NO316223B1

NO316223B1 - Blanding omfattende et B7-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl, samtanvendelse derav

Info

Publication number: NO316223B1
Application number: NO19940228A
Authority: NO
Inventors: Peter S Linsley; Jeffrey A Ledbetter; Nitin K Damle; William Brady; Philip M Wallace
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1993-01-22
Filing date: 1994-01-21
Publication date: 2003-12-29
Also published as: EP0613944A3; JPH0769914A; FI940270A; EP0613944B1; ES2247585T3; FI940270A0; AU5390194A; CA2113744A1; PT613944E; NO940228D0; EP0613944A2; NO940228L; IL108374A0; ATE302846T1; CA2113744C; US5770197A; DE69434465T2; DE69434465D1; JP3833723B2; IL108374A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører blanding omfattende et B7-bindende molekyl og et IL4-bmdende molekyl, samt anvendelse derav

Det er i hele foreliggende søknad referert til forskjellige publikasjoner Beskrivelser og fremgangsmåter i disse publikasjonene inngår her som referanser for mer detaljert å beskrive situasjonen eller tilstanden innenfor det området som oppfinnelsen angår

Foreliggende oppfinnelse angår uttrykningen av CTLA4 reseptorgenet, identifikasjon av interaksjonen mellom reseptoren og celler som uttrykker B7-antigen

Et karaktenstikum for et vertebratimmunsystem er dets evne til å kunne diskriminere mellom det det selv har produsert og det som er fremmed Denne egenskapen har ført til utviklingen av et system som krever flere signaler for å oppnå optimal immunaktivenng (Janeway, Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 54 1-14 (1998)) T-celle-B-cellemteraksjoner er essensielle og viktige i forbindelse med immunreaksjonen Man har funnet at nivået av mange tilfestede molekyler som finnes på T-cellene og B-cellene øker under en immunreaksjon (Springer et al, (1987), supra, Shaw og Shimuzu, Current Opinion in Immunology, red Kindt og Long, 1 92 97 (1988)), og Hemler "Immunology Today" 9 109-113 (1988)) Øket nivå av disse molekyler kan muligens forklare hvorfor aktiverte B-celler er mer aktive for stimulering av antigen-spesifikk T-celleoppformering enn hvilende B-celler (Kaiuchi et al, J Immunol 131 109-114 (1983), Kreiger et al, J Immunol 135 2938-2945 (1985), McKenzie, J Immunol 141 2907-2911 (1988), og Hawrylowicz og Unanue, J Immunol 141 4083-4088 (1988))

Utviklingen av en T-lymfocytt ("T-celle") immunreaksjon er en kompleks prosess som innbefatter celle-celle interaksjoner (Springer et al, A Rev Immunol 5 223 252 (1987)), spesielt mellom T- og hjelpeceller så som B-cellene, og produksjon av oppløselige immunaktivatorer (cytokmer og lymfokiner) (Dinarello og Mier, New Engl Jour Med 317 940-945 (1987)) Denne reaksjonen reguleres av flere T-celleoverflatereseptorer, blant annet T-cellereseptorkomplekset (Weiss et al, Ann Rev Immunol 4 593-619 (1986)) og andre "hjelpe"-overflatemolekyler (Springer et al, (1987) supra) Mange av disse hjelpe- eller ekstramolekylene er naturlig forekommende celleoverflatedifferensierende antigener (CD) definert ved reaktiviteten hos monoklonale antistoffer på overflaten av cellene (McMichael, red , Leukocyte Typing III, Oxford Univ Press, Oxford, N Y (1987))

Antigen-uavhengige intracellulære interaksjoner som innbefatter lymfocytt-hjelpemolekyler er meget viktige for en immunreaksjon (Springer et al, (1987) supra) Således er f eks bindingen av et T-celleassosiert protein, CD2, til dets ligand LFA-3, et meget vanlig uttrykt glykoprotein (se en oversikt i Shaw og Shimuzu, supra), viktig for å få en optimal antigen-spesifikk T-celleaktivering (Moingeon et al, Nature, 339 314 (1988))

Et viktig tilfestingssystem innbefatter bindingen av LFA-1 -glykoproteinet som finnes på lymfocytter, makrofager og granulocytter (Springer et al, (1987), supra, Shaw og Shimuzu (1988), supra) til dets ligander ICAM-1 (Makgoba et al, Nature 331 86-88 (1988)) og ICAM-2 (Staunton et al, Nature 339 61-64 (1989)) De T-cellehjelpende molekylene CD8 og CD4 styrker T-celletilfestningen ved en interaksjon med MHC klasse I (Norment et al, Nature 336 79-81 (1988) og klasse II (Doyle og Strominger, Nature 330 256-259 (1987)) molekyler henholdsvis Såkalte "homing-reseptorer" er viktige for kontroll av lymfocyttvandnng (Stoolman, Cell 56 907-910 (1989))

VLA-glykoproteinene er integnner som synes å styre lymfocyttfunksjoner som krever tilfesting til ekstracellulære matnsekomponenter (Hemler, supra) CD2/LFA-3, LFA-1/ICAM-1 og ICAM-2, og VLA-tilfestningssystemer finnes på en rekke forskjellige celletyper (Springer et al, (1987), supra, Shaw og Shimuzu,

(1988), supra og Hemler (1988), supra)

Tallrike in vrtro-undersøkelser har vist at cytokiner inngår i utviklingen av alloreaktive effektorceller F eks ble membranbundet IL-4 og oppløselig IL-4-reseptor tilført separat til mus, noe som resulterte i en svak økning av den lymfoformerende reaksjonen I motsetning til dette viste det seg at oppløselig IL-4-reseptor undertrykket denne reaksjonen i allogene celler i en doseavhengig måte Videre er det vist at en nøytraliserende antistoff mot IL-4 og et annet mot oppløselig IL-4-reseptor, var effektive inhibitorer for den lymfoformerende reaksjonen

Det ble for mange år siden foreslått at B-lymfocyttaktivering krever to signaler (Bretscher og Cohn, Science 169 1042-1049 (1970)) og det er nå generelt antatt at alle lymfocytter krever to signaler for å få en optimal aktivenng, en antigenspesifikk eller et klonalt signal, såvel som et annet antigen ikke-spesifikt signal (Janeway, supra) Freemanetal (J Immunol 143(8) 2714-2722(1989)) isolerte og sekvenserte et cDNA-klon som kodet et B-celleaktiveringsantigen som ble gjenkjent av mAb B7 (Freeman et al, J Immunol 138 3260 (1987)) COS-celler som var tilført dette cDNA viste seg å merke både merket mAb B7 og mAb BB-1 (Clark et al, Human Immunol 16 100-113 (1986), Yokochi et al, J Immunol 128 823 (1981)), Freeman et al, (1987) supra, og Freedman et al, (1987), supra)) I tillegg til dette har man oppdaget en uttrykning av dette antigenet i celler av en annen type, f eks monocytter (Freedman et al, supra)

De signalene som er nødvendige for en T-hjelpecelle (Tn) antigen reaksjon ble tilveiebragt av antigenpresenterende celler (APC) Det første signalet startes ved en interaksjon mellom T-cellereseptorkomplekset (Weiss, J Clm Invest 86 1015 (1990)) og antigen som er tilstede i forbindelse med klasse II hovedhistokompatibilitetskomplekset (MHC) molekylene på nevnte APC (Allen, Immunol Today 8 270 (1987)) Dette antigen-spesifikke signalet er ikke tilstrekkelig til å utvikle en full reaksjon, og kan i nærvær av et andre signal føre til en klonal inaktivering eller anergi (Schwartz, Science 248 1349 (1990)) Kravet til et annet samstimulerende signal som blir tilveiebragt av MHC er vist i en rekke ekspenmentelle systemer (Schwartz, supra, Weaver og Unanue, Immunol Today 11 49 (1990)) Selve den molekylære typen på nevnte andre signal er ikke fullt ut forstått, skjønt det er klart at i enkelte tilfeller dreier det seg både om løselige molekyler så som interleukm (IL)-1 (Weaver og Unanue, supra) og membran-reseptorer som inngår i den intracellulære tilfestnmgen (Springer, Nature 346 425

(1990)), og at de begge kan gi de samstimulerende signalene

CD28-antigen, et homodimert glykoprotein av immunoglobulingruppen (Aruffo og Seed, Prod Nati Acad Sei 84 8573-8577 (1987)), er et tilleggsmolekyl som finnes på de fleste modne humane T-celler (Damle et al, J Immunol 131 2296-2300 (1983)) Det man vet tdag tyder på at dette molekylet funksjonerer som en alternativ T-celleaktivenngsvei som skiller seg fra den som startes av T-cellereseptorkomplekset (June et al, Mol Cell Biol 7 4472-4481 (1987)) Monoklonale antistoffer (mAb) som er reaktive ved CD28-antigenet kan forsterke T-cellereaksjoner som er startet på grunn av forskjellige polyklonale stimuli (se oversikt av June et al, supra) Disse stimulerende effekter kan være et resultat av en mAb-indusert cytokinproduksjon (Thompson et al, Proe Nati Acad Sei 86 1333-1337 (1989), og Lmdsten et al, Science 244 339-343 (1989)) som en konsekvens av øket mRNA-stabilisenng (Lmdsten et al, (1989) supra) Anti-CD28 mAb kan også ha en hemmende effekt, dvs at de kan blokkere autologe blandede lymfocyttreaksjoner (Damle et al, Proe Nati Acad Sei 78 5096-6001 (1981)) og aktivering av antigen-spesifikke T-cellekloner (Lesslauer et al, Eur J Immunol 16 1289-1296 (1986))

Undersøkelser har vist at CD28 er en mot-reseptor for B-celleaktivenngsantigenet, B7/BB-1 (Linsley et al, Proe Nati Acad Sei USA 87 5031-5035

(1990)) Av hensiktsmessighetsgrunner vil B7/BB1-antigenet i det etterfølgende bli betegnet som "B7-antigenet"

Interaksjoner mellom CD28 og B7-antigenet er blitt karakterisert ved å bruke genetiske sammensmeltninger mellom de ekstracellulære delene på B7-antigenet og CD28-reseptoren og immunoglobulin (lg) Cy1 (tungkjedet konstant område) (Linsley et al, J Exp Med 173 721-730(1991)) Immobilisert B7lg sammensmeltet protein såvel som B7-positive CHO-celler har vist seg å samstimulere T-celfeoppformenng

Linsley et al, Science, 1992, 257 (5071) 792-795 demonstrerer at in vivo-administrasjon av CTLA4lg undertrykker T-celleavhengig antistoffresponser med store doser av CTLA4lg-undertrykkende immunresponser til en sekundær immunisering Imidlertid leder CTLA4lg-behandlingen, selv med store doser, ikke til permanent immunosuppresjon, det vil si ingen induksjon av toleranse Forfatterne spekulerer i om mangelen på toleranseinduksjon kan være forårsaket av en av fire faktorer, en av dem var at CTLA4lg-behandlingen kunne favorisere utviklingen av IL4-produserende TH2-celler (side 794, midterste kolonne, siste avsnitt) Dette utsagnet er nærmest en invitasjon til å ekspenmentere mer, og det er ingen grunn til å foreslå at et IL4-bmdende middel kunne være effektivt med et CTLA4-bindende molekyl i å indusere toleranse, og enda mindre virke synergistisk sammen i å bevirke toleranse

NO 93 48 01 beskriver identifiseringen av B7-antigen som ligand for CTLA4, fremstilling av CTLA4lg, karaktensering av CTLA4 og fremgangsmåter for regulering av cellulære interaksjoner involverende CTLA4 Alle ekspenmenter er in vitro ved bruk av rensede molekyler eller i cellekulturer IL-4 er nærmest nevnt i NO 93 48 01 som et cytokin hvis regulenng, det er sekresjon, kan affiseres ved CD28/CTLA4/B7-mteraksjoner Dette er ikke noe forslag til å kombinere IL4-bindende midler med CTLA4-bindende molekyler som CTLA4

T-cellestimulenng med B7-positive CHO-celler vil også spesifikt stimulere til høyere nivåer av transknpter for IL-2 Ytterligere undersøkelser har vist at anti-

CD28 mAb hemmer IL-2-produksjonen som er indusert av visse T-celleleukemi-celler ved en cellulær interaksjon med en B-celleleukemilinje (Kohno et al, Cell Immunol 131 1-10 (1990))

CD28 har et enkelt ekstracellulært variabelt (V)-lignende område (Aruffo og Seed, supra) Et homologt molekyl, CTLA4, er blitt identifisert ved differensiell screening av et musecytolyttisk-T-celle DNA-bibliotek (Brunet et al, Nature 328 267-270(1987))

Transknpter av CTLA4-molekylet har også blitt funnet i T-cellepopulasjoner med cytotoksisk aktivitet, noe som antyder at CTLA4 kan funksjonere i den cytologiske reaksjonen (Brunet et al, supra, og Brunet et al, Immunol Rev

103 21-36 (1988)) Det er også blitt rapportert om kloning og kartlegging av et gen for den humane motparten til CTLA4 (Danavach et al, Eur J Immunol 18 1901-1905 (1988)) til det samme kromosomale området (2q33-34) som CD28 (Lafage-Pochitaloff et al, Immunogenetics 31 198-201 (1990))

En sekvenssammenhgning mellom dette humane CTLA4-DNA og det som koder for CD28-proteiner har avslørt en betydelig homologi med hensyn til sekvens, og hvor man finner den høyeste homologigraden nær de membrane og cytoplasmatiske områder (Brunet et al, 1988, supra, Danavach et al, 1988, supra)

Den høye homologigraden mellom CD28 og CTLA4 sammen med samlokahsenngen av deres gener, reiser spørsmål på hvorvidt disse molekyler også er funksjonelt nærstående Ettersom man imidlertid ikke har greid med hell å uttrykke proteinproduktet av CTLA4, kan man ikke svare på disse spørsmål

Uttrykning av oppløselige denvater av celleoverflateglykoproteiner i undergruppen av immunoglobulingenet er blitt oppnådd med CD4, reseptoren for HIV-1 og CD28 og B7-reseptorene ved å bruke hybndsammensmeltede molekyler som består av DNA-sekvenser som koder for aminosyrer som tilsvarer deler av det ekstracellulære området av CD4-reseptor smeltet sammen med anttstoffområder (immunoglobulin y1 (Capon et al, Nature 337 525-531 (1989)

(CD4) og Linsley et al, J Exp Med , supra (CD28 og B7))

Det er et behov for den foreliggende oppfinnelse De terapier som for tiden brukes for å hindre en forkastelse av transplanterte organer, hviler i alt vesentlig på bruken av panimmuno-undertrykkende forbindelser, f eks cyklosponn A og monoklonale antistoffer (mAb) til CD3 Behandlingen med disse forbindelsene og stoffene må vanligvis skje hele livet igjennom for pasienten, og de undertrykker og svekker hele immunsystemet og vil ofte resultere i sekundære helseproblemer,

f eks en økende frekvens av infeksjoner og kreft

Det besknves fullstendig og korrekt DNA-sekvens som koder for aminosyresekvensen som tilsvarer CTLA4-reseptorproteinet, og identifiserer B7-antigenet som den naturlige liganden for CTLA4-reseptoren Det beskrives også en fremgangsmåte for uttrykning av DNA som et CTLA4-immunoglobulin (lg) fusjonsproteinprodukt

Foreliggende oppfinnelse innbefatter en blanding som er kjennetegnet ved at den omfatter a) et B7-bindende molekyl som er et løselig CTLA4-molekyl, og b) et IL4-bindende molekyl som er et monoklonalt antistoff som spesifikt gjenkjenner og binder til IL4, for anvendelse i regulering av en immunreaksjon ved en blokkering av en B7-interaksjon med lymfocytter Det B7-bindende molekylet i blandingen ifølge foreliggende oppfinnelse kan være et løselig CTLA4lg-fusjonsprotein

I en utførelse av oppfinnelsen omfatter blandingen et CD28lg/CTLA4lg-fusjonsproteinhybnd Videre tilveiebringer oppfinnelsen anvendelse av et B7-bmdende molekyl og et IL4-bindende molekyl for fremstilling av en farmasøytisk blanding som definert i kravene 1 til 3 for regulering av en immunrespons for blokkering av en B7-interaksjon med lymfocytter De nevnte lymfocyttende er fortrinnsvis B7-positive lymfocytter

I en foretrukket anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse, anvendes et B7-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl for fremstilling av en farmasøytisk blanding i henhold til krav 8, hvor immunresponsen er en B-cellerespons resulterende i inhibenngen av antistoffproduksjon, en T-cellerespons resulterende i inhibenng av cellemediert immunitet, eller immunresponsen er en inhibenng av lymfocyttprohferasjon

