CS277564B6 - Způsob výroby přípravku modifikovaného imunoglobulinu o nízké antikomplenentární aktivitě - Google Patents

Abstract

Způsob přípravy modifikovaného imunoglobulinu o nízké antikomplementární aktivitě je založen na principu nespecifické sorpce balastních látek na fosforečnan vápenatý, redukci imunoglobulinu dithio-DL-treitolem, jeho alkylaci jodacetamidem a oddělení nízkomolekulámích látek dialyzou nebo diafiltrací. Takto připravený roztok modifikovaného imunoglobulinu je stabilizován přidáním malťózy, glycinu, popřípadě sérového albuminu. Roztok 5% modifikovaného imunoglobulinu, pokud byly při jeho přípravě zachovány podmínky pro apyrogenní práci, je vhodný pro intravenózní aplikaci. Má nízkou antikomplementární aktivitu, neobsahuje vysoce agregované bílkovinné komplexy, schopné vyvolat nežádoucí reakce, má biologický poločas vylučování porovnatelný s nativním imunoglobulinem a při jeho aplikaci je maximálně sníženo riziko přenosu virových onemocnění.

Description

Vynález se týká způsobu výroby přípravku chemicky modifikovaného imunoglobulinu o nízké antikomplementární aktivitě, který je vhodný pro intravenozní aplikaci, způsobem umožňujícím zvýšení kvality, zejména z hlediska dalšího snížení antikomplementární aktivity, obsahu vysokomolekulárních agregovaných komplexů bílkovin, nežádoucího účinku biologicky aktivních látek a rizika přenosu některých virových onemocnění.

