JPH0769914A - 免疫応答調節組成物 - Google Patents

免疫応答調節組成物

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JPH0769914A JP6023365A JP2336594A JPH0769914A JP H0769914 A JPH0769914 A JP H0769914A JP 6023365 A JP6023365 A JP 6023365A JP 2336594 A JP2336594 A JP 2336594A JP H0769914 A JPH0769914 A JP H0769914A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 免疫応答を制御するための組成物を提供す
る。 【構成】 リンパ球とB7との相互作用をブロックするこ
とにより免疫応答を制御するために使用するためのIL−
４−結合分子及びCTLA−４結合分子を含んで成る組成
物。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、CTLA４レセプター遺伝
子の発現、前記レセプターとB7抗原を発現する細胞との
間の相互作用の同定、およびCTLA４レセプターを含む細
胞の相互作用を調節する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】脊椎動物の免疫系の特徴は、「自己」と
「非自己」とを区別する能力である。この性質は、最適
な免疫活性化を達成するために多数のシグナルを必要と
する系の進化に導いた（Janeway, Cold Spring Harbor
Symp. Quant. Biol. 54 : 1-14(1989))。Ｔ細胞−Ｂ細
胞の相互作用は免疫応答に対して必須である。Ｔ細胞お
よびＢ細胞上に見いだされる多数の付着分子のレベル
は、免疫応答の間に上昇する（Springerら、（1987）、
前掲；およびShimizu, Current Opinion in Immunolog
y, Kindt およびLong編、１：92-97 (1988)) ；およびH
emler, Immunology Today ９：109-113 (1988)) 。
【０００３】これらの分子のレベルの上昇は、活性化さ
れたＢ細胞が、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を刺激すると
き、休止のＢ細胞よりもいっそう有効である理由の説明
を助けるであろう（Kaiuchi ら、J. Immunol. 131 : 10
9-114 (1983) ; Krcigerら、J.Immunol. 135 : 2937-29
45 (1985) ; McKenzie, J. Immunol. 141 : 2907-2911
(1988) ; およびHawrylowicz およびUnanue, J. Immuno
l. 141 : 4083-4088 (1988)) 。
【０００４】Ｔリンパ球（「Ｔ細胞」）の免疫応答の発
生は、細胞−細胞の相互作用（Springerら、A. Rev. Im
munol.５：223-252 (1987)) 、とくにＴ細胞とアクセサ
リー細胞、例えば、Ｂ細胞との間の相互作用、および可
溶性仲介因子（サイトカインまたはリンホカイン）の生
産を含む複雑なプロセスである（Dinarello およびMie
r, New Engl. Jour. Med. 317 : 940-945 (1987))。
【０００５】この応答は、Ｔ細胞レセプター複合体（We
iss ら、Ann. Rev. Innunol.４：593-619 (1986)) およ
び他の「アクセサリー」表面分子（Springerら、（198
7）前掲）を含む、いくつかのＴ細胞表面レセプターに
より調節される。これらのアクセサリー分子の多数は、
細胞の表面上のモノクローナル抗体の反応性により定め
られる、天然に見いだされる細胞表面の分化（CD）抗原
である（McMichacl 編、Leukocyte Typing III，Oxford
Univ. Press、オックスフォード、ニューヨーク（198
7))。
【０００６】リンパ球のアクセサリー分子を含む抗原独
立の細胞間の相互作用は、免疫応答に対して必須である
（Springerら、（1987）前掲）。例えば、Ｔ細胞関連タ
ンパク質CD２のそのリガンドLFA ３（広く発現される糖
タンパク質（ShawおよびShimuz、前掲の中に概観されて
いる））への結合は、抗原特異的Ｔ細胞の活性化を最適
化するために重要である（Moigcon ら、Nature 339 : 3
14（1988))。
【０００７】重要な付着系は、リンパ球、マクロファー
ジ収量顆粒球上に見いだされるLFA-１糖タンパク質（Sp
ringerら、（1987）前掲；ShawおよびShimuz (1988) 前
掲）のそのリガンドICAM-1（Makgoba ら、Nature311 :
86-88 (1988)) およびICAM−２(Staunton ら、Nature 3
39 :61-64 (1989)) への結合を含む。Ｔ細胞のアクセサ
リー分子CD８およびCD４は、それぞれ、MHC クラスＩ
（Norment ら、Nature 336：79-81 (1988)) およびクラ
スII（Doyle およびStrominger, Nature 330 : 256-259
(1987))分子との相互作用により、Ｔ細胞の付着を強化
する。「ホーミング・レセプター（homing receptor)」
はリンパ球の移動のコントロールのために重要である
（Stoolman, Cell 56 : 907-910 (1989)) 。
【０００８】VLA 糖タンパク質は、細胞外マトリックス
成分への付着を必要とするリンパ球の機能を仲介するよ
うに思われるインテグリン（integrin) である（Hemle
r、前掲）。CD２／LFA-３，LFA-１／ICAM-1、およびVLA
付着系は、広範な種類のタイプの細胞上に存在する（S
pringerら、（1987）、前掲；ShawおよびShimuz、(198
9)、前掲およびHemler、（1988))、前掲）。
【０００９】さまざまなインビトロ研究により、サイト
カインが同種異系反応性エフェクター細胞の生成に関与
していることが実証された。例えば、膜結合IL−４及び
可溶性IL−４レセプターは、マウスに対し別々に投与さ
れリンパ増殖性応答を増大させるものであることが示さ
れた（William C, Fanslow et al. 「IL−４及び可溶性
IL−４レセプターによるインビボでの同種異系反応性の
調節」J. Immunol. 147 ：535-540 (1991)) 。特異的に
言うと、BALB／ｃマウスに対するIL−４の投与は、リン
パ増殖性応答のわずかな増大という結果をもたらした。
これとは対照的に、可溶性IL−４レセプターはこの同種
異系細胞に対する応答を用量に依存した形で抑制した。
その上、IL−４に対する中性化抗体及び可溶性IL−４レ
セプターに対するもう１つの抗体は、リンパ増殖性応答
の効果的な阻害物質であった。
【００１０】Ｂ−リンパ球の活性化は２つのシグナルを
必要とすることがかなり以前に提案され（Bretscher お
よびCohn, Science 169 : 1042−1049 (1970))そして現
在すべてのリンパ球はそれらの最適な活性化のための２
つのシグナル、抗原特異的またはクローナルシグナル、
ならびに抗原非特異的シグナルを必要とすると信じられ
ている（Janeway 、前掲）。
【００１１】Freeman ら（J. Immunol. 143 (8) ：2714
-2722 (1989)) は、mAB B7により認識されるＢ細胞活性
化抗原をエンコードするcDNAクローンを単離しそして配
列決定した（Freeman ら、J. Immunol. 138 ：3260 (19
87))。このcDNAでトランスフェクションしたCOS 細胞
は、標識化mAB B7およびmAB BB−１の両者により染色さ
れることが示された（Clark ら、Human Immunol. 16 :
100-113 (1986)；Yokochi ら、J. Immunol. 128 : 823
(1981)) ; Freeman ら、（1989）前掲；およびFreeman
ら、（1987）、前掲))。さらに、この抗原の発現は他の
系統の細胞、例えば、単球上に検出された（Freeman
ら、前掲）。
【００１２】Ｔヘルパー細胞（Ｔh ) 抗原の応答のため
に要求されるシグナルは、抗原を提示する細胞（APC)に
より提供される。Ｔ細胞レセプター複合体（Weiss, J.
Clin, Invest. 86 : 1015 (1990)) を、APC 上のクラス
IIの主要な組織適合性複合体（ＭIIＣ）分子に関係して
提示された抗原と相互作用させることによって、第１シ
グナルは開始される（Allen, Immunol. Today 8 : 270
(1987)) 。この抗原特異的シグナルは完全な応答を発生
するために不十分であり、そして第２シグナルの存在下
に、クローナルの不活性化またはアネルギーに実際に導
くことがある (Schwartz, Science 248 : 1349 (199
0))。
【００１３】MHC により提供される第２「共同刺激（co
stimulatory)」シグナルについての要件は、ある数の実
験の系において証明された（Schwartz, 前掲；Weaverお
よびUnanue, Immunol. Today 11 : 49 (1990))。これら
の１または２以上のシグナルの分子の性質は完全には理
解されないが、ある場合において、可溶性分子、例え
ば、インターロイキン（IL）−１（WeaverおよびUnanu
c, 前掲）および細胞間付着に関係する膜レセプターの
両者は共同刺激シグナルを提供できることが明らかであ
る。
【００１４】CD28抗原、すなわち、免疫グロブリン上科
のホモ２量体の糖タンパク質（AruffoおよびSeed, Pro
c. Natl. Acad. Sci. 84 : 8573-8577 (1987)) は、ほ
とんどの成熟ヒトＴ細胞上に見いだされるアクセサリー
分子である（Damle ら、J. Immunol. 131 : 2296-2300
(1983)) 。現在の証拠が示唆するように、Ｔ細胞反応複
合体により開始されるものと区別される別のＴ細胞活性
化の経路において、この分子は機能する（Juneら、Mol.
Cell. Bicl. 7 : 4472-4481 (1987))。
【００１５】CD28抗原と反応性のモノクローナル抗体
（mAb)は、種々のポリクローナルの刺激により開始され
るＴ細胞の応答を増強することができる（Juneら、前
掲、の中に概観されている）。これらの刺激作用はmAb
誘発サイトカインの生産（Thompsonら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. 86 : 1333-1337 (1989) ; およびLindsten
ら、Scicnce 244：339-343 (1989)から、mRNA安定化の
増加 (Lindstenら、(1989)、前掲）の結果としてを生ず
ることができる。
【００１６】抗CD28mAb は、また、阻止作用を有するこ
とができ、すなわち、それらはオートロガス混合リンパ
球反応（Damle ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 78 : 5096
-6001 (1981)) および抗原特異的Ｔ細胞クローンの活性
化（Lesslauer ら、Eur. J.Immunol. 16 : 1289-1296
(1986)) をブロックすることができる。CD28はＢ細胞活
性化抗原であるB7／BB−１のための対レセプターである
ことが研究において示された（Linsley ら、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 87 : 5031-5035 (1990)) 。便宜
上、B7／BB−１抗原を以後「B7抗原」と呼ぶ。
【００１７】CD28とB7抗原との間の相互作用は、B7抗原
およびCD28レセプターの細胞外部分、および免疫グロブ
リン（Ig）Ｃγ１（一定領域の重鎖）の遺伝学的融合を
使用して特徴づけられた（Linsley ら、J. Exp. Med. 1
73 : 721-730 (1991))。同定化B7Ig融合タンパク質なら
びにB7陽性CHO 細胞は、Ｔ細胞の増殖を共同刺激（cost
imulate)することが示された。B7陽性CHO 細胞によるＴ
細胞の刺激は、また、IL−２のための転写レベルの増加
を特異的に刺激する。追加の研究において、抗CD28mAb
は、ある種のＴ細胞白血病細胞系においてＢ細胞系白血
病系統との細胞の相互作用により誘発されたIL−２の生
産を阻止することが示された（Kohno ら、Cell Immuno
l. 131-1-10 (1990))。
【００１８】CD28は単一の細胞外の可変領域（Ｖ）様ド
メインを有する（AruffoおよびSeed、前掲) 。相同性分
子のCTLA４は、ネズミ細胞溶解性Ｔ細胞のcDNAライブラ
リーの分別スクリーニングにより同定された（Brunet
ら、Nature 328 : 267-270 (1987))。このCTLA４分子の
転写は細胞障害活性を有するＴ細胞の集団の中に見いだ
され、CTLA４が細胞溶解性応答において機能するであろ
うことを示唆した (Brunetら、前掲；およびBrunetら、
Immunol. Rev. 103-21-36 (1988)) 。
【００１９】研究者らの報告によると、CTLA４のヒトの
対 (Dariavach ら、Eur. J. Immuno l. 18 : 1901-1905
(1988)) の遺伝子はクローニングされそしてCD28と同一
の染色体領域（２ｇ 33-34) にマッピングされた (Lafa
ge-Pochitalodd) ら、Immunogenetics 31 : 198-201 (1
990)) 。このヒトCTLA４のDNA とCD28タンパク質をエン
コードするものとの間の配列の比較は、膜近傍領域およ
び細胞質領域において最高度の相同性をもつ、配列の有
意な相同性を明らかにする（Brunetら、1988、前掲；Da
riavach ら、1988、前掲）。
【００２０】CD28とCTLA４との間の高度の相同性は、そ
れらの遺伝子の共同局在化と一緒に、これらの分子がま
た機能的に関係するかどうかという問題を発生する。し
かしながら、CTLA４のタンパク質生産物はまだ首尾よく
発現されてきていないので、これらの問題は未解決のま
まである。免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーに
おける細胞表面の糖タンパク質の可溶性誘導体の発現
は、CD4, HIV-1のレセプター、およびCD28およびB7のレ
セプターについて、ハイブリッド融合分子を使用して活
性化され、これらのハイブリッド融合分子は抗体ドメイ
ンに融合されたCD4 レセプターの細胞外ドメインの部分
に相当するアミノ酸をエンコードするDNA 配列から成る
（免疫グロブリンγ１（Capon ら、Nature 337 : 525-5
31 (1989)(CD4)およびLinsley ら、J. Exp. Med.、前
掲）(CD28 およびB7) 。
【００２１】本発明に対する必要性が存在する。現在の
ところ、臓器移植片の拒絶を防ぐための主要な療法は、
サイクロスポリンＡ又はCD３に対するモノクローナル抗
体（MAbs) といった汎免疫抑制剤に依存している。これ
らの薬剤は、患者の生命を救うため頻繁に摂取されなく
てはならず、全免疫系を衰えさせ、往々にして、感染や
ガンの頻度の増大といった２次的な健康上の不安定さを
もたらす。
【００２２】
【発明の要約】したがって、本発明はCTLA４レセプター
タンパク質に相当するアミノ酸配列をエンコードする完
全なかつ正しいDNA 配列を提供し、そしてCTLA４レセプ
ターのために天然のリガンドとしてB7抗原を同定する。
本発明は、また、CTLA４免疫グロブリン（Ig）融合タン
パク質生産としてDNA を発現する方法を提供する。
【００２３】本発明の態様は、CTLA４Ig融合タンパク
質、およびCD28Ig／CTLA４ Ig 融合タンパク質を包含す
るハイブリッドの融合タンパク質を包含する。また、CT
LA４融合タンパク質、B7Ig融合タンパク質、およびそれ
らの断片および／または誘導体、例えば、CTLA４および
B7抗原と反応性のモノクローナル抗体を使用して細胞の
相互作用および免疫応答を調節する方法が提供される。
本発明のヒトCTLA４レセプタータンパク質は187 アミノ
酸によりコードされ、そして新しく同定されたＮ連鎖グ
リコシル化部位を包含する。
【００２４】本発明のCTLA４Ig融合タンパク質は、活性
化Ｂ細胞、および他の系統上に発現されたB7抗原、Ｔ細
胞上のCD28レセプターのためのリガンドと結合する。CT
LA４Igは、CD28レセプターに結合するB7よりも有意によ
り高い親和性でB7抗原と結合する。CTLA４Ig構成体は、
ヒトIgＣγ１ドメインに相当する第２アミノ酸配列に融
合したCTLA４レセプターの細胞外ドメインに相当する第
１アミノ酸配列を有する。
【００２５】第１アミノ酸配列は、アミノ酸配列の約位
置１から約位置125 のアミノ酸残基を含有し、これらの
アミノ酸残基はヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３
領域に相当するアミノ酸残基を含有する第２アミノ酸配
列に接合したCTLA４の細胞外ドメインに相当する。融合
タンパク質は好ましくは２量体の形態で生産される。可
溶性CTLA４IgはＴおよびＢリンパ球の応答の効力のある
in vivo インヒビターである。
【００２６】また、本発明において、ハイブリッド融合
タンパク質、例えば、第１アミノ酸配列を有するCD28Ig
／CTLA４Ig融合タンパク質が包含され、この第１アミノ
酸配列はCTLA４Igの細胞外ドメインの断片に相当する第
２アミノ酸配列およびヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およ
びCH３領域に相当する第３アミノ酸配列に接合したCD28
の細胞外ドメインの断片に相当する。
【００２７】ハイブリッド融合タンパク質の１つの態様
は、CD28の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約
位置１から約94のアミノ酸残基を含有する第１アミノ酸
配列を有するCD28Ig／CTLA４Ig融合タンパク質であり、
CD28の細胞外ドメインはCTLA４の細胞外ドメインに相当
するアミノ酸配列の約位置94から約位置125 のアミノ酸
残基を含有する第２アミノ酸配列を接合し、CTLA４の細
胞外ドメインはヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３
領域に相当するアミノ酸残基を含有する第３アミノ酸配
列に接合している。
【００２８】また、本発明において、Ｔ細胞をCTLA４レ
セプターのリガンドと反応させることによって、CTLA４
陽性Ｔ細胞とB7陽性細胞との相互作用を阻止することに
よる、他の細胞とのＴ細胞の相互作用を調節する方法が
