CN102573907A - 治疗急性髓性白血病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了使用治疗有效量的抗-α4抗体与化学治疗剂的组合治疗或预防血液学恶性肿瘤(诸如AML)的组合物和方法。所述方法包括给患者施用治疗有效量的组合物，所述组合物含有具有α4亚基的整联蛋白(VLA-4)和该整联蛋白的配体(VCAM-1)之间的相互作用的拮抗剂。

Description

治疗急性髓性白血病的组合物和方法
相关申请
本申请要求2009年4月17日提交的美国临时申请号61/170,551的利益，其通过引用整体并入本文。
背景技术
血液学恶性肿瘤是影响血液、骨髓、和淋巴结的增生性障碍。它们包括白血病诸如慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性髓性白血病(AML)、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
发明内容
本发明部分地基于下述发现，即抗-α4抗体可以阻断VLA-4介导的血液细胞系(包括急性髓性白血病(AML)细胞系)与VCAM-1和纤连蛋白的粘附，以及与骨髓基质细胞的粘附。尽管不希望受理论所限，该活性能够中断细胞存活信号传递途径，并增加细胞对细胞毒性剂的敏感性。因而，提供了使用抗-α4拮抗剂治疗诸如AML等血液学恶性肿瘤或降低对细胞毒性剂的抗性的方法。
在一个方面，提供了治疗具有血液学障碍(例如，白血病，诸如急性髓性白血病(AML))的患者的方法。所述方法包括：给所述患者施用治疗有效量的组合物，所述组合物含有具有α4亚基的整联蛋白(例如VLA-4)和该整联蛋白的配体(例如VCAM-1)之间的相互作用的拮抗剂。该拮抗剂可以是α4整联蛋白结合剂或α4整联蛋白配体结合剂。典型的试剂包括抗-VLA-4或抗-α4β7抗体(例如，人、嵌合、和人源化抗体及其片段)；抗-VCAM-1抗体(例如，人、嵌合、和人源化抗体及其片段)；和含α4亚基的整联蛋白和它们的配体之间的相互作用的小分子抑制剂。
在一个实施方案中，所述拮抗剂是抗-α4整联蛋白抗体或其抗原结合片段，例如，VLA-4结合抗体或其抗原结合片段。所述组合物可以是至少含有治疗有效量的VLA-4结合抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一个实施方案中，所述抗-α4结合抗体或其抗原结合片段是VLA-4结合抗体或其片段。在另一个实施方案中，所述抗-α4抗体或其抗原结合片段(例如，VLA-4结合抗体)是人抗体、嵌合抗体、人源化抗体，或者是人抗体、嵌合抗体、或人源化抗体的结合抗原的Fab、Fab’、F(ab’)2或F(v)片段，或者是具有超过2个抗原结合位点的改良抗体(例如双特异抗体)。在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆或单特异抗体、单链抗体(例如纳米抗体，如骆驼或鲨鱼抗体(IgNAR))、或这些抗体类型中任一种的抗原结合片段。
在一个实施方案中，所述拮抗剂是小分子抑制剂，例如WO 06/131200或US2007/0004775中描述的抑制剂，这两篇专利申请都通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，以一定剂量施用所述组合物，从而提供约0.1至约20mg/kg体重的抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，所述抗-α4抗体或其抗原结合片段结合VLA-4的α链，且在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是B表位特异性的VLA-4结合抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段是那他珠单抗或那他珠单抗的抗原结合片段。
在一个实施方案中，所述治疗血液学恶性肿瘤(例如，AML)的方法包括：施用除了抗-α4抗体以外的第二治疗剂。所述第二治疗剂可以是，例如，化学治疗剂，诸如(但不限于)阿糖胞苷(Ara-C)、柔红霉素、伊达比星、依托泊苷、吉妥珠单抗奥唑米星、三氧化二砷、或全反式维甲酸。除了施用α4拮抗剂以外，所述治疗血液学恶性肿瘤的方法还可以包括第二治疗方案，例如放射疗法。
有些实施方案适合通过皮下的(SC)或肌肉内的(IM)递送来递送给受试者，所述受试者诸如人，例如，人患者。含有抗-α4抗体的组合物也适用于静脉内的(IV)给药，例如，当在可接受的输注基质(诸如生理盐水)中稀释时。抗-α4抗体可以是例如那他珠单抗。
在一个实施方案中，所述抗-α4抗体是人源化的单克隆抗体，诸如那他珠单抗。在另一个实施方案中，所述抗-α4抗体是那他珠单抗的变体。例如，在有些实施方案中，抗体的轻链可变区具有与那他珠单抗的轻链可变区相差一个或多个氨基酸残基、但是不超过2、3、4、5、或6个氨基酸残基的氨基酸序列，和/或重链可变区具有与那他珠单抗的重链可变区相差一个或多个氨基酸残基、但是不超过2、3、4、5、或6个氨基酸残基的氨基酸序列。在有些实施方案中，有些或所有差异是保守变化。在有些实施方案中，抗-α4抗体具有和那他珠单抗的CDR相同的CDR，或者所述抗体结合和那他珠单抗相同或覆盖表位。
在另一个实施方案中，所述抗-α4抗体具有下述轻链可变区和重链可变区中的一者或二者，所述轻链可变区具有美国专利号5,840,299(其通过引用并入本文)中的SEQ ID NO：7的氨基酸序列，所述重链可变区具有美国专利号5,840,299中的SEQ ID NO：11的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述VLA-4抗体是这些抗体之一的变体。例如，在有些实施方案中，所述轻链可变区具有与美国专利号5,840,299中的SEQ ID NO：7序列相差一个或多个氨基酸残基、但是不超过2、3、4、5、或6个氨基酸残基的氨基酸序列，和/或所述重链可变区具有与美国专利号5,840,299中的SEQ ID NO：11所定义的相差一个或多个氨基酸残基、但是不超过2、3、4、5、或6个氨基酸残基的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述抗-α4抗体具有表1-1中的SEQ ID NO：1的轻链氨基酸序列和表1-2中的SEQ ID NO：2的重链氨基酸序列中的一者或二者。在其它实施方案中，所述VLA-4抗体是这些抗体之一的变体。例如，在有些实施方案中，所述抗体的轻链具有与SEQ ID NO：1序列相差一个或多个氨基酸残基、但是不超过2、3、4、5、或6个氨基酸残基的氨基酸序列，和/或所述抗体的重链具有与SEQ ID NO：2序列相差一个或多个氨基酸残基、但是不超过2、3、4、5、或6个氨基酸残基的氨基酸序列。
在该上下文中使用的氨基酸序列的“差异”是指氨基酸同一性的差异(例如，用不同的氨基酸置换上面提及的SEQ ID NO：7或11中的氨基酸)或缺失或插入。差异可以是在例如框架区、CDR、铰链、或恒定区中。差异可以是在蛋白序列的内部或末端。在有些实施方案中，有些或所有差异是相对于引用的序列的保守变化。
在一个实施方案中，所述方法允许逐渐增加提供的抗体剂量(这里使用的剂量表示在一次或在每次确定的小数量(例如，2次)给药中提供的抗体的量)。这允许逐渐增加剂量，且可以允许随着剂量增加而监测患者的耐受性、不良反应等。例如，所述方法的开始可以是，以一个或多个初始的或相对低的剂量将那他珠单抗提供给患者，随后以最终的、更高的剂量将那他珠单抗提供给患者。典型的初始剂量可以是例如最终的更高的剂量的80％、70％、50％、30％、20％或10％或更少。一旦已经达到稳态给药，典型的最终剂量将基于给药频率而变化。例如，有些实施方案包括每28天IV给药的50mg至1200mg的最终剂量。有些实施方案包括10mg至1000mg的最终剂量(例如，50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg)(这些剂量通常是大约每月给药)。其它实施方案包括25mg至250mg的最终剂量(例如，50mg、75mg、100mg、150mg、200mg)(这些剂量通常是每2周给药)。治疗剂量可由受体饱和程度决定。
在有些实施方案中，所述患者将以一个或多个初始剂量，接受一次或多次给药。例如，在一个实施方案中，所述患者将在多次给药中，接受递增的剂量。在有些实施方案中，在达到最终剂量之前，所述患者将以一个或多个初始剂量，接受2、3、4、5、6、7、或8次给药。例如，所述患者将以第一个初始剂量，接受一次或多次给药，并以第二个更高的初始剂量，接受一次或多次给药。在有些实施方案中，在一次或多次给药以后，评估患者的征状，包括不良征状。在有些实施方案中，仅在确定患者对先前剂量不具有不可接受的不良反应以后，才给患者施用增加剂量的那他珠单抗。
在有些实施方案中，该患者接受最初的更高剂量，然后接着更低的剂量，例如，随着征状改善。
在一个实施方案中，在接受初始剂量的化学治疗剂或放射疗法治疗的同时，给所述患者施用初始剂量的α4拮抗剂(例如，α4结合抗体)。在另一个实施方案中，在具有血液学恶性肿瘤复发后，给所述患者施用初始剂量的α4拮抗剂。
在另一个方面，本发明表征了如何施用本文所述的组合物来治疗血液学恶性肿瘤的方法，例如，指导需要α4拮抗剂治疗的患者如何施用本文所述的组合物来治疗血液学恶性肿瘤的方法。所述方法包括：(i)给患者提供至少一个单位剂量的拮抗剂(例如抗-α4抗体)制剂；和(ii)指导患者自己静脉内地施用至少一个单位剂量。另一种方法(例如，治疗方法)包括：(i)给患者提供至少两个单位剂量的α4拮抗剂制剂；和(ii)指导患者自己静脉内地施用所述单位剂量，例如，每次一个剂量。
在一个实施方案中，所述患者具有血液学障碍，诸如白血病，例如，急性髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、或慢性髓细胞性白血病(CML)、或毛细胞性白血病(HCL)。在另一个实施方案中，所述患者具有淋巴瘤，诸如霍奇金病或非霍奇金淋巴瘤(T或B细胞型)。在另一个实施方案中，所述患者具有骨髓增生异常综合征(MDS)，且在另一个实施方案中，所述患者具有骨髓增殖性疾病，诸如真性红细胞增多症(也称作PV、PCV或真性红血球过多症(PRV))、特发性血小板增多症(ET)、或骨髓纤维化。在另一个实施方案中，所述患者具有由轻链病引起的淀粉样蛋白、沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症、未定性单克隆γ球蛋白血症(MGUS)、或浆细胞白血病。在典型的实施方案中，所述患者具有AML。
在另一个方面，本发明表征了治疗具有血液学恶性肿瘤(诸如AML)的患者的方法，其中给患者施用含有α4拮抗剂(例如抗-α4抗体)的组合物，所述组合物是在适合静脉内或皮下或肌肉内给药的制剂中。在一个实施方案中，所述组合物作为一个方案来施用。在另一个实施方案中，所述方法另外包括：选择适合用所述组合物治疗的患者。例如，适合治疗的患者已经表现出指示疾病发作的迹象或征状，诸如指示AML的迹象或征状。与在不具有血液学恶性肿瘤(诸如AML)的人的细胞上表达的VLA4蛋白水平相比，适合治疗的患者也可以在组织样品的细胞(例如，来自血涂片或骨髓活组织检查的细胞)的表面上表达升高水平的VLA4蛋白。