Det humane CTLA-reseptorprotemet blir kodet ved hjelp av 187 aminosyrer og innbefatter en nylig identifisert N-forbundet glykosylenngsposisjon

CTLA4lg-fusjonsproteinet som omfattes av blandingen ifølge foreliggende oppfinnelse binder B7-antigenet som er uttrykt på aktiverte B-celler og celler fra andre cellelinjer, en ligand for CD28-reseptor på T-celler CTLA4lg binder B7-antigenet med betydelig høyere affinitet enn B7-bindingen til CD28-reseptoren CTLA4lg-konstruksjonen er den første aminosyresekvensen som tilsvarer det ekstracellulære området av CTLA4-reseptoren som er smeltet sammen med en annen aminosyresekvens som tilsvarer det humane lg Cy1 -området Den første aminosyresekvensen inneholder aminosyrerestene fra posisjon 1 til posisjon 125 av den aminosyresekvensen som tilsvarer det ekstracellulære området av CTLA4, bundet til en annen aminosyresekvens som inneholder aminosyrerestene eller gruppene som tilsvarer hengselet, CH2- og CH3-områdene i det humane IgCyl Fusjonsproteinet blir fortrinnsvis fremstilt i dimerisk form Oppløselig CTLA4lg er en sterk inhibitor in vitra av T- og B-lymfocyttreaksjoner

Foreliggende oppfinnelse omfatter også hybndfusjonsproteiner så som CD28lg/CTLA4lg fusjonsproteiner med en første aminosyresekvens som tilsvarer fragmentene av det ekstracellulære området av CD28, bundet til en annen aminosyresekvens som tilsvarer fragmentene fra det ekstracellulære området på CTLA4lg, og en tredje aminosyresekvens som tilsvarer hengselet, CH2- og CH3-områdene av det humane IgCyl En utførelse av hybndfusjonsproteinene er en CD28lg/CTLAIg-sammensmeltningskonstruksjon som har en første aminosyresekvens som inneholder aminosyregruppene fra stilling 1 til ca stilling 94 av den aminosyresekvens som tilsvarer det ekstracellulære området av CD28, forenet med en annen aminosyresekvens som inneholder aminosyregruppene fra posisjon 94 til ca posisjon 125 av den aminosyresekvens som tilsvarer det ekstracellulære området av CTLA4, forbundet til en tredje aminosyresekvens som inneholder aminosyregruppene som tilsvarer hengselet, CH2 og CH3-områdene av det humane IgCyl Blandingen ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et IL4-bindende molekyl som foretrukket er et monoklonalt antistoff eller en løselig IL4-reseptor som spesifikt gjenkjenner eller binder seg til IL4

Foreliggende oppfinnelse innbefatter også en blanding for anvendelse i regulering av en immunreaksjon kjennetegnet ved at immunreaksjonen er en B-cellereaksjon som fører til hemming av antistoffproduksjon, en T-cellereaksjon som fører til hemming av en cellestyrt immunitet, eller hvor immunreaksjonen er en hemming av en lymfocyttformenng

Ifølge et ytterligere aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en blanding for anvendelse å hemme forkastelse av transplantert vev hos en pasient som har mottatt slikt vev, eventuelt for å hindre sykdommer eller lidelser som skyldes reaksjoner mellom transplanterte vev og verten

Det beskrives også en fremgangsmåte for å regulere T-cellemteraksjonene med B7-positive celler, idet man bruker en ligand for B7-antigenet En slik ligand er CTLA4lg-fusjonsproteinet, dets fragmenter eller derivater, CD28lg/CTLA4lg-fusjonsproteinhybriden eller et monoklonalt antistoff som er reaktivt med B7-antigenet

Det beskrives en fremgangsmåte for å behandle immunsystemsykdommer som styres eller utvikles av T-celleinteraksjoner med B7-positive celler, ved at man tilfører en ligand som er reaktiv med B7-antigenet for derved å regulere T-celle-interaksjonene med B7-positive celler Liganden er CTLA4lg-fusjonsprotemet, eller CD28lg/CTLA4-fusjonsproteinhybnden eller et monoklonalt antistoff som er reaktivt med B7-antigenet

Det er her beskrevet et monoklonalt antistoff som er reaktiv med CTLA4lg-fusjonsproteinet og et monoklonalt antistoff som er reaktivt med CT28lg/CTLA4lg-fusjonsproteinet for bruk ved regulenng av cellulære interaksjoner eller reaksjoner

Det er også beskrevet en ny kinesisk hamstereggstokkcellehnje som stabilt uttrykker CTLA4lg-fusjonsproteinet

Beskrivelse av figurene

Fig 1 er en diagrammessig representasjon av en CTLA4lg-fusjonskonstruksjon som er beskrevet i det etterfølgende eksempel 2 Fig 2 er et fotografi av en gel oppnådd ved SDS-PAGE kromatografisk rensning av CTLA4lg som beskrevet i eksempel 2 Fig 3 viser den komplette aminosyresekvens som koder for human CTLA4-reseptor (SEQ ID NR 13 og 14) som er fusjonert med onkostatm M signalpeptidet (posisjon -25 til -1) og innbefatter den nylig identifiserte N-forbundne glykosyle-nngsposisjonen (posisjon 109-111), som beskrevet i eksempel 3 Fig 4 viser resultatene av en FACS^-analyse av bindingen av B7lg-fusjonsproteinet til CD28- og CTLA4-transfekterte COS-celler som beskrevet i eksempel 4 Fig 5 viser resultatene av FACS^-analyse av bindingen av renset CTLA4lg på B7-antigenpositive (B7<+>) CHO-celler og på en lymfoblastoid cellelinje (PM LCL) som beskrevet i eksempel 4 Fig 6 er et diagram som viser konkurransebmdingsanalysen mellom <1><ø>l-merket B7lg og immobilisert CTLA4lg som beskrevet i eksempel 4 Fig 7 er et diagram som viser resultatene av Scatchard-analyse av 125|. merket B7lg-binding til immobihsert CTLA4lg som beskrevet i eksempel 4 Fig 8 er et fotografi av en gel fra SDS-PAGE kromatografi av en immunoutfelhngsanalyse av B7-positive CHO-celler og PM LCL-celler som er overflatemerket med <125>| som beskrevet i eksempel 4 Fig 9 er et diagram som viser effekten av en oppformering av T-celler på CTLA4lg som målt ved en [<3>H]-thymidin-inkorporering som beskrevet i eksempel 4 Fig 10 er et stolpediagram som viser effekten av CTLA4lg på hjelpe-T-celle (Th)-indusert immunoglobulmutskillelse av humane B-celler, slik dette kunne bestemmes ved hjelp av enzymimmunoprøve (ELISA) som beskrevet i eksempel 4 Fig 11 A, 11B og 11C er linjediagrammer som viser overlevelsen av transplanterte humane pankreatiske øyer Fig 12A, 12B, 12C og 12D er fotografier av histopatologiske snitt av humaner øyer transplantert under en nyrekapsel av B10-mus Fig 13 er et hnjediagram som viser hvorledes transplanterte øyer får en forlenget overlevelsestid med MAb til humant B7 Fig 14 er et linjediagram som viser en induksjon av en donor-spesifikk mangel på reaksjon overfor antigener fra transplanterte øyer med CTLA4lg Fig 15 er et linjediagram som viser serumtitrenngsnivået av antistoff i mus injisert med røde blodceller (SRBC) fra sau, mAb L6 og rotte lg, mAb L6 og anti-IL4, CTLA4lg og rotte lg, CTLA4lg og anti-IL4 X-aksen viser antistoff-serums-titrenngsverdien Y-aksen angir tiden i døgn Den lukkede firkanten representerer mus injisert med SRBC på dag 0 og dag 46 Den åpne firkanten representerer mus injisert med SRBC på dag 46 Den lukkede sirkelen representerer mus injisert med mAb L6 og rotte immunoglobuhn Den åpne sirkelen representerer mus injisert med mAb L6 og anti-IL4-antistoff Den lukkede trekanten representerer mus injisert med CTLA4lg og rotte immunoglobuhn Den åpne trekanten representerer mus injisert med CTLA4lg og anti-IL4-antistoff Fig 16 er et linjediagram som viser serumtitrenngsnivået av antistoff hos mus injisert med KLH, mAb L6 og rotte lg, mAb L6 og anti-IL4, CTLA4lg og rotte lg, CTLA4lg og anti-IL4 På X-aksen er det avsatt titrenngsverdien for serum-antistoffet Y-aksen viser tiden i døgn Den lukkede firkanten representerer mus injisert med "keyhole hmpet" hemocyanin (KLH) på dag 46 Den lukkede sirkelen representerer mus injisert med mAb L6 og rotte immunoglobuhn Den åpne sirkelen representerer mus injisert med mAb L6 og anti-IL4-antistoff Den lukkede trekanten representerer mus injisert med CTLA4lg og rotte immunoglobuhn Den åpne trekanten representerer mus injisert med CTLA4lg og anti-IL4-antistoff

Definisioner

Slik det er brukt i foreliggende søknad, har følgende ord og fraser den mening som er angitt nedenfor

Begrepet "blokkerende B7-interaksjon" betyr å påvirke bindingen av B7-antigenet til dets ligander så som CD28 og CTLA4 ved at man hindrer T-celle- og B-celleinteraksjonen

Begrepet "CTLA4-bindende molekyl" betyr ethvert molekyl som vil binde B7-antigenet

Begrepet "IL4-bmdende molekyl" betyr ethvert molekyl som vil genkjenne og binde seg til IL4

For at oppfinnelsen lettere skal kunne forstås, er den mer detaljert beskrevet i det etterfølgende

Det beskrives isolering og uttrykning av den humane CTI_A4-reseptoren som finnes på overflaten av T-celler, og som binder seg til B7-antigenet uttrykt på aktiverte B-celler, og celler av andre cellelinjer, og uttrykningen av oppløselige fusjonsproteinprodukter fra CTLA4-reseptorgenet

Oppfinnelsen tilveiebringer blandinger som omfatter et B7-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl for anvendelse i regulering av en immunreaksjon ved en blokkering av en B7-interaksjon med lymfocytter, samt anvendelse derav

I en foretrukket utførelse, blir den fullstendige og riktige DNA-sekvensen som koder for aminosyresekvensen som tilsvarer det humane CTLA4-reseptor-proteinet, klonet ved hjelp av PCR cDNA som inneholder den fullstendige forutsatte kodningssekvensen for CTLA4, ble satt sammen av to PCR-fragmenter amplifisert eller oppformert fra H38 RNA og innsatt i uttrykningsvektoren, CDM8 slik det er detaljert beskrevet i de etterfølgende eksempler Isolater ble ført inn i COS-celler og prøvet for binding av B7lg, et oppløselig fusjonsprotein med en aminosyresekvens som tilsvarer det ekstracellulære området av B7 og et humant immunoglobuhn (lg) Cyl-område, slik det er beskrevet av Linsley et al, J Exp Med 173 721-730(1991)

DNA-sekvensen i et isolat med betegnelsen OMCTLA4 ble så bestemt, og man fant at denne sekvensen tilsvarte nøyaktig den predikerte humane CTLA4-sekvensen smeltet sammen ved N-enden til signalpeptidet fra onkostatin M CLTA4-reseptoren er kodet ved hjelp av 187 aminosyrer (eksklusive signalpeptidet og stoppekodonene) og innbefatter en nylig identifisert N-bundet glykosylenngsposisjon ved aminosyreposisjonen 109-111 (se blant annet fig 3) CTLA4-reseptoren ble uttrykt ved å bruke onkostatin M-signalpeptidet

I en annen foretrukken utførelse blir oppløselige former av proteinproduktet av CTLA4-reseptorgenet (CTLA4lg) fremstilt ved å bruke fusjonsproteiner som har en første aminosyresekvens som tilsvarer det ekstracellulære området av CTLA4 og en annen aminosyresekvens som tilsvarer det humane lg Cy1-området Kloning og uttrykmngsplasmidene (CDM8 og rcLN) ble konstruert inneholdende cDNA som koder for deler av aminosyresekvensen som tilsvarer den humane CTLA4-reseptoren, basert på de cDNA-sekvenser som her er beskrevet, hvor cDNA koder for en første aminosyresekvens som tilsvarer et fragment av det ekstracellulære området av CTLA4-reseptorgenet, og hvor dette festes til et DNA som koder for en annen aminosyresekvens som tilsvarer et IgC-område, noe som gjør det mulig å uttrykke CTLA4-reseptorgenet ved å endre oppløsehgheten på det uttrykte CTLA4-proteinet Oppløselig CTLA4lg-fusjonsprotein blir således først kodet ved en første aminosyresekvens som inneholder aminosyregruppene fra stilling 1 til ca stilling 125 i den aminosyresekvensen som tilsvarer det ekstracellulære området av CTLA4 bundet til en annen aminosyresekvens som inneholder aminosyrerestene eller gruppene som tilsvarer hengsel, CH2- og CH3-områdene av det humane IgCyl Fusjonsproteinet blir fortnnnsvis fremstilt i dimensk form Konstruksjonen ble så overført til COS- eller CHO-celler, og CTLA4lg ble renset og identifisert som en dimer

1 overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse kan CTLA4lg og CTL4lg/CD28-fusjonsproteinhybnden ha en aminosyresubstitusjon i aminosyresekvensen som tilsvarer det eksterne området av CTLA4, hvorved man får fremstilt molekyler som vil beholde de funksjonelle egenskaper ved CTLA4, dvs at molekyler med slike substitusjoner vil kunne binde B7-antigenet Disse aminosyre-substitusjonene innbefatter, men er ikke nødvendigvis begrenset til, aminosyresubstitusjoner som går under betegnelsen "konservative"

Det er f eks velkjent innen proteinkjemien at visse aminosyresubstitusjoner med betegnelsen "konservative aminosyresubstitusjoner" kan utføres i et protein uten at man endrer proteinets form eller funksjon Slike forandringer innbefatter at man kan erstatte enhver av aminosyrene isoleucm (I), valin (V) og leucin (L) med enhver annen av disse hydrofobe aminosyrene, asparaginsyre (D) for glutaminsyre (E) og vice versa, glutamin (Q) for asparagin (N) og vice versa, og senn (S) for treonin (T) og vice versa Andre substitusjoner eller erstatninger kan også anses å være konservative avhengige av den spesielle aminosyrens miljø og dens rolle i proteinets tredimensjonale struktur F eks kan glycin (G) og alamn (A) ofte byttes ut med hverandre, og det samme gjelder alanin og valin (V)

Metionm (M) er relativt hydrofob og kan ofte byttes ut med leucin og isoleucm, og enkelte ganger også med valin Lysin (K) og arginin (R) kan ofte byttes ut med hverandre i posisjoner hvor aminosyrens viktigste trekk er dens ladning, og hvor det ikke er betydelige forskjeller med hensyn til pK-verdiene på disse to aminosyregruppene I spesielle miljøer kan også andre forandnnger anses å være "konservative"

Ved å bruke de fremgangsmåter som her er beskrevet, kan man fremstille mutanter av det CTLA4-bindende molekylet En mutant innbefatter (1) en sekvens som begynner med aminosyren i posisjon 1 og ender med aminosyren i posisjon 95 av CD28-reseptorprotemet (Aruffo og Seed, 1987), (2) en sekvens som begynner med aminosyren i posisjon 95 og ender med aminosyren i posisjon 125 av det ekstracellulære området av CTLA4 (Brunet et al, 1987), og (3) en sekvens som tilsvarer det humane IgCyl-området

Den andre mutanter består av (1) en sekvens som begynner med aminosyren i posisjon 1 og ender med aminosyren i posisjon 95 av CD28-reseptor-proteinet (Aruffo og Seed, 1987), (2) en sekvens som begynner med aminosyren i posisjon 95 og ender med aminosyren i posisjon 120 av det ekstracellulære området av CTLA4 (Brunet et al, 1987), og (3) en sekvens som tilsvarer det humane IgCyl-området

Det beskrives en fremgangsmåte for å blokkere B7-interaksjon slik at man kan regulere immunreaksjonen, som innbefatter at man kontakter lymfocytter med et CTLA4-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl Lymfocyttene kan være B7-positive lymfocytter

Det beskrives videre en fremgangsmåte for å regulere en immunreaksjon, og hvor fremgangsmåten innbefatter at man kontakter B7-positive lymfocytter med et CTLA4-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl

Immunreaksjonen kan være en B-cellereaksjon som er et resultat av at man har hemmet antistoffproduksjonen Følgelig kan immunreaksjonen være en T-cellereaksjon som resulterer i at man hemmer en cellestyrt immunitet Videre kan immunreaksjonen være en hemming av en lymfocyttoppformering