包含される。リガンドはB7Ig融合タンパク質、CTLA４レ
セプターと反応性のモノクローナル抗体、および抗体断
片を包含する。本発明は、また、B7抗原のためのリガー
ゼを使用する、B7陽性細胞とのＴ細胞の相互作用を調節
する方法を提供する。このようなリガンドは、本発明の
CTLA４Ig融合タンパク質、その断片または誘導体、CD28
Ig／CTLA４Ig融合タンパク質のハイブリッド、またはB7
抗原と反応性のモノクローナル抗体である。
【００２９】本発明は、さらに、B7抗原と反応性のリガ
ンドを投与してB7陽性細胞とのＴ細胞の相互作用を調節
することによって、B7陽性細胞とのＴ細胞の相互作用に
より仲介される免疫系の疾患を処置する方法を包含す
る。このリガンドは、CTLA４Ig融合タンパク質、CD28Ig
／CTLA４Ig融合タンパク質のハイブリッド、またはB7抗
原と反応性のモノクローナル抗体である。CTLA４Ig融合
タンパク質と反応性のモノクローナル抗体およびCD28Ig
／CTLA４Ig融合タンパク質と反応性のモノクローナル抗
体を、細胞の相互作用の調節における使用について記載
する。
【００３０】CTLA４Ig融合タンパク質を安定に発現する
新規なチャイニーズハムスター卵巣細胞系をまた開示す
る。さらに、本発明は、免疫応答を調節するためB7相互
作用を遮断するための方法を提供する。この方法には、
CTLA４−結合分子及びIL４結合分子とリンパ球を接触さ
せる段階が含まれている。さらに、本発明は、CTLA４結
合分子及びIL４−結合分子とB7陽性リンパ球を接触させ
る段階を含む免疫応答を調節するための方法を提供す
る。
【００３１】同様に、本発明は、移植組織の被移植者で
ある患者による組織移植片の拒絶を阻害するための方法
をも提供している。この方法には、患者に対しCTLA−４
結合分子及びIL４−結合分子を投与する段階が含まれて
いる。本発明はさらに、患者に対しCTLA４−結合及びIL
４−結合分子を投与する段階を含む、患者体内の移植片
対宿主病を阻害するための方法をも提供する。
【００３２】
【発明の具体的な説明】ここに記載する本発明を完全に
理解することができるように、次の説明を記載する。
【００３３】定義 本出願中で使用する以下の語い又は熟語は規定通りの意
味を有する。ここで用いる「B7相互作用を遮断する」と
いうのは、CD28及びCTLA４といったそのリガンドに対す
るB7抗原の結合に干渉しかくしてＴ細胞とＢ細胞の相互
作用を妨害することを意味する。ここで使用するよう
に、「CTLA４−結合分子」はB7抗原を結合することにな
るあらゆる分子のことを意味する。ここで使用されてい
る「IL４結合分子」は、IL４を認識しこれに結合するこ
とになるあらゆる分子のことを意味する。本書で記述す
る発明をより良く理解することができるように、以下の
説明を提供する。
【００３４】本発明は、Ｔ細胞表面上に見いだされ、活
性化Ｂ細胞および他の系統の細胞上に発現されたB7抗原
に結合する、ヒトCTLA４レセプターの単離およびクロー
ニング、およびCTLA４レセプター遺伝子の可溶性融合タ
ンパク質生産物の発現に関する。本発明は、また、発現
されたCTLA４レセプターを使用して、B7陽性細胞とのＴ
細胞の相互作用を包含する細胞の相互作用を調節する方
法を提供する。
【００３５】好ましい態様において、本発明のヒトCTLA
４レセプタータンパク質に相当するアミノ酸配列をコー
ドする完全なかつ正しいDNA 配列をPCR によりクローニ
ングする。CTLA４の完全な予測されたコーディング配列
を含有するcDNAを、下の実施例の中に詳細に記載されて
いるように、H38RNAから増幅されたPCR 断片からアセン
ブリングし、そして発現ベクターCDM8の中に挿入した。
単離物をCOS 細胞の中にトランスフェクションし、そし
てB7Ig、すなわち、Linsley ら、J. Exp. Med.173 : 72
1-730 (1991) 記載されているように、B7の細胞外ドメ
インおよびヒト免疫グロブリン（Ig）Ｃγ１領域に相当
するアミノ酸配列を有する可溶性融合タンパク質の結合
について試験した。
【００３６】次いで、OMCTLA４と表示する１つの単離物
のDNA 配列を決定し、そしてＮ末端においてオンコスタ
チインＭからのシグナルペプチドに融合した、予測され
たヒトCTLA４配列に正確に相当することが発見された。
CTLA４レセプターは187 アミノ酸（シグナルペプチドお
よび停止コドンを除外する）によりコードされ、そして
アミノ酸位置109-111 に新しく同定されたＮ連鎖グリコ
シル化部位を含む（下の図３を参照）。オンコスタチイ
ンＭのシグナルペプチドを使用して、CTLA４レセプター
を発現させる。
【００３７】他の好ましい態様において、CTLA４の細胞
外ドメインに相当する第１アミノ酸配列およびヒトIgＣ
γ１ドメインに相当する第２アミノ酸配列を有する融合
タンパク質を使用して、CTLA４レセプター遺伝子（CTLA
４Ig）のタンパク質生産物の可溶性の形態を調製する。
【００３８】ここに記載するcDNA配列に基づくヒトCTLA
４レセプターに相当するアミノ酸配列の部分をエンコー
ドするcDNAを含有するクローニングおよび発現のプラス
ミド（CDM8およびπLN）を構成し、ここでCTLA４レセプ
ター遺伝子の細胞外ドメインの断片に相当する第１アミ
ノ酸配列をエンコードするcDNAを、発現されたCTLA４タ
ンパク質の可溶性の変更によりCTLA４レセプター遺伝子
の発現を可能とするIgＣ領域に相当する第２アミノ酸配
列をコードするDNA に接合する。
【００３９】こうして、可溶性CTLA４Ig融合タンパク質
は第１アミノ酸配列によりコードされ、この第１アミノ
酸配列はヒトIgのＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域
に相当するアミノ酸残基を含有する第２アミノ酸配列に
接合したCTLA４の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配
列の約位置１〜約125 のアミノ酸残基を含有する。融合
タンパク質は好ましくは２量体の形態で生産される。次
いでこの構成体をCOSまたはCHO 細胞の中にトランスフ
ェクションし、そしてCTLA４Igを精製しそして２量体と
して同定した。
【００４０】本発明の態様に従うと、CTLA４Ig及びCTLA
４Ig／CD28融合タンパク質は、CTLA４の機能的特性を保
持する分子を生成するべくCTLA４の外部ドメインに対応
するアミノ酸配列におけるアミノ酸置換を有していてよ
い。すなわち、このような置換を有する分子は、なおも
B7抗原に結合することになる。これらのアミノ酸置換に
は、当該技術分野において「保存的」として知られるア
ミノ酸置換が含まれるがこれらに必ずしも制限されるわ
けではない。
【００４１】例えば、１つのタンパク質の中でタンパク
質のコンホーメーションや機能を変えることなく「保存
的アミノ酸置換」と呼ばれるいくつかのアミノ酸置換を
頻繁に行なうことができるというのは、タンパク質化学
の確立した原理である。このような変化には、イソロイ
シン（Ｉ）、バリン（Ｖ）及びロイシン（Ｌ）のいずれ
かをこれらの疎水性アミノ酸のうちの他のいずれかに置
換すること；グルタミン酸（Ｅ）のかわりにアスパラギ
ン酸を又はその逆に置換すること、アスパラギン（Ｎ）
に代わってグルタミン（Ａ）を又はその逆に置換するこ
と、及びトレオニン（Ｔ）の代わりにセリン（Ｓ）を又
はその逆に置換することが含まれる。特定のアミノ酸の
環境及びタンパク質の３次元構造におけるその役割に応
じて、その他の置換も又保存的とみなすことができる。
例えば、グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）は、アラニ
ンとバリン（Ｖ）がそうでありうるように、互換性があ
ると考えられることが多い。
【００４２】比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）はロ
イシン及びイソロイシンと、又時としてバリンと頻繁に
互換されうる。リジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）は、
アミノ酸残基の有意な特徴がその負荷にありこれら２つ
のアミノ酸残基のpKの違いが著しいものではないような
場所において頻繁に互換可能である。特定の環境の中で
は、さらにその他の変化も「保存的」とみなすことがで
きる。
【００４３】実際、本書で開示する方法を用いて、CTLA
４結合分子の突然変異体が産生された。１つの突然変異
体は、（１）CD28受容タンパク質の位置１のアミノ酸で
始まり位置95のアミノ酸で終わる配列（Aruffo and See
d, 1987)；（２）CTLA４の細胞外ドメインの位置95のア
ミノ酸で始まり位置125 のアミノ酸で終わる配列 (Brun
et et al. 1987) ；及び（３）ヒトIgＣγ１ドメインに
対応する配列、を含んでいる。
【００４４】第２の突然変異体は、（１）CD28受容タン
パク質の位置１のアミノ酸で始まり位置95のアミノ酸で
終わる配列（Aruffo and Seed 1987) ；（２）CTLA４の
細胞外ドメインの位置95のアミノ酸で始まり位置120 の
アミノ酸で終わる配列 (Brunet et al. 1987) ；及び
（３）ヒトIgＣγ１ドメインに対応する配列、を含んで
いる。本発明は、CTLA４結合分子及びIL４結合分子とリ
ンパ球を接触させることを含む、免疫応答を調節するべ
くB7相互作用を遮断するための方法を提供する。リンパ
球は、B7陽性リンパ球であってよい。
【００４５】さらに、本発明は、CTLA４結合分子及びIL
４結合分子とB7陽性リンパ球を接触させることを含む、
免疫応答を調節するための方法を提供する。免疫応答
は、抗体産生の阻害という結果をもたらすＢ細胞応答で
ありうる。付加的には、免疫応答は、細胞性免疫の阻害
を結果としてもたらすＴ細胞応答であってもよい。さら
に免疫応答は、リンパ球増殖の阻害であってもよい。同
様に、本発明は、移植組織の被移植者である患者による
組織移植片の拒絶を阻害するための方法をも提供する。
この方法は、患者に対してCTLA４結合分子及びIL４結合
分子を投与することを含むことができる。
【００４６】本発明はさらに、患者に対してCTLA４結合
分子及びIL４結合分子を投与することを含む、患者体内
の移植片対宿主病を阻害するための方法をも提供する。
本発明の態様に従うと、CTLA４結合分子はCTLA４Ig融合
タンパク質であってよい。例えば、CTLA４Ig融合タンパ
ク質は、CTLA４の細胞外ドメインに対応するアミノ酸配
列のほぼ位置１から位置125 までのアミノ酸残基を含む
第１のアミノ酸配列と、ヒト免疫グロブリンＣγ１のヒ
ンジ、CH２及びCH３領域に対応するアミノ酸残基を含む
第２のアミノ酸配列を有する融合タンパク質でありう
る。
【００４７】あるいは、CTLA４結合分子は、CD28Ig／CT
LA４Ig融合タンパク質ハイブリッドであってよい。例え
ば、CD28Ig／CTLA４Ig融合タンパク質ハイブリッドは、
CTLA４レセプターの細胞外ドメインの一部分に対応する
第２のアミノ酸配列及びヒト免疫グロブリンＣγ１のヒ
ンジ、CH２及びCH３領域に対応する第３のアミノ酸配列
に融合されたCD28レセプターの細胞外ドメインの一部分
に対応する第１のアミノ酸配列を有する融合タンパク質
ハイブリッドであってよい。
【００４８】さらに、IL４結合分子は、IL４を特異的に
認識しこれに結合するモノクローナル抗体でありうる。
代替的には、IL４結合分子は、IL４を認識しこれに結合
する可溶性IL４レセプターである (Fanslow et al. 199
1)。CTLA４Ig融合タンパク質に相当するアミノ酸配列を
コードするDNA は、ブダベスト条約の規定に従いアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（American T
ype Culture Collcction)(ATCC) （米国マリイランド州
ロックビレ）に1991年５月31日に受託され、そしてATCC
受け入れ番号68629 を与えられた。
【００４９】本発明は、可溶性融合タンパク質の形態で
CTLA４転写体の第１タンパク質生産物を提供する。CTLA
４タンパク質はほぼ50,000サブユニットのＭr のジサル
ファイド連鎖の２量体を形成し、天然のCTLA４がＴ細胞
表面上にジサルファイド連鎖ホモ２量体として多分存在
することを示す。B7抗原はＴ細胞上のCD28レセプターの
ためのリガンドであることが示された（Linsley ら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA、前掲）。CTLA４レセプター
分子はCD28レセプターに機能的にかつ構造的に関係する
と思われる；両者はＢ細胞活性化抗原のためのレセプタ
ーであるが、CTLA４は、リンパ系付着系についてこれま
で報告された最高のもの中で、B7に対するより高い親和
性を有するように思われる。
【００５０】しかしながら、CTLA４IgはCD28IgよりB7陽
性（B7+ ) 細胞系にいっそう強く結合することが示され
た。他の実験において、CTLA４はB7抗原に対してCD28レ
セプターより高い親和性のレセプターであることが証明
された。さらに、CTLA４IgはB7抗原に大きさが類似する
リンパ芽球球細胞上の単一のタンパク質に結合すること
が示された。CTLA４IgはＴ細胞増殖を阻止し、そしてＴ
h 誘発IgM 生産を阻止した。
【００５１】他の好ましい態様において、異なるレセプ
タータンパク質の断片に相当するアミノ酸配列を有する
ハイブリッド融合タンパク質を構成した。例えば、CD28
およびCTLA４の細胞外ドメインの選択した断片に相当す
るアミノ酸配列を連鎖して、CD28Ig／CTLA４Igハイブリ
ッド融合タンパク質を形成した。こうして、第１アミノ
酸配列を有するCD28Ig／CTLA４Ig融合タンパク質が得ら
れ、この第１アミノ酸配列はCTLA４Igの細胞外ドメイン
の断片に相当する第２アミノ酸配列およびヒトIgＣγ１
のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当する第３アミノ酸
配列に接合した、CD28の細胞外ドメインの断片に相当す
るアミノ酸残基を含有する。
【００５２】ハイブリッド融合タンパク質の１つの態様
は第１アミノ酸配列を有するCD28Ig／CTLA４Ig融合構成
体であり、この第１アミノ酸配列はCD28の細胞外ドメイ
ンに相当するアミノ酸配列の約位置１〜約位置94のアミ
ノ酸残基を含有し、CD28はCTLA４の細胞外ドメインに相
当するアミノ酸配列の約位置94〜約位置125 のアミノ酸
残基を含有する第２アミノ酸配列に接合し、CTLA４はヒ
トIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当する第
３アミノ酸配列に接合している。
【００５３】CTLA４レセプタータンパク質、可溶性融合
タンパク質およびハイブリッド融合タンパク質に相当す
るアミノ酸配列をコードするDNA 配列をクローニングし
そして発現する技術、例えば、オリゴヌクレオチドの合
成、PCR 、細胞の形質転換、ベクターの構成、発現系な
どはこの分野においてよく確立されており、そしてほと
んどの熟練者は特定の条件および手順のための標準的源
材料をよく知っている。しかしながら、必要に応じて便
利および変更の注釈のために次の節を準備し、そしてこ
れらの節はカイドラインの役目をするであろう。
【００５４】レセプターおよび融合タンパク質のための
コーディング配列のクローニングおよび発現 本発明のCTLA４Igを特性決定しかつCD28Ig／CTLA４Ig融
合ハイブリッドを調製するためのCD28IgＣγ１およびB7
IgＣγ１に相当する融合タンパク質の構成体を、Linsle
y ら、J. Exp. Med. 173 : 721-730 (1991)(これを引用
によって加える）に記載されているように調製した。あ
るいは、B7抗原およびCD28レセプターを発現する細胞か
ら、これらのタンパク質について発表された知識（Aruf
foおよびSccd、およびFreeman 、前掲）に基づいて標準
的手順を使用して、cDNAクローンを調製することができ
る。
【００５５】CTLA４の細胞外ドメインおよびヒトIgＣγ
１のヒンジ、CH２およびCH３領域に対応するアミノ酸配
列をコードするDNA から成るCTLA４Ig融合体を、PCR 断
片の結合により構成した。アミノ酸をコードするcDNA
を、ポリメラーゼ連鎖反応（「PCR 」）技術に従い増幅
する（米国特許第4,683,195 号および米国特許第4,683,
202 号（Mullisら）、およびMullisおよび Faloona, Me
thods Enzymol. 154 : 335-350 (1987) を参照のこ
と）。
【００５６】CTLA４Ig融合ポリペプチドを構成し、これ
らのポリペプチドはCTLA４の細胞外ドメインに相当する
アミノ酸配列の約位置１〜約位置125 のアミノ酸残基を
含有するアミノ酸配列をコードするDNA 、およびIgＣγ
１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ酸配
列をコードするDNA を有した。
【００５７】ヒトリンパ系細胞の中のCTLA４レセプター
タンパク質の発現は従来報告されてきていないので、CT
LA４のmRNA源を探すことが必要であった。いくつかのヒ
ト白血病細胞系の全体の細胞のRNA から作ったPCR のcD
NAを、プライマーとして、CTLA４遺伝子の発表された配
列かのオリゴヌクレオチドを使用してスクリーニングし
た（Dariavach ら、前掲）。試験したcDNAのうちで、H3
8 細胞（HTLV II 関連白血病系統）は期待したサイズを
有するPCR 生産物の最良の収量を提供した。
【００５８】CTLA４の単一のペプチドはCTLA４遺伝子の
中で同定されなかったので、CTLA４の予測された配列の
Ｎ末端をオンコスタチインＭのシグナルペプチド（Mali
k ら、Molec. and Cell. Biol. 9： 2847 (1989)) に、
下の実施例に記載するオリゴヌクレオチドを使用して融
合した。PCR 反応の生産物を、IgＣγ１のヒンジ、CH２
およびCH３領域に相当するアミノ酸配列をコードするcD
NAを使用して、発現ベクター、例えば、CDM8またはπLN
の中に結合した。
【００５９】全長のヒトCTLA４をコードするDNA を得る
ために、CTLA４のトランスメンブレンおよび細胞質ドメ
インをコードするcDNAをH38 細胞からPCR により構成
し、そしてCTLA４のＮ末端に融合したオンコスタチイン
Ｍシグナルペプチドをコードする、前述したように構成
した、CTLA４Igからの断片と、下の実施例に記載するオ
リゴヌクレオチドのプライマーを使用して接合した。PC
R 断片をプラスミドCDM8の中に結合して、全長のCTLA４
をコードする発現プラスミドを生成し、そしてこれをOM
CTLA４と表示した。
【００６０】ハイブリッド融合タンパク質に相当するア
ミノ酸配列をエンコードするDNA を構成するために、１
つのレセプター遺伝子の細胞外ドメインの部分に相当す
るアミノ酸をコードするDNA を、他のレセプター遺伝子
