 G-CSF 용액 제제에 관한 것이다.

Description

장기 안정화 용액 제제 {SOLUTION PREPARATIONS STABILIZED OVER LONG TIME}

G-CSF는 호중구의 전구 세포에 작용하여 그 증식 및 분화 성숙을 촉진시키는 분자량 약 2만의 당단백질이다.

본 출원인에 의해 구강저암 환자의 종양세포에서 채취한 세포주를 배양함으로써 고순도의 인간 G-CSF가 정제된 이후, 이를 계기로 인간 G-CSF 유전자의 클로닝에 성공하고, 현재에는 유전자 공학적 방법으로 미생물이나 동물세포에서 재조합 인간 G-CSF를 대량으로 생산할 수 있게 되었다. 또, 본 출원인은 이 정제된 G-CSF의 제제화에 성공하여 이를 감염방어제로서 시장에 제품을 공급하고 있다(일본 특허 제2116515호).

G-CSF는 매우 미량으로 사용되고, 통상 성인 1인당 0.1∼1000㎍(바람직하게는 5∼500㎍)의 G-CSF를 함유하는 제제를 1∼7회/주의 비율로 투여한다. 그러나, 이 G-CSF는 예컨대 주사용 앰플, 주사기 등의 기벽에 대하여 흡착성을 나타낸다. 또, G-CSF는 불안정하고 외적 인자의 영향을 받기 쉬워 온도, 습도, 산소, 자외선등에 기인한 회합, 중합 또는 산화 등의 물리적, 화학적 변화를 유발시켜 결과적으로 큰 활성의 저하를 가져온다.

종래 이러한 영향을 방지하기 위해서 제형으로서 주로 동결 건조 제제가 선택되고, 각종 처방 설계가 이루어져 왔다. 예컨대, (a) 트레오닌, 트립토판, 리신, 히드록시리신, 히스티딘, 아르기닌, 시스테인, 시스틴, 메티오닌에서 선택된 1 종류 이상의 아미노산; (b) 1 종류 이상의 황함유 환원제; 또는 (c) 1 종류 이상의 산화방지제;로 이루어진 군에서 선택된 1 종류 이상을 함유하는 제제(일본 특허 제2577744호) 등이 제안되어 있다. 또, 안정화제로서 폴리소르베이트 등의 계면활성제를 함유하는 G-CSF 제제가 있다(일본 공개특허공보 소63-146826호).

또, 말토오스, 라피노스, 슈크로오스, 트레할로오스 또는 아미노당을 함유한 G-CSF 동결 건조 제제도 보고되어 있다(일본 특허공표공보 평8-504784호).

그러나, 동결 건조 공정은 공업적으로 생산 비용의 증대를 가져오고, 또한 기계 문제에 의한 위험성의 증대를 수반하게 된다. 또한, 동결 건조 제제는 사용시에 순수(주사용 멸균수)에 용해시켜 사용해야 한다는 수고가 든다는 문제가 있었다.

한편, 종래 시장에 공급되었던 제품에는 이들 화학적, 물리적 변화를 억제하기 위해서, 안정화제로서 일반적으로 사용되고 있는 인간 혈청 알부민 또는 정제 젤라틴 등의 단백질이 첨가되어 있는 것이 있다. 그러나, 단백질을 안정화제로서 첨가하는 것에 관해서는 바이러스의 오염을 제거하거나 하기 위해서 매우 번잡한 공정을 필요로 하는 등의 문제가 있었다.

그러나, 이와 같은 단백질을 첨가하지 않은 경우에는, G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체의 생성이 많아지고, 품질 열화를 가져온다는 문제가 있었다.

이상과 같은 이유 때문에 안정화제로서 단백질을 함유하지 않고, 또한 장기 보존에도 안정한, 동결 건조 제제를 대신하는 G-CSF의 용액 제제가 요구되어 왔다.

본 발명은 G-CSF(과립구 콜로니 자극인자) 용액 제제에 관한 것으로, 특히 장기간 보존한 후에도 활성성분의 손실이 적고, 또한 G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체의 생성률이 낮고, 안정화시킨 G-CSF 제제에 관한 것이다.

