ES2557768T3

ES2557768T3 - Un anticuerpo monoclonal bloqueante frente a VLA-1 y su uso para el tratamiento de trastornos inflamatorios

Info

Publication number: ES2557768T3
Application number: ES04018151.3T
Authority: ES
Inventors: Antonin R. De Fougerolles; Victor E. Kotelianski
Original assignee: Biogen MA Inc
Current assignee: Biogen MA Inc
Priority date: 1999-06-01
Filing date: 2000-06-01
Publication date: 2016-01-28
Anticipated expiration: 2020-06-01
Also published as: CY1116042T1; ES2529706T3; BG65579B1; JP2004500328A; HK1043320A1; NO20015864D0; CA2375827C; IS6179A; MXPA01012388A; EE200100651A; EP2314315A1; CN1309419C; HUP0202568A3; HK1154352A1; CA2375827A1; TR200103432T2; US8084031B2; US20120087925A1; CZ300710B6; JP5960762B2

Abstract

Un anticuerpo o un fragmento de dicho anticuerpo, capaz de 1) unirse a un dominio α1-I de VLA-1, y 2) capaz de inhibir la adhesión dependiente de K562-α1 al colágeno IV, para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio en una enfermedad vascular en un sujeto.

Description

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fragmentos, son el agente de unión preferido en el método de la invención.

Tal como se emplea en la presente, la expresión “homólogo de anticuerpo” incluye anticuerpos intactos que consisten en cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina unidas a través de enlaces disulfuro. La expresión “homólogo de anticuerpo” también pretende incluir una proteína que comprende uno o más polipéptidos seleccionados de cadenas ligeras de inmunoglobulina, cadenas pesadas de inmunoglobulina, y sus fragmentos de unión al antígeno, que son capaces de unirse a uno o más antígenos (es decir, subunidades de integrina que contienen dominios 1, 2, 6 o alfa-I). Los componentes polipeptídicos de un homólogo de anticuerpo compuesto por más de un polipéptido pueden estar opcionalmente unidos a través de enlaces disulfuro o entrecruzados covalentemente de otra forma.

Por consiguiente, los “homólogos de anticuerpos” incluyen inmunoglobulinas intactas de los tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como sus subtipos), en las que las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de tipo kappa o lambda.

Los “homólogos de anticuerpos” también incluyen porciones de anticuerpos intactos que conservan su especificidad de unión al antígeno, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos F(ab’)2, fragmentos F(v), monómeros o dímeros de cadenas pesadas, monómeros o dímeros de cadenas ligeras, dímeros que consistente en una cadena pesada y una cadena ligera, y similares. Así, los fragmentos de unión al antígeno, así como los polipéptidos diméricos o triméricos de longitud completa derivados de los anticuerpos descritos anteriormente, también son útiles en sí mismos.

Tal como se emplea en la presente, un “homólogo de anticuerpo humanizado” es un homólogo de anticuerpo, producido mediante la tecnología del ADN recombinante, en el que algunos o todos los aminoácidos de la cadena ligera o pesada de inmunoglobulina humana que no son necesarios para la unión al antígeno han sido sustituidos por los correspondientes aminoácidos procedentes de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina de mamífero no humano.

Tal como se emplea en la presente, un “homólogo de anticuerpo quimérico” es un homólogo de anticuerpo, producido mediante la tecnología del ADN recombinante, en el que todas o partes de las regiones bisagra y constantes de una cadena ligera de inmunoglobulina, una cadena pesada de inmunoglobulina, o ambas, han sido sustituidas por las correspondientes regiones de otra cadena ligera o cadena pesada de inmunoglobulina. En otro aspecto, la invención incluye un variante de una molécula quimérica, que incluye: (1) un resto dirigido a integrinas;

(2) opcionalmente, un segundo péptido, por ejemplo, un péptido que aumente la solubilidad o la semivida in vivo del resto dirigido a integrinas, por ejemplo, un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, o uno de sus fragmentos o porciones, por ejemplo, un fragmento o una porción de IgG, por ejemplo, la región constante de la cadena pesada de IgG1 humana, por ejemplo, las regiones bisagra CH2 y CH3; y un resto de toxina. La molécula quimérica puede utilizarse para tratar un sujeto, por ejemplo, un ser humano, que esté en riesgo de padecer un trastorno relacionado con la proliferación de células epiteliales, tales como folículos capilares y similares.

Tal como se emplea en la presente, un “homólogo de anticuerpo humano” es un homólogo de anticuerpo, producido mediante la tecnología del ADN recombinante, en el que todos los aminoácidos de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina se derivan de una fuente humana.

Tal como se emplea en la presente, un “trastorno inflamatorio” incluye, pero no se limita a trastornos, tales como trastornos relacionados con la piel, como psoriasis, eccema, quemaduras y dermatitis. Otros trastornos inflamatorios contemplados para el tratamiento según los métodos descritos en la presente incluyen, pero no se limitan al tratamiento del asma, bronquitis, calambres menstruales, tendinitis, bursitis, y el tratamiento del dolor y las cefaleas,

o como antipirético para el tratamiento de la fiebre. Los métodos descritos en la presente también serían útiles para tratar trastornos gastrointestinales, tales como la enfermedad del intestino inflamatoria, enfermedad de Crohn, gastritis, síndrome del intestino irritable y colitis ulcerosa, y para la prevención del cáncer colorrectal. Los métodos descritos en la presente serían útiles para tratar trastornos inflamatorios en enfermedades tales como enfermedades vasculares, cefaleas migrañosas, periartiritis nodosa, tiroiditis, anemia aplásica, enfermedad de Hodgkin, fiebre reumática, diabetes de tipo I, miastenia grave, esclerosis múltiple, sarcoidosis, síndrome nefrótico, síndrome de Behcet, polimiositis, gingivitis, hipersensibilidad, conjuntivitis, hinchamiento después de lesiones, isquemia miocárdica y similares. Los métodos descritos en la presente también son útiles para el tratamiento de la rinitis alérgica, síndrome de insuficiencia respiratoria, síndrome de choque por endotoxinas y aterosclerosis.