V průběhu posledních dvou desetiletí se všeobecně projevuje stále vzrůstající snaha využívat imunoglobulinovou frakci krevní plazmy nejen jako intramuskulární preparát, ale také upravit ji tak, aby bylo možné ji bezpečně aplikovat intravenozně. Tento vývoj je charakterizován snahou o přípravu plně účinného intravenozního roztoku, který by nevyvolával nežádoucí anafylaktické reakce u příjemců a byl bezpečný z hlediska přenosu virových onemocnění. Úkol spočívá v přípravě roztoku imunoglobulinu, který vykazuje velmi nízkou antikomplementární aktivitu, obsahuje pouze minimální množství agregovaných bílkovinných komplexů a obsahuje co nejméně biologicky aktivních látek, jako jsou skupinové látky krve, prekalikreinová aktivita gonadotropní hormon a podobně. Zároveň musí být vyloučena možnost přenosu virových onemocnění. Postupem doby bylo v této oblasti získáno mnoho zkušeností a existuje řada publikací, zabývajících se jak způsoby přípravy intravenožních preparátů a zjišťování jejich kvality, tak klinickým ověřováním jejich účinnosti a příklady aplikace při různých onemocněních. Nejdéle známým způsobem přípravy je parciální proteolytické štěpení,například pepsinem /H.E.Schultze,G.Schwick: Dtsch.Med.Wschr. 87, 1643 (1962)/,/S.Barandun,P.Kistler,J.Jeunet,H.Istiker: Vox Sang. 7, 157 (1962)/, /S.Barandun: Biblthemat.No.17 (Kargel·,Basel 1964), Die Gamma-globulin - Therapie/, /1.Banda a kolektiv: čs. autorské osvědčení č. 239838 / nebo plasminem /J.T.Sqouris: Vox Sang. 13,71 (1967)/, /I.Biněva,L.Bazadžiev,B.Zacharia:Probl.Infect.Parazit.Dis. 12,84 (1985)/. Preparáty tohoto typu mají minimální antikomplementární aktivitu a neobsahují agregované pornylery /F.R.Seiler: Die gelben Hefte XXII (1),L (1982)/. Část odborníků pokládá takto připravený imunoglobulinový preparát prozatím za nejbezpečnější z hlediska možného výskytu reakcí u příjemce, naopak jiná skupina jej označuje za zastaralý, zejména z důvodů velmi nízkého biologického poločasu vylučování a možné přítomnosti vedlejších produktů enzymatického štěpení /F.Škvařil, B.Roth-Wicky,S.Barandum: Vox Sang. 38, 147 (1980)/, /J.Rómer, F.Škvařil: Vox Sang.42, 62 (1982)/, /B.M.Alving,J.S.Findayson (editors): Immunoglobulins, characteristics and uses of intravenous preparations. US Dep. of Helth, 1979/, /F.R.Seiler,R.G. Geursen (editors): 7S-Immunoglobulin zur intravenosen Anwendung. Kargel 1982/, /R.E.Schmidt,I.Stroehmann (editors):Immunoglobulin therapie Grundlagen und klinische Anwendung. Symposium in Bonn, Karger 1981/, /R.A.Good (editor): Am.J.Med 76,3A (1984) Intra veil·: as Immune Globulin and the Compromised Host/. Dalším typem intravenózního preparátu je roztok nepozměněného, vysoce purifikovaného plně nativního imunoglobulinu. Tento druh přípravku je vysoce účinný a má délku biologického poločasu stejnou jako normální imunoglobulin. Využívání nativního typu takovéhoto preparátu, má však jistá úskalí. Problém spočívá v bezpečném vyloučení výskytu všech reakcí u příjemce. Stává se totiž diskutabilní objektivně vymezit hranici mezi intramuskulárním a intravenózním preparátem a tak stanovit přijatelný stupeň nebezpečí možného výskytu nežádoucích klinických reakcí. Obecně zde platí zásada požadující maximálně dosažitelnou elektroforetickou čistotu imunoglobulinu, co nejnižší obsah agregovaných bílkovin, minimální antikomplementární aktivitu a minimální obsah biologicky aktivních látek. Riziko přenosu virových onemocnění se u těchto preparátů vylučuje pečlivou kontrolou vstupní suroviny a zařazením etanolového srážecího stupně nebo jiných purifikačních kroků do frakcionačních postupů /Η.H.Hoppe,T.Mester^.Henning, H.J.Krebs: Vox Sang. 25, 308 (1973)/, /C.J.Cunninghan: Biochem.Soc.Transs. 8, 178 (1980)/, /W.Scheider,D.Wolter,L.J.McCarty: Vox sang. 31, 141 (1976)/, /A.D.Friesen, J.M.Bowmann, H.W.Price: J.Appl.Biochem. 3, 166 (1981)/, /J.Vaňák, A. Stejskal: čs. autorské osvědčení č. 220 725/, /R.M.Condie: US Patent 4.130094 - 1979/, /R.M.Condie: US Patent 4.296027 - 1981/, /W. Guddat, K.Hillger: DD patent 208918 A 61 K - 39395/, /1.Štěpánek: čs. autorské osvědčení č. 255 356/, /R.S.Lane: Lancet 974 (1983)/, /A.M.L.Lewer a kolektiv: Lancet 1062 (1984)/, /H.D.Ochs a kolektiv: Lancet 404 (1985)/, /M.A.Wells a kolektiv: Transfusion 26 (2), 212 (1986)/, /H.Friedli,J.Morgethaler: Lancet 1215 (1985). Kvalita intravenózního neštěpeného imunoglobulinu bývá vymezena směrnicí na příklad Světové zdravotnické organizace /Směrnice WHO The Collection, Fractionation, Quality, Control and Use of Blood and Blood Products, Geneva 1981, str. 50/ nebo normou /Podniková norma PNY 31-147-82/. Při volbě kvality je nutné mít na zřeteli to, že čím jsou hodnoty sledovaných veličin stanoveny tolerantněji, tím více se zvyšuje nebezpečí vzniku komplikací u příjemce.

