MXPA02005105A - Formulacion en solucion acuosa de alfa-interferon. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a una formulacion en solucion acuosa de que puede retener la actividad biologica y las propiedades fisicoquimicas de a-interferon durante un largo periodo; muy particularmente, la presente invencion se refiere a una formulacion en solucion acuosa de alfa-interferon que comprende alfa-interferon; un estabilizador; un agente de regulacion de presion osmotica; conservadores antimicrobianos seleccionados del grupo que consiste de fenol, m-cresol o mezclas de los mismos; y un sistema regulador de pH; la formulacion en solucion acuosa de la presente invencion tiene muchas ventajas ya que retiene la actividad del alfa-interferon durante un periodo largo, elimina dano potencial al cuerpo humano al reducir al minimo la cantidad de conservadores y es muy estable.

Description

FORMULACIÓN EN SOLUCIÓN ACUOSA DE ALFA-INTERFERON CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una formulación en solución acuosa de a-interferón (a-IFN), que no contiene albúmina de suero humano.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA ANTERIOR La mayoría de las proteínas fácilmente se desnaturalizan o pierden actividad biológica en solución acuosa. Por esa razón, muchas compañías farmacéuticas han desarrollado formulaciones secadas por congelamiento para mejorar la estabilidad de los productos de fármacos de proteína. Sin embargo, la formulación secada por congelamiento de los fármacos de proteína tienen muchos inconvenientes. Puesto que el procedimiento de secado por congelamiento es costoso y requiere un paso de reconstitución adicional de fármaco de proteína antes de administrar el fármaco al paciente, no es preferible para formulación líquida en términos de economía o conveniencia. Estos puntos se han considerado en el desarrollo de formulaciones de a-IFN. El interferón (IFN) juega un papel en el crecimiento, diferenciación y función de las células normales o tumorales y es una de las proteínas citosina que inhiben la multiplicación de una variedad de virus.

Específicamente, IFN controla la actividad de células asesinas naturales (NK), incrementa la actividad de linfocitos T citotóxicos e incrementa la actividad de los macrófagos. Por lo tanto, IFN finalmente es mediador de la reacción inmune de las células infectadas por virus, etc. IFN se puede categorizar en , ß y ?, dependiendo de los tipos de las células secretoras o materiales inductores. Entre ellos, las formas a y ß son estables incluso a un pH de 2, pero la forma ? es no estable bajo condiciones acidas. Entre las tres formas, a-interferón se ha usado como agente antiviral durante mucho tiempo ya que es altamente efectivo en el tratamiento de enfermedades virales incluyendo hepatitis C. Por lo tanto, muchos investigadores han hecho esfuerzos continuos para desarrollar formulaciones que puedan conservar la actividad de a-interferón durante un periodo más largo. La patente de E.U.A. 4496537 se refiere a una fórmula de liofilización de a-interferón que contiene alanina (o glicina) y albúmina de suero humano como un estabilizador y un sistema regulador de pH para mantener el pH en ia solución de 6.5 a 8.0. También, la patente de E.U.A. 4847079 se refiere a una formulación acuosa de a-interferón que contiene albúmina de suero humano, glicina, timerosal y un sistema regulador de pH para mantener el pH a 6.5 a 8.0. De manera interesante, ambas patentes antes mencionadas se caracterizan porque las formulaciones contienen albúmina de suero humano que es efectiva para retener la actividad biológica de a-interferón. Sin embargo, cuando la formulación contiene albúmina de suero humano, la posibilidad de que la formulación sea potencialmente contaminada por patógenos infecciosos tales como virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y virus de hepatitis B (VHB) es alta. Por lo tanto, recientemente, no se recomienda usar albúmina de suero humano. También, se sabe que la albúmina anterior puede inducir reacciones inmunes en algunas personas. La patente europea 0736303A2 describe una formulación de a-interferón acuosa que contiene polisorbato como un estabilizador y alcohol bencílico como un conservador antimicrobiano y que tiene un sistema regulador de pH para mantener el pH en la escala de 4.5 ~ 5.5. En la patente anterior, el polisorbato, que es seguro, se utiliza en lugar de albúmina de suero humano potencialmente dañina. Sin embargo, se sabe que la actividad antimicrobiana de alcohol bencílico se reduce cuando se usa con agente tensioactivo no iónico tal como polisorbato 80. De hecho, se ha descubierto que no es aceptable para usar polisorbato 80 con alcohol bencílico (Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association, 1986, p18). Por lo tanto, una cantidad relativamente grande de alcohol bencílico (0.9, 1.0%) se debe usar para mantener la actividad antimicrobiana. Dicho uso excesivo de alcohol bencílico, sin embargo, puede causar la agregación de péptidos (Richard L. Remmele et al., Pharmaceutical Research, Vol. 15, No. 2, 1998). También, de acuerdo con la prueba acelerada de la formulación de a-interferón a 40°C observada por los inventores de la presente invención, la formulación líquida que contiene 1.0% de alcohol bencílico y 0.02% de polisorbato 80 tuvo una actividad mucho menor de a-interferón que la formulación que contenía fenol (o m-cresol) y 0.02% de polisorbato 80. WO 96/11018 se refiere a una formulación de solución acuosa que contiene polisorbato y una agente quelatador tal como EDTA de disodio, y un conservador. Sin embargo, la formulación líquida anterior es potencialmente dañina ya que comprende EDTA de disodio que se sabe que es citotóxico (Paula Saarien-Savolainen et al., Pharmaceutical Research, Vol. 15, No. 2, 1998) y tiene otro problema debido a que puede formar un complejo quelatador con el ion calcio dentro del cuerpo humano. También, se sabe que el citrato que se menciona como otro agente quelatador en la patente anterior, ocasiona dolor severo cuando se administra al cuerpo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Para resolver los problemas antes mencionados, los inventores de la presente invención han estudiado desarrollar una formulación en solución acuosa de a-interferón que retenga la actividad biológica de a-interferón durante un largo periodo y sea muy estable, y que no contenga albúmina de suero humano potencialmente dañina ni agente quelatador. Los inventores de la presente han logrado la presente invención desarrollando una formulación en solución acuosa de a-interferón, que puede retener la actividad biológica de a-interferón durante un periodo largo y reduce al mínimo la cantidad de conservador usando polisorbato como un estabilizador y fenol, m-cresol o mezclas de los mismos como un conservador antimicrobiano. Un objeto de la presente invención es proveer una formulación en solución acuosa estable de a-interferón, que puede retener la actividad biológica y la estabilidad fisicoquímica durante un periodo largo y puede satisfacer los criterios de aceptación prescritos en la prueba de eficacia antimicrobiana de conservación antimicrobiana requerida por la farmacopea europea aun cuando contiene sólo una cantidad muy pequeña de conservadores. También, otro objeto de la presente invención es proveer una formulación en solución acuosa segura de a-interferón, que retiene actividades antimicrobianas sin materiales potencialmente dañinos para el cuerpo humano tales como albúmina de suero humano o agentes quelatadores. La presente invención provee una formulación en solución acuosa de a-interferón que comprende a-interferón; un estabilizador; un agente de regulación de presión osmótica; conservadores antimicrobianos seleccionados del grupo que consiste de fenol, m-cresol o mezclas de los mismos; y un sistema regulador de pH. De acuerdo con la presente invención, se provee una formulación en solución acuosa estable de a-interferón. También, se provee una formulación en solución acuosa segura de a-interferón. Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor con referencia a la siguiente descripción y reivindicaciones anexas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una gráfica que muestra el efecto del estabilizador sobre la actividad biológica de a-interferón (a-IFN) cuando la formulación en solución acuosa de la presente invención se almacena durante 4 meses a 4°C. La figura 2a es una gráfica que muestra el efecto de los conservadores antimicrobianos sobre la estabilidad de la formulación en solución acuosa de a-IFN (6 x 106 Ul/ml) midiendo la actividad biológica de a-IFN cuando la formulación en solución acuosa de la presente invención se almacena durante 36 semanas a 4°C. La flgura 2b es una gráfica que muestra el efecto de los conservadores antimicrobianos sobre la estabilidad de la formulación en solución acuosa de a-IFN (6 x 106 Ul/ml) midiendo la actividad biológica de a-IFN cuando la formulación en solución acuosa de la presente invención se almacena durante 16 semanas a 40°C. La figura 3a es una gráfica que muestra el efecto del pH sobre la estabilidad de la formulación en solución acuosa de a-IFN (6 x 106 Ul/ml) midiendo la actividad biológica de a-IFN cuando la formulación en solución acuosa de la presente invención se almacena durante 12 semanas a 40°C.