En una realización preferida, los métodos descritos en la presente son útiles para el tratamiento de la artritis que incluye, por ejemplo, la artritis reumatoide y la osteoartritis.

Una “cantidad eficaz” es una cantidad suficiente para lograr resultados clínicos beneficiosos o deseados. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. En términos de tratamiento de un trastorno inflamatorio, una “cantidad eficaz” de un anticuerpo anti-integrina es una cantidad suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, frenar o retrsar el avance de un trastorno relacionado con la inflamación según los estándares clínicamente aceptables para los trastornos que se van a tratar o para objetivos cosméticos. La detección y la medición de indicadores de la eficacia puede realizarse mediante una serie de herramientas de diagnóstico

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disponibles, que incluyen, pero no se limitan, por ejemplo, a un examen físico, que incluye pruebas sanguíneas, pruebas de la función pulmonar y rayos X del pecho; barrido de CT; broncoscopía; lavado broncoalveolar; biopsia de pulmón y barrido de CT.

La tecnología para producir anticuerpo monoclonales que incluyen, por ejemplo, anticuerpo monoclonales antiintegrina, es muy conocida. Véase, por ejemplo, Mendrick et al., 1995, Lab. Invest., 72:367-375 (mAb contra antiα1β1 y anti-α2β1 murinos); Sonnenberg et al., 1987, J. Biol. Chem., 262:10376-10383 (mAb contra anti-α6β1 murino); Yao et al., 1996, J. Cell Sci., 1996 109:3139-3150 (mAb contra anti-α7β1 murino); Hemler et al., 1984, J. Immunol., 132:3011-3018 (mAb contra α1β1 humano); Pischel et al., 1987, J. Immunol., 138:226-233 (mAb contra α2β1 humano); Wayner et al., 1988, J. Cell Biol., 107:1881-1891 (mAb contra α3β1 humano); Hemler et al., 1987, J. Biol. Chem., 262:11478-11485 (mAb contra α4β1 humano); Wayner et al., 1988, J. Cell Biol., 107:1881-1891 (mAb contra α5β1 humano); Sonnenberg et al., 1987, J. Biol. Chem., 262:10376-10383 (mAb contra α6β1 humano); A. Wang et al., 1996, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 15:664-672 (mAb contra α9β1 humano); Davies et al., 1989, J. Cell Biol., 109:1817-1826 (mAb contra αVβ1 humano); Sánchez-Madrid et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:74897493 (mAb contra αLβ1 humano); Diamond et al., 1993, J. Cell Biol., 120:1031-1043 (mAb contra αMβ2 humano); Stacker et al., 1991, J. Immunol., 146:648-655 (mAb contra αXβ2 humano); Van der Vieren et al., 1995, Immunity, 3:683-690 (mAb contra αDβ2 humano); Bennett et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2417-2421 (mAb contra αIIbβ3 humano); Hessle et al., 1984, Differentiation, 26:49-54 (mAb contra α6β4 humano); Weinacker et al., 1994, J. Biol. Chem., 269:6940-6948 (mAb contra αVβ5 humano); Weinacker et al., 1994, J. Biol. Chem., 269:6940-6948 (mAb contra αVβ6 humano); Cerf-Bensussan et al., 1992, Eur. J. Immunol., 22:273-277 (mAb contra αEβ7 humano); Nishimura et al., 1994, J. Biol. Chem., 269:28708-280715 (mAb contra αVβ8 humano); Bossy et al., 1991, EMBO J., 10:2375-2385 (antisuero policlonal contra α8β1 humano); Camper et al., 1998, J. Biol. Chem., 273:20383-20389 (antisuero policlonal contra α10β1 humano).

En general, una línea celular inmortal (generalmente células de mieloma) se fusiona con linfocitos (generalmente esplenocitos) procedentes de un mamífero inmunizado con células completas que expresan un antígeno concreto, por ejemplo, una integrina, y los sobrenadantes del cultivo de las células de hibridoma resultantes se seleccionan para anticuerpos contra el antígeno, Véase, en general, Kohler et al., 1975, Nature, 265:295-497, “Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity”.

La inmunización puede lograrse empleando procedimientos convencionales. La dosis unitaria y el régimen de inmunizacón dependen de la especie de mamífero inmunizado, su estado inmunológico, el peso corporal del mamífero, etc. Generalmente, los mamíferos inmunizados se sangran, y el suero de cada muestra de sangre se ensaya para anticuerpos concretos empleando los ensayos de selección apropiados. Por ejemplo, los anticuerpos anti-integrina pueden identificarse mediante inmunoprecipitación de lisados de celulas marcadas con 125I a partir de células que expresan integrinas. Los anticuerpos, que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-integrina, también pueden identificarse mediante citometría de flujo, por ejemplo, midiendo la tinción fluorescente de células que expresan anticuerpos incubadas con el anticuerpo que se cree que reconoce las moléculas de integrina. Los linfocitos empleados para la producción de células de hibridoma generalmente se aislan a partir de mamíferos inmunizados, cuyo suero ya ha dado positivo para la presencia de anticuerpos anti-integrina empleando estos ensayos de selección.