Určitým kompromisním řešením, které odstraňuje některé nevýhody obou výše uvedených typů intravenóžních roztoků imunoglobulinů, je třetí způsob přípravy, založený na chemické modifikaci imunoglobulinu. Parciálním rozštěpením molekul imunoglobulinu a chemickým zablokováním příslušných funkčních skupin je zabráněno vzniku agregátů schopných vyvolat reakce u příjemce. Současně je dosaženo částečného snížení antikomplementární aktivity. Biologický poločas vylučování z organismu je srovnatelný s poločasem u nativního imunoglobulinu, protože štěpy jsou za vhodných podmínek schopné in vivo i in vitro, rekombinace. Obsah účinných protilátek zůstává nezměněn. Chemickou modifikací molekul bílkovin dochází k likvidaci biologicky aktivních látek, například prekalikreinové aktivity /P.M.Fernandes,J.L.Lundblad: Vox Sang. 39, 101 (1980)/ a k desaktivaci· popřípadě přítomných nativních virů /W.Stephan: Vox Sang. 20, 442 (1971)/, /A.M.Price,W.Stephan, B.Brotman: Vox Sang. 46 (2), 80 (1984)/, /W-.Stephan: Z.Klin.Chem. Klin.Biochem.: 7, 286 (1969)/, /D.D.Schroeder a spolupracovníci: Am.J.Med. 76 (3A), 33 (1984)/. Z nej známějších postupů modifikace imunoglobulinu se uvádějí reakce s beta propiolaktonem /W.Stephan: Beitr.Infusionther.Klin.Enahr. 11, 20 (1983)/, amidace imunoglobulinu /R/Schmidtberger: US Patent 4, 118379 - 1978/, sulfitolytické štěpení /F.Franěk,O.M.Zorina: Coll.Czech. Chern.Commun. 32, 3229 (1967)/, /H. Muller: Open-laid Patent Gazette DE-AS 2658 334 - 1976/, /Y.Masubo,Y.Tomibe,T.Watanabe, Y.Fukomoto: Vox Sang. 32, 200 (1977)/, /Y.Masubo,Y.Tomibe, Y.Fukomoto,T.Watanabe: Vox Sang. 32, 290 (1977)/, /P.Gronski, E.Kanzy,G.Luben: Die gelben Hefte 40 (1982)/, /Z.Olšovská, F.Franěk:Folia biologica 29 (4), 282 (1983)/, /Z.Olšovská, F.Franěk: Folia biologica 29 (6), 365 (1983)/, /P.Gronski,

T.Hofstaetter,E.J.Kanzy,G.Luben,F.R.Seiler: Vox Sang. 45, 144 (1985)/, /T. Hofstaetter,P.Gronski,E. J.Kanzy,H.U.Schorlemmer, F.R. Seiler: Vox Sang. 45, 155 (1983)/, /P.Gronski a spolupracovníci: Ric.Clin.Lab. 14 Suppl. 1, 7 (1984)/. Osvědčeným způsobem modifikace je redukce s následnou alkylací /P.M.Fernandes,J.L.Lundblad: Vox Sang. 39, 101 (1980)/, /D.D.Schroeder, D.T.Tankersley,J.L. Lunblod: Vox Sang. 40,373 (1981)/, /D.D.Schroeder a spolupracovníci: Am.J.Med. 76 (3A), 33 (1984)/. Podstatný vliv na kvalitu konečného preparátu, na jeho bezpečnost při klinické aplikaci a na exspirační dobu má složení stabilizačního roztoku. Ke stabilizaci intravenozních roztoků imunoglobulinu se nejčastěji užívá glycin v kombinaci s některým cukrem, na příklad s maltózou nebo glukózou v různých koncentracích. V některých případech se u roztoku nativního imunoglobulinu užívá k jeho protekci sérového albuminu /D.Gislason a spolupracovníci: Vox Sang. 34, 143 (1978)/ nebo modifikované želatiny /T.Tomoto,K.Ikeda,T.Suzuki: Vox Sang. 51, 85 (1986)/.

Na základě výsledků našich pokusů, uvedených v následující tabulce, a údajů, obsažených v citovaných pracích, byl navržen postup přípravy intravenózního roztoku imunoglobulinu s nízkou antikomplementární aktivitou, jak jej předkládá předmět vynálezu.

Φ 4-> •H > •rd 4->

Φ

Přehled výsledků stanovení antikomplementární aktivity u 5% roztoků imunoglobulinů připravených různými postupy.