在另一个实施方案中，所述方法另外包括：给所述患者施用第二治疗剂，例如，化学治疗剂，例如，阿糖胞苷(Ara-C)、柔红霉素、伊达比星、依托泊苷、吉妥珠单抗奥唑米星、三氧化二砷、或全反式维甲酸。
在另一个方面，本发明表征了评价患者的方法，其中确定所述患者是否满足预选标准，和所述患者是否满足批准、提供、开具或施用本文所述的抗-α4抗体制剂给患者的预选标准。在一个实施方案中，所述预选标准是，患者不能对先前的替代治疗性处理或方案(例如，用于治疗血液学恶性肿瘤，诸如AML)适当地做出响应。在另一个实施方案中，所述预选标准是，没有进行性多病灶脑白质病(PML)的任何迹象或征状，或没有PML的任何诊断。在另一个实施方案中，所述标准如在通过引用并入本文中的PCT/US2007/075577(公开为WO/2008/021954)中所述，它描述了用于药物分配的方法和系统。
在另一个方面，本发明表征了指导受体施用那他珠单抗制剂的方法。所述方法包括：指导所述受体(例如，最终用户、患者、医师、零售或批发药房、分配者、或在医院、养老院门诊所或保健组织中的药房部门)将药物皮下地或肌肉内地施用给患者。
在另一个方面，提供了分配本文所述的组合物的方法。所述组合物含有那他珠单抗，且适合皮下的或肌肉内的或静脉内的给药。所述方法包括：给受体(例如，最终用户、患者、医师、零售或批发药房、分配者、或在医院、养老院门诊所或保健组织中的药房部门)提供包装，所述包装含有足以治疗患者至少6、12、24、或36个月的单位剂量的药物。
在另一个方面，本发明表征了在PCT/US2007/075577(公开为WO/2008/021954)中描述的方法或系统在本文所述的制剂中的应用。实施方案包括下述方法：分配本文所述的制剂，监测或跟踪本文所述的制剂向药房、输注中心、或患者的提供，监测一位或多位患者，选择患者，或编译或报告关于本文所述的制剂的使用的数据。PCT/US2007/075577(公开为WO/2008/021954)通过引用并入本文。
在另一个方面，本发明表征了选择使用含有抗-α4抗体的组合物进行治疗的患者的方法。所述方法包括：选择或提供具有血液学恶性肿瘤(诸如AML)的患者；和提供或施用包含抗-α4抗体的组合物，从而治疗患者。
“血液学恶性肿瘤”是影响血液、骨髓、或淋巴结的障碍，诸如癌症。血液学恶性肿瘤包括白血病，诸如ALL、AML、CML、CLL、和HCL；淋巴瘤，诸如霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤；和多发性骨髓瘤；骨髓增生异常综合征(MDS)(其最终可以是AML)；骨髓增殖性疾病，诸如真性红细胞增多症(也称作PV、PCV或真性红血球过多症(PRV))、特发性血小板增多症(ET)、骨髓纤维化；和由轻链病引起的淀粉样蛋白。
术语“治疗”表示，以有效地改善与障碍有关的病症、征状、或参数或防止障碍进展(达到统计上显著的程度或本领域技术人员可检测的程度)的量、方式和/或模式，施用治疗。有效的量、方式、或模式可以随受试者而变化，且可以针对受试者调整。
“抗-α4抗体”表示这样的抗体，其结合α4整联蛋白，诸如VLA-4整联蛋白的α4亚基，且至少部分地抑制整联蛋白的活性。例如，抗-α4抗体可以抑制整联蛋白与同源配体(例如，细胞表面蛋白诸如VCAM-1)的结合，或与胞外基质组分(诸如纤连蛋白或骨桥蛋白)的结合。该抑制作用可以阻止抗-α4整联蛋白结合细胞，诸如骨髓基质细胞。α4整联蛋白是这样的整联蛋白，其α4亚基与一个或另一个β亚基结合。因而，术语“α4整联蛋白”表示VLA-4，以及含有β1、β7或任意其它β亚基的整联蛋白(例如，α4β7、α4β1)。因而，可用于治疗血液学恶性肿瘤的抗-α4抗体包括，例如，VLA-4结合抗体以及α4β7抗体，和它们的抗原结合片段。抗-α4抗体可以以小于约10-6、10-7、10-8、10-9、或10-10M的Kd结合α4整联蛋白。
“VLA-4结合抗体”表示这样的抗体，其能够结合VLA-4整联蛋白，诸如VLA-4整联蛋白的α4亚基，且至少部分地抑制VLA-4的活性，特别是VLA-4整联蛋白的结合活性或信号传递活性，例如，转导VLA-4介导的信号的能力。例如，VLA-4结合抗体可以抑制VLA-4与VLA-4的同源配体(例如，细胞表面蛋白诸如VCAM-1)的结合，或与胞外基质组分(诸如纤连蛋白或骨桥蛋白)的结合。VLA-4结合抗体可以结合α4亚基或β1亚基或二者。在一个实施方案中，所述抗体结合α4的B1表位。VLA-4结合抗体可以以小于约10-6、10-7、10-8、10-9、或10-10M的Kd结合VLA-4。VLA-4也称作α4/β1和CD29/CD49b。在一个实施方案中，所述VLA-4结合抗体是那他珠单抗，或者具有的Kd为那他珠单抗的Kd的70％-130％内，例如80％-125％内。
本文使用的术语“抗体”表示这样的蛋白：其包含至少一个免疫球蛋白可变区，例如，提供免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列或免疫球蛋白可变结构域序列。例如，抗体可以包含重(H)链可变区(在本文中缩写为VH)和轻(L)链可变区(在本文中缩写为VL)。在另一个实施例中，抗体包含2个重(H)链可变区和2个轻(L)链可变区。术语“抗体”涵盖抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、Fd片段、Fv片段、和dAb片段)以及完整抗体，例如，IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(以及它们的亚型)的完整免疫球蛋白。免疫球蛋白的轻链可以为κ或λ型。在一个实施方案中，所述抗体是糖基化的。抗体在功能上可以具有抗体依赖性的细胞毒性和/或补体-介导的细胞毒性的功能，或可以没有这些活性之一或二者的功能。
VH和VL区可以进一步细分成称作“互补性决定区”(“CDR”)的超变区，它们中散布着称作“框架区”(FR)的更保守的区域。已经精确地确定了FR和CDR的范围(参见，Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，美国健康和人类服务部，国立卫生研究所公开号91-3242；和Chothia，C.等人(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。在本文中使用Kabat定义。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR组成，它们按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
“免疫球蛋白结构域”表示来自免疫球蛋白分子的可变域或恒定域的结构域。免疫球蛋白结构域通常含有由约7个β-链形成的2个β-折叠和一个保守的二硫键(参见，例如，A.F.Williams和A.N.Barclay 1988Ann.RevImmunol.6：381-405)。
本文使用的“免疫球蛋白可变结构域序列”表示可以形成免疫球蛋白可变结构域的结构的氨基酸序列。例如，所述序列可以包括天然存在的可变结构域的全部或部分氨基酸序列。例如，所述序列可以省略1个、2个或更多个N-端或C-端氨基酸、内部氨基酸，可以包括一个或多个插入或额外的末端氨基酸，或者可以包括其它改变。在一个实施方案中，含有免疫球蛋白可变结构域序列的多肽可以与另一个免疫球蛋白可变结构域序列结合，从而形成靶标结合结构(或“抗原结合部位”)，例如与VLA-4相互作用的结构。
抗体的VH或VL链还可以包括重链恒定区或轻链恒定区的全部或部分，以由此分别形成免疫球蛋白重链或轻链。在一个实施方案中，所述抗体是具有两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的四聚体。免疫球蛋白重链和轻链可以通过二硫键相连。重链恒定区一般包括三个恒定结构域：CH1、CH2和CH3。轻链恒定区一般包括CL结构域。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区一般介导抗体与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的启动成分(C1q))的结合。
抗体的一个或多个区域可以是人的、有效人化的、或人源化的。例如，一个或多个可变区可以是人的或有效人化的。例如，一个或多个CDR(例如，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2、和LC CDR3)可以是人的(HC，重链；LC，轻链)。每个轻链CDR可以是人的。HC CDR3可以是人的。一个或多个框架区(例如HC或LC的FR1、FR2、FR3、和FR4)可以是人的。在一个实施方案中，所有框架区都是人的，例如源自人的体细胞，例如生成免疫球蛋白的造血细胞或非造血细胞。在一个实施方案中，所述人序列是种系序列，例如由种系核酸编码的序列。一个或多个恒定区可以是人的、有效人化的、或人源化的。在另一个实施方案中，框架区(例如，FR1、FR2、和FR3-起，或FR1、FR2、FR3、和FR4-起)的至少70、75、80、85、90、92、95、或98％或整个抗体可以是人的、有效人化的、或人源化的。例如，FR1，FR2、和FR3一起可以与由人种系区段编码的人序列具有至少70、75、80、85、90、92、95、98、或99％同一性。
“有效人化的”免疫球蛋白可变区是这样的免疫球蛋白可变区：其包含足够数量的人框架氨基酸位置，使得该免疫球蛋白可变区在正常人体内不引起免疫原性应答。“有效人化的”抗体是这样的抗体：其包含足够数量的人氨基酸位置，使得该抗体在正常人体内不引起免疫原性应答。
“人源化的”免疫球蛋白可变区是经过下述修饰的免疫球蛋白可变区：所述修饰致使修饰后的形式在人体内引起的免疫应答比未修饰形式引起的免疫应答弱，例如修饰成包含足够数量的人框架氨基酸位置，使得免疫球蛋白可变区在正常人体内不引起免疫原性应答。“人源化的”免疫球蛋白的描述包括例如美国专利号6,407,213和美国专利号5,693,762。在某些情况下，人源化的免疫球蛋白可以在一个或多个框架氨基酸位置处包含非人氨基酸。
抗体的全部或部分可以由免疫球蛋白基因或其区段编码。示例性的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白“轻链”(约25Kd或214个氨基酸)在NH2-端(约110个氨基酸)由可变区基因编码，在COOH-端由κ或λ恒定区基因编码。同样，全长免疫球蛋白“重链”(约50Kd或446个氨基酸)由可变区基因(约116个氨基酸)和上述其它恒定区基因之一(例如γ(编码约330个氨基酸))编码。
术语全长抗体的“抗原结合片段”表示，全长抗体的一个或多个保留特异性地结合目标靶物(例如，VLA-4)的能力的片段。由术语全长抗体的“抗原结合片段”所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，即包括两个经二硫键在铰链区相连的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，它由VH结构域组成；和(vi)分离的保留功能的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由单独的基因编码，使用重组方法，可以用合成的连接物连接它们，使它们形成单个蛋白链，其中VL和VH区配对，从而形成称作单链Fv(scFv)的单价分子。参见例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883。