La figura 3b es una fotografía que muestra el efecto del pH sobre la dimerización de a-IFN determinada mediante tinción con plata del gel electroforizado con gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida después de almacenamiento durante 12 semanas a 40°C. Las figuras 4a, 4b y 4c son gráficas que muestran las diferencias en las actividades biológicas entre formulaciones que comprenden una mezcla de 0.15% de fenol y 0.1 % de m-cresol, y formulaciones que comprenden 0.3% de fenol solo como un conservador antimicrobiano cuando las formulaciones en solución acuosa de a-IFN (6 x 106 Ul/ml) se almacenan durante 12 semanas a 12°C, 25°C y 40°C, respectivamente. Las figuras 4d, 4e y 4f son gráficas que muestran ias diferencias en la pureza determinada por cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa (CLAR-FI) entre formulaciones que comprenden una mezcla de 0.15% de fenol y 0.1 % de m-cresol, y formulaciones que comprenden 0.3% de fenol solo como un conservador antimicrobiano cuando las formulaciones en solución acuosa de a-IFN (6 x 106 Ul/ml) se almacenan durante 12 semanas a 4°C, 25°C y 40°C, respectivamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Para lograr los conceptos anteriores, la presente invención provee una formulación en solución acuosa de a-interferón que comprende a-interferón; un estabilizador; un agente regulador de presión osmótica; conservadores antimicrobianos seleccionados del grupo que consiste de fenol, m-cresol o mezcla de los mismos; y un sistema regulador de pH. El término "a-interferón" en la presente invención incluye todos los tipos de a-interferones que se expresan y purifican en bacterias recombinantes, levaduras y células animales. Es decir, el término "a-interferón" como se usa aquí, incluye a-interferón natural y recombinante. También, los análogos o variantes de a-interferón, en donde los aminoácidos de a-interferón humano natural son parcialmente sustituidos aunque más del 50% de la actividad de a-interferón humano natural es retenida, se pueden incluir en la formulación en solución acuosa de la presente invención. La cantidad de a-interferón añadida en la formulación en solución acuosa de la presente invención está preferiblemente en el intervalo de 1 x 106 Ul/ml ~ 1 x 108 Ul/ml. El estabilizador que ayuda a mantener la estabilidad del a-interferón en la formulación en solución acuosa de la presente invención es preferiblemente polisorbato 80, y la concentración de polisorbato 80 está preferiblemente en el intervalo de 0.01 ~ 0.05 p/v %. También, la formulación en solución acuosa de la presente invención comprende conservadores que incluyen fenol y/o m-cresol para inhibir el crecimiento de microorganismos. La concentración de fenol preferible está en el intervalo de 0J ~ 0.3 p/v %, ia concentración de m-cresol preferible está en el intervalo de 0J ~ 0.2 p/v %, y la mezcla apropiada de fenol y m- cresol también se puede incluir en las formulaciones en solución acuosa de la presente invención. El sistema regulador de pH en la formulación en solución acuosa de ia presente invención incluye solución reguladora de pH de acetato o solución reguladora de pH de fosfato. Muy particularmente, un sistema regulador de pH consta de acetato de amonio y ácido acético, o un sistema regulador de pH consta de fosfato monoácido de sodio (Na2HP0 ) y fosfato diácido de sodio (NaH2P04) es preferible. También, la concentración del sistema regulador de pH anterior en la formulación en solución acuosa de la presente invención está preferiblemente en el intervalo de 5 ~ 20 mM. El pH de la formulación en solución acuosa de la presente invención depende de ios sistemas reguladores de pH anteriores. El pH de la formulación en solución acuosa de la presente invención está en el intervalo de 4.0 ~ 8.0 en la mayoría de los casos y preferiblemente en el intervalo de 4.5 ~ 6.0. La formulación en solución acuosa de la presente invención también puede incluir un agente regulador de presión osmótica tal como cloruro de sodio. La cantidad de agente regulador de presión osmótica depende de otros componentes en la formulación. Por último, la formulación en solución acuosa de la presente invención se prepara bajo condiciones asépticas. En la presente invención, a fin de buscar estabilizadores preferibles, ias formulaciones en solución acuosa que comprenden varios excipientes útiles para las formulaciones inyectables a varias concentraciones se han preparado, y el efecto del estabilizador sobre la actividad biológica del a-interferón se ha estudiado. Los resultados después del almacenamiento durante 4 meses a 4°C mostró que las actividades de las formulaciones en solución acuosa que comprenden albúmina de suero humano, polisorbato 80, polietilenglicol o gelatina, respectivamente, como un estabilizador fueron más de 90% de la actividad biológica inicial antes del almacenamiento mientras que la actividad de la formulación en solución acuosa que comprendía únicamente a-interferón y un sistema regulador de pH fue aproximadamente 80% de la actividad biológica inicial antes del almacenamiento. Es probable debido a que los estabilizadores anteriores evitan la adsorción de a-interferón sobre la superficie de un frasco. El uso de albúmina de suero humano y gelatina, sin embargo, no se recomienda recientemente debido a las crecientes preocupaciones acerca de la contaminación potencial de virus adventicios como VIH, VHB, etc. Además, puede ser inmunogénico para ciertas personas. Por lo tanto, el polisorbato 80 se selecciona como el estabilziador más adecuado en la presente invención. También, los inventores de la presente han estudiado el efecto de las concentraciones de polisorbato 80 y conservadores antimicrobianos sobre la apariencia de las formulaciones en solución acuosa. Como resultado, el polisorbato en el intervalo de 0.01 ~ 0.12% no afectó el aclaramiento de las formulaciones en solución acuosa. Sin