SK287328B6

SK287328B6 - Použitie kompozície obsahujúcej homológ protilátky, ktorý je antagonistom interakcie medzi integrínom nesúcim podjednotku alfa4 a ligandom pre integrín nesúci podjednotku alfa4

Info

Publication number: SK287328B6
Application number: SK1520-2001A
Authority: SK
Inventors: Philip Gotwals; Roy R. Lobb
Original assignee: Biogen Idec Ma Inc.
Priority date: 1999-04-22
Filing date: 2000-04-21
Publication date: 2010-07-07
Also published as: ATE298249T1; CN100360183C; IL206829A0; RS20080471A; CA2370814C; IL182908A0; CZ20013754A3; US6652856B2; EA006681B1; HUP0201015A2; HK1076379A1; CN1356911A; KR100837715B1; AU783054B2; KR20070102760A; CN1191860C; IL182908A; NO20015122D0; EP1173201A1; BG65578B1

Abstract

Opisuje sa použitie kompozície obsahujúcej homológ protilátky, ktorý je antagonistom interakcie medzi integrínom nesúcim podjednotku alfa4 a ligandom pre integrín nesúci podjednotku alfa4, na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie fibrózy u subjektu. Fibrózou je fibróza vnútorného orgánu, napr. pečene, pľúc, obličiek, krvných ciev srdca alebo gastrointestinálneho traktu. Opisuje sa tiež použitie kompozície obsahujúcej alfa4 homológ protilátky, ktorý môže byť humanizovaný, humánny alebo chimérický homológ protilátky.

Description

Predložený vynález sa týka použitia kompozície obsahujúcej homológ protilátky, ktorý je antagonistom interakcie medzi integrínom nesúcim podjednotku o4 a ligandom pre integrín nesúci podjednotku a4, na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie fibrózy u subjektu.

Doterajší stav techniky

Fibronektín a kolagén sú proteíny, ktoré sú nevyhnutné na udržanie integrity extracelulámeho matrixu v spojivovom tkanive. Tvorba týchto proteínov je vysoko regulovaný proces a jeho narušenie môže viesť k vývoju tkanivovej fibrózy. Aj keď vytváranie fibrózneho tkaniva je súčasťou normálneho prospešného procesu hojenia po poranení, za určitých okolností môže abnormálna akumulácia fibrózneho materiálu nakoniec viesť k zlyhaniu orgánu (Border a kol., (1994) New Engl. J. Med. 331:1286-1292). Poškodenie ktoréhokoľvek orgánu vedie k stereotypnej fyziologickej reakcii: doštičkami indukovaná hemostáza, po ktorej nasleduje prísun „zápalových“ buniek a aktivovaných fibroblastov. Cytokíny pochádzajúce z buniek týchto typov riadia vytváranie nového extracelulámeho matrixu a krvných ciev (granulačné tkanivo). Vytváranie granulačného tkaniva je veľmi starostlivo hierarchicky usporiadaný program, v ktorom je stimulovaná expresia inhibítorov proteáz a proteínov extracululámeho matrixu, a naopak expresia proteáz je redukovaná, čo v dôsledku vedie k akumulácii extracelulámeho matrixu.

Ústredným bodom vývoja fibrotického ochorenia, či už indukovaného alebo spontánneho, je stimulácia aktivity fibroblastov. Prísun „zápalových“ buniek a aktivovaných fibroblastov do poškodeného orgánu je závislý od schopnosti buniek týchto typov interagovať s intersticiálnym matrixom zloženým predovšetkým s fibronektínu a kolagénu. Tieto interakcie typu bunka-bunka alebo bunka-extracelulámy matrix sú sprostredkované molekulami bunkovej adhézie patriacimi do niekoľkých rodín molekúl, jedna z týchto rodín obsahuje integríny. Integríny sú štruktúrne a funkčne príbuzné glykoproteíny zložené z rôznych a (doteraz známe ocl, a2 až all) a β (βΐ a β7) heterodimémych transmembránových receptorových domén, ktoré sa v rôznych kombináciách vyskytujú u cicavcov prakticky vo všetkých typoch buniek (pozri prehľadné publikácie E.C. Butcher, Celí, 67, 1033 (1991); D. Cox a kol., „The Pharmacology of Integrins“, Medicinal Research Rev. Vol. 195 (1994) a V.W. Engleman a kol., „Celí Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets“ in Ann. Revs. Medicinal Chemistri, Vol. 31, J.A. Bristol, Ed.; Acad. Press. NY, 1996, p. 191). Opísané sú dva integríny obsahujúce dve podjednotky ct4 a pomenovali sa α4β1 (VLA-4) a α4β7.

Fibróza pľúcneho interstícia (IPF, interstitial pulmonary fibrosis) je dôsledkom mnohých ochorení pľúcneho interstícia a vedie k zníženiu pľúcnej kapacity a zhoršeniu vitálnej výmeny plynov v pľúcach. Bez ohľadu na etiológiu sú pre IPF charakteristické zápalové a fibroproliferatívne zmeny v pľúcach a nadmerná akumulácia kolagénu v interstíciu. U pacientov s IPF sa všeobecne prejavuje v priebehu aktívnej fázy pľúcnej fibrózy výskyt novozískaných („regrutovaných“) imunitných a „zápalových“ buniek, čo ukazuje na to, že pulmonálna fibróza je výsledkom chybnej reparácie po počiatočnom zápale tkaniva. „Regrutovanie“ zápalových buniek sa v mnohých prípadoch podieľa na počiatočnom zápale. Okrem toho tieto bunky hrajú veľmi zložitú úlohu v regulácii reparačného procesu. V každom prípade „regrutovanie“ zápalových a imunitných buniek do pľúc hrá dôležitú úlohu vo vyvolaní fibrotickej reakcie. Prísun „zápalových“ buniek a aktivovaných fibroblastov do poškodených pľúc závisí od schopnosti týchto buniek interagovať so zložkami ECM. Presun a stav aktivácie leukocytov sú modulované pôsobením rôznych integrínov. Zabránenie prísunu zápalových buniek do pľúc môže byť kritickým krokom v potlačení následnej fibrotickej reakcie.

Mnohé z ochorení spojených s proliferáciou fibrózneho tkaniva sú často tak chronické, ako aj oslabujúce, ako napr. kožné ochorenia, ako je skleroderma. Iné vrátane napr. pulmonálnej fibrózy, môžu byť aj fatálne v dôsledku toho, že v súčasnosti dostupná liečba má významné vedľajšie účinky, a všeobecne je neúčinná na spomalenie alebo zastavenie progresie fibrózy [Nagler a kol., 1996, Am. J. Respir. Crit. Čare Med., 154:1082-86], Existuje teda veľká potreba nových antifibrotických liekov.

WO-A-97 18838 opisuje spôsoby liečenia využívajúce humanizované imunoglobulíny, ktoré sa špecificky viažu na alfa-4 integrín a ktoré sa môžu použiť na liečenie takých ochorení, ako je akútne poškodenie pľúc sprostredkované leukocytmi (str. 25).

WO 97/11718 opisuje použitie neutralizujúcej protilátky, ktorá je špecifická na RGD rozpoznávajúce miesto integrínov a ktorá môže byť neutralizujúcou protilátkou špecifickou pre integrínový receptor.

Kidney Intemational 1996, 49:127-134 opisuje, že nie je silné prepojenie medzi glomelurálnou expresiou LFA-1, VLA-4, ICAM-1, VCAM-1, a glomerulámou makrofágovou infiltráciou a chronickým histologickým poškodením.

Podstata vynálezu

Pôvodcovia vynálezu skúmali možné účinky antagonistov integrínov obsahujúcich podjednotky al a a4 na patogenézu fibróz tak, že podávali integríny obsahujúce al alebo a4 podjednotku myšiam s pľúcnou fibrózou. Osožný účinok týchto antagonistov tak na celkovú akumuláciu kolagénu, ako aj na rozsah fibrotických lézií v pľúcach, viedol k predpokladu, že integríny obsahujúce podjednotku al a/alebo a4 sú vhodné na antifibrotickú terapiu.

Predmetom vynálezu je použitie kompozície obsahujúcej homológ protilátky, ktorý je antagonistom interakcie medzi integrínom nesúcim podjednotku o4 a ligandom pre integrín nesúci podjednotku «4, na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie fibrózy u subjektu.

Antagonista je agens viažuci integrín a4 alebo agens viažuci ligand integrínu a4. Výhodné agens viažuce integrín a4 je vybrané zo skupiny obsahujúcej: a) protilátkový homológ antagonizujúci interakciu ako VLA-4 tak α4β7 s príslušnými a4 ligandmi, b) protilátkový homológ antagonizujúci interakciu VLA-4 s jeho a4 ligandom, a c) protilátkový homológ antagonizujúci interakciu α4β7 s jeho a4 ligandom. V iných uskutočneniach vynálezu je protilátkový homológ vybraný zo skupiny obsahujúcej humánnu protilátku, chimerickú protilátku, humanizovanú protilátku a ich fragmenty.

Ďalším aspektom predloženého vynálezu je použitie antagonistu interakcie medzi integrínom nesúcim podjednotku o4 a ligandom pre integrín nesúci podjednotku o4, na prípravu farmaceutickej kompozície na zníženie nárastu leukocytov indukovaných fibrotickým stavom vo vzorke výplachu bronchoalveolámej tekutiny u subjektu s fibrotickým stavom. V niektorých uskutočneniach vynálezu je činidlo viažuce integrín a4 kódované sekvenciou nukleovej kyseliny, ktorá obsahuje nukleovú kyselinu hybridizujúcu za stringentných podmienok s definovanými sekvenciami nukleových kyselín vybraných zo skupiny sekvencii uvedených v tabuľke 6 patentu US 5 840 299 alebo s komplementom týchto sekvencii nukleových kyselín. V inom aspekte vynálezu je agens viažuci integrín a4 kódovaný sekvenciou nukleovej kyseliny, ktorá obsahuje nukleovú kyselinu hybridizujúcu za definovaných stringentných podmienok so sekvenciou nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptidovú sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej isté polypeptidy definované v patente US 5 932 214 alebo tvorené v bunkách línie ATCC CRĽ 11175.

Detailný opis vynálezu

Definície

Na jasnejší a presnejší opis vynálezu sú ďalej uvedené definície niektorých pojmov a termínov, ktoré sa používajú v opise vynálezu a v nárokoch predloženej prihlášky.

V detailnom opise vynálezu sa používajú nasledujúce termíny:

Superrodina integrínového veľmi oneskoreného antigénu (VLA, very late antigén) je tvorená štruktúrne a funkčne príbuznými glykoproteínmi zloženými z (a a β) heterodimémych, transmembránových receptorových molekúl, vyskytujúcich sa v rôznych kombináciách takmer vo všetkých typoch cicavčích buniek (pozri prehľady: E.C. Butcher, Celí, 67, 1033 (1991); D. Cox a kol., „The PharmacoloQV of Integrins“. Medicinal Research Rev. (1994) and V.W. Engleman a kol., „Celí Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets“. in Ann. Report in Medicinal Chemistry, Vol. 31, J.A. Bristol, Ed.; Acad. Press, NY, 1996, p. 191). Rodina VLA integrínov obsahuje (to znamená doteraz sú známe) integrín VLA-1, -2, -3, -4, -5, -6, -9 a -11, kde každá molekula obsahuje reťazec βΐ nekovalentne naviazaný na reťazec a (al, a2, a3, a4, a5, a6 atď.).

Integrín α4β1 sa vyskytuje na bunkovom povrchu ako receptor pre VCAM-1; fibronektín a možno aj ďalšie ligandy (tieto ligandy sú jednotlivo aj súborne nazvané „a4 ligandmi“). Termín integrín α4β1 (zameniteľné používaný s označením integrín „VLA-4“, „a4bl“ alebo ,,α4β1“) označuje polypeptidy, ktoré sú schopné viazať sa na VCAM-1 a členov rodiny proteínov extracelulámeho matrixu, najmä fibronektín, alebo ich homológy alebo fragmenty, aj keď odborníkom je jasné, že môžu existovať ďalšie ligandy pre VLA-4 a môžu byť analyzované obvyklými metódami. Ale je známe, že podjednotka a4 môže asociovať s ďalšími podjednotkami βΐ, takže „integrín a4“ (alebo „integrín a4“ alebo „integrín obsahujúci podjednotku oc4“ (prípadne „integrín obsahujúci podjednotku a4“) označuje také integríny, kde je podjednotka a4 asociovaná s niektorou z podjednotiek β. Ďalším príkladom integrínu „a4“ okrem VLA4 je tiež α4β7 (pozri Labb a Adams, citované skôr). Podobne termín „integrín al“ alebo „integrín obsahujúci podjednotku al“ označuje integríny, v ktorých je podjednotka al asociovaná s niektorou podjednotkou β.

„Antagonista“ integrínu je akákoľvek zlúčenina, ktorá inhibuje väzbu integrínov obsahujúcich podjednotku al a/alebo a4 s integrínovým ligandom a/alebo receptorom. Antiintegrínová protilátka alebo proteín obsahujúci homológ protilátky (ako je diskutované ďalej v texte) a ďalšie molekuly, ako sú napr. rozpustné formy ligandových proteínov pre integríny, sú užitočné. K rozpustným formám ligandových proteínov pre integríny obsahujúce podjednotku a4 patrí rozpustný VCAM-1, fúzny proteín obsahujúci VCAM-1, alebo bifunkčný fúzny proteín VCAM-l/Ig. Napr. rozpustná forma integrínového ligandu alebo jeho fragmentu sa môže podávať, aby viazala integrín, a výhodne tak kompetovala o väzbové miesta pre integrín na bunkách, takže toto podávanie má podobný účinok ako podávanie antagonistu, ako je napr. antiintegrínová protilátka (napr. proti VLA-1, VLA-4). Zvlášť potom rozpustné integrínové mutanty, ktoré viažu ligandy, ale nespúšťajú od integrínu závislú signalizačnú dráhu, patria do predmetu predloženého vynálezu. Také mutanty integrínu pôsobia ako kompetitívne inhibítory integrínových proteínov divého typu a je možné ich preto považovať za „antagonisty“. Inými typmi antagonistov užitočných podľa vynálezu sú „malé molekuly“, ako sú definované ďalej v texte.

Vynález sa ďalej týka použitia molekúl, ktoré antagonizujú pôsobenie viac ako jedného integrínu obsahujúceho podjednotku a4, ako sú napr. malé molekuly alebo protilátkové homológy, ktoré antagonizujú ako VLA-4 tak aj α4β7 alebo iné kombinácie integrínov obsahujúcich podjednotku a4. Ďalej sa vynález týka použitia molekúl, ktoré antagonizujú pôsobenie viac ako jedného integrínu obsahujúceho podjednotku al. Vynález sa týka tiež použitia kombinácie molekúl, keď kombinácia antagonizuje pôsobenie viac ako jedného integrínu, ako je napr. použitie kombinácie niekoľkých malých molekúl alebo protilátkových homologov, ktoré v kombinácii antagonizujú tak VLA-4, ako aj α4β7 alebo ďalšie kombinácie integrínov obsahujúcich podjednotku a4.

Niektoré antagonisty integrínov môžu byť íuzované alebo inak spojené napr. s protilátkovými homológmi, ako sú imunoglobulíny alebo ich fragmenty, bez obmedzenia konkrétnou štruktúrou integrínu alebo ligandu alebo ďalšej molekuly. Takže v zmysle vynálezu akékoľvek agens schopné vytvárať chimérické proteíny (pozri definície uvedené ďalej) a súčasne schopné viazať integrínové ligandy, ktoré účinne blokuje alebo obaľuje (poťahuje) integrín obsahujúci podjednotku a4 a/alebo al, je považované za ekvivalent antagonistov uvedených v príkladoch vynálezu.

Termín „protilátkový homológ“ (alebo „homológ protilátky“) znamená intaktnú protilátku zloženú z ľahkých a ťažkých imunoglobulínových reťazcov spojených disulfidickými väzbami. Termín „protilátkový homológ“ zahŕňa tiež protein obsahujúci jeden alebo viac polypeptidov vybraných zo skupiny obsahujúcej ľahké reťazce imunoglobulínu, ťažké reťazce imunoglobulínu a ich fragmenty viažuce antigén, ktoré sú schopné viazať jeden alebo viac antigénov (to znamená integrín alebo integrínový ligand). Polypeptidové zložky homológu protilátky, ktorý je zložený z viac ako jedného polypeptidu, môžu byť prípadne viazané disulfidickými mostíkmi alebo inak kovalentne zosietené. Taktiež k homológom protilátok patria intaktné imunoglobulíny typov IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (vrátane ich subtypov), pričom ľahké reťazce týchto imunoglobulínov sú typov χ alebo λ.

K homológom protilátok patria tiež časti intaktných imunoglobulínov, ktoré si ponechávajú väzbovú špecifitu pre antigén, napr. fragmenty Fab, Fab' a F(ab')2, fragmenty F(v), monoméry alebo diméry ťažkých reťazcov, monoméry alebo diméry ľahkých reťazcov alebo ich kombinácie.

Termín „homológ humanizovanej protilátky“ označuje homológ protilátky pripravený s použitím technológie rekombinantnej DNA (génového inžinierstva), kde niektoré alebo všetky aminokyseliny ťažkého alebo ľahkého reťazca imunoglobulínu cicavca iného ako človeka, ktoré nie sú potrebné pre väzbu antigénu, sa substituovali zodpovedajúcimi aminokyselinami ťažkého alebo ľahkého humánneho imunoglobulínu. Termín „homológ humánnej protilátky“ označuje homológ protilátky, kde všetky aminokyseliny ťažkého alebo ľahkého reťazca imunoglobulínu (bez ohľadu na to, či sú potrebné pre väzbu antigénu) sú získané z humánneho zdroja.

Termín „homológ humánnej protilátky“ označuje homológ protilátky pripravený technológiou rekombinantnej DNA, kde všetky aminokyseliny ťažkého alebo ľahkého reťazca imunoglobulínu sú získané z humánneho zdroja.

Termín „agonista“ integrínu označuje akúkoľvek zlúčeninu, ktorá aktivuje integrínový ligand.