の細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸をコードす
るDNA 、およびヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３
領域に相当するアミノ酸配列をコードするDNA に、B7I
g，CD28IgおよびCTLA４Ig構成体について前述した手順
を使用して接合する。
【００６１】こうして、例えば、CD28レセプターの細胞
外ドメインに相当するアミノ酸配列の約１位置〜約94位
置のアミノ酸残基をコードするDNA を、CTLA４レセプタ
ーの細胞外ドメインのアミノ酸配列の約位置94〜約位置
125 のアミノ酸残基をコードするDNA 、およびヒトIgＣ
γ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ酸
配列をコードするDNA に接合する。
【００６２】大量のクローニングしたDNA を生産するた
めに、本発明の融合構成体をコードするDNA を含有する
ベクターを適当な宿主細胞、例えば、細菌細胞系の大腸
菌（Ｅ．coli）MC1061／p3株（Invitrogen Corp.、カリ
フォルニア州サンディエゴ）の中に標準的手順を使用し
て形質転換し、そしてコロニーを適当なプラスミドにつ
いてスクリーニングする。
【００６３】次いで、前述したようにして得られた融合
構成体をコードするDNA を含有するクローンを、発現の
ために適当な宿主細胞の中にトランスフェクションす
る。使用する宿主細胞に依存して、このような細胞に適
当な標準的技術を使用してトランスフェクションを実施
する。例えば、哺乳動物細胞中のトランスフェクション
は、DEAE−デキストラン仲介トランスフェクション、Ca
PO4 共沈、リポフェクション（lipofection)、エレクト
ロポレイションまたは原形質体の融合、および他のこの
分野において知られている方法により達成し、ここで後
者の方法は次のものを包含する：
【００６４】リゾチームの融合または赤血球の融合、ス
クレイピング、直接的吸収、浸透圧またはスクロースの
ショック、直接的マイクロインジェクション、間接的マ
イクロインジェクション、例えば、赤血球仲介技術を介
するマイクロインジェクション、および／または宿主細
胞を電流に暴露する。遺伝的情報を細胞の中に導入する
他の手順は疑いなく開発されるであろうから、上に列挙
したトランスフェクションの技術は網羅的であると考え
られない。
【００６５】多細胞の生物から誘導化された真核生物の
宿主細胞の培養物の中の発現は好ましい（Tissure Cult
ures, Academic Press, CruzおよびPatterson 編、（19
73）を参照のこと）。これらの系はイントロンをスプラ
イスする能力をもつという追加の利点を有し、こうして
ゲノム断片の発現に直接使用することができる。有用な
宿主細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO)細
胞、サル腎臓（COS)細胞、VERO細胞およびHeLa細胞を包
含する。本発明において、融合構成体を安定に発現する
細胞系は好ましい。
【００６６】このような細胞のための発現ベクターは、
通常、哺乳動物細胞と適合性のプロモーターおよびコン
トロール配列、例えば、CMV プロモーター（CDM8ベクタ
ー）および鳥類の肉腫ウイルス（ASV)（πLNベクター）
を包含する。他の普通に使用される前期および後期のプ
ロモーターは、サルのウイルス40（SV40）(Fiersら、Na
ture 273 : 113 (1973))、または他のウイルスのプロモ
ーター、例えば、ポリオーマから誘導化されたもの、ア
デノウイルス２、およびウシ乳頭腫ウイルスを包含す
る。
【００６７】コントロール可能なプロモーター、hMTII
(Karinら、Nature 299：797-802 (1982)) をまた使用す
ることができる。哺乳動物細胞の宿主系の形質転換につ
いての一般的面は、Axel（米国特許第4,399,216 号、19
83年８月16日発行）により記載された。現在明らかなよ
うに、「エンハンサー」領域は発現を最適化するとき重
要である；これらは、一般に、非コーディング領域の中
のプロモーター領域の上流または下流に見いだされる配
列である。必要に応じて、複製の由来をウイルス源から
得ることができる。しかしがら、染色体中の組み込みは
真核生物におけるDNA の複製のための普通のメカニズム
である。
【００６８】融合構成体の発現のために好ましい真核生
物の細胞、例えば、COS またはCHO細胞を包含するが、
他の真核生物の微生物を使用できる。サッカロミセス・
セレビシアエ（Saccharomyces ccrevisiae）、イースト
の実験室用菌株をたいてい使用するが、他の菌株、例え
ば、シゾサッカロミセス・ポンペ（Schizosaccharomyce
s pombe)を使用できる。
【００６９】例えば、Broach, Mcthods Enzymol. 101 :
307 (1983) の２μの複製由来、または他の酵母適合性
の複製由来（例えば、Stinchcombら、Nature 282 : 39
(1979)) ; Tschempeら、Gene 10 ：157 (1980)；および
Clarkeら、Methods Enzymol.101 : 300 (1983) を参照
のこと）を用いるベクターを使用することができる。酵
母のベクターのためのコントロール配列は、グリコール
分解酵母の合成のためのプロモーターを包含する（Hess
ら、J. Adv. Enzyme Reg. ７: 149 (1968) ; Holland
ら、Biochcmistry. 17 : 4900 (1978)) 。
【００７０】この分野において知られている追加のプロ
モーターは、CDM8ベクターの中に提供されたCMV プロモ
ーター（Toyamaおよび Okayama, FEBS 268：217-221 (1
990);３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモ
ーター（Hitzemanら、J. Biol. Chem. 255 : 2073)) 、
および他のグリコール分解酵素のためのプロモーターを
包含する。
【００７１】増殖条件によりコントロールされる転写の
追加の利点を有する他のプロモーターは、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファタ
ーゼ、窒素の代謝に関連する分解酵素、およびマルトー
スおよびガラクトースの利用に関係する酵素のためのプ
ロモーター領域である。また、ターミネーター配列はコ
ーディング配列の３′末端において望ましいと信じられ
る。このようなターミネーターは、酵母誘導化遺伝子の
次の３′−非翻訳領域の中に見いだされる。
【００７２】あるいは、原核生物の細胞を発現のための
宿主として使用することができる。原核生物の細胞は、
大腸菌（Ｅ．coli）の種々の株により最も頻繁に発現さ
れる；しかしながら、他の微生物の菌株も使用できる。
ここにおいて転写開始のためのプロモーターを、必要に
応じてオペレーターとともに含むと定義される、普通に
使用される原核生物のコントロール配列は、リボソーム
結合部位の配列と一緒に、ベーターラクタマーゼ（ペニ
シリナーゼ）およびラクトース（lac)プロモーター系
（Chang ら、Nature 198 : 1056 (1977)) 、トリプトフ
ァン（trp)プロモーター系（Goeddel ら、核酸の研究
（Nucleic Acids Res. 8 : 4057 (1980)) およびラムダ
誘導化Ｐl プロモーターおよびＮ−遺伝子リボソーム結
合部位（Shimatake ら、Nature 292 : 128 (1981))のよ
うな普通に使用されているプロモーターを包含する。
【００７３】CD28IgおよびCTLA４Igタンパク質、および
融合ハイゾリッドタンパク質、例えば、CD28Ig／CTLA４
Igを後述するように種々の系の中で発現することができ
る。cDNAを適当な制限酵素で切り出し、そしてこのよう
な発現について適当な原核生物または真核生物の発現ベ
クターの中に結合することができる。CD28およびCTLA４
レセプターのタンパク質は天然に２量体として存在する
ので、これらのタンパク質の首尾よい発現はこれらのタ
ンパク質を２量体として形成することを可能とする発現
系を必要とすると信じられる。
【００７４】これらのタンパク質の切頭バージョン（す
なわち、タンパク質のトランスメンブレン領域より上流
の位置において配列の中に停止コドンを導入することに
よって形成される）は発現されると思われない。CD28お
よびCTLA４レセプターの融合タンパク質としての発現
は、これらのタンパク質の２量体の形成を可能とする。
こうして、CTLA４タンパク質の融合生産物としての発現
は、本発明において好ましい。チャイニーズハムスター
卵巣細胞系CTLA４Ig−24と表示する本発明の安定なCHO
系はCTLA４Igの発現のために好ましく、そしてブダベス
ト条約の規定に従いATCCに1991年５月31日に受託され、
そしてATCC受け入れ番号10762 を与えられた。
【００７５】本発明のCTLA４レセプターの発現は、細胞
系、例えば、COS 細胞をトランスフェクションし、そし
てCTLA４トランスフェクションした細胞をCTLA４レセプ
ターに結合することによって、例えば、細胞のB7Ig融合
タンパク質への結合について経験することによって、発
現を検出して達成される。生ずる構成体の配列は、既知
の手順、例えば、Sangerら、Proc. Natl. Acad.Sci. US
A 74 : 5463 (1977) に記載されている、さらにMcssing
ら、Nucleic Acids Res. 9 : 309 (1981) に記載され
ている手順を使用するDNA の配列決定によるか、あるい
はMaxam ら、Mcthods Enzymol. 65 : 499 (1980)の方法
により確証される。
【００７６】タンパク質生産物の回収 前述したように、CD28およびCTLA４レセプターの遺伝子
は、切頭タンパク質をエンコードするDNA の直接の発現
を使用して成熟タンパク質として容易に発現されない。
ホモ２量体の形成を可能とするために、CD28およびCTLA
４の細胞外ドメインに相当し、そしてシグナル配列、例
えば、適当なプロセシングを行うことができる細胞中の
オンコスタチインＭの配列のためのコドンを含むアミノ
酸配列をエンコードするDNA を、天然に２量体のタンパ
ク質のFcドメインに相当するアミノ酸配列をエンコード
するDNA と融合する。
【００７７】こうして、細胞から分泌された後のこれら
の融合タンパク質の生産物の精製は、融合タンパク質の
抗免疫グロブリン部分と反応性の抗体を使用して促進さ
れる。融合タンパク質の生産物は、培地の中に分泌され
ると、タンパク質の標準的精製技術、例えば、プロテイ
ンＡカラムへの適用により回収される。
【００７８】使 用 CTLA４Ig融合タンパク質および／またはその融合タンパ
ク質の断片を使用してB7陽性細胞、例えば、Ｂ細胞と反
応させて、B7抗原陽性細胞とのＴ細胞の相互作用により
仲介される免疫応答を調節することができる。
【００７９】CTLA４Ig融合タンパク質およびCTLA４Ig／
CD28Igハイブリッドタンパク質、および／またはこれら
のタンパク質の断片および誘導体を、また、使用して、
B7陽性細胞、例えば、Ｂ細胞と反応させて、Ｔ細胞依存
性Ｂ細胞の応答により仲介される免疫応答を調節するこ
とができる。用語「断片」は、ここにおいて使用すると
き、「CTLA４」と呼ぶタンパク質をエンコードするアミ
ノ酸配列の部分を意味する。使用できるCTLA４Ig融合の
タンパク質の断片は、ここに記載するCTLA４Ig融合タン
パク質を得るために使用するCTLA４レセプターに相当す
るアミノ酸配列のある部分に相当するアミノ酸配列を有
するポリペプチドである。
【００８０】活性化されたＢ細胞および他の系統の細胞
上で発現されたB7抗原、およびＴ細胞上で発現されたCD
28レセプターを互いに直接結合することができ、そして
この相互作用は細胞−細胞の相互作用を仲介することが
できる。このような相互作用は、Ｔ細胞の増殖、および
免疫グロブリン生産細胞へのＢ細胞の分化に導く、Ｔ細
胞の中のCD28活性化経路を直接トリガーする。
【００８１】起こるＢ細胞の活性化は、B7抗原の発現を
増加し、さらにCD28を刺激して、慢性の炎症の状態、例
えば、自己免疫疾病、異種移植の拒絶、移植片対宿主の
疾患または慢性のアレルギー反応に導くことがある。こ
の反応をブロックまたは阻止することは、Ｔ細胞のサイ
トカインの調製を防止し、こうして炎症反応を防止また
は逆転するとき有効であることがある。
【００８２】CTLA４Igは、ここにおいて、Ｔ細胞および
Ｂ細胞の相互作用を必要とするin vitroリンパ球機能の
効力のあるインヒビターであることが示された。これは
B7抗原およびその対レセプター、CTLA４および／または
CD28の間の相互作用の重要性を示す。ネズミおよびヒト
のCTLA４の細胞質ドメインは類似し（Dariavach ら、前
掲、1988）、この領域が重要な機能的性質を有すること
を示唆する。また、CD28およびCTLA４の細胞質ドメイン
は相同性を共有する。
【００８３】CTLA４は、抗BB１または抗CD28モノクロー
ナル抗体よりも、いっそう効力のあるリンパ球の応答の
in vitroインヒビターである。CTLA４Igは、その阻止作
用と反作用するＴ細胞の増殖に対する直接の刺激作用を
もたない。したがって、CTLA４Ig融合タンパク質は抗CD
28モノクローナル抗体よりもすぐれたin vivo インヒビ
ターとして働くことができる。CTLA４Igのin vitro免疫
抑制作用は、異常なＴ細胞の活性化またはIgの生産を包
含する自己免疫疾患の処置の治療におけるその使用を示
唆する。
【００８４】CTLA４Ig融合タンパク質は、in vivo 阻止
性質を示すことが期待された。こうして、CTLA４Igは、
同様なin vivo 条件下に抗CD28抗体について観察される
作用に類似する方法で、Ｔ細胞を阻止する作用をするこ
とが期待される。Ｔ細胞／Ｂ細胞の相互作用がＴ細胞と
Ｂ細胞との間の接触の結果として起こる条件下に、B7抗
原陽性細胞、例えば、Ｂ細胞と反応させために導入され
たCTLA４Igの結合は、Ｔ細胞／Ｂ細胞の相互作用を妨
害、すなわち、阻止して免疫応答の調節を生ずることが
できる。この独占的な阻止作用のために、CTLA４Igは生
体内でＴ細胞の活性のインヒビターとして、非特異的イ
ンヒビター、例えば、シクロスポリンまたはグルコステ
ロイドよりも有用であることが期待される。
【００８５】１つの態様において、CTLA４Ig融合タンパ
ク質またはCTLA４Ig／CD28Igハイブリッドタンパク質
は、適当な製剤学的担体と組み合わせてin vivo 導入す
る、すなわち、病理学的状態、例えば、免疫系の疾患ま
たは癌の処置のためにヒトの投与することができる。融
合タンパク質のin vivo 導入は、Ｔ細胞と他の細胞、例
えば、Ｂ細胞との相互作用を、B7陽性細胞へのリガンド
の結合の結果として、妨害することが期待される。正常
のＴ細胞の相互作用の防止は、Ｔ細胞の活性を減少し、
例えば、Ｔ細胞の増殖を減少することができる。
【００８６】さらに、融合タンパク質のin vivo 投与は
サイトカインのin vivo レベルの調節して被検体におい
て所望の作用を促進することが期待され、ここでサイト
カインは次のものを包含するが、これらに限定されな
い：インターロイキン、例えば、インターロイキン
（「IL」）−２，IL−３，IL−４，IL−６，IL−８，成
長因子、例えば、腫瘍成長因子（「TFG 」）、コロニー
刺激因子（「CSF 」）、インターフェロン（「IFN 」）
および腫瘍壊死因子（「TNF 」）。
【００８７】例えば、融合タンパク質をin vivo 導入す
るとき、それは悪性の増殖、例えば、腫瘍細胞の増殖に
寄与するサイトカインの生産をブロックすることができ
る。融合タンパク質は、また、Ｔ細胞の活性化に依存す
るウイルス、例えば、エイズを引き起こすウイルス、HT
LV１の増殖をブロックすることができる。
【００８８】ある環境下に、前述したように、CTLA４Ig
融合タンパク質またはその断片のinvivo 投与の作用は
阻止であり、Ｔ細胞／Ｂ細胞の接触から生ずるCTLA４お
よびCD28のトリガーの融合タンパク質によるブロッキン
グから生ずる。例えば、CTLA４Igタンパク質はＴ細胞の
増殖をブロックすることができる。こうして、CTLA４Ig
融合タンパク質のin vivo 導入は、Ｔ細胞およびＢ細胞
の両者が仲介する免疫応答に対する作用を生成するであ
ろう。また、融合タンパク質をサイトカインまたは他の
治療用試薬の導入と組み合わせて被検体に投与すること
ができる。
【００８９】本発明の追加の態様において、CTLA４Ig融
合タンパク質またはCTLA４レセプターと反応性の誘導体
を包含する他の試薬を使用してＴ細胞の相互作用を調節
する。例えば、CTLA４レセプターと反応性の抗体および
／または抗体断片をスクリーニングして、B7抗原へのCT
LA４Ig融合タンパク質の広いスペクトルのを阻止するこ
とができるものを同定することができる。次いで、抗体
または抗体断片、例えば、Fab またはＦ（ab′）2 断片
を使用して、例えば、Ｔ細胞と反応させてＴ細胞の増殖
を阻止することができる。
【００９０】CTLA４レセプターと反応性のモノクローナ
ル抗体は、既知の手順、例えば、KohlerおよびMilstein
(KohlerおよびMilstein, Nature, 256 : 495-97 (197
5))により導入された手順、およびその変更により生成
して、細胞の相互作用を調節することができる。これら
の技術は、特定の抗体を生産するようにプライミングし
た動物の使用を包含する。動物は免疫原（例えば、B7Ig
融合タンパク質、CTLA４Ig融合タンパク質またはCD28Ig
／CTLA４Igハイブリッド融合タンパク質）の注入により
プライミングして、所望の免疫応答、すなわち、プライ
ミングされた動物からの抗体の生産を引き出すことがで
きる。また、プライミングされた動物は疾患を発現する
動物である。
【００９１】プライミングされた病気の動物のリンパ
節、脾臓または末梢血液から誘導化されたリンパ球を使
用して、特定の抗体を探索することができる。所望の免
疫グロブリンをエンコードするリンパ球の染色体を、一
般に融合剤、例えば、ポリエチレングリコール（PEG)の
存在下に、リンパ球を骨髄腫細胞と融合することによっ
て、永久分裂能化する。ある数の骨髄腫細胞系、例え
ば、P3−NS１／１−Ag４−１，P3−ｘ63−Ag８，653, S
p2／０−Ag14、またはHLI-653 骨髄腫系統の任意のもの
を、標準的技術に従い、融合相手として使用することが
できる。これらの骨髄腫系統はATCC（米国マリイランド
州ロックビレ）から入手可能である。
【００９２】次いで、所望のハイブリドーマを包含する
生ずる細胞を選択培地、例えば、HAT 培地の中で成長さ
せ、ここで未融合の親の骨髄腫またはリンパ球の細胞は
究極的に死亡する。ハイブリドーマ細胞のみは生き残
り、そして制限希釈の条件下に成長して単離されたクロ
ーンを得ることができる。ハイブリドーマの上澄み液
を、例えば、免疫化に使用したCTLA４Igタンパク質を使