발명의 개시

상기 목적을 달성하기 위해서 예의 연구한 결과, 본 발명자들은 안정화제로서 특정 아미노산을 조합하여 첨가함으로써, 장기 보존 후에도 G-CSF 잔존률이 높고, 또한 G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체의 생성률이 낮은 G-CSF 용액 제제로 할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 안정화제로서 실질적으로 단백질을 함유하지 않고, 또한 안정화제로서 1 종류 이상의 아미노산 또는 그 염을 함유하는 G-CSF 용액 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 아미노산이 글리신, 글루타민산나트륨, 아르기닌 및 히스티딘 또는 이들 염에서 선택된 1 종류 이상인 상기 G-CSF 용액 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 아미노산이 아르기닌 및 히스티딘 또는 이들 염에서 선택된 1 종류 이상인 상기 G-CSF 용액 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 아미노산이 히스티딘 또는 그 염인 상기 G-CSF 용액 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 메티오닌을 추가로 함유하는 상기 G-CSF 용액 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 아미노산의 첨가량이 0.01 중량%∼10 중량%인 상기 G-CSF 용액 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 히스티딘 또는 그 염의 첨가량이 0.01 중량%∼10 중량%인 상기 G-CSF 용액 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 만니톨 및/또는 염화나트륨을 추가로 함유하는 상기 G-CSF 용액 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 계면활성제를 추가로 함유하는 상기 G-CSF 용액 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 계면활성제가 폴리옥시에틸렌소르비탄알킬에스테르인 상기 G-CSF 용액 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 계면활성제가 폴리소르베이트 20 및/또는 80인 상기 G-CSF 용액 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 pH가 5∼7인 상기 G-CSF 용액 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 pH가 5.5∼6.8인 상기 G-CSF 용액 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 G-CSF가 CHO 세포에서 생산된 G-CSF인 상기 G-CSF 용액 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 바이알 제제 또는 프리필드 시린지 제제인 상기 G-CSF 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 40℃－2주간의 가속 시험 후의 G-CSF 잔존률이 90% 이상이고, 또는 25℃－6개월간의 안정성 시험 후의 G-CSF 잔존률이 97% 이상이고, 또는 10℃－1년간의 안전성 시험 후의 G-CSF 잔존률이 97% 이상이고, 또한 40℃－2주간의 가속 시험 후 G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체의 생성률이 1% 이하인 안정된 G-CSF 용액 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 실질적으로 G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체를 함유하지 않은 안정된 G-CSF 용액 제제를 제공한다. 여기서, 「실질적으로 G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체를 함유하지 않는다는」것은 상기 G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체가 검출 한계 이하의 것을 말한다.

또한, 본 발명은 안정화제로서 실질적으로 단백질을 첨가하지 않고, 또한 안정화제로서 1 종류 이상의 아미노산 또는 그 염을 첨가하는 것을 포함하는 G-CSF 용액 제제의 안정화 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1 종류 이상의 아미노산 또는 그 염의 안정화된 G-CSF 용액 제제의 제조를 위한 사용을 제공한다.

본 발명의 용액 제제란 제조공정에서 동결 건조의 공정을 포함하지 않고 용액 상태로 장기 보존할 수 있는 제제를 말한다.

발명을 실시하기 위한 최선의 태양

본 발명의 용액 제제에 사용되는 G-CSF는 고순도로 정제된 인간 G-CSF라면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로는 포유동물, 특히 인간의 G-CSF와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 것으로, 천연 유래의 것 및 유전자 재조합법에 의해 얻어지는 것을 포함한다. 유전자 재조합법에 의해 얻어지는 G-CSF에는 천연 G-CSF와 아미노산 배열이 동일한 것, 또는 이 아미노산 서열의 한 개 또는 복수 개를 결실, 치환, 부가한 것으로 상기 생물학적 활성을 갖는 것을 포함한다. 본 발명의 G-CSF는 어떠한 방법으로 제조된 것이어도 되고, 인간 종양세포의 세포주를 배양하여 이것으로부터 각종 방법으로 추출하여 분리 정제한 것, 또는 유전자 공학적 수법으로 대장균 등의 세균류; 이스트균; 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, C127 세포, COS 세포 등과 같은 동물 유래의 배양세포 등으로 생산시키고, 각종 방법으로 추출하여 분리 정제한 것이 사용된다. 바람직하게는 대장균, 이스트균 또는 CHO 세포에 의해 유전자 재조합법으로 생산된 것이다. 가장 바람직하게는 CHO 세포에 의해 유전자 재조합법으로 생산된 것이다. 또한, PEG 등에 의해 화학 수식된 G-CSF도 포함한다(국제 특허출원 공개번호 WO90/12874 참조).

본 발명의 G-CSF 용액 제제는 바람직하게는 안정화제로서 인간 혈청 알부민이나 정제 젤라틴 등의 단백질을 실질적으로 함유하지 않는다.

