MXPA01012388A - Anticuerpo monoclonal bloqueador para vla-1 y su uso para el tratamiento de trastornos inflamatorios. - Google Patents

Abstract

Se describe un metodo para el tratamiento de trastornos inflamatorios, particularmente el tratamiento de la artritis. El metodo comprende la administracion de un anticuerpo bloqueador de una funcion que es capaz de unirse a un epitopo de VLA-1.

Description

ANTICUERPO MONOCLONAL BLOQUEADOR PARA VLA-1 Y Sü USO PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS INFLAMATORIOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las integrinas son complejos proteicos de la superficie celular que forman una gran clase de moléculas de la superficie celular que median la adhesión de células entre si y sus alrededores. Las células necesitan adherirse entre si y a otras moléculas en su ambiente en muchos procesos desarrollisticos y fisiológicos. Los ejemplos incluyen la creación de tejidos y órganos y el mantenimiento de su integridad. Incluidos entre esos procesos fisiológicos están los trastornos inflamatorios. Uno de los pasos clave durante el proceso inflamatorio implica la extravasación de células hacia afuera de los vasos sanguíneos, hacia los tejidos, y hacia el sitio de infección. El papel de las moléculas de adhesión en este proceso es con frecuencia dividido en un modelo de tres pasos que implica el ?rodaje' inicial de los leucocitos sobre el endotelio infamado, seguido por una unión firme, y la migración transendotelial resultante de los leucocitos hacia los tejidos inflamados (Hynes, R.O. 1992 Cell 69:11-25: Springer, T.A. 1992 CelJ 76:301-314). Un paso critico más en la cascada inflamatoria, y que no ha sido exhaustivamente explorado, ocurre dentro de los tejidos periféricos donde las Ref. 134213 células infiltrantes, asi como residentes, necesitan migrar hacia el sitio de infección, reconocer el antigeno foráneo y experimentar activación celular para efectuar sus funciones efectoras. Para evaluar directamente la importancia en la inflamación del adhesivo intersticial las interacciones en el aislamiento del papel de las interacciones del adhesivo juegan en el reclutamiento de leucocitos, nos hemos enfocado sobre la importancia de las moléculas de adhesión de la familia de la integrina y fragmentos de la misma, y su papel en modelos de inflamación anima, particularmente de artritis.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para el tratamiento de trastornos inflamatorios en un sujeto. Específicamente, la invención proporciona un método para el tratamiento de la artritis. De manera más particular, la invención proporciona un método para el tratamiento de un trastorno inflamatorio en un sujeto, que comprende" administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo o un fragmento del anticuerpo que bloquea la función de la alßl, donde el anticuerpo o fragmento que bloquea la función de la alßl es capaz de unirse a un epitopo de VLA-1 que comprende los aminoácidos residuales 92-97, Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg. El anticuerpo antiintegrina puede ser seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y fragmentos de los mismos. El anticuerpo antiintegrina puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal. La invención proporciona además un método para tratar trastornos inflamatorios en un sujeto que es un sujeto humano o animal. Toda la literatura citada en la sección anterior, así como la literatura citada incluida en la siguiente descripción, se incorpora aquí como referencia.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Integrinas de unión de colágeno alßl y a2ßl sobre leucoci tos acti vados . (A) análisis de citometría de flujo de la expresión de la integrina al y a2ßl sobre esplenocitos activados por IL-2 (d 11) . Las células fueron marcadas con Acm anti-al, Acm anti-a2, o Acm de control sin unión (líneas grises), y seguido por FITC-anti-inmunoglobulina de hámster. (B) Efecto de los Acm anti-al y anti-a2 sobre la adhesión de los leucocitos al colágeno. Se trataron 105 esplenocitos activados por IL-2 con los Acm indicados durante 15 minutos antes de cultivar en placa sobre cualesquier pozos recubiertos con colágeno del tipo IV o tipo I durante 1 hora a 37°C. La adhesión se calculó como se ilustra en el Ejemplo 1, y se expresó como el % de adhesión en relación a las células tratadas con Acm control. Los ensayos de adhesión se efectuaron por triplicado, y se efectuaron al menos tres experimentos independientes. Se muestra un ejemplo representativo. Figura 2. Efecto de los Acm antiin tegrina sobre la fase efectora de hipersensibilidad del tipo retrasada. Fueron inyectados i.p. ratones sensibilizados con SRBC con los Acm indicados 1 hora antes del desafío con SRBC. Se midió el espesor de la pata 20 horas después del desafío con antígeno, y los resultados se muestran como el % del incremento en el espesor de la pata ± DEM como se ilustra en el Ejemplo 2. Esos datos representan un resumen de ocho experimentos con n = 79 (PBS), 68 (Ig de hámster control), 68 (anti-al), 29 (anti-a2), 18 (anti-al + anti-a2), 45 (anti-a4), 18 (anti-a5), 20 (anti-aß), y 10 (anti-ßl) . Los Acm utilizados fueron: Ha4/8 (grupo 2 de Ig de hámster control), Ha31/8 (anti-al), Hal/29 (anti-a2), PS/2 (anti-a4), 5H10-27 (anti-a5), GoH3 (anti-a6) y HMßl-1 (anti-ßl). Figura 3. Efecto de los Acm antiintegrina sobre la fase efectora de hipersensibilidad al contacto . Fueron inyectados i.p. ratones sensibilizados con FITC con los Acm indicados 4 horas antes del desafío con FITC. Se midió el espesor de la oreja en la línea basal y 24 horas después del, y los resultados se muestran como el % del incremento en el espesor de la oreja ± DEM como se ilustra en el Ejemplo 3. Esos datos representan un resumen de nueve experimentos con n = 74 (PBS), 60 (Ig de hámster control), 26 (antiICAM-1 ) , 44 (anti-al), 44 (anti-a2), 38 (anti-al + anti-a2), 36 (anti-a4), 16 (anti-a5), 26 (anti-a4 + anti-a5), 24 (anti-a5), y 22 (anti-ßl) . Los Acm de hámster utilizados fueron: Ha4/8 (grupo 2 de Ig de hámster control), Ha31/8 (anti-al), Hal/29 (anti-a2), HMßl-1 (anti-ßl), 3E2 (anti-ICAM-1 ) ; los Acm de rata utilizados fueron: R35-95 y R35-38 (IgG2a de rata control e IgG2b de rata, respectivamente), PS/2 (anti-a4), 5H10-27 (anti-a5), GoH3 (anti-a5) . Figura 4. Respuestas de hipersensibilidad al contacto en ra tones defi cientes en al comparados con ra tones silvestres . Fueron inyectados i.p. ratones sensibilizados con FITC con los Acm indicados ~4 horas antes del desafío con FITC. Se midió el espesor de la oreja en la línea basal y 24 horas más tarde, y los resultados se muestran como el % de incremento en el espesor de la oreja + DEM como se ilustra en el Ejemplo 4. Se utilizaron grupos de cuatro a cinco ratones por condición, v ?-odos los experimentos se efectuaron un mínimo de tres veces. Se muestra un experimento representativo . Figura 5. Efecto de los Acm anti -al y anti -a2 sobre la inflamaci ón no específi ca inducida por acei te de crotón . Fueron inyectados i.p. ratones sensibilizados con los Acm indicados 4 horas antes de la tinción con aceite de crotón. Se midió el espesor de la oreja en la línea basal y 24 horas más tarde, y los resultados se muestran como el % de incremento en el espesor de la oreja + DEM como se ilustra en el Ejemplo 5. Se utilizaron grupos de cuatro a cinco ratones por condición, y todos los experimentos se efectuaron un mínimo de tres veces. Se muestra un experimento representativo . Figura 6. Efecto de los Acm anti -al y a2 en la artri ti s inducida por Acm de colágeno . Fueron inyectados i.p. ratones con Acm anti-colágeno al d 0, seguidos por LPS el día 3. Fueron inyectados i.p. ratones con los Acm indicados cada 3er día comenzando en d 0. La artritis clínica fue evidente 2-3 d después de la inyección de LPS y continuó durante varias semanas. Cada miembro fue evaluado sobre una escala de 0 a 4 cada 3er día de acuerdo a lo ilustrado en el Ejemplo 6 y los resultados se expresaron como el índice artrítico promedio entre el d9 y el d 15 (+ DEM) de los cuatro miembros. Esos datos representan un resumen de cuatro experimentos con cada experimento consistiendo de grupos de tres a cuatro ratones por condición. Figura 7. Administración de anti-al o anti-a2 que inhiben la infiltración de leucocitos en las patas durante la respuesta de DTH. El experimento se efectuó como se describe en la Figura 2. Las patas fueron extirpadas 20 h después del desafío con antígeno y se tiñeron cortes de tejido con hematoxilina y eosina. Los cortes de tejido son de las patas de ratones no desafiados (A) o ratones sensibilizados con SRBC desafiados con SRBC (B-H) . Los ratones fueron tratados 1 h antes del desafío con PBS (B) , Ig de hámster control (C, G) , anti-al (D) , anti-a2 (E) o una combinación de Acm anti-al y anti-a2 (F, H) . Amplificación: x 100 (A-F) , x 400 (G-H). Figura 8. Se expreso alßl sobre leucocitos infiltrantes en patas durante una respuesta de DTH. La tinción inmunohistoquímica de leucocitos infiltrantes de una pata no inflamada sin tratar 20 h después del desafío con antígeno. (A) . Cortes en serie teñidos directamente con Acm control conjugado con Alexa488 y Acm anti-al. (B) . Tinción inmunofluorescente doble con Acm anti-al conjugado con Alexa488 y Ácm específicos de la línea celular conjugados con Ficoeritrina (PE) . Los Acm conjugados con PE utilizados fueron específicos para granulocitos/monocitos (anti-CDllb). neutrófilos (anti-Ly6G/Gr-l ) , y linfocitos T (anti-CD3) . Amplificación: x 400. Figura 9. Efecto de los Acm anti -al y a2 en la artri tis inducida por Acm del colágeno . (A) . El tratamiento preventivo de los ratones con Acm anti-al o anti-a2 disminuye el índice artrítico. Los ratones fueron tratados con Acm anti-colágeno al d 0, seguidos por LPS el día 3. La artritis fue evidente al d 6 y continuó durante varias semanas. Los ratones fueron tratados con los Acm indicados cada 3er día comenzando el d 0. Cada miembro fue evaluado y valorado sobre una escala de 0 a 4 cada 3er día. Los resultados se expresaron como el índice artrítico promedio entre el d 9 y el d 15 (+ DEM) para los cuatro miembros (índice máximo de 16) . Se utilizaron grupos de cuatro ratones por condición, se muestra el promedio de doce experimentos, (B) . Los ratones deficientes en al tienen un índice artrítico reducido en comparación con los ratones silvestres tratados con Acm anti-al. Los detalles experimentales e índices de valores son como se describieron anteriormente. Se utilizaron grupos de 4 ratones por condición; se muestra el promedio de 2 experimentos . Figura 10. Efecto del tratamiento con Acm anti-al sobre la in unopatología de las articulaciones artríticas. El tratamiento con Acm anti-al reduce la infiltración leucocítica, adherencia de las células a superficies de articulaciones y destrucción de cartílago, de acuerdo a lo evidenciado por la pérdida de proteoglicano. Los miembros traseros de ratones normales (A-D) o ratones artríticos (d 8) recibieron Ig de hámster control (E-H) o tratamiento con Acm anti-al (I-L) . Los miembros fueron fotografiados (A, E, I) extirpados, y se tiñeron cortes de tejido con hematoxilina/eosina (B-C, F-G, J-K) o con azul de toluidina para detectar proteoglicano (D, H, L) . Amplificación; x 16 (B, F, J) ; x 160 (C, G, K) ; x 200 (D, H, L) . Figura 11. El desarrollo de la artritis es retardada por la ausencia de linfocitos y la inhibición de la artritis por el Acm anti-al ocurre en ausencia de linfocitos. Fueron tratados ratones B6,129 deficientes en B6,129 o RAG-1 silvestres con Acm anti-colágeno al día 0, seguido por LPS el día 3. La artritis fue evidente al día 6 y continuó durante varias semanas. Los ratones fueron tratados con los Acm indicados cada 3er día comenzando en el día 0. Cada miembro fue evaluado y valorado sobre una escala de 0 a 4 cada 3er inalámbricos. Los resultados se expresaron como el índice artrítico promedio por miembro (índice o valor máximo de 4). Se utilizaron grupos de 4 ratones por condición. Figura 12. Respuesta a la dosis de la inhibición de la artritis con Acm anti-al. Fueron tratados ratones Balb/c silvestres con Acm anti-colágeno al día 0, seguido por LPS el día 3. La artritis fue evidente al día 6 y continuó durante varias semanas. Los ratones fueron tratados i.p. con la dosis indicada de Acm Ha4/8 (control isotípico) o Ha31/8 (anti-al) cada 3er día comenzando el día 0. Cada miembro fue evaluado y valorado sobre una escala de 0 a 4 cada 3er día. Los resultados se expresaron como el índice artrítico promedio por miembro (índice o valor máximo de 4). Se utilizaron grupos de 4 ratones por condición. Figura 13. El tratamiento terapéutico : con Acm anti-al puede hacer disminuir el índice artrítico. Fueron tratados ratones Balb/c silvestres con Acm anticolágeno al día 0, seguido por LPS el día 3. La artritis fue evidente al día 6 y continuó durante varias semanas. Los ratones fueron tratados i.p. con Acm (250 ug) o proteína de fusión de Ig (200 ug) cada 3er día, comenzando el día 4. Los ratones recibieron Acm (control isotípico Ha4/8 o anti-al Ha31/8), proteína de fusión ig (Ig de control isotípico o TNF-R55-Ig) o una combinación de ambas (250 ug de Ha31/8 y 200 ug de TNF-R55-Ig) . Cada miembro fue evaluado y valorado sobre una escala de 0 a 4 cada 3er día. Los resultados se expresaron como el índice artrítico promedio por miembro (índice o valor máximo de 4). Se utilizaron grupos de 4 ratones por condición.