在附图和下面的描述中，阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。从说明书、附图和权利要求书中，会明白本发明的其它特征、目的、和优点。
附图说明
图1A、1B和1C的条形图描绘了通过流式细胞术测得的α4和β1整联蛋白的量对急性髓性白血病(AML)(图1A)、多发性骨髓瘤(MM)(图1B)、和慢性淋巴细胞白血病(CLL)(图1C)的血液学细胞系的影响。
图2的图描绘了通过流式细胞术测得的那他珠单抗与肿瘤细胞系上的VLA-4的结合。
图3A和3B的图显示了在从20μg/ml开始的那他珠单抗或同种型对照抗体系列稀释物存在下，那他珠单抗对HL60和KG1AML肿瘤细胞与VLA-4配体纤连蛋白(●FN)、血管粘附分子-1-Ig融合蛋白(■VCAM-Ig)、或骨髓基质细胞(▲BMSC)的粘附的抑制。图3C和3D显示了在有饱和水平的那他珠单抗(20μg/mL)(实心条)或同种型对照(空心条)存在下，HL60和KG1AML细胞与VLA-4配体的结合的抑制。
图4A和4B的图显示了那他珠单抗对H929和U266MM肿瘤细胞与VLA-4配体纤连蛋白(●FN)、血管粘附分子-1-Ig融合蛋白(■VCAM-Ig)、或骨髓基质细胞(▲BMSC)的粘附的影响。在从20μg/ml开始的那他珠单抗或同种型对照抗体系列稀释物存在下，测定粘附。图4C显示了在有饱和水平的那他珠单抗(20μg/mL)(实心条)或同种型对照(空心条)存在下，H929MM细胞与VLA-4配体的结合的抑制。
图5A和5B的图显示了那他珠单抗对Mec1和JM1CLL肿瘤细胞与VLA-4配体纤连蛋白(●FN)、血管粘附分子-1-Ig融合蛋白(■VCAM-Ig)、或骨髓基质细胞(▲BMSC)的粘附的影响。在从20μg/ml开始的那他珠单抗或同种型对照抗体系列稀释物存在下，测定粘附。图5C显示了在有饱和水平的那他珠单抗(20μg/mL)(实心条)或同种型对照(空心条)存在下，Mec1CLL细胞与VLA-4配体的结合的抑制。
图6A-6D的图显示了那他珠单抗对细胞粘附介导的抗药性的结果。图6A描述了在有(■)或没有(□)BMSC存在下共培养细胞24小时、然后暴露于化疗药物AraC(阿糖胞苷)24小时以后，剩余的活HL60细胞的百分比。图6B描述了用那他珠单抗或同种型对照抗体温育共培养的HL60细胞4小时、然后暴露于从图6A测定的有效剂量的AraC 24小时以后，凋亡细胞(膜联蛋白V+，7AAD)的百分比。图6C和6D显示了使用暴露于美法仑的U266细胞进行的类似实验的结果。
图7是一组测定HL60、KG1或U266细胞中的P-STAT3、STAT3、P-JNK、JNK、P-MAPK、和MAPK水平的蛋白印迹，所述细胞被悬浮培养，或用指示的BMSC和那他珠单抗共培养30分钟(HL60)或4小时(U266)。
具体实施方式
本发明涉及用于治疗或预防血液学恶性肿瘤(诸如AML)的疗法，和其它内容。更具体地，本文提供了与抗-α4抗体或其抗原结合片段在治疗血液学恶性肿瘤中的应用有关的方法，所述抗-α4抗体或其抗原结合片段能够阻断含有α4亚基的整联蛋白和该整联蛋白的配体之间的相互作用。
VLA-4(α4β1)整联蛋白是VCAM-1、纤连蛋白和可能的结合VLA-4或以其它方式与VLA-4相互作用的其它分子的细胞表面受体。在这方面，这样的结合含有α4亚基的整联蛋白或以其它方式与其相互作用的分子单个地和统一地称作“α4配体”。术语VLA-4(也称作“α4β1”、“α4β1整联蛋白”、“α4β1”和“α4β1整联蛋白”)因而表示这样的多肽：其能够结合VCAM-1和胞外基质蛋白成员(最特别地是纤连蛋白)或其同系物或片段，尽管本领域的普通技术人员会理解，VLA-4的其它配体可能存在，且可以使用常规方法进行分析。
已知α4亚基会结合除了β1以外的β亚基，所以术语“α4整联蛋白”表示这样的整联蛋白：其α4亚基结合一个或另一个β亚基。“α4”整联蛋白的其它实例是α4β7。本文使用的术语“α4整联蛋白”表示VLA-4，以及含有β1、β7或任意其它β亚基的整联蛋白。
适合本文所述的方法的拮抗剂不限于特定的分子类型或结构，所以，认为下述任意试剂是本文所述拮抗剂的等效物：能够结合含有α4亚基的任意整联蛋白(例如，VLA-4，在携带VLA4的细胞的表面上)或α4β7整联蛋白(在携带α4β7的细胞的表面上)[参见Lobb和Hemler，J.Clin.Invest.，94：17221728(1994)]或它们各自的α4配体(分别诸如VCAM 1和MadCAM，在携带VCAM-1和MadCAM的细胞的表面上)并有效地阻断或包被VLA-4(或α4β7)或VCAM-1(或MadCAM)(即，分别是“α4整联蛋白结合剂”和“α4整联蛋白配体结合剂”)的任意试剂。
整联蛋白“拮抗剂”(在本文中也称作“α4拮抗剂”)包括抑制α4整联蛋白与α4整联蛋白配体和/或受体结合的任意化合物。含有抗-整联蛋白抗体的蛋白以及其它分子(诸如整联蛋白的配体蛋白的可溶形式)是有用的。α4整联蛋白的配体蛋白的可溶形式包括可溶的VCAM-1或胶原肽、VCAM-1融合蛋白、或双功能的VCAM-1/Ig融合蛋白。例如，可以施用α4整联蛋白配体或其片段的可溶形式来结合整联蛋白，且在有些情况下，竞争细胞上的整联蛋白结合部位，从而导致与施用诸如抗-α4整联蛋白等拮抗剂(例如，α4β7抗体或VLA-4抗体)类似的效应。具体地，结合α4整联蛋白配体、但是不会引起整联蛋白-依赖性的信号传递的可溶的α4整联蛋白突变体适合用于所述方法中。这样的突变体可以作为野生型整联蛋白的竞争性抑制剂，并被视作“拮抗剂”。其它合适的拮抗剂是下面定义的“小分子”。
拮抗超过一种α4整联蛋白的作用的药剂，诸如拮抗几种α4整联蛋白的单个小分子或抗体或抗体片段，例如，VLA-4和α4β7或α4整联蛋白的其它组合，适用于治疗血液学恶性肿瘤。不同分子的组合(因而组合的活性拮抗超过一种α4整联蛋白的作用)也适用于本文所述的方法。
在有些实施方案中，某些整联蛋白拮抗剂融合到或以其它方式缀合到例如抗体或抗体片段(例如，免疫球蛋白或其片段)上，且不限于整联蛋白或配体或其它分子的特定类型或结构。因而，能够形成融合蛋白和能够结合α4整联蛋白配体、并有效地阻断或包被α4β7或VLA-4整联蛋白的任意药剂，被视作在本文的实施例中使用的拮抗剂的等效物。
“α4整联蛋白配体/α4整联蛋白相互作用的拮抗剂”表示这样的药剂(例如，多肽或其它分子)：其可以抑制或阻断α4配体(例如，VCAM-1)或α4整联蛋白(例如，α4β7或VLA-4)-介导的结合，或可以以其它方式调控α4配体或α4整联蛋白功能，诸如通过抑制或阻断α4-配体介导的α4整联蛋白信号转导或α4配体-介导的α4配体信号转导，且其可以以与抗-α4整联蛋白抗体相同的方式，有效地治疗血液学恶性肿瘤(诸如AML)。
VCAM-1/VLA-4相互作用的拮抗剂是具有一种或多种下述性质的药剂：(1)它以足够的特异性包被或结合携带VLA-4的细胞(例如，AML细胞)的表面上的VLA-4，从而抑制VLA-4-配体/VLA-4相互作用，例如，骨基质细胞和骨髓瘤细胞之间的VCAM-1/VLA-4相互作用；(2)它以足够的特异性包被或结合携带VLA-4的细胞(即，骨髓瘤细胞)的表面上的VLA-4，从而调节(例如抑制)VLA-4-介导的信号的转导，例如，VLA-4/VCAM-1-介导的信号传递；(3)它以足够的特异性包被或结合骨基质细胞上的VLA-4配体(例如，VCAM1)，从而抑制VLA-4/VCAM相互作用；(4)它以足够的特异性包被或结合骨基质细胞上的VLA-4-配体(例如，VCAM-1)，从而调节(例如抑制)VLA-4-配体介导的VLA-4信号传递的转导，例如，VCAM-1-介导的VLA-4信号传递。在有些实施方案中，所述拮抗剂具有性质1和2中的一者或两者。在其它实施方案中，所述拮抗剂具有性质3和4中的一者或两者。此外，可以将超过一种拮抗剂施用给患者，例如，可以将结合VLA-4的药剂与结合VCAM-1的药剂相组合。
例如，VLA-4和VCAM-1的抗体或抗体片段以及天然结合蛋白的可溶形式是有用的。VLA-4的天然结合蛋白的可溶形式包括：可溶的VCAM-1肽、VCAM-1融合蛋白、双功能的VCAM-1/Ig融合蛋白、纤连蛋白、具有交替剪接的非类型m连接段的纤连蛋白、和含有氨基酸序列EILDV或类似的保守置换的氨基酸序列的纤连蛋白肽。VCAM-1的天然结合蛋白的可溶形式包括：可溶的VLA-4肽、VLAD融合蛋白、双功能的VLA-4/Ig融合蛋白等。本文使用的“可溶的VLA-4肽”或“可溶的VCAM-1肽”是不能将它自身锚定在膜中的VLA-4或VCAM-1多肽。这样的可溶的多肽包括，例如，这样的VLA-4和VCAM多肽：其在它们的跨膜结构域中缺少锚定多肽的足够部分，或被修饰成该跨膜结构域是无功能的。通过与细胞-表面结合蛋白竞争VLA-4，或通过以其它方式改变VLA-4功能，这些结合剂可以起作用。例如，可以施用可溶形式的VCAM-1(参见，例如，Osborn等人1989，Cell，59：12031211)或其片段，以结合VLA-4，诸如竞争骨髓瘤细胞上的VLA-4结合部位，从而导致与施用拮抗剂(诸如小分子或抗-VLA-4抗体)类似的效应。
在另一个实施例中，VCAM-1或其能够结合携带VLA-4的骨髓瘤细胞的表面上的VLA-4的片段，例如，含有VCAM-1的2个N-端结构域的片段，可以融合到第二个肽(例如，增加VCAM-1部分的溶解度或体内寿命的肽)上。所述第二个肽可以是可溶肽的片段，诸如人肽或血浆蛋白、或免疫球蛋白超家族的成员。通常，所述第二个肽是IgG或其一部分或片段，例如，人IgG1重链恒定区，且至少包括铰链、CH2和CH3结构域。
模仿肽的作用的药剂(例如，称作“小分子”的有机分子)能够破坏α4整联蛋白/α4整联蛋白配体相互作用，例如，通过结合在细胞表面上的VLA-4受体，从而阻断VLA-4，或通过结合在细胞表面上的VCAM-1受体，从而阻断VCAM-1。这些“小分子”本身可以是小肽，或更大的含有肽的有机化合物或非肽有机化合物。“小分子”无意涵盖抗体或抗体片段。尽管这样的“小”分子的分子量通常小于2000，该数字无意作为分子量的绝对上限。
例如，可以采用小分子，诸如模仿VLA-4配体的结合域并配合VLA-4的受体结构域的寡糖(参见，J.J.Devlin等人，1990，Science 249：400406(1990)，J.K.Scott和G.P.Smith，1990，Science 249：386390，和美国专利号4,833,092(Geysen)，都通过引用并入本文。相反地，可以采用模仿VCAM-1配体的结合域并配合VCAM-1的受体结构域的小分子。
在WO 06/131200和US2007/0004775(它们二者通过引用并入本文)中描述的小分子也适用于治疗血液学恶性肿瘤。