„Aminokyselina“ je monoméma jednotka peptidu, polypeptidu alebo proteínu. V prirodzene sa vyskytujúcich peptidoch, polypeptidoch a proteínoch sa vyskytuje 20 aminokyselín, ktoré sú všetky Δ-izoméry. Termín aminokyselina zahŕňa tiež analógy aminokyselín a D-izoméry aminokyselín vyskytujúcich sa v proteínoch a ich analógy.

Termín „kovalentne naviazaný“ používaný v opise znamená to, že špecifické skupiny alebo časti (napr. PEGylovaný, fragment imunoglobulínu/antagonista integrínu a4 a/alebo al) sú buď vzájomne priamo kovalentne viazané, alebo sú spojené kovalentne prostredníctvom vmedzerenej skupiny alebo časti alebo skupín alebo častí, ako je napr. tzv. „spacer“. Táto vmedzerená skupina alebo skupiny sa nazývajú „spojovacie skupiny“. Termín „konjugovaný“ sa v opise vynálezu používa zameniteľné s termínom „kovalentne naviazaný“. „Spacer“ potom označuje skupinu, ktorá je vmedzerená medzi aminokyselinu alebo inú zložku integrínového antagonistu alebo jeho fragmentu a zvyšok molekuly. „Spacer“ teda oddeľuje aminokyselinu alebo inú zložku od zvyšku molekuly, a zabraňuje modifikácii plynúcej z interferencie funkcií proteínov, a uľahčuje spojenie aminokyseliny alebo inej zložky s ďalšou skupinou alebo časťou.

„Expresná kontrolná sekvencia“ je „sekvencia kontrolujúca expresiu“, to znamená sekvencia nukleotidov, ktorá riadi a reguluje expresiu génov, s ktorými je operatívne spojená.

„Expresný vektor“ je polynukleotid, ako je DNA plazmid alebo fág (najobvyklejšie prípady), ktorý dovoľuje expresiu aspoň jedného génu, keď je vektor vnesený do hostiteľskej bunky. Vektor môže ale nemusí byť schopný replikácie v hostiteľskej bunke.

Termín „účinné množstvo“ činidla podľa vynálezu označuje také množstvo, ktoré poskytuje požadovaný výsledok alebo prejavuje požadovaný vplyv na určité ochorenie, ktoré je liečené.

Termín „funkčný ekvivalent“ aminokyselinového zvyšku je

I) aminokyselina, ktorá má rovnaké reakčné vlastnosti ako aminokyselina, ktorá je nahradená funkčným ekvivalentom,

II) aminokyselina antagonista podľa vynálezu, ktorá má podobné vlastnosti ako aminokyselina, ktorá je nahradená funkčným ekvivalentom, a

III) molekula iná ako aminokyselina, ktorá má podobné vlastnosti ako aminokyselinový zvyšok, ktorý je nahradený funkčným ekvivalentom.

Prvý polynukleotid kódujúci proteínového antagonista podľa vynálezu je „funkčne ekvivalentný“ v porovnaní s druhým polynukleotidom kódujúcim antagonistický proteín, ak spĺňa aspoň jednu z nasledujúcich podmienok:

a) „funkčne ekvivalentný“ je prvý polynukleotid, ktorý hybridizuje s druhým polynukleotidom za štandardných hybridizačných podmienok a/alebo je degenerovaný vzhľadom na sekvenciu druhého polynukleotidu. Najvýhodnejšie ide o polynukleotid, ktorý kóduje proteínový mutant majúci aktivita proteínového antagonista integrínu,

b) „funkčne ekvivalentný“ je prvý polynukleotid, ktorý kóduje expresiu aminokyselinovej sekvencie kódovanej druhým polynukleotidom.

Všeobecne „antagonista integrínu“ zahŕňa, ale nie je obmedzený len na ne, všetky činidlá uvedené v opise a tiež ich funkčné ekvivalenty. Termín „funkčný ekvivalent“ sa ta týka antagonista integrínu alebo polynukleotidu kódujúceho antagonista integrínu, ktoré majú rovnaký alebo lepší prospešný účinok na príjemcu ako pôvodný antagonista integrínu, ku ktorému sa funkčný ekvivalent vzťahuje. Odborníkovi je jasné, že funkčne ekvivalentný proteín sa môže pripraviť rekombinantnou technikou, to znamená expresiou „funkčne ekvivalentnej“ DNA. Takže predložený vynález zahŕňa proteíny kódované prirodzene sa vyskytujúcou DNA, a tiež kódovanej DNA, ktorá sa prirodzene nevyskytuje, ale kóduje rovnaký proteín, ako je kódovaný prirodzene sa vyskytujúcou DNA. V dôsledku degenerácie nukleotidových kódujúcich sekvencii sa môžu použiť iné polynukleotidy na kódovanie rovnakých integrínových proteínov. K nim patria celé alebo časti uvedených sekvencií, ktoré sa zmenili substitúciou rôznych kodónov, ktoré kódujú rovnaký aminokyselinový zvyšok v sekvencii, ide teda o tzv. umlčanú zámenu. Také zmenené sekvencie sa považujú za ekvivalenty týchto sekvencií. Tak napr. Phe (F) je kódovaný dvoma kodónmi, a síce TTC alebo TTT, Tyr (Y) je kódovaný TAC alebo TAT a His (H) je kódovaný CAC alebo CAT. Na druhej strane Trp (W) je kódovaný jediným kodónom TGG. Takže je jasné, že pre danú sekvenciu DNA kódujúcu konkrétny integrín existuje mnoho degenerovaných sekvencii, ktoré ho kódujú. Tieto degenerované sekvencie patria taktiež do rozsahu predloženého vynálezu.

Termín „chimérický“, ak sa týka antagonista podľa vynálezu znamená, že tento antagonista obsahuje spojenie (chemickým zosietením alebo kovalentnou väzbou alebo väzbou iného typu) dvoch alebo viacerých proteínov majúcich rôznorodú štruktúru a/alebo pochádzajúcich z rôznorodých zdrojov. Tak napr. chimérický antagonista a4 integrínu môže obsahovať jednu časť, ktorou je antagonista a4 integrínu alebo jeho fragment a ďalšiu časť, ktorá nie je antagonistom a4 integrínu. Rovnako tak chimérický antagonista al integrínu môže obsahovať jednu časť, ktorou je antagonista al integrínu alebo jeho fragment a ďalšiu časť, ktorá nie je antagonistom α 1 integrínu.

Druhom chimérického proteínu je „fuzny proteín“ alebo skrátene „fúzia“, čo je kolineáme kovalentaé spojenie dvoch alebo viacerých proteínov alebo ich fragmentov prostredníctvom ich peptidovej kostry, a to najvýhodnejšie prostredníctvom expresie polynukleotidovej molekuly kódujúcej tieto proteíny. Takže k výhodným fúznym proteínom patria chimérické proteíny, ktoré obsahujú antagonista integrínu a4 (alebo al) alebo jeho fragment kovalentne naviazaný k druhej časti, ktorá nie je antagonistom integrínu a4 (alebo al). Výhodné fuzne proteíny podľa vynálezu obsahujú časti intaktných protilátok, ktoré si uchovávajú väzbovú špecifita pre antigén, ako sú napr. fragmenty Fab, Fab', F(ab')2 a F(v), monoméry alebo diméry ťažkých alebo ľahkých reťazcov, diméry pozostávajúce z jedného ťažkého a jedného ľahkého reťazca a pod.

Najvýhodnejšie fuzne proteíny sú chimérické proteíny obsahujúce jednu časť, ktorou je antagonista integrínu, fúzovanú alebo inak spojenú s celým alebo časťou kĺbového a konštantného úseku ľahkého reťazca imunoglobulínu, ťažkého reťazca imunoglobulínu alebo obidvoch. Takže predložený vynález sa týka molekuly, ktorá obsahuje: (1) časť predstavujúcu antagonista integrínu, (2) druhý peptid, napr. taký, ktorý zvyšuje rozpustnosť alebo in vivo biologický polčas antagonista integrínu, ako je napr. člen superrodiny imunoglobulínov alebo jeho fragment alebo časť, to znamená napr. fragment alebo časť IgG, napr. konštantný úsek ťažkého reťazca humánneho IgGl, napr. úseky CH2, CH3 a kĺbový úsek. Špecificky „fúzia antagonista integrínu/Ig“ je proteín obsahujúci molekulu biologicky aktívneho antagonista integrínu podľa vynálezu (napr. rozpustný ligand VLA-4 alebo VLA-1) alebo jeho biologicky aktívny fragment naviazaný na N-koniec imunoglobulínového reťazca, pričom časť N-konca imunoglobulínu je nahradená antagonistom integrínu. Druhom „fúzie antagonistu integrínu/Ig“ je „fúzia integrín/Fc“, čo je proteín obsahujúci molekulu biologicky aktívneho antagonistu integrínu podľa vynálezu naviazanú na aspoň časť konštantnej domény imunoglobulínu. Výhodná Fc fúzia obsahuje antagonistu integrínu podľa vynálezu, ktorý je naviazaný k fragmentu protilátky obsahujúcemu C-koncovú doménu ťažkého reťazca imunoglobulínu.

Termín „fúzny proteín“ znamená tiež antagonistu integrínu, ktorý je chemicky spojený prostredníctvom mono- alebo heterofunkčnej molekuly s druhou časťou, ktorá nie je antagonistom integrínu (čím vzniká chimérická molekula) a je vytvorený de novo z purifikovaných proteínov, ako je opísané ďalej. Jedným príkladom chemicky spojenej (na rozdiel od rekombinantne spojenej) chimérickej molekuly je fiizny proteín, ktorý obsahuje: (1) časť zameriavajúcu podjednotku a4 integrínu, to znamená časť VCAM-1 schopnú viazať sa na VLA-4 na povrchu buniek nesúcich VLA-4, (2) druhú molekulu, ktorá zvyšuje rozpustnosť alebo in vivo biologický polčas zameriavacej časti, ako je napr. polyalkylénglykolový polymér, napr. polyetylénglykol (PEG). Časť zameriavajúca podjednotku cc4 je prirodzene sa vyskytujúci a4 ligand alebo jeho fragment, napr. VCAM-1 peptid alebo podobná sekvencia s konzervatívnymi substitúciami aminokyselín.

Termín „heterológny promótor“ označuje promótor, ktorý nie je v prirodzenom stave spojený s génom alebo purifikovanou nukleovou kyselinou.

Termín „homológia“ (a teda aj „homológny“) sa tu používa ako synonymum s termínom „identita“ („identický“) a týka sa sekvenčnej podobnosti dvoch polypeptidových molekúl alebo molekúl nukleovej kyseliny. Keď je jedna určitá pozícia v dvoch porovnávaných sekvenciách obsadená rovnakou zásadou alebo aminokyselinou (napr. pozícia v dvoch molekulách DNA je obsadená adenínom alebo pozícia v dvoch polypeptidoch je obsadená lyzínom), potom dve porovnávané molekuly sú v tejto pozícii homológne. Percento homológie medzi dvoma sekvenciami je funkciou počtu zhodných alebo homológnych pozícií, ktoré majú dve sekvencie, deleným celkovým počtom pozícií a vynásobeným 100. Tak napr. ak 6 z 10 pozícií je zhodných alebo homológnych, potom tieto sekvencie sú na 60 % homológne. Alebo napr. DNA sekvencia CTGACT a CAGGTT majú 55 % homológiu (3 pozície zo 6 sa zhodujú). Všeobecne sa porovnanie uskutočňuje, keď sú sekvencie vzájomne priradené tak, aby sa dosiahla maximálna homológia. Také priradenie a porovnanie je možné uskutočniť metódou podľa Karlin a Altschul, ktorá je ďalej podrobnejšie opísaná.

Homológne sekvencie majú zhodné alebo podobné zvyšky aminokyselín, kde podobné aminokyselinové zvyšky sú konzervatívne substitúcie alebo „povolené bodové mutácie“ zodpovedajúcich aminokyselinových zvyškov vzhľadom na priradenú referenčnú sekvenciu. V tomto zmysle „konzervatívna substitúcia“ aminokyselinového zvyšku v referenčnej sekvencií znamená substitúciu aminokyselinou, ktorá je fyzicky alebo funkčne podobná zodpovedajúcemu referenčnému zvyšku, teda napr. má podobnú veľkosť, tvar, elektrický náboj, chemické vlastnosti vrátane schopnosti vytvárať kovalentné alebo vodíkové väzby a pod. Zvlášť výhodné sú kovalentné substitúcie, ktoré spĺňajú kritériá definované ako „prijateľné bodové mutácie“ v publikácii Dayhoff a kol., Atlas of Proteín Sequence and Structure 5, Suppl. 3, Chapter 22: 352- -354, NAt. Biomed. Res. foundation, Washington D.C., 1978.

„Homológia“ aj „identita“ sú zameniteľné pojmy a týkajú sa sekvenčnej podobnosti dvoch polypeptidových sekvencií. Homológia aj identita sa môžu stanoviť porovnaním pozícií v každej z dvoch sekvencií, ktoré sú pre potreby porovnania navzájom priradené. Ak je pozícia v porovnávaných sekvenciách obsadená zhodným aminokyselinovým zvyškom, potom sú polypeptidy v tejto pozícii identické, ak je ekvivalentná pozícia obsadená rovnakou aminokyselinou (to znamená identickou) alebo podobnou aminokyselinou (napr. podobnou z hľadiska sférickej a/alebo elektrónovej povahy), potom sú polypeptidy v tejto pozícii homológne. Percento homológie alebo identity je funkciou počtu zhodných alebo homológnych pozícií, ktoré majú obidve sekvencie. „Nepríbuzné“ alebo „nehomológne“ sekvencie majú menej ako 40 % identitu, výhodne menej ako 25 % identitu so sekvenciou podľa vynálezu.

„Percento homológie“ dvoch aminokyselinových sekvencií alebo dvoch sekvencií nukleových kyselín sa stanovuje použitím priradzovacieho algoritmu podľa Karlin a Altschul (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 2264 (1990), v modifikácii podľa Karlin a Altschul (Proc. Nat. Acad. Sci., USA 90: 5873 (1993). Tento algoritmus je inkorporovaný v programoch NBLAST alebo XBLAST podľa Altschul a kol., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990). Vyhľadanie homológnej nukleotidovej sekvencie zo sekvencií podľa vynálezu sa uskutočňuje programom NBLAST s nastavením parametrov skóre = 100, dĺžka slova = 12. Vyhľadávanie proteínov homológnych k referenčnému peptidu sa uskutočňuje programom XBLAST s nastavením parametrov skóre = 50, dĺžka slova = 3. Na získanie priradenia s medzerami sa používa program Gapped BLAST podľa Altschul a kol., Nucleic Acids Res., 25: 3389 (1997). Pri aplikovaní programov BLAST a GappedBLAST sa použili štandardné parametre týchto programov (XBLAST a NBLAST, pozri http://www/ncbi.nlm.nih.gov).

Termín „izolovaný“ (zameniteľný s termínom „v podstate čistý“), ak sa týka nukleových kyselín, to znamená polynukleotidových sekvencií kódujúcich polypeptidy, znamená RNA alebo DNA polynukleotid, časť genómového polynukleotidu, cDNA alebo syntetický polynukleotid, ktorý v dôsledku svojho pôvodu alebo zaobchádzania s ním: I) nie je spojený so všetkými polynukleotidmi s ktorými je spojený v prírode (napr. je prítomný v hostiteľskej bunke ako expresný vektor alebo jeho časť), alebo II) je spojený s inou nukleovou kyselinou alebo chemickou skupinou, než s ktorými je spojený v prírode, alebo III) nevyskytuje sa v prírode.

Ako „izolovaná“ sa ďalej označuje polynukleotidová sekvencia, ktorá je I) amplifikovaná in vitro napr. metódou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), II) chemicky syntetizovaná, III) rekombinantne pripravená klonovaním alebo IV) purifikovaná, napr. štiepením a separáciou na géli. Takže „v podstate čistá nukleová kyselina“ je nukleová kyselina, ktorá nie je bezprostredne súvisle spojená s jednou alebo obidvoma sekvenciami, s ktorými je normálne spojená v prirodzenom stave v genóme organizmu, z ktorého je izolovaná. V podstate čistá DNA tiež zahŕňa rekombinantnú DNA, ktorá je súčasťou hybridného génu kódujúceho dodatočné integrínové sekvencie.

„Izolovaný“ (plne zameniteľný s termínom „v podstate čistý“), ak sa týka polypeptidov, znamená polypeptid alebo jeho časť, ktorý v dôsledku svojho pôvodu alebo zaobchádzania s ním: I) je prítomný v hostiteľskej bunke ako expresný produkt časti expresného vektora, alebo II) je spojený s proteínom alebo inou chemickou skupinou, ktoré sa odlišujú od tých, s ktorými je spojený v prírode, alebo III) nevyskytuje sa v prírode. Ako „izolovaný“ sa ďalej označuje proteín, ktorý je I) chemicky syntetizovaný alebo II) exprimovaný v hostiteľskej bunke a purifikovaný od asociovaných proteínov. Termín všeobecne znamená polypeptid, ktorý sa separoval od ostatných proteínov a nukleových kyselín, s ktorými je v prírodnom stave asociovaný. Výhodne je polypeptid separovaný aj od látok, ako sú napr. protilátky alebo gélová matrica (napr. polyakrylamid), ktoré sa používajú k purifikácii.

„Multivalentný proteínový komplex“ je niekoľko integrínových antagonistov (jeden alebo viac). Antiintegrínový protilátkový homológ alebo jeho fragment môže byť zosietený alebo naviazaný na ďalší protilátkový homológ alebo fragment. Pritom môže ísť o rovnaké alebo rôzne proteíny a rovnaké alebo rôzne protilátkové homológy alebo fragmenty.

„Mutant“ („mutácia“ a pod.) sa týka akejkoľvek zmeny v genetickom materiáli organizmu, najmä akejkoľvek zmeny (napr. delécie, substitúcie, adície alebo alterácie) v polynukleotidovej sekvencii proteínu divého typu. Termín „muteín“ označuje mutovaný proteín a používa sa zameniteľné s termínom „mutácia“.