embargo, las formulaciones en solución acuosa se volvieron turbias si se usaba más de 0.15% de m-cresol, y el grado de turbidez fue proporcional a la concentración de m-cresol. Cuando se uso fenol como un conservador antimicrobiano, el fenol en el Intervalo de 0.1 ~ 0.3% no afectó el aclaramiento de las formulaciones en solución acuosa, sino que las formulaciones en solución acuosa se volvieron turbias si se usaba más de 0.3% de fenol. Aunque la formulación en solución acuosa que comprende fenol tiene una capacidad un poco mayor para retener la actividad biológica que la formulación en solución acuosa que comprende m-cresol o alcohol bencílico, la diferencia no es grande. Sin embargo, en el caso en ei que la formulación en solución acuosa se almacenó a una temperatura alta de 40°C, la actividad biológica de la formulación en solución acuosa que comprendía alcohol bencílico disminuyó en gran medida. La actividad biológica así como la dimerización de a-interferón es influenciada por el pH. La actividad biológica de a-interferón es relativamente estable a aproximadamente un pH de 5.8 y la dimerización fue más frecuente a un pH superior. Por lo tanto, no es preferible tener un pH alto para almacenamiento a largo plazo de la formulación en solución acuosa de a-interferón. También, los inventores de la presente han investigado los efectos de preservación antimicrobiana de las formulaciones en solución acuosa que comprende una variedad de composiciones y concentraciones de conservadores de acuerdo con el protocolo para probar la eficacia de la preparación antimicrobiana en la farmacopea europea (European Pharmacopoeia 1997, 5.1.3 Efficacy of Antimicrobial Preparation). El protocolo completo para probar la eficacia de la preparación antimicrobiana en la farmacopea europea se describe en el ejemplo de referencia 3, y como sigue en breve. Cinco especies de cepas estándares que se describe para usarse en esta prueba (cepas estándares en bacterias gram positivas y gram negativas y géneros de hongos) fueron inoculadas artificialmente a la concentración de 105 a 106 células por 1 mi de la formulación en solución acuosa. A intervalos de tiempo determinados, una porción de las formulaciones se muestreó y el grado de cambios en el número de células viables se transformó logarítmicamente. Los valores logarítmicamente transformados a mayores(valores de reducción Log) se compararon con los valores en el cuadro 5.1.3-1 de la farmacopea europea para estimar el nivel de actividad antimicrobiana, la clasificación entre las categoría A y B descritas en la farmacopea europea se puede lograr a partir de la diferencia en los valores de reducción log de los microorganismos de interés en el curso del tiempo. En el caso de las bacterias, la categoría A prescribe que 2 reducciones log dentro de 6 horas y 3 reducciones log en el número de microorganismos viables contra el valor obtenido en el inoculo dentro de 24 horas debe ocurrir, y la categoría B prescribe que 1 reducción log dentro de 24 horas y 3 reducciones log dentro de 7 días a partir de la inoculación debe ocurrir. De manera similar, en el caso de los hongos, la categoría A prescribe que 2 reducciones log dentro de 7 días deben ocurrir, y la categoría B prescribe que 1 reducción log dentro de 14 días deberá ocurrir. También, después del tiempo prescrito anterior, no se debe observar recuperación o incremento en el número de microorganismos viables. Los valores de reducción log anteriormente descritos para cada categoría se aplican a formulaciones inyectables y gotas para los ojos, y la formulación en solución acuosa de a-interferón de la presente invención cae bajo esta prescripción. Por lo tanto, preparando varias formulaciones en solución acuosa de a-interferón que comprenden diferentes conservadores y estimando la actividad antimicrobiana relativa al realizar la prueba de eficacia antimicrobiana contra 5 especies de cepas estándares, los inventores de la presente han intentado determinar la mejor formulación. Como resultado, tanto la formulación que comprende 0.2% de fenol y 0.1 % de m-cresol como la formulación que comprende 0.15% de fenol y 0.1 % de m-cresol satisficieron las categorías A y B en la farmacopea europea contra Aspergillus Níger, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Sin embargo, en el caso de la formulación que comprendía 0.15% de fenol y 0.1 % de m-cresol, las cantidades totales de conservadores son de 0.25% de la formulación. Por lo tanto, la formulación que comprendía 0.15% de fenol y 0.1 % de m-cresol es una formulación más preferible en términos de seguridad, ya que tiene la más baja cantidad de conservadores. Las versiones anteriormente descritas de la presente invención tienen muchas ventajas, incluyendo proveer una formulación en solución acuosa estable de a-interferón que puede retener la actividad biológica de a- interferón durante un periodo más largo para evitar la adsorción de a-interferón sobre la superficie de un frasco; proveer una formulación en solución acuosa de a-interferón en la cual la actividad biológica así como la actividad antimicrobiana de a-interferón pueda ser retenida reduciendo al mínimo la cantidad de consevadores; proveer una formulación en solución acuosa más segura de a-interferón con una cantidad mínima de conservadores debido a que se sabe que el uso de una gran cantidad de conservadores es perjudicial para el cuerpo humano; proveer una formulación en solución acuosa de a-interferón que no contenga material potencialmente dañino ai cuerpo humano tal como albúmina de suero humano o agentes quelatadores; y proveer una formulación en solución acuosa de a-interferón que sea muy estable. La invención se ilustrará además mediante los siguientes ejemplos. Será evidente para los expertos en la técnica que esos ejemplos se dan sólo para ilustrar la presente invención con más detalle, pero la invención no está limitada a los ejemplos dados.