可用于本发明中的其它小分子的实例，可以参见：Komoriya等人(″TheMinimal Essential Sequence for a Major Cell Type-Specific Adhesion Site(CS1)Within the Alternatively Spliced Type III Connecting Segment Domain ofFibronectin Is Leucine-Aspartic Acid-Valine″，J.Biol.Chem.，266(23)，第1507579页(1991))。他们鉴别出了结合VLA-4必需的最小活性氨基酸序列，并合成了多种基于特定纤连蛋白种类的CS-1区域的氨基酸序列(VLA-4结合域)的重叠肽。他们鉴别出了8-氨基酸肽Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr以及2个更小的重叠五肽Glu-Ile-Leu-Asp-Val和Leu-Asp-Val-Pro-Ser，它们具有针对纤连蛋白-依赖性的细胞粘附的抑制活性。随后证实，某些更大的含有LDV序列的肽在体内是有活性的(T.A.Ferguson等人，″Two Integrin BindingPeptides Abrogate T-cell-Mediated Immune Responses In Vivo″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，第807276页(1991)；和S.M.Wahl等人，″Synthetic FibronectinPeptides Suppress Arthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion andRecruitment″，J.Clin.Invest.，94，第65562页(1994))。还已经描述了一种环状五肽Arg-Cys-Asp-TPro-Cys(其中Tpro表示4-硫代脯氨酸)，其可以抑制VLA-4和VLA-5与纤连蛋白的粘附(参见，例如，D.M.Nowlin等人″A NovelCyclic Pentapeptide Inhibits Alpha4Beta1 Integrin-mediated Cell Adhesion″，J.Biol.Chem.，268(27)，第2035259页(1993)；和PCT公开PCT/US91/04862)。
其它小分子VLAW抑制剂的实例已经报道在，例如，Adams等人″CellAdhesion Inhibitors″，PCT US97/13013，其描述了具有细胞粘附抑制活性的含有β-氨基酸的线性肽基化合物。国际专利申请WO 94/15958和WO 92/00995描述了具有细胞粘附抑制活性的环状肽和肽拟似物化合物。国际专利申请WO 93/08823和WO 92108464描述了含有胍基、脲和硫脲的细胞粘附抑制化合物。美国专利号5,260,27描述了胍基细胞粘附调控化合物。
可以如下生产这样的小分子模仿剂：合成多种肽、半肽化合物或非肽的有机化合物，然后筛选这些化合物的抑制α4整联蛋白/α4整联蛋白配体相互作用的能力。通常参见：美国专利号4,833,092，Scott和Smith，″Searching forPeptide Ligands with an Epitope Library″，Science，249，第38690页(1990)，和Devlin等人，″Random Peptide Libraries：A Source of Specific Protein BindingMolecules″，Science，249，第40407页(1990)。
在其它实施方案中，用于结合(包括阻断或包被)细胞-表面α4整联蛋白和/或α4整联蛋白配体的药剂是抗-VLA-4和/或抗-α4β7单克隆抗体或抗体片段。用于治疗、尤其是人治疗的抗体和抗体片段包括：人、人源化的、和嵌合的抗体和抗体片段、Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)抗体片段以及抗体重链或轻链的单体或二聚体或其混合物。通常，所述结合剂是结合VLA-4的单克隆抗体。
血液学恶性肿瘤
提供了使用含有VLA-4结合抗体的组合物治疗具有血液学障碍的患者的方法。血液学恶性肿瘤是影响血液、骨髓、和/或淋巴结的障碍，诸如癌症。血液学恶性肿瘤包括白血病，诸如ALL、AML、CML、CLL、和HCL；淋巴瘤，诸如霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤；和多发性骨髓瘤；骨髓增生异常综合征(MDS)(其最终可以是AML)；骨髓增殖性疾病，诸如真性红细胞增多症(也称作PV、PCV或真性红血球过多症(PRV))、特发性血小板增多症(ET)、骨髓纤维化；和由轻链病引起的淀粉样蛋白。
可以如下鉴别出具有血液学恶性肿瘤的患者，通过分析血细胞计数和血膜，例如通过光学显微术，其可以用于鉴别恶性细胞。活组织检查(诸如来自骨髓)也可以用于鉴别恶性细胞，且来自淋巴结的活组织检查可以用于鉴别淋巴结病。
急性髓性白血病(AML)
VLA-4结合抗体可以用于治疗白血病，诸如AML。白血病是源自骨髓的癌症，这时恶性细胞是白血细胞(白细胞)。急性髓性白血病(也称作急性髓细胞白血病、急性髓母细胞白血病、急性粒细胞白血病、和急性非淋巴细胞白血病)是源自粒细胞或单核细胞的恶性肿瘤。AML的特征在于：称作白血病淋巴母细胞(leukemic blast)的细胞的失控的、过度的生长和积累(其不能作为正常血细胞起作用)，和正常骨髓细胞生产的阻断，从而导致红细胞(贫血)、和血小板(血小板减少症)和正常白细胞(特别是嗜中性粒细胞，即，嗜中性粒细胞减少症)在血液中的缺乏。
AML的所有亚型都适合用VLA-4结合抗体进行治疗。基于成髓细胞在诊断时已经达到的发育阶段，对AML的亚型进行分类。所述类别和子集允许医师判断哪种治疗对该细胞类型的作用最好，以及疾病可能的发展速度。所述子集是：M0，成髓细胞白血病，基于专门分析；M1，成髓细胞白血病，没有成熟；M2，成髓细胞白血病，已经成熟；M3，前髓细胞性白血病；M4，髓单核细胞白血病；M5，单核细胞白血病；M6，红白血病；和M7，巨核细胞白血病。可以与特别适合AML亚型的第二药剂一起施用VLA-4抗体。例如，急性前髓细胞性白血病(APL)和急性单核细胞白血病是需要不同于其它AML亚型的治疗的AML亚型。用于治疗APL的第二药剂可以包括全反式维甲酸(ATRA)或抗代谢药，诸如阿糖胞苷。用于治疗急性单核细胞白血病的第二药剂可以包括脱氧腺苷类似物，诸如2-氯-2′-脱氧腺苷(2-CDA)。
AML的危险因素包括某些遗传障碍的存在，诸如唐氏综合征、范科尼贫血、舒-戴二氏综合征和其它遗传障碍。可以给具有AML和遗传障碍的患者施用VLA-4结合抗体和用于治疗遗传障碍征状的第二药剂。例如，可以给具有AML和范科尼贫血的患者施用VLA-4结合抗体和抗生素。
AML的其它危险因素包括用于治疗不同癌症的化疗或放疗、烟草烟雾、和暴露于大量苯。
如果血流或骨髓中恶性细胞的比率或比例存在统计上显著的差异，则认为治疗是有效的。例如，当实现缓解时(也就是当没有恶性细胞的迹象时)，认为治疗是有效的。
也可以评价施用第一药剂和任选的第二药剂的效能，这基于：例如，在血流中发现的恶性细胞的数目减少，细菌或病毒感染的频率或严重性降低，伤口愈合的速率增加，和患者的一般感觉，包括增加的能量水平和减少的骨和关节酸痛。
除了人研究以外，或在人研究之前，可以使用动物模型来评价使用所述两个药剂的效能。例如，可以给小鼠施用本文所述的第一和第二药剂，然后关于特征标准对小鼠进行评价，以确定在该模型中使用所述两个药剂的效能。这样的模型是本领域已知的，例如见Drug Discovery Today：DiseaseModels 3(2)：137-142(2006)；Blood，online March 30，2009；DOI10.1182/blood-2009-01-198937；以及互联网网址emice.nci.nih.gov/emice/mouse_models/organ_models/hema_models/hema_mouse_tools。
那他珠单抗和其它的VLA-4结合抗体
适用于治疗血液学恶性肿瘤(诸如AML)的抗体包括那他珠单抗，即一种α4整联蛋白结合抗体。那他珠单抗(美国选定药名)具有抗体代码号AN100226，也称作“TYSABRITM”。在任何体内修饰(例如，氨基酸的剪切)之前，那他珠单抗的轻链和重链的氨基酸序列如表1-1和表1-2所示。
表1-1：那他珠单抗轻链的序列(SEQ ID NO：1)
            10         20         30         40          50
  1DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKTSQDIN KYMAWYQQTP GKAPRLLIHY
 51TSALQPGIPS RFSGSGSGRD YTFTISSLQP EDIATYYCLQ YDNLWTFGQG
101TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD
151NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL
201SSPVTKSFNR GEC
表1-2：那他珠单抗重链的序列(SEQ ID NO：2)
            10         20         30         40          50
  1Q1VQLVQSGAEVKKPGASVKV SCKASGFNIK DTYIHWVRQA PGQRLEWMGR
 51IDPANGYTKY DPKFQGRVTI TADTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCAREG
101YYGNYGVYAM DYWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC
151LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG
201TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKYGPPCP SCPAPEFLGG PSVFLFPPKP
251KDTLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN
301STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ
551VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV
401LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLGK2
1谷氨酰胺环化为焦谷氨酸
2赖氨酸在翻译后被去除
那他珠单抗会抑制白细胞从血液迁移至中枢神经系统。那他珠单抗会结合在活化的T-细胞和其它单核白细胞的表面上的VLA-4(也称作α4β1)。它可以破坏T-细胞和内皮细胞之间的粘附，并从而防止单核白细胞穿过内皮迁移和进入实质。结果，也可以降低促炎细胞因子的水平。