Termín „operatívne spojená“ znamená v prípade polynukleotidovej sekvencie (DNA, RNA), že sekvencia je „operatívne spojená“ s expresnou kontrolnou sekvenciou, keď expresná kontrolná sekvencia riadi a reguluje transkripciu a transláciu tejto polynukleotidovej sekvencie. Termín „operatívne spojená“ tiež znamená, že pred polynukleotidovou sekvenciou, ktorá má byť exprimovaná, je vhodný počiatočný signál (start-signál), napr. kodón ATG, a že sekvencia je v zhodnom čítacom rámci, ktorý umožňuje expresiu polynukleotidovej sekvencie pod kontrolou expresnej kontrolnej sekvencie, a teda vedie k produkcii požadovaného polypeptidu kódovaného polynukleotidovou sekvenciou.

„Farmakologický agens“ je definovaný ako jedna alebo viac zlúčenín alebo iných chemických indivíduí, ktoré sa podávajú pacientovi (navyše s antagonistom podľa vynálezu), a ktoré ovplyvňujú pôsobenie antagonistu. Termín „farmakologický agens“ teda označuje taký agens, ktorý sa podáva v priebehu „kombinovanej terapie“, keď sa antagonista podľa vynálezu podáva buď pred, po alebo súčasne s jedným alebo viacerými farmakologickými agensmi.

„Proteín“ je polymér zložený v podstate z ktorýchkoľvek dvadsiatich proteínových aminokyselín. Aj keď termín „polypeptid“ sa často používa na označenie relatívne veľkých polypeptidov a termín „peptid“ sa často používa na označenie relatívne malých polypeptidov, použitie týchto termínov v odbore sa často prekrýva a je odlišné. V tomto opise sa termín „proteín“ používa na označenie tak peptidov, ako aj proteínov a polypeptidov, ak nie je výslovne uvedené inak.

Takže termíny „peptid(y)“, „proteín(y)“ a „polypeptid(y)“ sú v tomto opise používané zameniteľné. Tiež termíny „polynukleotidová sekvencia“ a „nukleotidová sekvencia“ sú tu používané zameniteľné.

„Rekombinantný“ znamená, že proteín pochádza z rekombinantného cicavčieho expresného systému. Pretože integríny nie sú glykozylované ani neobsahujú disulfidické väzby, môžu byť exprimované vo väčšine prokaryotických a eukaryotických expresných systémov.

Termín „malá molekula“ je definovaný v časti A2.

Termín „povrchová aminokyselina“ znamená akúkoľvek aminokyselinu, ktorá je vystavená rozpúšťadlu, keď je proteín zostavený do svojej natívnej formy.

„Hybridizačné podmienky“ sú podmienky určené koncentráciou solí a teplotou, v podstate zhodné s podmienkami 0,5xSSC až 5xSSC a 65 °C tak pre vlastnú hybridizáciu, ako aj premývanie. Tu používaný termín „štandardné hybridizačné podmienky“ je preto operačná definícia zahŕňajúca rad hybridizácií. Takže podmienky s vysokou stringenciou (prísnosťou) zahŕňajú hybridizáciu v pufŕi pre skríning plakov (obsahuje 0,2 % polyvinylpyrolidón, 0,2 % Ficoll 400, 0,2 % hovädzí sérový albumín, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, IM NaCl, 0,1 % difosforečnan sodný, 1 % SDS) s 10 % dextránsulfátom a 100 pg/ml denaturovanej sonikovanej DNA lososej spermy pri 65 °C počas 12 až 20 hodín a premývame v 75 mM NaCl/7,5 mM citrát sodný (0,5xSSC)/l % SDS pri 65 °C. Podmienky s nízkou stringenciou znamenajú napr. hybridizáciu v pufŕi na skríning plakov s 10 % dextránsulfátom a 110 pg/ml denaturovanej sonikovanej DNA lososej spermy pri 55 °C počas 12 až 20 hodín a premývanie v 300 mM NaCl/30 mM citrát sodný (2xSSC)/l % SDS pri 55 °C (pre podrobnosti pozri Ausubel a kol., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, Inc., 1989, kapitoly 6.3.1 až 6.3.6, 1989).

Termín „terapeutická kompozícia“ označuje kompozíciu obsahujúcu antagonistu podľa vynálezu a ďalšie biologicky kompatibilné prísady. Terapeutická kompozícia obsahuje ďalej tiež excipienty, ako je voda, minerály a nosiče, ako sú napr. proteíny.

Termín „pacient s fibrotickým ochorením“ sa týka pacienta trpiaceho fibrózou vnútorných orgánov, kožným fibróznym ochorením, dermálnou fibrózou a fibrotickým ochorením oka (ale tento výpočet nie je obmedzujúci). K fibróze vnútorných orgánov (napr. pečene, pľúc, obličiek, srdca, krvných ciev, gastrointestinálneho traktu) dochádza pri ochoreniach, ako je pulmonálna fibróza, myelofíbróza, cirhóza pečene, mesangiálna proliferatívna glomerulonefritída, kosákovitá glomerulonefritída, diabetická nefropatia, fibróza renálneho interstícia, renálna fibróza pacientov na cyklosporíne, nefropatia asociovaná s HIV.

K dermálnym fibróznym ochoreniam patrí (ale výpočet nie je obmedzujúci) skleroderma; morfea, keloidy, hypertrofické jazvy, familiárny kutánny kolagenóm, a névy v spojivovom tkanive kolagénového typu. K fibrotickým ochoreniam oka patrí napr. diabetická retinopatia, jazvy po chirurgickom zákroku (napr. po filtračnej operácii glaukómu alebo krížovej operácii oka) a proliferatívna vitreoretinopatia. Ďalšie fibrotické ochorenia, ktoré je možné liečiť prípravkami podľa vynálezu, sú: reumatoidná artritída, choroby spojené s dlhotrvajúcou bolesťou kĺbov a opotrebovaním kĺbov, progresívna systémová skleróza, polymyozitída, dermatomyozitída, eozinofilná fascitída, morfea, Raynaudov syndróm a nazálna polypóza. Navyše k fibrotickým ochoreniam, ktoré je možné liečiť prípravkami podľa vynálezu, patrí inhibícia nadmernej tvorby jaziev, u ktorých je známa tvorba keloidov alebo hypertrofické zjazvenie; inhibícia alebo prevencia zjazvenia alebo nadmerného zjazvenia v priebehu hojenia rôznych typov rán vrátane chirurgických rezov, chirurgických rezov brušnej steny a traumatických lacerácií, prevencia alebo inhibícia zjazvenia alebo uzáveru artérií po vykonaní angioplastiky, prevencia alebo inhibícia nadmerných jaziev alebo tvorby fibrózneho tkaniva spojenej so srdcovou fibrózou po infarkte a hypersenzitívna vaskulopatia.

„Účinné množstvo“ je také množstvo, ktoré je dostatočné na navodenie prospešného alebo požadovaného účinku. Účinné množstvo môže byť podané v jednej dávke alebo vo viacerých dávkach. V terapeutickom zmysle „účinné množstvo“ antagonistu podľa vynálezu je množstvo dostatočné na zmiernenie, potlačenie, stabilizáciu, zvrátenie, spomalenie alebo oneskorenie progresie ochorení podľa prijatých štandardov pre dané ochorenie. Detekcia a meranie ukazovateľov účinnosti terapie sa uskutočňuje celým radom rôznych diagnostických metód, napr. fyzikálnym vyšetrením vrátane krvných testov, testov pulmonálnej funkcie, rôntgen hrudníka, vyšetrenie CT; bronchoskopia, bronchoalveolámy výplach, biopsia pľúc.

Praktické uskutočnenie predloženého vynálezu vyžaduje, ak nie je špecificky uvedené inak, obvyklú techniku bunkovej a molekulárnej biológie, bunkových kultúr, mikrobiológie, rekombinantnej DNA, proteínovej chémie, farmakológie a imunológie, ktoré sú odborníkom známe a sú dostatočne opísané v odbornej literatúre.

Opis výhodných uskutočnení predloženého vynálezu

Predložený vynález je založený na zistení, že antagonisty integrínov obsahujúcich podjednotku al a/alebo a4 a ich fragmenty sa môžu využiť na liečenie pulmonálnej fibrózy.

A. Antagonisty integrínu

Pre potreby predloženého vynálezu je antagonistom integrínu antagonista akejkoľvek interakcie medzi integrínom a ním rozpoznávaným ligandom alebo receptorom, ktorý tak mení (to znamená celkom ruší, spomaľuje alebo inak modifikuje) normálne funkcie indukované interakciami ligand-receptor). V jednom výhodnom uskutočnení je antagonistom integrínu antagonista interakcií a4 integrínov s ich ligandmi, napr. interakcia VCAM-l/VLA-4. Je to agens, napr. polypeptid alebo iná molekula, ktorá môže inhibovať alebo blokovať väzbu sprostredkovanú VCAM-1 a/alebo VLA-4 alebo môže iným spôsobom modulovať funkcie VCAM-1 a/alebo VLA-4, napr. tým, že inhibuje alebo blokuje signálnu transdukciu VLA-4 sprostredkovanú ligandom VLA-4 alebo signálnu transdukciu VCAM-1 sprostredkovanú ligandom VCAM-1, a ktoré je účinné pri liečení akútnych poškodení mozgu, výhodne rovnakým spôsobom ako anti-VLA-4 protilátky.

Antagonista interakcie VCAM-l/VLA-4 je agens, ktoré má aspoň jednu z nasledujúcich vlastností: (1) pokrýva VLA-4 alebo sa viaže na VLA-4 na povrchu buniek nesúcich VLA-4 (napr. endotelových buniek) so špecificitou dostatočnou na inhibiciu interakcie VLA-4-ligand/VLA-4, napr. interakcie VCAM-l/VLA-4; (2) pokrýva alebo sa viaže na VLA-4 na povrchu buniek nesúcich VLA-4 (napr. lymfocytov) so špecificitou dostatočnou na modifikáciu, výhodne inhibiciu, transdukcie signálu sprostredkovanej VLA-4, napr. signalizácie sprostredkovanej VLA-4/VCAM-1; (3) pokrýva alebo sa viaže na VLA-4 ligand (napr. VCAM-1) na endotelových bunkách so špecificitou dostatočnou na inhibiciu interakcie VLA-4/VCAM-1; (4) pokrýva alebo sa viaže na VLA-4 ligand (napr. VCAM-1) so špecificitou dostatočnou na modifikáciu, výhodne inhibiciu signálnej transdukcie VLA-4 sprostredkovanej VLA-4 ligandom, napr. signálnej transdukcie VLA-4 sprostredkovanej VCAM-1. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu má antagonista jednu alebo obidve z vlastností 1 a 2. V inom výhodnom uskutočnení má antagonista jednu alebo obidve z vlastností 3 a 4. Navyše sa môže použiť viac ako jeden antagonista, napr. agens viažuci VLA-4 sa môže kombinovať s agensom viažucim VCAM-1.

Ďalším uskutočnením antagonistu integrínu je antagonista interakcie integrínov al s ich ligandmi, napr. interakcia kolagén/VLA-1. Je to agens, napr. polypeptid alebo iná molekula, ktorá môže inhibovať alebo blokovať väzbu sprostredkovanú kolagénom a/alebo VLA-1 alebo môže iným spôsobom modulovať funkcie kolagénu a/alebo VLA-1, napr. tým, že inhibuje alebo blokuje signálnu transdukciu VLA-1 sprostredkovanú ligandom VLA-1 alebo signálnu transdukciu kolagénu sprostredkovanú ligandom kolagénu. Antagonista interakcie kolagén/VLA-1 je agens, ktoré má aspoň jednu z nasledujúcich vlastností: (1) pokrýva alebo sa viaže na VLA-1 na povrchu buniek nesúcich VLA-1 (napr. kolagén) so špecificitou dostatočnou na inhibíciu interakcie VLA-1-ligand/VLA-1, napr. interakciu kolagén/VLA-1; (2) pokrýva alebo sa viaže na VLA-1 na povrchu buniek nesúcich VLA-1 so špecifícitou dostatočnou na modifikáciu, výhodne inhibíciu, transdukcie signálu sprostredkovanú VLA-1, napr. signalizácie sprostredkovanej VLA-1/kolagén; (3) pokrýva alebo sa viaže na VLA-1 ligand (napr. kolagén) so špecifícitou dostatočnou na inhibíciu interakcie VLA-l/kolagén; (4) pokrýva alebo sa viaže na VLA-1 ligand so špecifícitou dostatočnou na modifikáciu, výhodne inhibíciu signálnej transdukcie VLA-1 sprostredkovanej VLA-1 ligandom, napr. signálnej transdukcie VLA-1 sprostredkovanej kolagénom. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu má antagonista al jednu alebo obidve z vlastností 1 a 2. V inom výhodnom uskutočnení má antagonista jednu alebo obidve z vlastností 3 a 4. Navyše sa môže použiť viac ako jeden antagonista, napr. agens viažuci VLA-1 sa môže kombinovať s agensom viažucim kolagén.

Ako je už uvedené, antagonista používaný podľa vynálezu nie je obmedzený konkrétnym typom alebo štruktúrou molekuly, takže antagonistom podľa vynálezu a v zhode s príkladmi alebo ekvivalentom agensu podľa vynálezu je akýkoľvek agens schopný viazať sa na a4 integríny (napr. VLA-4) na povrchu buniek alebo na a4 ligand (ako je napr. VCAM-1 na povrchu buniek nesúcich a4 ligand), a ktoré účinne blokuje alebo pokrýva a4 integrin (napr. VLA-4) alebo a4 ligand (napr. VCAM-1), a nazýva sa „agens viažuci integrin a4“ a prípadne „agens viažuci ligand a4 integrínu“.

Napríklad protilátky a protilátkové homológy (podrobnejšie ešte ďalej) a tiež rozpustné formy prirodzených väzbových proteínov pre VLA-4 a VCAM-1 sú užitočné podľa vynálezu. K rozpustným formám prirodzených väzbových proteínov pre VLA-4 patria rozpustné VCAM-1 peptidy, fúzny proteín VCAM-1, bifunkčný fúzny proteín VCAM-l/Ig (napr. „chimérická“ molekula opísaná skôr), fibronektín, fibronektín majúci alternatívne zostrihnutý spojovací segment odlišný od typu III, a fibronektínové peptidy obsahujúce aminokyselinovú sekvenciu EILDV alebo podobnú konzervatívne substituovanú aminokyselinovú sekvenciu. K rozpustným formám prírodných väzbových proteínov pre VCAM-1 patria rozpustné peptidy VLA-4, VLA-4 fúzne proteíny, bifunkčný fúzny proteín VLA-4/Ig a pod.. Termín „rozpustný peptid VLA-4“ alebo „rozpustný peptid VCAM-1“ označuje polypeptid VLA-4 alebo VCAM-1, ktorý nie je schopný zakotvenia v membráne. K takým rozpustným polypeptidom patria napr. polypeptidy VLA-4 a VCAM, ktorým chýba dostatočný úsek membránovej domény na ukotvenie polypeptidu v membráne alebo sú modifikované tak, že membránová doména je nefunkčná. Tieto väzbové agensy pôsobia tak, že kompetujú s väzbovými proteínmi pre VLA-4 na bunkovom povrchu alebo iným spôsobom menia funkciu VLA-4. Napr. rozpustná forma VCAM-1 (pozri napr. Osbom a kol., 1989, Celí, 59: 1203-1211) alebo jej fragment sa môžu podávať, aby viazali VLA-4, a výhodne tak kompetovali o väzbové miesta pre VLA-4 na bunkách nesúcich VCAM-1, čo vedie k účinku podobnému podaniu antagonistov, ako sú malé molekuly alebo anti-VLA-4 protilátky.

1. Homológy anti-integrínových protilátok

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je antagonistom používaným podľa vynálezu, ktorý viaže, a teda blokuje alebo poťahuje integríny al a/alebo a4 na bunkovom povrchu (ako sú napr. VLA-1, VLA-4 alebo α4β7) a/alebo ligandy na bunkovom povrchu pre integrin al a/alebo a4 (ako je kolagén alebo VCAM-1, v uvedenom poradí) anti-VLA-1 alebo anti-VLA-4 a/alebo anti-kolagén alebo anti-VCAM-1 monoklonálna protilátka alebo homológ takej protilátky, ako už boli definované v texte. K výhodným protilátkam a protilátkovým homológom, najmä na použitie v humánnej terapii, patria humánne protilátkové homológy, humanizované protilátkové homológy, chimérické protilátkové homológy, protilátkové fragmenty Fab; Fab', F(ab')2 a F(v), monoméry alebo diméry ťažkého alebo ľahkého reťazca protilátky alebo ich kombinácie. Výhodné väzbové agensy podľa vynálezu sú monoklonálne protilátky proti VLA-4.

2. Malé molekuly ako antagonisty integrínu

Termín „malá molekula“ antagonistu integrínu označuje chemické agens (to znamená organickú molekulu) schopné narušiť interakciu integrín/ligand integrínu, napr. tým, že blokuje interakcie VLA-4/VCAM väzbou na VLA-4 alebo väzbou na VCAM-1 na povrchu buniek. Tieto malé molekuly sa môžu tiež viazať na príslušné receptory VLA-4 a VCAM-1. Malé molekuly inhibujúce VLA-4 a VCAM-1 sú samé peptidy, semipeptidové zlúčeniny alebo zlúčeniny nepeptidovej povahy, ako napr. malé organické molekuly, ktoré antagonizujú interakcie VCAM-l/VLA-4. „Malá molekula“ v zmysle predloženého vynálezu nezahŕňa protilátky ani protilátkové homológy. Všeobecne je molekulová hmotnosť malých molekúl obvykle menšia ako 1000.

Napríklad sa môžu použiť malé molekuly, ako sú oligosacharidy napodobňujúce väzbovú doménu VLA-4 ligandu a „pasujúce“ do receptorovej domény VLA-4 (pozri J.J. Devlin a kol., 1990, Science 249: 400-406 (1990); J.K. Scott a G.P. Smith, 1990, Science 249: 386-390, a patent US 4 833 092 (Geysen)). Naopak sa môžu použiť malé molekuly napodobňujúce väzbovú doménu VCAM-1 ligandu a „pasujúce“ do receptorovej domény VCAM-1.