본 발명의 G-CSF 용액 제제는 안정화제로서 1 종류 이상의 아미노산 또는 그 염을 함유한다. 상기 아미노산으로는 글리신, 글루타민산나트륨, 아르기닌 및 히스티딘 또는 이들 염에서 선택된 1 종류 이상인 것이 바람직하고, 아르기닌 및 히스티딘 또는 이들 염에서 선택된 1 종류 이상인 것이 보다 바람직하며, 히스티딘 또는 그 염인 것이 가장 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 아미노산은 유리 아미노산 및 그 나트륨염, 칼륨염, 염산염 등과 같은 염을 함유한다. 본 발명의 제제에는 이들 아미노산의 D-, L- 및 DL-체를 함유하고, 보다 바람직한 것은 L-체 및 그 염이다.

본 발명의 제제에 첨가되는 아미노산의 첨가량은 사용되는 아미노산의 종류에 따라 후술하는 시험방법으로 바람직한 범위를 정할 수 있다. 일반적으로는 0.001∼10 중량%, 바람직하게는 0.01∼5 중량%이며, 보다 바람직하게는 0.1∼3 중량%이다. 히스티딘 또는 그 염의 경우에는 통상 0.01∼10 중량%, 바람직하게는 0.05∼3 중량%이며, 보다 바람직하게는 0.1∼2 중량%이다. 히스티딘 염산염의 경우에는 40℃－2주간의 가속 시험에서는 시험한 0.1∼1.6 중량% 범위에서 매우 높은 G-CSF 잔존률을 나타내고, 0.4 중량%에서 가장 높은 잔존률을 나타내었다.

본 발명의 G-CSF 용액 제제에는 메티오닌을 함유하는 것이 바람직하다. 메티오닌의 첨가량은 바람직하게는 0.001∼5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01∼1 중량%, 가장 바람직한 것은 0.1 중량%이다. 메티오닌의 첨가에 의해 G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체의 생성률을 검출 한계 이하로 하는 것이 관찰되었다. 본 발명자들은 특정 이론에 구속되는 것은 아니지만, G-CSF의 메티오닌 잔기를 대신하여 첨가된 메티오닌이 산화됨으로써, G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체의 생성률을 낮게 하는 것으로 추측하였다.

본 발명의 제제에는 등장화제로서, 폴리에틸렌글리콜; 덱스트란, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 글루코스, 프락토오스, 락토오스, 자일로오스, 만노오스, 말토오스, 슈크로오스, 라피노오스 등과 같은 당류나 염화나트륨, 염화칼륨 등과 같은 무기염류를 사용할 수 있고, 바람직하게는 만니톨 또는 염화나트륨, 특히 바람직하게는 만니톨을 사용한다. 만니톨 등의 당류의 첨가량은 제제 중에 0.1∼10 중량%, 더욱 바람직하게는 0.5∼6 중량%이다. 염화나트륨 등과 같은 무기염류의첨가량은 제제 중에 20∼200mM, 바람직하게는 50∼150mM이다.

본 발명의 제제에는 계면활성제를 추가로 함유할 수 있다. 계면활성제로는, 비이온 계면활성제, 예컨대 소르비탄모노카프릴레이트, 소르비탄모노라우레이트, 소르비탄모노팔미테이트 등과 같은 소르비탄 지방산 에스테르; 글리세린모노카프릴레이트, 글리세린모노밀리테이트, 글리세린모노스테아레이트 등과 같은 글리세린 지방산 에스테르; 데카글리세릴모노스테아레이트, 데카글리세릴디스테아레이트, 데카글리세릴모노리놀레이트 등과 같은 폴리글리세린 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄트리올레에이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄트리스테아레이트 등과 같은 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌소르비톨테트라스테아레이트, 폴리옥시에틸렌소르비톨테트라올레에이트 등과 같은 폴리옥시에틸렌소르비톨 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌글리세릴모노스테아레이트 등과 같은 폴리옥시에틸렌글리세린 지방산 에스테르; 폴리에틸렌글리콜디스테아레이트 등과 같은 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌라우릴에테르 등과 같은 폴리옥시에틸렌알킬에테르; 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌프로필에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌세틸에테르 등과 같은 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르; 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르 등과 같은 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르; 폴리옥시에틸렌피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유(폴리옥시에틸렌 수소 피마자유) 등과 같은 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유; 폴리옥시에틸렌소르비톨 밀랍 등과 같은 폴리옥시에틸렌 밀랍 유도체; 폴리옥시에틸렌라놀린 등과 같은 폴리옥시에틸렌라놀린 유도체; 폴리옥시에틸렌스테아르산 아미드 등과 같은 폴리옥시에틸렌 지방산 아미드 등의 HLB 6∼18을 갖는 것; 음이온 계면활성제, 예컨대 세틸황산나트륨, 라우릴황산나트륨, 올레일황산나트륨 등과 같은 탄소원자수 10∼18의 알킬기를 갖는 알킬황산염; 폴리옥시에틸렌라우릴황산나트륨 등과 같은 에틸렌옥시드의 평균 부가 몰수가 2∼4이며 알킬기의 탄소원자수가 10∼18인 폴리옥시에틸렌알킬에테르황산염; 라우릴술포숙신산에스테르나트륨 등과 같은 알킬기의 탄소원자수가 8∼18인 알킬술포숙신산에스테르염; 천연계 계면활성제, 예컨대 레시틴, 글리세로인지질; 스핑고미에린 등과 같은 스핑고인지질; 탄소원자수 12∼18의 지방산의 자당 지방산 에스테르 등을 전형적인 예로 들 수 있다. 본 발명의 제제에는 이들 계면활성제의 1 종류 또는 2 종류 이상을 조합하여 첨가할 수 있다.