用するイムノアッセイ技術により、所望の選択性の存在
についてスクリーニングする。次いで、陽性のクローン
を制限希釈の条件下にサブクローニングし、そして生成
したモノクローナル抗体を単離することができる。
【００９３】モノクローナル抗体の単離および精製の種
々の普通の方法を使用して、他のタンパク質および汚染
物質を含有しない抗体を得ることがてきる。モノクロー
ナル抗体を精製する普通に使用されている方法は、硫酸
アンモニウム沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、お
よびアフィニティクロマトグラフィーを包含する（Zola
ら、Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniques a
nd Applications, Hurell 編、p. 51-52 (CRC Press, 1
982 を参照のこと）。
【００９４】これらの方法に従い生産されたハイブリド
ーマは、この分野において知られている技術を使用して
in vitroまたはin vivo （腹水の中で）増殖することが
できる（一般に、Finkら、Prog. Clin. Pathol., 9：12
1-33 (1984), Fig. 6-1, p.123 を参照のこと）。一般
に、個々の細胞系を、例えば、実験室用容器の中でin v
ivo 増殖させ、そして高い濃度の単一の特定のモノクロ
ーナル抗体を含有する培地をデカンテーション、濾過ま
たは遠心により収穫することができる。
【００９５】さらに、CTLA４レセプターの細胞外ドメイ
ンと反応性の活性結合領域を含有するこれらの抗体の断
片、例えば、Fab ，Ｆ（ab′）2 およびFv断片を生成す
ることができる。このような断片は、この分野において
よく確立された技術を使用して生成することができる
（例えば、Rousseaux ら、Methods Enzymol. 121 : 663
-69, Academic Press (1986)を参照のこと）。
【００９６】前述したようにして調製した抗B7モノクロ
ーナル抗体を使用してB7抗原に結合させて、CD28陽性ま
たはCTLA４陽性のＴ細胞とB7陽性細胞との相互作用を阻
止することができる。抗CTLA４モノクローナル抗体を使
用してCTLA４レセプターと結合させて、CTLA４陽性Ｔ細
胞と他の細胞との相互作用を阻止することができる。他
の態様において、CTLA４Ig融合タンパク質を使用して、
CTLA４とB7抗原との間の相互作用を調節できる追加の化
合物を同定することができる。このような化合物は、Ｂ
細胞および／またはＴ細胞と反応させるために使用でき
る天然に見いだされる小さい分子を包含することができ
る。
【００９７】例えば、発酵ブロスをCTLA４／B7の相互作
用を阻止する能力について試験することができる。さら
に、前述のCTLA４Ig融合タンパク質の誘導体を使用して
Ｔ細胞の増殖を調節することができる。例えば、断片ま
たは誘導体を使用して、異種移植の骨髄の移植に伴う移
植片対宿主（GVH)の疾患におけるＴ細胞の増殖をブロッ
クすることができる。
【００９８】CD28仲介Ｔ細胞増殖経路は、CD３／Ｔ細胞
のレセプター複合体により与えれる増殖（Juneら、198
7、前掲）と対照的に、シクロスポリン耐性である。シ
クロスポリンはGVH 疾患のための処置として比較的無効
である（Storb, Blood 68 : 119-125 (1986)) 。GVH 疾
患は、CD28抗原を発現するＴリンパ球により仲介される
と考えられる（Storb およびThomas, Immunol. Rev. 8
8：215-238 (1985)) 。こうして、CTLA４Ig融合タンパ
ク質は、単独で、あるいは免疫抑制剤、例えば、シクロ
スポリンと組み合わせて、GVH 疾患におけるＴ細胞の増
殖のブロッキングに有用であることができる。
【００９９】こうして、Ｂ細胞を包含するB7陽性細胞と
のCTLA４陽性Ｔ細胞の相互作用の本発明の方法による調
節を使用して、病理学的状態、例えば、自己免疫性、移
植、感染症および新形成を処置することができる。ここ
で記述されているCTLA４結合分子及びIL４結合分子は、
溶液又は懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、座薬、重合体マイ
クロカプセル又は微小嚢、リポソーム及び注射液又は輸
液を含むもののこれらに限定されるわけではないさまざ
まな用量決定形態をしていてよい。好ましい形態は、投
与様式及び治療的利用分野によって異なる。
【０１００】本発明に基づく分子のための最も効果的な
投与様式及び用量決定方法は、疾病の重症度及び経過、
患者の健康状態及び治療に対する応答性ならびに担当医
の判断によって左右される。従って、分子の服用量は、
個々の患者に対し滴定されなくてはならない。表面積１
ｍ2 あたりのmg数に基づくさまざまなサイズ及び種の動
物及び人間に対する服用量の相互関係は、Freireich,
E. J et al.によって記述されている（マウス、ラッ
ト、ハムスター、イヌ、サル及びヒトにおける抗ガン剤
の毒性の定量比較、Cancer Chemother, Rep., 50, No.
4, 219-244, 1966 年５月）。
【０１０１】成長阻害応答を最適化するため、用量決定
方法を調製することが可能である。用量は、分割して毎
日投与することもできるし、又状況に比例して用量を減
少することもできる。例えば、いくつかの分割用量を毎
日投与することもできるし、或いは又特定の治療状況に
よって指示される通りに比例して減少させることもでき
る。
【０１０２】本発明の実施例に従うと、患者を治療する
ための有効量は、患者の体重１kgあたり約0.1 〜約10mg
でありうる。同様に、有効量は、患者の体重１kgにつき
約１mg〜約10mgの量でもありうる。発明の利点：本発明
は、組織又は器官の移植片の拒絶を防止することに向け
られた現行の療法に付随する問題を克服する。現行の療
法とは対照的に、本発明はB7相互作用により媒介される
免疫応答のみに影響を及ぼす。
【０１０３】例えば、本発明は、移植片抗原特異Ｔ細胞
に影響を及ぼし、かくしてドナー特異的及び抗原特異的
寛容を誘導する。Ｔ細胞レセプター嵌入中のCD28のその
リガンドB7／BB1 (B7)による結合は、いくつかの系内で
の適切なＴ細胞シグナル付与にとって重大なことである
(M. K. Jenkins, P. S. Taylor, S. D. Norton, K.B.
Urdahl, J. Immunol. 147 : 2461 (1991)； C. H. Jun
e, J. A. Ledbetter,P. S. Linsley, C. B. Thompson,
Immunol. Today 11：211 (1990)；H. Reiser,G. J. Fre
eman, Z. Razi-Wolf, C. D. Gimmi, B. Benacerraf, L.
M. Nadler,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89：271
(1992)；N. K. Damie, K. Klussman, P. S. Linsley,
A. Aruffo, J. Immunol. 148 ：1985 (1992))。
【０１０４】CD28とそのリガンドの相互作用が遮断され
ると、抗原特異Ｔ細胞は、不適切に抗原特異Ｔ細胞アネ
ルギー状態に誘導される (M. K. Jenkins, P. S. Taylo
r, S. D. Norton, K. B. Urdahl, J. Immunol. 147：24
61 (1991) ；F. A. Harding,J. G. McArthur, J. A. Gr
oss, D. H. Raulet, J. P. Allison, Nature 356 ：607
(1992)) 。
【０１０５】CTLA４Ig融合タンパク質は、（CD28に比べ
20倍大きい親和力をもつ）ヒト及びマウスB7の両方に結
合し、B7に対するCD28の結合を遮断し、Ｔ細胞活性化を
阻害し、インビトロでのＴ細胞不応答を誘導する（F.
A. Harding, J. G. McArthur,J. A. Gross, D. H. Raul
et, J. P. Allison, Nature 356 ：607 (1992)；P. S.
Linsley et al., J. Exp. Med. 174：561 (1991)。
【０１０６】その上、本発明は、それまで発現されなか
ったCTLA遺伝子の可溶性タンパク質産物の発現を得るた
め、又Ｔ細胞の機能的応答に関与するCTLA４のための天
然リガンドを同定するために役立つ。このとき、可溶性
タンパク質産物は、病理状態を治療するべくインビボで
Ｔ細胞応答を調節するのに使用することができる。次の
実施例によって、本発明をさらに説明しかつ当業者によ
る本発明の実施および使用を助ける。これらの実施例は
本発明を限定しない。
【０１０７】例 １．B7Ig及びCD28Ig融合タンパク質の
調製 レセプター−免疫グロブリンＣγ（IgＣγ）融合タンパ
ク質B7Ig及びCD28Igを、本発明において引用により組込
まれる、Linsley など., J. Exp. Med. 173 :721 〜730
(1991)により記載されているようにして調製した。簡
単に言えば、それぞれのレセプタータンパク質（たとえ
ばB7）に対応するアミノ酸配列をコードするDNA を、ヒ
トIgＣγ１のヒンジ、CH２及びCH３領域に対応するアミ
ノ酸配列をコードするDNA に連結した。これは次のよう
にして達成される。
【０１０８】ポリメラーゼ鎖反応（PCR) PCR のために、DNA フラグメントを、個々の融合タンパ
ク質について下記のようにしてプライマー対を用いて増
幅した。PCR 反応（０．１mlの最終体積）を、 Tag ポリ
メラーゼ緩衝液（Stratagene, La Jolla, CA）において
行ない、ここで前記緩衝液は、個々のdNTP20μモル；前
記に示されたプライマー50〜100 ｐモル；鋳型（引用に
より本明細書において組込まれる、Kauasaki, PCR Prot
ocols, Academic Press, 21 〜27ページ（1990）により
記載されるようにして、ランダムヘキサマープライマー
を用いて合計≦１μｇのRNA から合成されたプラスミド
又はcDNA１ng）；及びTag ポリメラーゼ（Stratagene)
を含んだ。反応は、16〜30回のサイクル（典型的なサイ
クルは、94℃で１分、50℃で１〜２分及び72℃で１〜３
分の段階から成る）のためにサーモサイクラー（Perkin
Elmer Corp. Norwalk, CT) 上で行なわれた。
【０１０９】プラスミドの構成 Aruffo and Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 8
573 (1987)により記載されるような、CD28をコードする
cDNAを含む発現プラスミドが、Drs. Aruffo and Seed
(Mass General Hospital Boston, MA) により供給され
た。Aruffo, Cell61 : 1303 (1990)により記載されるよ
うな、CD５をコードするcDNAを含むプラスミドがDr. Ar
uffoにより供給された。Freeman など.,J. Immunol. 14
3 : 2714(1989)により記載されるような、B7をコードす
るcDNAを含むプラスミドは、Dr.Freeman (Dana Farber
Cancer Institute, Boston, MA)により供給された。
【０１１０】CD28及びB7の可溶性形の発現での初期試み
のために、構成体をLinsley など.,J. Exp. Med.,前記
により記載されているようにして製造し（OMCD28及びOM
B7)、ここで停止コドンがトランスメンブランドメイン
の上流に導入され、そして生来のシグナルペプチドがオ
ンコスタチインＭ（oncostatin M）（Malik など., Mo
l. Cell Biol. 9 : 2847 (1989)) からのシグナルペプ
チドにより置換された。それらは、再構成のための合成
オリゴヌクレオチド（OMCD28）を用いて又はPCRのため
のプライマー（OMB7）として製造された。
【０１１１】OMCD28は、シグナルペプチドをオンコスタ
チインＭからの類似領域により置換することによってよ
り効果的な発現のために変性されたCD28 cDNA である。
CD28Ig及びB7Ig融合構成体を２つに分けて製造した。
５′部分を、鋳型としてOMCD28及びOMB7及び前方プライ
マーとしてオリゴヌクレオチド、CTAGCCACTGAAGCTTCACC
ATGGGTGTACTGCTCACAC （配列番号１）（オンコスタチイ
ンＭシグナルペプチドに対応するアミノ酸配列をコード
する）及び逆方向プライマーとしてTGGCATGGGCTCCTGATC
AGGCTTAGAAGGTCCGGGAAA （配列番号２）又は、TTTGGGCT
CCTGATCAGGAAAATGCTCTTGCTTGGTTGT （配列番号３）のい
づれかをそれぞれ用いて製造した。
【０１１２】PCR 反応の生成物を、PCR プライマーに導
入される部位として制限エンドヌクレアーゼ（HindIII
及びBcl Ｉ）により切断し、そしてゲル精製した。ヒト
IgＣγ１配列に対応する融合構成体の３′部分を、鋳型
として、ヒト−マウスキメラmAB L6を生成する骨髄細胞
系（Dr. P. Fell and M. Gayle, Bristol-Myers Squibb
Conyany, Pharmaceutical Research Institute, Seatt
le, WAにより供給される）からのRNA を用いて、連結さ
れた逆転写酵素（トリ骨髄芽症ウィルスからの；Life S
ciences Associates, Bayport, NY)-PCR反応により製造
した。
【０１１３】オリゴペプチド、すなわちAAGCAAGAGCATTT
TCCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCCCCACCGT
CCCCAGCACCTGAACTCCTG（配列番号４）を前方プライマー
及びCTTCGACCAGTCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC （配
列番号５）を逆方向プライマーとして使用した。反応生
成物をBal Ｉ及びXba Ｉにより切断し、そしてゲル精製
した。
【０１１４】最終生成物を、IgＣγ１配列を含む、Bcl
Ｉ／Xba Ｉ切断されたフラグメントと共に、CD28又はB7
配列を含む、HindIII ／Bcl Ｉ切断されたフラグメント
を、HindIII ／Xba Ｉ切断されたCD28中に連結すること
によってアセンブリーした。連結生成物を用いてMC1061
／p3 Ｅ．コリ細胞を形質転換し、そしてコロニーを適
切なプラスミドのためにスクーンした。得られた構成体
の配列を、DNA 配列決定により確認した。
【０１１５】B7をコードする構成体は、B7の細胞外ドメ
インの約１位〜約215 位のアミノ酸残基に対応するアミ
ノ酸をコードするDNを含んだ。CD28をコードする構成体
は、CD28の細胞外ドメインの約１位〜約134 位のアミノ
酸残基に対応するアミノ酸をコードするDNA を含んだ。
CD５Igを、前方プライマーとしてCATTGCACAGTCAAGCTTCC
ATGCCCATGGGTTCTCTGGCCACCTTG （配列番号６）及び逆方
向プライマーとしてATCCACAGTGCAGTGATCATTTGGATCCTGGC
ATGTGAC （配列番号７）を用いて、同じ態様で構成し
た。PCR 生成物を制限エンドヌクレアーゼ消化し、そし
て上記のようにしてIgＣγ１フラグメントにより連結し
た。
【０１１６】得られた構成体（CD５Ig）は、CD５に対応
する配列の１位〜347 位のアミノ酸残基を含むアミノ酸
配列を有する成熟タンパク質、前記構成工程により導入
された２つのアミノ酸（アミノ酸DQ）、次にIgＣγ１領
域に対応するアミノ酸をコードするDNA をコードした。
【０１１７】細胞培養及びトランスフェクション COS(モンキー腎細胞）を、引用により本発明に組込まれ
る、Seed and Aruffo(Proc. Natl. Acad. Sci. 84 : 33
65 (1987))の方法の変法を用いて、CD28及びB7を発現す
る発現プラスミドによりトランスフェクトした。細胞
を、トランスフェクトする18〜24時間前、10cmの直径の
培養皿当たり106 個で接種した。
【０１１８】プラスミドDNA を、0.1 mMのクロロキン
（cloroquine) 及び600 μｇ／mlのDEAE Dextranを含む
血清フリーDMEM５mlに添加し（約15μｇ／皿）、そして
細胞を37℃で３〜3.5 時間インキュベートした。次に、
トランスフェクトされた細胞をすぐに、PBS 中、10％ジ
メチルスルホキシドにより処理し（約２分）、そして10
％FCS を含むDMEMにおいて37℃で16〜24時間インキュベ
ートした。トランスフェクションの24時間後、培養培地
を除去し、そして血清フリーDMEMにより変換した（６ml
／皿）。インキュベーションを37℃で３時間続け、この
時点で、古い培地を集め、そして新鮮な血清フリー培地
を添加した。37℃でさらに３日後、古い培地を再び集
め、そして細胞を捨てた。
【０１１９】CD28，CD５又はB7を発現するCHO 細胞を、
次の通りに、Linsley など., (1991) 前記により記載さ
れるようにして単離した：簡単に言及すれば、CD28，CD
５又はB7を発現する安定したトランスフェクタントを、
適切な発現プラスミド及び選択マーカー、pSV2dhfr (Li
nsley など., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 87 : 5031
(1990))の混合物によるジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損
チャイニーズハムスター卵巣（dhfr- CHO)細胞の同時ト
ランスフェクションの後、次に、形質転換体を、１μＭ
の最終レベルまでメトトレキヤートの徐々に高まる濃度
で増殖させ、そして10％ウシ胎児血清（FBS)、0.2 mMの
プロリン及び１μＭのメトトレキヤートにより補充され
たDMEMに維持した。
【０１２０】高レベルのCD28（CD28+ CHO)又はB7（B7+
CHO)を発現するCHO 系を、mAbs9.3又はBB−１による間
接的な免疫染色に従って、複数回の螢光活性化細胞ソー
チング（FACS（Ｒ))により単離した。CD28又はB7の表面
発現のために陰性の増幅されたCHO 細胞をまた、CD28−
トランスフェクトされた集団からFACS（Ｒ）により単離
した。
【０１２１】免疫染色及びFACS（Ｒ）分析 トランスフェクトされたCHO 又はCOS 細胞又は活性化さ
れたＴ細胞を、間接的免疫染色法により分析した。染色
の前、CHO 細胞を、10mMのEDTAを含むPBS におけるイン
キュベーションによりそれらの培養器から除去した。細
胞をまず、ネズミmAbs9.3 （Hansenなど., Immunogenet
ics 10 : 247 (1980))又はBB−１（Yokochi など., J.