那他珠单抗和有关的VLA-4结合抗体描述在例如美国专利号5,840,299中。单克隆抗体21.6和HP1/2是结合VLA-4的示例性的鼠单克隆抗体。那他珠单抗是鼠单克隆抗体21.6的人源化形式(参见，例如，美国专利号5,840,299)。还已经描述了HP1/2的人源化形式(参见，例如，美国专利号6,602,503)。几种额外的结合VLA-4的单克隆抗体(诸如HP2/1、HP2/4、L25和P4C2)描述在例如：美国专利号6,602,503；Sanchez-Madrid等人，1986Eur.J.Immunol.，16：1343-1349；Hemler等人，1987 J.Biol.Chem.2：11478-11485；Issekutz和Wykretowicz，1991，J.Immunol.，147：109(TA-2单抗)；Pulido等人，1991 J.Biol.Chem.，266：10241-10245；和美国专利号5,888,507。
有些VLA-4结合抗体会识别α4亚基的参与结合同源配体(例如，VCAM-1或纤连蛋白)的表位。许多这样的抗体会抑制VLA-4与同源配体(例如，VCAM-1和纤连蛋白)的结合。
有些有用的VLA-4结合抗体可以与细胞(例如，淋巴细胞)上的VLA-4相互作用，但是不会造成细胞聚集。但是，已经观察到，其它VLA-4结合抗体会造成这样的聚集。HP1/2不会造成细胞聚集。HP1/2单克隆抗体(Sanchez-Madrid等人，1986)具有非常高的效价，会阻断VLA-4与VCAM1和纤连蛋白的相互作用，且对VLA-4上的表位B具有特异性。该抗体和其它B表位-特异性的抗体(诸如B1或B2表位结合抗体；Pulido等人，1991，同上)代表着可以在本文所述的制剂和方法中使用的一类VLA-4结合抗体。
一种示例性的VLA-4结合抗体具有一个或多个CDR，例如，本文公开的特定抗体的所有3个HC CDR和/或所有3个LC CDR，或与这样的抗体(例如，那他珠单抗)总共具有至少80、85、90、92、94、95、96、97、98、99％同一性的CDR。在一个实施方案中，所述H1和H2高变环具有与本文所述抗体相同的规范结构(canonical structure)。在一个实施方案中，所述L1和L2高变环具有与本文所述抗体相同的规范结构。
在一个实施方案中，HC和/或LC可变结构域序列的氨基酸序列与本文所述抗体(例如，那他珠单抗)的HC和/或LC可变结构域的氨基酸序列具有至少70、80、85、90、92、95、97、98、99、或100％同一性。HC和/或LC可变结构域序列的氨基酸序列与本文所述抗体(例如，那他珠单抗)的对应序列可以相差至少一个氨基酸，但是不超过10、8、6、5、4、3、或2个氨基酸。例如，所述差异可以主要或完全在框架区中。
HC和LC可变结构域序列的氨基酸序列可以由这样的核酸序列编码：所述核酸序列在高严谨性条件下与本文所述的核酸序列杂交，或编码本文所述的可变结构域或氨基酸序列。在一个实施方案中，HC和/或LC可变结构域的一个或多个框架区(例如，FR1、FR2、FR3、和/或FR4)的氨基酸序列与本文所述抗体的HC和LC可变结构域的对应框架区具有至少70、80、85、90、92、95、97、98、99、或100％同一性。在一个实施方案中，一个或多个重链或轻链框架区(例如，HC FR1、FR2、和FR3)与来自人种系抗体的对应框架区的序列具有至少70、80、85、90、95、96、97、98、或100％同一性。
如下计算2个序列之间的“同源性”或“序列同一性”(所述术语在本文中互换地使用)。为了最佳对比目的，比对所述序列(例如，为了最佳比对，可以将间隙引入第一个和第二个氨基酸或核酸序列中的一者或二者，且可以为了对比目的，忽视非同源序列)。使用GCG软件包中的GAP程序，使用Blossum 62评分矩阵(间隙罚分为12、间隙延伸罚分为4、移码间隙罚分为5)，将最佳比对确定为最佳评分。然后对比在对应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当在第一个序列中的位置被与在第二个序列中对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置是相同的(本文使用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。2个序列之间的同一性百分比随着所述序列共有的相同位置的数目而变化。
本文使用的术语“在高严谨性条件下杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。关于进行杂交反应的指导，可以参见：Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，其通过引用并入。在该参考文献中描述了水性的和非水性的方法，且可以使用任一种。高严谨性杂交条件包括：在约45℃在6X SSC中杂交，随后在65℃在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次，或基本上类似的条件。
示例性的第二药剂
在某些情况下，治疗血液学障碍的方法包括：施用VLA-4结合抗体和第二治疗剂。
在一个实现中，将所述VLA-4结合抗体和第二药剂提供为共同制剂，并将所述共同制剂施用给受试者。还可能，例如，在施用共同制剂之前或之后至少24小时，单独施用一个剂量的抗体制剂，然后施用一个剂量的含有第二药剂的制剂。在另一个实现中，将所述抗体和第二药剂提供为单独的制剂，且施用步骤包括：先后施用所述抗体和第二药剂。先后给药可以在同一天(例如，彼此相隔不到1小时，或相隔至少3、6、或12小时)或在不同天提供。
在一个实施方案中，所述抗体和第二药剂各自作为在时间上分开的多个剂量来施用。所述抗体和第二药剂通常根据方案来各自施用。其一或二者的方案可以具有规则的周期性。抗体的方案可以具有不同于第二药剂的方案的周期性，例如，一种可以比另一种更频繁地施用。在一个实现中，每周施用所述抗体和第二药剂之一一次，并每月施用另一种一次。在另一个实现中，连续地施用所述抗体和第二药剂之一，例如，在超过30分钟、但是小于1、2、4、或12小时的时段内，且另一种作为推注施用。通过任意适当的方法，例如，皮下地、肌肉内地、或静脉内地，可以施用所述抗体和第二药剂。
在有些实施方案中，以各自与在单一疗法中相同的剂量，施用所述抗体和第二药剂中的每一个。在其它实施方案中，以等于或小于单独施用时效能所需的量的剂量，施用所述抗体。同样地，可以以等于或小于单独施用时效能所需的量的剂量，施用所述第二药剂。
与VLA-4结合抗体联合地用于治疗血液学恶性肿瘤(诸如AML)第二药剂的非限制性实例包括：阿糖胞苷(也称为AraC或胞嘧啶阿糖胞苷)、柔红霉素(道诺霉素)、多柔比星、替莫唑胺、道诺霉素、更生霉素、表柔比星、伊达比星、依索比星、博来霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、吉妥珠单抗奥唑米星、利妥昔单抗、ofatumumab、托西莫单抗、替伊莫单抗、依帕珠单抗、阿伦单抗、氟达拉滨、二-氯乙基硝基脲、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、普卡霉素、泼尼松、羟基孕酮、睾酮、他莫昔芬、达卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲基三聚氰胺、五甲基三聚氰胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基硝基脲、氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧柯福霉素(喷司他丁)、2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨)、4-羟基过氧环磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷(5-FUdR)、美法仑、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙碱、紫杉醇、长春新碱、长春碱、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、托泊替康、吉西他滨、替尼泊苷、顺铂、卡波铂、和二乙基己烯雌酚(DES)。通常，参见，The Merck Manual of Diagnosis andTherapy，第15版.1987，第1206-1228页，Berkow等人，编，Rahway，N.J.。当与在本发明中表征的dsRNA一起使用时，这样的化学治疗剂可以单独使用(例如，5-FU和寡核苷酸)，先后使用(例如，施用5-FU和寡核苷酸一段时间后，继之以MTX和寡核苷酸)，或与一种或多种其它的这类化学治疗剂联合施用(例如，5-FU、MTX和寡核苷酸，或5-FU、放疗和寡核苷酸)。抗炎药(包括但不限于非类固醇类抗炎药和皮质甾类)、和抗病毒药(包括但不限于利巴韦林、阿糖腺苷、阿昔洛韦和更昔洛韦)也可以组合在本发明表征的组合物中。通常，参见，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第15版，Berkow等人，编，1987，Rahway，N.J.，分别在第2499-2506页和第46-49页)。
第二治疗剂还可以是蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米；Flt3抑制剂，例如索拉非尼；或者干细胞稳定剂，例如普乐沙福。
其它非-RNAi化学治疗剂也在本发明的范围内。
2种或更多种组合的化合物可以一起使用，或先后使用。
在有些实施方案中，给具有血液学恶性肿瘤的患者施用除了VLA-4结合抗体给药之外的治疗。例如，给所述患者施用输血、放疗、免疫治疗或骨髓移植。在一个实施方案中，所述患者具有AML，且所述患者除了接受VLA-4抗体治疗以外，还接受血液干细胞移植。
在有些实施方案中，可以使用第二药剂来治疗恶性肿瘤的一种或多种征状或副作用。副作用包括，例如，贫血(其可能造成疲劳和呼吸短促)、感染增加、骨和关节痛、轻度发热、更容易擦伤或出血(例如，牙龈或鼻出血，或伤口愈合缓慢)。这样的药剂包括，例如，抗生素或补铁剂。示例性的抗生素包括，例如，阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类诸如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药诸如氨基格鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；defofamine；地美可辛；地吖醌；多卡米星、maytansin、auristatin、elfomithine；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌(诺安托)；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSKTM；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(也称作“Ara-C”、阿糖胞苷和胞嘧啶阿糖胞苷)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL TM，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西他赛(TAXOTERETM，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌(诺安托)；长春新碱；长春瑞滨(诺维本)；诺肖林；替尼泊苷；柔红霉素(道诺霉素)；氨基蝶呤；卡培他滨(希罗达)；伊班膦酸盐；喜树碱-11(CPT-1)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨；和以上任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。作为合适的化学治疗细胞调节剂，还包括抗激素剂，其作用是调节或抑制激素对肿瘤的作用，诸如抗雌激素类，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬，抑制芳香酶的4(5)-咪唑类、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮、和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素类诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、多柔比星、柔红霉素、多卡米星、新长春碱、和长春碱。