바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르이고, 특히 바람직한 것은 폴리소르베이트 20, 21, 40, 60, 65, 80, 81, 85이며, 가장 바람직한 것은 폴리소르베이트 20 및 80이다.

본 발명의 G-CSF 함유 제제에 첨가되는 계면활성제의 첨가량은 일반적으로는 G-CSF 1 중량부에 대하여 0.0001∼10 중량부이고, 바람직하게는 G-CSF 1 중량부에 대하여 0.01∼5 중량부이며, 가장 바람직하게는 G-CSF 1 중량부에 대하여 0.2∼2 중량부이다. 구체적으로 계면활성제의 첨가량은 0.0001∼0.5 중량% 사이에서 적절하게 선택할 수 있다.

본 발명의 G-CSF 용액 제제의 pH는 바람직하게는 5∼7이고, 더 바람직하게는 pH가 5.5∼6.8이며, 더욱 바람직하게는 pH가 6∼6.7이고, 가장 바람직하게는 pH가 6.5이다.

본 발명의 G-CSF 용액 제제에는 원하는 바에 따라 추가로 희석제, 용해보조제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 황함유 환원제, 산화방지제 등을 함유할 수도 있다. 예컨대, 황함유 환원제로는, N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 티옥트산, 티오디글리콜, 티오에탄올아민, 티오글리세롤, 티오소르비톨, 티오글리콜산 및 그 염, 티오황산나트륨, 글루타티온, 그리고 탄소원자수 1∼7의 티오알칸산 등과 같은 술프히드릴기를 갖는 것 등을 들 수 있다. 또, 산화방지제로는 에리소르빈산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 아세트산토코페롤, L-아스코르브산 및 그 염, L-아스코르브산팔미테이트, L-아스코르브산스테아레이트, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 몰식자산트리아밀, 몰식자산프로필 또는 에틸렌디아민 4아세트산 2나트륨(EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등과 같은 킬레이트제를 들 수 있다. 또한, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 인산나트륨, 인산칼륨, 탄산수소나트륨 등과 같은 무기염; 시트르산나트륨, 시트르산칼륨, 아세트산나트륨 등과 같은 유기염 등의 통상 첨가되는 성분을 포함해도 된다.

본 발명의 용액 제제는 이들 성분을 인산 완충액(바람직하게는 인산 1수소나트륨-인산 2수소나트륨계) 및/또는 시트르산 완충액(바람직하게는 시트르산나트륨의 완충액) 등의 용액 제제의 분야에서 공지된 수성 완충액에 용해시켜 제조할 수있다.

본 발명의 안정화된 G-CSF 용액 제제는 통상 비경구 투여 경로에서 예컨대 주사제(피하주사, 정맥주사, 근육주사 등), 경피, 경점막, 경비, 경폐 등으로 투여되지만, 경구 투여도 가능하다.

본 발명의 G-CSF 용액 제제는 통상 밀봉, 멸균된 플라스틱 또는 유리 용기 내에 수납되어 있다. 용기는 앰플, 바이알 또는 1회용 주사기와 같은 규정 용량의 형상으로 공급할 수 있거나 또는 주사용 백 또는 병과 같은 대용량의 형상으로 공급할 수도 있다.