Figura 14. Ubi cación del epi topo para los Acm que bl oquean el dominio I del anti -al . A. Una secuencia de aminoácidos del dominio I de al de la rata (parte superior) y humano (parte inferior) . Los residuos que comprenden el motivo MIDAS (sitio de adición dependiente de ion metálico) se muestran en negritas. Los aminoácidos humanos que reemplazan los residuos de rata correspondientes (R?H) se muestran debajo de la secuencia de rata en la región cuadrada. Por claridad, la numeración de los residuos en el texto se refiere a esta figura. B. Las concentraciones crecientes de Acm AJH10 (ATCC NO. ) se unieron a placas recubiertas con 30 µg/ml de dominio I de al de humano (círculos), rata (triángulos) o R?H (cuadrados). Los datos mostrados son representativos de tres experimentos. Figura 15. Secuencia de aminoácidos del dominio I de al humano. Figura 16. Identifi cación de un Acm que bloquea el dominio I de al . A. se unió una concentración creciente de Acm AEF3 (triángulos) o AJH10 (ATCCC NO. ) (círculos) a placas recubiertas con 30 µg/ml de dominio I de al. B. El dominio I de al fue tratado con concentraciones crecientes de Acm AJH10 ~(ATCC NO. ) (diamantes) o Acm BGC5 (cuadrados) y placas recubiertas con colágeno IV unido (2 µg/ml). C. Se trataron células K562-al con concentraciones crecientes de Acm AEF3 (triángulos) o AJH10 (ATCC No. ) (círculos) y se unieron a placas recubiertas con colágeno IV (5 µg/ml). 45-50% de las células agregadas a cada pozo se adhirieron al colágeno IV. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes. Figura 17. Reactividad Cruzada de las especies de los Acm bloqueadores . A. Los usados con detergentes de (1) músculo liso vascular de oveja, (2) células K562-al de leucemia humana o (3) dominio I de GST-1 de R?H purificado; (4) dominio I de GST-al de rata, y (5) dominio I de GST-al humano fueron separados por SDS-PAGE al 10-20% bajo condiciones no reductoras, y sometidos a electroinmunotransferencia con Acm bloqueador de la función AJH10 (ATCC NO. ) . Los marcadores del peso molecular se muestran a la izquierda; la integrina alßl no reducida migración a ~ 180 kDa; el dominio GST-I migración a - 45 kDa. B. Fueron incubadas células de músculo liso vascular de conejo con Acm AJH10 (ATCC No. ) (fondo) o control de IgG murino (parte superior) y analizadas por un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) . Figura 18. El colágeno se une al dominio I de al . A. Se unieron concentraciones crecientes del dominio I de al humana a placas previamente recubiertas con 1 µg/ml de colágeno 1 (cuadrados) o colágeno IV (círculos) . Los valores mostrados han sido corregidos para la unión de fondo a BSA. B. Se mezclaron 2 µg/ml de dominio I de al humana con concentraciones crecientes de anticuerpo anti-integrina al humana 5E8D9 (cuadrados) o anticuerpo antiintegrina a2 humana A211E10 (círculos), y a continuación se unieron a placas previamente recubiertas con 1 µg/ml de colágeno IV. C. Las placas fueron recubiertas con 1 µg/ml de colágeno IV o BSA al 3%. El dominio I de al (2 µg/ml) fue posteriormente unido a placas recubiertas en presencia de Mn2+ 1 mM, Mg2+ 1 mM o EDTA 5 mM. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un descubrimiento de la presente invención es que un anticuerpo para una integrina y fragmento de la misma, particularmente la subunidád 1 de la integrina, puede bloquear la interacción de los leucocitos inflamatorios con componentes de la matriz extracelular, incluyendo, pero sin limitarse a los colágenos, laminina y fribonectina. Aunque no se pretende limitar la invención a ningún solo mecanismo de acción, se propone que la perturbación de la interacción entre la integrina y un fragmento de la misma y la matriz circundante puede hacer disminuir la expresión de citocinas proinflamatorias. Además se propone que los anticuerpos para las integrinas y fragmentos de las mismas pueden ser moduladores de las fases efectoras de las respuestas inflamatorias actuando a nivel de la célula T específica del antígeno. Además, se propone que los anticuerpos para las integrinas y fragmentos de las mismas pueden actuar perturbando la migración celular dentro de tejidos y/o efectos sobre el cebado y activación celular dentro de tejidos. Este descubrimiento ilustra la importancia de las moléculas de adhesión de la familia de la integrina, particularmente la alßl, en el ambiente de tejido periférico durante condiciones relacionadas con inflamación. También amplía el papel de la familia de las integrinas y fragmentos de las mismas en inflamación más allá de la unión de los leucocitos y la extravasación en la interfaz endotelial resaltando la importancia del ambiente del tejido periférico rico en matriz para las respuestas inmunes y revela los tejidos periféricos como un nuevo punto de intervención para terapias basadas en la adhesión. Los métodos de la presente invención contemplan el uso de anticuerpos para integrinas donde las integrinas contempladas incluyen moléculas las cuales comprenden una cadena de ß, incluyendo, pero sin limitarse a ßl, ß, ß3, ß4, ß5, ß6, ß7, ß8, unidas no covalentemente a una cadena a, incluyendo pero sin limitarse a al, a2, a3, a4, a5, a6, a7, a8, a9, alO, aV, aL, aM, aX, aD, aE, allb. Los ejemplos .de varias integrinas contempladas para utilizarse en la invención incluyen, pero no se limitan a: alßl, a2ßl, a3ßl, a4ßl, a5ßl, a6ßl, a7ßl, a8ßl, a9ßl, alOßl, aVßl, aLßl, aMßl, aXßl, aDßl, allbßl, aEßl; alß2, a2ß2, a3ß2, a4ß2, a5ß2, a6ß2, a7ß2, a8ß2, a9ß2, al0ß2, aVß2, aLß2, aMß2, aXß2, aDß2, allbß2, aEß2; alß3, a2ß3, a3ß3, a4ß3, a5ß3, a6ß3, a7ß3, a8ß3, a9ß3, al0ß3, aVß3, aLß3, aMß3, aXß3, aDß3, allbß3, aEß3; alß4, a2ß4, a3ß4, a4ß4, a5ß4, a6ß4, a7ß4, a8ß4, a9ß4, al0ß4, aVß4, aLß4, aMß4, aXß4, aDß4, allbß4, aEß4; alß5, a2ß5, a3ß5, a4ß5, a5ß5, a6ß5, a7ß5, a8ß5, a9ß5, al0ß5, aVß5, aLß5, aMß5, aXß5, aDß5, allbß5, aEß5; alßß, a2ß6, a3ß6, a4ß6, a5ß6, a6ß6, a7ß6, a8ß6, a9ß6, al0ß6, aVß6, aLß6, aMß6, aXß6, aDß6, allbßd, aEß6; alß7, a2ß7, a3ß7, a4ß7, a5ß7, a6ß7, a7ß7, a8ß7, a9ß7, al0ß7, aVß7, aLß7, aMß7, aXß7, aDß7, allbß7, aEß7; alß8, a2ß8, a3ß8, a4ß8, a5ß8, a6ß8, a7ß8, a8ß8, a9ß8, al0ß8, aVßd, aLß8, aMßd, aXß8, aDß8, allbßd, aEß8; Los métodos de la presente invención también contemplan el uso de anticuerpos para fragmentos de integrina, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos para una sola cadena ß, incluyendo pero sin limitarse a ßl, ß2, ß3, ß4, ß5, ß6, ß7, ßd, así como una sola cadena a, incluyendo pero sin limitarse a al, a2, a3, a4, a5, a6, a7, a8, a9, alO, aV, aL, aM, aX, aD, aE, allb. Además, los métodos de la presente invención contemplan además el uso de anticuerpos para fragmentos de integrina, incluyendo por ejemplo anticuerpos para el dominio I de la cadena a, incluyendo pero sin limitarse al dominio de alßl (Briese itz et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:2989); a2ßl (Takada y Hemler, 1989 J Cell Biol 109:397), aLß2 (Larson et al., 1969 J Cell Biol 108:703), aMß2 (Corbi et al., 1988 J Biol Chem 263:12403), aXß2 (Corbi et al., 1987 EMBO J 6:4023), aDß2 (Grayson et al., 1988 J Exp Med 188:2187), aEß7 (Shaw et al., 1994 J Biol Chem 269:6016). En una modalidad preferida, el determinante antigénico del dominio I de al comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 6 aminoácidos contiguos, donde la secuencia contigua se encuentra dentro de la secuencia de la Figura 15. Además, en una modalidad preferida, la secuencia contigua es Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg. Los métodos para producir integrinas para utilizarse en la presente invención son conocidos por aquellos expertos en la técnica (véase por ejemplo Springer et al. 190, Na ture 346:425-434). Las modalidades de la presente invención incluyen además anticuerpos policlonales y monoclonales antiintegrina. Las modalidades preferidas de la presente invención incluyen un anticuerpo monoclonal tal como el anticuerpo monoclonal anti-al. El anticuerpo bloqueador de la función de alßl como se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo que se une al dominio I de al, específicamente los residuos 92-97 de la Figura 15, y bloquea la función de alßl de acuerdo a lo probado por, por ejemplo, su capacidad para inhibir la adhesión dependiente de K562-al al Colágeno IV (véase el Ejemplo 15) . Los anticuerpos y homólogos preferidos del tratamiento, en particular para el tratamiento humano, incluyen homólogos de anticuerpos humanos, homólogos de anticuerpos humanizados, homólogos de anticuerpos quiméricos, fragmentos de anticuerpo Fab, Fab' , F(ab')2 y F(v), y monómeros o dímeros de cadenas pesada o ligera de anticuerpo o mezclas de los mismos. De este modo, los anticuerpos monoclonales contra una molécula de integrina y un fragmento de la misma son el agente de unión preferido en el método de la invención. Como se utiliza aquí, el término "homólogo de anticuerpo" incluye anticuerpos intactos que consisten de cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina ligadas vía enlaces disulfuro. El término "homólogo de anticuerpo" también pretende abarcar una proteína que comprende uno o más polipéptidos seleccionados de cadenas ligeras de inmunoglobulinas, cadenas pesadas de inmunoglobulina y fragmentos de unión de antígeno de las mismas, los cuales son capaces de unirse a uno o más antígenos (es decir, subunidades de integrina que contienen el dominio I de al. a2, a6 o a) . Los polipéptidos componentes de un homólogo de ^~.. *..