EJEMPLO DE REFERENCIA 1 Preparación de a-IFN recombinante purificado a-interferón purificado para el estudio de formulación se preparó mediante el procedimiento de producción de sustancia activa de Intermax-a™ (Interferón-a 2a, LG Chemical LTD). Después de que Saccharomyces cerevisiae que contenía una inserción de gen de a-interferón humano (Saccharomyces cerevisiae pYLBC A/G af a-IFN; Depósito No. KCTC 0051 BP en el depósito coreano para cultivos tipo del Instituto Coreano de Investigación de Biociencia y Biotecnología depositado el 2 de julio de 1992) se fermentó, el a-interferón con una pureza por cromatografía de fase inversa mayor que 95% se obtuvo a través de varios pasos de purificación incluyendo cromatografía de intercambio de iones y cromatografía de filtración de gel. Para más detalles favor de referirse a la solicitud de patente coreana No. 1992-25912, presentada el 28 de diciembre de 1992, titulada "Purification process of a-¡nterferón expressed ¡n recombinant yeast" ahora patente coreana No. 111251 , que se incorpora aquí por referencia EJEMPLO DE REFERENCIA 2 Preparación de la formulación en solución acuosa de a-interferón y estimación de la actividad biológica de la misma Se prepararon formulaciones en solución acuosa de a-interferón que tenían la siguiente composición: a-interferón: 1 x 106 Ul/ml ~ 100 x 106 Ul/ml; Polisorbato 80: 0.1 ~ 0.5 mg/ml; Fenol: 1.5 mg/ml; m-cresol: 1.0 mg/ml; y un sistema regulador de pH que comprendía 10 mM de solución reguladora de pH de acetato o 10 mM de solución reguladora de pH de fosfato. La actividad biológica de la formulación en solución acuosa de a-interferón como se preparó antes se probó de acuerdo con los procedimientos prescritos en la monografía 1997:1110 'Interferon alfa-2 concentrated solution' de la farmacopea europea. En otras palabras, el efecto protector de células de la formulación en solución acuosa de a-interferón contra la infección celular por virus se midió para calcular las unidades internacionales (U.l.) comparando con la del interferón a-2 humano recombinante estándar (IFN a-2) o estándar de trabajo interno. Bajo la condición de cultivo de 37°C y 5% de C02, se cultivaron -élulas de MDBK (células de riñon de bovino Madin-Derby: ATCC No. CCL22) en placas de microtitulación para formar una monocapa de células. Después, más de 3 concentraciones diferentes de muestra de prueba de a-interferón y estándar de trabajo de a-interferón que se calibraron con el estándar de a-interferón humano recombinante de NiH (número de catálogo: Gxa 01-901-535, E.U.A.) se añadieron a las placas de microtitulación y se cultivaron. Una serie de placas de microtitulación contenían células que no se trataron con a-interferón, respectivamente, y se usaron como controles negativos. Después de cultivar durante 18 - 24 horas bajo la condición de cultivo de 37°C y 5% de CO2, la solución de a-interferón tratada se desechó y el virus de estomatitis vesicular citopática (ATCC No. VR-158) se añadió a los pozos de todas las placas excepto para los controles. Después de cultivar durante 24 ~ 48 horas, las placas de microtitulación se tiñeron con cristal violeta y se secaron en aire. Después de añadirse etilenglicol a cada pozo, para extraer los colorantes de tinción, se midió la absorbancia a 600 nm usando un espectrofotómetro de microplaca. Los valores de absorbancia de soluciones estándares y de prueba se graficaron con respecto a la dosis de a-interferón para hacer una relación lineal. Después, los títulos de las soluciones de prueba se calcularon mediante comparación usando un método de análisis de línea paralela.