Φ

Q

Φ ta

Φ

Ό

>N >N

Φ Φ co in

04 > Φ >4 CL '3

'>t	'>1	'>1	'>1	'>1	'>1 ·	'>1		'>1
β	β	β	β	β	β	β	β	β
0)	0)	φ	φ	Φ	Φ	Φ	Φ	φ
CL	(ta	Sta	Sta	(ta	(ta	Sta	CL	Sta
>Φ	>φ	>φ	>φ	>Φ	>Φ	>φ	>Φ	>Φ
4->	4-1	ψ)	.4-)	4-)	44	4-)	-μ	44
>cn	κη	κη	>Φ	κη	κη	>cn	>cn	κη
Φ	0)	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ	φ	Φ
β	β	β	β	β	β	β	β	β
Ή	'rd	Ή	Ή	Ή	Ή	Ή	Μ '	Μ
β	β	β	β	β	β	β	β	β
>	>	>	>	>	>	>	>	>
rd	•rd	•rd	rd	rd	rd	•rd	•rd	•rd
4->	+>	4-)	4->	4-)	4-1	4-1	44	44
Φ	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ
β	β	β	β	β	β	β	β	β

04

sobem	zC rm	ο ω 04	0 Ο β ta β — •rd on β φ β Ο	β on μ	'ď Μ	S’ Ο ta on Φ ο	β β •Η β
W Ο r4	β > •rd 44 44 Φ
β-	«β	κϋ			Λ			(ta		β
β	(ta	r—1	3*		γ4 φ	Φ	Φ	^	φ	Λ
rd	Ν	β			Φ β	β	β	0	β	ι-4
r—1		44	a	υ				(4 Μ		Φ
β	β	cn		«	dP 'rd	Μ	'rd	(ta (ta	Ή
Λ	'>	β			Ο	Ο	U		0	dP
0	β	β	'>1	ο	in (ta	Cu	Sta	Μ β	(ta
rd	Ν	Φ	β		(4	β	μ	r4 >	μ	ιη
Cn	«β	μ	φ		'>t Ο	Ο	0	.β Ή	0
0	Cd	44	>	Φ	β cn	tn	tn	β Η	tn	tn
β		β	Ο	β	Φ			>
β	'>!	•rd	β.		> '><				'><
S	β		0	'><	0 β	β	β	'>1	β
•rd	Φ	'rd	Η	β	Μ Φ	Φ	Φ	β	Φ
	>	β	Ο	Φ	Η >	>	>	Φ	>
44	Φ	r—{	44	>	Η 0	0	0	>	0
0	μ	Md	Φ	'rd	•rd Ο	ο	0	Φ	υ
44	Sta	β	μ	>(4	Λ Φ	φ	φ	44	φ
Ν	•rd	μ	144	Λ	Φ μ	μ	(4	cn	μ
0	>μ	ο	Φ	φ	44 CU	cu	(ta	>1	(ta
Ρί	cu	β	μ	Ν	cn ο	0	0	>	0

Poznámka: a) - mikrostanovení podle Fultona a Dumbella, b) - stanovení podle PNY 31-147-82 c) - imunoglobulin obsahuje přibližně 10 % agregovaných podílů bílkovin d) - rozsah stanovených hodnot u více stanovení

Φ
+J		ο
-Η
>	Λ	m					ID	ο
•Η	tn					CX	Ο	ο
-μ	ε	>Ν	1	I	1
44		Φ				Ο	Ο	ο
Φ	ο
	ιη	<0
Ή	m
β	ο	Ο
μ
χφ
4->
β
Φ
g
Φ	φ	Ο		Γ**
Γ~*4	Q
ft	Φ	<ο		00
g	ft		m			Ο	ο	ο
0		>Ν		>Ν		X.	X.	κ
44	Φ	Φ	ιη	Φ	ιη	τ™Η	<—Η	τ-Η
•Η μ	Ό	CO		Ο			V	V
β
Φ

linu

ováný

->i β Φ > 0

'>1 β φ > 0

'>1 β Φ > 0

'>1 β φ > 0

'>· β Φ > 0

'>1 β φ ft

β

'>t

44

>1

44

44

'>1

44

44

'>1

44

>Φ

Ή

Λ

β

H

β

•Η

β

•Η

β

•Η

β

Η

β

Ή

•μ

β

0

Φ

U-l

Φ

Μ-Ι

φ

ΨΙ

Φ

ιμ

Φ

ιμ

Φ

Ψ4

>tn

χφ

r4

ft

•H

ft

•Η

ft

•Η

ft

Ή

ft

Η

ft

•Η

>

tn

>φ

Ό

>Φ

>φ

Ό

>Φ

Ό

>Φ

>Φ

Ό

>1

0

0

+»