-*,.. F~ anticuerpo compuesto de más de un polipéptido pueden opcionalmente estar unidos por disulfuro o reticulados covalentemente de otro modo. En consecuencia, por lo tanto los "homólogos de anticuerpo" incluyen inmunoglobulinas intactas de los tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como subtipos de las mismas), donde las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de los tipos kappa o lambda. Los "homólogos de anticuerpo" también incluyen porciones de anticuerpos intactos que retienen la especificidad de unión del antígeno, por ejemplo, fragmentos Fab, Fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos F(v), monómero o dímeros de cadena pesada, monómeros o dímeros de cadena ligera, dímeros que consisten de una cadena pesada y una ligera, y similares. De este modo, los fragmentos de unión de antígeno, así como los polipéptidos diméricos o triméricos de longitud completa derivados de los anticuerpos descritos anteriormente son en sí útiles. Como se utiliza aquí, un "homólogo de anticuerpo humanizado" es un homólogo de anticuerpo, producido por la tecnología del ADN recombinante, en el cual algunos o todos los aminoácidos de la cadena ligera o pesada de la inmunoglobulina humana que no son requeridos para la unión del antígeno han sido sustituidos por los aminoácidos correspondientes de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina de un mamífero no humano. Como se utiliza aquí, un "homólogo de anticuerpo qu'i-mérico" es un homólogo de anticuerpo, producido por la tecnología del ADN recombinante, en el cual toda o parte de la bisagra y las regiones constantes de una cadena ligera, cadena pesada o ambas de inmunoglobulina, han sido sustituidas por las regiones correspondientes de otra cadena ligera o cadena pesada de inmunoglobulina. En otro aspecto la invención presenta una variante de una molécula quimérica la cual incluye: (1) una porción objetivo de integrina; (2) opcionalmente, un segundo péptido, por ejemplo, uno el cual incrementa la solubilidad o el tiempo de vida in vivo de la porción objetivo de integrina, por ejemplo, un miembro de la superfamilia de la inmunoglobulina o fragmento o porción de la misma, por ejemplo una porción de un fragmento de IgG, por ejemplo, la región constante de la cadena pesada de la IgGl humana, por ejemplo, las regiones de la bisagra da CH2 y CH3; y una porción de toxina. La molécula quimérica puede ser utilizada para tratar a un sujeto, por ejemplo, un humano, en riesgo de un trastorno relacionado con la proliferación de células epiteliales tales como los folículos pilosos y similares. Como se utiliza aquí, un "homólogo de anticuerpo humano" es un homólogo de anticuerpo producido por la tecnología del ADN recombinante, en el cual todos los aminoácidos de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina son derivados de una fuente humana. Como se utiliza aquí, un "trastorno inflamatorio", incluye, pero no se limita a, trastornos tales como, condiciones relacionadas con la piel tales como la psoriasis, eczema, quemaduras y dermatitis. Otros trastornos inflamatorios contemplados para el tratamiento por los métodos de la presente invención incluyen pero no se limitan al tratamiento del asma, bronquitis, contracciones espasmódicas menstruales, tendinitis, bursitis y el tratamiento del dolor y jaquecas, o co o un antipirético para el tratamiento de la fiebre. Los métodos de la invención también serían útiles para tratar condiciones gastrointestinales tales como la enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, gastritis, síndrome del intestino irritables y colitis ulcerativa y para la prevención del cáncer colorrectal. Los métodos de la invención serían útiles en ~ el tratamientos de trastornos inflamatorios tales como enfermedades tales como las enfermedades vasculares, jaquecas debidas a migraña, periarteritis nodosa, tiroiditis, anemia aplástica, enfermedad de Hodgking, fiebre reumática, diabetes del tipo I, diastemia gravis, esclerosis múltiple, sarcoidosis, síndrome nefrótico, síndrome de Behcet, polimiocitis, gingivitis, hipersensibilidad, conjuntivitis, el hinchamiento que ocurre después de una lesión, isquemia miocárdica y similares. Los métodos de la invención son también útiles en el tratamiento de la rinitis alérgica, síndrome de distensión respiratoria, síndrome de choque por endotoxina y aterosclerosis . En una modalidad preferida, los métodos de la invención son útiles en el tratamiento de la artritis incluyendo, por ejemplo, la artritis reumatoide u osteoartritis. Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para obtener los resultados clínicos benéficos o deseados. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o más administraciones. En términos del tratamiento de un trastorno inflamatorio, una "cantidad efectiva" de anticuerpo de antiintegrina es una cantidad suficiente para paliar, aliviar, estabilizar, revertir, aletargar o retrasar el progreso de una condición relacionada con la inflamación de acuerdo con estándares clínicamente aceptables para los trastornos a ser tratados o para propósitos cosméticos. La detección y medición indicadores de la eficacia puede ser medida por un número de herramientas de diagnostico disponibles, incluyendo pero sin limitarse a, por ejemplo, el examen médico, incluyendo pruebas de sangre, pruebas de función pulmonar y rayos X torácicos; exploración CT; broncoscopía; lavado bronquioalveolar; biopsia pulmonar y exploración CT. La tecnología para producir anticuerpos monoclonales, incluyendo por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-integrinas bien conocida. Véase por ejemplo, Mendrick et al. 1995, Lab. Invest . 72:367-375 (Acm para anti-alßl y anti-a2ßl); Sonnenberg et al. 1987 J. Bi ol . Chem. 262:10376-10383 (Acm para anti-a6ßl murinos); Yao et al. 1996, J Cell Sci 1996 109:3139-50 (Acm para anti-a7ßl murinos); Hemler et al. 1984, J Immunol 132:3011-8 (Acm para alßl humana); Pischel et al. 1987 J Imm?nol 138:226-33 (Acm para a2ßl humano); Wayner et al. 1986, J Cell Biol 107:1881- 91 (Acm para a3ßl humana); Hemler et al. 1987 J Biol Chem 262:11478-85 (Acm para a4ßl humana); Wayner et al. 1988 J Cell Biol . 107:1881-91 (Acm para a5ßl humana); Sonnenberg et al. 1987, J. Biol . Chem . 262:10376-10383 (Acm para a6ßl humana); A Wang et al. 1996 Am. J. Respir. Cell Mol . Biol . 15:664-672 (Acm para a9ßl humana); Davies et al. 1989 J Cell Biol . 109:1817-26 (Acm para aVßl humana); Sánchez-Madrid et al. 1982, Proc Na ti Acad Sci E U A 79:7489-93 (Acm para aLß2); Diamond et al. 1993, J Cell Biol 120:1031-43 (Acm para aMß2 humana); Stacker et al. 1991 J Immunol 146:648-55 (Acm para aXß2 humana); Van der Vieren et al 1995 Immuni ty 3:683-90 (Acm para aDß2 humana); Bennett et al. 1983 Proc Na ti Acad Sci E U A 80:2417-21 (Acm para atibß3); Hessle et al. 1984, Differentia tion 26:49-54 (Acm para a6ß4 humana); Weinacker et al. 1994 J Biol Chem 269:6940-8 (Acm para aVß5); Weinacker et al. 1994 J Biol Chem 269:6940-8 (Acm para aVß6); Cerf-Bensussan et al 1992 Eur J Immunol 22:273-7 (Acm para aEß7); Nishimura et al. 1994 J Bio Chem 269:28708-15 (Acm para aVß8); Bossy et al. 1991 EMBO J 10:2375-85 (antisuero policlonal para a8ßl humano); Camperet al. 1998 J. Biol . Chem. 273:20383-20389 (antisuero policlonal alOßl humano). En general, una línea celular inmortal (típicamente células de mieloma) se fusiona a linfocitos (típicamente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con células completas que expresan un antígeno dado, por ejemplo, una integrina, y los sobrenadantes de cultivo de las células de hibridoma resultantes son separadas por anticuerpos contra el antígeno. Véase, de manera general Kohler et at., 1975, Nature 265: 295-497, "Cultivos Continuos de Células Fusionadas que se Secretan Anticuerpo de Especificidad Predefinida". La inmunización puede ser lograda utilizando procesamientos estándar. La dosis unitaria y régimen de inmunización depende de la especie de mamífero inmunizado, su estado inmune, el peso corporal del mamífero, etc. Típicamente, los mamíferos inmunizados son sangrados y el suero de cada muestra de sangre es ensayada para anticuerpos particulares utilizando ensayos de separación apropiados. Por ejemplo, los anticuerpos anti-integrina pueden ser identificados por inmunoprecipitación de usados de células marcadas con 1251 de células que expresan integrina. Los anticuerpos, incluyendo por ejemplo, anticuerpos antiintegrina, también pueden ser identificados por citometría de flujo, por ejemplo, midiendo la tinción fluorescente de células que expresen anticuerpo incubadas con un anticuerpo que se cree reconoce las moléculas de integrina. Los linfocitos utilizados en la producción de células de hibridoma son típicamente aislados de mamíferos inmunizados cuyos sueros ya han probado ser positivos para la presencia de anticuerpos anti-integrinas utilizando tales ensayos de separación. Típicamente, la línea celular inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) se deriva de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Las líneas de células inmortales preferidas son líneas de células de mieloma de ratón que son sensibles a un medio de cultivo que contiene hipoxantina, arninopterina y timidina ("medio HAT") . Típicamente, las células de mieloma sensibles al HAT son fusionadas con esplenocitos de ratón utilizando polietilen glicol con un peso molecular de 1500 ("PEG 1500"). Las células de hibridoma resultantes de la fusión son entonces seleccionadas utilizando el medio HAT, el cual mata las células de mieloma no fusionadas y fusionadas de manera no productiva (los esplenocitos no fusionados mueren después de varios días debido a que no se transformaron) . Los hibridomas que producen un anticuerpo deseado son detectados separando los sobrenadantes de cultivo de hibridoma. Por ejemplo, los hibridomas preparados para producir anticuerpos anti-integrina pueden ser separados integrando el sobrenadante de cultivo de hibridoma por anticuerpos secretados que tengan la capacidad de unirse a una línea celular recombinante que exprese integrina. Para producir homólogos de anticuerpo, incluyendo por ejemplo, homólogos de anticuerpo anti-integrina, que son inmunoglobulinas intactas, las células de hibridoma que probaron ser positivas en tales ensayos de separación fueron cultivadas en un medio nutriente bajo condiciones, y durante un tiempo suficiente para permitir que las células de hibridoma secreten los anticuerpos monoclonales en el medio de cultivo. Las técnicas de cultivo tisular y medios de cultivo adecuados para las células de hibridoma son bien conocidos. El sobrenadante de cultivo de hibridoma condicionado puede ser recolectado y los anticuerpos anti-integrina ser purificados opcionalmente de manera adicional por métodos bien conocidos.