EJEMPLO DE REFERENCIA 3 Prueba de eficacia antimicrobiana de la formulación en solución acuosa de a-interferón Cinco especies de cepas estándares usadas en la prueba fueron las siguientes. Dos especies de cepas de hongos, Aspergillus niger (ATCC 16404) y Candida albicans (ATCC 10231 ) y tres especies de cepas de bacterias Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Staphylococcus aereus (ATCC 6538) y Escherichia coli (ATCC 8739) se usaron. Se uso agar B (15 g/l de Casitone, 5 g/l de Soytone, 5 g/l de NaCI, 18 g/l de agar, pH 7.3 ± 0.2) para cultivo sólido de bacterias, y se uso agar C (10 g/l de Peptona, 40 g/l de glucosa, 15 g/l de agar, pH 5.6± 0.2) para cultivo sólido de hongos. Las bacterias se cultivaron a 30 ~ 35°C durante 18 ~ 24 horas y los hongos se cultivaron a 20 ~ 25°C durante 24 ~ 48 horas en el caso de Candida albicans y durante 2 ~ 7 días en el caso de Aspergillus niger. En el caso de Aspergillus, esporas negras formadas después del cultivo de aproximadamente 5 días se recogieron y se usaron para laprueba en lugar de hongos. A fin de inocular directamente cepas estándares en un recipiente que contenía la formulación en solución acuosa de prueba de a-interferón con la concentración 105 a 106 células (esporas en el caso de Aspergillus) /ml de cepas estándares, la concentración de células antes de la inoculación se diluyó a 107 a 108 células (o esporas) /ml con regulador de pH de dilución, y después la suspensión de células diluida se añadió a la formulación en solución acuosa de tal manera que la cantidad de la suspensión de células añadida es de 1 (v/v) % de la formulación en solución acuosa. Como regulador de pH de dilución, se uso un regulador de pH de dilución A (9 g/l de NaCI, 1 g/l de Peptona) para bacterias y Candida, y un regulador de pH B (9 g/I de NaCI, 0.5 g/l de polisorbato 80) se uso para Aspergillus. Después de que las suspensiones de cepas estándares se inocularon a las formulaciones en solución acuosa de prueba, cada 0.1 ~ 0.5 mi de las formulaciones de prueba se muestrearon a 0 horas, 6 horas, 24 horas, 7 días, 14 días y 28 días, respectivamente, y las soluciones muestreadas se diluyeron en 1 a 103 veces usando reguladores de pH de dilución. Después, las muestras diluidas se midieron sobre un medio sólido de agar y se cultivaron a las temperaturas de cultivo como se describió anteriormente. El número de células viables por 1 mi de la muestra se calculó contando el número de colonias formadas del cultivo sólido. Mientras tanto, las formulaciones en solución acuosa de prueba se almacenaron en una incubadora a 20 ~ 25 °C inmediatamente después del muestreo. Como el método para estimar el número de células viables y el medio para la prueba, se usaron aquellos descritos en la farmacopea europea (E.P 1997, 2.6.12).