Ďalšie príklady malých molekúl užitočných podľa predloženého vynálezu je možné nájsť v publikácii Komoriya a kol. („The Minimal Essential Sequence for a Major Celí Type Specific Adhesion Site (CS1) Within Altematively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronektin Is Leucine Aspartic AcidValine“, J. Biol. Chem., 266 (23), pp. 15075-79 (1991)). Títo autori identifikovali minimálne sekvencie aminokyselín nevyhnutné pre väzbu VLA-4 a syntetizovali rôzne prekrývajúce sa peptidy založené na aminokyselinovej sekvencií úseku CS-1 (väzbová doména VLA-4) konkrétnych druhov fibronektínu. Identifikovali peptid z 8 aminokyselín, Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr, a tiež dva menšie prekrývajúce sa pentapeptidy, Glu-Ile-Leu-Asp-Val a Leu-Asp-Val- -Pro-Ser, ktoré vykazujú inhibičnú aktivitu pre bunkovú adhéziu závislú od fibronektínu. Určité väčšie peptidy obsahujúce sekvenciu LDV sa identifikovali ako aktívne in vivo (T.A. Ferguson a kol., „Two Integrin Binding Peptides Abrogate T-cell-Mediated Immune Reaction In Vivo“, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, pp. 8072-76 (1991); a S.M. Wahi a kol., „Synthetic Fibronectin Peptides Suppress Arthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion and Recruitment“, J. Clin. Invest., 94, pp. 655-62 (1994)). Opísaný bol tiež cyklický pentapeptid, Arg-Cys-Asp-TPro-Cys (kde TPro je 4-tioprolin), ktorý inhibuje ako VLA-4 tak VLA-5 adhéziu na fibronektin (pozri napr. D.M. Nowlin a kol., „A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits α4β1 Integrinmediated Celí Adhesion“, J. Biol. Chem., 268(27); pp. 20352-59 (1993); a PCT/US91/04862). Tento pentapeptid je založený na tripeptidovej sekvencií Arg-Gly-Asp z fibronektínu, ktorá je známa ako spoločný motív v rozpoznávacom mieste pre niekoľko proteínov extracelulámeho matrixu. Príklady ďalších VLA-4 inhibítorov sú uvedené napr. v Adams a kol. „Celí Adhesion Inhibitors“, PCT/US97/13013, kde sú opísané lineárne peptidylové zlúčeniny obsahujúce β-aminokyseliny s inhibičnou aktivitou na bunkovú adhéziu. Medzinárodné patentové prihlášky WO 94/15958 a WO 92/00995 opísali cyklické peptidy a peptidomimetické zlúčeniny s inhibičnou aktivitou pre bunkovú adhéziu. Medzinárodné patentové prihlášky WO 93/08823 a WO 92/08464 opisujú zlúčeniny inhibujúce bunkovú adhéziu obsahujúcu guanidinyl, močovinu a tiomočovinu. Patent US 5 260 277 opisuje guanidinylovú zlúčeninu modulujúcu bunkovú adhéziu. Ďalšie peptidylové antagonisty VLA-4 sú opísané v D.Y. Jackson a kol., „Potent α4β1 peptide antagonists as potential anti-inflammatory agens', J. Med. Chem., 40, 3359 (1997); H. Shroff a kol., 'Small peptide inhibitors of α4β7 mediated MadCAM-1 adhesion to lymphocytes“, Bio. Med. Chem. Lett., 1, 2495 (1996); Patent US 5 510 332, PCT Publikácie WO 98/53814, WO 97/03094, WO 97/02289, WO 96/40781, WO 96/22966, WO 96/20216, WO 96/01644, WO 96/06108 a WO 95/15973.

Také malé molekuly sa môžu pripraviť tak, že sa syntetizuje množstvo peptidov (napr. dĺžky 5 až 20 aminokyselín), semi-peptidových zlúčenín alebo organických zlúčenín nepeptidovej povahy, a potom sa uskutoční skríning týchto zlúčenín na schopnosť inhibovať príslušnú interakciu VLA-l/kolagén alebo VLA4/VCAM-l (pozri patent US 4 833 092, Scott and Smith, „Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library“, Science, 249, pp. 386- -90 (1990), a Devlin a kol., „Random Peptide Libraries: A Source of Specific Proteín Binding Molecules“, Science, 249, pp. 40407 (1990).

B. Metódy prípravy homológov anti-integrínových protilátok

Metódy prípravy monoklonálnych protilátok (mAb) vrátane napr. antiintegrínových monoklonálnych protilátok, sú dobre známe (pozri napr. Mendrick a kol., 1995, Lab. Invest. 72: 367-375 (mAb k myšej antiαϊβΐ a anti-o^l); Sonnenberg a kol., 1987, J. Biol. Chem. 262: 10376-10383 (mAb k myšej 3ηη-α6β1); Yao a kol. 1996, J. Celí Sci 1996, 109: 3139-50 (mAb k myšej 3ηΙί-α7β1); Hemler a kol. 1984, J. Immunol. 132: 3011-8 (mAb k humánnemu alβ 1); Pischel a kol. 1987, J. Immunol. 138: 226-33 (mAb k humánnemu α2β1); Wayner a kol., 1988, J. Celí. Biol. 107: 1881-91 (mAb k humánnemu α3β1); Hemler a kol. 1987, J. Biol. Chem. 262: 11478-85 (mAb k humánnemu α4β1); Wayner a kol., 1988, J. Celí. Biol., 107: 1881-91 (mAb k humánnemu α5β 1); Sonnenberg a kol., 1987, J. Biol. Chem., 262: 10376-10383 (mAb k humánnemu α6β 1); A. Wang a kol., 1996, Am. J. Respir. Celí. Mol. Biol. 15: 664-672 (mAb k humánnemu α9β1); Davies a kol., 1989, J. Celí. Biol. 109: 1817-26 (mAb k humánnemu ανβΐ); Sanchez-Madrid a kol. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 748993 (mAb k humánnemu aLp2); Diamond a kol. 1993, J. Celí. Biol. 120: 1031-43 (mAb k humánnemu αΜβ2); Stacker a kol. 1991, J. Immunol. 146: 648-55 (mAb k humánnemu αΧβ2); Van der Vieren a kol., 1995, Immunity 3: 683-90 (mAb k humánnemu αΏβ2); Bennett a kol. 1983, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80: 2417-21 (mAb k humánnemu allbp3); Hessle a kol., 1984, Differentiation 26: 49-54 (mAb k humánnemu α6β4); Weinacker a kol., 1994, J. Biol. Chem. 269: 6940-8 (mAb k humánnemu ανβ5); Weinacker a kol., 1994, J. Biol. Chem. 269: 6940-8 (mAb k humánnemu ανβ6); CerfBensussan a kol. 1992, Eur. J. Immunol. 22: 273-7 (mAb k humánnemu αΕβ7); Nishimura a kol., 1994, J. Biol. Chem., 269: 28708-15 (mAb k humánnemu ανβ8); Bossy a kol., 1991, EMBO J. 10: 2375-85 (polyklonálne antisérum k humánnemu α8β 1); Camper a kol., 1998, J. Biol. Chem. 273: 20383-20389 (polyklo nálne antisérum k humánnemu αΙΟβΙ).

Výhodné antagonisty integrínu podľa predloženého vynálezu môžu byť exprimované z intaktnej alebo skrátenej genómovej alebo cDNA alebo zo syntetickej DNA v prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských bunkách. Diméme proteíny sa izolujú z kultivačného média a/alebo sú zostavené a dimerizované in vitro, aby vytvorili biologicky aktívnu molekulu. Heterodiméry sa môžu vytvárať in vitro kombináciou samostatných odlišných polypeptidových reťazcov. Alternatívne sa môžu heterodiméry pripravovať v jedinej bunke koexpresiou nukleových kyselín kódujúcich jednotlivé odlišné polypeptidové reťazce (pozri napr. WO 93/09229 alebo patent US 5 411 941, uvedené niekoľko postupov prípravy rekombinantných heterodimérnych proteínov). K výhodným hostiteľským bunkám patria bez toho, aby bol však výpočet takto obmedzený, prokaryoty ako E. coli, alebo eukaryoty ako kvasinky, Saccharomyces, bunky hmyzu alebo cicavčie bunky ako CHO, COS alebo BSC. Odborníkovi je zrejmé, že sa môžu použiť aj iné bunky.

Napríklad anti-VLA-4 protilátky sa môžu identifikovať imunoprecipitáciou 1251-značených bunkových lyzátov z buniek exprimujúcich VLA-4 (pozri Sanchez-Madrid a kol., 1986, Eur. J. Immunol., 16: 1343-1349 a Hemler a kol., 1987, J. Biol. Chem., 262, 1147811485). Protilátky anti-VLA4 môžu byť tiež identifikované prietokovou cytometriou, napr. meraním fluorescenčného farebného značenia buniek Ramos inkubovaných protilátkou, o ktorej sa domnievame, že rozpoznáva VLA-4 (pozri Elices a kol., 1990 Celí., 60: 577-584). Lymfocyty používané na prípravu hybridómových buniek sú typicky izolované z imunizovaných cicavcov, ktorých sérum už bolo v takom skríningovom teste nájdené pozitívne na prítomnosť anti-VLA-4 protilátok.

Typicky sa nesmrteľné bunkové línie (napr. línie myelómových buniek) získavajú z rovnakých cicavcov ako lymfocyty. Výhodnou nesmrteľnou bunkovou líniou je línia myších myelómových buniek, ktoré sú senzitívne na kultivačné médium obsahujúce hypoxantín, aminopterín a tymidín („médium HAT“). Typicky sú tieto HAT-senzitívne myšie myelómové bunky fúzované s myšími splenocytmi použitím polyetylénglykolu s molekulovou hmotnosťou 1500 („PEG 1500“). Hybridómové bunky vzniknuté fúziou sú selektované použitím média HAT, ktoré usmrtí nefúzované a neproduktívne fúzované myelómové bunky (nefuzované splenocyty odumierajú po niekoľkých dňoch, pretože nie sú transformované). Hybridómy produkujúce požadovanú protilátku sa detegujú skríningom supematantov hybridómových kultúr. Tak napr. hybridómy pripravené k produkcii anti-VLA-4 protilátok sa skrínujú tak, že sa testuje supematant bunkovej kultúry na secemované protilátky majúce schopnosť viazať na bunkovú líniu exprimujúcu rekombinantnú podjednotku a4 (pozri Elices a kol., citované skôr).

Na produkciu anti-VLA-4 protilátkových homológov, ktorými sú intaktné imunoglobulíny, sa hybridómové bunky pozitívne v takých testoch kultivovali v takom médiu, takých podmienkach a po taký čas, ktoré boli dostatočné na to, aby hybridómové bunky secemovali monoklonálne protilátky do kultivačného média. Techniky tkanivových kultúr a kultivačné médiá vhodné pre hybridómové bunky sú odborníkom známe. Upravený supematant z hybridómovej kultúry sa odoberie a anti-VLA-4 protilátky sa môžu prípadne ďalej purifikovať známymi metódami.

Alternatívne sa požadované protilátky pripravujú injekciou hybridómových buniek do peritoneálnej dutiny neimunizovanej myši. Hybridómové bunky proliferujú v peritoneálnej dutine a secemujúce protilátky sa hromadia v ascitálnej tekutine. Protilátky sa potom získajú odsatím ascitálnej tekutiny z peritoneálnej dutiny injekčnou striekačkou. Už skôr sa opísalo niekoľko myších monoklonálnych anti-VLA-4 protilátok, pozri napr. Sanchez-Madrid a kol., 1986, pozri skôr; Hemler a kol., 1987, pozri skôr; Pulido a kol., 1991, J. Biol. Chem., 266 (16), 10241-10245); Issekutz and Wykretowicz, 1991, J. Immunol., 147: 109 (TA-2 mAb). Tieto anti-VLA-4 monoklonálne protilátky a ďalšie anti-VLA-4 protilátky (pozri napr. patent US 5 888 507 - Biogen, Inc. vrátane tam citovaných odkazov) schopné rozpoznávať a a/alebo β reťazec VLA-4 sú užitočné tiež podľa predloženého vynálezu. Výhodné sú protilátky anti-VLA-4, ktoré rozpoznávajú epitopy a4 reťazca VLA-4 podieľajúce sa na väzbe ligandov VCAM-1 a fibronektínu (to znamená protilátky, ktoré sú schopné sa viazať na VLA-4 v mieste, ktoré sa zúčastňuje rozpoznania ligandu, a tým blokovať väzbu VCAM-1 a fibronektínu). Také protilátky sú definované ako protilátky špecifické pre epitop B (BI alebo B2) (Pulido a kol., 1991, pozri skôr) a sú to také anti-VLA-4 protilátky podľa predloženého vynálezu.

Ďalšími vhodnými väzbovými agensmi podľa predloženého vynálezu, ktoré blokujú alebo pokrývajú VLA-4 ligand, sú plne humánne monoklonálne protilátkové homológy proti VLA-4. Na ich prípravu sa používajú in vitro inštruované („primed“) humánne splenocyty, ako opísali Boemer a kol., 1991, J. Immunol., 147, 86-95. Alternatívne sa môžu pripraviť repertoárovým klonovaním, ako opísali Persson a kol., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 2432- -2436 alebo Huang and Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227236. Patent US 5 798 230 (25. august 1998, „Proces for the preparation of human monoclonal antibodies and their use“) opisuje prípravu humánnych monoklonálnych protilátok z humánnych B lymfocytov. Pri tejto metóde sú humánne B lymfocyty produkujúce protilátku imortalizované tým, že sú infikované vírusom EpsteinBarr, alebo jeho derivátom, ktorý exprimuje jadrový antigén vírusu Epstein-Barr 2 (EBNA2). Funkcia EBNA2, potrebná na imortalizáciu, je neskôr vyradená, čo vedie k zvýšeniu tvorby protilátok.

V ďalšej metóde produkcie plne humánnych protilátok (patent US 5 789 650 (4. august 1998, „Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies“) sa opisujú transgénne zvieratá s výnimkou človeka, schopné vytvárať heterológne protilátky majúce inaktivované endogénne imunoglobulínové gény. Endogénne imunoglobulínové gény sú suprimované použitím antisense polynukleotidov a/alebo antisérom namiereným proti endogénnym imunoglobulínom. Heterológne protilátky sú kódované imunoglobulínovými génmi, ktoré sa normálne nevyskytujú v genóme daného druhu transgénneho zvieraťa. Jedna alebo viac sekvencií obsahujúcich transgén nepreorganizovaného génu ťažkého reťazca heterológneho humánneho imunoglobulínu sa vnesie do zvieraťa s výnimkou človeka, a tak sa vytvorí transgénne zviera schopné funkčného preorganizovania sekvencií transgénneho imunoglobulínu a produkcie repertoáru protilátok rôznych izotypov kódovaných humánnymi imunoglobulínovými génmi. Také heterológne humánne protilátky sú produkované v B lymfocytoch, ktoré sú potom imortalizované, to znamená fuzované s imortalizovanou bunkovou líniou, ako sú napr. myelómové bunky, alebo manipuláciou B lymfocytov inými technikami, keď sa vytvorí permanentná bunková línia schopná produkovať monoklonálne heterológne plne humánne protilátkové homológy.

Veľké neimunizované humánne „phage display“ knižnice sa tiež môžu využiť na izoláciu protilátok s vysokou afinitou, ktoré je možné pripraviť ako humánne terapeutiká štandardnými metódami fágových knižníc a expresie vo fágu („phage display“) (pozri Vaughan a kol., 1996).

Ešte ďalšie výhodné väzbové agens podľa vynálezu blokujúce alebo poťahujúce ligandy integrínu je humanizovaný rekombinantný protilátkový homológ majúci anti-integrínovú špecifítu. Po pôvodných metódach prípravy pravých „chimérických protilátok“ (kde vždy celý konštantný a celý variabilný úsek pochádzal z odlišného zdroja) je v dokumente EP 0239400 (Winter a kol.) opísaný nový prístup, keď sú protilátky zmenené substitúciou (vnútri daného variabilného úseku) úseku určujúceho komplementaritu (CDR) jedného druhu týmto úsekom z iného druhu. Tento postup je možné napr. použiť na substitúciu CDR z variabilných úsekov domén ťažkého a ľahkého reťazca humánneho Ig alternatívnymi CDR z variabilných úsekov príslušných domén myšej protilátky. Tieto zmenené variabilné úseky Ig sa potom kombinujú s konštantnými úsekmi humánneho Ig, a tak sa pripravia protilátky, ktoré sú z hľadiska zloženia plne humánne, okrem substituovaného úseku myšej CDR. Predpokladalo sa, že tieto CDR-substituované protilátky budú s oveľa menšou pravdepodobnosťou vyvolávať imunitnú reakciu u ľudí v porovnaní s uvedenými pravými chimérickými protilátkami, lebo CDR-substituované protilátky obsahujú výrazne menej zložiek iného ako humánneho pôvodu. Spôsob „humanizácie“ monoklonálnych protilátok prostredníctvom tzv. „vrúbľovania“ CDR sa nazval „prestavba“ (pozri Riechmann a kol., 1988, Náture 332, 323-327; Verhoeyen a kol., 1988, Science 239, 15341536).

Typicky sa úseky určujúce komplementaritu (CDR) myšej protilátky transplantujú do zodpovedajúcich úsekov humánnej protilátky, pretože práve CDR (tri v ťažkom reťazci a tri v ľahkom reťazci protilátky) sú tie úseky myšej protilátky, ktoré sa viažu na špecifický antigén. Transplantácia CDR sa uskutočňuje metódami genetického inžinierstva, keď sa DNA sekvencie pre CDR určia klonovaním génových segmentov variabilných (V) úsekov ťažkých a ľahkých reťazcov myších protilátok a potom sa prenesú do zodpovedajúcich humánnych V úsekov miesto-cielenou mutagenézou. V záverečnej fáze tohto postupu sa pridajú génové segmenty humánnych konštantných úsekov požadovaného izotypu (obvykle γ I pre CH a χ pre CL) a gény humanizovaných ťažkých a ľahkých reťazcov sú koexprimované v cicavčích bunkách, kde produkujú rozpustné humanizované protilátky.