Videre besknves en fremgangsmåte for å hindre en avstøtning av transplantert vev hos en pasient som har mottatt slikt vev Denne fremgangsmåten kan innbefatte at man tilfører pasienten et CTLA4-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl

Det beskrives ytterligere en fremgangsmåte for å hemme sykdommer som skyldes interaksjoner mellom transplantert vev og vertens vev, som innbefatter at man tilfører verten eller pasienten et CTLA4-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl

I overensstemmelse med blandingen i henhold til foreliggende oppfinnelse kan det nevnte CTLA4-bindende molekyl være et CTLA4lg-fusjonsprotein F eks

kan sistnevnte protein være et fusjonsprotein som har en første aminosyresekvens som inneholder aminosyrerestene fra posisjon 1 til ca posisjon 125 av den aminosyresekvensen som tilsvarer det ekstracellulære området av CTLA4, og en annen aminosyresekvens som inneholder aminosyrerestene som tilsvarer hengselen, CH2- og CH3-områdene i det humane immunoglobulinet Cy1

Alternativt kan det nevnte CTLA4-bindende molekyl være en CD28lg/- CTLA4lg-fusjonsproteinhybnd F eks kan denne hybriden være en fusjonsprotein-hybnd som har en første aminosyresekvens som tilsvarer en del av det ekstracellulære området av CD28-reseptoren smeltet sammen med en annen aminosyresekvens som tilsvarer en del av det ekstracellulære området av CTLA4-reseptoren og en tredje aminosyresekvens som tilsvarer hengselet, CH2- og CH3-områdene av det humane immunoglobulinet Cy1

Videre kan det IL4-bindende molekylet være et monoklonalt antistoff som spesifikt gjenkjenner og binder seg til IL4 Alternativt kan det IL4-bindende molekylet være en oppløselig IL4-reseptor som gjenkjenner og binder seg til IL4

(Fanslowetal ,1991)

DNA som koder for aminosyresekvensen som tilsvarer nevnte CTLA4lg-fusjonsproteinet er innlevert til the American Type Culture Collection (ATCC) i Rockville, Maryland, ifølge reglene i Budapest-konvensjonen, den 31 mai 1991 og er gitt ATCC tilvekstnummer 68629

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer blandinger som omfatter det første proteinproduktet av CTLA4-transknpter i form av et oppløselig fusjonsprotein CTLA4lg-proteinet danner en disulfid-forbundet dimer med to underenheter, hver som har en Mr på 50 000, noe som indikerer at det naturlige CTLA4 antagelig eksisterer på T-celleoverflaten som en disulfid-bundet homodimer

B7-antigen har vist seg å være en ligand for CD28-reseptoren på T-celler (Linsley et al, Proe Nati Acad Sei USA, supra) CTLA4-reseptormolekylet synes funksjonelt og strukturelt å være beslektet med CD28-reseptoren, idet begge er reseptorer for B-celleaktiveringsantigenet B7, mens CTLA4 synes å ha høyere affinitet for B7, dvs blant de høyeste som hittil er rapportert for lymfoide tilfestningssystemer Det har imidlertid vist seg at CTLA4lg binder seg sterkere til B7-positive (B7<+>) cellelinjer enn CD28lg Andre eksperimenter har vist at CTLA4 har en høyere affinitetsreseptor for B7-antigen enn CD28-reseptoren Videre er det vist at CTLA4lg binder seg til et enkelt protein på lymfoblastoide celler og som har nesten samme størrelse som B7-antigenet CTLA4lg hemmet T-celleformering og hemmet Tn-indusert IgM-produksjon

I en annen utførelse er det konstruert hybrid-fusjonsproteiner med aminosyresekvenser som tilsvarer fragmenter av forskjellige reseptorproteiner F eks ble aminosyresekvenser som tilsvarer utvalgte fragmenter av de ekstracellulære områdene av CD28 og CTLA4 forbundet slik at man dannet CD28lg/CTLA4lg-hybndfusjonsproteiner Et slikt protein ble fremstilt med en første aminosyresekvens som inneholdt aminosyrerestene som tilsvarer et fragment av det ekstracellulære området CD28 forbundet med en annen aminosyresekvens som tilsvarte et fragment av det ekstracellulære området av CTLA4lg, og en tredje aminosyresekvens som tilsvarte hengselet CH2- og CH3-områdene av humant IgCyl En utførelse av hybndfusjonsproteinene er en CD28lg/CTLA4lg-fusjonskonstruksjon som har en første aminosyresekvens som inneholder aminosyrerestene fra ca posisjon 1 til posisjon 94 av den aminosyresekvens som tilsvarer det ekstracellulære området av CD28, forbundet med en annen aminosyresekvens som inneholder aminosyrerestene fra posisjon 94 til posisjon 125 av den aminosyresekvens som tilsvarer det ekstracellulære området av CTLA4, forbundet med en tredje aminosyresekvens som tilsvarer hengselet, CH2- og CH3-områdene av det humane IgCyl

Teknikker for kloning og uttrykning av DNA-sekvenser som koder for aminosyresekvenser som tilsvarer CTLA4-reseptorproteinet, oppløselige fusjonsproteiner og hybndfusjonsproteiner, f eks syntese av oligonukleotider, PCR, transformering av celler, konstruksjon av vektorer, uttrykningssystemer og lignende er velkjente innen den biologiske og medisinske forskning, og de fleste forskere er familiære med standard ressursmatenaler for spesifikke betingelser og fremgangsmåter De etterfølgende avsnitt er derfor tilveiebragt av hensiktsmessighetsgrunner og for å angi enkelte modifikasjoner, og kan således tjene som en retningslinje for anvendelse av foreliggende oppfinnelse

Kloning og uttrykning av kodende sekvenser for reseptorer og fusjonsproteiner

Fusjonsproteinkonstruksjoner som tilsvarer CD28lgCy1 og B7lgCy1 for karakterisering av CTLA4lg ifølge foreliggende oppfinnelse, og for fremstilling av CD28lg/CTLA4lg fusjonshybnder, ble fremstilt som beskrevet av Linsley et al, J Exp Med 173 721-730 (1991), som her inngår som en referanse Alternativt kan cDNA-kloner fremstilles fra RNA oppnådd fra celler som uttrykker B7-antigen og CD28-reseptor basert på kunnskap om publiserte sekvenser for disse proteiner (Aruffo og Seed, og Freeman, supra) ved bruk av kjente fremgangsmåter

CTLA4lg-fusjoner som består av DNA som koder for aminosyresekvenser som tilsvarer det ekstracellulære området av CTLA4 og hengselet, CH2- og CH3-områdene av humant IgCyl, ble konstruert ved ligenng av PCR-fragmenter cDNA som koder for aminosyresekvensene ble amplifisert ved å bruke polymerase-kjedereaksjons (PCR) -teknikken (se US-patenter 4 683 195 og 4 683 202 til Mullis et al og Mullis & Faloona, Methods Enzymol 154 335-350(1987)) CTLA4lg fusjonspolypeptider ble fremstilt med DNA som koder for aminosyresekvenser som inneholder aminosyrerestene fra posisjon 1 til posisjon 125 av den aminosyresekvens som tilsvarer det ekstracellulære området av CTLA4, og DNA som koder for aminosyresekvensene som tilsvarer hengselet, CH2- og CH3-områdene av IgCyl

Ettersom uttrykningen av CTLA4-reseptorproteinet i humane lymfoide celler ikke tidligere er rapportert, var det nødvendig å lokalisere en kilde for CTLA4 mRNA PCR-fremstilt cDNA fremstilt fra totalt cellulært RNA fra flere humane leukemicellelinjer ble gjennomsøkt, idet man som primere brukte ohgonukleotider fra de publiserte sekvenser av CTLA4-genet (Danavach et al, supra) Av det cDNA som ble undersøkt, ga H38-celler (en HTLV-ll-assosiert leukemicellelinje) det beste utbyttet av PCR-produkter med den forventede størrelse Ettersom et signalpeptid for CTLA4 ikke var identifisert i CTLA4-genet, ble N-terminusgruppen for den forutberegnede sekvensen av CTLA4 festet til signalpeptidet onkostatin M (Malik et al, Molec and Cell Biol 9 2847 (1989)) i to trinn, hvor man brukte de ohgonukleotider som er beskrevet i de etterfølgende eksempler Produktet av PCR-reaksjonen ble ligert med cDNA som kodet for aminosyresekvensene som tilsvarer hengselet, CH2- og CH3-områdene i IgCyl i en uttrykningsvektor, f eks CDM8 eller jiLN

For å oppnå DNA som koder for den fulle lengden av human CTLA4, ble det fremstilt et cDNA som koder for transmembran og cytoplasmiske områder av CTLA4 ved hjelp av PCR fra H38-celler, og forenet med et fragment fra CTLA4lg fremstilt som beskrevet ovenfor, og som koder nevnte onkostatin M-signalpeptid festet til N-terminusgruppen av CTLA4, idet man brukte oligonukleotidprimere som beskrevet i de etterfølgende eksempler PCR-fragmentene ble ligert over i plasmid CDM8, noe som resulterte i en uttrykningsplasmid som koder for den fulle lengde av CTLA4-genet og som fikk betegnelsen OMCTLA4

For konstruksjon av DNA som koder for aminosyresekvensen som tilsvarer hybndsammensmeltningsproteinene, ble DNA som koder for aminosyrer som tilsvarer deler av det ekstracellulære området for ett av reseptorgenene forbundet med DNA som koder aminosyrer som tilsvarer deler av det ekstracellulære området av det annet reseptorgen, og til DNA som koder for aminosyresekvenser som tilsvarer hengselet, CH2- og CH3-områdene av det humane IgCyl, idet man brukte fremgangsmåter som beskrevet ovenfor for B7lg, CD28lg og CTLA4lg-konstruksjonene Således ble f eks DNA som koder for aminosyregruppene fra posisjon 1 til posisjon 94 i den aminosyresekvens som tilsvarer det ekstracellulære området av CD28-reseptoren forenet med DNA som koder aminosyregruppene fra posisjon 94 til posisjon 125 av den aminosyresekvens som tilsvarer det ekstracellulære området av CTLA4-reseptoren, og til DNA som koder for aminosyresekvenser som tilsvarer hengselet, CH2- og CH3-områdene av det humane IgCyl

For å fremstille store mengder av klonet DNA, ble vektorer som inneholdt DNA som koder for fusjonskonstruksjonen som omfattes av blandingen ifølge foreliggende oppfinnelse, transformert over i egnede vertsceller, f eks baktene-cellelinjen E coli stamme MC1061/p3 (Invitrogen Corp , San Diego, USA) ved hjelp av standardmetoder, og kolonier ble gjennomsøkt for passende plasmider

Kloner som inneholdt DNA som koder fusjonskonstruksjoner fremstilt som beskrevet ovenfor ble så overført til egnede vertsceller for uttrykning Avhengig av den vertscellen som ble brukt, ble transfeksjonen utført ved hjelp av standard-teknikk som er passende for slike celler F eks ble transfeksjonen over i pattedyrceller utført ved å bruke en DEAE-dekstran styrt transfeksjon, CaP04-ko-utfelling, lipofeksjon, elektroporenng eller protoplastsammensmeltmng eller andre fremgangsmåter som er velkjente, og hen inngår lysozymfusjon eller erytrocytt-fusjon, skraping, direkte opptak, osmotisk eller sukrosesjokk, direkte mikroinjeksjon, indirekte mikroinjeksjon f eks via erytrocytt-styrt teknikk og/eller ved å la vertscellene bli eksponert overfor elektrisk strøm Den ovennevnte liste av transfeksjonsteknikker er ikke å anse som fullt ut uttømmende, ettersom man også vil kunne utvikle andre fremgangsmåter for å føre genetisk informasjon over i andre celler

Uttrykning i eukaryotiske vertscellekulturer fremstilt fra multicellulære organismer er foretrukket (se Tissue Cultures, Academic Press, Cruz and Patterson, red (1973)) Disse systemer har den ytterligere fordel at de har evne til å spalte ut mtroner og kan således brukes direkte for å uttrykke genomiske fragmenter Bruktbare vertscellelinjer innbefatter kinesisk hamstereggstokk (CHO), apenyre (COS), VERO og HeLa-celler I foreliggende oppfinnelse er det foretrukket å bruke cellelinjer som stabilt uttrykker fusjonskonstruksjonene

Uttrykningsvektorer for slike celler vil vanligvis innbefatte promotorer og kontrollsekvenser som er forenlige med pattedyrceller, f eks CMV-promotor

(CDM8-vektor) og fuglesarkomvirus (ASV) (rcLN-vektor) Andre tidligere brukte og senere promotorer innbefatter de som er fremstilt fra Simian Virus 40 (SV 40)

(Fiers et al, Nature 273 113 (1973)), og andre viruspromotorer, f eks av den type som er fremstilt fra polyom, Adenovirus 2, og bovint papillomvirus Man kan også bruke den kontrollerbare promotoren hMTII (Kann et al, Nature, 299 797-802

(1982)) Generelle fremgangsmåter med hensyn til systemtransformasjoner av pattedyrceller er blitt beskrevet av Axel (US-PS 4 399 216, utstedt 16 august 1983) Det er nå velkjent at "forsterkende" områder er viktige for å få en optimal uttrykning, og dette er vanligvis sekvenser som finnes oppstrøms eller nedstrøms for promotorområdet i ikke-kodende DNA-områder Ett eller flere rephkasjonsongo kan oppnås hvis dette er nødvendig fra virale kilder Imidlertid er en integrenng i kromosomet en vanlig mekanisme for DNA-rephkasjon hos eukaryoter

Skjønt de foretrukne vertsceller for uttrykning av fusjonskonstruksjonene innbefatter eukaryotiske celler så som COS- og CHO-celler, kan man også bruke andre eukaryotiske mikrober som verter Laboratonestammer av Saccharomyces ceævisiae, vanlig bakergjær, er vanlig brukt, men man kan også bruke andre stammer så som Schizosaccharomyces pombe Man kan også bruke vektorer hvor man anvender 2// replikasjonsongoet til Broach, Meteh Enz 101 307 (1983), eller andre gjærkompatible rephkasjonsongo (se f eks Stinchcomb et al, Nature 2823 39 (1979)), Tschempe et al, Gene 10 157 (1980), og Clarke et al, Meth Enz 101 300(1983)) Kontrollsekvenser for gjærvektorer innbefatter promotorer for syntesen av glykolytiske enzymer (Hess et al, J Adv Enzyme Reg 7 149

(1968), Holland et al, Biochemistry 17 4900 (1978)) Andre promotorer som er kjent innbefatter CMV-promotoren som er tilveiebragt i CDM8-vektoren (Toyama et Okayama, FEBS 268 217-221 (1990), promotoren for 3-fosfoglyceratkinase (Hitzeman et al, J Bnol Chem 255 2073 (1980)), og de for andre glykolytiske enzymer Andre promotorer som har den ytterligere fordel at transkripsjonen kan reguleres ved hjelp av vekstbetingelsene er promotorområdene for alkohol-dehydrogenase 2, isocytokrom C, syrefosfatase, kuttende enzymer som er forbundet med nitrogenmetabolisme og enzymer som er ansvarlig for anvendelsen av maltose og galaktose Det er også antatt at det er ønskelig med en termmator-sekvens ved 3-enden av de kodende sekvensene Slike terminatorgrupper kan finnes i det 3' uoversatte området som følger etter den kodende sekvensen i gjæravledede gener

Alternativt kan man bruke prokaryotiske celler som verter for uttrykning De prokaryoter som vanligvis er brukt er forskjellige stammer av E coli, men man kan også bruke andre mikrobielle stammer eller arter Vanlig brukte prokaryote kontrollsekvenser er her definert til å innbefatte promotorer for en start på transkripsjonen, eventuelt med en operator, sammen med ribosombindende posisjonssekvenser, og hen inngår vanlig brukte promotorer så som beta-laktamase (penicilhnase) og laktose (lac) promotorsystemer (Chang et al, Nature 198 1056 (1977)), tryptofan (trp) promotorsystemet (Goeddel et al, Nucleic Acids Res 8 4057 (1980)) og den lambda-avledede P[_-promotoren og den N-genribosombindende posisjonen (Shimatake et al, Nature, 292 128 (1981))