De manera alternativa, el anticuerpo deseado puede ser producido inyectando las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón inmunizado. Las células de hibridoma proliferan en la cavidad peritoneal, secretando el anticuerpo que se acumula como fluido en los ascitos. El anticuerpo puede ser cosechado extrayendo el fluido de los ascitos de la cavidad peritoneal con una jeringa. Los homólogos de anticuerpos monoclonales completamente humanos contra, por ejemplo integrinas, son otro agente de unión preferido el cual puede bloquear antígenos en el método de la invención. En su forma intacta esos pueden ser separados utilizando esplenocitos humanos cebados in vi tro, de acuerdo a lo descrito por Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147:86-95, "Producción de Anticuerpos Monoclonales Humanos Específicos del Antígeno de Esplenocitos Humanos Cebados In Vi tro" . De manera alternativa, ellos pueden ser preparados por un repertorio de clonación de acuerdo a lo descrito por Persson et al., 1991 , Proc: Nat. Acad. Sci. EUA 88: 2432-2436, "Generación de diversos anticuerpos monoclonales humanos de alta afinidad por un repertorio de clonación" y Huang y Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141: 227-236, "Construcción de bibliotecas de ADNc de la región variable de la inmunoglobulina representativas de linfocitos de sangre periférica sin estimulación in vi tro" . En la Patente Estadounidense 5,798,230 (Agosto 25, 1998, "Proceso para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos y su uso") describe la preparación de anticuerpos monoclonales humanos a partir de células B humanas. De acuerdo a este proceso, las células que producen anticuerpos humanos son inmortalizadas por infección con un virus de Epstein-Barr, o un derivado del mismo, que expresa el antígeno nuclear del virus de Epstein-Barr 2 (EBNA2) . La función del EBNA2, que se requiere para la inmortalización, es posteriormente interrumpida, lo cual da como resultado un incremento en la producción de anticuerpo. En otro método más para producir anticuerpos completamente humanos, la Patente Estadounidense 5,789,650 (Agosto 4, 1998, "Animales transgénicos no humanos para producir anticuerpos heterólogos") describe animales transgénicos no humanos capaces de producir anticuerpos heterólogos y animales transgénicos no humanos que tienen genes de inmunoglobulina endógena activados. Los genes de inmunoglobulina endógena son suprimidos por polinucleótidos antisentido y/o por ~ antisuero dirigido contra inmunoglobulinas endógenas. Los anticuerpos heterólogos son codificados por genes de inmunoglobulina normalmente no encontrados en el genoma de aquellas especies de animales no humanos. Uno o más transgenes que contienen secuencias de cadenas pesadas de inmunoglobulina humana heteróloga no arregladas son introducidas en un animal no humano formando por lo tanto un animal transgénico capaz de rearreglar funcionalmente secuencias de inmunoglobulina transgénica y producir un repertorio de anticuerpos de varios isotipos codificados por genes de inmunoglobulina humanos. Tales anticuerpos humanos heterólogos son producidos en células B, las cuales son posteriormente inmortalizadas, por ejemplo, fusionando con una línea celular inmortalizante tal como un mieloma o manipulando tales células B por otras técnicas para perpetuar la línea celular capaz de producir un homólogo de anticuerpo completamente humano, heterólogo, monoclonal. Otro agente de unión aún preferido que puede bloquear antígenos de integrina o fragmentos de los mismos en el método de la invención es un homólogo de anticuerpo humanizado que tiene la capacidad de unirse a una proteína de la integrina o fragmento de la misma. Después de los primeros métodos para la preparación de anticuerpos quiméricos, se describió un nuevo método en la EP 0239400 (Winter et al.), mediante el cual los anticuerpos son alterados mediante la sustitución de sus regiones determinantes de complementaridad (CDR) para una especie con aquéllas de otra. Este proceso puede ser utilizado, por ejemplo, para sustituir las CDR de los dominios de la región variable de Ig de cadena pesada y ligera humanos con CDR de dominios de la región variable murinos. Esas regiones variables de Ig variables pueden ser posteriormente combinadas con regiones constantes de Ig humanas para anticuerpos creados las cuales son totalmente humanas en composición excepto por las CDR murinas sustituidas. Se predeciría que tales anticuerpos sustituidos por PCR es muy poco probable que produzcan una respuesta inmune en humanos en comparación con anticuerpos quiméricos debido a que los anticuerpos sustituidos por CDR contienen considerablemente menos componentes no humanos. El proceso para inmunizar anticuerpos monoclonales vía el "injerto" de CDR ha sido llamado "reformación". (Riechmann et al., 1988 Nature 332: 323-327, "Reformación de anticuerpos humanos para terapia"; Verhoeyen et al., 1986, Science 239: 1534-1536, "Reformación de anticuerpo humanos utilizando el injerto de CDR en Anticuerpos Monoclonales". Típicamente, las regiones determinantes de la complementaridad (CDR) de un anticuerpo murino son transplantadas sobre las regiones correspondientes de un anticuerpo humano, puesto que éstas con las CDR (tres en las cadenas pesadas del anticuerpo, tres en las cadenas ligeras) qué son las regiones del anticuerpo de ratón que se unen a un antígeno específico. El transplante de CDR se logra por ingeniería genética, por lo que las secuencias de ADN de las CDR son determinadas mediante la clonación de los segmentos el gen de la región variable (V) de cadena pesada y ligera murinos, y son entonces transferidas a las regiones V humanas correspondientes por mutagénesis dirigida al sitio. En la etapa final del proceso, los segmentos del gen de la región constante humanos del isotipo deseado (usualmente gamma I para CH y kappa para CL) son agregados y los genes de cadena pesada y ligera humanizados son coexpresados en células de mamífero para producir anticuerpo humanizado soluble. La transferencia de esas CDR a un anticuerpo humano confiere a este anticuerpo las propiedades de unión de antígeno del anticuerpo murino original. Las seis CDR en el anticuerpo murino están montadas estructuralmente sobre una región "estructural" de la región V. La razón por la que el injerto de CDR es exitosa es que las regiones estructurales entre los anticuerpos de ratón y humano pueden ser estructuras 3D muy similares con puntos de unión muy similares para las estructuras CDRS, de modo que las CDR pueden ser intercambiadas. Tales homólogos de anticuerpos humanizados pueden ser preparados, de acuerdo a lo ejemplificado en Jones et al., 1986 Nature 321: 522-525, "Reemplazo de las regiones que determinan la complementaridad en un anticuerpo humano con a"quéllas de un ratón"; Riechmann, 1988, Nature 332:323-327, "Reformación de anticuerpos humanos para terapia"; Queen et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 86:10029, "Un anticuerpo humanizado que se une al receptor de interleucina 2" y Orlandi et al., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86:3833 "Clonación de dominios variables de Inmunoglobulina para su expresión por la reacción en cadena de la polimerasa". No obstante, se piensa que ciertos aminoácidos dentro de las regiones estructurales interactúan con las CDR y tienen influencia sobre la afinidad de unión de antígeno total. La transferencia directa de CDR de un anticuerpo murino para producir anticuerpo humanizado sin ninguna modificación de las estructuras de la región V con frecuencia da como resultado una pérdida parcial o completa de la afinidad de unión. En numerosos casos, parece ser crítico alterar los residuos en las regiones estructurales de anticuerpo receptor para obtener una actividad de unión. Queen et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 86: 10029-10033, "Un anticuerpo humanizado que se une al receptor de interleucina 2" y la WO 90/07861 (Protein Design Labs Inc.) han descrito la preparación de un anticuerpo humanizado que contiene residuos modificados en las regiones estructurales del anticuerpo receptor combinando las CDR de un Acm murino (anti-Tac) con estructuras de inmunoglobulina humana y regiones de contraste. Ellos han demostrado una solución al problema de la pérdida de afinidad de unión que con frecuencia resulta de la transferencia directa de CDR sin ninguna modificación de los residuos estructurales de la región V humana; su solución implica dos pasos clave. Primero, las regiones estructurales V humanas son elegidas por análisis de computadora para la homología de secuencia de proteína óptima para la estructura de la región V de la región del anticuerpo murino original, en este caso, el Acm anti-Tac. En el segundo paso, la estructura terciaria de la región V murina es modelada por computadora para visualizar los aminoácidos residuales estructurales que probablemente interactúen con las CDR murinas y esos aminoácidos residuales murinos son entonces superpuestos sobre la estructura humana homologa. Su método de emplear estructuras humanas homologas con residuos de contacto murinos putativos dio como resultado anticuerpos humanizados con afinidades de unión similares a la del anticuerpo murino original con respecto a anticuerpos específicos para el receptor de interleucina 2 (Queen et al., 1989 [supra] ) y también para anticuerpos específicos para el virus del herpes simple (HSV) (Co. et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 2869-2873, "Anticuerpos humanizados para terapia antiviral". De acuerdo al método descrito anteriormente dedos pasos en la WO 90/07861, Queen et al.", esbozan varios criterios para diseñar inmunoglobulinas humanizadas. El primer criterio es utilizar como receptor humano la estructura de una inmunoglobulina humana particular que usualmente es homologa a la inmunoglobulina donadora no humana a ser humanizada, o utilizar una estructura de consenso de muchos anticuerpos humanos. El segundo criterio es utilizar el aminoácido donador en lugar del receptor si el residuo receptor humano es inusual y el residuo donador es típico para secuencias humanas en un residuo específico de la estructura. El tercer criterio es utilizar los aminoácidos residuales estructurales donadores en lugar del recipiente en posiciones inmediatamente adyacentes a las CDR. Puede utilizarse un método diferente (véase Tempest, 1991, Biotechnology 9: 266-271, "Reformación de un anticuerpo monoclonal humano para inhibir la infección por el virus sincitial respiratorio humano in vivo" y utilizar, como estándar, las estructuras de la región V derivadas de cadenas pesada y ligera NEWM y REÍ, respectivamente para injertar CDR sin introducción radical de residuos de ratón. Una ventaja de utilizar el método de Tempest et al., 1991 para construir anticuerpos humanizados basados en NEWM y REÍ es que las estructuras tridimensionales de las regiones variables NEWM y REÍ son conocidas por cristalografía de rayos X y de este modo las interacciones específicas entre las CDR y los residuos estructurales de la "región V pueden ser modeladas. Los tratamientos objeto son efectivos en sujetos tanto humanos como animales afligidos por esas condiciones. Los animales sujeto a los cuales la invención es aplicable se extienden a animales domésticos y ganado, criados ya sea como mascotas o para propósitos comerciales. Los ejemplos son perros, gatos, ganado vacuno, caballos, ovejas, cerdos y cabras. En los métodos de la invención los anticuerpos, incluyendo por ejemplo, el anticuerpo anti-VLA-1, pueden ser administrados parenteralmente. El término "parenteral" como se utiliza aquí incluye las técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intra esternal, intratecal, intrahepática, intralesión e intracraneal. Las composiciones farmacéuticas de esta invención comprenden cualquiera de los compuestos de la presente invención, o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos, junto con cualquier portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador" como se utiliza aquí incluye adyuvantes y vehículos aceptables conocidos. De acuerdo a esta invención, las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una preparación inyectable estéril, por ejemplo una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión puede ser formulada de acuerdo a métodos conocidos en la técnica utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes suspensores adecuados. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden darse oralmente. Si se dan oralmente, pueden ser administradas en cualquier dosis oralmente aceptable incluyendo, pero sin limitarse a, cápsulas, tabletas, suspensiones o soluciones acuosas. Para aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas en un ungüento adecuado que contenga el componente activo suspendido o disuelto en uno o más portadores. Las composiciones farmacéuticas de esta invención también pueden ser administradas por aerosol o inhalación nasal a través del uso de un nebulizador, un inhalador de polvo seco o u inhalador de dosis medida. La dosis y tasa de dosificación de los compuestos de esta invención efectivas para producir los efectos deseados dependerá de una variedad de factores, tales como la naturaleza del inhibidor, el tamaño o talla del sujeto, la meta del tratamiento, la naturaleza de la patología a ser tratada, la composición farmacéutica específica utilizada, y el juicio del médico tratante. Los niveles de dosificación entre aproximadamente 0.001 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día, de manera preferible de entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal por día del compuesto de ingrediente activo son útiles. De manera más preferible, el homólogo de anticuerpo será administrado a una dosis que fluctúe entre aproximadamente 0.1 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal/día, de manera preferible fluctúa de entre aproximadamente 0.1 mg/kg de peso corporal /día . y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día y a intervalos de cada uno de 1-14 días. En otra modalidad preferida el anticuerpo es administrado a una dosis de aproximadamente .3 a l mg/kg cuando se administra I.P. En otra modalidad preferida, el anticuerpo es administrado a una dosis de aproximadamente 5 a 12.5 mg/kg cuando se administra I.V. De manera preferible, una composición de anticuerpo es administrada en una cantidad efectiva para proporcionar un nivel en plasma del anticuerpo de al menos 1 ug/ml. Los expertos en la técnica pueden probar fácilmente si un antígeno de la invención tiene el efecto pretendido. Por ejemplo, las células contenidas en una muestra de epitelio del individuo son probadas para determinar la presencia del agente in vivo (o ex vivo) utilizando un segundo reactivo para detectar el agente administrado. Por ejemplo, éste puede ser un anticuerpo marcado con fluorocromo específico para el agente administrado, el cual es entonces medido por análisis FACS (clasificador de células activado por fluorescencia) estándar. De manera alternativa, la presencia del agente administrado es detectada in vivo (o ex vi vo) por la capacidad o capacidad disminuida de las células individuales para unirse al mismo agente que ha sido en sí marcado (por ejemplo, por un flurocromo) . La dosis preferida deberá producir un recubrimiento detectable de la vasta mayoría de las células positivas de erizo. De manera preferible, el recubrimiento es sostenido en el caso de un homólogo de anticuerpo durante un periodo de 1-14 días. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, las técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, química de proteínas e inmunología, las cuales están dentro de las destrezas de la técnica. Tales técnicas se describen en la literatura. Véase, por ejemplo, Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, 2a edición. (Sambrook, Fritsch y Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Clonación del ADN, Volúmenes I y II (D.N. Glover, ed) , 1985; Sintesis Oligonucleotidica, (M.J. Gait, ed.), 1984; Patente Estadounidense No. 4,683,195 (Mullís et al.,); Hibridación de Acido Nucleico (B.D. Hames y S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcripción y Traducción (B.D. Hames y S.J. Higgins, eds.), 1984; Cultivo de Células de Animales (R.I. Freshney, ed) . Alan R. Liss, Inc., 1987; Células y Enzimas Inmovilizadas, IRL Press, 1986; Una Guia Práctica para la Clonación Molecular (B. Perbal), 1984; Métodos en Enzimologia, volúmenes 154 y 155 (Wu et al., eds), Academic Press, New York; Vectores para la Transferencia Genética para Células de Mamífero (J.H. Miller y M.P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Métodos Inmunoquimicos en Biologia Celular y Molecular (Mayer y Waiker, eds.), Academic Press, Londres, 1987; Manual de Inmunología Experimental, Volúmenes I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulación de Embriones de Ratón, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. Los siguientes Ejemplos se proporcionan para ilustrar la presente invención, y no deberán constituirse en limitantes de la misma.