본 발명의 제제 중에 함유되는 G-CSF의 양은 치료해야 할 질환의 종류, 질환의 중증도, 환자의 연령 등에 따라 결정할 수 있지만, 일반적으로는 최종 투여 농도로 1∼1000㎍/mL, 바람직하게는 10∼800㎍/mL, 더욱 바람직하게는 50∼500㎍/mL이다.

본 발명의 제제는 감염증이나 암의 화학 치료에서 항생물질, 항균제, 항암제 등과 같은 약제를 투여할 때에 동시 투여하면, 환자의 저항력, 활성 등과 같은 면역 응답력에 기초한 방어기능을 개선시키는 것이 판명되어 임상적으로 매우 유용하다. 따라서, 본 발명의 제제는 이들 약제와 병용 투여할 수 있다.

본 발명의 G-CSF 용액 제제는 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이 40℃－2주간의 가속 시험 후에도 매우 양호한 G-CSF 잔존률을 나타낸다. 또, 40℃－2주간의 가속 시험 후에도 G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체의 생성률이 거의 관찰되지 않았다.

본 발명의 G-CSF 용액 제제는 40℃－2주간의 가속 시험 후의 G-CSF 잔존률이 90% 이상, 바람직하게는 93% 이상이며, 가장 바람직하게는 95% 이상이고, 또는 25℃－6개월간의 안정성 시험 후의 G-CSF 잔존률이 97% 이상이고, 또는 10℃－1년간의 안전성 시험 후의 G-CSF 잔존률이 97% 이상이고, 또한 40℃－2주간의 가속 시험 후 G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체의 생성률이 1% 이하, 바람직하게는 검출 한계 이하로서, 종래에 알려진 G-CSF 제제에 비해 매우 안정된 제제이다.

본 발명을 검토하는 중에, 용액 제제를 봉입하는 바이알, 시린지 등의 용기 조건(제조 로트간의 차이 등)에 따라서는 히스티딘을 첨가했을 때에 메티오닌 잔기 산화체가 증가되는 현상이 관찰되고, 이 현상은 특히 시린지 용기에서 현저하였다. 이 메티오닌 잔기 산화체의 생성은 메티오닌의 첨가에 의해 거의 완전히 억제되었다. 따라서, 프리필드 시린지 제제로서 공급하는 경우에는, 히스티딘 등의 아미노산과 메티오닌 또는 이미 알려진 산화방지제 등 메티오닌 잔기 산화체의 생성을 억제하는 약제를 첨가함으로써, G-CSF의 잔존률이 매우 높고 또 G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체의 생성률이 낮은 장기 안정화 제제로 할 수 있다.

본 발명을 다음 실시예로 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명의 범위는 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 기재에 기초하여 당업자는 여러가지 변경, 수식을 할 수 있고, 이들 변경, 수식도 본 발명에 포함된다.

실시예 1: 각종 아미노산의 안정성에 미치는 효과

표 1에 기재된 처방이 되도록 소정량의 아미노산, 0.01 중량% 폴리소르베이트 20을 함유하는 250㎍/mL G-CSF, pH 6.5 조제액을 무균 여과한 후, 유리 바이알에 상기 조제액을 1mL씩 무균적으로 충전하고 뚜껑을 덮었다.

피험시료 No.	G-CSF(㎍/mL)	첨가 아미노산(%)	폴리소르베이트-20(%)	pH
1	250	글리신 5	0.01	6.5
2	250	알라닌 4	0.01	6.5
3	250	프롤린 0.6	0.01	6.5
4	250	로이신 0.32	0.01	6.5
5	250	글루타민산나트륨 0.32	0.01	6.5
6	250	히드록시프롤린 0.08	0.01	6.5
7	250	아르기닌 염산염 0.4	0.01	6.5
8	250	리신 염산염 1	0.01	6.5
9	250	히스티딘 염산염 0.4	0.01	6.5

이와 같이 무균적으로 조제ㆍ여과를 실시하여 제조된 표 1에 기재된 G-CSF 제제는 40℃ 항온조에서 2주간 가속에 사용되었다. 미가속품 시료 및 40℃－2주간 가속품 시료에 대해서 다음 평가법 1을 이용하여 40℃－2주간 가속 후의 잔존률(%)을 산출하였다.

평가법 1

C4 역상 칼럼(4.6㎜×250㎜, 300 옹스트롬)을 사용하고, 순수, 아세토니트릴, 트리플루오로아세트산을 이동상으로 사용한 역상계 고속 액체 크로마토그래피법으로 G-CSF 함량을 측정하였다. G-CSF로서 5㎍ 상당량을 주입하고, 아세토니트릴의 그래디언트에 의해 G-CSF를 용출시키고, 215㎚ 파장에서 분광학적으로 검출하여 G-CSF 함량을 측정하였다.