Immunol. 128 : 823 (1981))と共に、又はIg融合タンパ
ク質（10％のFCS を含むDMEMにおいて10μｇ／mlで）と
共に４℃で１〜２時間インキュベートした。
【０１２２】次に細胞を洗浄し、そしてさらに0.5 〜２
時間、４℃で、FITC−接合の第２段階試薬（ネズミmAbs
のためにヤギ抗−マウスIg血清又は融合タンパク質のた
めにヤギ抗−ヒトIgＣγ血清（Tago, Inc., Burlingam
a, CA))と共にインキュベートした。螢光を、40対数増
幅器（four decade logarithmic amplifier)を備えたFA
CS IV(Ｒ）細胞ソーター（Becton Dickinson and Co.,
Mountain View, CA ）上で分析した。
【０１２３】Ig融合タンパク質の精製 トランスフェクトされたCOS 細胞からの古い血清フリー
培養培地の第１，第２及び第３回収集物を、Ig融合タン
パク質の精製のための源として使用した。高速遠心分離
により細胞残髄物を除去した後、培地を、0.05Ｍのクエ
ン酸ナトリウム溶液（pH8.0)により平衡化された、固定
されたプロテインＡ（Repligen Corp.,Cambridge, MA)
のカラム（約200 〜400 mlの培地／ml充填層体積）に適
用した。
【０１２４】その培地の適用の後、カラムを１μのリン
酸カリウム溶液（pH８）により洗浄し、そして結合され
たタンパク質を0.05Ｍのクエン酸ナトリウム溶液（pH
３）により溶出した。画分を集め、そしてすぐに、２Ｍ
のトリス（pH８）１／10体積の添加により中和した。Ａ
280 吸収材料のピークを含む画分をプールし、そして使
用の前、PBS に対して透析した。それぞれCD28Ig及びB7
Igのための吸光係数は、既知の吸光度の溶液のアミノ酸
分析により2.4 及び2.8 nl／mgであった。精製されたCD
28Ig及びB7Ig結合活性の回収率は、B7+ 及びCD28+ CHO
細胞の間接的な螢光染色の後、FACS（Ｒ）分析により判
断される場合、ほぼ定量的であった。
【０１２５】例 ２．CTLA４Ig融合タンパク質の調製 CTLA４の細胞外ドメインとIgＣγ１ドメインとの間にCT
LA４Igをコードする可溶性遺伝子融合体を、CD28Ig構成
体についての上記方法に類似する方法で構成した。CTLA
４遺伝子の細胞外ドメインを、公開された配列（Dariar
ach など., Eur. Jour. Immunol. 18 : 1901〜1905 (19
88))に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いてPCR に
よりクローン化した。CTLA４のためのシグナルペプチド
はCTLA４遺伝子において同定されていないので、CTLA４
の示された配列のＮ−末端を、オーバーラップオリゴヌ
クレオチドを用いて２段階で、オンコスタチインＭ（Me
lik など., Mol. and Cell. Biol. 9: 2847 (1989))の
シグナルペプチドに融合せしめた。
【０１２６】第１段階に関しては、オリゴヌクレオチ
ド、CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGG
CAATGCACGTGGCCCAGCC （配列番号８）（CTLA４のＮ末端
側の７個のアミノ酸に融合されるコンスタチンＭシグナ
ルペプチドからのＣ末端側の15個のアミノ酸をコードす
る）を、前方プライマーとして、及びTTTGGGCTCCTGATCA
GAATCTGGGCACGGTTG （配列番号９）（Bcl Ｉ制限酵素部
位を含み、そしてCTLA４レセプターをコードするアミノ
酸配列のアミノ酸残基119 〜125 をコードする）を逆方
向プライマーとして使用した。
【０１２７】この段階のための鋳型は、H38 細胞（Drs.
Salahudin and Gallo, NCI, Bethesda, MD により供給
されるHTLVII感染性Ｔ細胞白血球細胞系）からの合計１
μｇのRNA から合成されたcDNAであった。第１段階から
のPCR 生成物の一部を、オンコスタチインＭシグナルペ
プチドのＮ末端部分をコードし、そしてHindIII 制限エ
ンドヌクレアーゼ部位を含むオーバーラップ前方プライ
マー、CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAG
GACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC（配列番号10）及び同じ
逆方向プライマーを用いて再増幅した。
【０１２８】PCR 反応の生成物をHindIII 及びBcl Ｉに
より消化し、そしてBcl Ｉ／Xha Ｉにより切断された、
IgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に対応するアミ
ノ酸配列をコードするcDNAフラグメントと共に、HindII
I ／Xha Ｉ切断された発現ベクター、CDM8又はHindIII
／Xba Ｉ切断された発現ベクター、πLN（Dr. Aruffoに
より供給される）中に連結した。
【０１２９】得られたCTLA４Ig融合構成体の地図は図１
に示される。その図に示される配列は、CTLA４（上方の
文字、黒くない部分）とコンスタチンＭのシグナルペプ
チドSP（黒い部分）及びIgＣγ１のヒンジＨ（点描模様
の部分）との間の連結を示す。括弧内のアミノ酸は、構
成の間に導入された。星印（★）は、IgＣγヒンジ領域
に導入されたシステイン〜セリン変異を示す。CTLA４に
存在する免疫グロブリンスーパーファミリーＶ−株ドメ
インは、IgＣγ１のCH２及びCH３ドメインであるように
示される。
【０１３０】次に、CTLA４Igを含む発現プラスミド、CD
M8を、Seed and Aruffo, 1987,前記により記載される方
法の変法（Linsley など., 1991,前記）により、DEAE／
テキストラントランスフェクションを用いてCOS 細胞中
にトランスフェクトした。CTLA４Igのアミノ酸配列をコ
ードするcDNAを含む発現プラスミド構成体（πLN又はCD
M8）を、標準方法を用いてのリポフェクションによりdh
fr- CHO 系中にトランスフェクトし、CTLA４Igを安定し
て発現する新規細胞系を得た。
【０１３１】CTLA４Igに対応するアミノ酸配列をコード
するDNA は、1991年５月31日、ブタペスト条約に基づい
てATCCに寄託され、そしてATCC受託番号68629 を得た。
チャイニーズハムスター卵巣細胞系CTLA４Ig−24と称す
る、CTLA４Igを発現する好ましい安定性のトランスフェ
クタントを、免疫染色法を用いて、培地におけるB7結合
活性についてB7陽性CHO 細胞系をスクリーンすることに
よって製造した。トランスフェクタントは、10％ウシ胎
児血清（FBS)、0.2 mMのプロリン及び１μＭのメトトレ
キヤートにより補充されたDMEMに維持された。
【０１３２】CTLA４Ig−24CHO 細胞系は、1991年５月31
日、ブタペスト条約に基づいてATCCに寄託され、そして
ATCC受託番号10762 を得た。CTLA４Igを、血清フリーに
条件付けられた上清液からプロテインＡクロマトグラフ
ィー処理により精製した（図２）。CTLA４Igの濃度を、
280 nmで1.6 の吸光係数（既知の吸光度の溶液のアミノ
酸分析により実験的に決定された）を仮定して、決定し
た。CTLA４Igのサンプル（１μｇ）（レーン２及び４）
及び分子量標準（レーン１及び３、図２）を、非還元条
件（−βME、レーン１及び２）又は還元条件（＋βME、
レーン３及び４）下でSDS-PAGE（４〜12％のアクリルア
ミドグラジエント）にゆだねた。タンパク質は、クーマ
シーブリリアンドブルーによる染色により可視化され
た。
【０１３３】非還元条件下で、CTLA４IgはMrが約100,00
0 である種として移動し、そして還元条件下でそれは、
Mrが約50,000である種として移動した（図２）。IgＣγ
ヒンジのジスルフィドが構成の間に排除されたので、CD
28IgのようなCTLA４Igは、生来のジスルフィド結合を通
してたぶん連結されたダイマーである。
【０１３４】例 ３．CTLA４レセプター 十分な長さのヒトCTLA４遺伝子に対応するアミノ酸をコ
ードするDNA を再構成するために、CTLA４のトランスメ
ンブラン及び細胞質ドメインのフラグメントに対応する
アミノ酸をコードするcDNAを、PCR によりクローン化
し、そして次に、CTLA４のＮ−末端に融合されるオンコ
スタチンＭシグナルペプチドに対応する、CTLA４Igから
のフラグメントに対応するアミノ酸をコードするcDNAに
より連結した。PCR のための方法、及び細胞培養及びト
ランスフェクションは、COS 細胞及びDEAE−デキストラ
ン トランスフェクションを用いて、例１に記載されて
いる通りであった。
【０１３５】ヒトリンパ球細胞におけるCTLA４レセプタ
ータンパク質の発現はこれまで報告されていないので、
CTLA４mRNAの源を示す必要はなかった。上記に示される
ような、H38 細胞の全体の細胞RNA から逆転写されるPC
R cDNAを、PCR によるクローニングのために使用した。
この目的のためには、オリゴヌクレオチド、GCAATGCACG
TGGCCCAGCCTGCTGTGGTAGTG （配列番号11）（推定される
コード配列に初めの11個のアミノ酸をコードする）を、
前方プライマーとして及び逆方向プライマーとして、TG
ATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAAATAAGGCTG （配列
番号12）CTLA４における最後の８個のアミノ酸に相同で
あり、且つXba Ｉ部位を含む）を使用した。
【０１３６】鋳型は再び、H38 細胞からの１μｇのRNA
から合成されたcDNAであった。PCR反応の生成物を制限
エンドヌクレアーゼNco Ｉ及びXba Ｉにより切断し、そ
して得られた316 bpの生成物をゲル精製した。上記CTLA
Ig融合からの340 bpのHindIII ／Nco Ｉフラグメントを
またゲル精製し、そして両制限フラグメントを、HindII
I ／Xba Ｉ切断されたCDM8中に連結し、OMCTLAを形成し
た。
【０１３７】得られる構成体は、完全な長さのCTLA４
（配列番号13及び14）及びオンコスタチンＭシグナルペ
プチドに対応した。その構成体は図３に示され、そして
OMCTLA４と称した。図３に示されるCTLA４のための配列
は、示されるアミノ酸配列のアミノ酸位置111 でのこれ
まで達告されたアラニンがトレオニンをコードするよう
な塩基変化により、推定されるヒトCTLA４DNA 配列（Da
riavach など.,前記）とは異なる。このトレオニンは、
融合タンパク質の好結果をもたらす発現のために重要で
ある、新しく同定されたＮ−連結グリコシル化部位の一
部である。
【０１３８】連結生成物を用いて、MC1061／p3 Ｅ．コ
リ細胞を形質転換し、そしてコロニーを適切なプラスミ
ドについてスクリーンした。得られる構成体の配列を、
DNA配列分析により確かめた。
【０１３９】例 ４．CTLA４Igの特徴化 CTLA４Ig構成体を特徴づけるために、いくつかの単離
体、CD28Ig，B7Ig及びCD５Igを上記のようにして調製
し、そして例２及び３に記載されるようにしてCOS細胞
をトランスフェクトし、そしてB7Igの結合のためにFACS
（Ｒ）分析により試験した。上記構成体の他に、Aruffo
and Seed (EMBO Jour. 6 : 3313〜3316 (198)) により
記載されるようなCD７をコードするcDNAを含むCDM8プラ
スミドをまた使用した。
【０１４０】mAbs. ネズミモノクローナル抗体（mAba）
9.3 （抗−CD28）及びG19-４（抗−CD３）、G3−７（抗
−CD７），BB−１（抗−B7抗原）及びラットmAb 187.1
(抗−マウスＫ鎖）はこれまで記載されており（Ledbett
er など., Pruc. Natl. Acad.Sci. 84：1384〜1388（19
87) ; Ledbetter など., Bloud 75 : 1531 (1990) ;Yok
ochi など.,前記）、そして使用の前、腹水から精製し
た。
【０１４１】mAb OKT8を生成するハイブリドーマをATC
C, Rockville, MD から得、そしてmAb をまた、使用の
前、腹水から精製した。mAb 4G9(抗−CD19）は、Dr. E.
Engleman (Stanfurd Uninersity, Palo Altu, (A)によ
り提供された。精製されたヒト−マウスキメラmAb L6
（ヒトＣγ１Fc部分を有する）は、Dr. P. Fell and M.