De nukleotidsekvenser som koder for CD28lg- og CTLA4lg-proteinene og deres fusjonshybndproteiner så som CD28lg/CTLA4lg, kan uttrykkes i en rekke forskjellige systemer slik dette er beskrevet nedenfor cDNA kan kuttes ut ved hjelp av egnede restnksjonsenzymer og ligeres over i egnede prokaryotiske eller eukaryotiske uttrykningsvektorer for slik uttrykning Ettersom CD28 og CTLA4 reseptorproteinene opptrer i naturen som dimerer, antar man at for å få en god uttrykning av disse proteinene bør man ha et system som gjør at disse proteinene kan dannes som dimerer Avkuttede versjoner av disse proteiner (f eks slike som dannes ved å innføre et stoppekodon i sekvensen i en posisjon som ligger oppstrøms for transmembranområdet for proteinet) synes ikke å bh uttrykt Uttrykningen av CD28 og CTLA4-reseptorene som fusjonsproteiner gjør det mulig å få en dimerdannelse av disse proteinene Det er således foretrukket i foreliggende oppfinnelse å ha en uttrykning av CTLA4-proteinet som et fusjonsprodukt

En stabil CHO-hnje ifølge foreliggende oppfinnelse, som her er betegnet kinesiske hamstereggstokkcellehnje CTLArlg-24, er foretrukket for uttrykning av CLTA4lg og er blitt innlevert under ATCC slik det er angitt i Budapest-konvensjonen, den 31 mai 1991 og har fått tilvekstnummeret 10762

Uttrykning av CTLA4-reseptoren ifølge foreliggende oppfinnelse oppnås ved at man utfører en transfeksjon av en cellelinje så som COS-celler, og påviser uttrykningen ved binding av de CTLA4-transfekserte celler til en ligand for CTLA4-reseptoren, f eks ved å teste for binding av cellene til B7lg-fusjonsprotein

Sekvenser i de resulterende konstruksjoner ble bekreftet ved DNA-sekvensenng ved hjelp av kjente fremgangsmåter, f eks slik det er beskrevet av Sanger et al, Proe Nati Acad Sei USA 74 5463 (1977), og som ytterligere er beskrevet av Messing et al, Nucleic Acids Res 9 309 (1981), og ved fremgangsmåten til Maxam et al, Methods Enzymol 65 499 (1980))

Utvinning av proteinprodukter

Som nevnt ovenfor lar CD28- og CTLA4-reseptorgenene seg ikke så lett bli uttrykt som ferdige proteiner ved å bruke en direkte uttrykning av DNA som koder for det avkuttede proteinet For å få en homodimerdannelse må DNA som koder for aminosyresekvensen som tilsvarer det ekstracellulære området på CD28 og CTLA4 og som innbefatter kodonene for en signålsekvens, f eks av den type man finner for onkostatin M i celler som lar seg bearbeide passende, bh smeltet sammen med DNA som koder for den aminosyresekvensen som tilsvarer Fc-området i et naturlig dimerisk protein En rensning av disse fusjonsprotein-produktene etter utskillelse fra cellene blir således lettet ved å bruke antistoffer som er reaktive med den anti-immunoglobuhndelen av de sammensmeltede proteiner Når de blir skilt ut i mediet kan fusjonsproteinproduktet innvinnes ved hjelp av standard proteinrensningsteknikk, f eks ved å anvende protein A-kolonner

Anvendelse

CTLA4lg-fusjonsproteinet og/eller fragmenter av dette kan brukes for å reagere med B7-positive celler, f eks B-celler, for å regulere immunreaksjoner som reguleres eller styres ved hjelp av T-celleinteraksjoner med B7-antigen-positive celler

CTLA4lg-fusjonsprotein og CTLA4lg/CD28lg hybndproteiner, og/eller fragmenter og derivater av disse, kan også brukes for reaksjon med B7-positive celler, hen inngår B-celler, for å regulere immunreaksjoner som styres eller reguleres ved hjelp av T-celleavhengige B-cellereaksjoner Med begrepet "fragment" slik det brukes her, forstås en del av den aminosyresekvensen som koder for det protein som er betegnet "CTLA4" Et fragment av CTLA4lg-fusjonsproteinet som kan brukes er et polypeptid med en aminosyresekvens som tilsvarer en viss del av den aminosyresekvensen som tilsvarer CTLA4-reseptoren som brukes for å oppnå CTLA4lg-fusjonsproteinet, slik det er beskrevet her

B7-antigenet som uttrykkes på aktiverte B-celler og celler av annen opprinnelse og CD28-reseptoren som uttrykkes på T-celler kan direkte binde seg til hverandre, og denne interaksjonen kan styre celle-til-celle-interaksjonen Slike interaksjoner eller reaksjoner utløser direkte CD28-aktivenngsveien i T-celler, noe som fører til cytokinproduksjon, T-celleoppformering og B-celledifferensiering i immunoglobulin-produserende celler Den aktivering som forekommer av B-celler kan gi en økende uttrykning av B7-antigen og ytterligere CD28-stimulering, noe som fører til en tilstand av kronisk inflammasjon, slik man f eks ser det i auto-immunologiske sykdommer, avstøtning av transplanterte organer, sykdommer som oppstår mellom det transplanterte organ og verten eller kronisk allergiske reaksjoner En blokkering eller hemming av denne reaksjonen kan således effektivt brukes for å hindre en T-celle cytokinproduksjon, og således hindre eller reversere inflammatonske reaksjoner

CTLMIg er her vist å være en sterk inhibitor av in vitro lymfocyttreaksjoner som krever T- og B-celleinteraksjon Dette understreker viktigheten av interaksjoner mellom B7-antigenet og dets motreseptorer, CTLA4 og/eller CD28 De cytoplasmiske områder i mus og humant CTLA4 er nokså like (Danavach et al, supra, 1988), noe som antyder at dette området har viktige funksjonelle egenskaper Også cytoplasmiske områder i CD28 og CTLA4 har høy grad av homologi

CTLA4 er en sterkere inhibitor m vitro av lymfocyttreaksjoner enn både anti-BB1 og anti-CD28 mAb CTLMIg har ikke en direkte stimulerende effekt på T-celleformenng for å motvirke dets hemmende effekter Derfor vil CTLA4lg-fusjonsproteinet være en bedre inhibitor in vivo enn anti-CD28 monoklonale antistoffer De immunoundetrrykkende effekter av CTLA4lg in vitro antyder bruk i terapi for behandling av autoimmunologe sykdommer som innbefatter unormal T-celleaktivenng eller lg-produksjon

CTLA4lg-fusjonsproteinet er forventet å vise hemmende egenskaper in vivo Det er således forventet at CTLA4lg vil kunne virke slik at det hemmer T-celler på samme måte som de effekter man observerer for anti-CD28 antistoff under lignende betingelser in vivo Under slike betingelser hvor det opptrer T-celle/B-celle-interaksjoner som et resultat av kontakt mellom slike celler, vil en binding av tilført CTLA4lg reagere med B7-antigenpositive celler, f eks B-celler, og dette vil hemme T-celle/B-celle-interaksjoner, som igjen resulterer i en regulering av immunreaksjonene På grunn av denne eksklusive hemmende effekten kan man forvente at CTLA4lg kan brukes in vivo som en inhibitor for T-celleaktivitet fremfor ikke-spesrfikke inhibitorer så som cyklosponn og glukosteroid-forbindelser

I en utførelse kan CTLA4lg-fusjonsproteinet eller CTLA4lg/CD28lg-hybndproteiner tilsettes egnede farmasøytiske fortynningsmidler eller bærere in vivo, og så tilføres en pasient for behandling av patologiske tilstander, f eks sykdommer i forbindelse med immunsystemet, eller kreft

Innfønngen av fusjonsproteinet in vivo kan forventes å resultere i en interferens med T-celleinteraksjoner og andre celler, så som B-celler, noe som skjer på grunn av en binding av liganden til B7-positive celler En hindring av normale T-celleinteraksjoner eller reaksjoner kan resultere i nedsatt T-celle-aktivitet, f eks nedsatt T-celleformering eller produksjon I tillegg vil en tilførsel av fusjonsproteinet in vivo kunne resultere i en regulering av in v/vo-nivået av cytokiner, og hen inngår, men er inne begrenset til, interleukiner, f eks interieukin (<n>IL>2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, vekstfaktorer som f eks svulstvekstfaktor (TGF<n>), kolonistimulerende faktor ("CSF"), interferoner ("IFN") og svulstnekrosefaktor ("TNF") for å fremme forønskede effekter i en pasient Når f eks fusjonsproteinet føres in vivo inn i en pasient, kan dette blokkere produksjonen av cytokiner som bidrar til ondartet vekst f eks av svulstceller Fusjonsproteinet kan også blokkere oppformeringen av virus som er avhengig av T-celleaktivering, f eks den type virus som forårsaker AIDS, HTLV1

Under visse omstendigheter som angitt ovenfor, vil effekten av en tilførsel av CTLA4lg-fusjonsproteinet eller dets fragmenter in vivo være hemmende, noe som skyldes at fusjonsproteinet blokkerer en utløsning av CTLA4 og CD28 som oppstår ved en T-celle/B-celle-kontakt F eks kan CTLA4lg-proteinet blokkere en T-celleformenng En innføring av CTLA4lg-fusjonsproteinet in vivo vil således gi effekter både på T-celle- og B-cellestyrte immunreaksjoner Fusjonsproteinet kan også tilføres en pasient i kombinasjon med at man tilfører cytokiner eller andre terapeutiske reagenser

I andre utførelser av oppfinnelsen vil andre reagenser, heri inngår denvater som er reaktive med CTLA4lg-fusjonsproteinet eller CTLA4-reseptoren, brukes for å regulere T-celleinteraksjoner F eks kan antistoffer og/eller antistoff-fragmenter som er reaktive med CTLA4-reseptoren gjennomsøkes for å identifisere de som er istand til å hemme bindingen av CTLA4lg-fusjonsproteinet til B7-antigenet

Antistoffene eller antistoffragmentene så som Fab eller F(ab')2-fragmenter kan så brukes for å reagere med T-celler, f eks for å hemme en T-celleformering

Monoklonale antistoffer som er reaktive med CTLA4-reseptor kan fremstilles ved hjelp av hybridomer fremstilt ved hjelp av kjente fremgangsmåter, f eks av den type som er beskrevet av Kohler og Milstein (se Kohler og Milstein, Nature, 256 495-97 (1975)), og modifikasjoner av disse fremgangsmåter, for å regulere cellulære interaksjoner

Disse teknikker innbefatter bruken av et dyr som er aktivert eller primet for å fremstille et spesielt antistoff Dyret kan aktiveres ved en injeksjon av et immunogen (f eks B7lg fusjonsproteinet, CTLA4lg-fusjonsprotein eller CD28lg/CTLA4lg hybndfusjonsproteinet) for å utvikle den forønskede immunreaksjonen, dvs fremstilling av antistoffer fra det aktiverte dyret Dette kan også være ett som har en spesiell sykdom Lymfocytter avledet fra lymfeknutene, milten eller det perifere blodet i aktiverte, avdøde dyr kan brukes for å lete etter et spesielt antistoff Lymfocyttkromosomer som koder de forønskede immunoglobuliner kan holdes i live ved en fusjon mellom lymfocyttene og myolomceller, vanligvis i nærvær av et fusjonsmiddel så som polyetylenglykol (PEG) Man kan bruke en rekke forskjellige myolomcellelinjer som en fusjonspartner ved hjelp av standard teknikk, f eks P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8 653, Sp2/0-Ag14 eller HL1-653 myolomhnjer Disse myolomlinjer er tilgjengelige fra ATCC, Rockville, Maryland, USA

De resulterende celler som innbefatter de forønskede hybndomer, kan så

dyrkes i et selektivt medium så som et HAT-medium, hvor ufusjonerte opprinnelig myolom eller lymfocyttceller eventuelt vil dø Bare hybndomcellene vil overleve og kan dyrkes under begrensende fortynningsbetingelser for å oppnå isolerte kloner Supernatantene fra hybndomene kan så gjennomsøkes for nærvær av den forønskede spesifisitet, f eks ved hjelp av en immunogjennomsøkningsteknikk, hvor man bruker CTLA4lg-proteinet som er blitt brukt for immunisenng Positive kloner kan så igjen klones under begrensende fortynnende betingelser, og man kan deretter isolere det monoklonale antistoffet som er blitt fremstilt

Forskjellige vanlige kjente fremgangsmåter kan brukes for isolasjon og rensing av de monoklonale antistoffer slik at de befns for andre proteiner og forurensninger Vanlig bruke fremgangsmåter for rensing av monoklonale antistoffer innbefatter en ammoniumsulfatutfelning, loneutbytningskromatografi og affinitetskromatografi (se Zola et al, i Monoclonal Hybndoma Antibodies Techniques and Applications, Hurell (red ) s 51-52 (CRC Press, 1982)) Hybndomer fremstilt ved hjelp av disse fremgangsmåter kan så formeres in vitro eller in vivo (i ascitesvæske) ved hjelp av velkjent teknikk (se generelt Fink et al, Prog Chn Pathol 9 121-33 (1984), fig 6-1 på side 123)

Generelt kan den individuelle cellelinje oppformeres in vitro, f eks i laboratonekulturkar, og kulturmediet som inneholder en høy konsentrasjon av et enkelt spesifikt monoklonalt antistoff kan så innhøstes ved avhelning, filtrering eller sentnfugering

I tillegg til dette kan man fremstille fragmenter av disse antistoffer som inneholder det aktivt bindende område som er reaktivt med det ekstracellulære området på CTLA4-reseptoren, f eks som Fab, F(ab')2 og Fv-fragmenter Slike fragmenter kan fremstilles ved hjelp av velkjent teknikk (se f eks Rousseaux et al, i Methods Enzymol 121 663-69, Academic Press (1986))

Anti-B7 monoklonale antistoffer fremstilt som beskrevet ovenfor kan brukes for å binde B7-antigen for derved å hindre interaksjoner mellom CD28-positive eller CTLA4-positive T-celler og B7-positive celler Anti-CTLA4 monoklonale antistoffer brukes for å binde CTLA4-reseptor, for derved å hindre interaksjonen mellom CTLA4-positive T-celler og andre celler

I en annen utførelse kan CTLA4lg-fusjonsproteinet brukes for å identifisere ytterligere forbindelser som er istand til å regulere interaksjonen mellom CTLA4 og B7-antigenet Slike forbindelser innbefatter små naturlig forekommende molekyler som kan brukes for en reaksjon med B-celler og/eller T-celler F eks kan et fermentenngsmedium undersøkes for evne til å hindre CTLA4/B7-interaksjoner I tillegg til dette kan derivater av CTLA4lg-fusjonsproteinet som beskrevet ovenfor brukes for å regulere T-celleformenngen F eks kan fragmenter eller derivater brukes for å blokkere en T-celleformering i sykdommer som utvikler seg mellom transplanterte organer og verten (GVH) som ofte følger allogenisk benmargs-transplantering

CD28-styrt T-celleformeringsveien er cyklosponnresistent, dette i kontrast til den oppformering som drives av CD3/Ti-cellereseptorkomplekset (June et al, 1987, supra) Cyklosponn er relativt ineffektiv som en behandling for GVH-sykdommer (Storb, Blood, 68 119-125 (1986)) GVH-sykdommer, dvs komplikasjoner som oppstår mellom transplanterte organer og verten, styres antagelig av T-lymfocytter som uttrykker CD28-antigen (Storb og Thomas, Immunol Rev 88 215-238 (1985)) Således kan CTLA4lg-fusjonsproteinet brukes alene eller i kombinasjon med andre immunundertrykkende forbindelser, f eks cyklosporin, for derved å blokkere en T-celleformenng i en GVH-lidelse

Regulering av CTLA4-positive T-celleinteraksjoner med B7-positive celler, og hen inngår B-celler, ved hjelp av foreliggende fremgangsmåter, kan således brukes for å behandle patologiske tilstander som autoimmunitet, transplantenng, infeksjonssykdommer og neoplasi

CTLA4-bindende molekyler og ILA4-bindende molekyler som her er beskrevet kan opparbeides i en rekke forskjellige doseringsformer som innbefatter, men som ikke er begrenset til, flytende oppløsninger eller suspensjoner, tabletter, piller, pulvere, suppositorier, polymenske mikrokapsler eller mikroblærer, iiposomer og injiserbare eller infuserbare oppløsninger Den foretrukne former vil være avhengig av tilførselsveien og den terapeutiske anvendelse

Den mest effektive tilførselsvei og doseringsregime for molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse er avhengig av sykdommens grad og utvikling, pasientens helse og reaksjon overfor behandling og legens generelle bedømmelse Følgelig må doser av molekylene justeres til den individuelle pasient

Doseforholdet for dyr av forskjellig størrelse og art og mennesker basert på mg/m<2> overflateareal er beskrevet av Freireich, E J et al, (Quantitative Companson of Toxicity of Anticancer Agents in Mouse, Rat, Hamster, Dog, Monkey and Man Cancer Chemother, Rep , 50, nr 4, 219-244, mai 1966)