在有些实施方案中，所述第二药剂是第二种抗-α4结合抗体或双特异抗体。例如，为了治疗血液学恶性肿瘤，可以施用VLA-4结合抗体和α4β7结合抗体(或其片段)。
除了第二药剂以外，还可能给受试者递送其它药剂。但是，在有些实施方案中，除了VLA-4结合抗体和第二药剂以外，不给受试者施用蛋白或生物制品作为药物组合物。VLA-4结合抗体和第二药剂可以是通过注射递送的唯一药剂。在其中VLA-4结合抗体和第二药剂是重组蛋白的实施方案中，VLA-4结合抗体和第二药剂可以是施用给受试者的唯一重组药剂，或至少是调节免疫或炎症应答的唯一重组药剂。在其它实施方案中，单独的VLA-4结合抗体是施用给受试者的唯一重组药剂或唯一生物制品。
药物组合物
本文所述的组合物被配制成药物组合物。通常，药物组合物包含药学上可接受的载体。本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
“药学上可接受的盐”表示这样的盐：其保留抗体的希望的生物活性，且不会产生任何不希望的毒理学作用(参见例如，Berge，S.M.，等人(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括源自无毒的无机酸(诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸等)的那些，以及源自无毒的有机酸(诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基-取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸、游离氨基酸等)的那些。碱加成盐包括源自碱土金属(诸如钠、钾、镁、钙等)的那些，以及源自无毒的有机胺(诸如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的那些。
通常，生理上相容的试剂(诸如游离氨基酸，游离氨基酸的氢氯化物盐、钠盐、或钾盐)被用作药物制剂中的赋形剂，以促进抗体的稳定性。本文的制剂可以包括添加剂，诸如甘油、甘露醇、山梨醇、和其它多元醇、以及糖类(例如，蔗糖)，以促进稳定性。
含有VLA-4结合抗体的药物组合物可以是液体溶液(例如，注射液和不溶性的溶液)的形式。这样的组合物可以通过肠胃外模式(例如，皮下的、腹膜内的、或肌肉内的注射)来施用。本文使用的短语“肠胃外给药”和“肠胃外地施用的”是指除了肠内和局部给药以外的给药模式，通常是通过注射，且包括：皮下的或肌肉内的给药、以及静脉内的、囊内的、眶内的、心内的、真皮内的、腹膜内的、经气管的、表皮下的、囊下的、蛛网膜下的、椎管内的、硬膜外的、肝内的、关节内的、滑膜内的、鞘内的、病灶内的、淋巴管内的、颅内的和胸骨内的注射和输注。在有些实施方案中，可在抗体之前施用例如透明质酸酶的物质，从而允许皮下给予更大量的抗体。在一个实施方案中，皮下地施用本文所述的制剂。
药物组合物是无菌的，且在生产和储存条件下是稳定的。还可以测试药物组合物，以确保它满足调控的和工业的管理标准。
可以将含有VLA-4结合抗体的药物组合物配制成溶液、微乳剂、分散系、脂质体、或适合高抗体浓度的其它有序结构。可以如下制备无菌的注射液：与上面列举的一种成分或多种成分的组合(根据需要)一起，将需要量的本文所述的药剂掺入适当的溶剂中，随后过滤除菌。通常，如下制备分散系：将本文所述的药剂掺入无菌的媒介物中，所述媒介物含有基础分散介质和需要的来自上面列举的那些的其它成分。可以维持溶液的适当流动性，例如，通过使用包衣剂诸如卵磷脂，通过维持需要的粒度(在分散系的情况下)，和通过使用表面活性剂。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
制备抗体制剂的方法
可以如在美国公开申请2005/0053598或WO2008157356中所述，制备含有VLA-4结合抗体的制剂。这些申请的内容通过引用并入本文。
施用
通过多种方法，可以将含有VLA-4结合抗体的组合物施用给具有血液学恶性肿瘤(例如，AML)的受试者，例如，人受试者。通常，肠胃外地，诸如通过皮下的、静脉内的、肌肉内的、关节内的、滑膜内的、胸骨内的、鞘内的、肝内的、病灶内的和颅内的注射或输注技术，施用VLA-4结合抗体。在有些实施方案中，鼻内地施用含有所述抗体的组合物。
含有有效地防止、阻止或抑制细胞粘附的VLA-4结合抗体或抗体片段的组合物的剂量和剂量率取决于多种因素，诸如抗体或片段的性质、患者体型、治疗目的、要治疗的病理学性质、使用的具体药物组合物、和主治医师的判断。约0.001至约100mg/kg体重/天(例如，约0.1至约50mg/kg体重/天)的剂量水平的活性成分化合物是有用的。通常，以约0.1mg/kg体重/天至约20mg/kg体重/天(例如，约0.1mg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天)范围内的剂量，并以每1-90天的间隔，施用VLA-4抗体或抗体片段。可以以有效地提供至少1mg/ml的抗体血浆水平的量，施用抗体组合物。可以如下确定剂量的优化：施用结合剂，随后在给定的剂量体内施用后，评估该试剂随时间对VLA-4-阳性细胞的包被。
可以以固定剂量，或以mg/kg剂量，施用组合物。通常，以固定剂量进行施用。例如，可以在每4周(例如，每月)1mg至500mg(例如，1mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg)的固定单位剂量，或在每2周50mg至250mg(例如，75mg、100mg、150mg、200mg)的固定单位剂量，或在每周一次25mg至150mg(例如，50mg、75mg、100mg、125mg)的固定单位剂量，施用制剂。还可以以1至8mg/kg(例如，约6.0、4.0、3.0、2.0、1.0mg/kg)的剂量，推注施用制剂。修改的剂量范围包括小于500、400、300、250、200、150或100mg/受试者的剂量，通常用于每4周或每月一次给药。在一个实施方案中，总剂量为每28天50至1200mg(例如100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg、或1100mg)。例如，可以每3-9周(例如，每第4周、每第5周、每第6周、每第7周、或每第8周)施用VLA-4结合抗体。
可以调节剂量方案，以提供希望的应答，例如治疗应答。还可以选择剂量，以减少或避免针对VLA-4结合抗体的抗体的产生，以达到大于40、50、70、75、或80％的α4亚基饱和度，以达到小于80％、70％、60％、50％、或40％的α4亚基饱和度，或防止循环白血细胞水平的增加。
可以如下测定VLA-4结合抗体的毒性和治疗效能：通过在细胞培养物或实验动物中的标准制药规程，例如，用于测定LD50(使50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗上有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，它可以表示为LD50/ED50比。表现出高治疗指数的化合物是典型的。
从细胞培养试验和动物研究得到的数据可以用于形成用于人类的剂量范围。组合物的剂量通常在包括几乎没有或根本没有毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可以在该范围内随采用的剂型和使用的给药途径而变化。对于在本发明表征的方法中使用的任何化合物，从细胞培养试验可以初步估计治疗上有效的剂量。可以在动物模型中形成剂量，以达到化合物的循环血浆浓度范围，或在适当时，达到靶序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，达到降低的多肽浓度)，所述范围包括IC50(即，达到征状的半数最大抑制的实验化合物浓度)，这在细胞培养物中测定。这样的信息可以用于更准确地确定在人类中有用的剂量。通过例如高效液相色谱法，可以测量在血浆中的水平。
在某些实施方案中，使用保护抗体免于快速释放的载体，可以制备活性剂，诸如控释制剂，包括植入物和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、和聚乳酸。许多制备这样的制剂的方法获得了专利，或通常是已知的。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，编，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
可以调节剂量方案，以提供希望的应答，例如治疗应答。“治疗应答”是与障碍有关的病症、征状、或参数的改善，以达到统计上显著的程度或本领域技术人员可检测的程度。
本文使用的剂量单位形式或“固定的剂量”表示适合作为要治疗的受试者的单元剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算会产生希望的治疗效果的预定量的活性抗体，其与需要的药用载体相组合，并任选地与其它药剂相组合。
药物组合物可以包括“治疗有效量”的本文所述的VLA-4-结合抗体，例如，那他珠单抗。基于施用的药剂的作用，或药剂和第二药剂(如果使用超过一种药剂)的联合作用，可以确定这样的有效量。药剂的治疗有效量也可以随多种因素变化，诸如疾病状态，个体的年龄、性别、和体重，和抗体在个体中引起希望的应答的能力，例如，至少一种障碍参数(例如，AML参数)的改善，或障碍(例如，AML)的至少一种征状的改善。治疗有效量也是这样的量，其中治疗上有益的作用超过组合物的任何有毒的或有害的作用。
装置和试剂盒
使用医疗装置，可以施用含有VLA-4-结合抗体(例如，那他珠单抗)的组合物，用于治疗血液学恶性肿瘤(诸如AML)。可以将所述装置设计成具有下述特征，诸如携带性、室温储存、和容易使用，使得它可以用于紧急情形，例如，由未经训练的受试者或急救人员在野外使用，从医疗设施和其它医疗设备取出。所述装置可以包括，例如，一个或多个用于储存包含VLA-4-结合抗体(例如，那他珠单抗)的药物制剂的壳体，且可以构造成递送一个或多个单位剂量的药剂。