EJEMPLO 1 Búsqueda de estabilizadores preferibles El siguiente experimento se realizó para buscar estabilizadores preferibles que retuvieran la actividad biológca de a-interferón evitando la adsorción de a-interferón sobre la superficie de un frasco. Primero, formulaciones en solución acuosa que comprendían varios excipientes útiles para formulaciones inyectables a varias concentraciones se prepararon como se describe en el cuadro 1 , y se añadió cloruro de sodio para ajustar la tonicidad. Cada formulación en solución acuosa se almacenó durante 4 meses a 4°C para estimar la actividad biológica de a-interferón en cada formulación de acuerdo con el método descrito en el ejemplo de referencia 2. Los resultados se muestran en la figura 1 y cuadro 1 siguientes. La figura 1 es una gráfica que muestra la actividad biológica relativa (%) de a-interferón con respecto a la actividad biológica completa de la formulación en solución acuosa que contenía 9 x 106 Ul/ml de a-interferón.

CUADRO 1 Prueba de almacenamiento de tiempo real a 4°C * Actividad biológica completa de a-interferón: 9 x 106 Ul/ml (unidad: x 106 Ul/ml) Las formulaciones de control negativo que comprenden sólo a-interferón y sistema regulador de pH, retuvieron aproximadamente 80% de la actividad biológica completa inicial. Por otra parte, la formulación en solución acuosa que comprendía albúmina de suero humano, poiisorbato 80, polietilenglicol o gelatina retuvo más de 90% de la actividad biológica completa inicial. Es probable que la adsorción de a-interferón sobre la superficie de un frasco se evite con los aditivos anteriores. Aunque los aditivos anteriores contribuyen a retener la actividad biológica de a-interferón, el uso de albúmina de suero humano y gelatina es restringido para las formulaciones inyectables debido a los problemas de contaminación potenciales por los virus adventicios. Por lo tanto, el polisorbato 80 es el estabilizador más adecuado.

EJEMPLO 2 Efecto de las concentraciones de polisorbato 80 y conservadores antimicrobianos sobre la apariencia de las formulaciones en solución acuosa Como un experimento preliminar para la selección inicial de la formulación en solución acuosa de a-interferón, el efecto de las concentraciones de polisorbato 80 y conservadores antimicrobianos sobre la apariencia de las formulaciones en solución acuosa se investigó. 100 mililitros de las formulaciones en solución acuosa de a-interferón que comprendían polisorbato 80 y conservadores antimicrobianos incluyendo fenol, m-cresol o mezclas de los mismos a varias concentraciones se prepararon. Después, la tonicidad y el pH de cada formulación se ajustó usando 0.8% de cloruro de sodio y 10 mM de regulador de pH de acetato de amonio, respectivamente. El pH de cada formulación se ajustó a 5.3. El color y turbidez de formulaciones en solución acuosa anteriores que comprendían polisorbato 80 y los conservadores antimicrobianos a varias concentraciones se observaron visualmente. Los resultados se muestran en el cuadro 2.

CUADRO 2 Cambios en la apariencia de las formulaciones en solución acuosa de a- interferón dependiendo de las concentraciones de polisorbato 80 y conservadores antimicrobianos Cuando se uso más de 0.15% de m-cresol, las formulaciones en solución acuosa se volvieron turbias y el grado de turbidez fue proporcional a la concentración de m-cresol. En el caso de fenol, el intervalo de concentración que no hizo turbias las formulaciones en solución acuosa fue 0.1 ~ 0.3%, y las formulaciones en solución acuosa se volvieron turbias cuando se añadió más de 0.3% de fenol. Los resultados de prueba anteriores son similares a la concentración de 0.01 % y a la concentración de 0.02% de polisorbato 80.

EJEMPLO 3 Efecto de conservadores antimicrobianos sobre la actividad biológica de a-interferón El pH de formulación en solución acuosa se controló a 4.5 -5.5 usando regulador de pH de acetato de amonio, y la tonicidad de la formulación en solución acuosa se ajustó añadiendo cloruro de sodio. La concentración de a-interferón se ajustó a 6 x 106 Ul/ml para todas las formulaciones en solución acuosa, la temperatura de almacenamiento fue a 4°C o 40°C. Durante el periodo de almacenamiento, los cambios en la actividad biológica de a-interferón se midieron usando el método descrito en el ejemplo de referencia 2. El cuadro 3 y la figura 2a siguientes muestran los resultados de la prueba de actividad biológica de la formulación en solución acuosa almacenada a 4°C, y el cuadro 4 y la figura 2b siguientes muestran el resultado a 40°C.

CUADRO 3 Cambios en la actividad biológica de a-interferón durante el almacenamiento de la formujación en solución acuosa gue comprende una variedad de conservadores antimicrobianos a 4°C CUADRO 4 Cambios en la actividad biológica de a-interferón durante el almacenamiento de la formulación en solución acuosa gue comprende una variedad de conservadores antimicrobianos a 40°C * En los cuadros 3 y 4, el valor superior es la actividad biológica absoluta de a-interferón, y el valor inferior es la actividad biológica relativa (%) de a-interferón con respecto a la actividad biológica de a-interferón en tiempo 0. Como se muestra en el cuadro 3 y la figura 2a, aunque la formulación en solución acuosa que comprende fenol y la capacidad ligeramente mayor para retener la actividad biológica que otras formulaciones en solución acuosa, la diferencia no fue grande. Sin embargo, en el caso del almacenamiento a 40°C, la actividad biológica de la formulación en solución acuosa que comprendía alcohol bencílico disminuyó en gran medida en comparación con otras formulaciones eh solución acuosa (refiérase a cuadro 4 figura 2b).

EJEMPLO 4 Efecto del pH sobre la actividad biológica y dimerización de a-interferón Las formulaciones en solución acuosa que comprendían 6 x 106 Ul/ml de a-interferón, 0.15% de m-cresol y 10 mM de regulador de pH de acetato de amonio se prepararon. El pH de cada formulación en solución acuosa se controló a 5.3, 5.8 y 6.3 respectivamente. Las formulaciones en solución acuosa preparadas se almacenaron a 40°C durante 12 semanas, y la actividad biológica de cada formulación en solución acuosa se midió a intervalos de tiempo apropiados. Los resultados se muestran en el cuadro 5 y la figura 3a siguientes.