본 방법으로 측정한 G-CSF 함량을 사용하여, 다음 식에 따라 40℃－2주간 가속 후의 잔존률(%)을 산출하였다.

잔존률 (%) = 100 ×가속품시료의 G-CSF 함량/미가속품시료의 G-CSF 함량

그 결과를 표 2에 나타내었다.

피험시료 No.	아미노산	40℃－2주간 가속 후의 잔존률(%)
1	글리신	92.3
2	알라닌	89.6
3	프롤린	87.1
4	로이신	83.7
5	글루타민산나트륨	90.2
6	히드록시프롤린	89.1
7	아르기닌 염산염	96.3
8	리신 염산염	85.5
9	히스티딘 염산염	97.0

이와 같이 글리신, 글루타민산나트륨, 아르기닌 염산염 및 히스티딘 염산염의 첨가에 의해 40℃－2주간 가속에서 양호한 잔존률이 관찰되고, 특히 아르기닌 염산염 및 히스티딘 염산염의 첨가에 의해 잔존률이 현저히 향상됨이 발견되었다.

실시예 2: 메티오닌 첨가의 G-CSF 산화체 생성에 미치는 효과

표 3에 기재된 처방이 되도록 소정량의 메티오닌, 0.01 중량% 폴리소르베이트 20을 함유하는 100㎍/mL G-CSF, pH 6.5 조제액을 무균 여과한 후, 유리 바이알에 상기 조제액을 1mL씩 무균적으로 충전하고 뚜겅을 덮었다.

피험시료 No.	G-CSF(㎍/mL)	Met(%)	폴리소르베이트-20(%)	pH
10	100	0	0.01	6.5
11	100	0.1	0.01	6.5
Met: 메티오닌

이와 같이 무균적으로 조제ㆍ여과하여 제조된 표 3에 기재된 G-CSF 제제를 25℃ 항온조에서 5일간 보존한 후, 다음 평가법 2를 이용하여 G-CSF 산화체 함량을 산출하였다.

평가법 2

C4 역상 칼럼(4.6㎜×250㎜, 300 옹스트롬)을 사용하고, 순수, 아세토니트릴, 트리플루오로아세트산을 이동상으로 사용한 역상계 고속 액체 크로마토그래피법으로 G-CSF 함량을 측정하였다. G-CSF로서 5㎍ 상당량을 주입하고, 아세토니트릴의 그래디언트에 의해 G-CSF를 용출시키고, 215㎚ 파장에서 분광학적으로 검출하여 G-CSF 산화체의 피크 면적, G-CSF 미변화체의 피크 면적을 측정하였다.

본 방법으로 측정한 각 피크 면적값을 이용하여, 다음 식에 따라 G-CSF 산화체 함량(%)를 산출하였다.

그 결과를 표 4에 나타내었다.

피험시료 No.	G-CSF(㎍/mL)	Met(%)	G-CSF 산화체 함량
10	100	0	2.7
11	100	0.1	N.D.
Met: 메티오닌N.D.: 검출하지 않음

메티오닌의 첨가에 의해 G-CSF 산화체의 생성을 억제할 수 있음을 발견하였다.

실시예 3: 히스티딘 첨가량의 안정성에 미치는 효과

표 5에 기재된 처방이 되도록 소정량의 염산히스티딘, 0.1 중량% 메티오닌, 0.01 중량% 폴리소르베이트 20을 함유하는 250㎍/mL G-CSF, pH 6.5 조제액을 무균 여과한 후, 유리 바이알에 상기 조제액을 1mL씩 무균적으로 충전하고 뚜껑을 덮었다.

피험시료 No.	G-CSF(㎍/mL)	His(%)	Met(%)	NaCl(mM)	폴리소르베이트-20(%)	pH
12	250	0	0.1	100	0.01	6.5
13	250	0.1	0.1	100	0.01	6.5
14	250	0.4	0.1	100	0.01	6.5
15	250	0.8	0.1	100	0.01	6.5
16	250	1.6	0.1	100	0.01	6.5
His: 히스티딘 염산염으로서.Met: 메티오닌NaCl: 염화나트륨

이와 같이 무균적으로 조제ㆍ여과를 실시하여 제조된 표 5에 기재된 G-CSF 제제는 40℃ 항온조에서 2주간 가속에 사용되었다. 미가속품 시료 및 40℃－2주간 가속품 시료에 대해서 상기 평가법 1을 이용하여 40℃－2주간 가속 후의 잔존률(%)을 산출하였다.