Justeringer i doseringsregimer kan gjøres for å få en optimal vekst-hemmende reaksjon Dosene kan oppdeles og tilføres på daglig basis, eller dosen kan reduseres proporsjonalt avhengig av situasjonen F eks kan flere oppdelte doser tilføres daglig, eller dosen kan proporsjonalt reduseres, slik det indikeres fra den spesifikke terapeutiske situasjonen som er under behandling

I overensstemmelse med praktisk gjennomføring av foreliggende oppfinnelse, vil en effektiv mengde for behandling av en pasient være mellom 0,1 og 10 mg/kg kroppsvekt av pasienten Den effektive mengden kan også være en mengde på mellom 1 og 10 mg/kg kroppsvekt

Fordeler ved oppfinnelsen Den foreliggende oppfinnelse unngår problemer med den terapi som for tiden brukes for å hindre en avstøtning i forbindelse med vevs- eller organtransplantenng I motsetning til de foreliggende terapier vil anvendelse av den foreliggende oppfinnelse bare påvirke immunologiske reaksjoner som styres av B7-interaksjoner

Således vil f eks foreliggende oppfinnelse påvirke transplanterte antigen-spesifikke T-celler, og dette induserer en donor-spesifikk og antigen-spesifikk toleranse Bindingen av CD28 av sin ligand B7/BB1 (B7) under T-cellereseptor-aktivenng, er kntisk for riktig T-cellesignahsenng i enkelte systemer (M K Jenkins, PS Taylor, SD Norton, K B Urdahl, J Immunol 147 2461 (1991), C H June,

J A Ledbetter, P S Linsley, C B Thompson, Immunol Today 11 211 (1990), H Reiser, G J Freeman, Z Razi-Wolf, C D Gimmi, B Benacerraf, L M Nadler, Proe Nati Acad Sei USA 89 271 (1992), N K Damie, K Klussman, P S Linsley, A Aruffo, J Immunol 148 1985(1992))

Når interaksjonen mellom CD28 og dets ligand er blokkert, vil antigen-spesifikke T-celler bli feilaktig indusert over i en tilstand av antigen-spesifikk T-celleanergi (M J Jenkins, P S Taylor, S D Norton, K B Urdahl, J Immunol 147 2461 (1991), F A Haørding, J G McArthur, J A Gross, D H Raulet, J P Alhson, Nature 356 607 (1992))

CTLA4lg-fusjonsprotein binder seg både til humant og muse B7 (med en ca 20 ganger større affinitet enn CD28), blokkerer bindingen av CD28 til B7, hemmer T-celleaktivenng og induserer T-cellepassitivet in vitro (F A Harding, J G McArthur, J A Gross, D H Raulet, J P Alhson, Nature 356 607 (1992), P S Linsley et al, J Exp Med 174 561 (1991)

Videre kan foreliggende oppfinnelse brukes for å få en uttrykning av et oppløselig proteinprodukt av CTLA4-genet, hvor man hittil ikke har oppnådd en uttrykning, og for å identifisere en naturlig ligand for CTLA4, som inngår i T-cellenes funksjonelle reaksjoner Et oppløselig proteinprodukt kan også brukes for å regulere T-cellereaksjonen in vivo for behandling av patologiske tilstander

De følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse for å lette forståelsen og bruken av oppfinnelsen

EKSEMPEL 1

Fremstilling av B7la- og CD28lg- fusionsproteiner

Reseptor-immunoglobulin C gamma (IgCy) fusjonsproteinene B7lg og CD28lg ble fremstilt som beskrevet av Linsley et al, i J Exp Med 173 721-730

(1991), som her inngår som en referanse Kort forklart ble DNA som koder for aminosyresekvenser som tilsvarer de respektive reseptorproteiner, (f eks B7) bundet til DNA som koder aminosyresekvenser som tilsvarer hengselen, CH2- og CH3-områdene i det humane IgCyl Dette ble oppnådd på følgende måte

Polvmerasekiedereaksioner f PCR)

For PCR ble DNA-fragmenter amplifisert ved å bruke pnmerpar, slik det er beskrevet nedenfor, for hvert enkelt fusjonsprotein PCR-reaksjonene (sluttvolum på 0,1 ml) ble kjørt i en Tag-polymerasebuffer (Stratagene, La Jolla, CA) som inneholdt 20 pinol av dNTP, 50-100 pmol av de angitte primere, templat (1 ng plasmid eller cDNA syntetisert fra < 1 fjg totalt RNA ved å bruke en vilkårlig heksamerpnmer, som beskrevet av Kawasaki i PCR Protocols, Academis Press, s 21-27 (1990), som her inngår som en referanse), og Tag-polymerase (Stratagene) Reaksjonene ble kjørt i et termocykhserende apparat (Perkin Eimer Corp , Norwalk, CT) med fra 16 til 30 cykluser (en typisk cyklus besto av trinn på 1 min ved 94°C, 1-2 min ved 50°C og 1-3 min ved 72°C)

Plasmidkonstruksion Uttrykningsplasmider inneholdende cDNA som koder for CD28, som beskrevet av Aruffo og Seed, Proe Nati Acad Sei USA 84 8573

(1987)), ble tilveiebragt av dr Aruffo og Seed (Mass General Hospital, Boston, MA) Plasmider som inneholdt cDNA som koder for CD5, som beskrevet av Aruffo, Cell 61 1303 (1990)), ble tilveiebragt av dr Aruffo Plasmider som inneholder cDNA som koder for B7, som beskrevet av Freeman et al, J Immunol 143 2714

(1989)), ble tilveiebragt av dr Freeman (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA) For de innledende forsøk på en uttrykning av oppløselige former av CD28 og B7 ble det fremstilt konstruksjoner (OMCD28 og OMB7) som beskrevet av Linsley et al, J Exp Med , supra, hvor stoppkodoner ble innført oppstrøms av transmembranområdene, og hvor de opprinnelige signalpeptidene ble erstattet med signalpeptidet fra onkostatin M (Malik et al, Mol Cell Biol 9 2847 (1989)) Konstruksjonene ble fremstilt ved å bruke syntetiske oh<g>onukleotider for rekonstruksjon (OMCD28) eller som primere (OMB7) for PCR OMCD28 er et CD28 som er cDNA-modifisert for mer effektiv uttrykning ved å erstatte signalpeptidet med det tilsvarende analoge området i onkostatin M CD28lg og B7lg fusjonskonstruksjoner ble fremstilt i to deler 5'-delene ble fremstilt ved å bruke OMCD28 og OMB7 som tempiater og ohgonukleotidet

CTAGCCACTGAAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACAC (SEQ ID NR 1),

(som koder for aminosyresekvensen som tilsvarer onkostatin M signalpeptidet), som en såkalt foroverprimer, og enten

TGGCATGGGCTCCTGATCAGGCTTAGAAGGTCCGGGAAA (SEQ ID NR 2), eller TTTGGGCTCCTGATCAGGAAAATGCTCTTGCTTGGTTGGT (SEQ ID NR 3) som reverspnmer henholdsvis Produktene fra PCR-reaksjonene ble kuttet med restriksjonsendonukleaser (Hind III og Bell) i posisjoner som var innført i PCR-pnmerne og deretter gelrenset

3-delen av fusjonskonstruksjonene som tilsvarer de humane IgCyl - sekvenser ble fremstilt ved en koblet revers transknptase (fra fuglemyeloblastose-virus, Life Sciences Associates, Bayport, NY)-PCR-reaksjon ved å bruke RNA fra en myelomcellehnje som produserte humant-musekimensk mAb L6 (tilveiebragt av Dr P Fell og M Gayle, Bnstol-Myers Squibb Company, Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA) som templat Ohgonukleotidet,

AAGCAAGAGCATTTTCCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACAC

ATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG (SEQ ID NR 4), ble brukt som en foroverrettet pnmer, og

CTTCGACCAGTCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC (SEQ ID NR 5)

som en reverspnmer Reaksjonsproduktene ble kuttet med Bell og Xbal og gelrenset De endelige konstruksjoner ble satt sammen ved å ligere Hindlll/Bcll-spaltede fragmenter som inneholdt CD28 og B7-sekvensene med Bcll/Xbal-spaltet fragment som inneholdt IgCyl-sekvensene over i Hindlll/Xbal-spaltet CDM8 Ligeringsproduktene ble transformert over i MC1061/p3 E co//-celler og kolonier ble gjennomsøkt for passende plasmider Sekvensene i de resulterende konstruksjoner ble bekreftet ved DNA-sekvensenng

Den konstruksjon som kodet for B7 inneholdt DNA som koder aminosyren som tilsvarer aminosyregruppene fra ca posisjon 1 til ca posisjon 215 i det ekstracellulære området av B7 Konstruksjonen som koder CD28 inneholdt DNA som koder aminosyrer som tilsvarer aminosyregruppene fra ca posisjon 1 til ca posisjon 134 av det ekstracellulære området av CD28

CD5lg ble konstruert på lignende måte, idet man brukte

CATTGCACAGTCAAGCTTCCATGCCCATGGGTTCTCTGGCCACCTTG (SEQ ID

NR 6) som foroverrettet pnmer og

ATCCACAGTGCAGTGATCATTTGGATCCTGGCATGTGAC (SEQ ID NR 7) som

reverspnmer PCR-produktet ble kuttet ved hjelp av restnksjonsendonuklease og ligert med IgCyl-fragmentet som beskrevet ovenfor Den resulterende konstruksjonen (CD5lg) kodet for et fullverdig protein med en aminosyresekvens som inneholdt aminosyregruppene fra posisjon 1 til posisjon 347 av den sekvens som tilsvarer CD5, to aminosyrer som var innført ved konstruksjonsmetoden (aminosyrene DQ), fulgt av DNA som koder aminosyren som tilsvarer IgCyl hengselområdet

Cellekulturer og transfeksioner COS (apenyreceller) ble transfektert med uttrykningsplasmider som uttrykte CD28 og B7 ved å bruke en modifikasjon av den protokoll som er beskrevet av Seed og Aruffo (Proe Nati Acad Sei 84 3365

(1987)), som her inngår som en referanse Celler ble tilsatt i en mengde på 10<6> pr kulturskål med en diameter på 10 cm 18-24 timer før transfeksjon Plasmid DNA ble tilsatt (ca 15 //g/skål) i et volum på 5 ml av serumfntt DMEM inneholdende 0,1 mmol klorokin og 600//g/ml DEAE dekstran, og cellene ble inkubert fra 3 til en halv time ved 37°C Transfekterte celler ble så kortvarig behandlet (ca 2 min) med 10% dimetylsulfoksid i PBS og inkubert ved 37°C i fra 16 til 24 timer i DMEM som inneholdt 10% FCS 24 timer etter transfeksjonen ble kulturmediet fjernet og erstattet med serumfntt DMEM (6 ml/skål) Inkubenngen ble fortsatt i 3 døgn ved 37°C, og på dette tidspunkt ble det brukte mediet oppsamlet, og det ble tilsatt friskt serumfntt medium Etter ytterligere 3 døgn ved 37°C ble det brukte medium igjen oppsamlet, og cellene ble kastet

CHO-celler som uttrykte CD28, CD5 eller B7 ble isolert som beskrevet av Linsley et al, (1991) supra, på følgende måte Stabile transfektanter som uttrykte CD28, CD5 eller B7 ble isolert etter samtransfeksjon av dihydrofolat reduktase-fattig kinesisk hamstereggstokk (dhfr CHO) celler med en blanding av den passende uttryknmgsplasmiden og en utvalgt markør, pSV2dhfr (Linsley et al, Proe Nati Acad Sei USA 87 5031 (1990)), som her inngår som en referanse Transfektantene ble så dyrket ved økende konsentrasjoner av metotreksat til et sluttnivå på 1 / jM og ble holdt i DMEM som var tilsatt 10% fosterbovint serum (FBS), 0,2 mM prolin og 1 //M metotreksat CHO-linjer som uttrykte høye nivåer av CD28 (CD28<+> CHO) eller B7 (B7<+> CHO) ble isolert ved flere runder av fluorescensaktivert cellesortenng (FACS<R>) etter en indirekte immunomerking med mAbs 9,3 eller BB-1 Amplifiserte CHO-celler som var negative for overflateuttrykning av CD28 eller B7 (dhfr<+> CHO) ble også isolert ved FACS<R> fra CD28-transfekterte populasjoner

Immunomerkin<g> oa FACSR- analvse Transfekterte CHO- eller COS-celler eller aktiverte T-celler ble analysert ved en indirekte immunofarging Før farging ble CHO-cellene fjernet fra sine kulturkar ved inkubenng i PBS som inneholdt 10 mM EDTA Cellene ble først inkubert med muse mAbs 9,3 (Hansen et al, Immunogetics 10 247 (1980)) eller BB-1 (Yokochi et al, J Immunol 128 823

(1981)), eller med Ig-fusjonsproteiner (alle i en konsentrasjon på 10 //g/ml i DMEM som inneholdt 10% FCS) i fra 1-2 timer ved 4°C Cellene ble så vasket og inkubert i ytterligere en halv til 2 timer ved 4°C med en FITC-konjugert annet trinns reagens (geite anti-mus lg-serum for muse mAbs, eller geit anti-humant IgCy-serum for fusjonsproteiner (Tago, Inc , Burhngame, CA)) Fluorescens ble analysert ved hjelp av et FACS IV<R->cellesortenngsapparat (Becton Dickinson og Co , Mountain View, CA) utstyrt med en firedekaders logaritmisk forsterker

Rensing av Ig- fusionsproteiner Første, andre og tredje oppsamling av brukt serumfntt kulturmedium fra transfekterte COS-celler ble brukt som kilde for rensingen av Ig-fusjonsproteiner Etter fjerning av cellulært avfall ved lavhastig-hetssentrrfugenng, ble mediet påsatt en kolonne (ca 200-400 ml medium/ml pakket sjiktvolum) av immobilisert protein A (Repligen Corp , Cambridge, MA) ekvilibrert med 0,05 M natriumcitrat, pH 8,0 Etter påsetning av mediet ble kolonnen vasket med 1 M katiumfosfat pH 8, og bundet protein ble så eluert med 0,05 M natriumcitrat, pH 3 Fraksjoner ble oppsamlet og umiddelbart nøytralisert ved tilsetning av en tiendedel av volumet av 2 M Tris, pH 8 Fraksjoner som inneholdt toppen for A280"aDsorDerenc'e materiale ble slått sammen og dialysert mot PBS før bruk Ekstinksjonskoeffisientene på 2,4 og 2,8 ml/mg for CD28lg og B7lg henholdsvis, ble bestemt ved en aminosyreanalyse av oppløsninger med kjent absorpsjon Innvendingen av renset CD28lg ob B7lg-bindende aktiviteter var nesten kvantitativt, slik dette kunne bedømmes ved en FACS<R->analyse etter en indirekte fluorescerende farging av B7<+-> og CD28<+->CHO-celler

EKSEMPEL 2

Fremstilling av CTLA4lg fusionsprotem

En oppløselig genetisk fusjonskonstruksjon som koder for CTLMIg mellom det ekstracellulære området for CTLA4 og et IgCyl-område ble konstruert på samme måte som beskrevet ovenfor for CD28lg-konstruksjonen Det ekstracellulære området på CTLA4-genet ble klonet ved hjelp av PCR idet man brukte syntetiske ohgonukleotider som tilsvarte den publiserte sekvensen (Danavach et al, Eur Joum Immunol 18 1901-1905 (1988))

Fordi et signalpeptid for CTLA4 ikke er identifisert i CTLA4-genet, ble N-terminusgruppen i den forutsagte sekvensen for CTLA4 fusjonert til signalpeptidet for onkostatin M (Malik et al, Mol and Cell Biol 9 2847 (1989)) i to trinn, idet man brukte overlappende ohgonukleotider I det første trinnet ble ohgonukleotidet

CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTG

TTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC (SEQ ID NR 8)

(som koder C-terminalgruppen på 15 aminosyrer fra onkostatin M signalpeptidet fusjonert med N-terminalgruppen på 7 aminosyrer i CTLA4) brukt som en foroverrettet primer, og

TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG (SEQ ID NR 9) (som koder aminosyregruppene fra 119 til 125 for den aminosyresekvens som koder CTLA4-reseptorog som inneholderen Bell restnksjonsenzymposisjon) som en revers primer Templaten for dette trinnet var cDNA syntetisert fra 1 yg totalt RNA fra H38-celler (en HTLV ll-infisert T-celleleukemi cellelinje tilveiebragt av dr Salahudin og Gallo, NCI, Bethesda, MD) En del av PCR-produktet fra dette første trinnet ble igjen amplifisert ved å bruke en overlappende foroverrettet primer som koder fra den N-terminale delen av onkostatin M signalpeptidet og som inneholder en Hindi 11 restnksjonsendonukleaseposisjon,

CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGC

TCAGTCTGGTCCTTGCACTC (SEQ ID NR 10) og den samme reverspnmeren Produktet fra PCR-reaksjonen ble kuttet med Hindlll og Bell og ligert sammen med et BcM/Xba I spaltet cDNA-fragment som koder for aminosyresekvensen som tilsvarer hengselen, CH2- og CH3-områdene for IgCyl og plassert i en Hind Ill/Xba I spaltet uttrykningsvektor CDM8 eller Hind Ill/Xba I spaltet uttrykningsvektor 71LN

(tilveiebragt av dr Aruffo)

Et kart av den resulterende CTLA4lg-fusjonskonstruksjonen er vist på fig 1 Sekvenser på denne figuren viser forbindelsene mellom CTLA4 (store bokstaver, områder uten skygger) og signalpeptidet, SP, fra onkostatin M (områder med mørk skygge) og hengselen, H, 1 IgCyl (stiplet område) Aminosyren 1 parentesene ble innført under konstruksjonen En stjerne (<*>) indikerer mutasjoner av cystem til senn som ble innført 1 IgCy hengselområdet Det immunoglobuhn superfamilie V-hgnende området som er tilstede 1 CTLA4 er indikert, det samme gjelder CH2- og CH3-områdene 1 IgCyl

Uttrykningsplasmider, CDM8, som inneholder CTLA4lg, ble så transfektert over 1 COS-celler ved hjelp av en DEAE/dekstrantransfeksjon ved hjelp av modifikasjon (Linsley et al, 1991, supra) av den protokoll som er beskrevet av Seed og Aruffo, 1987, supra

Uttrykningsplasmidkonstruksjoner (rcLN eller CDM8) inneholdende cDNA som koder aminosyresekvensen for CTLA4lg, ble transfektert ved en hpofeksjon ved hjelp av standardmetoder over 1 dhfr CHO-hnjer, hvorved man fikk fremstilt nye cellelinjer som stabilt uttrykker CTLA4lg

Det DNA som koder aminosyresekvensen som tilsvarer CTLA4lg er innlevert til ATCC under Budapest-konvensjonen den 31 mai 1991 og er gitt ATCC tilvekstnummer 68629

En foretrukken stabil transfektant som uttrykker CTLA4lg, og som er gitt betegnelsen kinesisk hamstereggstokkcellehnje, CTLA4lg-24, ble fremstilt ved å gjennomsøke B7-positive CHO-cellehnjer for B7-bindende aktivitet 1 mediet ved hjelp av immunofarging Transfektanter ble holdt 1 DMEM tilsatt 10% fosterbovint serum (FBS), 0,2 mM prohn og 1 //M metotrekstat

CTLA4lg-24 CHO-cellelinjen er innlevert til ATCC under Budapest-konvensjonens bestemmelser av 31 mai 1991 og er gitt tilvekstnummer ATCC 10762

CTLA4lg ble renset ved protein A-kromatografi fra serumfntt behandlede supematanter (fig 2) Konsentrasjonen av CTl_A4lg ble bestemt ved å anta en ekstinsjonskoeffisient ved 280 nm på 1,6 (eksperimentelt bestemt ved en ammo-syreanalyse av en oppløsning med kjent absorpsjon) Molekylvektstandarder (kolonne 1 og 3, fig 2) og prøvene (1 jjg) av CLTA4lg (kolonne 2 og 4) ble underkastet en SDS-PAGE (4-12% akrylamidgradient) under ikke-reduserende betingelser (-RME, kolonnene 1 og 2) eller reduserende betingelser (+ IJME, kolonnene 3 og 4) Proteinene ble visualisert ved Coomassie Brilliant-blått

Under ikke-reduserende betingelser vandret CTLA4lg som en Mr med en molekylvekt på ca 100 000, og under reduserende betingelser som en Mr med en molekylvekt på ca 50 000 (fig 2) Ettersom IgCy hengsel disulfidene var eliminert under konstruksjonen, er CTLA4lg på samme måte som CD28lg en dimer som antagelig er forbundet ved hjelp av en oppnnnehg disulfid binding

EKSEMPEL 3

CTLA4- reseptor

For å rekonstruere DNA som koder aminosyresekvensen som tilsvarer den fulle lengden på det humane CTLA4-genet, ble cDNA som koder aminosyrer som tilsvarer et fragment av de transmembrane og cytoplasmiske områder av CTLA4, klonet ved hjelp av PCR og så forbundet med cDNA som koder for aminosyrer som tilsvarer et fragment fra CTLA4lg, som tilsvarer onkostatin M signalpeptidet fusjonert til N-terminusgruppen på CTLA4 Fremgangsmåter for PCR og celle-dyrking og transfeksjoner er som beskrevet ovenfor i eksempel 1, idet man brukte COS-celler og DEAE-dekstrantransfeksjon

Fordi uttrykningen av CTLA4-reseptorproteinet i humane lymfoide celler ikke tidligere er rapportert, var det nødvendig å finne en kilde for CTLA4 mRNA PCR cDNA reversert transkribert fra det totale cellulære RNA fra H38-celler, som nevnt ovenfor, ble brukt for kloning ved hjelp av PCR For dette formål ble oligo-nukieotidet GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTAGTG (SEQ ID NR 11), (som koder de første 11 aminosyrene i den forutsatte kodende sekvensen) brukt som en foroverrettet pnmer, og

TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAAATAAGGCTG (SEQ ID

NR 12) (homologt med de siste 8 aminosyrene i CTLA4 og inneholdende en Xba I posisjon) som en reverspnmer Templaten var igjen et cDNA syntetisert fra 1 fig RNA fra H38-celler Produktene fra PCR-reaksjonen ble kuttet med restnksjons-endonukleasene Nco I og Xba I, og det resulterende 316 bp-produktet ble gelrenset Et 340 bp Hind lll/Nco l-fragment fra den CTLA4lg-fusjon som er beskrevet ovenfor ble også gelrenset og, begge restnksjonsfragmenter ble ligert til et Hind Ill/Xba l-spaltet CDM8, hvorved man fikk fremstilt OMCTLA

Den resulterende konstruksjonen tilsvarer den hele lengden av CTLA4 (SEQ ID NR 13 og 14) og onkostatin M signalpeptidet Konstruksjonen er vist på fig 3 og er gitt betegnelsen OMCTLA4 Den sekvens for CTLA4 som er vist på fig 3, skiller seg fra den forutsagte human CTLA4 DNA-sekvensen (Danavach et al, supra) ved en baseforandnng, slik at det tidligere rapporterte alanin i aminosyre-posisjon 111 i den viste aminosyresekvensen koder et treonin Dette treonin er en del av en nylig identifisert N-forbundet glykosylenngsposisjon som kan være viktig for en heldig uttrykning av fusjonsproteinet

Ligenngsprodukter ble transformert over i MC1061/p3 E co//-celler, og kolonier ble gjennomsøkt for passende plasmider Sekvenser i de resulterende konstruksjoner ble bekreftet ved DNA sekvensanalyse

EKSEMPEL 4

Karaktensennq av CTLA4lg

For å karakterisere CTLA4lg-konstruksjonene ble flere isolater, CD28lg, B7lg og CD5lg fremstilt som beskrevet ovenfor og transfektert over i COS-celler, som beskrevet i eksemplene 2 og 3, og så undersøkt ved hjelp av en FACS<R->analyse for binding av B7lg I tillegg til ovennevnte konstruksjoner ble det også brukt CDM8-plasmider som inneholdt cDNA som koder for CD7, slik dette er beskrevet av Aruffo og Seed (EMBO Jour 6 3313 3316 (1987)), som er inngår som en referanse

mAb Muse monoklonale antistoffer (mAb) 9,3 (anti-CD28) og G19-4 (anti-CD3), G3-7 (anti-CD7), BB-1 (anti-B7-antigen) og rotte mAb 187,1 (anti-mus K-kjede) er tidligere beskrevet (Ledbetter et al, Proe Nati Acad Sei 84 1384-1388(1987),

Ledbetter et al, Blood 75 1531 (1990), Yokochi et al, supra) og ble renset fra ascites før bruk Den hybridom som fremstilte mAb OKT8 kom fra ATCC, Rockville, Maryland, MD, og denne ble også renset for ascites før bruk mAb 4G9 (anti-CD19) ble levert av dr E Engleman, Stanford Universitet, Palo Alto, CA Renset human-muse kimensk mAb L6 (med en human Cy1 Fc-del) var en gave fra dr P Fell og M Gayle (Bnstol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA)

Immunofarqinq og FACSR- analvse

Før farging ble COS- eller CHO-cellene fjernet fra sine kulturkar ved

inkubenng i PBS som inneholdt 10 mM EDTA Cellene ble først inkubert med mAb eller Ig-fusjonsproteiner i en mengde på 10 //g/ml i DMEM inneholdende 10% FBS i fra 1 til 2 timer ved 4°C Cellene ble så vasket og inkubert i ytterligere en halv til 2 timer ved 4°C med FITC-konjugert geite anti-mus immunoglobulin eller med FITC-konjugert geite anti-humant IgCy-serum (begge deler fra Tago, Burlingame, CA)

Når man målte bindingen av både mAb og Ig-fusjonsproteiner i samme eksperimentet, ble FITC-konjugert anti-mus og anti-humant annettnnnsreagenser blandet før bruk Man analyserte så fluorescensen i totalt 10 000 celler ved hjelp av FACSR

Perifer blodlvmfocvtt- separasion og stimulering

Perifere blodlymfocytter (PBL) ble isolert ved sentnfugenng gjennom lymfocyttseparasjonsmedium (Litton Bionetics, Kensington, MD) Alloreaktive T-celler ble isolert ved stimulenng med PBL i en primært blandet lymfocyttreaksjon (MLR) PBL ble dyrket med 10<6>/ml bestrålte (5000 rad) T51 LCL EBV-transformerte lymfoblastoidcellelinjer (LCL), PM (Bristol-Myers Squibb Co ) og T51 (Bristol-Myers Squibb Co ) ble holdt i RPMI supplert med 10% FBS Etter 6 dager ble alloreaktive "blasto"-celler kryokonservert Sekundær MLR ble gjennomført ved å dyrke de oppfinte alloreaktive blastocellene sammen med friskt bestrålt T51 LCL i nærvær eller fravær av mAb og Ig-fusjonsproteiner Cellene ble dyrket 196 brønns flate bunnplater (4x10<4> alloreaktive blastoceller og 1x10<4> bestrålte T51 LCL-celler/brønn i et volum på 0,2 ml) i RPMI inneholdende 10% FBS Celleformering 14 parallellkulturer ble målt ved opptak av [<3>H]-thymidin under de siste 6 timene av en dyrkningstid på fra 2 til 3 døgn

PHA-aktiverte T-celler ble fremstilt ved å dyrke PBL-celler med 1 //g/ml PHA (Wellcome, Charlotte, NC) i 5 døgn og 1 døgn i et medium som manglet PHA Levende celler ble oppsamlet ved sedimentasjon gjennom et lymfocyttseparasjonsmedium før bruk Cellene ble stimulert med mAb eller transfekterte CHO-celler 4-6 timer ved 37°C, oppsamlet ved sentnfugenng og brukt for å fremstille RNA

CD4<+> T-celler ble isolert fra PBL ved å skille PBL fra friske givere over i T-og ikke-T-celler ved å bruke en saue erytrocyttrosett-teknikk og videre skille ut T-cellene ved overfønng i CD4<+->celler, slik det er beskrevet av Damle et al, J Immunol 139 1501 (1987), som her inngår som referanse B-cellene ble også renset fra perifert blod ved overføring som beskrevet av Wysocki og Sato, Proe Nati Acad Sei 75 2844 (1978), som her inngår som referanse, ved å brukte anti-CD19 mAb 4G9 For å måle Tn-indusert lg-produksjon ble 10<6> CD4<+> T-celler blandet med 10<6> CD19<+> B-celler 11 ml RPMI inneholdende 10% FBS Etter dyrking i 6 døgn ved 37°C ble produksjonen av humant IgM målt i supernatantene ved å bruke fast fase ELISA, slik det er beskrevet av Volkman et al, Proe Nati Acad Sei USA 78 2528 (1981), som her inngår som en referanse Kort forklart ble 96 brønns flate bunnmikrotiter ELISA-plåter (Coming, Coming, NY) belagt med 200 //l/brønn av natnumkarbonatbuffer (pH 9,6) inneholdende 10 //g/ml av affinitetsrenset geite anti-humant IgG eller IgM-antistoff (Tago, Burlingame, CA), inkubert over natten ved 4°C og så vasket med PBS, hvoretter brønnene ble ytterligere blokkert med 2% BSA (BSA-PBS) De prøver som skulle undersøkes ble tilsatt ved passende fortynning til disse brønnene og inkubert med 200 //l/brønn av en 1 1000 fortynning av pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert F(ab") 2-fraksjon av affinitetsrenset geite-humant IgG eller IgM-antistoff (Tago) Platene ble så vasket og tilsatt 100 //l/brønn av en o-fenylendiamin (Sigma Chemical Co , St Louis, MO) oppløsning (0,6 mg/ml i citrat-fosfatbuffer ved pH 5,5 og 0,045% hydrogenperoksid) Fargeutvikltngen ble stoppet med 2 N svovelsyre Man målte så absorpsjonen ved 490 nm med en automatisert ELISA plateleser Prøvene og kontrollprøvene ble kjørt i tre paralleller, og absorpsjonsverdiene ble sammenlignet med de man oppnådde med kjent IgG eller IgM-standarder som ble kjørt parallelt med supernatantprøvene, slik at man fikk fremstilt standardkurven som så kan brukes for å kvantifisere konsentrasjonene av lg i kultursupernatanten Data ble uttrykt som ng/ml av lg ± SEM for hver kultur, enten disse ble kjørt som tre paralleller eller fire paralleller

Immunoutfelningsanalvse og SDS- PAGE

Celler ble overflatemerket med <125>j og underkastet en immunoutfelningsanalyse Kort forklart ble PHA-aktiverte T-celler overflatemerket med <125>j vecj hjelp av laktoperoksidase og H2O2, slik det er beskrevet av Vitetta et al, J Exp Med 134 242 (1971), som er inngår som en referanse SDS-PAGE-kromatografi ble utført på lineære akrylamidgradientgeler med pålagte geler av 5% akrylamid Gelene ble farget med Coomassie-blått, så avfarget og fotografert eller tørket og eksponert overfor røntgenfilm (Kodak XAR-5)

Bindingsprøve

B7lg ble merket med <125>J til en spesifikk aktivitet på ca 2x10<6> cpm/pmol 96-brønns plastikkplater ble belagt 16-24 timer med en oppløsning inneholdende CTLA4lg (0,5 //g i et volum på 0,05 ml 10 mM Tris pH 8) Brønnene ble blokkert med bindende buffer (DMEM inneholdende 50 mM BES (Sigma Chemical Co ), pH 6,8, 0,1% BAS og 10% FCS) før man tilsatte en oppløsning (0,09 ml) inneholdende 125 j <g>7ig ^ 5X-| <q5>Cpmj | nærvær eller fravær av konkurrerende reagens Etter inkubenng i 2-3 timer ved 23°C ble brønnene vasket en gang med bindende buffer og fire ganger med PBS Bundet radioaktivitet ble så oppløse-liggjort ved tilsetning av 0,5 N NaOH og kvantifisert ved gammatelhng

Binding til B7lq

Den funksjonelle aktiviteten for OMCTLA4-konstruksjonene som koder for det komplette humane CTLA4 DNA-genet, ble vist i det eksperiment som er vist på fig 4 COS-cellene ble transfektert med uttrykningsplasmidene CD7, OMCD28 og OMCTLa4, som beskrevet ovenfor 48 timer etter transfeksjonene ble cellene oppsamlet og inkubert enten bare med medium (ingen tilsetning) eller med mAb 9,3, B7lg, CD5lg eller G3-7 Cellene ble så vasket, og binding ble påvist ved hjelp av en blanding av FITC-konjugert geite anti-mus lg og FITC-konjugert geite anti-humant annet-trinns reagenser Transfekterte celler ble så undersøkt for uttrykning av de angjeldende celleoverflatemarkører ved indirekte immunofarging, hvoretter fluorescensen ble målt ved å bruke en FACS<R->analyse som beskrevet ovenfor

Som vist på fig 4 er mAb 9,3 bundet til CD28-transfekterte COS-celler, men ikke til CTLA4-transfekterte celler I motsetning til dette er B7lg-fusjonsproteinet (men ikke kontroll CD5lg-fusjonsproteinet) bundet til både nevnte CD28- og CTLA4-transfekterte celler CD7-transfekterte COS-celler er hverken bundet til mAb 9,3 eller noen av fusjonsproteinene Dette indikerer at CD28 og CTLA4 begge binder B-celleaktiveringsantigenet B7 Videre kunne man ikke påvise at mAb 9,3 binder seg til CTLA4