CUADRO 5 Efecto del pH sobre la actividad biológica de a-interferón durante el almacenamiento de la formulación en solución acuosa a 40°C Después de 12 semanas, la ocurrencia y grado de dimerización se midieron por SDS-PAGE al 14% (electroforesis de gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida) (sistema regulador de pH discontinuo, gel de separación; 14%, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, gel de apilamiento; 0.5%; 0.125M Tris-HCL, pH 6.8) bajo condiciones no reductoras seguidas por tinción con plata. Primero, después de preparar 14% de gel de separación solidificado entre 2 piezas de placas de vidrio, 5% de solución de gel de apilamiento se preparó y se vació en el gel de separación y después se insertó un peine. Después de que el gel de apilamiento se solidificó por completo, el peine se removió, y cada pozo formado se lavó con regulador de pH en flujo (regulador de pH de Tris-glicina, pH 8.3). A 100 µl de la formulación en solución acuosa anterior, se añadieron 50 µl de regulador de pH de muestra 3 veces concentrada (0.186 M de Tris, 3% de SDS, 30 v/v% de glicerol, 0.009% de azul de bromofenol, pH 6.8) y se mezcló bien. Después, la mezcla se hirvió en un baño de agua a ebullición durante 2 minutos y se enfrió en un baño frío. 50 µl de esta muestra y 10 µl de marcador de peso molecular (marcador de peso molecular de intervalo bajo Bio-Rad) se cargó en diferentes pozos. Después de cargar la muestra y marcador de peso molecular, el gel se colocó en el sistema de electroforesis (Hoeffer Scientific Instruments, SE 600) y después se vació el pH de flujo al sistema. Aplicando una corriente de 10 mA por hoja de gel poniendo en contacto el sistema con el dispositivo de suministro de energía (Hoeffer Scientific Instruments, PS 2500), se llevó a cabo la electroforesis hasta que la banda de azul de bromofenol alcanzó el límite entre el gel de separación y el gel de apilamiento. Cuando la banda de azul de bromofenol alcanzó el límite, la corriente se elevó a 20 mA, y después la electroforesis se llevó a cabo hasta que la banda de azul de bromofenol alcanzó el extremo inferior de la placa de vidrio. Después de haberse completado la electroforesis, la energía se apagó, el gel se recogió del sistema y el gel que contenía las proteínas se fijo en la mezcla de metanol:ácido acético:agua (50:10:40) a temperatura ambiente durante 12 ~ 16 horas. Después, el gel se transformó a solución" de glutaraldehído al 10% durante 30 minutos con agitación y se lavó 3 veces con agua desionizada para cada 20 minutos. Después de preparar la solución de nitrato de plata (0.8% de nitrato de plata, 0.08% de NaOH y 4% de agua amoniacal), el gel se transfirió a esta solución y se agitó en un lugar oscuro durante 5 minutos. Después, el gel se lavó 3 veces con agua desionizada durante cada minuto. La solución de revelado (0.005% de ácido cítrico, 0.14% de formaldehído y 0.005% de metanol) preparada inmediatamente antes de usarse se añadió al gel, y el gel se agitó suavemente para revelar las bandas de proteína teñidas con plata. Los resultados se muestran en el cuadro 6 y la figura 3b siguientes.

CUADRO 6 Efecto del pH sobre la dimerización de a-interferón Como se muestra en el cuadro 5 y la figura 3a, la actividad biológica de a-interferón fue relativamente estable a aproximadamente un pH de 5.8. Mientras tanto, la dimerización de a-interferón fue más frecuente a un pH mayor (refiérase al cuadro 6 y la figura 3b). Consecuentemente, el pH elevado no es preferible para un almacenamiento a largo plazo de la formulación en solución acuosa de a-interferón.

EJEMPLO 5 Efecto de dos conservadores la actividad antimicrobiana Las pruebas de eficacia antimicrobiana se llevaron a cabo para las formulaciones en solución acuosa de a-interferón que comprendían fenol y/o m-cresol como conservadores de acuerdo con los procedimientos descritos en la farmacopea europea (E.P 1997, 5.1.3). Primero, cada formulación en solución acuosa que comprendía 6 x 106 Ul/ml de a-interferón, 0.02% de polisorbato 80 y 10 mM de regulador de pH de acetato de amonio se preparó. A la formulación, se añadieron los conservadores a varias concentraciones como se muestra en el cuadro 7 siguiente, y se añadió cloruro de sodio para ajustar la tonicidad a cada formulación. Los resultados de la prueba de eficacia antimicrobiana de las formulaciones en solución acuosa se muestran en el cuadro 7 siguiente. El número de células viables por 1 ml de formulación en solución acuosa se midió usando los procedimientos que se describen en el ejemplo de referencia 3. Los números de células viables medidos en cada tiempo de muestreo se transformaron logarítmicamente y la reducción Log en cada intervalo de tiempo se calculó. Las reducciones Log obtenidas se compararon con los valores de los criterios A o B prescritos en la farmacopea europea para estimar si satisfacen los criterios A o B.

CUADRO 7 Prueba de eficacia animicrobiana de las formulaciones en so acuosa que comprenden conservadores a varias concentraciones * A: significa que la formulación en solución acuosa satisface el criterio A en la farmacopea europea.