EJEMPLOS Reactivos químicos El isotiocianato de fluoresceína (FITC) fue comprado de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) . El aceite de crotón fue comprado de ICN Biochemicals (Aurora, OH) . La sangre completa de oveja en solución de Alsevers se obtuvo de East Acres Biologicals (Southbridge, MA) . El colágeno de cola de rata tipo I y el colágeno de ratón tipo IV se compraron de Collaborative Research Inc. (Bedford, MA) y Gibco (Gaithersburg, MD) , respectivamente. Los ratones hembra Balb/c de 6-8 semanas de edad fueron comprados de Taconic (Germantown, NY) y los ratones deficientes de integrina alßl en un antecedente de Balb/c fueron como se describió anteriormente en (3) .

Ejemplo 1 Anticuerpos Monoclonales . Los Acm que bloquean la función para los antígenos murinos fueron preparados en un formato libre de azida y bajo la endotoxina: Ha31/8 (anti-CD49a de hámster); integrina al) (Mendrick et al. 1995. Lab. Invest . 72:367-375), Hal/29 (anti-CD49b de hámster; integrina a2) (ßl) (Mendrick et al. 1995. Lab . Invest . 72:367-375; Mendrick, D.L. y D.M. Kelly 1993 Lab . Invest . 69 : 690-702) , Acm control del grupo II de hámster Ha4/8 (anti-KLH de hámster) (Mendrick, D.L. y D.M. Kelly 1993 Lab . Invest . 69:690-702), y PS/2 (anti-CD49d de rata; integrina cadena a4ßl) (Miyake et al. 1991 J. Exp. Med. 173:599-607). Además, los Acm bloqueadores de la función para los antígenos murinos son comprados como preparaciones sin azida/bajas en endotoxina de Pharmingen (San Diego, CA) : HMßl-1 (anti-CD29 de hámster; cadena de la integrina ßl) (Noto et al. 1995 Int . Immunol . 7:835-842), Ha2/5 (anti-CD29 de hámster; cadena de la integrina ßl) ( Mendrick,- D.L. y D.M. Kelly 1993 Lab. Invest . 69:690-702;, 3E2 (anti-CD54 de hámster, ICAM-1) (Scheynius et al. 1993 J. Immunol. 150:655-663), 5H10-27 (anti-CD49e de rata; integrina a5) (Kinashi, T., y T.A. Springer. 1994. Blood Cells . 20:25-44), GoH3 (anti-CD49f de rata; integrina a6) (Sonnenberg et al. 1987 J. Biol . Chem . 262:10376-10383), y los Acm control del isotipo de rata R35-95 (IgG2a de rata) y R35-38 (IgG2b de rata).

Ensayo de adhesión . Fueron cultivados esplenocitos de ratones Balb/c con 20 ng/ml de IL-2 durante 7-12 d. La adhesión de las células al colágeno del tipo I y el tipo IV fue como se describió anteriormente (Gotwals et al. 1996 J. Clin . Invest . 97 :2469-2477) . De manera breve, fueron recubiertas placas Maxisorp de 96 pozos (Nunc, Napierville, IL) con 10 g/ml de colágeno del tipo IV o 5 µg/ml del tipo I y los sitios no específicos bloqueados con BSA al 1%. Los esplenocitos activados con IL-2 fueron marcados con 2 µM de BCECF [penta acetoximetiléster de 2' , 7' -bis (carboxietil) -5 (6) carboxilfluresceína] 2 µm (Molecular Probes, Eugene, OR) y se incubaron con 10 µg/ml de los Acm indicados durante 15 min. Se agregaron entonces 105 células en BSA al 0.25% en RPMI a los pozos recubiertos y se incubó durante 60 min a 37 °C. Las células no unidas fueron removidas lavando tres veces con BSA al 0.25% en RPMI . La adhesión fue cuantificada utilizando un lector de placas fluorescentes CytoFluor 2350 (Millipore, Bedford, MA) . Se midió la relación de células unidas a células introducidas y se calculó el % de adhesión en relación a las células tratadas con Acm control (r?ormc¿Íj.¿aaa3 al 100%) . Se sustrajeron los valores de fondo debidos a la adhesión celular sobre pozos recubiertos con BSA únicamente. Expresión y bloqueo funcional de alßl y a2ßl sobre l eucoci tos acti vados . Dado el papel clave que juegan los leucocitos en la inflamación, decidimos probar si los Acm anti-al y anti-a2 eran capaces de bloquear la adhesión de los leucocitos a los colágenos. Para obtener altos niveles de expresión de leucocitos de al y a2, fueron estimuladas células T murinas in vi tro con IL-2 durante 7-12 d. Esas células expresaron altos niveles de al y a2 (Figura 1 A) , y se unieron bien a ambas superficies recubiertas con colágeno del tipo IV y el tipo I (Figura I B). La adhesión al colágeno de 1 tipo IV fue inhibida parcialmente por el Acm anti-al únicamente y no fue inhibida por el Acm anti-a2 solo. En contraste, la adhesión al colágeno del tipo I fue inhibida completamente por el Acm anti-a2 y el Acm anti-al solo mostró únicamente una inhibición parcial. Tanto el Acm anti-ßl como la combinación de Acm anti-al y anti-a2 inhibieron completamente la adhesión a los colágenos de los tipos I y IV. Habiendo demostrado que las integrinas alßl y a2ß2 son expresadas sobre células activadas y que los Acm anti-al y anti-a2 son capaces de bloquear funcionalmente la adhesión de los leucocitos a los colágenos, utilizamos esos Acm para investigar el papel in vi vo de esas integrinas en modelos animales de trastornos inflamatorios.

Ejemplo 2 Inhibi ción de las respuestas de DTH por Acm anti integrina . Las respuestas de hipersensibilidad de tipo tardío (DTH) inducidas por SRBC fueron adaptadas de un protocolo previamente descrito (Hurtrel et al. 1992 Cell . Immunol , 142:252-263). De manera breve, los ratones fueron inmunizados s.c. en la espalda con 2 x 107 SRBC en 100 ul de PBS el d 0. Los ratones fueron desafiados al d 5 inyectando 1 x 108 de SRBG en 25 ul de PBS s.c. en la pata trasera derecha. El espesor de la pata fue medido con un calibrador de ingeniero (Mitutoyo/MTI, Paramus, NJ) 20 h después del desafío con antígeno, y se calculó el hinchamiento de la pata. Los resultados se reportaron como el por ciento de incremento promedio del espesor de la pata + DEM y se calculó como un por ciento de incremento = [1 - (Espesor de la pata derecha 20 h después del desafío con antígeno/Espesor de la pata izquierda sin inyectar 20 h después del desafío con antígeno)] x 100. Para bloquear la fase efectora de la respuesta de la fase de DTH inducida por SRBC, los Acm terapéuticos o de control (100 ug) , los cuales fueron preparados de acuerdo a los métodos descritos en el Ejemplo 1, se proporcionaron i.p. lh antes del desafío con antígeno en el d 5. La DTH inducida por SRBC es un modelo de inflamación in vi vo bien caracterizado, y en particular de psoriasis, que ha sido utilizado para demostrar la importancia de una variedad de citocinas y moléculas de adhesión o inflamación (Tedder et al. 1995 J. Exp . Med. 181:2259-2264, Terashita et al. 1996 J. Immunol . 156:4638-4643) . Los ratones sensibilizados con SRBC recibieron Acm anti-integrina 1 h antes del desafío con antígeno en la pata y la inflamación se evaluó 20 h después de acuerdo a lo medido por el incremento del espesor de la pata. Los ratones tratados con PBS e Ig de hámster control mostraron un incremento de 60-70% en el espesor de pata 20 h después del desafío con antígeno (Figura 2) . En comparación con el tratamiento de Ig de hámster control, los Acm anti-al o anti-a2 tienen como resultado una inhibición del 68% y 60% en el espesor de la pata, respectivamente. La combinación de Acm anti-al y a2 dio como resultado una inhibición del 71%, demostrando poco efecto aditivo sobre los Acm anti-al o anti-a2 solos. El tratamiento con otros Acm anti-integrina también fue efectivo para inhibir la respuesta efectora de DTH. El grado de inhibición observado por los diferentes tratamientos con Acm fue del 49% (anti-a4), 23% (anti-a5), y 57% (anti-aß) . Finalmente, el bloqueo del Acm de la subunidad de integrina ßl común (Acm HMBI-1) inhibió la respuesta de DTH efectora en un 67%.

Ejemplo 3 Inhibición de las respuestas efectoras de CHS por Acm anti -integrina . Se ensayó la hipersensibilidad al contacto (CHS) para FITC como se describió anteriormente (Gaspari et al. 1991 En Current Protocols in Immunology, J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, y W. Strober, editores. John Wiley & Sons, New York. Sección 4.2:1). De manera breve, los ratones fueron sensibilizados pintando 10 ul de FITC al 0.5% en acetona/ftalato de dibutilo 1:1 sobre la espalda rasurada el d 0. 10 d más tarde, los animales fueron desafiados aplicando 5 ul de FITC al 0.5% sobre ambos lados de cada oreja. Se determinó la respuesta d hinchamiento de la oreja midiendo el espesor de la oreja con un calibrador de ingeniero (Mitutoyo/MTI, Paramus, NJ) al momento del desafío con antígeno (d 10) y 24 h más tarde, y los resultados se reportaron como el por ciento de incremento promedio en el espesor basal de la pata + DEM. El incremento en el espesor de la oreja fue calculado como % de incremento = [1 - (Espesor de la oreja 24 h después del desafío con antígeno/Espesor de la oreja al momento del desafío con antígeno)] x 100. Para bloquear la fase efectora de la respuesta de CHS, se proporcionó i.p. Acm terapéutico o control (250 ug) 4 h antes del desafío con antígeno el d 10. Los ratones que fueron sensibilizados con antígeno y desafiados en la oreja con vehículo únicamente (vehículo control) o los ratones que fueron desafiados en la oreja sin sensibilización previa (control irritante) sirvieron como controles negativos (nunca excedieron de un incremento del 2% en el espesor de la oreja) . Dado que la CHS es mecanísticamente distinta a la DTH e implica diferentes células efectoras, investigamos que efecto habían tenido los Acm anti-integrina sobre la fase efectora de la respuesta de CHS. Los ratones fueron sensibilizados con hapteno utilizando FITC aplicada a sus espaldas rasuradas, seguida 10 d más tarde por el desafío con FITC a la oreja dando como resultado una respuesta inflamatoria al siguiente día. Los ratones sensibilizados con FITC demostraron un incremento del 60-70% en el espesor 24 h después del desafío con antígeno (Figura 3) . Consistente con los resultados publicados (Scheynius et al. J. Immunol, 150:655-663), el tratamiento con Acm anti-ICAM-1 dio como resultado una inhibición del 51% del hinchamiento de la oreja. Comparado con el Acm de hámster control, el tratamiento de los ratones con Acm anti-al o anti-a2 4 h antes del desafío con antígeno dio como resultado una inhibición del 37% y del 57% del hinchamiento de la oreja, respectivamente (Figura 3) . La combinación de los Acm anti-al y anti-a2 dio como resultado una inhibición ligeramente mayor del hinchamiento de la oreja (65%). El tratamiento con otros Acm a integrinas ßl reveló que aunque los Acm anti-a4 y anti-a5 dieron como resultado la inhibición de la respuesta efectora de CHS inducida por FITC cuando se compararon con al Acm de rata control, el tratamiento con Acm anti-a6 dio como resultado una inhibición del 66% de las respuestas efectoras. Finalmente, el bloqueo el Acm de la subunidad de la integrina ßl común inhibió las respuestas efectoras de CHS en un 74%. Se obtuvieron resultados de CHS similares utilizando diferentes cepas de ratones (C57/BL6, 129/SV) y diferente agente sensibilizador (oxazolona) (no se muestran los datos) . De manera similar a los resultados observados en el modelo de DTH inducida por SRBC, el análisis histológico de las orejas inflamadas reveló que tanto- la formación de edema como la infiltración leucocítica fueron inhibidas por el tratamiento con Acm anti-al y anti-a2. Consistente con el descubrimiento de que la alßl y a2ßl pueden ser expresadas sobre esplenocitos activados por 11-2, el análisis de los nodos linfáticos de ratones sensibilizados con antígeno (FITC u oxazolona) reveló que las -alßl y a2ßl se expresan exclusivamente sobre células CD4+ y CD8+ activadas con CD44hiLFA-lhl (no se muestran los datos) .

El tratamiento de ratones con Acm anti-al y anti-a2 no dio como resultado la supresión de esas células, puesto que el número de células T activadas tanto en el bazo como en los nodos linfáticos que aparecen en respuesta a la sensibilización con antígeno del modelo de CHS no se vieron afectados. Además, las células efectoras no fueron suprimidas funcionalmente debido a que el tratamiento prolongado' de ratones sensibilizados con antígeno con Acm anti-al y anti-a2 (d 10-16) no afectó la respuesta inflamatoria de los ratones desafiados con antígeno el d 20 (no se muestran los datos) .

Ejemplo 4 Las respuestas efectoras de CHS son disminuidas en ra tones defi cientes en alßl . Para excluir la posibilidad de que el papel inhibidor de alßl en la respuesta efectora de CHS mediada por FITC fuera mediada por el Acm, se llevaron a cabo experimentos en ratones silvestres y deficientes en integrina alßl (Figura 4). La inhibición del Acm de la fase efectora en ratones silvestres fue consistente con los resultados anteriores, con una inhibición el 56% en el espesor de la oreja observada con anti-al, 56% con anti-a2 y 62% con una combinación de anti-al y anti-a2. La fase efectora de la CHS fue producida significativamente, en ratones deficientes en alßl no tratados en comparación con los ratones silvestres no tratados (39% contra 71% de incremento en el espesor de la oreja, respectivamente) . Como se esperaba, el nivel de hinchamiento de la oreja en ratones deficientes en alßl no tratados fue equivalente al nivel de hinchamiento de la oreja observado con ratones silvestres tratados con Acm anti-al. Finalmente, el bloqueo del Acm de a2ßl en ratones deficientes en alßl dio como resultado sólo un ligero incremento en la inhibición del hinchamiento de la oreja, consistente con los resultados observados en ratones silvestres tratados con una combinación de Acm anti-al y anti-a2.