Gayle (Bristal-Myers Squibb Pharmacentical Resear
ch Institute, Seattle, WA)の贈与である。
【０１４２】免疫染色及びFACS（Ｒ）分析 染色の前、COS 又はCHO 細胞を、10mMのEDTAを含むPBS
においてインキュベートすることによってそれらの培養
容器から除去した。細胞をまず、mAbs又はIg融合タンパ
ク質と共に、10％FBS を含むDMEMにおいて10μｇ／mlで
４℃で１〜２時間インキュベートした。
【０１４３】次に、細胞を洗浄し、そしてFITC−接合ヤ
ギ抗−マウス免疫グロブリン又はFITC−接合ヤギ抗−ヒ
トIgＣγ血清（両者とも、Tago, Burlingam, CA からで
ある）と共に、４℃でさらに0.5 〜２時間インキュベー
トした。両mAbs及びIg融合タンパク質の結合が同じ実験
において測定される場合、FITC−接合抗−マウス及び抗
−ヒト第２段階試薬を、使用の前、一緒に混合した。合
計10,000個の細胞に基づく螢光を次に、FACS（Ｒ）によ
り分析した。
【０１４４】末梢血液リンパ球分離及び刺激 末梢血液リンパ球（PBLs）を、リンパ球分離媒体（Litt
on Bionetics, Kensington, MD) を通しての遠心分離に
より単離した。アロ反応性Ｔ細胞を、一次混合リンパ球
反応（MLR)におけるPBL の刺激により単離した。PBL
を、106 ／mlの照射された（5000ラド）T51 LCL で培養
した。EBV-形質転換リンパ球芽細胞系（LCL)，PM（Bris
tol-Myers Squibb Co.) 及びT51 (Bristol-Myers Squib
b Co.)を、10％FBS により補充されたRPMIに維持した。
【０１４５】６日後、アロ反応性“幼芽”細胞を凍結保
存した。二次MLR を、mAbs及びIg融合タンパク質の存在
及び不在下で、新鮮な照射T51 LCL と共に融解されたア
ロ反応性幼芽を培養することによって行なった。細胞
を、10％FBS を含むRPMIを有する96ウェル平底プレート
（0.2 mlの体積、４×104 個のアロ反応性幼芽及び１×
104 個の照射T51 LCL 細胞／ウェル）において培養し
た。四重培養物の細胞増殖を、２〜３日の培養の最後の
６時間、〔 3Ｈ〕−チミジンの摂取により測定した。
【０１４６】PHA-活性化されたＴ細胞を、１μｇ／mlの
PHA (Wellcome, Charlotte, NC) と共にPBL を５日間、
培養することによって、及びPHA を欠く培地において１
日間、培養することによって調製した。生存細胞を、使
用の前、リンパ球分離媒体を通しての沈殿により集め
た。細胞をmAbsにより刺激し、又はCHO 細胞により37℃
で４〜６時間トランスフェクトせしめ、遠心分離により
集め、そしてRNA を調製するために使用した。
【０１４７】CD４+ Ｔ細胞を、健康なドナーからのPBL
を、羊赤血球ロゼット技法を用いてＴ及び非−Ｔ細胞に
分離し、そしてさらに、Damle など., J. Immunol. 139
: 1501 (1987)（引用により本明細書に組込まれる）に
より記載されるようにCD４+細胞をパンニングすること
によりＴ細胞を分離することによってPBLsから単離し
た。Ｂ細胞をまた、抗−CD19mAb 4G9 を用いて、Wysock
i and Sato, Proc. Natl. Acad. Sci. 75 : 2844 (197
8)(引用により本明細書に組込まれる）により記載され
るようにパンニングすることにより末梢血液から精製し
た。
【０１４８】Ｔh −誘発されたIg生成を測定するため
に、106 個のCD４+ Ｔ細胞を、10％のFBS を含むRPMI１
mlにおいて106 個のCD19+ Ｂ細胞と共に混合した。37℃
での６日間の培養に続いて、ヒトIgM の生成を、Volkma
n など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 2528 (198
1)（引用により本明細書に組込まれる）により記載され
るようにして固相ELISA を用いて培養上清液において測
定した。
【０１４９】簡単に言及すれば、96−ウェル平底マイク
ロタイターELISA プレート（Corning, Corning, NY)
を、10μｇ／mlのアフィニティー精製されたヤギ抗−ヒ
トIgG又はIgM 抗体（Tago, Burlingame, CA) を含む200
μｌ／ウェルの炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6)により
被覆し、４℃で一晩インキュベートし、そして次に、PB
S により洗浄し、そしてウェルをさらに、PBS 中、２％
BSA (BSA-PBS) によりブロックした。
【０１５０】アッセイされるべきサンプルを、それらの
ウェルに適切な希釈度で添加し、そして200 μｌ／ウェ
ルの１：1000希釈度のアフィニティー精製されたヤギ抗
−ヒトIgG 又はIgM 抗体（Tago）のホスラディシュ ペ
ルオキシダーゼ（HRP)−接合Ｆ（ab′）2 画分と共にイ
ンキュベートした。次に、プレートを洗浄し、そして10
0 μｌ／ウェルのｏ−フェニレンジアミン（Signa Chem
ical Co., St. Louis,MO)溶液（pH５のクエン酸−リン
酸緩衝液１ml当たり0.6 ng及び0.045 ％の過酸化水素）
を添加した。色の進行を、２Ｎの硫酸により止めた。
【０１５１】490 nmでの吸光度を、自動ELISA プレート
リーダーにより測定した。試験及び対照サンプルは３通
り行なわれ、そして吸光度の値を、培養上清液における
Igの濃度が定量化される標準曲線を生成するために、上
清液サンプルにより同時に行なわれた既知のIgG 又はIg
M 標準により得られた値と比較した。データを、三重反
復又は四重反復培養物のIg±SEM のng／mlとして表わさ
れる。
【０１５２】免疫沈殿分析及びSDS PAGE 細胞を、125Iにより表面ラベル化し、そして免疫沈殿分
析にゆだねた。簡単に言及すれば、PHA-活性化されたＴ
細胞を、Vitetta など., J. Exp. Med. 134 :242 (197
1)（引用により本明細書に組込まれる）により記載され
るように、ラクトペルオキシターゼ及びH2O2を用いて
125Iにより表面ラベル化した。SDS-PAGEクロマトグラフ
ィー処理を、５％のアクリルアミドの積み重ねゲルを有
する直線アクリルアミドグラジエントゲル上で行なっ
た。ゲルをクーマシーブルにより染色し、脱色し、そし
て写真を取り、又は乾燥せしめ、そしてＸ線フィルム
（Kodak XAR-5)に露光せしめた。
【０１５３】結合アッセイ B7Igを、約２×106 cpm/ｐモルの比活性に125Iによりラ
ベルした。96のウェルのプラスチック皿を、CTLA４Ig
（10mMのトリス（pH８）0.05mlの体積において0.5 μ
ｇ）を含む溶液により16〜24時間、被覆した。ウェル
を、競争体の存在又は不在下で、125I B7Ig（約５×10
5 cpm)を含む溶液（0.09ml）の添加の前、結合緩衝液
（50mMのBES (Sigma Chemical Co), pH6.8, 0.1％BAS
及び10％FCS を含むDMEM) によりブロックした。23℃で
２〜３時間のインキュベーションに続いて、ウェルを結
合緩衝液により１度洗浄し、そしてPBS により４度洗浄
した。次に、結合された放射能を0.5 ＮのNaOHの添加に
より溶解し、そしてｒ計数により定量化した。
【０１５４】B7Igへの結合 完全なヒトCTLA４DNA 遺伝子をコードするOMCTLA４構成
体の官能多活性が、図４に示される実験に示される。CO
S 細胞を、上記のようにして発現プラスミドCD７，OMCD
28及びOMCTLA４によりトランスフェクトした。トランス
フェクションの48時間後、細胞を集め、そして培地のみ
（添加なし）と共に又はmAbs 9.3，B7Ig，CD５Ig又はG3
−７と共にインキュベートした。次に細胞を洗浄し、そ
して結合性を、FITC−接合ヤギ抗−マウスIg及びFITC−
接合ヤギ抗−ヒトIg第２段階試薬の混合物により検出し
た。トランスフェクトされた細胞を、間接的免疫染色法
により適切な細胞表面マーカーの発現について試験し、
そして螢光を上記のようにしてFACS（Ｒ）分析を用いて
測定した。
【０１５５】図４に示されるように、mAb 9.3 は、CD28
−トランスフェクトされたCOS 細胞に結合したが、しか
しCTLA４−トランスフェクトされる細胞には結合しなか
った。対照的に、B7Ig融合タンパク質（但し、対照のCD
５Ig融合タンパク質ではない）は、CD28−及びCTLA４−
トランスフェクトされた細胞の両者に結合した。CD７−
トランスフェクトされたCOS 細胞は、mAb 9.3 にも融合
タンパク質のいづれにも結合しなかった。これは、CD28
及びCTLA４の両者がＢ細胞活性化抗原、B7を結合するこ
とを示唆する。さらに、mAb 9.3 は検出できるほどは、
CTLA４を結合しなかった。
【０１５６】B7陽性CHO 細胞上へのCTLA４Igの結合 CTLA４Ig及びB7の結合をさらに特徴づけるために、B7+
CHO 細胞及びリンパ芽球細胞系（PM LCL) 上への精製さ
れたCTLA４Igの結合活性を、図５に示される実験におい
て測定した。増幅された、トランスフェクトされたCHO
細胞系及びPM LCLを、培地のみ（添加なし）又はCD５I
g，CD28Ig又はCTLA４Igの同濃度のヒトIgＣγ１−含有
タンパク質（10μｇ／ml）と共にインキュベートした。
結合性を、FITC−接合ヤギ抗−ヒトIg第二段階試薬の添
加に続いて、FACS（Ｒ）により検出した。合計10,000個
の染色された細胞を、FACS（Ｒ）により分析した。
【０１５７】図５に示されるように、CD28IgはB7+ CHO
細胞に結合するが、しかしPM LCLには結合せず、すなわ
ち細胞系は比較的低レベルのB7抗原を発現する（Linsle
y など.,前記，1990）。CTLA４IgはCD28Igよりも両細胞
系により強く結合し、これは、それが高い親和性を伴っ
て結合することを示唆する。CD28IgもCTLA４Igも、CD28
+ CHO 細胞に結合しなかった。
【０１５８】CTLA４Ig及びB7Igの結合の親和性 次に、CTLA４IgとB7Igとの間の相互作用の見掛け親和性
を、固相競争結合アッセイを用いて測定した。96−ウェ
ルプラスチック皿を、上記のようにしてCTLA４Igにより
被覆した。B7Igを125I（５×105 cpm, ２×106 cpm/ｐ
モル）により放射ラベルし、そして添加し、示される濃
度（図６を参照のこと）のラベルされていないキメラmA
b L6, mAb 9.3, mAb BB−１又はB7Igの存在下で、４nM
の濃度にした。
【０１５９】プレート−結合放射能を測定し、そして競
争体なしに処理されたウェルに結合される放射能の百分
率として表わされた（28,300cpm)。個々の点は二重反復
測定の平均を示し；反復試験は一般的に平均から20％以
下変化した。濃度を、mAb に関して結合部位当たり75,0
00のMrに基づいて及びB7Igに関して結合部位当たり51,0
00のMrに基づいて計算した。
【０１６０】図６に示されるように、mAb BB−１及びラ
ベルされていないB7Igが125I−B7Ig結合のために有意に
競争した（それぞれ約22nM及び約175 nMで最大の半分の
効果）。キメラmAb L6もmAb 9.3 も、試験された濃度で
効果的に競争しなかった。他の実験においては、使用さ
れるmAb の濃度は、固定されたCD28Ig又は90％以上、CD
28を発現する細胞表面への125I−B7Igの結合を阻害する
のに十分であった。
【０１６１】図６からの競争データがスキャッチャート
プロットでプロットされる場合、約12nMの解離定数Kd
が、固定されたCTLA４Igへの125I−B7の結合性について
計算した（図７）。この値は、125I−B7IgとCD28との間
で前で測定されたKdよりも約20倍低く（約200 nM）（Li
nsley など, (1991), 前記）、これは、CTLA４がCD28レ
セプターよりもB7抗原のためにより高い親和性レセプタ
ーであることを示唆する。
【０１６２】CTLA４Igを結合したリンパ芽球細胞上の分
子を同定するために（図７）、125I−表面ラベルされた
細胞を、免疫沈殿分析にゆだねた（図８）。B7+ CHO 及
びPMLCL細胞を125Iにより表面ラベルし、そして上記の
ようにして非イオン性界面活性剤溶液により抽出した。
約1.5 ×107 cpm を有する、0.1 mlの体積での抽出物の
アリコートを、添加を伴わないで、又はそれぞれ２μｇ
のCD28Ig，CTLA４Ig又はCD５Igを伴って、上記のように
して免疫沈殿分析にゆだねた。
【０１６３】次に、洗浄された免疫沈殿物を、還元条件
下でSDS-PAGE (10〜20％のアクリルアミドグラジエン
ト）により分析した。次に、ゲルを乾燥せしめ、そして
オートラジオグラフィーにゆだねた。図８の左側のパネ
ルは、１日間の暴露の後に得られたオートラジオグラム
を示す。図８の右側のパネルは、10日間の暴露の後の同
じゲルのオートラジオグラムを示す。図８の中央のパネ
ルにおけるオートラジオグラムはまた、10日間、暴露さ
れた。分子量標準の位置はまた、この図に示される。
【０１６４】図８により示されるように、分散的に移動
する（約50,000〜75,000；約60,000での中央）、放射性
ラベルされたタンパク質を、CTLA４Igにより（但し、CD
28Ig又はCD５Igによってではない）免疫沈殿せしめた。
この分子は、CTLA４Igにより、B7+ CHO 細胞から免疫沈
殿されたB7と共に同時移動し、そしてCD28Igより免疫沈
殿されたB7と共には、より一層弱く同時移動した。これ
らの発見は、CTLA４Igが、B7抗原に大きさが類似する、
リンパ芽球細胞上の単一タンパク質を結合することを示
唆する。
【０１６５】CTLA４Igによるインビトロでの免疫応答の
阻害 増殖の阻害 これまでの研究は、抗−CD28 mAb, 9.3 及び抗−B7mAb,
BB−１が、アロ抗原を表わすＢ細胞により、アロ抗原
特異的Ｔn の増殖及び免疫グロブリン分泌を阻害するこ
とを示している（Damle,など., Proc. Natl. Acad. Sc
i. 78 : 5096 (1981)；Lesslauer など., Eur. J. Immu
nol. 16 : 1289 (1986)) 。CTLA４は本明細書に示され
るようにB7抗原のために高い親和性レセプターであるの
で、可溶性CTLA４Igは、それらの応答を阻害するその能
力について試験された。Ｔ細胞増殖に対するCTLA４Igの
効果は、図９に示される実験で試験された。
【０１６６】一次混合リンパ球反応（MLR)幼若を、ネズ
ミ mAb 9.3 Fabフラグメント、又はB7Ig，CD28Igもしく
はCTLA４Ig免疫グロブリンＣγ融合タンパク質の濃縮物
の不在又は存在下で、照射されたT51 リンパ芽球細胞
（IC）により刺激した。細胞増殖を、４日後、〔 3Ｈ〕
−チミジン組込みにより測定し、そして未処理の培養物
による組込みの百分率として表わす、（21,000cpm)。図
９は、４重反復測定の平均を表わす（SEM ≦10％）。
【０１６７】図９に示されるように、CTLA４Igは、約30
ng／ml（約0.8 nM）で、１／２最大応答を伴って最大90
％以上、投与量−依存性態様でMLR 反応を阻害した。完
全なmAb 9.3 よりもより可能性あるMLR のインヒビター
であることがこれまで示されている、mAb 9.3 のFab フ
ラグメント（Damle など., J. Immunol. 140 : 1753〜1
761 (1988))はまた、MLR を阻害したが、しかしその濃
度は、より高い濃度（約800 ng／ml又は１／２最大応答
のためには約30nM）であった。B7Ig及びCD28Igは、高濃
度でさえ、MLR を有意に阻害しなかった。他の実験にお
いては、CTLA４Igと共にB7Igの添加は、CTLA４Igによる
MLR の阻害を一部克服し、この事は、その阻害がB7抗原
との特異的な相互作用によることを示唆する。
【０１６８】免疫グロブリン分泌の阻害 ヘルパーＴ細胞（Ｔn ）−誘発性免疫グロブリン分泌に
対するCTLA４Igの効果をまた試験した（図10）。CD４+
Ｔ細胞を、上記のようにして、指示された免疫グロブリ
ン分子の存在又は不在下で、同種CD19+ Ｂ細胞と共に混