Generalmente, la línea celular inmortal (por ejemplo, una línea de células de mieloma) se deriva de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Las líneas celulares inmortales preferidas son líneas de células de mieloma de ratón que son sensibles a un medio de cultivo que contenga hipoxantina, aminopterina y timidina (“medio HAT”). Generalmente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan con esplenocitos de ratón empleando polietilenglicol de peso molecular 1500 (“PEG 1500”). Las células de hibridoma resultantes de la fusión después se seleccionan empleando medio HAT, que mata las células no fusionadas y las células de mieloma fusionadas de forma no productiva (los esplenocitos no fusionados mueren varios días después porque no están transformados). Los hibridomas que producen un anticuerpo deseado se detectan seleccionando los sobrenadantes de los cultivos de los hibridomas. Por ejemplo, los hibridomas preparados para producir anticuerpos anti-integrina pueden seleccionarse ensayando el sobrenadante del cultivo del hibridoma para anticuerpos segregados que tengan la capacidad de unirse a una línea celular que expresa una integrina recombinante.

Para producir homólogos de anticuerpos que incluyen, por ejemplo, homólogos de anticuerpos anti-integrina, que son inmunoglobulinas intactas, se cultivan células de hibridoma que han puntuado como positivas en estos ensayos de selección, en un medio nutriente bajo condiciones y durante un tiempo suficiente como para permitir que las células de hibridoma segreguen los anticuerpos monoclonales hacia el medio de cultivo. Las técnicas de cultivo de tejidos y los medios de cultivo adecuados para las células de hibridoma son muy conocidos. El sobrenadante del cultivo de hibridoma condicionado puede recogerse, y los anticuerpos anti-integrina después pueden purificarse opcionalmente mediante métodos muy conocidos.

Como alternativa, el anticuerpo deseado puede producirse inyectando las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón no inmunizado. Las células de hibridoma proliferan en la cavidad peritoneal, segregando el anticuerpo que se acumula como fluido de ascitis. El anticuerpo puede recolectarse extrayendo el fluido de ascitis de la cavidad peritoneal con una jeringa.

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20:25-44), GoH3 (anti-CD49f de rata; integrina 6) (Sonnenberg et al., 1987, J. Biol. Chem., 262:10376-10383), y los mAb de control de isotipo de rata R35-95 (IgG2a de rata) y R35-38 (IgG2b de rata).

Ensayo de adhesión: Se cultivaron esplenocitos de ratones Balb/c con IL-2 20 ng/ml durante 7-12 días. La adhesión de las células al colágeno de tipo I y de tipo IV fue como previamente se ha descrito (Gotwals et al., 1996, J. Clin. Invest., 97:2469-2477). Brevemente, placas Maxisorp de 96 pocillos (Nunc, Napierville, IL) fueron revestidas con 10 g/ml de colágeno de tipo IV o 5 g/ml de colágeno de tipo I, y los sitios no específicos fueron bloqueados con BSA al 1%. Los esplenocitos activados con IL-2 fueron marcados con BCECF [2′,7′-bis(carboxietil)5(6)carboxilfluoresceinpentaacetoximetil éster] 2 M (Molecular Probes, Eugene, OR) y se incubaron con 10 g/ml de los mAb indicados durante 15 min. Después se añadieron 105 células en BSA al 0,25% en RPMI a los pocillos revestidos y se incubó durante 60 min a 37 ºC. Las células no unidas se eliminaron lavando tres veces con BSA al 0,25% en RPMI. La adhesión se cuantificó empleando un lector de placas fluorescente CytoFluor 2350 (Millipore, Bedford, MA). La proporción de células unidas a células añadidas se midió, y se calculó el porcentaje de adhesión relativa a las células tratadas con mAb control (normalizado al 100%). Se restaron los valores de fondo debido a la adhesión de células en pocillos revestidos solo con BSA.

Expresión y bloqueo funcional de 11 y 21 en leucocitos activados. Debido al papel clave que desempeñan los leucocitos en la inflamación, los inventores decidieron ensayar si unos mAb anti-1 y anti-2 eran capaces de bloquear la adhesión de los leucocitos a colágenos. Para obtener leucocitos que expresan altos niveles de 1 y 2, células T murinas fueron estimuladas in vitro con IL-2 durante 7-12 días. Estas células expresan altos niveles de 1 y 2 (figura 1A), y se unen bien a superficies revestidas con colágeno de tipo IV y de tipo I (figura 1B). La adhesión al colágeno de tipo IV fue parcialmente inhibida por el mAb anti-1 por sí solo y no fue inhibida por el mAb anti-2 por sí solo. Por contraste, la adhesión al colágeno de tipo I fue completamente inhibida por el mAb anti-2, y el mAb anti-1 por sí solo mostró únicamente una inhibición parcial. Ambos mAb anti-1 y la combinación de mAb anti-1 y anti-2 inhibieron completamente la adhesión al colágeno de tipo I y IV. Habiendo demostrado que las integrinas 11 y 21 se expresan sobre células T activadas y que los mAb anti-1 y 2 son capaces de bloquear funcionalmente la adhesión de leucocitos a los colágenos, los inventores emplearon estos mAb para investigar el papel in vivo de estas integrinas en modelos animales de trastornos inflamatorios.