Ejemplo 5 Para excluir aún más la posibilidad de que el efecto inhibidor de los Acm ánti-integrina observado en ambos modelos de inflamación de DTH y CHS es causado por un efecto antiinflamatorio general mediado por los Acm anti-al y anti-a2, se estudió el efecto de esos Acm sobre la dermatitis irritante.

Para evaluar la dermatitis irritante, los ratones fueron pintados con 5 ul de aceite de crotón al 0.8% en acetona sobre ambos lados de cada oreja. Se dieron anticuerpos terapéuticos o control 4 h antes de la aplicación del irritante. El hinchamiento de la oreja se midió 24 h más tarde como se describió anteriormente y se comparó con el espesor de la oreja antes de la aplicación del aceite de crotón. Los resultados se reportaron como el por ciento de incremento promedio en el espesor basal de la oreja + DEM como se describió anteriormente. Los ratones pintados con acetona únicamente (vehículo control) sirvieron como control negativo. 24 h más tarde, las orejas de los ratones tratados con aceite de crotón mostraron un incremento significativo en el espesor de la oreja (48%), cuando se compararon con los ratones que recibieron vehículo únicamente (acetona) . El hinchamiento tóxico de la oreja causado por el aceite de crotón no fue afectado significativamente en ratones pretratados con Acm anti-al o~ anti-a2 cuando se compararon con los animales tratados con PBS o Acm control (Figura 5) . El examen histológico de las orejas tratadas con aceite de crotón no reveló diferencias en los números o tipos de células infiltrantes o la formación de edema en ratones tratados con Acm anti-al o anti-a2, en comparación con los ratones tratados con Acm control o los ratones tratados con PBS (no se muestran los datos) .

Ejemplo 6 Inhibición de la artri tis por alßl y a2ßl . Puesto que la alßl es también expresada sobre células infiltrantes en el sinovio de pacientes artríticos, decidimos examinar si los Acm anti-al o anti-a2 serían inhibidores del modelo acelerado de artritis previamente descrito (Terato et al. 1992 J. Immunol . 148:2103-2108; Terato et al. 1995 Autoimmuni ty. 22:137-147) . Se compraron equipos de anticuerpo Artrogen-CIA de Stratagene (La Jolla, CA) y se indujo la artritis utilizando un protocolo bien establecido (Terato et al. 1992 J. Immunol . 148:2103-2108; Terato et al. 1995 Autoimmuni ty. 22:137-147). De manera breve, la artritis fue inducida a través de una inyección i.p. de un cóctel de 4 Acm anti-colágeno del tipo II (1 mg de cada uno) el d 0, seguida por la inyección i.p. de 50 ug de LPS el d 3. Durante el curso de los siguientes 3-4 d, los ratones desarrollaron codillos, tobillos y dedos hinchados. Se administró i.p. Acm terapéutico control (250 ug) 4 h antes de la inyección de los Acm anti-colágeno el d 0, y nuevamente 4 h antes de la administración de LPS el d 3, y entonces se continuó cada 3er día durante la duración del experimento. Comenzando el d 3, los ratones fueron evaluados para el desarrollo de artritis. La severidad de la artritis en cada miembro fue valorada utilizando un sistema de cuatro puntos. 0=normal; l=rubor moderado, ligero hinchamiento de los tobillos o codillos; 2=hinchamiento moderado de los tobillos o codillos; 3=hinchamiento severo incluyendo algunos dedos, tobillos y patas; 4=inflamado al máximo. La artritis severa en ratones Balb/c se desarrolló dentro de 72 h después de la inyección de LPS y persistió durante más de 3 semanas. Ni la inyección de Acm anticolágenos sola ni la LPS sola indujeron la artritis. Los ratones que recibieron tratamiento con Acm control presentaron artritis igualmente severa que la observada en los ratones tratados con PBS (Figura 6) . En contraste, el tratamiento con Acm anti-al solo dio como resultado una reducción marcada (78%) en la artritis, durante la duración del experimento. El tratamiento con Acm anti-a2 no tuvo efecto benéfico, dando como resultado una disminución del 32% en el índice artrítico en comparación con los ratones tratados con Acm control. La combinación de Acm anti-al y anti-a2 dio como resultado un grado similar de inhibición de la observada con el Acm anti-al solo.

Ejemplo 7 Análisis histológico del efecto del tratamiento con Acm anti-al y anti-a2 sobre el infil trado celular inflama torio . El análisis histológico adicional de la 5 respuesta de DTH inducida por SRBC confirmó la capacidad del tratamiento con Acm anti-al y anti-a2 para modular la respuesta inflamatoria producida (Figura 7). Una pata no desafiada de un ratón sensibilizado con SRBC (Figura 7, Panel A) virtualmente no mostró infiltrado celular inflamatorio 10 cuando se comparó con la pata desafiada con SRBC del mismo . ratón (Figura 7, Panel B) . El tratamiento del ratón sensibilizado con SRBC con Acm anti-al y anti-a2 solos o combinados redujo en gran medida el número de células infiltrantes encontradas en las patadas desafiadas con CRBC 15 cuando se compararon con los ratones tratados con Acm control (Figura 7, Paneles C-F) . El examen más estrecho de las células infiltrantes reveló que la mayoría de las células estaban compuestas de neutrófilos, con algunos monocitos y linfocitos presentes, y confirmó que el tratamiento con Acm 20 anti-al y anti-a2 hizo disminuir en gran medida el número de esas células (Figura 7, Paneles G-H) .

^^^^^^ Ejemplo 8 Demostración inmunohistoquímica de las células que expresan al en el infil trado celular inflamatorio. Se efectuó la inmunohistoquímica para determinar de manera más precisa la naturaleza de las células infiltrantes y si ellas expresan integrinas que se unan al colágeno (Figura 8). Las células infiltrantes de una pata inflamada de un ratón no tratado fueron examinadas por la expresión de integrina alßl y los marcadores del linaje celular (Figura 8) . Se encontró que la integrina alßl era expresada sobre muchos leucocitos infiltrantes (Figura 8 A) . Se utilizó un inmunohistoquímica doble para identificar la naturaleza de las células infiltrantes y la distribución de la expresión de alßl (Figura 8 B) . Utilizando marcadores del linaje celular, se encontró que el infiltrado estaba compuesto en gran medida de granulocitos/monocitos (Mac-1+), con muchas de esas células siendo neutrófilos (Grl+) , junto con un número más pequeño de linfocitos T (CD3+) (Figura 8 B) . La expresión de la integrina alßl fue encontrada entre los tres subconjuntos de células, con la al expresada sobre un subconjunto de granulocitos/monocitos -1+, un subconjunto de neutrófilos Grl+, y sobre la mayoría de los linfocitos T CD3+ infiltrantes (Figura 8 B) . El análisis inmunohistoquímico detallado reveló que aunque el tratamiento con Acm anti-al y anti-a2 redujo el número de células infiltrantes, no se observó cambio en la composición celular del infiltrado (no se muestran los datos) . La tinción con inmunohistoquímica con un Acm anti-hámster con FITC confirmó la capacidad de los Acm anti-al y anti-a2 para localizar la pata inflamada (no se muestran los datos) .

Ejemplo 9 Inhibición de la artri tis por Acm para alßl y a2ßl y en ra tones deficientes en al . Puesto que la alßl está bien expresada sobre células infiltrantes en el sinovio de pacientes artríticos, decidimos examinar si los Acm anti-al o anti-a2 serían inhibidores en un modelo acelerado de artritis previamente descrito (Terato et al. 1992 J. Immunol 148:2103-2108; Terato et al. 1995 Autoimmuni ty 22:137-147). Este modelo implica la inyección de un cóctel de Acm de anticolágeno del tipo II en ratones, seguida más tarde con la administración de LPS, lo que da como resultado el desarrollo de artritis durante los siguientes 3-7 d. A los ratones se les dio Acm cada 3er día comenzando en el d 0, y se valoraron por el desarrollo de artritis cada 3er día. La artritis severa se desarrolló en todos los ratones dentro de 72 h después de la inyección de LPS y persistió durante más de 3 semanas. Ni la inyección de Acm de anti-colágeno solos ni LPS solo indujo ---•-"'•" la artritis. Los ratones que recibieron tratamiento con Acm control presentaron artritis igualmente severa que la observaron en los ratones tratados con PBS (Figura 9 A) . En contraste, el tratamiento con Acm anti-al solo dio como resultado una reducción marcada (79% y mayor) en la artritis, durante la duración del experimento. El tratamiento con Acm anti-a2 solo también tubo un efecto benéfico, dando como resultado una disminución de 37% del índice artrítico en comparación con los ratones tratados con Acm control. La combinación de actividad anti-al y anti-a2 dio como resultado un grado similar de inhibición con el observado con anti-al solo. La reducción del índice artrítico con tratamiento con Acm anti-al fue observada en todos los ratones y se compara favorablemente con varios otros tratamientos basados en Acm para la artritis tales como la proteína de fusión Ig receptora de TNF soluble (Mori et al. J. Immunol . 157:3178-3182), anti-Mac-1 (Taylor et al. 1996 Immunology. 88:315-321), anti-a4 (Seiffge 1996- J. Rheuma tol . 23:2086-2091), y anti-ICAM-1 (Kakimoto et al. 1991 Cell Imunol . 142:326-337) (Figura 9A) . De acuerdo con los datos basados en el Acm que muestran un papel importante para la alßl en la artritis, los ratones deficientes en al no tratados mostraron una reducción significativa en el índice artrítico cuando se compararon con ratones silvestres (Figura 9 B) .

Ejemplo 10 Efecto del tra tamiento con Acm anti -al sobre la inmunopa tología de las arti culaciones artrí ti cas . Las articulaciones de ratones artríticos silvestres (día 8) que recibieron Acm control o tratamiento con Acm anti-al fueron comparados visual e histológicamente con articulaciones de un ratón no tratado normal (Figura 10) . Visualmente, las articulaciones de los ratones tratados con Acm control demostraron rubosidad e hinchamiento en toda la pata incluyendo los dedos, mientras que los ratones tratados con Acm anti-al 'mostraron pocos, si los había, signos de inflamación en las articulaciones o dedos. El examen histológico mostró cambios severos en las articulaciones artríticas tratadas con Acm control, sin infiltración extensiva del tejido subsinovial con células inflamatorias, adherencia de células a la superficie de la articulación y destrucción marcada del cartílago de acuerdo a lo evidenciado por la pérdida del proteoglicano (Figura 10) . Consistente con los reportes anteriores (Terato et al. 1992 J. Immunol 148:2103-2108; Terato et al. 1995 Autoimmuni ty 22:137-147) , la mayoría de las células infiltrantes en este modelo son neutrófilos. El tratamiento con Acm anti-al de ratones redujo dramáticamente la cantidad de infiltrado inflamatorio y el grado de destrucción de cartílago (Figura 10) .

Ejemplo 11 El desarrollo de la artri tis es retardado en ausencia de linfoci tos y la inhibición de la artri tis por Acm anti -al ocurre en ausencia de linfoci tos. Para determinar cuales tipos de células pueden ser importantes en el modelo de artritis inducida por Acm de colágeno, comparamos la capacidad de ratones B6-129 silvestres y ratones B6-129 deficientes en RAG-1 para desarrollar artritis (Figura 11) .

La supresión genética del gen RAG-1 (gen 1 activante de la recombinación) da como resultante una pérdida completa de linfocitos T y B maduros (Momaerts et al. 1992 CelJ 68:869-877) . Tanto los ratones silvestres como deficientes en RAG-1 desarrollaron artritis, aunque la cinética de inducción en los ratones deficientes en RAG-1 es significativamente más lenta (Figura 11). Esos resultados sugieren que aunque los linfocitos que están implicados en este modelo de artritis, no sin requeridos para el desarrollo o progreso de la enfermedad. Reportes publicados que examinan el efecto de ratones deficientes en RAG-1 en otros modelos de artritis también encontraron que la pérdida de linfocitos T y B retrasó la aparición de la artritis (Plows et al. 1999 J. Immunol . 162:1018-1023). El tratamiento de ratones silvestres o deficientes en RAG-1 con Acm anti-al inhibió completamente la artritis (Figura 11) . Esos resultados demuestran que la efectividad del Acm anti-al en este modelo no depende de la presencia de linfocitos, y que de acuerdo a lo sugerido por experimentos anteriores (Figura 9), la eficacia del Acm anti-al en la prevención de la enfermedad puede ser a través de su acción sobre otras células que expresan al, tales como los macrófagos y neutrófilos.