Prenos myších CDR do humánnych protilátok poskytuje týmto protilátkam antigénne väzbové vlastnosti pôvodných myších protilátok. Šesť úsekov CDR v myšej protilátke je umiestnených štruktúrne vo V úseku „rámcovej“ oblasti. Dôvodom, prečo je vrúbľovanie CDR úspešné, je to, že rámcové oblasti myších a humánnych protilátok majú veľmi podobné 3-D štruktúry s podobnými bodmi pripojenia CDR, takže CDR môžu byť ľahko zamenené. Také humanizované protilátkové homológy je možné pripraviť napr. ako opísali Jones a kol., 1986, Náture 321, 522-525; Riechmann, 1988, Náture 332, 323-327; Queen a kol., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 10029; a Orlandi a kol., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 3833.

Predsa len určité aminokyseliny vnútri rámcovej oblasti interagujú s CDR, a tak ovplyvňujú celkovú väzbovú afinitu k antigénu. Priamy prenos CDR z myšej protilátky s cieľom pripraviť rekombinantnú humanizovanú protilátku bez akejkoľvek modifikácie V úsekov rámcovej oblasti humánnej protilátky, často vedie k čiastočnej alebo aj úplnej strate väzbovej afinity. V mnohých prípadoch bola kritickým momentom zámena aminokyselinových zvyškov v rámcovej oblasti akceptorovej protilátky, aby sa získala protilátka s väzbovou afinitou.

Queen a kol., 1989 (pozri už uvedenú publikáciu) a dokument WO 90/07861 (Proteín Design Labs) opísali prípravu humanizovanej protilátky, ktorá obsahuje modifikované zvyšky v rámcovej oblasti akceptorovej protilátky tým, že sa kombinovali úseky CDR z myšej monoklonálnej protilátky (anti-Tac) s konštantnými úsekmi a rámcovou oblasťou humánneho imunoglobulínu. Ukazálo sa tak jedno riešenie problému straty väzbovej afinity, ku ktorej často dochádza pri priamom prenose CDR bez príslušnej modifikácie zvyškov V úseku humánnej rámcovej oblasti, pričom toto riešenie obsahuje dva základné kroky. V prvom kroku sa pomocou počítačovej analýzy vyberú V úseky humánnej rámcovej oblasti, ktoré majú optimálnu homológiu proteínovej sekvencie s V úsekom rámcovej oblasti pôvodnej myšej protilátky, v opisovanom prípade monoklonálnej protilátky anti-Tac. V druhom kroku sa pomocou počítača modeluje terciáma štruktúra V úsekov myšej protilátky, aby sa vizualizovali aminokyselinové zvyšky rámcovej oblasti protilátky, ktoré by mohli in teragovať s myšími CDR, a tieto aminokyselinové zvyšky z myšej sekvencie sú prenesené na homológny humánny rámcový úsek (pozri patenty US 5 693 762; 5 693 761; 5 585 089 a 5 530 101 (Proteín Design Labs).

Môže sa tiež využiť odlišný postup (Tempest a kol., 1991, Biotechnology 9, 266-271) a využiť ako štandard V úseky z rámcovej oblasti z ťažkých a ľahkých reťazcov NEWM a REI na vrúbľovanie CDR bez radikálneho vnášania aminokyselinových zvyškov myších sekvencií. Výhodou postupu konštrukcie humanizovaných protilátok založených na NEWM a REI, ako ho opísali Tempest a kol., je to, že trojrozmerné štruktúry variabilných úsekov NEWM a REI sú známe z rontgenovej kryštalografíe, a je teda možné modelovať špecifické interakcie medzi CDR a aminokyselinovými zvyškami V úseku rámcovej oblasti.

Bez ohľadu na použitý prístup príklady doteraz pripravených počiatočných homológov humanizovaných protilátok ukázali, že taká príprava nie je jednoduchý proces. Ale aj keď uznáme, že nejaké zmeny v rámci protilátky sú potrebné, nie je možné na základe dostupných znalostí a stavu techniky predpovedať, ktoré aminokyselinové zvyšky, ak nejaké, z rámcového úseku protilátky majú byť zmenené, aby sa získala funkčná humanizovaná rekombinantná protilátka s požadovanou špecificitou. Doterajšie výsledky ukazujú, že zmeny potrebné na zachovanie špecificity a afinity sú väčšinou jedinečné pre danú protilátku a nie je ich možné predvídať na základe humanizácie inej protilátky.

K antagonistom integrínu obsahujúceho podjednotku a4 užitočným podľa predloženého vynálezu patria chimérické a humanizované rekombinantné protilátkové homológy (to znamená intaktné imunoglobulíny a ich časti) so špecificitou B epitopu, ktoré sa pripravili a sú opísané v patente US 5 932214 (monoklonálny HP1/2). Východiskovým materiálom na prípravu chimérických (myšie variabilné - humánne konštantné) a humanizovaných homológov anti-integrínových protilátok sú myšie monoklonálne anti-integrínové protilátky, ako sú opísané skôr, monoklonálne anti-integrínové protilátky komerčne dostupné (napr. HP2/1, Amae Intemational; Inc., Westbrook, Maine), alebo monoklonálne anti-integrínové protilátky pripravené podľa predloženého vynálezu. Ďalšie výhodné humanizované anti-VLA4 protilátkové homológy sú opísané v Medzinárodnej patentovej prihláške PCT/US95/01219, Athena Neurosciences, Inc. (27. júla 1995) a v patente US

840 299 (publikácie vložené formou odkazu). Tieto humanizované anti-VLA-4 protilátky obsahujú humanizovaný ľahký reťazec a humanizovaný ťažký reťazec. Humanizovaný ľahký reťazec obsahuje tri úseky určujúce komplementaritu (CDR1, CDR2 a CDR3) majúcu aminokyselinové sekvencie zo zodpovedajúcich úsekov určujúcich komplementaritu z myšieho ľahkého reťazca imunoglobulínu 21.6 a rámec variabilného úseku z rámca variabilného úseku humánneho ľahkého χ reťazca s výnimkou aspoň jednej pozície, ktorá je obsadená rovnakou aminokyselinou, ako je prítomná v ekvivalentnej pozícii v rámcovom úseku variabilnej oblasti ľahkého reťazca imunoglobulínu 21.6. Humanizovaný ťažký reťazec obsahuje tri úseky určujúce komplementaritu (CDR1, CDR2 a CDR3) majúcu aminokyselinové sekvencie zo zodpovedajúcich úsekov určujúcich komplementaritu z myšieho ťažkého reťazca imunoglobulínu 21.6 a rámec variabilného úseku z rámca variabilného úseku humánneho ťažkého reťazca s výnimkou aspoň jednej pozície, kde je pozícia obsadená rovnakou aminokyselinou, aká je prítomná v ekvivalentnej pozícii v rámcovom úseku variabilnej oblasti ťažkého reťazca imunoglobulínu 21.6.

Podľa predloženého vynálezu sa používajú antagonistické molekuly, kódované sekvenciami nukleových kyselín, ktoré hybridizujú za stringentných podmienok so sekvenciami nukleových kyselín kódujúcich protilátky namierené proti integrínom obsahujúcim podjednotku a4. Napríklad anatagonista podľa predloženého vynálezu je proteín, ktorému zodpovedajúca nukleová kyselina hybridizuje za podmienok vysokej stringencie s jednou alebo viacerými sekvenciami nukleových kyselín opísaných v tabuľke 6 v patente US 5 840 299, alebo sekvenciou komplementárnou s jednou alebo viacerými z týchto sekvencií. Antagonista môže byť tiež proteín, ktorého nukleová kyselina hybridizuje za podmienok vysokej stringencie s nukleovou kyselinou kódujúcou sekvenciu SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 4 z patentu US 5 932 214. Ďalej antagonista je aj proteín, ktorého nukleová kyselina hybridizuje za podmienok vysokej stringencie s nukleovou kyselinou kódujúcou variabilnú doménu protilátky produkovanej bunkovou líniou ATCC CRL 11175.

Alternatívne je antagonistom podľa predloženého vynálezu proteín, ktorému zodpovedajúca nukleová kyselina hybridizuje za podmienok nízkej stringencie s jednou alebo viacerými sekvenciami nukleových kyselín opísaných v tabuľke 6 v patente US 5 840 299, alebo sekvenciou komplementárnou s jednou alebo viacerými z týchto sekvencií. Antagonista môže byť tiež proteín, ktorého nukleová kyselina hybridizuje za podmienok nízkej stringencie s nukleovou kyselinou kódujúcou sekvenciu SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 4 z patentu US 5 932 214. Ďalej antagonista je aj proteín, ktorého nukleová kyselina hybridizuje za podmienok nízkej stringencie s nukleovou kyselinou kódujúcou variabilnú doménu protilátky produkovanej bunkovou líniou ATCC CRL 11175.

C. Príprava fragmentov a anafógov

Fragmenty izolovaných antagonistov a4 integrínu (to znamená fragmenty tu opísaných protilátkových homológov) je možné tiež účinne pripravovať rekombinantnými metódami, proteolytickým štiepením alebo chemickou syntézou, a síce použitím postupov, ktoré sú odborníkom známe. Použitím rekombinantných techník sa vnútorné alebo výsledné fragmenty polypeptidu pripravujú odstránením jedného alebo viacerých nukleotidov z jedného konca (v prípade terminálneho fragmentu) alebo obidvoch koncov (v prípade vnútorného fragmentu) z DNA sekvencie kódujúcej izolovaný polypeptid. Expresia takto mutovanej DNA poskytuje polypeptidové fragmenty. Štiepenie endonukleázami, ktoré „okusujú konce“, môže tiež poskytnúť DNA kódujúce spektrum rôznych fragmentov. DNA kódujúce fragmenty proteínu sa môžu pripraviť tiež náhodným (nešpecifickým) „strihaním“ DNA alebo štiepením restriktázami alebo kombináciou obidvoch postupov. Proteínové fragmenty môžu tiež byť pripravené priamo z intaktných proteínov. Peptidy sa môžu špecificky štiepiť proteolytickými enzýmami, ku ktorým patrí (pričom výpočet nie je obmedzujúci) pfazmín, trombín, trypsín, chymotrypsín a pepsín. Každý z týchto enzýmov je špecifický pre určitý typ peptidovej väzby, ktorú štiepi. Trypsín katalyzuje hydrolýzu peptidových väzieb, kde je karbonylová skupina zo zásaditej aminokyseliny, obvykle arginínu alebo lyzínu. Pepsín a chymotrypsín katalyzujú hydrolýzu peptidových väzieb z aromatických aminokyselín, ako je tryptofán, tyrozín a fenylalanín. Alternatívne súpravy naštiepených proteínových fragmentov sa pripravia tým, že sa zabráni štiepeniu v miestach, ktoré sú citlivé k proteolytickým enzýmom. Tak napr. reakcia ε-aminoskupiny lyzínu s etyltrifluórtioacetátom v mierne zásaditom roztoku vedie k zablokovaniu aminokyselinových zvyškov, ku ktorým priľahlá peptidová väzba už ďalej nie je hydrolyticky štiepiteľná trypsínom. Proteíny môžu byť modifikované, aby vytvárali peptidové väzby, ktoré sú citlivé k proteolytickým enzýmom. Napr. alkylácia cysteínových zvyškov β-haloetylamínmi poskytuje peptidové väzby, ktoré nie sú hydrolyzované trypsínom (Lindley, (1956) Náture 178, 647). Navyše sa môžu použiť chemické činidlá, ktoré štiepia peptidové reťazce v miestach špecifických zvyškov. Napr. brómkyán štiepi peptidy v metionínovom zvyšku (Gross and Witkip, (1961), J. Am. Chem. Soc. 83, 1510). Takže pôsobením rôznych kombinácií modifikujúcich proteolytických enzýmov a/alebo chemických činidiel na proteíny, môžu byť proteíny rozložené na fragmenty požadovaných dĺžok, ktoré sa neprekrývajú, alebo na prekrývajúce sa fragmenty požadovaných dĺžok.

Fragmenty môžu byť tiež syntetizované chemicky, použitím metód, ktoré sú odborníkom známe, ako je napr. Merrifieldova chemická syntéza na pevnej fáze používajúca Fmoc alebo í-Boc (pozri Merrifield, Recent Progress in Hormone Research 23:451 (1967)).

Príklady metód známych zo stavu techniky, ktoré umožňujú prípravu a testovanie fragmentov a analógov, sú diskutované ďalej. Tieto alebo analogické metódy je možné použiť na prípravu a skríning fragmentov a analógov izolovaných antagonistov integrálu a4, ktoré majú biologickú aktivitu. Príklad metódy na testovanie toho, či fragmenty a analógy antagonistov integrálu obsahujúcich podjednotku a4 majú biologickú aktivitu, je uvedený v sekcii IV a v príkladoch.

D. Príprava zmenených DNA sekvencií a peptidových sekvencií: náhodné metódy

Varianty aminokyselinových sekvencií proteínov sa môžu pripraviť náhodnou mutagenézou DNA, ktorá kóduje protein alebo jeho určitú časť. K užitočným metódam patria PCR mutagenézy a saturačné mutagenézy. Knižnica náhodných variantov aminokyselinových sekvencií sa môže tiež pripraviť použitím syntézy sady degenerovaných oligonukleotidových sekvencií. Metódy prípravy variantov aminokyselinových sekvencií daného proteínu použitím zmenených DNA sekvencií alebo peptidových sekvencií sú odborníkom dobre známe. Nasledujúce príklady sú uvedené na ilustráciu týchto postupov a predložený vynález nijako neobmedzujú. Odborníkovi je jasné, že pre tento cieľ je možné použiť aj iné metódy.

PCR mutagenéza:

Pozri napr. Leung a kol., (1989) Technique 1, 11-15.

Saturačná mutagenéza:

Jedna z metód je všeobecne opísaná v Mayers a kol., (1989) Science 229, 242.

Mutagenéza s degenerovanými oligonukleotidmi:

Pozri napr. Harang, S.A., (1983) Tetrahedron 39, 3; ftakura a kol., (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 323 a Itakura a kol., Rekombinantné DNA, Proc. 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules, pp. 273-289 (A.G. Walton, ed.), Elsevier, Amsterdam, 1981.

E: Príprava zmenených sekvencií DNA a peptidových sekvencií:

Priame metódy

Nenáhodná alebo cielená mutagenéza poskytuje špecifické sekvencie alebo mutácie v špecifických častiach polynukleotidových sekvencií, ktoré kódujú izolované polypeptidy, čím vznikajú varianty, ktoré zahŕňajú delécie inzercie alebo substitúcie aminokyselinových zvyškov známej aminokyselinovej sekvencie izolovaného polypeptidu. Mutované miesta môžu byť modifikované individuálne alebo v sériách napr. tým, že sa (1) substituujú sa najskôr konzervatívnymi aminokyselinami a potom sa uskutočňujú radikálnejšie zmeny v závislosti od získaných výsledkov, (2) uskutoční sa delécia cieľového aminokyselinového zvyšku, alebo (3) do susedstva vybraného miesta sa vložia aminokyselinové zvyšky rovnakej alebo odlišnej triedy, alebo sa kombinujú kroky 1 až 3.

Je jasné, že metódy miesto-cielenej mutagenézy sú jedným spôsobom, ako vniesť do danej polypeptidovej sekvencie N-koncový cysteín (alebo jeho funkčný ekvivalent), aby sa pripravilo miesto na pripojenie hydrofóbnej skupiny.

Alanínová skenovacia mutagenéza:

Pozri Cunningham and Wells, (1989) Science 244, 1081-1085.

Mutagenéza sprostredkovaná oligonukleotidmi:

Pozri napr. Adelman a kol., (1983) DNA 2, 183.

Kazetová mutagenéza:

Pozri Wells a kol., (1985) Gene 34, 315.

Kombinačná mutagenéza:

Pozri napr. Ladner a kol., WO 88/06630.

Stratégia „Fág Display“

Pozri napr. prehľadná publikácia Marsk a kol., J. Biol. Chemistry: 267 16007-16010 (1992).

F. Ďalšie varianty antagonistov integrínu

Varianty sa môžu líšiť od ostatných tu opísaných antagonistov integrínu v aminokyselinovej sekvencii alebo spôsobom, ktorý sa netýka sekvencie, a alebo obidvoma spôsobmi. Najvýhodnejšie polypeptidy podľa vynálezu obsahujú modifikácie inej ako sekvenčnej (nesekvenčnej) povahy, ku ktorým patrí in vivo alebo in vitro chemická derivatizácia (napr. ich N-konca), a tiež prípadne zmeny acetylácie, metylácie, fosforylácie, amidácie, karboxylácie alebo glykozylácie.

K ďalším analógom patria proteíny alebo ich biologicky aktívne fragmenty, ktorých sekvencia sa líši od sekvencii opísaných v patentoch US 5 840 299, 5 888 507 a 5 932 214 (zahrnuté formou odkazu) alebo v medzinárodnej prihláške PCT US/94/00266 jednou alebo viacerými substitúciami konzervatívnej alebo nekonzervatívnej aminokyseliny, alebo deléciami alebo inzerciami, ktoré nenarušujú biologickú aktivitu izolovaného proteínu. Ku konzervatívnym substitúciám typicky patria substitúcie jednej aminokyseliny inou aminokyselinou s podobnými vlastnosťami, ako napr. substitúcie v rámci nasledujúcich skupín aminokyselín: valín, alanín a glycín; leucín a izoleucín; asparágová a glutámová kyselina; asparagín a glutamín; serín a treonín; lyzín a arginín; a fenylalanín a tyrozín. Ku skupine nepolámych hydrofóbnych aminokyselín patrí alanín, leucín, izoleucín, valín, prolín, fenylalanín, tryptofán a metionín. Skupina polárnych neutrálnych aminokyselín obsahuje glycín, serín, treonín, cysteín, tyrozín, asparagín a glutamín. Ku skupine pozitívne nabitých (zásaditých) aminokyselín patrí arginín, lyzín a histidín. Ku skupine negatívne nabitých (kyslých) aminokyselín patrí asparágová a glutámová kyselina. Ďalšie konzervatívne zámeny sú odborníkovi ihneď zrejmé. Tak napr. aminokyselinu alanín je možné konzervatívne substituovať ktoroukoľvek aminokyselinou zo skupiny obsahujúcej D-alanín, glycín, β-alanín, Δ-cysteín a D-cysteín. Lyzín je možné nahradiť ktoroukoľvek aminokyselinou zo skupiny obsahujúcej D-lyzín, arginín, D-arginín, homoarginín, metionín, D-metionín, omitín a D-omitín.