Ejemplo 2

Inhibición de las respuestas DTH por mAb anti-integrina. Las respuestas de hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH) inducidas por SRBC fueron adaptadas a partir de un protocolo previamente publicado (Hurtrel et al., 1992, Cell. Immunol., 142:252-263). Brevemente, se inmunizaron ratones s.c. en la espalda con 2 x 107 SRBC en 100 ul de PBS en el día 0. Los ratones fueron expuestos el día 5 con una inyección de 1 x 108 SRBC en 25 ul de PBS s.c. en la almohadilla de la pata trasera derecha. Se midió el espesor de la almohadilla de la pata con un calibrador de ingeniero (Mitutoyo/MIT, Paramus, NJ) 20 h después de la exposición al antígeno, y se calculó el grado de hinchamiento de la almohadilla de la pata. Los resultados se indican como el porcentaje medio de aumento en el espesor de la almohadilla de la pata  MEE, y se calcula como porcentaje de aumento = [1-(espesor de la almohadilla de la pata derecha 20 h después de la exposición al antígeno/espesor de la almohadilla de la pata izquierda no inyectada 20 h después de la exposición al antígeno)] x 100. Para bloquear la fase efectora de la respuesta DTH inducida por SRBC, se administraron i.p. mAb terapéuticos o control (100 ug), que se prepararon según los métodos descritos en el ejemplo 1, 1 h antes de la exposición al antígeno en el día 5.

La DTH inducida por SRBC es un modelo in vivo bien caracterizado de la inflamación, y en particular la psoriasis, que se ha empleado para demostrar la importancia de una diversidad de citoquinas y moléculas de adhesión en la inflamación (Tedder et al., 1995, J. Exp. Med., 181:2259-2264; Terashita et al., 1996, J. Immunol., 156:4638-4643). Los ratones sensibilizados con SRBC reciben mAb anti-integrina 1 h antes de la exposición al antígeno de la almohadilla de la pata, y se evaluó la inflamación 20 h después, según se mide mediante el aumento en el espesor de la almohadilla de la pata. Ratones tratados con PBS y con Ig de hámster control mostraron un aumento del 6070% en el espesor de la almohadilla de la pata 20 h después de la exposición al antígeno (figura 2). Comparado con el tratamiento con Ig de hámster control, los mAb anti-1 o anti-2 produjeron una inhibición del 68% y 60% en el espesor de la almohadilla de la pata, respectivamente. La combinación de mAb anti-1 y 2 produjo una inhibición del 71%, lo cual demuestra poco efecto aditivo frente a los mAb anti-1 o anti-2 por sí solos. El tratamiento con otros mAb anti-integrina también resultó eficaz para inhibir la respuesta efectora de DTH. El grado de inhibición observado con los diversos tratamientos con mAb fue del 49% (anti-4), 23% (anti-5), y 57% (anti-6). Por último, el bloqueo de mAb de la subunidad de integrina 1 común (mAb HMBI-1) inhibió la respuesta DTH efectora en 67%.

Ejemplo 3

Inhibición de las respuestas efectoras CHS por mAb anti-integrina. Se ensayó la hipersensibilidad por contacto (CHS) a FITC como se ha descrito previamente (Gaspari et al., 1991, en Current Protocols in Immunology, J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, y W. Strober, editores, John Wiley & Sons, Nueva York, sección 4.2:1). Brevemente, los ratones fueron sensibilizados extendiendo 100 ul de FITC al 0,5% en acetona/dibutilftalato 1:1 sobre la espalda afeitada en el día 0. Diez días después, los animales se expusieron mediante la aplicación de 5 ul de FITC al 0,5% a ambos lados de cada oreja. Se determinó la respuesta de

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hinchamiento de la oreja mediante el espesor de la oreja medido con un calibrador de ingeniero (Mitutoyo/MTI, Paramus, NJ) en el momento de la exposición al antígeno (día 10) y 24 h después, y los resultados se indican como el porcentaje medio de aumento en el espesor de la oreja desde la línea de base  MEE. El aumento en el espesor de la oreja se calcula como porcentaje de aumento = [1-(espesor de la oreja 24 h después de la exposición al antígeno/espesor de la oreja en el momento de la exposición al antígeno)] x 100. Para bloquear la fase efectora de la respuesta CHS, se administraron mAb terapéuticos o control (250 ug) i.p. 4 h antes de la exposición al antígeno en el día 10. Los ratones que fueron sensibilizados con el antígeno y que su oreja fue expuesta solo a vehículo (control de vehículo), o los ratones que fueron expuestos en la oreja sin sensibilización previa (control irritante) actuaron como controles negativos (nunca exceden de un aumento del 2% en el espesor de la oreja).

Puesto que CHS es mecanísticamente diferente de DTH e implica a diferentes células efectoras, los inventores investigaron el efecto de los mAb anti-integrina sobre la fase efectora de la respuesta CHS. Los ratones fueron sensibilizados con haptenos empleando FITC aplicado a la espalda afeitada, seguido 10 días después por una exposición a FITC en la oreja que produce una respuesta inflamatoria al día siguiente. Los ratones sensibilizados con FITC mostraron un aumento del 60-70% en el espesor 24 h después de la exposición al antígeno (figura 3). En coherencia con los resultados publicados (Scheynius et al., J. Immunol., 150:655-663), el tratamiento con mAb anti-ICAM-1 produjo una inhibición del 51% en el hinchamiento de la oreja. Comparado con el mAb de hámster control, el tratamiento de ratones con mAb anti-1 o anti-2 4 h antes de la exposición al antígeno produjo una inhibición del 37% y 57% en el hinchamiento de la oreja, respectivamente (figura 3). La combinación de mAb anti-1 y anti-2 produjo una inhibición ligeramente mayor del hinchamiento de la oreja (65%). El tratamiento con otros mAb contra integrinas 1 reveló que, aunque los mAb anti-4 y anti-5 no producen inhibición de la respuesta efectora CHS inducida por FITC cuando se comparan con el mAb de rata control, el tramiento con mAb anti-6 produjo una inhibición del 86% de las respuestas efectoras. Por último, el bloqueo de mAb de la subunidad de integrina 1 común inhibe las respuestas efectoras CHS en 74%. Se obtuvieron resultados similares de CHS empleando diferentes razas de ratones (C57/BL6, 129/Sv) y un agente sensibilizante diferente (oxazolona) (los datos no se muestran). De forma similar a los resultados observados en el modelo de DTH inducida por SRBC, los analisis histológicos de las orejas inflamadas demostraron que la formación de edemas y la infiltración de leucocitos fueron inhibidas por el tratamiento con mAb anti-1 y anti-2.