合した。ネズミmAbs OKT8, 9.3及びBB−１を20μｇ／ml
で添加し、そしてIg融合タンパク質を10μｇ／mlで添加
した。６日間の培養の後、培養上清液におけるヒトIgM
の濃度（SEM ＜５％）を、上記のようにして酵素イムノ
アッセイ（ELISA)により測定した。CD４+ Ｔ細胞の不在
下で培養されたＢ細胞によるIgM 生成は11ng／mlであっ
た。
【０１６９】図10に示されるように、CD４+ Ｔ細胞は同
種CD19+ Ｂ細胞によるIgM 生成を刺激した（CD４+ Ｔ細
胞の不在下で、IgM レベルは93％減じられた）。mAbs
9.3及びBB−１は、Ｔh −誘発されたIgM 生成を有意に
阻害した（それぞれ63％及び65％の阻害率）。CTLA４Ig
は、それらのmAbsよりもインヒビターとしてより効果的
であった（89％の阻害率）。
【０１７０】対照分子、mAb OKT8及びCD５Igによる阻害
は、より低かった（30％以下の阻害率）。それらの分子
は、スタフィロコーカル アウレウス（Staphylococcal
aureus)エンテロトキシンＢの存在下で測定されるIg生
成を有意に阻害しなかった。類似する結果が、他のドナ
ーに由来するＢ細胞及びCD４+ Ｔ細胞により得られた。
それらの結果は、CTLA４Igによる阻害が特異的であるこ
とを示す。
【０１７１】上記データはまた、CTLA４及びCD28レセプ
ターが機能的及び構造的に関連していることを示す。CD
28のように、CTLA４はまた、Ｂ細胞活性化抗原、B7のた
めのレセプターでもある。CTLA４Igは、約12nMの親和性
定数Kdを伴って125I−B7を結合し、その値は、CD28とB7
Igとの間の親和性よりも20倍高い（約200 nM）。従っ
て、CTLA４及びCD28は、同じリガンド、すなわちB7抗原
のために、それぞれ高い及び低い親和性レセプターとし
て考えられる。
【０１７２】CD28とB7との間の見掛け親和性は、ネズミ
Ｔ細胞ハイブリドーマのＴ細胞レセプターへの可溶性ア
ロ抗原の結合について報告される親和性に類似し（約10
0 nM；Schnekなど.,Cell 56 : 47 (1989))、そしてCD２
とLFA3との間（Recny など.,J. Biol. Chem. 265 : 854
2 (1990))又はCD４とMHC クラスII分子との間（Clayton
など.,Nature 339 : 548 (1989))の相互作用よりも高
い親和性である。
【０１７３】CTLA４とB7との間の見掛け親和性定数Kdは
さらに大きく、そして好都合には、より高い親和性のmA
bsに匹適する（Ｋ2 ２−10,000nM；Alzariなど.,Ann. R
ev.Immuno. 6 : 555 (1988)) CTLA４とB7との間のKd
は、インテグリンレセプター及びそれらのリガンドのKd
に類似するか又はそれの値よりも大きい（10〜2000nM：
Hautanenなど.,J. Biol. Chem. 264 : 1437 〜1442 (19
89) ; Di Minnoなど.,Blood 61 : 140〜148 (1983) ; T
hiagarajan and Kelley, J. Biol. Chem. 263 :3035〜3
038 (1988))。
【０１７４】従って、CTLA４とB7との間の相互作用の親
和性は、リンパ芽球付着システムについて報告される中
で最高である。それらの結果は、CTLA４転写体の官能的
タンパク質生成物の最初の発現を示す。CTLA４Ig、すな
わちIgＣγ１ドメインに融合されるCTLA４の細胞外ドメ
インを含む融合構成体は、約50,000サブユニットのMrの
ジスルフィド結合ダイマーを形成する（図１）。鎖間ジ
スルフィドはこの融合のIg部分において形成することが
予期されないので、CTLA４からのシステインはジスルフ
ィト結合形成に包含される。同種CD28Ig融合タンパク質
（Linsley など, 前記，1991）はまた鎖間ジスルフィド
結合を含む。
【０１７５】それらの結果は、CD28のようにCTLA４レセ
プター（Hansenなど., Immunogenetics 10 : 247〜260
(1980)) がジスルフィド結合ホモダイマーとしてＴ細胞
表面上に存在することを示唆する。CD28及びCTLA４は高
い相同性のタンパク質であるが、それらは免疫学的に異
なっている。なぜならば抗−CD28mAb, 9.3はCTLA４を認
識しないからである（図４及び５）。
【０１７６】CTLA４が、CD28に類似するシグナル化路に
よりＴ細胞を活性化できるかどうかについては知られて
いない。ネズミ及びヒトCTLA４の細胞質ドメインは同一
であり（Dariavach., 前記 1988)、これは、この領域が
重要な官能性質を有することを示唆する。CD28及びCTLA
４の細胞質ドメインはまた、相同性を共有す。但し、こ
れが２つの分子に類似するシグナル性質を付与するため
に十分であるかいづれかについては不明である。
【０１７７】CTLA４IgはＴ細胞及びＢ細胞協力を必要と
するインビトロリンパ球機能の可能性あるインヒビター
である（図９及び10）。前記研究と共に、これらの発現
は、Ｔ及びＢリンパ球応答を調節することにおいて、B7
抗原とそのカウンターレセプター、CD28及び／又はCTLA
４との間に相互作用の基本的重要性を示唆する。CTLA４
Igは、免疫応答の間、それらの相互作用の役割上、未来
の調査のために有用な試薬であるべきである。
【０１７８】CTLA４Igは、mAb BB−１又はmAb 9.3 のい
づれよりもインビトロリンパ球応答のより可能性あるイ
ンヒビターである（図９及び10）。mAb BB−１よりもよ
りCTLA４Igの高い能力は、ほとんどそれらの分子間での
B7のための親和性の差異によると思われる（図６）。CT
LA４Igはまた、mAb 9.3 よりも可能性がある。なぜなら
ば、たぶん、mAb とは異なって、それはその阻害効果を
妨害するために、Ｔ細胞増殖に対して直接的な刺激効果
を有さないからである（Juneなど.,Immunology Today 11
: 211 (1989)) 。インビトロでのCTLA４Igの免疫抑制
効果は、未来の研究が、異常なＴ細胞活性化又はIg生成
を包含する自己免疫疾患の処置のために、この分子の可
能な治療効果を保証されることを示唆する。
【０１７９】例 ５．生後６〜８週間の雌のBALB／c (H
-2d ) 及び C57BL／6 (H-2d ) マウスを、The Jackson
Laboratory (Bar Harbor, ME) から得た。記述されたと
おり、コラゲナーゼ消化の後ヒト膵島細胞を精製した
（C. Ricordi et al. 移植 52：519 (1991)；A. G. Tz
akis et al. Lancet 336：402 (1990)；C. Ricordi, P.
E. Lacy, E. H. Finke, B. J. Olack, D. W. Scharp,
糖尿病 37：413 (1988)) 。
【０１８０】移植の３〜５日前にストレプトゾシン（体
重１kgにつき175 mg) での処置を受け280 mg／dl以上
(大部分が300 mg／ml以上) の非絶食血漿グルコースレ
ベルを示すB6又はＢ10マウスを被移植動物として用い
た。各々のマウスは、左副腎の下に直径150 μｍの約80
0 個の新鮮なヒト膵島を受けた (D. Faustman and C. C
oe, Science 252 ：1700 (1991) ；Y. J. Zeng etal.
移植 53：277 (1992)) 。処置は、移植直後に開始され
た。
【０１８１】対照動物を、移植直後14日間にわたり隔日
に50μｇの割合で PBS (実線) 又はL6 (点線) で処置し
た（図11) 。３日連続してグルコースレベルが250 mg／
dl以上であった時点で、膵島移植片は拒絶されたとみな
された。PBS(ｎ＝14) 及びL6(ｎ＝８）での処置を受け
た動物は、それぞれ5.6 日及び6.4 日の平均移植片生残
期間を有していた。移植直後連続14日間、動物を10μｇ
のCTLA４Igで処置した（ｎ＝７)(図12) 。７匹のうち３
匹の動物がその移植片を80日以上維持した。残りの４匹
の動物は12.75 日という平均移植片生残期間を有してい
た。
【０１８２】ヒト膵島移植直後14日間隔日に50μｇのCT
LA４Igで動物を処置した（図13) 。この用量での処置を
受けた全ての動物（ｎ＝12) が、分析中全体を通して移
植片を維持した (図13) 。移植片の機能を評価するた
め、移植後21日目及び29日目に、選択されたマウスを腎
摘出した (図13) 。ヒト膵島細胞の移植を受けた腎臓に
対して組織検査を行なった（図14) 。スライドを無差別
に分析した。
【０１８３】移植後29日目のヒト膵島移植を受けた対照
マウスのヘマトキシリン及びエオシン染色は、大きいリ
ンパ球浸潤を示した (図14のＡ）。インシュリンについ
て染色された同じ組織は、検出可能なインシュリン産生
を全く示さなかった（図14のＢ）。
【０１８４】移植後21日目のCTLA４Igでの処置を受けた
マウスからの組織の組織学的検査は、きわめてわずかな
リンパ球しか移植された組織に浸潤していない状態の副
腎下の無傷の膵島を示した (図14のＣ）。組織を、ヘマ
トキシリン及びエオシンで染色した。インシュリンにつ
いて染色されたCTLA４Ig−処理されたマウスからの同じ
組織は、移植された膵島によるインシュリンの産生を示
した（図14のＤ）。後の時点で検査された移植片組織内
でも類似の結果が観察された。上部、中央及び下部の矢
印の頭は、副腎、膵島移植片及び腎臓実質をそれぞれ同
定している。
【０１８５】組織病理学検定においては、全ての組織は
10％の緩衝ホルマリン内で固定され処理され、５μｍの
切片をヘマトキシリン及びエオシンのいずれかで、又は
アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法を用いてイン
シュリンについて、染色した(S. M. Hsu, L. Raine, H.
Fanger, J. Histochem, Cytochem, 29：577 (1981))
。倍率は×122 であった。
【０１８６】図15では、図11について上述したように、
ストレプトゾトシン処理を受けた動物に移植を施した。
14日間隔日に50μｇの用量でヒトB7に対する MAb (実
線) 又は PBS (点線) のいずれかでマウスを処置した
(図15) 。(PBSで処置された) 対照動物（ｎ＝３）は3.5
日という平均移植片生残期間を有し、一方、抗B7処置
を受けた動物（ｎ＝５）は、９日乃至50日以上移植片を
維持した (図15) 。
【０１８７】図16において、血糖正常で、CTLA４Ig処理
され移植を受けたマウス (点線) を、移植後44日目に腎
摘出し、直ちに1000個の第１の当事者であるドナーの膵
島 (点線、黒丸) 又は1000個の第２の当事者の膵島 (点
線、白丸) を用いて残存する副腎の下に再移植した。最
初の移植の時点で凍結されていたこれらの膵島を解凍
し、膵島の機能を確認するため移植より前３日間にわた
り培養した。ストレプトゾトシンで処置され280 mg／dl
という非絶食グルコースレベルを示したＢ10マウスを対
照として用いた( 実線)(図16) 。移植後はいかなる処置
も施さなかった。
【０１８８】対照動物は、移植後４日目までに第１の当
事者（実線、黒丸）及び第２の当事者（実線、白丸）の
膵島移植片の両方を拒絶した（図14) 。第２の当事者の
膵島で再移植を受けたCTLA４Ig処理されたマウスは、4.
5 日の平均移植片生残期間を有していたのに対し、第１
の当事者であるドナーの膵島で再移植された動物は、、
分析中ずっと (80日以上) 移植片を維持した (図16) 。
【０１８９】CTLA４Igは、マウス体内でのヒト膵島移植
片の生残期間をドナー特異的な形で著しく延長し、かく
して免疫抑制に対する１つのアプローチを提供してい
る。マウスの膵島のＢ dell 機能を除去するため、 C57
BL／6 (B6)又は C57BL／10(B10)マウスをストレプトゾ
トシンで処置した。副腎下で糖尿病の動物に対して移植
を施し、外科手術後直ちに処置を開始した。血中グルコ
ース濃度の分析により膵島移植片の生残を監視した。
【０１９０】リン酸緩衝溶液 (PBS)（ｎ＝14) 又はL6
(ヒトIgG1キメラMAb ；ｎ＝８）のいずれかで処理され
た移植を受けた対照動物は、それぞれ5.6 日及び6.4 日
の平均移植片生残期間を有していた (図11) 。これとは
対照的に、CTLA４Igでの処置を受けた動物 (14日間１日
14μｇ) における膵島拒絶は遅らされ、７匹の動物のう
ち５匹は平均移植片生残期間の穏やかな延長を示し (1
2.75 日) 、一方残りの３匹の動物は80日以上の間正常
なグルコースレベルを維持した (図12) 。活発な細胞拒
絶の証拠は全く観察されなかったため、グルコース濃度
におけるこの増大は膵島消耗の結果でありうる。
【０１９１】長期の膵島移植片を維持した３匹のマウス
において、移植から21日目前後でのグルコース濃度の過
度的な増大は、療法後のCTLA４Igの浄化値の薬物速度論
と一貫した自己制限的拒絶の発現を表わしていた可能性
がある（P. S. Linsley et al., Science 257 ：792 (1
992)) 。その後の実験においては、約14日間隔日で動物
一匹あたりのCTLA４Ig用量は50μｇまで増大された。こ
の処置の結果、100 ％の動物は拒絶発症の兆候を全く示
さず実験全体を通して正常な膵島機能を維持することに
なった (図13) 。
【０１９２】インシュリン産生が未変性マウス膵臓では
なく移植された膵島に源を発していたことを確認するた
め、我々は、膵島移植片を除去するべく21日目及び29日
目に、選択された動物を腎摘出した (図13) 。これらの
動物において、グルコース濃度は、24時間以内で350 mg
／dl以上まで増大し、このことは、膵島異種移植片が正
常なグルコースレベルを維持する原因であることを示し
ていた。CD28−B7相互作用の遮断は、異種間膵島移植片
拒絶を阻害すると思われる。
【０１９３】可溶性レセプターすなわちCTLA４Ig融合タ
ンパク質を用いた処理の効果は、Fc結合 (L6は移植片拒
絶をひき起こさなかった) 又はインビボでのＴ細胞又は
Ｂ細胞機能に対する全体的効果の結果ではなかった。対
照 (PBS 処置された）マウス及びCTLA４Ig処置されたマ
ウスからの膵島異種移植片の経時的分析を行なった（図
14) 。対照動物からの膵島組織は、移植片内への著しい
リンパ球浸潤物を伴い、膵島をほとんど残さない状態
で、免疫拒絶の証拠を示した (図14のＡ）。
【０１９４】免疫組織学的染色は、インシュリン陽性細
胞が稀にしか存在せず、ソマトスタチン陽性細胞が全く
存在しないことを示した（図14のＢ）。これとは対照的
に、CTLA４Ig処置されたマウスからの移植片組織には、
リンパ球浸潤物が全く無かった（図14のＣ）。移植片
は、数多くの膵島が見える状態で無傷であった。さら
に、ヒト膵島組織内に見られるＢ細胞はヒトインシュリ
ン（図14のＤ）及びソマトスタチンを産生した。
【０１９５】本研究において用いられたヒトCTLA４Ig
は、マウス及びヒトの両方のB7と反応する。異種間移植
モデルの１つの利点は、マウスB7と反応しないヒトB7に
対するMAb の利用可能性である（T. Yokochi, R. D. Ho
lly, E. A. Clark, J. Immunol. 128 ：823 (1982)) 。
かくしてヒトB7を支持する抗原提供細胞（APCs) の役目
を直接検討することができる。記述通りマウスを移植
し、次に移植後14日間隔日にヒトB7に対するMAb 50μｇ
を用いて処置した。この処置は、対照マウスに対するも
のに比べて処置を受けたマウスにおける移植片生残期間
を延長した (９日から50日以上にまで)(図15) 。抗B7MA
b はCTLA４Igと同じように有効に拒絶を遮断することが
できない。
【０１９６】CTLA４Ig治療は、大部分のマウスにおける
移植片の受容という結果をもたらした。しかしながら、
動物は寛容でない可能性がある。過度的な免疫抑制は、
移植片適合のため常時膵島移植片受容を導く可能性があ
る (APC 機能の喪失の結果としての免疫原性の喪失)
(L. Hao, Y. Wang, R. G. Gill, K. J. Lafferty, J. I
mmunol. 139 ：4022 (1987) ；K. J. Lafferty, S. J.