0

+>

0

+>

0

-μ

0

-μ

0

μ

0

44

. TABULKA (pokrač

Roztok imunoglobulinu úprava imun

připravený různým způsobem

2+ sulfonovaný (SO^ ) parciálně š

g 1

xn >Φ β r—1 Χφ •Η 0 μ φ ft + CN 'D Ο ω '>ϊ β φ > 0 β 0 U-I rd β ω

g 1

>ω >φ β χφ Η 0 μ Φ ft '>1 β Φ > 0 >1 44 Φ Φ '>1 β Φ > 0 44 β t Φ μ

g 1 g Φ 0 +> •Η Φ μ +> 0 •Η Λ μ •Η Ό

>ω >Φ β r—I ΧΦ •Η 0 μ φ ft g φ 0 -μ Η Φ μ -μ 0 •Η X! •μ •Η β Φ > 0 44 •Η m •μ Ό 0 g

g 1 β β •Η g β Λ γΗ φ dP ΙΓ> Φ

>ω >Φ β χφ •Η 0 μ φ ft β Ν φ χφ β >1 > Φ Ό 0 ft β Φ > Φ μ ft •Η >μ ft

g 1 β β Ή g β X) φ Ή β Χφ Ό •Η >μ ft Ν Φ Λ

>ϋ) >Φ β χφ •Η 0 μ φ ft β Ν Φ χφ β >1 > φ Ό 0 ft '>1 β Φ > Φ μ ft •Η >μ ft

g 1 β β •Η g β Λ Φ dP uO ω

Ο •Η -μ >1 0 Φ -μ 0 μ ft ft ω ω ω 'w* g φ β Ή ω ft Φ ft >1 β Φ ft >φ μ >ω

Navržený způsob výroby přípravku modifikovaného imunoglobulinu o nízké antikomplementární aktivitě, který je vhodný pro intravenozní aplikaci, založený na kombinaci známých postupů přípravy fosforečnanu vápenatého, chemické modifikace imunoglobulinu DL-dithiotreitolem a přidání maltózy, glycinu a sérového albuminu jako stabilizačních složek, vyznačující se tím, že se vodný roztok obsahující 3 až 10 g imunoglobulinu, o elektroforetické čistotě nejméně 95 %, na každých 100 ml uvede do kontaktu s fosforečnanem vápenatým na dobu 30 až 60 minut, potom se fosforečnan vápenatý oddělí od tekutiny, k takto získanému roztoku imunoglobulinu se přidá 1,4-dithio-DL-treitol v množství 23 až 38 mg na každých 100 ml roztoku a po 30 minutovém míchání se přidá 50 až 100 mg jodacetamidu na každých 100 ml roztoku, míchá se dalších 60 minut, roztok takto modifikovaného imunoglobulinu se dialyzuje nebo diafiltruje proti roztoku obsahujícímu 0,2 až 0,4 g chloridu sodného na každých 100 ml, potom se upraví koncentrace bílkovin naředěním roztokem chloridu sodného o uvedené koncentraci, nebo naopak zahustí ultrafiltrací tak, aby obsahoval 4,5 až 5,5 g modifikovaného imunoglobulinu na 100 ml roztoku, potom se přidá stabilizační složky 1 až 5 g maltózy, 1 až 2,5 g glycinu, popřípadě 1 až 5 g sérového albuminu na každých 100 ml roztoku, jeho hodnota pH se upraví na 6,4 až 7,4 a provede se sterilní filtrace.