En coherencia con el descubrimiento de que 11 y 21 pueden ser expresadas sobre esplenocitos activados con IL-2, el análisis de los nódulos linfáticos de ratones sensibilizados con el antígeno (FITC u oxazolona) reveló que 11 y 21 se expresan exclusivamente sobre células T CD4+ y CD8+ activadas con CD44hi LFA-1hi (los datos no se muestran). El tratamiento de ratones con los mAb anti-1 y anti-2 no produjo la deleción de estas células, puesto que el número de células T activadas en el bazo y en los nódulos linfáticos en respuesta a la sensibilización con el antígeno en el modelo de CHS no se vió afectado. Además, las células efectoras no fueron funcionalmente delecionadas, puesto que un tratamiento prolongado de los ratones sensibilizados con el antígeno con los mAb anti1 y anti-2 (día 10-16) no afectó a la respuesta inflamatoria de los ratones expuestos al antígeno en el día 20 (los datos no se muestran).

Ejemplo 4

Las respuestas efectoras CHS son menores en ratones deficientes en 11. Para excluir la posibilidad de que el papel inhibidor de 11 en la respuesta efectora de CHS mediada por FITC también esté mediada por mAb, se realizaron experimentos en ratones deficientes en la integrina 11 y de tipo salvaje (figura 4). La inhibición por mAb de la fase efectora en los ratones de tipo salvaje fue coherente con los resultados previos, observándose una inhibición del 56% en el espesor de la oreja con anti-1, del 56% con anti-2, y del 62% con una combinación de anti-1 y anti-2. La fase efectora de CHS se redujo significativamente en los ratones deficientes en 11 no tratados, comparado con los ratones de tipo salvaje no tratados (aumento del 30% frente al 71% en el espesor de la oreja, respectivamente). Tal como se esperaba, el nivel de hinchamiento de la oreja en los ratones deficientes en 11 no tratados fue equivalente al nivel de hinchamiento de la oreja observado en los ratones de tipo salvaje tratados con el mAb anti-1. Por último, el bloqueo por mAb de 21 en los ratones deficientes en 11 solo produjo una inhibición ligeramente mayor del hinchamiento de la oreja, lo cual es coherente con los resultados observados en los ratones de tipo salvaje tratados con una combinación de mAb anti-1 y anti-2.

Ejemplo 5

Para excluir también la posibilidad de que el efecto inhibidor de los mAb anti-integrina observado en los modelos de inflamación de DTH y CHS esté provocado por un efecto antiinflamatorio general mediado por los mAb anti-1 y anti-2, se estudió el efecto de estos mAb sobre la dermatitis irritante.

Para evaluar la dermatitis irritante, los ratones fueron pintados con 5 ul de aceite de crotón al 0,8% en acetona en ambos lados de cada oreja. Se administraron anticuerpos terapéuticos o control 4 h antes de la aplicación del irritante. El hinchamiento de la oreja se midió 24 h después tal como se describió anteriormente y se compara con el espesor de la oreja antes de la aplicación del aceite de crotón. Los resultados se indican como el porcentaje medio de aumento en el espesor de la oreja desde la línea de base  MEE, según se describió anteriormente. Los ratones pintados solo con acetona (control de vehículo) actúan como control negativo.

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Veinticuatro horas después, las orejas de los ratones tratados con aceite de crotón mostraron un aumento significativo en el espesor de la oreja (48%), cuando se compara con ratones que reciben solo vehículo (acetona). El hinchamiento tóxico de la oreja provocado por el aceite de crotón no se vió significativamente afectado en ratones pretratados con los mAb anti-1 y anti-2, cuando se compara con los animales tratados con mAb control o PBS (figura 5). El examen histológico de las orejas tratadas con aceite de crotón no reveló diferencias en el número o el tipo de células infiltrantes o en la formación de edemas en ratones tratados con los mAb anti-1 o anti-2, comparado con los ratones tratados con el mAb control o los ratones tratados con PBS (los datos no se muestran).

Ejemplo 6

Inhibición de la artritis por 11 y 21. Puesto que 11 se expresa bien en células infiltrantes en el sinovio de pacientes con artritis, los inventores decidieron estudiar si los mAb anti-1 o anti-2 serían inhibidores en un modelo acelerado de artritis previamente descrito (Terato et al., 1992, J. Immunol., 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoimmunity,. 22:137-147).