Binding av CTLA4lq på B7- positive CHO- celler

For ytterligere å karakterisere bindingen av CTLA4lg og B7, målte man bindingsaktiviteten for renset CTLA4lg på B7<+> CHO-celler og på en lymfoblastoid cellelinje (PM LCL) i det ekspenmentet, som er vist på fig 5 Amplifiserte transfekterte CHO-cellelinjer og PM LCL ble inkubert i rent medium (uten tilsetning) eller en ekvivalent konsentrasjon av humant IgCyl-holdige proteiner (10 //g/ml) av CD5lg, CD28lg eller CTLA4lg Bindingen ble påvist ved hjelp av FACS<R> etter at man hadde tilsatt FITC-konjugert geite anti-humant lg annet tnnns reagenser Totalt ble 10 000 fargede celler analysert ved hjelp av FACS<R>

Som vist på fig 5 binder CD28lg seg til B7<+> CHO-celler, men ike til PM LCL, en cellelinje som uttrykker relativt lave nivåer av B7-antigenet (Linsley et al, supra, 1990) CLTA4lg bandt seg sterkere til begge cellelinjer enn CD28lg, noe som antyder at det binder seg med høyere affinitet Hverken CD28lg eller CTLA4lg bandt seg til CD28<+> CHO-celler

Affinitet med hensyn til binding av CTLA4lg og B7lg

Den tilsynelatende affiniteten for interaksjonen mellom CTLA4lg og B7lg ble så målt ved å bruke en fast fase konkurransebindingsprøve 96 brønns plastikkplater ble belagt med CTLA4lg som beskrevet ovenfor B7lg ble så radiomerket med 125j (5x10^ cpm, 2x10^ cpm/pmol) og tilsatt til en konsentrasjon på 4 nM i nærvær av de angitte konsentrasjoner (se fig 6) av umerket kimensk mAb L6, mAb 9,3, mAb BB-1 eller B7lg Platebundet radioaktivitet ble så bestemt og uttrykt som prosentvis radioaktivitet bundet til brønner behandlet uten konkurrent (28 300 cpm) Hvert punkt representerer middelverdien av to bestemmelser, og de to parallellene vanerte vanligvis ved et middel som var < 20% Konsentrasjonene ble beregnet på basis av en Mr på 75 000 pr bindingsposisjon for mAb og 51 000 pr bindingsposisjon for B7lg

Som vist på fig 6 var det bare mAb BB-1 og umerket B7lg som konkurrerte signifikant med hensyn til 125j_B7|g-bmding (ca halv maksimal effekt ved ca 22 nM og ca 175 nM henholdsvis) Hverken kimensk mAb L6 eller mAb 9,3 konkurrerte effektivt ved de prøvede konsentrasjoner I andre ekspenmenter var de brukte konsentrasjonene av mAb 9,3 tilstrekkelig til å hemme bindingen av <125 >J-B7lg til immobilisert CD28lg eller til celleoverflateuttrykt CD28 med > 90%

Når konkurransedata fra fig 6 ble avsatt på et Scatchard diagram, kunne man beregne en dissosiasjonskonstand, Kq\ på ca 12 nM for binding av <12>5j_B7 til immobilisert CTLA4lg (fig 7) Denne verdien er ca 20 ganger lavere enn den tidligere bestemte Kø for bindingen mellom <125>j_B7ig og CD28 (ca 200 nM)

(Linsley et al, (1991), supra), noe som indikerer at CTLA4 er en høyere affimtets-reseptor for B7-antigenet enn CD28-reseptoren

For å identifisere molekylene på lymfoblastoidcellene som bandt CTLA4lg (fig 7) ble <125>j-oVerflatemerkede celler underkastet en immunoutfelningsanalyse (fig 8) B7<+> CHO- og PM LCL-celler ble overflatemerket med <125>j 0g ekstrahert med en ikke-ionisk rensende oppløsning, som beskrevet ovenfor Porsjonene av ekstrakter inneholdende ca 1,5x10<?> cpm i et volum på 0,1 ml ble så underkastet en immunoutfelningsanalyse som beskrevet ovenfor, uten tilsetning eller tilsatt 2 /sg hver av CD28lg, CTLA4lg eller CD5lg Vasket immunoutfelninger ble så analysert ved SDS-PAGE (10-20% akrylamidgradien) under reduserende betingelser Gelen ble så tørket og underkastet autoradiografi Den venstre delen av fig 8 viser et autoradiogram man fikk etter en dags eksponenng Den høyre delen viser et autoradiogram av samme gel etter 10 dagers eksponenng Auto-radiogrammet i den sentrale delen av fig 8 ble også eksponert 110 dager Posisjoner med hensyn til molekylvektsstandarder er også angitt på denne figuren

Som vist på fig 8 ble et diffust vandrende (Mf ca 50 rj00-75 OOO, sentrum ca 60 000) radiomerket protein immunoutfelt ved hjelp av CTl_A4lg, men ikke av CD28lg eller CD5lg Dette molekylet vandret sammen med B7 som var immunoutfelt fra B7<+>CHO-celler ved hjelp av CTLA4lg, og langt svakere ved CD28lg Disse resultatene indikerer at CTLA4lg binder et enkelt protein på lymfoblastoide celler, og hvor proteinet har omtrent samme størrelse som B7-antigenet

Hemming av immunreaksjoner in vitro ved hielp av CTLA4lg

Hemming av formering

Tidligere undersøkelser har vist at anti-CD28 mAb, mAb 9,3 og anti-By Mab, mAb BB-1 hemmer formeringen av alloantigene spesifikke Tn-celler, såvel som immunoglobulinutskillelsen hos alloantigentilstedeværende B-celler (Damle et al, Proe Nati Acad Sei 78 5096 (1981), Lesslauer et al, Eur J Immunol 16 1289 (1986)) Fordi CTLA4 er en høyaffinitetsreseptor for B7-antigenet, slik det blant annet er vist her, ble oppløselig CTLA4lg prøvet for sin evne til å hemme disse reaksjoner Effektene av CTLA4lg på T-celleformenng ble undersøkt i et eksperiment som er vist på fig 9

Primære blandede lymfocyttreaksjons (MLR) blåster ble stimulert med bestrålede T51 lymfoblastoide celler (LC) i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner av muse mAb 9,3 Fab-fragmenter, eller B7lg, CD28lg eller CTLA4lg immunoglobuhn Cy fusjonsproteiner Celleformenngen ble målt ved hjelp av [<3>H]-thymidininkorporenng etter 4 døgn og uttrykt som prosentvis inkorporering i forhold til ubehandlede kulturer (21 000 cpm) Fig 9 viser midlere verdier for 4 paralleller (SEM < 10%)

Som vist på fig 9 hemmer CTLA4lg MLR-reaksjonen på en doseavhengig måte med et maksimum på >90% med en halv maksimal reaksjon ved ca 30 ng/ml (ca 0,8 nM) Fab-fragmentet av mAb 9,3, som tidligere viste seg å være en sterkere inhibitor for MLR enn hele mAb 9,3 (Damle et al, J Immunol 140 1753-1761 (1988)), hemmet også MLR, men ved høyere konsentrasjoner (ca 800 ng/ml eller ca 30 nM for en halv maksimal reaksjon) B7lg og CD28lg ga ingen signifikant hemming av MLR selv ved høyere konsentrasjoner I et annet eksperiment viste det seg at tilsetningen av B7lg sammen med CTLMIg delvis opphevet hemmingen av MLR ved hjelp av CTLA4lg, noe som indikerer at hemmingen spesifikt skyldes interaksjoner med B7-antigen

Hemming av immunoglobulin- utskillelse

Man undersøkte også effekten av CTLA4lg på hjelpe T-celle (Tn)-indusert immunoglobuhnutskillelse (fig 10) CD4<+->T-celler ble blandet med allogene CD19 <+> B-celler i nærvær eller fravær av de angitte immunoglobulmmolekyler som er beskrevet ovenfor Muse mAb OKT8, 9,3 og BB-1 ble tilsatt i en dose på 20 //g/ml, og Ig-fusjonsproteiner i en dose på 10 jug/ml Etter 6 døgns dyrking bestemte man konsentrasjonene av humant IgM (SEM <5%) i supernatantene ved hjelp av en enzymimmunoprøve (ELISA) som beskrevet ovenfor IgM-produksjon ved hjelp av B-celler som er dyrket i fravær av CD4<+> T-celler var 11 ng/ml

Som vist på fig 10 stimulerte CD4+ T-celler IgM-produksjonen hos allogene CD19<+> B-celler (i fravær av CD4<+> T-celler ble IgM-nivået redusert med 93%) mAb 9,3 og BB-1 hemmet i signifikant grad Tn-indusert IgM-produksjon (63 og 65% hemming henholdsvis) CTLA4lg var enda mer effektiv som inhibitor (89% hemming) enn nevnte mAb-molekyler Hemming ved kontroll lg-molekyler, mAb OKT8 og CD5lg var langt mindre (<30% hemming) Ingen av disse molekylene hemmet i signifikant grad lg-produksjon, slik dette kunne måles i nærvær av Staphylococcal aureus enterotoxin B Lignende resultater ble oppnådd med CD4<+ >T-celler og B-celler fremstilt fra andre donorer Disse resultater indikerer at hemmingen ved hjelp av CTLA4lg er spesifikk

De ovennevnte data viser også at CTLA4 og CD28-reseptorene er funksjonelt såvel som strukturelt nærstående På lignende måte som CD28 er CTLA4 også en reseptor for B-celleaktivenngsantigenet B7 CTLA4lg bandt <125>J-B7 med en affinitetskonstant, Kq\ på ca 12 nM, dvs en verdi som er 20 ganger høyere enn affiniteten mellom CD28 og B7lg (ca 200 nM) Man antar således at CTLA4 og CD28 er høy- og lavaffinitetsreseptor henholdsvis for den samme liganden, dvs B7-antigenet

Den tilsynelatende affiniteten mellom CD28 og B7 ligner på den affiniteten som er angitt for binding av oppløselig alloantigen til T-cellereseptoren i en muse

T-cellehybndom (ca 100 nM, Schnek et al, Cell 56 47 (1989)), og gir en høyere affinitet enn interaksjonene mellom CD2 og LFA3 (Rechny et al, J Biol Chem 265 8542 (1990)), eller CD4 og MHC klasse ll-molekylene (Clayton et al, Nature 339 548 (1989)) Den tilsynelatende affimtetskonstanten, Kq-, mellom CTLA4 og B7 er enda høyere, og lar seg gunstig sammenligne med høyere affinitets mAb-molekyler (Kj 2-10 000 nM, Alzan et al, Ann Rev Immuno 6 555 (1988)) Affimtetskonstanten, K(j, mellom CTLA4 og B7 er hk eller større enn K^-verdiene for integnnreseptorene og deres ligander (10-2000 nM, Hautanen et al, J Biol Chem 264 1437-1442 (1989), Di Minno et al, Blood, 61 140-148 (1983), Thiagarajan og Kelley, J Biol Chem 263 3035-3038(1988)) Affiniteten for interaksjonen mellom CTLA4 og Bt er således blant de høyeste som hittil er angitt for iymfoide tilfestningssystemer

Disse resultater viser den første uttrykning av et funksjonelt proteinprodukt fra CTLA4-transknpter CTLA4lg, en fusjonskonstruksjon som inneholder det ekstracellulære området av CTLA4 fusjonert med et IgCyl-område, danner en disulfid-forbundet dimer med en Mr på ca 50 000 underenheter (fig 1) Ettersom man ikke skulle kunne forutsi at det skulle dannes mterkjede disulfider i lg-delen av denne fusjonen, er det sannsynlig at cysteingruppene fra CTLA4 inngår i disulfid-bindingsdannelsen Det analoge CD28lg fusjonsproteinet (Linsley et al, supra, 1991) inneholder også mterkjede disulfidbmdinger Disse resultater antyder at CTLA4-reseptor på lignende måte som CD28 (Hansen et al, Immunogenetics 10 247-260 (1980)), eksisterer på T-celleoverflaten som en disulfidbundet homodimer Skjønt CD28 og CTLA4 er meget homologe proteiner, er de immunologisk distinkte, fordi anti-CD28 mAb, mAb 9,3 ikke gjenkjenner CTLA4

(fig 4 og 5)

Det er ikke kjent hvorvidt CTLA4 kan aktivere T-celler ved en signalvei som er analog til det man finner for CD28 De cytoplasmiske områder hos mus og humant CTLA4 er identiske (Danavach et al, supra, 1988) som antyder at dette området har viktige funksjonelle områder De cytoplasmiske områder for CD28 og CTLA4 er også homologe, skjønt det er uklart hvis dette er tilstrekkelig til å gi lignende signalegenskaper til de to molekylene

CTLA4lg er en sterk inhibitor av in vitro lymfocytt-funksjoner som krevet T-celle og B-cellesamarbeid (fig 9 og 10) Disse oppdagelser, sammen med tidligere undersøkelser, indikerer en fundamental viktig interaksjon som skjer mellom B7-antigen og dets motreseptorer, CD28 og/eller CTLA4, ved regulenng av både T-og B-lymfocyttreaksjoner CTLA4lg skulle således være en meget anvendbar reagens for ytterligere undersøkelser med hensyn til disse interaksjoners rolle under immunreaksjoner CTLA4lg er en sterkere inhibitor av in vitro lymfocyttreaksjoner enn både mAb, BB-1 eller mAb 9,3 (fig 9 og 10) Den sterkere virkningen for CTLA4lg i forhold til mAb BB-1 skyldes sannsynligvis forskjellene i affiniteter for B7 mellom disse molekylene (fig 6) CTLA4lg er også sterkere enn mAb 9,3, noe som skyldes at det i motsetning til mAb ikke har en direkte stimulerende effekt på T-celleformenngen (June et al, Immunology Today 11211

(1989)) som motvirker dens hemmende effekter De immunoundertrykkende effekter av CTLA4lg in vitro antyder at ytterligere undersøkelser vil kunne avsløre ytterligere terapeutiske effekter av dette molekylet for behandling av auto-immunologiske lidelser, som innbefatter avvikende T-celleaktivering eller lg-produksjon

Det tør være innlysende for de med faglig innsikt at foreliggende oppfinnelse kan utarbeides i andre former enn de som spesifikt er beskrevet ovenfor, uten at man derved forlater oppfinnelsens intensjon og vesentlige karakteristika De spesielle utførelser av oppfinnelsen som er beskrevet ovenfor er derfor kun å betrakte som illustrerende, og ikke som begrensende Oppfinnelsens omfang er angitt i de etterfølgende krav snarere enn å være begrenset til de eksempler som er angitt i de foregående avsnitt

EKSEMPEL 5

Hunn BALB/c (H-2<*) og C57BL/6 (H-2<<*>)-must med en alder på 6-8 uker ble innkjøpt fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)

Humane pankreatiske øyceller ble renset etter behandling med kollagenase som tidligere beskrevet (se Ricordi et al, Transplantation 52 519 (1991), A G Tzakis et al, Lancet 336 402 (1990), C Ricordi, P E Lacy, E H Finke, B J Olack, DW Sharp, Diabetes 37 413 (1988))

B6- eller B-10-mus behandlet med streptozokm (175 mg/kg kroppsvekt) 3-5 døgn før transplantering og som viste ikke-fastende plasmaglukosenivåer på mer enn 280 mg/dl (de fleste var over 300 mg/ml) ble brukt som mottagere

Hvert dyr fikk ca 800 friske humanøyceller med en diameter på 150 //m under den venstre nyren (D Faustman og C Coe, Science 252 1700 (1991), Y J Zeng et al, Transplantation 53 277 (1992)) Behandlingen startet umiddelbart etter transplantenngen

Kontrolldyrene ble behandlet med PBS (hele linjer) eller L6 (stiplede linjer) i en dose på 50 /vg hver annen dag 114 dager umiddelbart etter transplantenng (fig 11 A) Øycelletransplantenngen ble ansett å være forkastet når glukosenivåene var større enn 250 mg/dl i 3 påfølgende dager Dyr behandlet med PBS (n=14) og L6 (n=8) hadde en midlere transplantenngsoverlevelse på 5,6 og 6,4 døgn henholdsvis

Dyrene ble behandlet med 10 fjg CTLA4lg 114 påfølgende dager umiddelbart etter transplantenng (n=7) (fig 11B) Tre av syv dyr beholdt sine transplanterte celler i mer enn 80 dager De gjenværende fire dyrene hadde en midlere overlevelse med hensyn til transplanterte celler på 12,75 dager