그 결과를 표 6에 나타내었다.

피험시료 No.	His(%)	40℃－2주간 가속 후의 잔존률(%)
12	0	85.5
13	0.1	97.2
14	0.4	99.1
15	0.8	97.6
16	1.6	98.1
His: 히스티딘 염산염으로서.

이와 같이 히스티딘의 첨가에 의해 비약적으로 잔존률이 향상되고, 단기 가속 시험에서의 안정성 향상이 가능해졌다.

또한, 피험시료 No.12∼16은 모두 G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체는 검출 한계 이하였다.

실시예 4: 용기 형태가 안정성에 미치는 효과

표 7에 기재된 처방이 되도록 0.4 중량% 염산히스티딘, 0.1 중량% 메티오닌, 0.01 중량% 폴리소르베이트 20을 함유하는 250㎍/mL G-CSF, pH 6.5 조제액을 무균여과한 후, 다음에 나타낸 용기 형태에 상기 조제액을 1mL씩 무균적으로 충전하고 뚜껑을 덮었다.

피험시료 No.	G-CSF(㎍/mL)	His(%)	Met(%)	NaCl(mM)	폴리소르베이트-20(%)	pH	용기형태
17	250	0	0	100	0.01	6.5	바이알
18	250	0	0	100	0.01	6.5	시린지
19	250	0.4	0.1	100	0.01	6.5	바이알
20	250	0.4	0.1	100	0.01	6.5	시린지
His: 히스티딘 염산염으로서.Met: 메티오닌NaCl: 염화나트륨시린지: Becton Dickinson사 제조의 유리 시린지(바이팩 SCF 1mL 롱)에 상기 조제액을 충전하고, Becton Dickinson사 제조의 플랜저 스토퍼(바이팩 SCF)로 밀봉하여 뚜껑을 덮은 것.바이알: 미처리 백색 유리 바이알에 상기 조제액을 충전하고 고무뚜껑을 덮은 것

이와 같이 무균적으로 조제ㆍ여과를 실시하여 제조된 표 7에 기재된 G-CSF 제제는 40℃ 항온조에서 2주간 가속에 사용되었다. 미가속품 시료 및 40℃－2주간 가속품 시료에 대해서 상기 평가법 1을 이용하여, 40℃－2주간 가속 후, 25℃－6개월 보존 후, 10℃－1년간 보존 후의 잔존률(%)을 산출하였다.

그 결과를 표 8에 나타내었다.

피험시료 No.	His(%)	용기형태	잔존률(%)
피험시료 No.	His(%)	용기형태	40℃－2주간가속후	20℃－6개월간보존후	10℃－1년간보존후
17	0	바이알	92.3	95.4	96.3
18	0	시린지	90.8	93.1	93.3
19	0.4	바이알	98.0	97.7	98.1
20	0.4	시린지	99.1	97.9	98.1

40℃에서의 단기 가속 시험뿐만 아니라 25℃ 및 10℃에서의 장기 보존 시험에서도 히스티딘의 첨가 효과는 현저하고, 히스티딘의 첨가에 의해 G-CSF 제제의장기 보존 안정성 확보가 가능함이 발견되었다. 또, 피험시료 No.19 및 20은 모두 G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체는 검출 한계 이하였다. 이들 결과에서 용기 형태에 따르지 않고 안정화된 G-CSF 제제의 제공이 가능한 것으로 보였다.

또, 본 검토 중에서 용액 제제를 봉입하는 바이알이나 시린지의 제조 로트간의 차이에 의해 히스티딘 0.4%만을 첨가했을 때에 메티오닌 잔기 산화체가 증가되는 현상이 관찰되고, 이 현상은 특히 시린지 용기에서 현저했다. 이 메티오닌 잔기 산화체의 생성은 메티오닌 0.1% 의 첨가에 의해 검출 한계 이하로 되었다.

실시예 5: 등장화제의 안정성에 미치는 효과

표 9에 기재된 처방이 되도록 소정의 등장화제(염화나트륨 또는 D-만니톨), 0.4% 중량% 염산히스티딘, 0.1 중량% 메티오닌, 0.01 중량% 폴리소르베이트 20을 함유하는 250㎍/mL G-CSF, pH 6.5 조제액을 무균 여과한 후, 유리 바이알에 상기 조제액을 1mL씩 무균적으로 충전하고 뚜껑을 덮었다.