Los kits de anticuerpos Arthrogen-CIA se obtuvieron en Stratagene (La Jolla, CA) y se indujo la artritis empleando un protocolo bien establecido (Terato et al., 1992, J. Immunol., 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoimmunity,. 22:137-147). Brevemente, la artitis se indujo a través de una inyección i.p. de un cóctel de 4 mAb anti-colágeno de tipo II (1 mg cada uno) en el día 0, seguido de una inyección i.p. de 50 ug de LPS en el día 3. A lo largo de los siguientes 3-4 días, los ratones desarrollaron hinchamiento en muñecas, tobillos y dedos. Los mAb terapéuticos o control (250 ug) se administraron i.p. 4 h antes de la inyección de los mAb anti-colágeno en el día 0, y de nuevo 4 h antes de la administración de LPS en el día 3, y después continuando cada 3er día durante todo el experimento. Comenzando en el día 3, los ratones fueron evaluados para el desarrollo de la artritis. La gravedad de la artritis en cada extremidad fue puntuada empleando un sistema de cuatro puntos: 0 = normal; 1 = enrojecimiento ligero, hinchamiento ligero del tobillo o muñeca; 2 = hinchamiento moderado del tobillo o muñeca; 3 = hinchamiento grave que incluye algunos dedos, tobillo y pie; 4 = máximamente inflamado.

La artritis grave en ratones Balb/c se desarrolló en las 72 h después de la inyección de LPS y persistió durante más de 3 semanas. Ni la inyección de los mAb anti-colágeno solos ni el LPS solo indujeron artritis. Los ratones que recibieron un tratamiento con mAb control mostraron una artritis igual de grave que la que se observa en los ratones tratados con PBS (figura 6). Por contraste, el tratamiento con el mAb anti-1 solo produjo una reducción marcada (78%) en la artritis, que dura todo el experimento. El tratamiento con el mAb anti-2 solo también tuvo un efecto beneficioso, dando como resultado una disminución del 32% en la puntuación artrítica comparado con los ratones tratados con mAb control. La combinación de mAb anti-1 y anti-2 produjo un grado de inhibición similar al observado con el mAb anti-1 solo.

Ejemplo 7

Análisis histológico del efecto del tratamiento con mAb anti-1 y anti-2 sobre el infiltrado celular inflamatorio. Otros análisis histológicos de la respuesta DTH inducida por SRBC confirmaron la capacidad del tratamiento con mAb anti1 y anti-2 para modular la respuesta inflamatoria suscitada (figura 7). Una almohadilla de la pata no expuesta de un ratón sensibilizado con SRBC (figura 7, panel A) mostró prácticamente ningún infiltrado celular inflamatorio cuando se compara con una almohadilla de la pata expuesta a SRBC del mismo ratón (figura 7, panel B). El tratamiento de ratones sensibilizados con SRBC con mAb anti-1 y anti-2 solos o combinados redujo en gran medida el número de estas células infiltrantes que se encuentran en almohadillas de la pata expuestas a SRBC, cuando se compara con ratones tratados con mAb control (figura 7, panel C-F). Un examen más exhaustivo de las células infiltrantes reveló que la mayoría de las células estaban compuestas de neutrófilos, con algunos monocitos y linfocitos presentes, y confirmó que el tratamiento con mAb anti-1 y anti-2 disminuyó en gran medida el número de estas células (figura 7, panel G-H).

Ejemplo 8

Demostración inmunohistoquímica de células que expresan 1 en el infiltrado celular inflamatorio. Se realizó una inmunohistoquímica para determinar con más precisión la naturaleza de las células infiltrantes y si expresan integrinas de unión al colágeno (figura 8). Las células infiltrantes de una almohadilla de la pata inflamada de un ratón no tratado se estudiaron para la expresión de la integrina 11 y los marcadores del linaje celular (figura 8). Se descubrió que la integrina 11 era expresada por muchos leucocitos infiltrantes (figura 8A). Se empleó una inmunohistoquímica dual para identificar la naturaleza de las células infiltrantes y la distribución de la expresión de 11 (figura 8B). Empleando marcadores del linaje celular, se descubrió que el infiltrado estaba compuesto en gran medida por granulocitos/monocitos (Mac-1+), siendo muchas de estas células neutrófilos (Gr1+), junto con un número más pequeño de linfocitos T (CD3+) (figura 8B). La expresión de la integrina 11 se encontró en los tres subconjuntos de células, siendo 1 expresada en un subconjunto de granulocitos/monocitos Mac-1+, un subconjunto de neutrófilos Gr1+, y sobre la mayoría de los linfocitos T CD3+ infiltrantes (figura 8B). Un análisis inmunohistoquímico detallado reveló que aunque el tratamiento con mAb anti-1 y anti-2 reduce el número de células infiltrantes, no se observan cambios en la composición celular del infiltrado (los datos no se muestran). La tinción inmunohistoquímica con un mAb anti-hámster FITC confirmó la capacidad de los mAb anti-1 y anti-2 para

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localizarse en la almohadilla de la pata inflamada (los datos no se muestran).