Dyr ble behandlet med 50 fjg CTLA4lg hver annen dag 114 dager umiddelbart etter transplantenngen av humane øyceller (fig 11C) Alle dyrene (n=12) behandlet med denne dosen beholdt sine transplanterte celler under hele analysen (fig 11C) På utvalgte mus ble det utført nyrebiopsi på dag 21 og 29 etter transplantenngen for å bedømme de transplanterte cellers funksjon (fig 11C)

Det ble utført histologiske undersøkelser på dyrevev hvor det var inntransplanterte humane øyceller (fig 12A, 12B, 12C og 12D) Snittene ble analysert blindt

Hematoksylin og eosinfarging av snitt fra en kontrollmus som hadde mottatt transplanterte humanøyceller 29 døgn etter transplantenng viste en massiv lymfocyttinfiltrenng (fig 12A) Det samme vevet som ble farget for insulin viste ingen påvisbar insulinproduksjon (fig 12B)

Histologisk undersøkelse av vev fra en CTLA4lg-behandlet mus 21 døgn etter transplantenng viste intakte øyceller under nyrekapselen, og det var meget liten lymfocyttinfiltrenng i det transplanterte vevet (fig 12C) Det samme vevet ble farget med hematoksylin og eosin Det samme vevet fra den CTLA4lg-behandlede musen farget for påvisning av insulin viste produksjon av insulin ved hjelp av de transplanterte øycellene (fig 12D) Lignende resultater ble observert i vev med transplanterte celler som ble undersøkt på senere tidspunkter De øvre, midtre og nedre pilspissene identifiserer nyrekapselen, transplanterte øyceller og nyre-parenchym, henholdsvis

I den histopatologiske undersøkelsen ble alle vev fiksert 110% buffret formalin og deretter bearbeidet, hvoretter 5 /vm tynne snitt ble farget enten med hematoksylin eller eosin for påvisning av insulin ved hjelp av avidin-biotin-peroksidase-metoden (S M Hsu, L Rame, H Fanger, J Histochem, Cytochem, 29 577 (1981)) Forstørrelsen var 122 ganger

Fig 13 viser resultatene fra streptozotocm-dannede dyr som var transplantert som beskrevet ovenfor i forbindelse med fig 11 Musene ble behandlet enten med PBS (stiplede linjer) eller MAb til humant B7 (heltrukne linjer) i en dose på 50 //g hver annen dag 114 dager (fig 13) Kontrolldyrene (behandlet med PBS) (n = 3) hadde en midlere overlevelse for de transplanterte celler på 3,5 døgn, mens anti-B7-behandlede dyr (n = 5) beholdt de transplanterte celler i fra 9 til >50 dager (fig 13)

På fig 14 er det vist reaksjonen hos normale glycemiske, CTLA4lg-behandlede mus som var transplanterte (stiplede linjer), og hvor det var utført nyrebiopsi på dag 44 etter transplantenngen og umiddelbart etter en ny transplantenng med enten 1000 førstedels donor øyceller (stiplede linjer, heltrukne sirkler) eller 1000 annendels øyceller (stiplede linjer, åpne sirkler) under den gjenværende nyrekapselen

Disse øycellene som var frosset på det tidspunkt da man utførte den første transplantenngen ble tinet opp og dyrket i 3 døgn før de ble transplantert for å sikre en øycellefunksjon B10-mus som hadde vært behandlet med streptozotocm og viste ikke-fastende glukosenivåer på mer enn 280 mg/dl ble brukt som kontroller (hele linjer) (fig 14) Ingen behandling ble gitt etter transplantenng

Kontrolldyrene forkastet både de førstetransplanterte cellene (heltrukne linjer, lukkede sirkler) og den andre transplantenngen (hele linjer, åpne sirkler) ca 4 dager etter transplantenngen (fig 14) CTLA4lg-behandlede mus som ble transplantert om igjen med en ny porsjon øyceller hadde en midlere overlevelse for de transplanterte cellene på 4,5 døgn, mens dyr som ble transplantert på nytt med førstedels donor øyceller beholdt disse cellene så lenge som analysen ble utført (>80 dager) (fig 14)

CTLA4lq forlenger i betydelig grad overlevelsen for transplanterte humane ø<y>celler i mus på en donor- spesrfikk måte, hvorved man tilveiebnnger en mulighet for immunundetrrvkning

C57BL/6 (B6) eller C57BL/10 (B10) mus ble behandlet med streptozotocin for å eliminere musepankreatiske øyceller B dell-funksjon Diabetiske dyr ble tilført transplanterte celler under nyrekapselen, og behandlingen startet umiddelbart etter operasjonen Overlevelse av disse transplanterte øycellene ble undersøkt ved hjelp av analyse av blodglukosekonsentrasjonen

Transplanterte kontrolldyr som enten var behandlet med fosfatbuffret saltoppløsning (PBS) (n = 14) eller L6 (en human lgG1-kimensk MAb, n - 8) hadde en midlere overlevelse for de transplanterte cellene på 5,6 og 6,4 dager henholdsvis (fig 11 A)

I motsetning til dette ble forkastelsen av de transplanterte øycellene forsinket i dyr som var behandlet med CTLA4lg (10 yg pr døgn 114 dager), og hvor 4 av 7 dyr viste moderat forlenget overlevelse for de transplanterte celler (12,75 dager), mens de gjenværende 3 dyrene opprettholdt normale glukosenivåer i mer enn 80 dager (fig 11B) Denne eventuelle økning i glukosekonsentrasjonen kan være et resultat av at øyecellene var utslitt, fordi man ikke kunne observere noen tegn til aktiv cellulær forkastelse

I de tre mus som beholdt de transplanterte øycellene over et langt tidsrom, kan den økning i glukosekonsentrasjonen man observerte omknng 21 dager etter transplantenngen være en selvbegrensende forkastelsesepisode som er i overensstemmelse med den farmakokinetikk man kjenner for CTLA4lg-fjerning etter terapi (P S Linsley et al, Science 257 792 (1992))

I etterfølgende ekspenmenter ble dosen av CTLA4lg øket til 50 //g/døgn hver annen dag i ca 14 dager Denne behandlingen resulterte i at 100% av dyrene beholdt den normale øycellefunksjonen under hele eksperimentet uten noen tegn til en forkastningsknse (fig 11C)

For å bekrefte at insulinproduksjonen skjedde fra de transplanterte øycellene og ikke fra musens egen pankreaskjertel, ble det utført biopsi på utvalgte dyr på dag 21 og 29 for å fjerne transplanterte øyceller (fig 11C) t disse dyrene var glukosekonsentrasjonene øket til 350 mg/dl i løpet av 24 timer, noe som indikerer at de transplanterte øycellene var ansvarlig for å holde normale glukosenivåer Det synes som om blokkeringen av CD28-B7-interaksjonen hemmer en xenogenisk forkastelse av de transplanterte øycellene

Effektene av behandling med en oppløselig reseptor, dvs CTLAIg-fusjonsprotein, var ikke et resultat av Fc-binding (L6 frembragte ingen forkastelse av de transplanterte celler) eller generelle effekter på T-celle- eller B-celle-funksjonen in vivo

Det ble utført histologiske analyser av transplanterte øyceller fra kontrolldyrene (PBS-behandlede) og CTLA4lg-dyrene (fig 12A, 12B, 12C, 12D) Vev med øyceller hos kontrolldyrene viste tegn til immunreaksjon, med et markant lymfocyttisk infiltrat både i de transplanterte celler og de gjenværende øyceller (fig 12 A)

Immunohistokjemisk farging viste at insuhnpositive celler bare var sjelden tilstede, og at somatostatin-positive celler var totalt fraværende (fig 12B) i motsetning til dette viste det seg at transplantert vev fra de CTLA4lg-behandlede musene viste total mangel på lymfocyttisk infiltrat (fig 12C)

De transplanterte cellene var intakte med mange synlige øyer I tillegg til dette kunne man observere at B-cellene i det humane øycellevevet produserte humant insulin (fig 12B) og somatostatin

Det humane CTLA4lg som ble brukt i denne undersøkelsen reagerer både med muse- og humant B7 En fordel ved den xenogeniske transplantenngs-modellen er tilgjengeligheten av et MAb til humant B7 som ikke reagerer med museB7(T Yokochi, R D Holly, E A Clark J Immunol 128 823(1982)) Man kan således direkte undersøke rollen til de human B7-bærende anttgen-tilstedeværende cellene (APC)

Mus ble transplantert som beskrevet og så behandlet med 50 / jq MAb til humant B7 hver annen dag 114 dager etter transplantenngen Denne behandlingen forlenget overlevelsen for de transplanterte celler hos de behandlede musene (9 til >50 dager) sammenlignet med gruppen av kontrollmus (fig 13) Anti-B7 Mab er ikke istand til å blokkere forkastelsen så effektivt som CTLA4lg

CTLA4lg-terapi resulterte altså i en akseptering av transplanterte celler hos størstedelen av de undersøkte musene Det kan imidlertid være at dyrene ikke er tolerante En foreløpig immunoundertrykning kan føre til permanent akseptering av de transplanterte øycellene, fordi disse tilpasser seg vertens vev (tap av immunogemtet som et resultat av et tap av APC-funksjon) (L Hao, Y Wang, R G Gill, K J Lafferty, J Immunol 139 4022 (1987), K J Lafferty, S J Prowse, M Simeonivic, Annu Rev Immunol 1 143 (1983))

For å differensiere mellom disse mulighetene, ble det utført biopsi på utvalgte xenotransplanterte CTLA4lg-behandlede mus (dag 40), og dyrene ble så igjen transplantert under den gjenværende nyrekapselen, enten med de opprinnelige donorøycellene (første gruppe) eller med ubeslektede annen gruppes humane øyceller (fig 14)

Streptozotocin-behandlede kontrolldyr som ikke hadde mottatt noen typer transplanterte celler ble også transplantert med enten første eller annen gruppes øyceller Det ble ikke gitt noen behandling etter transplantenngen Kontrolldyrene forkastet både første og annen gruppes øyceller på dag 4 CTLA4lg-behandlede dyr som hadde mottatt annen gruppes øyceller forkastet disse på dag 5, mens de dyr som hadde mottatt første gruppes donorøyceller beholdt disse cellene i over 80 dager (fig 14)

Disse resultatene antyder at CTLA4lg-behandling resulterer i en forlenget donor-spesifikk mangel på reaksjon overfor de xenogeniske øycellene Muse-immunreaksjonens evne til å skille forskjeller mellom de humane øycelledonorene understøtter den direkte gjenkjennelsen av polymorfe MHC-produkter som uttrykkes på de humane øycellene

EKSEMPEL 6

Hunn BALB/c (H-2<d>) mus, med en alder på fra 6 til 8 uker, ble kjøpt fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)

Monoklonalt antistoff 11B11 er et rotte lgG1 anti-mus IL-4 (Ohara, J , og W E Paul, 1985, Production of a monoclonal antibody to and molecular charactenzation of B-cell stimulatory factor-1 Nature 315 333) (Verax (Lebanon,

NH))

BALB/c-mus (5 dyr pr gruppe) ble intravenøst immunisert med 10<**> SRBC alene eller sammen med 200 jjg kimænsk L6 mAb eller humant CTLA4lg-fusjonsprotein De angitte grupper ble behandlet to timer etter injeksjonen av SRBC med en intrapentonal injeksjon av 2 ml, enten av rotte immunoglobuhn eller rotte anti-mus IL-4 mAb 11B11 i en dose på 5 mg/ml Behandlingen med kimænsk L6 mAb eller CLTA4lg ble gjentatt daglig 14 påfallende dager

Alle dyr ble gitt intravenøse injeksjoner av SRBC (fig 15) eller KLH (fig 16) på dag 46 Spesifikt vil de lukkede sirkler på fig 15 representere mus som er tilført bare SRBC på dag 0 og dag 46 Den åpne sirkelen representerer mus som bare er tilført SRBC på dag 46 De gjenværende mus som er representert på fig 15 ble ytterligere tilført SRBC på dag 46 Fig 16 på den annen side viser mus som ble tilført en annen immunogen, KLH, utelukkende på dag 46

Serumkonsentrasjoner av mus med antistoffer mot SRBC eller KLH ble bestemt ved hjelp av ELISA som beskrevet (Linsley et al, Science 1992)

Serumantistoff-titreringsverdiene ble beregnet som fortynningen som gir en A450 som er fem ganger høyere enn bakgrunnsverdien Serumantistoff-titrenngsverdiene fra fig 15 ble bestemt fra de sammenslåtte sera fra 5 mus pr gruppe, mens serumantistoff-titreringsverdiene som er vist på fig 16 representerer midlere titrenngsverdier for de 5 individuelle sera Pilene indikerer SRBC eller KLH-injeksjonen på dag 46

Fig 15 og 16 viser at den immunologiske reaksjonen hos mus som var injisert samtidig med både CTLA4lg og anti-IL4 (åpen trekant) blir undertrykt på en antigen-spesifikk måte Fig 15 viser dessuten at det er ingen primær immunologisk reaksjon hos mus som samtidig fikk en injeksjon med CTLA4lg og kontrollrotte-lg (Cappel, Organontecknika, Palo Alto, CA) Disse musene viste imidlertid en sekundær immunologisk reaksjon etter injeksjon med SRBC på dag 46 (lukket trekant, fig 15) Fig 16 viser at en tilførsel av CTLA4lg og anti-IL4, fulgt av en annen immunogen, KLH, på dag 46 1 mus ikke undertrykker en primær immunreaksjon overfor KLH 1 mus Isteden viste disse musene en primær immunreaksjon overfor KLH (åpen trekant, fig 16) Således viste mus som var behandlet med CTLA4lg og anti-IL4 en meget spesifikk immunreaksjon som var avhengig av det antigen som var tilført

Claims

1 Blanding, karakterisert ved at den omfatter a) et B7-bindende molekyl som er et løselig CTLA4-molekyl, og b) et IL4-bindende molekyl som er et monoklonalt antistoff som spesifikt gjenkjenner og binder til IL4, for anvendelse i regulering av en immunreaksjon ved en blokkenng av en B7-interaksjon med lymfocytter

2 Blanding ifølge krav 1,karakterisert ved at det løselige CTLA4-molekylet er et CTI_A4lg-fusjonsprotein med en første aminosyresekvens som inneholder aminosyregruppene fra omtrent posisjon 1 til omtrent posisjon 125 av den aminosyresekvens som tilsvarer det ekstracellulære området av CTLA4, og en annen aminosyresekvens som inneholder aminosyregruppene som tilsvarer hengselet, CH2- og CH3-områdene av det humane immunglobulinet Cy1

3 Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at det løselige CTLA4-molekylet er et CD28lg/CTLA4lg-fusjonsproteinhybrid som har en første aminosyresekvens som tilsvarer en del av det ekstracellulære området av CD28-reseptor fusjonert til en annen aminosyresekvens som tilsvarer en del av det ekstracellulære området av CTI_A4-reseptor, og en tredje aminosyresekvens som tilsvarer hengselet, CH2- og CH3-området av det humane immunglobulinet Cy1

4 Blanding ifølge ethvert av kravene 1 til 3, karakterisert ved at lymfocyttene er B7-positive lymfocytter

5 Blanding ifølge ethvert av kravene 1 til 3, karakterisert ved at immunreaksjonen er en B-cellereaksjon som fører til hemming av antistoffproduksjon, en T-cellereaksjon som fører til hemming av en cellestyrt immunitet, eller hvor immunreaksjonen er en hemming av en lymfocyttformering

6 Blanding ifølge ethvert av kravene 1 til 3, karakterisert ved at blandingen er for anvendelse å hemme forkastelse av transplantert vev hos en pasient som har mottatt slikt vev

7 Blanding ifølge ethvert av kravene 1 til 3, karakterisert ved at blandingen er for anvendelse å hindre sykdommer eller lidelser som skyldes reaksjoner mellom transplanterte vev og verten

8 Anvendelse av et B7-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl for fremstilling av en farmasøytisk blanding som definert i kravene 1 til 3, for regulenng av en immunrespons for blokkenng av en B7-interaksjon med lymfocytter

9 Anvendelse av et B7-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl for fremstilling av en farmasøytisk blanding i henhold til krav 8, hvor lymfocyttene er B7-positive lymfocytter

10 Anvendelse av et B7-bindende molekyl og et IL4-bindende molekyl for fremstilling av en farmasøytisk blanding i henhold til krav 8, hvor immunresponsen er en B-cellerespons resulterende i inhibenngen av antistoffproduksjon, en T-cellerespons resulterende i inhibenng av cellemediert immunitet, eller immunresponsen er en inhibenng av lymfocyttproliferasjon