Ďalšími analógmi vhodnými pre predložený vynález sú analógy modifikované tak, aby sa zvýšila stabilita peptidu. Také analógy obsahujú napr. jednu alebo viac nepeptidových väzieb (ktoré nahradzujú pôvodné peptidové väzby) v peptidovej sekvencii. Patria sem tiež: analógy obsahujúce aminokyselinové zvyšky iné ako v prírode sa vyskytujúce Δ-aminokyseliny, ako sú napr. D-aminokyseliny alebo aminokyseliny nevyskytujúce sa v prírode alebo syntetické aminokyseliny, ako sú napr. β- alebo γ-aminokyseliny alebo cyklické analógy aminokyselín. Inkorporácia D-aminokyseliny namiesto pôvodnej Δ-aminokyseliny v izolovanom polypeptide môže zvýšiť jeho rezistenciu k proteázam (pozri patent US 5 219 990).

K výhodným protilátkovým homológom patria aminokyselinové sekvencie, ktoré majú aspoň 60 % 80 %, 90 %, 95 %, 98 % alebo 99 % homológiu s aminokyselinovou sekvenciou protilátky PS/2 (pozri príklady) alebo obsahujú aminokyselinovú sekvenciu s aspoň 60 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % alebo 99 % homológiou s aminokyselinovými sekvenciami opísanými v patente US 5 840 299 (SEQ ID NO: 15 -variabilný úsek ľahkého reťazca, alebo SEQ ID NO: 17 - variabilný úsek ťažkého reťazca) alebo v patente US 5 932 214 (SEQ ID NO: 2 alebo 4) a v medzinárodnej patentovej prihláške WO 94/16094 (sekvencia vyskytujúca sa v anti-VLA4 protilátke produkovanej uloženou bunkovou líniou ATCC CRL 11175).

G. Formy polymérových konjugátov

Podľa predloženého vynálezu je možné použiť jedinú molekulu polyméru na konjugáciu a antagonista integrálu al alebo a4, ale je možné pripojiť aj viac ako jednu molekulu polyméru. Konjugované kompozície antagonista integrínu a4 podľa vynálezu sú užitočné tak na in vivo, ako aj iné ako in vivo aplikácie. Navyše je možné, aby konjugované polyméry používali ešte ďalšie akékoľvek iné kupóny, časti alebo ďalšie konjugované molekuly podľa výsledného cieľa zvolenej aplikácie. Tak napr. v niektorých aplikáciách môže byť užitočné kovalentne naviazať na polymér funkčnú skupinu, ktorá poskytuje polyméru rezistenciu proti degradácii UV-žiarením, alebo antioxidačné vlastnosti alebo iné vlastnosti. Ďalším príkladom aplikácie môže byť výhodná funkcionalizácia polyméru, aby bol reaktívny a mohol sa zosietením naviazať na molekulu liečiva, čím sa môžu zlepšiť rôzne vlastnosti celkového konjugovaného materiálu. Teda polymér môže obsahovať akékoľvek funkčné skupiny, opakujúce sa skupiny, väzby alebo iné základné štruktúry, ktoré nevylučujú jeho účinnú konjugáciu s kompozíciou antagonista integrínu a4 pre zamýšľaný cieľ. Ďalšie výhody predloženého vynálezu budú zrejmé z ďalšieho opisu a z patentových nárokov.

Príklady polymérov, ktoré je možné výhodne použiť v predloženom vynáleze na dosiahnutie požadovaných vlastností kompozícií sú opísané ďalej na príklade niektorých reakčných schém. V kovalentne viazaných konjugátoch antagonista/polymér môže byť polymér funkcionalizovaný a potom naviazaný na voľné aminoskupiny antagonistmi, čím sa vytvoria labilné väzby.

Antagonisty integrínov obsahujúcich podjednotku a4 alebo al sú najvýhodnejšie konjugované prostredníctvom koncových reaktívnych skupín na polymér, aj keď konjugácia sa môže tiež „vetviť“ z vnútorných, teda nekoncových reaktívnych skupín. Polymér s reaktívnou skupinou (skupinami) je označovaný ako „aktivovaný polymér“. Reaktívna skupina selektívne reaguje s voľnou aminoskupinou alebo inou reaktívnou skupinou v molekule antagonista. Aktivovaný polymér sa nechá reagovať tak, že k napojeniu dôjde na akejkoľvek dostupnej aminoskupine antagonista integrínu, ako je napr. α-aminoskupina alebo ε-aminoskupina lyzínu. Voľné karboxylové skupiny, vhodne aktivované karbonylové skupiny, guanidylová skupina, oxidované sacharidy a merkaptoskupiny antagonista integrínu a4 (ak sú dostupné) môžu sa tiež využiť ako miesta pripojenia.

Aj keď polymér môže byť pripojený kdekoľvek na molekulu antagonista integrínu, výhodné miesto na naviazanie polyméru na antagonista integrínu (najmä ak ide o proteín) je N-koniec antagonista integrínu. Sekundárne miesto (miesta) je na alebo v blízkosti C-konca a alebo prostredníctvom cukrových skupín (ak nejaké v molekule sú). Takže predložený vynález zahŕňa (I) konjugáty antagonistov integrínu al a a4 s N-koncovo naviazaným polymérom, (II) konjugáty antagonistov integrínu al a a4 s C-koncovo naviazaným polymérom, (III) konjugáty spojené prostredníctvom sacharidu, a tiež (IV) konjugáty antagonistov integrínu al a a4 s C-koncovo, N-koncovo aj cez cukor naviazaným polymérom.

Všeobecne sa používa 1,0 až 10 molov aktivovaného polyméru na 1 mól antagonista, v závislosti od koncentrácie antagonista. Výsledné množstvo je rovnováhou medzi maximalizáciou rozsahu reakcie a minimalizáciou nešpecifických modifikácií produktu, a súčasne určením reakcie, ktorá udrží optimálnu aktivita, a pritom bude podľa možností optimálny polčas antagonista. Výhodne je zachovaných aspoň 50 % biologickej aktivity antagonista, najvýhodnejšie je zachovaných 100 %.

Reakcia sa môže uskutočňovať akýmkoľvek odborníkovi známym spôsobom vhodným na reakciu biologicky aktívneho materiálu s inertnými polymérmi. Všeobecne taký spôsob zahŕňa prípravu aktivovaného polyméru (ktorý má aspoň jednu koncovú hydroxylovú skupinu) a potom reakciu antagonista s aktivovaným polymérom, čím vznikne rozpustný proteín vhodný na formuláciu do prípravku. Tieto modiftkačné reakcie sa uskutočňujú rôznymi metódami v jednom alebo viacerých krokoch.

Ako už bolo uvedené skôr, v niektorých uskutočneniach vynálezu sa používa N-koniec antagonista integrínu na pripojenie k polyméru. Vhodné konvenčné metódy sú k dispozícii na selektívnu prípravu N-koncovo modifikovaných antagonistov integrínu al alebo a4. Príkladom jednej takej metódy je metóda redukčnej alkylácie, keď sa využíva odlišná reaktivita rôznych typov primárnych aminoskupín (ε aminoskupiny na lyzíne oproti aminoskupinám na N-konci metionínu) prístupných na derivatizáciu na vhodných antagonistoch integrínu. Za vhodných selekčných podmienok je možné dosiahnuť v podstate selektívnu derivatizáciu vhodného antagonista integrínu na jeho N-konci polymérom obsahujúcim karbonylovú skupinu. Reakcia sa uskutočňuje pri pH, ktoré dovoľuje využiť výhodu rozdielnych pKa pre ε-aminoskupiny lyzínových zvyškov a a-aminoskupinu N-koncového zvyšku v molekule antagonista integrínu. Tento spôsob chemickej modifikácie je odborníkom dobre známy.

Stratégia naviazania polyalkylénglykolových polymérov, ako je napr. PEG na C-koniec antagonistov integrínu al alebo a4 (napr. proteínov) môže byť buď chemické naviazanie alebo genetická manipulácia miesta, ktoré sa môže využiť na napojenie polymérovej časti. Tak napr. inkorporácia Cys do miesta v blízkosti alebo na C-konci proteínu umožní špecifickú modifikáciu použitím maleimidom, vinylsulfónom alebo haloacetátom aktivovaných derivátov polyalkylénglykolu (napr. PEG), ktoré sú odborníkom známe. Tieto deriváty sa môžu použiť na špecifickú modifikáciu geneticky vnesených cysteínových zvyškov vďaka vysokej selektivite týchto činidiel pre Cys. K ďalším stratégiám, predstavujúcim alternatívy pre modifikáciu C-konca an tagonistu integrínu podľa vynálezu patrí inkorporácia histidovej značky („tag“), ktorá potom môže byť zacielená (Fancy a kol., (1996) Chem. & Biol. 3: 551) alebo ďalších glykozylačných miest v proteine.

Metódy zameriavania cukrov ako miest chemickej modifikácie sú tiež dobre známe a je teda pravdepodobné, že polyalkylénglykolové polyméry môžu byť priamo a špecificky pridané k cukrom (ak také sú) na molekule antagonistu integrínu, ktoré boli aktivované oxidáciou. Napr. polyetylénglykol-hydrazid sa môže pripraviť vo forme relatívne stabilných hydrazónových reťazcov kondenzáciou s aldehydmi a ketónmi. Táto vlastnosť sa využila na modifikáciu proteinov prostredníctvom oxidovaných oligosacharidových reťazcov (pozri Andresz, H. a kol., (1978), Macromol. Chem. 179: 301). Konkrétne pôsobením nitritu na PEG-karboxymetylhydrazid sa pripraví PEG-karboxymetylazid, čo je elektrofilne aktívna skupina reagujúca s aminoskupinami. Táto reakcia sa môže využiť na prípravu polyalkylénglykolom modifikovaných proteinov (pozri patent US 4 101 380 a 4 179 337).

Na vytvorenie kompozícií obsahujúcich multivalentné antagonisty integrínu cti alebo a4 je možné tiež použiť odborníkom známy postup sprostredkovaný tiolovým linkerom (spojkou) na zosietenie proteinov. Konkrétne reaktívne aldehydové skupiny na sacharidových častiach molekuly sa vytvoria pomocou j odistanu sodného, vytvoria sa cystamínové konjugáty prostredníctvom týchto aldehydov a indukuje sa zosietenie prostredníctvom tiolových skupín na cystamínoch (pozri Pepinsky, B. a kol., (1991), J. Biol. Chem., 266: 1824418249 a Chen, L.L. a kol., (1991), J. Biol. Chem., 266: 18237-18243). Teda je tento chemický postup vhodný tiež na modifikácie polyalkylénglykolovými polymérmi, keď linker je inkorporovaný do sacharidu a polyalkylénglykolový polymér je pripojený k linkeru. Aj keď linkery obsahujúce aminotiol alebo hydrazín umožňujú pripojenie jednej polymérovej skupiny, štruktúra linkera môže byť menená tak, aby bolo možné pripojiť viac polymérov a/alebo bola zmenená priestorová orientácia polyméru vzhľadom na molekulu antagonistu integrínu.

V praktickom uskutočnení vynálezu sa výhodne do požadovaných polymémych systémov inkorporujú polyalkylénglykolové zvyšky alkylpolyalkylénglykolov s alkylovou skupinou obsahujúcou 1 až 4 atómy uhlíka, výhodne polyetylénglykol (PEG), alebo poly(oxy)alkylénglykolové zvyšky z takých glykolov. Takže polymér, ku ktorému je proteín pripojený, môže byť homopolymér polyetylénglykolu (PEG) alebo je to polyoxyetylovaný polyol, v každom prípade za predpokladu, že ide o polymér rozpustný vo vode pri teplote miestnosti. K príkladom takých polymérov, ktoré však nie sú obmedzujúce, patria homopolyméry polyalkylénoxidu, ako je PEG alebo polypropylénglykoly, polyoxyetylénované glykoly, ich kopolyméry a blokové kopolyméry, za predpokladu, že blokové kopolyméry si uchovávajú rozpustnosť vo vode. K príkladom polyoxyetylovaných polyolov patrí polyoxyetylovaný glycerol, polyoxyetylovaný sorbitol, polyoxyetylovaná glukóza a pod. Glycerolová kostra polyoxyetylovaného glycerolu je zhodná s kostrou vyskytujúcou sa v prírode, napr. v mono-, di- a triglyceridoch živočíchov a človeka. Teda takto rozvetvená kostra by nemala byť v tele rozpoznávaná ako cudzorodé činidlo.

Ako alternatíva k polyalkylénoxidom sa môže použiť dextrán, polyvinylpyrolidóny, polyakrylamidy, polyvinylalkoholy, polyméry založené na sacharidoch a ďalšie. Odborníkovi je zrejmé, že skôr uvedené výpočty sú len ilustratívne a že vynález zahŕňa akékoľvek ďalšie polyméme materiály opísaných vlastností.

Polymér nemusí mať nejakú konkrétnu molekulovú hmotnosť, aleje výhodné, keď molekulová hmotnosť leží v rozsahu 300 až 100 000, výhodnejšie 10 000 až 40 000. Najmä veľkosti 20 000 a viac sú výhodné na zabránenie strát proteinov pri filtrácii v obličkách.

Derivatizácia polyalkylénglykolu má rad výhodných vlastností na formuláciu konjugátov antagonistu integrínu s polymérom podľa vynálezu, ktoré sú spojené s nasledujúcimi vlastnosťami polyalkylénglykolových derivátov: majú lepšiu rozpustnosť vo vode, a súčasne nevyvolávajú antigénnu alebo imunogénnu reakciu, vysoký stupeň biologickej kompatibility, absencia biologickej degradácie polyalkylén-glykolových derivátov in vivo a ľahké vylučovanie zo živých organizmov.

Navyše v inom aspekte predloženého vynálezu sa môže použiť antagonista integrínu al alebo a4 kovalentne naviazaný na polymérovú zložku, kde povaha konjugátu je taká, že obsahuje štiepiteľné kovalentné chemické väzby. To potom umožňuje riadiť časový priebeh odštiepenia polyméru od antagonistu integrínu. Kovalentná väzba medzi liečivom, to znamená antagonistom integrínu a polymérom sa môže štiepiť chemickou alebo enzymatickou reakciou. Produkt „polymér-antagonista integrínu“ si pritom uchováva prijateľnú hladinu aktivity. Súčasne sú prítomné v konjugovanom polymére časti polyetylénglykolu, ktoré poskytnú produktu polymér-antagonista integrínu vysokú rozpustnosť vo vode a predĺžený čas cirkulácie v krvnom obehu. V dôsledku týchto zlepšených vlastností je možné podľa vynálezu uvažovať pri in vivo aplikáciách o parenterálnom, nazálnom alebo perorálnom podávaní obidvoch druhov aktívnych molekúl polymérantagonista integrínu, a po hydrolytickom štiepení je možné očakávať dobrú biologickú dostupnosť antagonistu integrínu samotného.

Odborníkovi je jasné, že tu opísané reakčné schémy sú len na ilustratívne potreby a nie sú nijako obmedzujúce vzhľadom na reakcie a štruktúry, ktoré sa môžu použiť na modifikácie antagonistov integrínu al alebo a4, aby sa dosiahla dobrá rozpustnosť, stabilita a afinita k bunkovej membráne pri parenterálnom a perorálnom podávaní. Aktivita a stabilita týchto konjugátov antagonistov integrínu podľa predloženého vynále zu môže do istej miery kolísať, keď sa použijú polyméry s rôznou veľkosťou molekuly. Rozpustnosť konjugátov sa môže meniť v závislosti od podielu a veľkosti polyetylénglykolového fragmentu vloženého do polymémej kompozície.

III. Využitie vynálezu

Množstvo účinnej látky, ktoré sa kombinuje s nosičovým materiálom do jednotkovej liekovej formy závisí od toho, aký pacient sa má liečiť a aký je zvolený spôsob podávania. Je treba však rozumieť, že konkrétne dávky a liečebný režim určitého pacienta sú závislé od mnohých faktorov, ako je napr. aktivita konkrétnej použitej účinnej látky, vek, hmotnosť, pohlavie a aktuálny stav pacienta, diéta, čas podávania, rýchlosť vylučovania, kombinácia s liečivami, závažnosť liečeného ochorenia a názor ošetrujúceho lekára. Množstvo účinnej látky bude tiež závisieť od profylaktických alebo liečivých prípravkov, ktoré sú podávané súčasne.

Podľa vynálezu sa antagonisty majú podávať pacientovi v úinnom množstve. Používajú sa také dávky, ktoré predstavujú účinné, netoxické množstvo. Odborník je schopný použitím rutinných postupov určiť optimálne dávky na liečenie konkrétneho ochorenia.

Farmaceutické prípravky

Prípravky obsahujúce antagonista podľa vynálezu sú výhodne na parenterálne podanie. Termín „parenterálne“ podávanie zahŕňa podávanie subkutánne, intravenózne, intramuskuláme, infraartikuláme, intrasynoviálne, intrastemálne, intratekálne, intrahepatickou a intrakraniálnou injekciou alebo injekciou priamo do lézie alebo infúzne podávanie. Požadovaná dávka je na podanie pacientovi jedenkrát alebo viackrát za deň intravenózne, perorálne, rektálne, parenterálne, intranazálne, topicky alebo inhaláciou. Požadovaná dávka môže byť tiež na podanie kontinuálnou intravenóznou infúziou.