例如，使用经皮的递送装置(诸如注射器，包括皮下注射器或多室注射器)，可以施用药物组合物。在一个实施方案中，所述装置是具有连接的或整体的针头的预填充的注射器。在其它实施方案中，所述装置是不具有连接的针头的预填充的注射器。所述针头可以与预填充的注射器一起包装。在一个实施方案中，所述装置是自动注射装置，例如，自动注射器。在另一个实施方案中，所述注射装置是笔式注射器。在另一个实施方案中，所述注射器是竖针注射器、路厄旋口注射器、或路厄滑套注射器(luer slip syringe)。其它合适的递送装置包括支架、导管、显微操作针、和可植入的控释装置。使用标准的静脉内装置(包括，例如，静脉内管道)，使用或不使用线内过滤器，可以静脉内地施用组合物。在某些实施方案中，所述装置是用于皮下或肌肉内给药的注射器。
可以使用医疗装置来施用药物组合物。例如，使用无针皮下注射装置，诸如在美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824、或4,596,556中公开的装置，可以施用药物组合物。众所周知的植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了一种用于以受控的速率分配药物的可植入的微量输液泵；美国专利号4,486,194，其公开了一种用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了一种用于以精确的输注速率递送药物的药物输液泵；美国专利号4,447,224，其公开了一种用于连续药物递送的变速流可植入的输液器；美国专利号4,439,196，其公开了一种具有多室隔室的渗透药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其公开了一种渗透药物递送系统。所述治疗组合物也可以是用于皮下或肌肉内给药的可生物降解的或不可生物降解的持续释放制剂形式。参见，例如，美国专利号3,773,919和4,767,628和PCT申请号WO 94/15587。使用可植入的或体外的泵，也可以实现连续给药。给药也可以间断进行，例如，每天单次注射，或以低剂量连续进行，例如，持续释放制剂。可以将递送装置调整成最佳地适用于施用VLA-4结合抗体。例如，可以硅化处理注射器至对于抗-VLA-4抗体的储存和递送而言最佳的程度。当然，许多其它的这样的植入物、递送系统、和模块也是已知的。
本发明也表征了用于施用第一和第二药剂的装置。所述装置可以包括，例如，一个或多个用于储存药物制剂的壳体，且可以构造成递送单位剂量的第一和第二药剂。所述第一和第二药剂可以储存在相同的或单独的隔室中。例如，所述装置可以在给药之前混合药剂。还可能使用不同的装置来施用第一和第二药剂。
可以在试剂盒中提供VLA-4-结合抗体(例如，那他珠单抗)。在一个实施方案中，所述试剂盒包括：(a)含有组合物的容器，所述组合物包含高浓度的VLA-4-结合抗体，任选的(b)含有组合物的容器，所述组合物包含第二药剂，和任选的(c)信息材料。所述信息材料可以是描述性的、指导性的、销售性的或其它材料，其涉及本文所述的方法和/或使用所述药剂的治疗益处。在一个实施方案中，所述试剂盒还包括第二药剂，例如，化学治疗剂。例如，所述试剂盒包括第一个容器和第二个容器，所述第一个容器含有包含VLA-4-结合抗体的组合物，且所述第二个容器包含第二药剂。在一个实施方案中，所述试剂盒包括一个或多个一次性使用的注射器，所述注射器预先填充了本文所述的高浓度液体抗体制剂。
试剂盒的信息材料的形式没有限制。在一个实施方案中，所述信息材料可以包括关于抗体的生产、浓度、失效期、批次或产地信息等的信息。在一个实施方案中，所述信息材料涉及施用VLA-4-结合抗体(例如，那他珠单抗)的方法，例如，以合适的剂量、剂型、或给药模式(例如，本文所述的剂量、剂型、或给药模式)，以治疗具有血液学恶性肿瘤(例如，AML)的受试者，或处于经历与血液学恶性肿瘤有关的发作风险中的受试者。所述信息可以以多种形式提供，包括印制文本、计算机可读物质、视频记录、或音频记录，或为实体材料(substantive material)提供了联系或地址的信息。
除了药剂以外，试剂盒中的组合物可以包括其它成分，诸如溶剂或缓冲液、稳定剂、或防腐剂。所述药剂可以以任意形式提供，例如，液体、干燥的或低压冻干的形式，和以基本上纯的和/或无菌的形式。当在液体溶液中提供药剂时，所述液体溶液是例如水溶液。当作为干燥形式提供药剂时，通常通过加入合适的溶剂，进行重配。在试剂盒中可以任选地提供溶剂，例如，无菌的水或缓冲液。
试剂盒可以包括一个或多个容器，所述容器用于容纳一种或多种含有药剂的组合物。在有些实施方案中，所述试剂盒含有组合物和信息材料的单独的容器、分配器或隔室。例如，组合物可以包含在瓶子、管形瓶、或注射器中，且信息材料可以包含在塑料筒或盒中。在其它实施方案中，所述试剂盒的单独元件包含在单个未分隔的容器内。例如，组合物包含在已经连接了标签形式的信息材料的瓶子、管形瓶或注射器中。在有些实施方案中，所述试剂盒包括多个(例如，一包)单个的容器，每个容器含有药剂的一个或多个单位剂型(例如，本文所述的剂型)。所述容器可以包括组合单位剂量，例如，包括理想比例的VLA-4-结合抗体(例如，那他珠单抗)和第二药剂(例如，化学治疗剂)的单位。例如，所述试剂盒包括多个注射器、安瓿、箔包、泡罩包、或医疗装置，例如，每个含有单个组合单位剂量。试剂盒的容器可以是不透气的、防水的(例如，对于水分或蒸发的变化是不可透过的)、和/或不透光的。
所述试剂盒任选地包括适合施用组合物的装置，例如，注射器或其它合适的递送装置。所述装置可以预装载一种或两种药剂，或可以是空的(但是适合装载)。
抗体生成
通过免疫(例如使用动物)、或通过体外方法(诸如噬菌体展示)，可以生成结合VLA-4的抗体。VLA-4的全部或一部分可以用作免疫原。例如，α4亚基的胞外区可以用作免疫原。在一个实施方案中，所述免疫的动物含有免疫球蛋白生产细胞，所述细胞具有天然的、人、或部分人免疫球蛋白基因座。在一个实施方案中，所述非人动物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，可能用人Ig基因座的大片段来工程化具有小鼠抗体生产缺陷的小鼠品系。使用杂交瘤技术，可以生产和选择源自具有希望的特异性的基因的抗原-特异性的单克隆抗体。参见，例如，XenoMouseTM，Green等人NatureGenetics 7：13-21(1994)，美国2003-0070185，美国专利号5,789,650和WO96/34096。
还可以在例如啮齿动物中生产VLA-4的非人抗体。可以人源化所述非人抗体，例如如在美国专利号6,602,503、EP 239400、美国专利号5,693,761、和美国专利号6,407,213中所述。
EP 239400(Winter等人)描述了通过将一个物种的抗体(在指定的可变区内)的互补性决定区(CDR)置换为另一物种的CDR，从而改变抗体的方法。CDR-置换的抗体可以比真正的嵌合抗体更少可能地引起人的免疫应答，因为CDR-置换的抗体含有明显更少的非人组分(Riechmann等人，1988，Nature 332，323-327；Verhoeyen等人，1988，Science 239，1534-1536)。通常，使用重组核酸技术，将鼠抗体的CDR置换为人抗体的对应区，以产生编码希望的置换的抗体的序列。可以添加具有希望的同种型的人恒定区基因区段(通常是γI(对于CH而言)和κ(对于CL而言))，并可以在哺乳动物细胞中共表达人源化的重链基因和轻链基因，以产生可溶的人源化抗体。
Queen等人，1989和WO 90/07861已经描述了一种方法，其包括：通过计算机分析与原始鼠抗体的V区框架的最佳蛋白序列同源性，选择人V框架区，并建立鼠V区的三级结构模型，从而显示可能与鼠CDR相互作用的框架氨基酸残基。然后将这些鼠氨基酸残基叠加在同源人框架上。也参见美国专利号5,693,762；5,693,761；5,585,089；和5,530,101。Tempest等人，1991，Biotechnology 9，266-271利用分别源自NEWM和REI重链和轻链的V区框架作为标准，在不引入小鼠残基的情况下，进行CDR-移植。使用Tempest等人方案构建基于NEWM和REI的人源化抗体的一个好处是，NEWM和REI可变区的三维结构可通过X-射线晶体学弄清楚，因而可以对CDR和V区框架残基之间的特异性相互作用建立模型。
可以将非人抗体修饰成包括插入人免疫球蛋白序列的取代，例如在特定位置处的共有人氨基酸残基，例如在一个或多个(诸如至少5、10、12、或全部)下述位置：(在轻链可变结构域的FR中)4L、35L、36L、38L、43L、44L、58L、46L、62L、63L、64L、65L、66L、67L、68L、69L、70L、71L、73L、85L、87L、98L、和/或(在重链可变结构域的FR中)2H、4H、24H、36H、37H、39H、43H、45H、49H、58H、60H、67H、68H、69H、70H、73H、74H、75H、78H、91H、92H、93H、和/或103H(根据Kabat编号)。参见，例如，美国专利号6,407,213。
使用例如体外引发的人脾细胞，可以生产结合VLA-4的全人单克隆抗体，如Boerner等人，1991，J.Immunol.，147，86-95所述。通过所有组分克隆(repertoire cloning)，可以制备它们，参见：Persson等人，1991，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，88：2432-2436，或Huang和Stollar，1991，J.Immunol.Methods 141，227-236；以及美国专利号5,798,230。大型未免疫的人噬菌体展示文库也可以用于分离高亲和力抗体，使用标准的噬菌体技术，可以将它们开发为人治疗剂(参见，例如，Vaughan等人，1996；Hoogenboom等人(1998)Immunotechnology 4：1-20；和Hoogenboom等人(2000)Immunol Today2：371-8；美国2003-0232333)。
抗体生产
可以在原核细胞和真核细胞中生产抗体。在一个实施方案中，在诸如毕赤酵母(参见，例如，Powers等人(2001)JImmunol Methods.251：123-35)、汉逊酵母(Hanseula)、或酵母菌(Saccharomyces)等酵母细胞中表达抗体(例如，scFv)。
在一个实施方案中，在哺乳动物细胞中生产抗体，尤其是全长抗体，例如IgG。用于重组表达的示例性的哺乳动物宿主细胞包括：中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，其与DHFR选择标记一起使用，例如，描述于Kaufman和Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621)，淋巴细胞系，例如，NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞、K562、和来自转基因动物(例如，转基因的哺乳动物)的细胞。例如，所述细胞是哺乳动物上皮细胞。