Ejemplo 9

Inhibición de la artritis por mAb contra 11 y 21 en un ratón deficiente en 1. Puesto que 11 se expresa bien en células infiltrantes en el sinovio de pacientes con artritis, los inventores decidieron estudiar si los mAb anti-1 o anti-2 serían inhibidores en un modelo acelerado de artritis previamente descrito (Terato et al., 1992, J. Immunol., 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoimmunity,. 22:137-147). Este modelo implica la inyección de un cóctel de mAb anti-colágeno de tipo II en ratones, seguido de la administración de LPS, dando como resultado el desarrollo de la artritis en los siguientes 3-7 días. Los ratones recibieron mAb cada 3er día, comenzando en el día 0, y fueron puntuados para el desarrollo de la artritis cada 3er día. Se desarrolló una artritis grave en todos los ratones a las 72 h después de la inyección de LPS y persistió durante más de 3 semanas. Ni la inyección con los mAb anti-colágeno solos ni el LPS solo indujeron artritis. Los ratones que recibieron un tratamiento con mAb control mostraron una artritis igual de grave que la que se observa en los ratones tratados con PBS (figura 9A). Por contraste, el tratamiento con el mAb anti-1 solo produjo una reducción marcada (79% y mayor) en la artritis, que dura todo el experimento. El tratamiento con el mAb anti-2 solo también tuvo un efecto beneficioso, dando como resultado una disminución del 37% en la puntuación artrítica comparado con los ratones tratados con mAb control. La combinación de mAb anti-1 y anti-2 produjo un grado de inhibición similar al observado con el mAb anti-1 solo. Se observó una reducción en la puntuación artrítica con el tratamiento de mAb anti-1 en todos los ratones, y supone un mejor resultado que varios otros tratamientos basados en mAb para la artritis, tales como la proteína de fusión Ig-receptor de TNF soluble (Mori et al., 1996, J. Immunol., 157:3178-3182), anti-Mac-1 (Taylor et al., 1996, Immunology, 88:315321), anti-4 (Seiffge, 1996, J. Rheumatol., 23:2086-2091), y anti-ICAM-1 (Kakimoto et al., 1992, Cell Immunol., 142:326-337) (figura 9A). En conformidad con los datos basados en mAb que demuestran un papel importante de 11 en la artritis, los ratones deficientes en 1 mostraron una reducción significativa en la puntuación artrítica cuando se comparan con los ratones de tipo salvaje (figura 9B).

Ejemplo 10

Efecto de un tratamiento con mAb anti-1 sobre la inmunopatología de articulaciones artríticas. Las articulaciones de ratones artríticos de tipo salvaje (día 8) que recibieron mAb control o un tratamiento con mAb anti-1 fueron comparadas de modo visual e histológico con articulaciones de un ratón no tratado normal (figura 10). Desde el punto de vista visual, las articulaciones de los ratones tratados con mAb control mostraron enrojecimiento e hinchamiento del pie entero, incluyendo los dedos, mientras que los ratones tratados con mAb anti-1 mostraron poca o ninguna señal de inflamación en las articulaciones o en los dedos. El examen histológico mostró cambios graves en las articulaciones artríticas tratadas con mAb control, con una extensa infiltración del tejido subsinovial por células inflamatorias, la adherencia de células a la superficie de la articulación, y una marcada destrucción del cartílago, según se pone en evidencia por la pérdida de proteoglicanos (figura 10). En coherencia con informes previos (Terato et al., 1992, J. Immunol., 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoimmunity,. 22:137-147), la mayoría de las células infiltrantes en este modelo son neutrófilos. El tratamiento con mAb anti-1 de los ratones redujo drásticamente la cantidad de infiltrado inflamatorio y el grado de destrucción del cartílago (figura 10).

Ejemplo 11

El desarrollo de la artristis se retrasa en ausencia de linfocitos, y la inhibición de la artritis por mAb anti-1 se produce en ausencia de linfocitos. Para determinar qué tipos celulares pueden ser importantes en el modelo de artritis inducida por mAb de colágeno, los inventores compararon la capacidad de ratones B6-129 de tipo salvaje y ratones B6-129 deficientes en RAG-1 para desarrollar artritis (figura 11). La deleción genética del gen RAG-1 (gen activador de la recombinación-1) produce la pérdida completa de linfocitos B y T maduros (Mombaerts et al., 1992, Cell, 68:869-877). Tanto los ratones de tipo salvaje como los ratones deficientes en RAG-1 desarrollaron artritis, aunque la cinética de la inducción en los ratones deficientes en RAG-1 es significativamente más lenta (figura 11). Estos resultados sugieren que aunque los linfocitos están implicados en este modelo de artritis, no son necesarios para el desarrollo y el avance de la enfermedad. Los informes publicados que estudian el efecto de los ratones deficientes en RAG-1 en otros modelos de artritis también han descubierto que la pérdida de linfocitos T y B retrasa la aparición de la artritis (Plows et al., 1999, J. Immunol., 162:1018-1023). El tratamiento de ratones de tipo salvaje o deficientes en RAG-1 con mAb anti-1 inhibe completamente la artritis (figura 11). Estos resutlados demuestran que la eficacia del mAb anti-1 en este modelo no depende de la presencia de linfocitos y que, tal como sugieren los experimentos previos (figura 9), la eficacia de un mAb anti-1 para prevenir la enfermedad puede ser a través de su acción sobre otras células que expresan 1, tales como macrófagos y neutrófilos.

Ejemplo 12

Dosis-respuesta de la inhibición de la artritis por mAb anti-1. Dados los sorprendentes efectos del tratamiento con mAb anti-1 en la prevención de la artritis, los inventores extendieron estos estudios para incluir un análisis de dosisrespuesta (figua 12). Se administraron i.p. diferentes dosis de mAb cada 3er día comenzando en el día 0. En coherencia con los datos previos, una dosis de 250 ug de mAb anti-1 produjo una prevención casi completa de la artritis. Una dosis menor de 100 ug de mAb anti-1 fue parcialmente eficaz para prevenir la artritis en este modelo,

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integrina 11 humana, de conejo y de oveja, pero no de rata, lo cual sugiere que los mAb bloqueantes se unen a un epitopo lineal conservado evolutivamente. Los mAb no bloqueantes no son eficaces en la inmunotransferencia ni reaccionan con especies diferentes a la especie humana.