Protilátkové homológy sa výhodne podávajú ako sterilné farmaceutické kompozície obsahujúce farmaceutický prijateľný nosič, čo je ktorýkoľvek zo známych nosičov, ako je voda, soľný roztok, fosfátom pufŕovaný soľný roztok, dextróza, glycerol, etanol a ďalšie, alebo ich kombinácie. Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa môžu použiť vo forme farmaceutický prijateľných solí odvodených z anorganických alebo organických kyselín a zásad. K príkladom takých kyslých solí patrí acetát, adipát, alginát, aspartát, benzoát, benzénsulfonát, bisulfát, butyrát, citrát, kamforát, kamforsulfonát, cyklopentánpropionát, diglukonát, dodecylsulfát, etánsulfonát, fumarát, glukoheptanoát, glycerofosfát, hemisulfát, heptanoát, hexanoát, hydrochlorid, hydrobromid, hydrojodid, 2-hydroxyetánsulfonát, laktát, maleát, metánsulfonát, 2-naftalénsulfonát, nikotinát, oxalát, pamoát, pektinát, persulfát, 3-fenylpropionát, pikrát, pivalát, propionát, sukcinát, tartrát, tiokyanát, tozylát a undekanoát. K zásaditým soliam patria amóniové soli, soli alkalických kovov, ako sú sodné a draselné soli, soli kovov alkalických zemín, ako sú vápenaté a horečnaté soli, soli s organickými zásadami, ako sú napr. dicyklohexylamínové soli, ŕV-metyl-Z)-glukamín, tris(hydroxymetyl)metylamín a soli s aminokyselinami ako je arginín, lyzín atď. Zásadité skupiny obsahujúce dusík môžu byť kvarterizované činidlami, ako sú halogenidy nižších alkylov, ako sú metyl-, etyl-, propyl- a butylchlorid, -bromid a -jodid; dialkylsulfáty, ako je dimetyl-, dietyl, dibutyl a diamylsulfát, halogenidy s dlhším reťazcom, ako sú decyl-, lauryl-, myristyl- a stearyl chlorid, -bromid a jodid, aralkylhalogenidy, ako sú benzyl- a fenyletylbromid a ďalšie. Získajú sa tak prípravky rozpustné alebo dispergovateľné vo vode alebo v oleji.

Farmaceutické kompozície podľa predloženého vynálezu obsahujú ktorúkoľvek zo zlúčenín podľa vynálezu alebo jej farmaceutický prijateľný derivát, spolu s akýmkoľvek farmaceutický prijateľným nosičom. Termín „nosič“ v opise vynálezu označuje farmaceutický prijateľné adjuvans a vehikulá. K farmaceutický prijateľným nosičom vhodným na uskutočnenie predloženého vynálezu patria (ale výpočet nie je obmedzujúci) ionomeniče, oxid hlinitý, stearát hlinitý, lecitín, sérové proteíny, ako je napr. humánny sérový albumín, pufŕovacie látky, ako sú napr. fosfáty; glycín, kyselina sorbová, sorbát draselný, čiastočné glyceridové zmesi rastlinných nasýtených mastných kyselín, vody, solí alebo elektrolytov, ako je napr. protamínsulfát, hydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan draselný, chlorid sodný, zinočnaté soli, koloidný oxid kremičitý, kremičitan horečnatý, polyvinylpyrolidón, látky založené na celulóze, polyetylénglykol, sodná soľ karboxymetylcelulózy, polyakryláty, vosky, blokové polyméry, polyetylénpolyoxypropylén, polyetylénglykol a tak z ovčej vlny.

Farmaceutické kompozície podľa predloženého vynálezu môžu byť tiež vo forme sterilných injekčných prípravkov, ako je napr. sterilná injikovateľná vodná alebo olejová suspenzia. Taká suspenzia sa formuluje odborníkovi známym postupom pomocou vhodných dispergujúcich, zvlhčovacích alebo suspendujúcich činidiel. Sterilné injikovateľné prípravky môžu byť tiež sterilné injikovateľné roztoky alebo suspenzie v netoxickom parenterálne prijateľnom rozpúšťadle alebo riedidle, ako je napr. roztok v 1,3-butándiole. K vhodným farmaceutický prijateľným vehikulom a rozpúšťadlám, ktoré sa môžu použiť, patrí voda, Ringerov roztok a izotonický roztok chloridu sodného. Okrem toho sterilné, stále oleje sú používané ako obvykle, ako rozpúšťadlá alebo suspendačné médiá. Na tento účel sa môže použiť akýkoľvek nedráždivý stály olej vrátane syntetických mono- alebo diglyceridov. Mastné kyseliny, ako je kyselina olejová a jej glyceridové deriváty sú užitočné na prípravu injikovateľných prípravkov, rovnako tak ako prírodné farmaceutický prijateľné oleje, ako je olivový olej, ricínový olej, zvlášť ich polyoxyetylované verzie.

Farmaceutické kompozície podľa vynálezu sa môžu podávať perorálne. Ak sa podávajú perorálne, môžu sa podávať v každej perorálne prijateľnej dávkovej forme vrátane (výpočet nie je limitujúci) toboliek, tabliet, vodných suspenzií alebo roztokov. V prípade tabliet na perorálne použitie obvykle používané nosiče zahŕňajú laktózu a kukuričný škrob. Sú tiež typicky pridávané lubrikanty, ako napríklad stearát horečnatý. Na perorálne podávanie vo forme toboliek zahŕňajú použiteľné riedidlá laktózu a usušený kukuričný škrob. Keď je na perorálne použitie vyžadovaná vodná suspenzia, aktívna zložka je spojená s emulgátormi a suspendujúcimi činidlami. Ak je žiaduce, môžu sa tiež pridať určité sladidlá, príchute alebo farbivá.

Zvláštne kompozície na použitie podľa vynálezu sú kompozície, keď antagonista podľa vynálezu je formulovaný do vezikulov, ako sú napr. kompozície obsahujúce lipozómy. Lipozómy sú vezikuly (mechúriky) vytvorené amfipatickými molekulami, ako sú napr. poláme lipidy, napr. fosfatidylcholíny, etanolamíny a seríny, sfingomyelíny, kardiolipíny, plazmalogény, fosfatidové kyseliny a cerebrozidy. Lipozómy sa vytvoria, keď sa vhodné amfipatické molekuly nechajú napučiavať vo vode alebo vodnom roztoku, aby vytvorili tekuté kryštály s obvykle viacvrstvovou štruktúrou obsahujúcou niekoľko dvojvrstiev vzájomne separovaných vodou (označované ako surové lipozómy). Iným známym typom sú lipozómy tvorené jedinou dvojvrstvou obaľujúcou vodnú fázu, ktoré sa nazývajú jednovrstvové vezikuly. Ak je vo vodnej fáze v priebehu napučiavania lipidov prítomný vo vode rozpustný materiál, je zachytený vo vodnej vrstve medzi lipidovými dvojvrstvami.

Zvlášť vhodnou metódou na formuláciu antagonistov podľa vynálezu do lipozómových prípravkov je metóda opísaná v európskom patente EP-A-253 619, ktorý je zahrnutý formou odkazu. Pri tejto metóde sa lipozómy s jedinou dvojvrstvou obaľujúcou účinnú látku pripravia tým, že sa lipidová zložka rozpustí v organickom médiu, a organický roztok lipidovej zložky sa pod tlakom vstrekuje do vodnej zložky za súčasného premiešavania organickej a vodnej zložky vysokorýchlostným homogenizátorom alebo iným miešacím zariadením, pričom sa spontánne vytvárajú lipozómy. Lipozómy s jednou dvojvrstvovou obaľujúcou účinnou zložkou sa môžu použiť na topickú aplikáciu buď priamo alebo vo vhodnom farmaceutický prijateľnom nosiči. Viskozita lipozómov sa môže zvýšiť pridaním jedného alebo viacerých zahusťovacích činidiel, ako je napr. xantánová guma, hydroxypropylcelulóza, hydroxypropylmetylcelulóza alebo ich zmesi.

Vodná zložka je buď samotná voda, alebo môže obsahovať elektrolyty, pufŕovacie systémy a ďalšie zložky ako napr. konzervačné látky. K vhodným elektrolytom patria soli kovov, ako napr. soli alkalických kovov alebo soli kovov alkalických zemín. Výhodné soli sú chlorid vápenatý, chlorid sodný a chlorid draselný. Koncentrácia elektrolytov môže byť rôzna, od 0 do 260 mM, výhodne 5 mM až 160 mM. Vodná zložka je umiestnená do vhodnej nádoby, ktorá umožňuje uskutočňovať homogenizáciu, ktorá sa realizuje silnou turbulenciou, v priebehu vstrekovania organickej zložky. Homogenizácia dvoch zložiek sa uskutočňuje v nádobe, alternatívne sa vodná a organická zložka vstrekujú oddelene do miešacieho zariadenia, ktoré je umiestnené mimo nádoby. V takom prípade sa lipozómy tvoria v tomto miešacom zariadení a v nádobe sa len zhromažďujú.

Organickú zložku tvorí vhodné netoxické farmaceutický prijateľné rozpúšťadlo, ako je napr. etanol, glycerol, propylénglykol a polyetylénglykol, a vhodný fosfolipid, ktorý je rozpustný v rozpúšťadle. K vhodným fosfolipidom patrí napr. lecitín, fosfatidylcholín, fosfatidylserín, fosfatidyletanolamín, fosfatidylinositol, lyzofosfatidylcholín a fosfatidylglycerol. Ďalšie lipofilné prísady sa môžu použiť na selektívnu modifikáciu vlastností lipozómov. K príkladom takých prísad patrí napr. stearylamín, kyselina fosfatidová, tokoferol, cholesterol a lanolínové extrakty.

Navyše sa do organickej zložky môžu pridávať ďalšie prísady, napr. zabraňujúce oxidácii fosfolipidov. K takým prísadám patrí napr. tokoferol, butylovaný hydroxyanizol, butylovaný hydroxytoluén, askorbylpalmitát a askorbyloleát. Tiež sa môžu pridať konzervačné činidlá ako kyselina benzoová, metylparabén alebo propylparabén.

Okrem opísaných kompozícií sa pre vynález môžu využiť aj obväzové formy, ako napr. náplasti, ovínadlá, obväzy, gázové vankúšiky a pod., obsahujúce vhodné množstvo liečiva, to znamená anti-VLA protilátky. V niektorých prípadoch sa môžu použiť náplasti, ovínadlá, obväzy, gázové vankúšiky a pod., ktoré sa impregnovali topickým prípravkom obsahujúcim liečivý prípravok.

Farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu sa môžu tiež podávať ako nazálny aerosól alebo inhalovaním s použitím nebulizéra, inhalátora suchého prášku alebo inhalátora s odmeranými dávkami. Také kompozície sa pripravujú postupmi dobre známymi v odbore formulácie farmaceutických prípravkov a môžu sa pripraviť obvykle ako roztoky vo fyziologickom roztoku, s využitím benzylalkoholu alebo ďalších vhodných konzervačných prostriedkov, činidiel podporujúcich absorpciu na zvýšenie biologickej dostupnosti prípravku, fluorovaných uhľovodíkov a/alebo ďalších obvyklých solubilizačných alebo dispergujúcich činidiel.

V iných uskutočneniach kompozície obsahujúce zlúčeninu podľa vynálezu môžu ďalej obsahovať ďalšie činidlo vybrané zo skupiny zahŕňajúcej kortikosteroidy, protizápalové činidlá, imunosupresíva, antimetabolity a imunomodulátory. Špecifické zlúčeniny v každej z týchto skupín môžu byť vybrané z akýchkoľvek zlúčenín uvedených v príslušnej skupine v publikácii „Comprehensive Medicinal Chemistry“ (Pergamon Press,

Oxford, England, ss. 970-986, 1990), pričom tento opis uvedených látok je zahrnutý formou odkazu. Patria sem také zlúčeniny, ako napríklad teofylín, sulfasalazín, a aminosalicyláty (protizápalové látky); cyklosporín, FK-506 a rapamycín (imunosupresíva); cyklofosfamid a metotrexát (antimetabolity); steroidy (inhalačné, perorálne alebo topické) a interferóny (imunomodulátory).

Dávkovanie zlúčenín podľa vynálezu a liečebný režim potrebné na dosiahnutie požadovaného liečebného účinku závisia od celého radu faktorov, ako je napr. povaha použitej zlúčeniny, vek, telesná hmotnosť, pohlavie a všeobecný zdravotný stav pacienta, diéta, čas podávania, rýchlosti vylučovania, vážnosť konkrétneho liečeného ochorenia, požadovaný liečebný cieľ a úsudok ošetrujúceho lekára.

Použiteľná hladina dávok aktívnej zložky je v rozsahu asi 0,001 a asi 100 mg/kg telesnej hmotnosti denne, výhodne v rozsahu asi 0,1 a asi 50 mg/kg telesnej hmotnosti denne. Najvýhodnejšie, VLA-4 viažuce činidlo, keď ide o protilátku alebo jej derivát, je podávané v dávke 0,1 mg/kg telesnej hmotnosti/deň až 20 mg/kg telesnej hmotnosti/deň, výhodne 0,1 mg/kg až 10 mg/kg telesnej hmotnosti/deň v režime jedenkrát za 1 až 14 dní. V prípade malých molekúl alebo väzbových činidiel iných ako protilátok sú vhodné dávky molámymi ekvivalentmi dávok určených pre protilátky. Výhodne je protilátková kompozícia podávaná v množstve, ktoré poskytuje účinnú hladinu protilátky v plazme aspoň 1 mg/ml. Optimalizáciu dávok je možné určiť na základe podávania väzbového činidla a následného vyhodnotenia potiahnutia buniek pozitívnych na integrín činidlom v priebehu času po podaní danej dávky in vivo.

Prítomnosť podávaného agensu môže byť delegovaná in vitro (alebo tiež ex vivo) pomocou neschopnosti alebo zníženej schopnosti buniek pacienta viazať rovnaké činidlo, ktoré bolo samé označené (napr. fluorochrómom). Výhodné dávkovanie by malo viesť k detegovateľnému potiahnutiu prevažnej väčšiny buniek pozitívnych na integrín. Výhodne by toto potiahnutie buniek malo pretrvávať v prípade protilátkového homológa počas 1 až 14 dní.

Odborník môže ľahko testovať antagonistu podľa vynálezu, či má požadovaný účinok. Odborník na to použije napr. štandardné testy na vyhodnotenie klinického zotavovania (napr. výplach a použitie FACS skenovania na väzbu protilátok, zlepšenie nútenej vitálnej pľúcnej kapacity). Tak napr. bunky obsiahnuté vo vzorke pacientovho pľúcneho tkaniva sa môžu testovať na prítomnosť agensu in vitro (alebo ex vivo) použitím druhého činidla na detekciu podávaného agensu. Môže to byť napr. fluorochrómom značená protilátka špecifická k podávanému agensu, ktorá sa potom meria štandardnou FACS analýzou (triedenie fluorescenciou aktivovaných buniek). Alternatívne prítomnosť podávaného agensu môže byť detegovaná in vitro (alebo tiež ex vivo) pomocou neschopnosti alebo zníženej schopnosti buniek pacienta viazať rovnaké činidlo, ktoré bolo samotné označené (napr. fluorochrómom). Výhodné dávkovanie by malo viesť k detegovateľnému potiahnutiu prevažnej väčšiny buniek pozitívnych na integrín. Výhodne by toto potiahnutie buniek malo pretrvávať v prípade protilátkového homológa počas 1 až 14 dní.

Nasledujúce príklady slúžia na ilustráciu predloženého vynálezu a v žiadnom prípade ho nijako neobmedzujú.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Zvieracie modely pľúcnej fibrózy

Existuje mnoho dôkazov účasti zápalových buniek a mediátorov v pulmonálnej fibróze na modeli hlodavcov s bleomycínom (BL). Tento model fibrózy je príťažlivý najmä preto, že vytvára charakteristický obraz fibrózy s mnohými zložkami ako u humánnej fibrózy, a tiež preto, že BL-indukovaná pulmonálna fibróza je dobre známym nežiaducim účinkom v humánnej chemoterapii. Intratracheálna (IT) instilácia (nakvapkanie) BL u hlodavcov sa často používa na výskum mechanizmov fibrogenézy a na skríning potenciálnych antifibrotických zlúčenín. Aj keď pôvodnou príčinou BL-indukovanej pľúcnej toxicity je vytváranie kyslíkových radikálov (ROS), akonáhle sa naviažu na železo a DNA, proces vedúci k výslednej manifestácii pulmonálnej fibrózy zahŕňa uvoľnenie rôznych zápalových mediátorov (Girl a Wang., Comments Toxicol., 3: 145-176 (1989)). Patogenéza BL-indukovaného poškodenia pľúc začína edémom, hemorágiou a bunkovým infiltrátom s prevládajúcimi neutrofilmi a makrofágmi. Nadmerná akumulácia zápalových leukocytov v cievnych, intersticiálnych a alveolárnych priestoroch pľúc potom spôsobuje poškodenie ciev a parenchýmu tvorbou ROS a proteolytických enzýmov. Neutrofily obsahujú značné množstvá myeloperoxidázy (MPO), ktorá oxiduje Cľ na kyselinu chlórnu (HOCI) v reakcii s H₂O₂ a je známe, že práve HOCI pochádzajúca z neutrofílov spôsobuje bunkovú toxicitu. ROS pochádzajúce z makrofágov a neutrofílov sú schopné stimulovať produkciu prozápalových fibrogénnych cytokínov, ktoré sprostredkovávajú zosilnenú fibroproliferatívnu reakciu (Phan a Kunkel., Exp. Lung Res., 18: 29-43 (1992)). Okrem rozsiahlej infiltrácie zápalových buniek je fibrotický proces ďalej charakterizovaný hyperproliferatívnou reakciou aktivovaných fibroblastov. Fibroblastom podobné bunky sú primáme zodpovedné za absolútne zvýšenie obsahu kolagénu v pľúcach a abnormality v ultraštruktúre a priestorovej distribúcii rôznych typov kolagénu.