B: significa que la formulación en solución acuosa satisface el criterio B en la farmacopea europea. -: significa que la prueba no se realizó. Como se puede ver a partir de los resultados del cuadro 7, la formulación en solución acuosa que comprendía 0.15% de fenol y 0.1 % de m-cresol satisfizo los criterios A y B de la prueba de eficacia antimicrobiana en la farmacopea europea aun cuando contenía la mínima cantidad de los conservadores (cantidad total de conservadores: 0.25%).

EJEMPLO 6 Prueba de comparación de la estabilidad entre la formulación en solución acuosa que comprende una mezcla de 0.15% de fenol y 0.1% de m-cresol y la formulación en solución acuosa que comprende 0.3% de fenol solo Una formulación en solución acuosa que comprendía 6 x 106 Ul/ml de a-interferón, 0.02% de polisorbato 80, 0.3% de fenol y 10 mM de regulador de pH de acetato de amonio (formulación en solución acuosa de prueba # 7-1) y la misma formulación que se describió anteriormente excepto que se uso una mezcla de 0.15% de fenol y 0.1% de m-cresol en lugar de 0.3% de fenol (formulación en solución acuosa de prueba # 7-2), se preparó. El pH de cada formulación en solución acuosa se ajustó a 5.3, y se añadió cloruro de sodio a la formulación en solución acuosa para ajustar la tonicidad.

Los dos tipos de formulaciones se dividieron en tres grupos y los tres grupos a 4°C, 25°C y 40°C, respectivamente, se almacenaron durante 12 semanas. Cada grupo tiene 3 lotes. A intervalos de tiempo regulares, los cambios en la actividad biológica de a-interferón se midieron. La pureza se determinó usando una cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa (CLAR-FI, Waters Alliance System, detector de UV, columna de C18 Júpiter). Los resultados se muestran en los cuadros 8 ~ 13 y las figuras 4a ~ 4f siguientes. (6-1 ) Estimación de los cambios en la actividad biológica de a-ínterferón CUADRO 8 Actividad biológica de a-interferón durante el almacenamiento a 4°C CUADRO 9 Actividad biológica de a-interferón durante el almacenamiento a 25°C CUADRO 10 Actividad biológica de a-interferón durante el almacenamiento a 25°C • En los cuadros 8 ~ 10, el valor superior es la actividad biológica absoluta de a-interferón y el valor inferior es la actividad biológica relativa (%) de a-interferón con respecto a la actividad biológica de a-interferón en el tiempo 0. la unidad de cada valor en los cuadros es de 106 Ul/ml. (6-2) Pureza de a-interferón CUADRO 11 Pureza de las formulaciones en solución acuosa durante el almacenamiento a 4°C determinado por CLAR-FI CUADRO 12 Pureza de las formulaciones en solución acuosa durante el almacenamiento a 25°C determinado por CLAR-FI CUADRO 13 Pureza de jas formulaciones en solución acuosa durante el almacenamiento a 40°C determinado por CLAR-FI Las figuras 4a, 4b y 4c son las gráficas que muestran los cambios en la actividad biológica relativa con respecto a la actividad biológica de a-interferón en el tiempo 0. Como se muestra en el cuadro 8 ~ 13 y las figuras 4a ~ 4f, las formulaciones en solución acuosa que comprendían una mezcla de 0.15% de fenol y 0.1 % de m-cresol mostraron una tendencia similar con aquellas que comprendían 0.3% de fenol solo en términos de actividad así como pureza durante todo el periodo de prueba. También, los dos tipos de formulaciones satisficieron los requisitos antimicrobianos prescritos en la prueba de eficacia antimicrobiana en la farmacopea europea. Sin embargo, la formulación en solución acuosa que comprendía una mezcla de 0.15% de fenol y 0.1% de m-cresol, es más segura para el cuerpo humano que aquella que comprendía 0.3% de fenol solo debido a que la primera contiene menor cantidad de conservadores.

Claims (5)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una formulación en solución acuosa de a-interferón que comprende a-interferón; un estabilizador; un agente regulador de presión osmótica; conservadores antimicrobianos seleccionados del grupo que consiste de fenol, m-cresol o mezcla de los mismos; y un sistema regulador de pH. 2.- La formulación en solución acuosa de a-interferón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la cantidad de a-interferón añadida está en el intervalo de 1 x 106 Ul/ml ~ 1 x 108 Ul/ml. 3.- La formulación en solución acuosa de a-interferón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el estabilizador es polisorbato 80. 4.- La formulación en solución acuosa de a-interferón de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque la concentración de polisorbato 80 está en el intervalo de 0.01 ~ 0.05 p/v %. 5.- La formulación en solución acuosa de a-interferón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el agente regulador de presión osmótica es cloruro de sodio. 6.- La formulación en solución acuosa de a-interferón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el conservador se selecciona del grupo que consiste de 0.1 ~ 0.3 p/v % de fenol, 0.1 ~ 0.2 p/v % de m-cresol, o una mezcla de los mismos. 7.- La formulación en solución acuosa de a-interferón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el sistema 5 regulador de pH es un sistema regulador de pH que consta de acetato de amonio y ácido acético, o un sistema regulador de pH consta de fosfato 4 monoác?do de sodio (Na2HP0 ) y fosfato diácido de sodio (NaH2P0 ). s 8.- La formulación en solución acuosa de a-interferón de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la 10 concentración del sistema regulador de pH en la formulación en solución acuosa está en el intervalo de 5 ~ 20 mM. 9.- La formulación en solución acuosa de a-interferón de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el pH de la formulación está en el intervalo de 4.5 ~ 6.0. % I V