Ejemplo 12 Respuesta a la dosis de la inhibición de la artri tis por el Acm anti -al . Dados los efectos extraños del tratamiento con Acm anti-al sobre la prevención de la artritis, extendimos esos estudios para incluir un análisis de respuesta a la dosis (Figura 12) . Se administran i.p. dosis de Acm cada 3er día comenzando en el día 0. De acuerdo con los primeros datos, una dosis de 250 ug de Acm anti-al da como resultado una prevención casi completa de la artritis. Una dosis menor de 100 ug de Acm de Acm anti-al fue parcialmente efectiva en la prevención de la artritis en este M^^'^w modelo, mientras que dosis menores no tuvieron ningún efecto discernible sobre el índice artrítico (Figura 12) .

Ejemplo 13 El tra tamiento terapéuti co con el Acm anti -al puede hacer disminuir el índice artrí tico . Dada la efectividad del Acm anti-al en la prevención de la artritis, intentamos tratar ratones que se encuentran en vía de desarrollar la enfermedad. La artritis fue inducida en los ratones mediante la inyección de un cóctel de Acm anti-colágeno del tipo II el día 0, seguida por la administración de LPS el día 3. Los ratones fueron entonces tratados con Acm anti-al o proteína de fusión Ig receptora de TNF soluble comenzando el día 4. El progreso de la artritis fue bloqueado completamente en ratones que recibieron Acm anti-al comenzando el día 4, cuando se compararon con ratones que recibieron Acm de hámster control comenzando el día 4 (Figura 13) . El grado de inhibición observado con la administración terapéutica de Acm anti-al fue completo y fue igual al observado con el tratamiento preventivo de Acm anti-al (comenzado el día 0) (Figura 13) . En comparación, el tratamiento con proteína de fusión Ig receptora de TNF desde el día 4 en adelante dio como resultado únicamente una inhibición del 60-70% en el índice artrítico cuando se comparó con la proteína de fusión Ig control (Figura 13) . El tratamiento combinado de Acm anti-al y fusión de Ig receptora de TNF juntas fue efectivo para inhibir completamente el índice artrítico, lo cual no es sorprendente dada la total efectividad del tratamiento con Acm anti-al solo en la supresión de la artritis. En resumen, esos resultados indican que el tratamiento terapéutico con Acm anti-al es efectivo para inhibir el índice artrítico, y se compara de manera favorable con el tratamiento terapéutico con antagonista del TNF.

Ejemplo 14 Clonación y mutagénesis del dominio anti -al . Las secuencias del dominio I de la integrina alßl humana y de rata fueron amplificadas a partir de ADNc de longitud completa (Kern, et al. (1991) J. Biol . . Chem . 269, 22811-22816; Ignatius et al. (1990) J. Cell . Vol. 111, 709-720) por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Equipo PCR CORE; Boehringer Mahhheim,- GMBH Alemania), utilizando cebadores específicos de humano (5'-CAGGATCCGTCAGCCCCACATTTCAA-3' [hacia delante]; 5'-TCCTCCGAGGGCTTGCAGGGCAAATAT-3' [inverso] ) o específico de rata [5' - CAGGATCCGTCAGTCCTACATTTCAA-3' (hacia delante]; 5'-TCCTCGAGCGCTTCCAAAGCGAATAT-3' [inverso] . Los productos amplificados por PCR resultantes fueron purificados, ligados en pGEX4t-i (Pharmacia), y transformados en células DH5a competentes (Life Technologies) . Las colonias resistentes a la ampicilina fueron separadas por la expresión de la proteína de fusión glutation S-transferasa del dominio I de -45 kDa. Las secuencias de los insertos del ADN plasmídico de las clonas que fueron seleccionadas para la caracterización adicional fueron confirmadas por secuenciamiento de ADN. Se generó un dominio I de al quimérico de rata/humano (R?H) (equipo de mutagénesis MORPH; cebador 5 -cebador 3), intercambiando los residuos de rata G92, R93, Q94, y L97 (Figura 14) por los residuos humanos correspondientes, V, Q, R y R, respectivamente. Las clonas que alojan el dominio I de R?H fueron identificadas por la pérdida de el sitio enzimático de restricción Stu 1 de diagnóstico, y los insertos se confirmaron con secuenciamiento de ADN. La secuencia de aminoácidos del dominio I de la al humana se muestra en la Figura 15.

Ejemplo 15 Generación de Acm específi cos para el dominio I de al . Los anticuerpos monoclonales han probado ser sondas muy útiles en el estudio de la relación entre la estructura y función de las subunidades de la integrina. Por ejemplo, los Acm fueron utilizados exhaustivamente para estudios de las regiones de la subunidad ßl asociada con la conformación activada (Qu, A., y Leahy, D J. (1996) Structure 4, 931-942). De este modo, para identificar sondas potenciales por cambios conformacionales del dominio I de al, generamos un panel de Acm para el dominio I de la al humana.

Generación de Anticuerpos Monoclonales del Dominio I de Anti-al . Se inmunizaron intraperitonealmente (i.p.) ratones Robert sonianos hembra (Jackson Labs) con 25 µ g de alßl humana purificada (Edwards et al. (1995) J. Biol . . Chem . 270, 12635-12640) emulsificada con adyuvante de Freund completo (LifeTechnologies) . Ellos fueron reforzados tres veces i.p. con 25 µg de alßl emulsificada con adyuvante de Freund incompleto (LifeTechnologies) . El ratón con el título del dominio I del anti-al mayor fue reforzado i.p. con 100 µg de alßl tres días antes de la fusión, e intravenosamente con 50 µg de alßl un día antes de la fusión. Las células de bazo fueron fusionadas con células de mieloma FL653 a una relación de 1 : 6 y fueron cultivadas a 100,000 y 33,000 por pozo en placas de cultivo tisular de 96 pozos. Los sobrenadantes fueron evaluados para la unión del integrina alßl por FACS de un solo color. Antes del análisis por FACS, los sobrenadantes fueron incubados con células K562 no transfectadas para eliminar la IgG que se unió únicamente a la unidad ß. Posteriormente, se transfectaron 3-5 X 104 células K562 con una subunidad de integrina al (K562-al) suspendida en amortiguador de FACS (suero de carnero fetal al 1%) (FCS) en PBS que contenía NaN3 al 0.5%) se incubaron con sobrenadante durante 45 minutos a 4°C, se lavaron e incubaron con anti-IgG de ratón conjugado con ficoeritrina. Después de lavar dos veces con amortiguador de FACS, las células fueron analizadas en un citómetro de flujo Becton Dickinson. Los sobrenadantes de los hibridomas resultantes fueron separados por la unión del dominio I de al . de manera breve, se recubrieron 50 µl de fusión del dominio I de al humano-GST 30 µg/ml en PBS sobre los pozos de una placa de 96 pozos (Nunc) durante la noche a 4°C. Las placas fueron lavadas con PBS, bloqueadas con BSA al 1% en PBS y el sobrenadante del hibridoma fue incubado con el dominio I a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de un lavado exhaustivo con PBS que contenía Tween 20 al 0.03%, se agregó anti-IgG de ratón ligada con fosfatasa alcalina (Jackson ImmunoResearch) durante una hora adicional. Después del lavado final, se agregó 1 mg/ml p-nitrofenilfosfato (pNPP) en glicina 0.1 M; ZnCl2 1 mM, y MgCl2 1 mM durante 30 minutos a temperatura ambiente, y las placas fueron leídas a una D.O. de 405. Los sobrenadantes seleccionados fueron probados por su capacidad para inhibir la adhesión dependiente de K562-al del Colágeno IV. Las células K562-al fueron marcadas con penta acetiloximetiléster del 2 ' , 1 ' (bis-2-carboxietil-5- y 6) carboxifluoresceína (BCECF; Molecular Probes) en DMEM que contenía BSA al 0.25% a 37°C durante 30 minutos. Las células marcadas fueron lavadas con amortiguador de unión (Hepes 10 mM, ph 7.4; NaCl al 0.9%; y glucosa al 2%) y resuspendidas en amortiguador de unión más MgCl2 5 mM a una concentración final de 1 X 106 células/ml. Se incubaron 50 µl de sobrenadante con un volumen igual de 2 X 105 células K562-al en los pozos de una placa de 96 pozos. La placa fue entonces centrifugada y los sobrenadantes removidos. Las células fueron resuspendidas en amortiguador de unión y transferidas a pozos de una placa recubierta con colágeno e incubadas durante 1 hora a 37 °C. Después de la incubación, las células no adherentes fueron removidas lavando tres veces con amortiguador de unión. Las células unidas fueron analizadas en un Cytofluor (Millipore) . Identificamos inicialmente 19 hibridomas, los sobrenadantes de los cuales se unieron a células K562 de leucemia humana que expresa la integrina alßl (K562-al) y al . ^F¡se-f£ftFy.X dominio I de al . Las inmunoglobulinas fueron purificadas de cada uno de esos hibridomas y probadas por la capacidad para bloquear cualquier unión a cada K562-al o dominio I de al al colágeno IV. Los Acm caen en dos clases; aquéllos que bloquean y aquéllos que no bloquean la función de alßl. Por ejemplo, aunque los Acm producidos por las clonas AEF3, BGC5 y AJH10 se unen al dominio I de al (Figura 16A, no se muestran datos para BGC5), únicamente el Acm AJH10 inhibe la adhesión dependiente del dominio I de al (Figura 16B) o K562-al (Figura 16C) al colágeno IV. Secuenciamiento de las Regiones que Determinan la Complementaridad. Para establecer el origen clonal de este panel de Acm, amplificamos por PCR y secuenciamos las CDR de 12 de los 19 anticuerpos (no se muestran los datos) . 2 µg de ARNm, aislados de 107 hibridomas (equipo de aislamiento de ARNm FastTrack, Invitrogen), fueron transcritos de manera inversa (Equipo Listo para Obtener Tu Primer Hebra de Cebador, Pharmacia Biotech) utilizando 25 pM de cada uno de los siguientes cebadores: VHIFOR-2 de cadena pesada Michishita et al. (1993) Cell 72, 857-867); cadena ligera, VK4FOR, que define cuatro oligos separados (Kern et al. (1994) J. Biol . Chem. 269, 22811-22816). Por cada hibridoma, las cadenas pesada y ligera fueron amplificadas en cuatro regiones PCR separadas utilizando varias combinaciones de los siguientes oligos: 1) cadena pesada: VH1FR1K (Kamata et al. (1995) J. of Biol . Chem. 270, 12531-12535), VH1BACK, VH1BACK (Baldwin et al. (1998) Structure 6, 923-935), VHfrla, VHfrlb, VHfrle, VHfrlf, VHfrlg (Ignatius et al. I (1990) J. Cell Biol . 111, 709-720), o VH1FOR-2 (Michishita, M., Videm, V., y Arnaout, M. A. (1993) Cell 12 , 857-867); 2) Cadena ligera: VK1BACK (Baldwin et al. (1998) Structure 6, 923-935), oligos VK4FOR, VK2BACK (Kern et al. (1994) J. Biol . Chem. 269, 22811-22816), o V?frla, VHfrlc, VHfrle, VHfrlf (Ignatius et al. (1990) J. Cell Biol . 111, 709-720). Los productos fueron amplificados (5 min a 95°C, 50 ciclos de 1 min a 94 °C, 2 min a 55°C, 2 min a 72°C, y un ciclo final de 10 min a 72°C), purificado sobre gel (QIAquick, Qiagen), y secuenciados directamente utilizando varios de los oligos listados sobre un Secuenciador ABI 377. Las secuencias de los clones que producen Acm bloqueadores de la función fueron casi idénticas a través de todas las reacciones que determinan la complementaridad (CDR) y las regiones estructurales intervinientes sugiriendo que esos hibridomas están clonalmente relacionados.

Ejemplo 16 Inmunoelectrotransferencia y Análisis FACS. Las secuencias de las regiones variables de los anticuerpos bloqueadores fueron notablemente diferentes de la familia clonalmente relacionada de secuencias encontradas para los anticuerpos bloqueadores. Puesto que los anticuerpos bloqueadores parecen originarse de un solo clon, elegimos uno (AJH10) para caracterizarlo aún más.

Electroinmunotransferencia. Se disecó la capa celular de músculo liso de aorta de oveja, y se extrajeron las células K562-al con Tritón X-100 al 1% en Hepes 50 M, pH 7.5, NaCl 150 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 10 mM (PMSF), 20 µg/ml de aprotinina, 10 µg/ml de leupeptina, ácido etilendiaminotetraacético 10 mM (EDTA) . Se sometieron muestras al gradiente de 4-20% de DSD-PAGE, y se electroinmunotransfirieron sobre membranas de nitrocelulosa. Las manchas fueron bloqueadas con 5% de leche seca en TBS; lavadas en TBS que contenía Tween-20 al 0.03%, y se incubaron con anticuerpos en amortiguadores de bloqueo que contenía NaN3 al 0.05% durante 2 horas. Las manchas fueron entonces lavadas como antes, incubadas con anti-IgG de ratón conjugada con peroxidasa de rábano durante una hora, lavadas nuevamente y a continuación tratadas con reactivo ECL (Amersham) . Las manchas fueron entonces expuestas a una películas (Kodak) durante 30 a 60 segundos, y reveladas. La inmunoelectrotransferencia (Figura 17A) y el análisis FACS (Figura 17B) demuestran que en AJH10 reacciona ...J.*!! con la integrina alßl humana, de conejo, de oveja, pero no de rata, sugiriendo que los Acm bloqueadores se unen a un epitopo lineal evolutivamente conservado. Los Acm no bloqueadores no fueron eficientes en la electroinmunotransferencia ni reaccionaron con especies diferentes a la humana.