Ejemplo 17

La unión del dominio 1-I al colágeno depende de cationes divalentes

A. Purificación de los dominios 1-I.

Los dominios 1-I fueron expresados en E. coli como proteínas de fusión de GST (glutatión-S-transferasa) que contienen un sitio de ruptura de trombina en la unión de las secuencias. El sobrenadante aclarado de las células lisadas en PBS se cargó sobre una columna de glutatión-Sepharose 4B (Pharmacia) que se lavó a fondo con PBS. La proteína de fusión del dominio 1-I-GST eluyó con Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, glutatión (reducido) 5 mM. Para los estudios de desnaturalización, el dominio I se rompió con trombina en Tris 50 mM, pH 7,5, y se purificó del compañero de fusión GST. Se añadió DTT a 2 mM y la muestra se cargó sobre una columna de glutatión-Sepharose 4B. La corriente y las fracciones de lavado se reunieron y se cargaron en una columna Q Sepharose FF (Pharmacia). El dominio 1-I eluyó con Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, 2-mercaptoetanol 10 mM, NaCl 75 mM. El dominio I purificado muestra su masa predicha (Lee et al. (1995), Structure, 3, 1333-1340, 871 Da) mediante una ionización de electropulverización-espectrometría de masas (ESI-MS), migra como una única banda mediante SDS-PAGE, y la proteína eluye como un único pico con el tamaño apropiado mediante una cromatografía de exclusión molecular en una columna Superose 6 FPLC (Pharmacia).

B. Análisis funcional.

Se revistieron a 4 ºC durante la noche placas de 96 pocillos con colágeno IV 1 g/ml (Sigma) o colágeno de tipo I (Collaborative Biomedical), se lavaron con tampón Triton (Triton X-100 al 0,1%, MnCl2 1 mM, Tris-HCl 25 mM, NaCl 150 mM) y se bloquearon con albúmina de suero bovina (BSA) al 3% en Tris-HCl 25 mM, NaCl 150 mM (TBS). Unas diluciones en serie de la proteína de fusión del dominio 1-I-GST en TBS que contenía MnCl2 1 mM y BSA al 3% se incubaron en las placas revestidas a temperatura ambinete durante 1 hora, y se lavaron en tampón Triton. Se detectó el dominio 1-I unido con adiciones en serie de anticuerpo policlonal anti-GST biotinilado 10 g/ml (Pharmacia), ExtrAvidin-peroxidasa de rábano (Sigma) diluido 1:3000 en TBS que contenía MnCl2 1 mM y BAS al 3%, y 1-Step ABTS (2,2’-azina-di[sulfonato de 3-etilbenztiazolina], Pierce). Las placas se leyeron a D.O. 405 en un lector de microplacas (Molecular Devices).

Resultados:

Los dominios 1-I humano y de rata (95% de identidad con el humano) se expresaron en E. coli como proteínas de fusión con GST y se purificaron en glutatión-Sepharose. Ambas proteínas se estudiaron para la unión al colágeno I y IV empleando una variación de un ensayo basado en ELISA previamente descrito (Qu, A., y Leahy, D. J. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 10277-10281). El dominio 1-I humano se une al colágeno IV con mejor eficacia que al colágeno I (figura 18A). Un anticuerpo específico para el dominio 1-I, pero no un anticuerpo específico para el dominio 2-I (figura 18b) abroga la unión de ambos ligandos (los datos para el colágeno I no se muestran). Tanto Mn2+ como Mg2+ estimulan la unión, y EDTA reduce la unión a niveles de fondo (figura 18C). No se detectaron diferencias mensurables entre los dominios 1-I humano y de rata, lo cual sugiere que las diferencias de secuencia entre las especies no son importantes desde el punto de vista funcional (los datos no se muestran). Así, el dominio 1-I, específicamente, requiere cationes para una unión eficaz al ligando.

Ejemplo 18

Un epitopo dependiente de cationes reside cerca del motivo MIDAS. Los inventores han aprovechado la observación de que AJH10 reconoce las secuencias del dominio 1-I humano, pero no de rata, para cartografiar el epitopo para los mAb bloqueantes de la función 11. Las secuencias humana y de rata se diferencian solo en 12 aminoácidos, 4 de los cuales se encuentran en un tramo de 6 aminoácidos (aa 92-97, figura 14A), adyacentes a la treonina crítica (figura 14A, aa 98) dentro del motivo MIDAS. Para ensayar la hipótesis de que los 6 restos aminoácidos, Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg, comprenden el epitopo para los mAb bloqueantes, los inventores construyeron un dominio I quimérico (RH), intercambiando los restos de rata G91, R92, Q93 y L96 por los correspondientes restos humanos, V, Q, R y R, respectivamente. AJH10, junto con todos los mAb bloqueantes de la función, reconoce el dominio I quimérico (RH, figura 14B).

Para orientar a estos restos con respecto al dominio MIDAS en la estructura terciaria del dominio 1-I, los inventores realizaron un modelo del dominio 1-I empleando las coordenadas de la estructura cristalina del dominio 2-I.

Se construyó un modelo de homología del dominio 1-I humano empleando la estructura cristalina de rayos X del dominio 2-I humano (Ward et al. (1989), Nature, 341, 544-546). El modelo se construyó empleando el módulo de formación de modelos de homología de Insight II (versión 2.3.5; Biosym Technologies). Se empleó el programa CHARMM (Clackson et al. (1991), Nature, 352, 624-628) con el parámetro de todo hidrógeno ajustado a 22 con una

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Claims

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