피험시료 No.	G-CSF(㎍/mL)	His(%)	Met(%)	등장화제	폴리소르베이트-20(%)	pH
21	250	0.4	0.1	100mM NaCl	0.01	6.5
22	250	0.4	0.1	2.5% 만니톨	0.01	6.5
His: 히스티딘 염산염으로서.Met: 메티오닌NaCl: 염화나트륨

이와 같이 무균적으로 조제ㆍ여과를 실시하여 제조된 표 9에 기재된 G-CSF 제제는 40℃ 항온조에서 2주간 가속에 사용되었다. 미가속품 시료 및 40℃－2주간 가속품 시료에 대해서 상기 평가법 1을 이용하여 25℃－4개월간, 25℃－6개월간 및 10℃－1년간 보존 후의 잔존률(%)을 산출하였다.

그 결과를 표 10에 나타내었다.

피험시료 No.	등장화제	잔존률(%)
피험시료 No.	등장화제	25℃－4개월간보존 후	25℃－6개월간보존 후	10℃－1년간보존 후
21	NaCl	97.7	96.4	97.6
22	만니톨	97.4	97.1	96.7

또, 피험시료 No.21 및 22는 모두 G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체는 검출 한계 이하였다.

이상과 같은 결과에서 등장화제의 종류에 따르지 않고, 양호한 안정성 확보가 가능함이 판명되었다.

본 발명의 G-CSF 용액 제제는 단기 가속 시험 후에나 장기 보존 후에도 등장화제의 종류나 용기 형태에 관계없이, G-CSF의 잔존률이 매우 높고, 또한 G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체의 생성률을 거의 완전히 억제할 수 있는 안정된 제제이다.

Claims

안정화제로서 실질적으로 단백질을 함유하지 않고, 또한 안정화제로서 1 종류 이상의 아미노산 또는 그 염을 함유하는 G-CSF 용액 제제.
제 1 항에 있어서, 아미노산이 글리신, 글루타민산나트륨, 아르기닌 및 히스티딘 또는 이들 염에서 선택된 1 종류 이상인 G-CSF 용액 제제.
제 2 항에 있어서, 아미노산이 아르기닌 및 히스티딘 또는 이들 염에서 선택된 1 종류 이상인 G-CSF 용액 제제.
제 3 항에 있어서, 아미노산이 히스티딘 또는 그 염인 G-CSF 용액 제제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 메티오닌을 추가로 함유하는 G-CSF 용액 제제.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산의 첨가량이 0.01 중량% 내지 10 중량%인 G-CSF 용액 제제.
제 6 항에 있어서, 히스티딘 또는 그 염의 첨가량이 0.01 중량% 내지 10 중량%인 G-CSF 용액 제제.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 만니톨 및/또는 염화나트륨을 추가로 함유하는 G-CSF 용액 제제.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제를 추가로 함유하는 G-CSF 용액 제제.
제 9 항에 있어서, 계면활성제가 폴리옥시에틸렌소르비탄알킬에스테르인 G-CSF 용액 제제.
제 10 항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 20 및/또는 80인 G-CSF 용액 제제.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 5 내지 7인 G-CSF 용액 제제.
제 12 항에 있어서, pH가 5.5 내지 6.8인 G-CSF 용액 제제.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, G-CSF가 CHO 세포에서 생산된 G-CSF인 G-CSF 용액 제제.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이알 제제 또는 프리필드 시린지 제제인 G-CSF 제제.
제 15 항에 있어서, 프리필드 시린지 제제인 G-CSF 제제.
40℃－2주간의 가속 시험 후의 G-CSF 잔존률이 90% 이상이고, 또는 25℃－6개월간의 안정성 시험 후의 G-CSF 잔존률이 97% 이상이고, 또는 10℃－1년간의 안전성 시험 후의 G-CSF 잔존률이 97% 이상이고, 또한 40℃－2주간의 가속 시험 후 G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체의 생성률이 1% 이하인, 안정된 G-CSF 용액 제제.
실질적으로 G-CSF의 메티오닌 잔기 산화체를 함유하지 않은 안정된 G-CSF 용액 제제.
안정화제로서 실질적으로 단백질을 첨가하지 않고, 또한 안정화제로서 1 종류 이상의 아미노산 또는 그 염을 첨가하는 것을 포함하는 G-CSF 용액 제제의 안정화 방법.
1 종류 이상의 아미노산 또는 그 염의 안정화된 G-CSF 용액 제제의 제조를위한 사용.