除了编码免疫球蛋白结构域的核酸序列以外，重组表达载体还可以携带额外的核酸序列，诸如调节该载体在宿主细胞中的复制的序列(例如，复制起点)和选择标记基因。选择标记基因会促进选择其中已经导入了所述载体的宿主细胞(参见例如，美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。示例性的选择标记基因包括：二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于使用甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
在一个示例性的抗体(例如，全长抗体或其抗原结合部分)重组表达系统中，通过磷酸钙介导的转染，将编码抗体重链和抗体轻链二者的重组表达载体导入dhfr-CHO细胞中。在该重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自可操作地连接到增强子/启动子调控元件(例如，源自SV40、CMV、腺病毒等，诸如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子/AdMLP启动子调控元件)上，以驱动所述基因的高水平转录。所述重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用甲氨蝶呤选择/扩增，选择已经用所述载体转染的CHO细胞。培养选择的转化体宿主细胞，使之表达抗体重链和轻链，并从培养基中回收完整抗体。使用标准的分子生物学技术来制备重组表达载体，以转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞，并从培养基中回收抗体。例如，通过利用蛋白A或蛋白G的亲和色谱法，可以分离有些抗体。例如，使用标准的蛋白浓缩技术，可以将纯化的VLA-4-结合抗体(例如那他珠单抗)浓缩至约100mg/mL至约200mg/mL。
抗体还可以包含修饰，例如，改变Fc功能的修饰，例如，从而减弱或消除与Fc受体或与C1q或与二者的相互作用。例如，人IgG1恒定区可以在一个或多个残基(例如残基234和237中的一个或多个，例如，根据美国专利号5,648,260中的编号)处突变。其它示例性的修饰包括在美国专利号5,648,260中描述的那些。
对于有些包含Fc结构域的抗体，可以将抗体生产系统设计成合成其中Fc区被糖基化的抗体。例如，IgG分子的Fc结构域在CH2结构域的天冬酰胺297处被糖基化。该天冬酰胺是用双触角型寡糖修饰的位置。这种糖基化参与Fc γ受体和补体C1q介导的效应子功能(Burton和Woof(1992)Adv.Immunol.51：1-84；Jefferis等人(1998)Immunol.Rev.163：59-76)。可以在哺乳动物表达系统中生产Fc结构域，从而适当地糖基化与天冬酰胺297对应的残基。Fc结构域也可以包含其它的真核细胞翻译后修饰。
抗体也可以由转基因动物生产。例如，美国专利号5,849,992描述了在转基因哺乳动物的乳腺中表达抗体的方法。构建转基因，使其含有乳特异性的启动子、编码目标抗体(如本文所述的抗体)的核酸序列、以及用于分泌的信号序列。由这类转基因哺乳动物中的雌性动物生产的乳汁包含分泌在其中的目标抗体(如本文所述的抗体)。可以从乳汁中纯化出所述抗体，或在一些应用中，直接使用。
可以修饰抗体，例如，使用改善(例如，至少1.5、2、5、10、或50倍)其在循环(例如，血液、血清、淋巴)、支气管肺泡灌洗液、或其它组织中的稳定性和/或保留的部分。
例如，VLA-4结合抗体可以与聚合物结合，所述聚合物例如基本上无抗原性的聚合物，诸如聚环氧烷烃(polyalkylene oxide)或聚环氧乙烷(polyethylene oxide)。合适的聚合物可以在分子量上差别很大。可以使用数均分子量在约200至约35,000道尔顿(或约1,000至约15,000，和2,000至约12,500)范围内的聚合物。
例如，VLA-4结合抗体可以与水溶性聚合物缀合，所述水溶性聚合物例如亲水的聚乙烯聚合物，如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。这类聚合物的非限制性列表包括：聚环氧烷烃均聚物诸如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化的多元醇、它们的共聚物和嵌段共聚物，条件是，维持所述嵌段共聚物的水溶性。其它可用的聚合物包括：聚氧化烯(polyoxyalkylene)如聚氧乙烯、聚氧丙烯、以及聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆；含有以下糖单体的分支或非分支多糖：D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如聚甘露糖醛酸或海藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神经氨酸包括同多糖和杂多糖诸如乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、硫酸葡聚糖、葡聚糖、糊精、糖原、或酸性粘多糖的多糖亚基如透明质酸；糖醇聚合物如聚山梨糖醇和聚甘露糖醇；肝素或heparon。
在本文中包含的所有参考文献和出版物都通过引用并入。下述实施例无意进行限制。
实施例
下面的实施例证实了，在共培养实验中，VLA-4结合抗体那他珠单抗会阻断VLA-4介导的骨髓瘤和白血病细胞系与配体VCAM-1和纤连蛋白的粘附，以及与骨髓基质细胞的粘附。经证实，用那他珠单抗处理这些细胞系，会破坏存活信号传递途径，并增加细胞对细胞毒性剂的敏感性。因而，VLA-4粘附会参与血液学恶性肿瘤的存活和化学抗性，并且用VLA-4结合抗体(诸如那他珠单抗)破坏这些相互作用是有效的治疗方案。
实施例1.在血液学肿瘤细胞系上表达VLA-4
骨髓微环境与淋巴样和骨髓样祖细胞的发育有关，且也为源自这些细胞类型的恶性肿瘤提供保护环境。整联蛋白介导的骨髓基质细胞和肿瘤细胞之间的粘附相互作用，会在共培养模型中提供细胞保护优点。
如下面证实的，整联蛋白VLA-4在血液学恶性肿瘤中广泛表达。VLA-4与骨髓基质中的纤连蛋白和在骨髓基质细胞表面上的血管细胞粘附分子-1(VCAM-1或CD106)啮合，并活化肿瘤细胞中的多种促存活的信号传递途径。
观察到VLA-4在AML、MM和CML的血液学肿瘤细胞系上表达(图1A、1B和1C)。
进行流式细胞术实验，以评估肿瘤细胞系上的VLA-4表达水平，并在测试的所有细胞系上观察VLA-4表达(图1)。如图2所示，通过流式细胞术测定那他珠单抗与AML、CLL和MM肿瘤细胞系的结合。在所有情况中，观察到饱和的结合，并且表2中示出了那他珠单抗的计算亲和性(EC50值)。
表2.结合细胞系的那他珠单抗的定量
Figure BDA0000119331770000341
实施例2.那他珠单抗抑制肿瘤细胞与VLA-4配体的结合
进行实验来测试VLA-4拮抗剂是否能够抑制肿瘤细胞与VLA-4配体的结合。在有浓度渐增的那他珠单抗或同种型对照抗体存在下，允许细胞系粘附到用纤连蛋白(●FN)、血管粘附分子-1-Ig融合蛋白(■VCAM-Ig)、或骨髓基质细胞(▲BMSC)包被的孔上。结果证实了那他珠单抗的以剂量依赖方式抑制不同肿瘤细胞类型与VLA-4配体的粘附的能力(图3A、3B、4A、4B、5A和5C)。那他珠单抗粘附抑制的计算IC50值示于表2。还测定了在有饱和水平的那他珠单抗(实心条)或同种型对照(空心条)存在下，肿瘤细胞与VLA-4配体的结合的最大可达抑制水平，结果如图3C、3D、4C、和5C所示。经证实，那他珠单抗会抑制测定的所有细胞类型的结合。总的来说，上述数据清楚地证实了那他珠单抗以高亲和力结合表达VLA-4的血液学肿瘤细胞和有效抑制这些细胞中VLA-4介导的粘附相互作用的能力。
实施例3.那他珠单抗消除AML HL60细胞的粘附介导的抗药性
在有BMSC存在下培养AML细胞系HL60，会在用化学治疗剂ara-C处理时，为细胞提供保护优点，如图6A所示。在有(■)或没有(□)BMSC存在下，培养细胞24小时，然后暴露于化疗药物AraC(阿糖胞苷)24小时(图6A)。BMSC的存在会增强细胞生存。当在该试验中将那他珠单抗与经证实可有效降低在共培养物中的生存力的浓度(10μM)的ara-C相组合时，发生细胞凋亡的细胞的百分比增加，如图6B所示。这些数据指示，那他珠单抗可以克服BMSC的细胞保护作用，提示它可以有效地克服VLA-4粘附介导的抗药性。
使用MM细胞系U226的类似实验证明那他珠单抗不具有抗药物美法仑的细胞保护作用(图6C和6D)。
实施例4.那他珠单抗处理抑制共培养诱导的通过P-STAT3的存活信号 传递。
悬浮培养或用BMSC和那他珠单抗共培养(如指示的)HL60、KG1或U266细胞30分钟(HL60)或4小时(U266)，然后使所述细胞与BMSC分离，并处理，以用于蛋白印迹分析，以测定P-STAT3、STAT3、P-JNK、JNK、P-MAPK、和MAPK的水平(图7)。
结果表明，通过那他珠单抗处理，可以抑制共培养诱导的通过P-STAT3的存活信号传递。
上述实验的结果指示，VLA-4抗体(诸如那他珠单抗)可以是血液学恶性肿瘤的有效治疗剂。
其它实施方案在权利要求书中。

Claims (14)

1.一种治疗患者的急性髓性白血病(AML)的方法，所述方法包括：给所述患者施用治疗有效量的包含抗-α4整联蛋白抗体或其抗原结合片段的组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗-α4整联蛋白抗体或其抗原结合片段是VLA-4结合抗体或其VLA-4结合片段。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段选自：人抗体、嵌合的抗体、人源化的抗体和人抗体、嵌合的抗体或人源化的抗体的结合抗原的Fab、Fab’、F(ab’)2或F(v)片段。
4.如权利要求1所述的方法，其中以一定剂量施用所述组合物，从而提供约0.1至约20mg/kg体重的抗体或其抗原结合片段。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是人抗体或其抗原结合片段或人源化的抗体或其抗原结合片段。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是人抗体或其抗原结合片段或人源化的抗体或其抗原结合片段。
7.如权利要求3所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是人源化的抗体或其抗原结合片段。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是B表位特异性的VLA-4结合抗体或其抗原结合片段。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体是那他珠单抗。
11.如权利要求1所述的方法，所述方法另外包括：施用第二治疗剂。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述第二治疗剂是化学治疗剂。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述第二治疗剂是阿糖胞苷(Ara-C)。
14.如权利要求1所述的方法，其中皮下地或肌肉内地施用所述组合物。
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