Předností navrženého postupu přípravy modifikovaného imunoglobulinu je to, že umožňuje výrobu potřebného léku vhodného pro intravenozní aplikaci, který vykazuje nízkou antikomplementární aktivitu, neobsahuje agregované podíly bílkovin, má snížený obsah biologicky aktivních látek, maximálně snižuje riziko přenosu virových onemocnění, je klinicky bezpečný a má biologický poločas vylučování srovnatelný s nativním neštěpeným imunoglobulinem. Roztok modifikovaného imunoglobulinu, připravený podle navrženého postupu, si podržuje stejný obsah protilátek, jaký měl výchozí materiál. Preparát je stálý při provedení zkoušky stability podle směrnice Světové zdravotnické organizace a nemění svůj vzhled a viskozitu po čtyřhodinovém zahřívání na 58 °C. Roztok modifikovaného imunoglobulinu je neškodný na morčatech a myších.

Způsob přípravy preparátu o nízké antikomplementární aktivitě je v principu založen na vhodné kombinaci nespecifické sorpce vysokomolekulárních látek na fosforečnan vápenatý, chemické modifikace molekuly imunoglobulinu redukcí dithiotreitolem a alkylací jodacetamidem. Nežádoucí nízkomolekulární látky jsou odstraněny dialýzou nebo diafiltrací. Injekční roztok je vhodným způsobem stabilizován. Účinek fosforečnanu vápenatého je možné dosáhnout jiným vhodným způsobem, na příklad užitím iontoměniče nebo sorbentu podobných vlastností. Provedení chemické modifikace diothiotreitolem a jodacetamidem je podle výsledků našich pokusů i podle zkušeností jiných autorů výhodnější, než je modifikace pomocí sulfitolýzy. Zařazením náležitě účinné dialýzy nebo diafiltrace je dosaženo nejen odstranění vedlejších produktů redukce a alkylace, ale také oddělení dalších nízkomolekulárních látek, původně obsažených ve výchozím roztoku imunoglobulinu řádově o čtyři řády. Jako stabilizační složka se nejlépe osvědčila kombinace maltózy a glycinu s doplněním o sérový albumin. Přítomnost albuminu zvyšuje stabilitu modifikovaného imunoglobulinu, zajišťuje blokování i stopových zbytků reakčních produktů, dále snižuje riziko anafylaktických reakcí a při klinické aplikaci napomáhá detoxikaci látek vzniklých v důsledku infekčního onemocnění v organizmu příjemce.

Z hlediska technologické přípravy je navržený postup jednoduchý a nevyžaduje žádná mimořádná zařízení. Předností postupu je také skutečnost, že umožňuje přípravu žádaného intravenozního preparátu, jehož léčebný význam se bude nepochybně dále zvyšovat, z imunoglobulinu připraveného způsobem, Vhodným pro intramuskulární aplikaci, o který zájem stále klesá.

Příklad 1 g lyofilizovaného imunoglobulinu, vhodného pro přípravu intramuskulárního preparátu, který vykazuje nejméně 95 % elektroforetickou čistotu, se rozpustí ve 200 ml destilované apyrogenní vody a pH roztoku se upraví na hodnotu 7,2 ± 0,2 pomocí 0,2 M roztoku hydroxidu sodného nebo 0,2 M kyseliny octové. K roztoku se přidá 40 ml hustého sedimentu fosforečnanu vápenatého, připraveného podle dále uvedeného postupu. Vzniklá suspenze se míchá 60 minut, potom se fosforečnan oddělí filtrací přes vrstvy typu K5 a EKS2. Dále se přidá na každých 100 ml filtrátu 23 až 38 mg 1,4-dithio-DL-treitolu a po 30 minutovém míchání se přidá 55 až 100 mg jodacetamidu. Roztok se míchá dalších 60 minut. Roztok redukovaného a alkylovaného imunoglobulinu se potom dialyzuje třikrát opakovaně proti 20 násobnému objemu 0,2 až 0,4% roztoku chloridu sodného nebo se za podobných podmínek podrobí diafiltraci. Dialyzovaný roztok se naředí na koncentraci 5 ± 0,5 % bílkovin a přidá se na každých 100 ml 1 až.5 g maltózy, 1 až 1,5 g glycinu a 1 až 5 g sérového albuminu. Provede se konečná kontrola, popřípadě úprava pH na hodnotu 6,4 až 7,4, roztok se sterilně zfiltruje a rozplní na požadované dávky. Celý pracovní postup se provádí při teplotách 4 až 8 °C a musí se provádět podle zásad apyrogenní práce. Z 20 g výchozího množství lyofilizovaného imunoglobulinu bylo uvedeným postupem připraveno 260 ml 5% roztoku, který vykazoval antikomplementární aktivitu 0,06 CH₅₀/mg. Roztok byl neškodný při zkouškách na myších a morčatech a měl nezměněný obsah antistafylokokových protilátek. Roztok byl stabilní při zahřívání na 58 ’C po dobu 4 hodin.