Prowse, M. Simeonovic,Annu. Rev. Immunol.１：143
(1983)) 。
【０１９７】これらの可能性の区別を行なうため、我々
は、選択された異種移植を受けたCTLA４Ig処置済みマウ
スを（40日目に) 腎摘出し、当初のドナー膵島 (第１の
当事者) 又は無関係の第２の当事者のヒト膵島のいずれ
かを用いて残りの副腎の下でそれらに再移植した (図1
6) 。
【０１９８】ストレプトゾトシンの処置を受けた、膵島
移植片を一度も受けたことのない対照動物にも、第１の
当事者又は第２の当事者のいずれかの膵島で移植を施し
た。移植後は、いかなる処置もとらなかった。対照動物
は、４日目までに第１及び第２の当事者の膵島を拒絶し
た。第２の当事者の膵島を受けたCTLA４Ig処置済みの動
物は、これらの膵島を５日目までに拒絶し、一方第１の
当事者であるドナーの膵島を受けた動物は80日以上移植
片を維持した (図16) 。
【０１９９】これらの結果は、CTLA４Ig処置が結果とし
て異種膵島に対するドナー特異的不応答の延長をもたら
したということを示唆している。ヒト膵島ドナー間の差
異を識別するマウス免疫応答の能力は、ヒト膵島細胞上
で発現された多形性MHC 産物の直接的認識を支援する。
【０２００】例 ６．生後６〜８週目の雌のBALB／c (H
-2d ) 及び C57BL／6 (H-2d ) マウスを、Jackson Labo
ratory (BarHarbor, ME)から入手した。モノクローナル
抗体11B11 は、ラットIgG1抗マウスIL−４である（Ohar
a, J.,及びW. E. Paul, 1985, Ｂ細胞刺激因子−１に対
するモノクローナル抗体の産生とその分子特徴づけ。Na
ture 315：333) (Verax (Lebanon, NH))。
【０２０１】BALB／c マウス（１グループにつき５匹）
を108 のSRBC単独で又は、200 μｇのキメリックL6 mAb
又はヒトCTLA４Ig融合タンパク質と合わせて、静脈内に
て免疫化させた。指示されたグループに、５mg／mlの割
合でラット抗マウスIL−４mAb11B11又はラット免疫グロ
ブリンのいずれかを２mls 腹腔内注射することによって
SRBCの注入に先立ち２時間処置を施した。キメリックL6
mAb又はCTLA４Igでの処置は、さらに４日間毎日繰返し
た。
【０２０２】46日目に全ての動物にSRBC (図17) 又は K
LH (図18) の静脈内注射を施した。特定的に言うと、図
15では、黒丸は、０日目と46日目にSRBCのみを投与した
マウスを表わしている。白丸は46日目にSRBCのみ投与し
たマウスを表わしている。図17中に表わされた残りのマ
ウスは、さらに46日目にSRBCの投与を受けた。これとは
対照的に、図18では、マウスは、46日目のみに異なる免
疫原KLH の投与を受けた。
【０２０３】SRBC又はKLH に向けられた抗体をもつもの
として測定されるマウスの血清濃度は、記述どおり (Li
nsley et al., Science 1992) ELISA により決定され
た。バックグラウンドの５倍のＡ450 を与える希釈液と
して、血清抗体力価を計算した。図15からの血清抗体力
価値は、１グループにつき５匹のマウスからのプールし
た血清から決定されており、一方図16からの血清抗体力
価値は５つの個々の血清の平均力価を表わしている。矢
印は、46日目におけるSRBC又はKLH 注射を表わす。
【０２０４】図17及び図18は、CTLA４Igと抗−IL４の両
方を同時に注射したマウスにおける免疫応答（白い三角
形）が抗原特異的な形で抑制されることを示している。
図17は、CTLA４Ig及び抗−IL４の同時注射を受け０日目
及び46日目にSRBCの注射を受けたマウスにおいて血清抗
体力価の上昇が全く存在しない (すなわち、一次的又は
二次的免疫応答が全くない) ことを示している。CTLA４
Ig及び抗−IL4の組合せは、一次及び二次免疫応答を抑
制し、SRBCに対する長く持続する免疫学的不応答を誘導
する。
【０２０５】さらに、図17は、CTLA４Ig及び対照ラット
Igを同時に注射されたマウスにおいて一次免疫応答が全
く存在しないことを示している (Cappel, Organonteckn
ika,Palo Alto, CA) 。しかしながら、これらのマウス
は、46日目にSRBCの注射後に二次免疫応答を示している
(黒丸、図17) 。
【０２０６】図16は、マウスにおける46日目のCTLA４Ig
及び抗−IL４とそれに続く異なる免疫原KLH の投与がマ
ウス体内のKLH に対する一次免疫応答を抑制しないこと
を示している。その代り、これらのマウスはKLH に対す
る一次免疫応答を示した (白い三角形、図16) 。かくし
てCTLA４Ig及び抗−IL4 で処置されたマウスは、体内に
投与された抗原に応じてきわめて特異的な免疫応答を示
した。本発明が関与する当業者に明らかなように、本発
明は、本発明の範囲内で、上記に特別に開示されるもの
以外の形で具体化され得る。従って、上記本発明の特定
の態様は例示的であると考えられるべきである。本発明
の範囲は、例示的であって、本発明を制限するものでは
ない。
【０２０７】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA （ゲノム） ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：Homo sapiens 配列 CTAGCCACTG AAGCTTCACC ATGGGTGTAC TGCTCACAC 39
【０２０８】配列番号：２ 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA （ゲノム） ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：Homo sapiens 配列 TGGCATGGGC TCCTGATCAG GCTTAGAAGG TCCGGGAAA 39
【０２０９】配列番号：３ 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA （ゲノム） ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：Homo sapiens 配列 TTTGGGCTCC TGATCAGGAA AATGCTCTTG CTTGGTTGT 39
【０２１０】配列番号：４ 配列の長さ：84 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA （ゲノム） ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：Homo sapiens 配列 AAGCAAGAGC ATTTTCCTGA TCAGGAGCCC AAATCTTCTG ACAAAACTCA 50 CACATCCCCA CCGTCCCCAG CACCTGAACT CCTG 84
【０２１１】配列番号：５ 配列の長さ：41 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA （ゲノム） ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：Homo sapiens 配列 CTTCGACCAG TCTAGAAGCA TCCTCGTGCG ACCGCGAGAG C 41
【０２１２】配列番号：６ 配列の長さ：47 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA （ゲノム） ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：Homo sapiens 配列 CATTGCACAG TCAAGCTTCC ATGCCCATGG GTTCTCTGGC CACCTTG 47
【０２１３】配列番号：７ 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA （ゲノム） ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：Homo sapiens 配列 ATCCACAGTG CAGTGATCAT TTGGATCCTG GCATGTGAC 39
【０２１４】配列番号：８ 配列の長さ：65 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA （ゲノム） ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：Homo sapiens 配列 CTCAGTCTGG TCCTTGCACT CCTGTTTCCA AGCATGGCGA GCATGGCAAT 50 GCACGTGGCC CAGCC 65
【０２１５】配列番号：９ 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA （ゲノム） ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：Homo sapiens 配列 TTTGGGCTCC TGATCAGAAT CTGGGCACGG TTG 33
【０２１６】配列番号：10 配列の長さ：72 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA （ゲノム） ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：Homo sapiens 配列 CTAGCCACTG AAGCTTCACC AATGGGTGTA CTGCTCACAC AGAGGACGCT 50 GCTCAGTCTG GTCCTTGCAC TC 72
【０２１７】配列番号：11 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA （ゲノム） ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：Homo sapiens 配列 GCAATGCACG TGGCCCAGCC TGCTGTGGTA GTG 33
【０２１８】配列番号：12 配列の長さ：45 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA （ゲノム） ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：Homo sapiens 配列 TGATGTAACA TGTCTAGATC AATTGATGGG AATAAAATAA GGCTG 45
【０２１９】配列番号：13 配列の長さ：561 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA （ゲノム） ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：Homo sapiens 特徴： 名称／キー：CDS 位置：1..561 配列 GCA ATG CAC GTG GCC CAG CCT GCT GTG GTA CTG GCC AGC AGC CGA 45 Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg 1 5 10 15 GGC ATC GCC AGC TTT GTG TGT GAG TAT GCA TCT CCA GGC AAA GCC 90 Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala 20 25 30 ACT GAG GTC CGG GTG ACA GTG CTT CGG CAG GCT GAC AGC CAG GTG 135 Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val 35 40 45 ACT GAA GTC TGT GCG GCA ACC TAC ATG ATG GGG AAT GAG TTG ACC 180 Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr 50 55 60 TTC CTA GAT GAT TCC ATC TGC ACG GGC ACC TCC AGT GGA AAT CAA 225 Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln 65 70 75 GTG AAC CTC ACT ATC CAA GGA CTG AGG GCC ATG GAC ACG GGA CTC 270 Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu 80 85 90 TAC ATC TGC AAG GTG GAG CTC ATG TAC CCA CCG CCA TAC TAC CTG 315 Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu 95 100 105 GGC ATA GGC AAC GGA ACC CAG ATT TAT GTA ATT GAT CCA GAA CCG 360 Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro 110 115 120 TGC CCA GAT TCT GAC TTC CTC CTC TGG ATC CTT GCA GCA GTT AGT 405 Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser 125 130 135 TCG GGG TTG TTT TTT TAT AGC TTT CTC CTC ACA GCT GTT TCT TTG 450 Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu 140 145 150 AGC AAA ATG CTA AAG AAA AGA AGC CCT CTT ACA ACA GGG GTC TAT 495 Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr 155 160 165 GTG AAA ATG CCC CCA ACA GAG CCA GAA TGT GAA AAG CAA TTT CAG 540 Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln 170 175 180 CCT TAT TTT ATT CCC ATC AAT 561 Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 185
【０２２０】配列番号：14 配列の長さ：187 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg 1 5 10 15 Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala 20 25 30 Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val 35 40 45 Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr 50 55 60 Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln 65 70 75 Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu 80 85 90 Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu 95 100 105 Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro 110 115 120 Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser 125 130 135 Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu 140 145 150 Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr 155 160 165 Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln 170 175 180 Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 185
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、下の実施例２に記載するCTLA４Ig融合
構成体の線図である。
【図２】図２は、下の実施例２に記載するCTLA４IgのSD
S-PAGEクロマトグラフィーの精製から得られたゲルの写
真であり、電気泳動の結果を表わす図面に代る写真であ
る。
【図３】図３は、実施例３に記載する、オンコスタチイ
ン（oncostatin) Ｍシグナルプライマー伸長（位置−25
〜−１）に融合したヒトCTLA４レセプター（配列識別番
号：13および14）をエンコードし、そして新しく同定さ
れたＮ連鎖グリコシル化部位（位置109 〜111)を含む、
完全なアミノ酸配列を示す図である。
【図４】図４は、実施例４に記載する、CD28およびCTLA
４でトランスフェクションしたCOS 細胞へのB7Ig融合タ
ンパク質の結合のFACSR 分析の結果を示すグラフであ
る。
【図５】図５は、実施例４に記載する、B7抗原陽性（B7
+ ) CHO 細胞およびリンパ芽球様細胞系（PM-LCL) 上の
精製したCTLA４Igの結合のFACSR 分析の結果を示すグラ
フである。
【図６】図６は、実施例４に記載する、同定化CTLA４Ig
への125I標識化B7Igの競争結合の分析を示すグラフであ
る。
【図７】図７は、実施例４に記載する、同定化CTLA４Ig
への125I標識化B7Igのスキャッチャード分析の結果を示
すグラフである。
【図８】図８は、実施例４に記載する、125Iで表面標識
化したB7陽性CHO 細胞およびPM-LCL細胞の免疫沈澱分析
のSDS-PAGEクロマトグラフィーからのゲルの電気泳動の
結果を示す図面に代る写真である。
【図９】図９は、実施例４に記載する、〔 3Ｈ〕−チミ
ジンの組み込みにより測定した、CTLA４IgのＴ細胞の増
殖への作用を示すグラフである。
【図１０】図10は、実施例４に記載する、酵素のイムノ
アッセイ（ELISA)により決定した、ヒトＴ細胞によるヘ
ルパーＴ細胞（Ｔh ）誘発免疫グロブリンの分泌へのCT
LA４Igの作用を示す棒グラフである。
【図１１】図11は、ヒト膵島異種移植片の生残を示す線
グラフである。
【図１２】図12は、ヒト膵島異種移植片の生残を示す線
グラフである。
【図１３】図13は、ヒト膵島異種移植片の生残を示す線
グラフである。
【図１４】図14は、Ｂ10マウスの副腎の下に移植された
ヒト膵島の組織病理学スライドの写真である。
【図１５】図15は、ヒトB7に対するMAb を用いた膵島移
植片の生残期間の延長を示す線グラフである。
【図１６】図16は、CTLA４Igによる膵島移植片抗原に対
するドナー特異的不応答の誘導を示す線グラフである。
【図１７】図17は、ヒツジ赤血球 (SRBC) 、mAbL6 及び
ラットIg，mAbL6 及び抗−IL４,CTLA４Ig及びラットIg,
CTLA４Ig及び抗−IL４の注射を受けたマウスの抗体血
清力価レベルを示す線グラフである。Ｘ軸は抗体−血清
力価を測定する。Ｙ軸は、日数単位の時間を測定する。
黒の正方形は、０日目と46日目にSRBCの注射を受けたマ
ウスを表わす。白の正方形は、46日目にSRBCの注入を受
けたマウスを表わす。黒丸は、mAbL6 及びラット免疫グ
ロブリンの注射を受けたマウスを表わす。白丸は、mAbL
6 及び抗IL4 抗体の注射を受けたマウスを表わす。黒の
三角形は、CTLA４Ig及びラット免疫グロブリンの注射を
受けたマウスを表わす。白の三角形は、CTLA４Ig及び抗
−IL４抗体の注射を受けたマウスを表わす。
【図１８】図18は、KLH, mAbL6及びラットIg，mAbL6 及
び抗−IL４, CTLA４Ig及びラットIg, CTLA４Ig及び抗−
IL４の注射を受けたマウスの抗体血清力価レベルを示す
線グラフである。Ｘ軸は、抗体血清力価を測定する。Ｙ
軸は、日数で表わした時間を測定する。黒の正方形は、
46日目にキーホールリンペットヘモシアニン (KLH)の注
射を受けたマウスを表わす。黒丸はmAbL6 及びラット免
疫グロブリンの注射を受けたマウスを表わす。白丸はmA
bL6 及び抗−IL4 抗体の注射を受けたマウスを表わす。
黒の三角形は、CTLA４Ig及びラット免疫グロブリンの注
射を受けたマウスを表わす。白の三角形は、CTLA４Ig及
び抗−IL４抗体の注射を受けたマウスを表わす。
【手続補正書】
【提出日】平成６年４月１９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１１】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１２】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１３】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１４】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１５】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１６】
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１７】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１８】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジェフリー エー．リドベター アメリカ合衆国，ワシントン 98117，シ アトル，ノースウエスト ワンハンドレッ ドサーティーンス プレイス 306 (72)発明者 ナイティン ケー．デイムル アメリカ合衆国，ニュージャージー 08852，モンマウント ジャンクション, リッジ ロード 865 (72)発明者 ウィリアム ブレディ アメリカ合衆国，ワシントン 98021，ボ ーゼル，トゥーハンドレッドナインティー ンス プレイス サウスウエスト 618 (72)発明者 フィリップ エム．ウォーレース アメリカ合衆国，ワシントン 98116，シ アトル，ディー，シックスティーフォース アベニュ サウスウエスト 3020

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 リンパ球とB7との相互作用をブロックす
    ることにより免疫応答を制御するために使用するための
    IL−４−結合分子及びCTLA４−結合分子を含んで成る組
    成物。
  2. 【請求項２】 前記CTLA４−結合分子がCTLA４Ig融合蛋
    白質である、請求項１に記載の組成物。
  3. 【請求項３】 前記CTLA４Ig融合蛋白質が、CTLA４の細
    胞外ドメインに対応するアミノ酸配列のおよそ１位から
    およそ125 位までのアミノ酸残基を含む第１アミノ酸配
    列及びヒト免疫グロブリンＣγ１のヒンジ、CH２及びCH
    ３領域に対応するアミノ酸配列を含む第２アミノ酸配列
    を有する融合蛋白質である、請求項２に記載の組成物。
  4. 【請求項４】 前記CTLA４−結合分子がCD28Ig／CTLA４
    Ig融合蛋白質ハイブリドである、請求項１に記載の組成
    物。
  5. 【請求項５】 前記CD28Ig／CTLA４Ig融合蛋白質ハイブ
    リドが、ヒト免疫グロブリンＣγ１のヒンジ、CH２及び
    CH３領域に対応する第３アミノ酸配列及びCTLA４受容体
    の細胞外ドメインの部分に対応する第２アミノ酸配列に
    融合した、CD28受容体の細胞外ドメインの部分に対応す
    る第１アミノ酸配列を有する融合蛋白質ハイブリドであ
    る、請求項４に記載の組成物。
  6. 【請求項６】 前記リンパ球がB7陽性リンパ球である、
    請求項１，２，３，４又は５に記載の組成物。
  7. 【請求項７】 前記免疫応答が、抗体産生阻害をもたら
    すＢ細胞応答、細胞性免疫の阻害をもたらすＴ細胞応
    答、又はリンパ球増殖阻害である、請求項１，２，３，
    ４又は５に記載の組成物。
  8. 【請求項８】 前記組成物が、移植組織の受容者である
    対象者において移植拒絶を阻害するために使用するもの
    である、請求項１，２，３，４又は５に記載の組成物。
  9. 【請求項９】 前記組成物が、移植片対宿主病の抑制の
    ために使用されるものである、請求項１，２，３，４又
    は５に記載の組成物。
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