Ejemplo 17 La unión de dominio I de al al colágeno depende de un ca tión divalente A. Purifi cación del dominio I de al . Los dominios I de al fueron expresados en E.coli como proteínas de fusión GST (glutation-S transferasa) que contienen un sitio de escisión de trombina en la unión de las secuencias. El sobrenadante clarificado de las células Usadas en PBS fue cargado sobre una columna de Sefarose 4B con glutatión (Pharmacia) la cual fue lavada exhaustivamente con PBS. La proteína de fusión dominio I de al-GST fue evaluada con Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, glutatión (reducido) 5 mM. Para estudios de desnaturalización, el dominio I fue escindido con trombina en Tris 50 mM, pH 7.5, y purificado del patrón de fusión de GST. Se agregó DTT a 2 mM y la muestra fue cargada sobre una columna de Sefarose 4B con glutatión. El flujo pasante y las fracciones del lavado fueron reunidas y cargadas sobre . una columna de Q Sefarose FF (Pharmacia). El dominio I de al fue evaluado con Tris HCl 50 mM, pH 7.5, mercaptoetanol 10 mM, NaCl 75 mM. El dominio purificado I presentó su masa predicha (Lee et al. (1995) Structure 3, 1333-1340, 871 Da) por espectroscopia de masas con electrorrocío (ESI-MI), migrado como una sola banda por SDS-PAGE, y la proteína eluyó como un solo pico de tamaño apropiado por cromatografía de exclusión por tamaño sobre una columna de Superóse 6 FLPC (Pharmacia) .

B. Análisis Funcional Fueron recubiertas placas de 96 pozos durante la noche a 4°C con 1 µg/ml de colágeno IV (Sigma) o colágeno del Tipo I (Collaborative Biomedical), lavadas con amortiguador de Tritón (Tritón X-100 al 0.1%; MnCl2 1 mM; Tris-HCl 25 M; NaCl 150 mM) , y bloqueadas con seroalbúmina bovina (BSA) al 3% en Tris-HCl 25 mM; NaCl 150 mM (TBS). Se incubaron diluciones en serie de la proteína de fusión dominio I de al-GST en TBS que contenía MnCl2 1 mM y BSA al 3% sobre las placas recubiertas a temperatura ambiente durante 1 hora, y se lavaron en amortiguador de Tritón. El dominio I de al unido fue detectado con diluciones en serie con 10 µg/ml de anticuerpo policlonal anti-GST biotinilado (Pharmacia); ExtrAvidina-peroxidasa de rábano (Sigma) diluido en 1:3000 en TBS que contenía MnCl2 1 mM y BSA al 3%, y ABTS del paso 1 (2, 2' -Azin-di [sulfonato de 3-etilbenztiazolina ] ; Pierce). Las placas fueron leídas a O.D. 405 sobre el lector de microplacas (Molecular Devices) .

Resul tados Los dominios I al de humano y rata (con una identidad de 95% del humano) se expresaron en E. coli como una proteína de fusión con GST y se purificaron sobre sefarose con glutation. Ambas proteínas fueron examinadas uniendo a colágeno I y IV utilizando una variación del ensayo basado en ELISA previamente descrita (Qu, A., y Leahy, D.J. (1995) Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 92, 10277-10281). El dominio I de al humano se une al colágeno IV con mejor eficiencia que el colágeno I (Figura 18A) . Un anticuerpo específico para el dominio I al, pero no un anticuerpo específico para el dominio I de al (Figura 18B) abrogó la unión a ambos ligandos (los datos para el colágeno I no se muestran) . Tanto el Mn2+ como el Mg2+ estimularon la unión, y el EDTA redujo la unión a niveles básales (Figura 18C) . No se detectaron diferencias medibles en la unión de ligando entre los dominios I de al humano y rata sugiriendo que las diferencias de secuencias entre las especies no son funcionalmente revelantes (no se muestran los datos) . De este modo, el dominio I de al, específicamente, requiere un catión para la unión eficiente de ligando.

Ejemplo 18 Un epitopo dependiente de cationes reside cerca del moti vo MIDAS. Explotamos la observación de que el AJH10 reconoce las secuencias del dominio I de al humano, pero no de rata para trazar el mapa del epitopo para los Acm que bloquean la función de la alßl. Las secuencias humanas y de rata difieren únicamente en 12 aminoácidos, 4 de los cuales se encuentran en una extensión de 6 aminoácidos (aa 92-97, Figura 14A) adyacentes a la treonina crítica (Figura 14A, aa 98) dentro del motivo MIDAS. Para probar la hipótesis de que los 6 aminoácidos residuales, Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg, comprende además el epitopo para los Acm bloqueadores, construimos un dominio I quimérico (R?H), intercambiando los residuos de rata G92, R93, Q94, y L97 por los residuos humanos correspondientes, V, Q, R y R, respectivamente. El AJH10, junto con todos los Acm bloqueadores de la función, reconocen el dominio I quimérico (R?H; Figura 14B) . Para orientar esos residuos con respecto al dominio MIDAS en la estructura terciaria del dominio I de al, modelamos el dominio de I de al utilizando las coordenadas de la estructura cristalina del dominio I de a2. Se construyó un modelo de homología del dominio I de la al humana utilizando la estructura cristalina de rayos X del domino I de a2 humano (Ward et al. (1989) Nat?re 341, 544-546) . El modelo se construyó utilizando el módulo de modelaje de homología del Insight II (versión 2.3.5; Biosym Technologies). Se utilizó el programa CHARMM (Clackson et al. (1991) Na ture 352, 624-628) con todos los parámetros del hidrógeno fijados en 22 con una constante dieléctrica dependiente distante de dos veces la distancia de separación del átomo. Primero efectuamos 1000 pasos a la minimización gradual descendente con restricciones de posición armónicas ponderadas por masa de 1 kcal/(mol A2) sobre todos los átomos del dominio I de al. Esta minimización fue seguida por otros pasos de descenso gradual y 5000 pasos de una Base de Newton Raphson Adoptada con restricciones de 0.1 kcal/ (mol Á2) sobre los átomos C-a del dominio I de al para evitar desviaciones significativas de la estructura de cristal de rayos X del dominio I de a2. Las secuencias de las integrinas alßl y a2ßl exhiben una identidad de 51% sin inserciones ni supresiones, sugiriendo que la estructura total de los dos dominios I serán similares. Se predice que el sitio de coordinación del metal será el mismo en el dominio I de al que en el dominio I de a2 y los residuos que comprenden el epitopo para los Acm bloqueadores se encuentran en una vuelta entre la hélice a3 y la hélice a4 que contiene la treonina dentro del motivo MIDAS crítico para la unión del catión. El modelo del dominio I de al predice que el nitrógeno de la amida de Q92 (Figura 14A) une el hidrógeno con el grupo carbonilo de 133, el residuo adyacente a S32. De este modo, la vuelta que contiene el epitopo puede jugar un papel funcional en la estabilización de la región MIDAS. Aunque la invención anterior ha sido descrita con algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para 9 propósitos de claridad y comprensión, será evidente a aquellos expertos en la técnica que serán practicados ciertos cambios y modificaciones. Por lo tanto, la descripción y •ejemplos no deberán constituirse en limitantes del alcance de la invención, la cual es delineada por las reivindicaciones anexas. Se hace constar que con relación a esta fecha, ei mejor método conocido por ia solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es ei que resulta claro de la presente descripción de la invención.

A076pct LISTADO DE SECUENCIA <110> Biogen, Inc. De Fougerolles, Antonin Gotwals, Philip Lobb, Roy Koteliansky, Victor <120> Método para el tratamiento de Tr as e?:._ ; I;. ""i.::atorios <130> A076PCT <140> PCT/USOO/15004 <141> 2000-06-01 <150> 60/185336 <151> 2000-02-29 <150> 60/137038 <151> 1999-06-01 <160> 9 A076pct <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0 <210> 1 5 <211> 26 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 1 10 caggatccgt cagccccaca tttcaa 26 <210> 2 <211> 26 15 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 2 tcctcgaggg cttgcagggc aaatat 20 26 <210> 3 <211> 26 <212> ADN ~_ ^^^a^^áaiai&tt A076pct <213> rat <400> 3 caggatccgt cagtcctaca tttcaa 26 <210> 4 <211> 26 <212> ADN <213> rat <400> 4 tcctcgagcg cttccaaagc gaatat -26 <210> 5 <211> 212 <212> PRT <213> rat <400> 5 Val Ser Pro Thr Phe Gln Val Val Asn Ser Phe Ala Pro Val Gln Glu 1 5 10 15 A076pct Cys Ser Thr Gln Leu Asp He Val He Val Leu Asp Gly Ser Asn Ser 20 25 30 He Tyr Pro Trp Glu Ser Val He Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys 35 40 45 Arg Met Asp He Gly Pro Lys Gln Thr Gln Val Gly He Val Gln Tyr 50 55 60 Gly Glu Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr 65 70 75 80 Glu Glu Val Leu Val Ala Ala Lys Lys He Gly Arg Gln Gly Gly Leu 85 90 95 Gln Thr Met Thr Ala Leu Gly He Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Phe 100 U05 110 Thr Glu Arg Ala Arg Arg Gly Val Lys Lys Val Met Val He Val Thr 115 120 125 Asp Gly Glu Ser His Asp Asn Tyr Arg Leu Lys Gln Val He Gln Asp 130 135 140 Cys Glu Asp Glu Asn He Gln Arg Phe Ser He Ala He Leu Gly His 145 150 155 160 Tyr Asn Arg Gly Asn Leu Ser Thr Glu Lys Phe Val Glu Glu He Lys 165 170 175 Ser He Ala Ser Glu Pro Thr Glu Lys His Phe Phe Asn Val Ser Asp 180 185 190 A076pct Glu Leu Ala Leu Val Thr He Val Lys Ala Leu Gly Glu Arg He Phe 195 200 205 Ala Leu Glu Ala 210 <210> 6 <211> 212 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 6 Val Ser Pro Thr Phe Gln Val Val Asn Ser He Ala Pro Val Gln Glu 1 5 . 10 15 Cys Ser Thr Gln Leu Asp He Val He Val Leu Asp Gly Ser Asn Ser 20 25 30 He Tyr Pro Trp Asp Ser Val Thr Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys 35 40 45 Arg Met Asp He Gly Pro Lys Gln Thr Gln Val Gly He Val Gln Tyr 50 55 60 Gly Glu Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr 65 70 75 80 Glu Glu Val Leu Val Ala Ala Lys Lys He Val Gln Arg Gly Gly Arg 85 90 95 A076pCt Gln Thr Met Thr Ala Leu Gly Thr Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Phe 100 105 110 Thr Glu Arg Ala Arg Arg Gly Val Lys Lys Val Met Val He Val Thr 115 120 125 Asp Gly Glu Ser His Asp Asn His Arg Leu Lys Lys Val He Gln Asp 130 135 140 Cys Glu Asp Glu Asn He Gln Arg Phe Ser He Ala He Leu Gly Ser 145 150 155 160 Tyr Asn Arg Gly Asn Leu Ser Thr Glu Lys Phe Val Glu Glu He Lys 165 170 175 Ser He Ala Ser Glu Pro Thr Glu Lys His Phe Phe Asn Val Ser Asp 180 * 185 190 Glu Leu Ala Leu Val Thr He Val Lys Thr Leu Gly Glu Arg He Phe 195 200 205 Ala Leu Glu Ala 210 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> rat A076pct <400> 7 Gly Arg Gln Gly Gly Leu 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 8 Val Gln Arg Gly Gly Arg 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 9 Val Gln Arg Gly Gly Arg 1 5

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. El uso de un anticuerpo bloqueador o un fragmento del anticuerpo, capaz de unirse a un epitopo de VLA-1, donde el epitopo comprende los aminoácidos residuales 92-97 de la Figura 15, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de artritis.
2. 2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, donde la disminución en el índice artrítico es de aproximadamente 65% o más cuando se compara con un sujeto tratado con un anticuerpo control.
3. 3. El uso de conformidad con la reivindicación 1, donde la disminución en el índice artrítico es de aproximadamente 79% o más.
4. 4. El uso de conformidad con la reivindicación 1, donde la disminución en ~ el índice artrítico es de aproximadamente 85% o más.
5. 5. El uso de conformidad con la reivindicación 1, donde la disminución en el índice artrítico es de aproximadamente 90% o más.
6. 6. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el anticuerpo es monoclonal.
7. 7. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el sujeto es un humano.
8. 8. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el sujeto sufre de artritis reumatoide .