Příklad 2 ‘

250 ml 3 až 8% roztoku imunoglobulinu, který vznikl rozpuštěním sedimentu bílkovin při etanolové francionaci a vykazuje nejméně 95% elektroforetickou čistotu, se přefiltruje přes filtrační vrstvu typu ΕΚ. K filtrátu se přidá 40 ml hustého sedimentu fosforečnanu vápenatého připraveného podle dále uvedeného postupu. Sorpce na fosforečnan vápenatý, redukce a alkylace, dialyza, diafiltrace a složení stabilizátoru je stejné jako v příkladě 1. Pokud po dialýze je koncentrace bílkovin nižší, roztok se zahustí ultrafiltrací na požadovanou koncentraci. Sterilně zfiltrovaný roztok se rozplní do požadovaných dávek a usuší lyofilizací.

Příprava fosforečnanu vápenatého:

Fosforečnan vápenatý se připraví pozvolným směšováním 0,2M roztoku chloridu vápenatého a 0,2M středního fosforečnanu sodného v ekvimolárním poměru za stálého míchání. Vzniklá suspenze se po ukončení srážení ještě míchá 20 až 30 minut a potom se promývá dekantací s destilovanou vodou tak dlouho, pokud roztok vykazuje reakci na přítomnost vápníkových nebo fosforečnanových iontů. Sraženina se ponechá sedimentovat při +4'°C po dobu 16 až 24 hodin, vodná fáze se oddělí a sediment se během dalších 24 hodin užije k sorpci nebo se vysterilizuje autoklávováním. Celý postup práce musí být proveden podle zásad platných pro apyrogenní práci.

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Způsob výroby přípravku modifikovaného imunoglobulinu o nízké antikomplementární aktivitě, který je vhodný pro intravenozní aplikaci, využívající postupů zahrnujících přípravu fosforečnanu vápenatého,chemické modifikace imunoglobulinu DL-dithiotreitolem a přidáni maltózy, glycinu a sérového albuminu jako stabilizačních složek, vyznačující se tím, že se vodný roztok obsahující 3 až 10 g imunoglobulinu, o elektroforetické čistotě nejméně 95 %, na každých 100 ml uvede do kontaktu s fosforečnanem vápenatým na dobu 30 až 60 minut, potom se fosforečnan vápenatý oddělí od tekutiny, k takto získanému roztoku imunoglobulinu se přidá 1,4-dithio-DL-treitol v množství 23 až 38 mg na každých 100 ml roztoku a po 30 minutovém míchání se přidá 50 až 100 mg jodacetamidu na každých 100 ml roztoku, míchá se dalších 60 minut, roztok takto modifikovaného imunoglobulinu se dialyzuje nebo diafiltruje proti roztoku obsahujícímu 0,2 až 0,4 g chloridu sodného na každých 100 ml, potom se upraví koncentrace bílkovin naředěním roztokem chloridu sodného o uvedené koncentraci, nebo naopak zahustí ultrafiltrací tak, aby obsahoval 4,5 až 5,5 g modifikovaného imunoglobulinu na 100 ml roztoku, potom se přidají stabilizační složky 1 až 5 g maltózy, 1 až 2,5 g glycinu, popřípadě 1 až 5 g sérového albuminu na každých 100 ml roztoku, jeho hodnota pH se upraví na 6,4 až 7,4 a provede se sterilní filtrace.