Príklad 2

Inhibícia fibrózy použitím antagonista integrínu obsahujúceho podjednotku a4

Materiály a metódy

V tomto experimente sa použila nešpecifická kontrolná protilátka (1E6) a protilátka proti integrínu obsahujúcemu podjednotku ct4 (PS2). 1E6 je myšia anti-humánna LFA3 (doména 1) monoklonálna IgGl protilátka (pozri Miller, Hochman, Meier, Tizard, Bixler, Rosa, and Wallner (1992) J. Exp. Med. 178: 211-222. PS/2 sa pripravila metódou podľa Miyake a kol., J. Exp. Med., 173: 599-607 (1991)).

Samci myší C57BL/6 bez chronického respiračného ochorenia s hmotnosťou 25 až 30 g sa zakúpili od firmy Charles River Laboratory. Sulfát bleomycínu (predávaný pod chráneným označením Blenoxane) bol dar od firmy Bristol Laboratories (Syracuse, NY). L-[3,4-3//]prolín slúžiaci na označenie prokolagénového substrátu prolylhydroxylázy sa získal od firmy NEN Life Science Products (Boston, MA), Z-fix, pufrovaný vodný roztok zinkformalínu sa získal od firmy Anatech, LTD (Battle Creek, MI). Všetky ostatné reagencie boli v štandardnej čistote chemických reagencií alebo lepšie a získali sa zo štandardných komerčných zdrojov.

Ošetrovanie experimentálnych zvierat

Myši sa umiestnili v klietkach po 4 zvieratách a zaobchádzalo sa s nimi v súlade s príslušnými pokynmi (NIEI Guidelines for Animal Welfare). Myši sa pred ošetrením nechali 1 týždeň, aby sa aklimatizovali. Udržiaval sa cyklus 12 hodín svetlo/12 hodín tma a zvieratá mali neobmedzený prístup k vode aj k potrave (Rodení Laboratory Chow). Zvieratá sa náhodne rozdelili do 4 experimentálnych skupín: 1) SA + SA; 2) BL + + IE6; 3) BL + SA; a 4) BL + +PS2. Myši sa intratracheálne (IT) injikovali jednou dávkou fyziologického roztoku alebo BL dávkou 0,08 jednotiek/100 μΐ/myš pri anestézii xylazínom a ketamínom. Po IT instilácii myši dostali IP injekciu IE6, SA alebo PS2 (100 pg/0,2 ml/myš) trikrát týždenne. Dvadsať dní po IT instilácii BL sa myši utratili v anestézii pentobarbitálom a tekutina z bronchoalveolámeho výplachu (BALF) sa podrobila biochemickej a histopatologickej analýze.

Príprava BALF a pľúcneho tkaniva

Po anestézii sa otvorila brušná dutina a potom sa uskutočnila exsangvinácia zostupnej abdominálnej aorty. Pľúca sa pripravili na výplach kanyláciou trachey tupou ihlou nasadenou na injekčnú striekačku. Pľúcny výplach sa uskutočnil 3 ml chladného izotonického roztoku soli, podaného v 1 ml alikvotoch. Alikvot BALF sa rozdelil na odpočet celkového počtu buniek. Zostávajúca BALF sa centrifugovala pri 1500 g počas 20 minút v 4 °C, a výsledný supematant sa rozdelil na alikvoty a uložil do -70 °C. Po výplachu sa pľúcne laloky rýchlo zbavili neparenchymatického tkaniva a okamžite zmrazili v tekutom dusíku a uložili do -70 °C.

Neskôr sa zamrazené pľúca roztopili a homogenizovali v 0,1 M KC1, 0,02 M Tris (pH 7,6) v homogenizátori Polytron (Brinkmann Inštrumente Inc., Westbury, NY). Homogenát sa dôkladne premiešal opakovaným obrátením a výsledné objemy homogenátu (4-5 ml) sa zaznamenali. Homogenát sa rozdelil na niekoľko alikvotov a uložil do -70 °C na neskoršie biochemické analýzy.

Stanovenie obsahu malóndialdehydových ekvivalentov a hydroxyprolínu v pľúcach

Malóndialdehydové ekvivalenty v pľúcach sa stanovili z celkového množstva produktov reagujúcich s tiobarbiturovou kyselinou v nefrakcionovanom homogenáte postupom podľa Ohkawa a kol., Anál. Biochem., 95: 351 (1979). Pre test hydroxyprolínu v pľúcach sa 1 ml homogenátu precipitoval s 0,25 ml ľadovo vychladenej 50 % (hmotn./objem) trichlóroctovej kyseliny, centrifugoval a precipitát sa hydrolyzoval v 2 ml 6 N HC1 počas 18 hodín v 110 °C. Obsah hydroxyprolínu sa potom meral postupom podľa Woessner, J.F., Árch. Biochem. Biophys., 93: 440 (1961).

Stanovenie aktivít prolylhydroxylázy (EC 1.14.11.2)

Príprava substrátu (prokolagén) prolylhydroxylázy a spôsob testovania prolylhydroxylázy sú opísané v Giri, S.N. a kol., Exp. Mol. Pathol. 39: 317 (1983). Stručne zhrnuté, čerstvo vybrané tíbie z 10 dňových kuracích embryí sa značili [3H]prolínom v kultivačnom médiu bez prolínu pri 37 °C počas 6 hodín. Po odstránení neinkorporovanej značky opláchnutím sa tkanivo homogenizovalo a centrifugovalo pri 3000 g počas 20 minút v 4 °C. Výsledný supematant sa extenzívne dialyzoval, aby sa odstránila neinkorporovaná značka. Značený prokolagénový substrát sa rozdelil na alikvoty a uložil v -70 °C. Inkubačná zmes pre enzýmový test v celkovom objeme 2 ml obsahovala síran železnatoamónny (0,1 mmol/1), α-ketoglutarovú kyselinu (0,1 mmol/1), [3H]prolín-prokolagén (200 000 dpm), homogenát pľúcneho tkaniva (0,2 ml), kyselinu askorbovú (0,5 mmol/1), a TRIS-HC1 pufor (0,1 mol/1, pH 7,8). Reakcia sa zastavila pridaním 0,2 ml 50 % trichlóroctovej kyseliny po 30 minútach v 37 °C v metabolickej trepačke podľa Dubnoffa. V priebehu reakcie sa uvoľňovala tríciovaná voda v stechiometrickom pomere k prolylhydroxylácii a použila sa ako meradlo enzymatickej aktivity. Tríciovaná voda v reakčnom systéme sa separovala vákuovou destiláciou celej reakčnej zmesi a odmerala sa jej rádioaktivita. Enzymatická aktivita sa vyjadrila v dpm tríciovanej vody uvoľnenej z celkového objemu pľúc za 30 minút.

Stanovenie počtov buniek v BALF

Celkový počet buniek v BALF sa stanovil postupom, ktorý opísali Wang, Q. a kol., Lab. Invest., 67: 234242 (1992). Celkový počet leukocytov v BALF sa určil pomocou počítača Coulter (Model F, Coulter Electronics; Inc., Hialeah, FL) podľa inštrukcií výrobcu.

Test na proteín v BALF

Obsah proteínu v BALF supematante sa určil použitím proteínového testu Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), pričom ako štandard sa použil hovädzí sérový albumín.

Histopatologická a imunohistochemická analýza

Tri až štyri zvieratá z každej skupiny sa náhodne vybrali na histopatologické a imunohistochemické vyšetrenie na konci experimentu. Otvorila sa im brušná dutina a potom sa uskutočnila exsangvinácia zostupnej abdominálnej aorty. Ihneď potom sa pľúca pripravili na histologickú analýzu podľa Wang a kol. (pozri už uvedenú publikáciu). Po kanylácii trachey tupou ihlou sa otvorila pľúcna dutina a pľúca so srdcom sa vybrali en bloc. Pľúca sa fixovali roztokom Z-fix tracheou pri tlaku 30 cm H₂O. Pravý kraniálny a kaudálny lalok a ľavý lalok pľúc sa neskôr blokovali, zaliali do parafínu a narezali na 7 pm rezy a zafarbili hematoxylínom a eozínom. Na imunohistochemické farbenie na aSMA, sa rezy pľúcneho tkaniva deparafinovali a blokovala sa endogénna peroxidáza. Rezy určené na farbenie sa potom ošetrili blokujúcim kozím sérom počas 30 minút a inkubovali 16 hodín primárnou monoklonálnou anti-aSMA protilátkou (Sigma Chemical Co., St Louis, MO).

Štatistická analýza dát

Dáta sa vyjadrili v prepočte na celé pľúca a sú uvedené ako priemerné hodnoty ± stredná chyba (SE). Dáta zo štyroch skupín zvierat sa porovnali použitím dvojfaktorovej analýzy rozdielu (SIGMASTAT) metódou podľa Student-Newman-Keulse. Hodnota P < 0,05 sa považovala za štatisticky významnú.

Výsledky

Peroxidácia lipidov v pľúcach myší

Obsah malóndialdehydových ekvivalentov v pľúcach bol ako index peroxidácie lipidov testovaný u rôznych skupín myší. BL instilácia významne zvýšila obsah malóndialdehydových ekvivalentov v pľúcach myší tak v skupine BL+IE6, ako aj BL+SA na rozdiel od skupín SA+SA a BL+PS2 (dáta neuvedené). Ošetrenie PS2 účinne blokovalo BL-indukovanú peroxidáciu lipidov, pretože hladina malóndialdehydových ekvivalentov v pľúcach u skupiny BL+PS2 nebola odlišná od skupiny SA+SA.

Obsah hydroxyprolínu v pľúcach myší

Obsah hydroxyprolínu v pľúcach, kľúčový index hladiny kolagénu v pľúcach sa stanovil pre 4 skupiny myší. IT instilácia BL významne zvýšila hladinu hydroxyprolínu v pľúcach v skupine BL+IE6 a BL+SA na 185 % a 205 % kontrolnej skupiny SA+SA, v uvedenom poradí. BL indukované zvýšenie hydroxyprolínu v pľúcach u skupiny BL+PS2 sa významne znížilo o 35 % podávaním PS2 v porovnaní so skupinou BL+SA. Hladina hydroxyprolínu v pľúcach skupiny BL+TR nebola významne vyššia ako kontrolná skupina IT SA (SA+SA).

Aktivita prolylhydroxylázy v pľúcach myší

Aktivita prolylhydroxylázy v pľúcach myší rôznych skupín ukazuje, že BL samotný významne zvyšuje aktivitu prolylhydroxylázy v skupine BL+SA na 207 % kontrolnej skupiny SA+SA. PS2 významne znížila zvýšenie prolylhydroxylázovej aktivity vyvolanej podaním BL u skupiny BL+SA.

Celkový počet buniek v BALF

Celkové počty buniek v BALF u rôznych skupín myší, 21 dní po IT instilácii soľného roztoku alebo BL ukázali, že podanie BL zvýšilo celkové počty buniek v BALF skupín BL+IE6 a BL+SA v porovnaní s kontrolnou skupinou (SA+SA), aj keď len skupina BL+IE6 mala počty štatisticky významne vyššie ako skupina SA+SA. Počet buniek v BALF v skupine BL+PS2 sa nelíšil od skupiny SA+SA.

Obsah proteínov v BALF

Obsah proteínov v supematante BALF meraný u 4 experimentálnych skupín myší odhalil, že IT instilácia BL štatisticky významne zvýšila obsah proteínov v BALF u všetkých ošetrených skupín v porovnaní s kontrolnou skupinou SA+SA. Ale podanie PS2 v skupine BL+PS2 znížilo BL-indukované zvýšenie proteínu v supernatante BALF, aj keď tento rozdiel nebol štatisticky významný.

Histopatológia pľúc myší

Histologické vyšetrenie myších pľúc ukázalo normálne pľúcne parenchymatické tkanivo u skupiny SA+SA. Ale pľúca myší zo skupín BL+IE6 a BL+SA prejavovali difúznu alveolitídu a multifokálnu intersticiálnu fíbrózu obsahujúcu akumulovanú extracelulámu fíbróznu hmotu. Pľúca myší z týchto skupín mali zosilnené interalveoláme steny a zápalové bunky v susedných vzdušných priestoroch. V porovnaní so skupinami BL+IE6 a BL+SA, pľúca myší skupiny BL+PS2 mali oveľa menej fibrotických lézií, aj keď niektoré laloky vykazovali mierny stupeň intersticiálnej fibrózy.

Imunohistochemické farbenie na aSMA v pľúcach myší

Na stanovenie akumulácie fibroblastov a fíbroblastom podobných buniek u myší po ošetrení sa skúmala expresia aSMA v pľúcnom tkanive použitím monoklonálnej protilátky proti aSMA. V pľúcach kontrolných zvierat sa imunopozitivita objavila vo vrstvách vaskulámeho a bronchiálneho hladkého svalstva. V pľúcach ošetrených BL a kontrolnou protilátkou alebo soľným roztokom boli extenzívne a intenzívne imunopozitívne oblasti vo fibrotických oblastiach, tak v interstíciu, ako aj v pohrudnici. Ale pľúca ošetrené BL a PS2 javili výrazne znížené imunofarbenie aSMA, v porovnaní so skupinami BL+IE6 a BL+SA.

Diskusia

IPF je invalidizujúce ochorenie a zle odpovedá na súčasnú terapiu. V predloženej štúdii sú poskytnuté dôkazy, že integrín obsahujúci podjednotku oc4 je ďalším možným cieľom v terapii IPF. Všeobecne sa predpokladá, že leukocyty v pľúcach sa podieľajú na rozvoji pulmonálnej fibrózy tým, že secemujú ROS, fibrogénne cytokíny a rastové faktory. Prenos a stav aktivácie leukocytov sú modulované rôznymi povrchovými proteínmi, ako sú napr. integríny. Je jasné, že interakcie bunka-bunka a tiež interakcie bunka-ECM sú kritické pre patogenézu pulmonálnej fibrózy. Konzistentným nálezom u pacientov s aktívnou pulmonálnou fibrózou a u zvieracích modelov fibrotických pľúcnych ochorení je akumulácia zvýšeného počtu imunitných a zápalových buniek v oblastiach s prebiehajúcou fibrózou.

VLA-4 je exprimovaný na všetkých cirkulujúcich leukocytoch a viaže sa na adhezívnu molekulu vaskulámych buniek (VCAM-1), čo je člen génovej superrodiny Ig exprimovaný na endotelových bunkách aktivovaných cytokínom, a na matrixový proteín fibronektín. α4β7 je exprimovaný na podmnožine T a B lymfocytov, „zabíjačských“ lymfocytoch („natural killer“) a eozinofiloch. Viaže sa na adrezín vaskulámej mukózy (MAdCAM-1), čo je člen rodiny adhezívnych molekúl podobných mucínu, a tiež na VCAM-1 a fibronektín. Štúdie in vitro ukázali, že interakcia VLA-4 s VCAM-1 sa podieľa na adherencii mononukleámych leukocytov a eozinofilov k endotelu a na transendotelovej migrácii, a že α4β7 sa primáme podieľa na „regrutovaní“ leukocytov do lymfoidného tkaniva spojeného s črevom.

V predloženej štúdii liečebné podávame PS2 viedlo k zníženiu BL-indukovaného zvýšenia celkových leukocytov v BALF. Zníženie leukocytov v pľúcach myší skupiny BL+PS2 by mohlo byť zodpovedné za zmenšenie zápalového poškodenia a fibrózy pľúc u myší po podaní BL. BL-indukované poškodenie pľúc sa významne znížilo po podaní PS2, ako ukazujú výsledky merania peroxidácie lipidov v pľúcach. Zvýšenie kolagénu v pľúcach sa spojilo so zvýšením počtu fibroblastov v interstíciu a samotných alveolárnych priestoroch. Mnohé z týchto buniek podobných fíbroblastom sú myofibroblasty, ktoré majú odlišný fenotyp, ku ktorému patrí expresia aSMA, kontraktilného proteínu, ktorý sa vyskytuje normálne v bunkách hladkého svalstva a je zrejme významný pre fibrogenézu a hojenie rán.

Významným zistením tejto štúdie je tiež to, že podávanie PS2 zoslabilo BL-indukovanú proliferáciu myofibroblastov. Bez ohľadu na konkrétnu teóriu, podávanie protilátky proti α-integrínu znižuje hladinu rastových faktorov v pľúcach, ktoré sú uvoľňované infiltrujúcimi leukocytmi alebo priamo ovplyvňuje správanie myofibroblastov. V každom prípade redukovaná proliferácia myofibroblastov viedla k zníženiu akumulácie kolagénu v pľúcach u zvierat indukovaných podaním BL v skupine BL+PS2.

Príklad 3

Inhibícia fibrózy podávaním antagonistu integrínu obsahujúceho podjednotku al

Ošetrovanie zvierat

Samci myší C57/BL6 s hmotnosťou 28 až 30 g sa umiestnili po 4 zvieratách v plastových klietkach v zariadení schválenom na tento cieľ príslušnými úradmi (Američan Association for Accreditation of Laboratory Animal Čare). Myši sa pred ošetrením nechali 1 týždeň, aby sa aklimatizovali. Udržiaval sa cyklus 12 hodín svetlo/12 hodín tma a zvieratá mali neobmedzený prístup k vode aj k potrave (Rodent Laboratory Chow 5001, Purina Mills, Inc., St. Louis, MO). V miestnosti s klietkami bol filtrovaný vzduch a svetelný režim 12 hodín svetlo/12 hodín tma. Zvieratá sa náhodne rozdelili do 4 experimentálnych skupín:

Skupina	Ošetrenie
A	Soľný roztok + pufŕovaný soľný roztok
B	Soľný roztok + kontrolná protilátka IgG
C	Bleomycín + kontrolná protilátka IgG
D	Bleomycín + protilátka anti-αΐ βΐ-integrín

Sulfát bleomycínu sa rozpustil v apyrogénnom sterilnom izotonickom soľnom roztoku tesne pred intratracheálnou (IT) instiláciou. Myšiam z príslušných skupín sa pri anestézii metoxyfluránom podalo intratracheálne buď 100 μΐ sterilného izotonického roztoku alebo 0,08 bleomycínu v 100 μΐ roztoku. Protilátky (4 mg/kg) sa podávali intraperitoneálnou injekciou myšiam z príslušných skupín trikrát týždenne v priebehu 21 dní po instilácii. Potom sa zvieratá všetkých skupín utratili predávkovaním pentobarbitalu sodného (100 až 125 mg/kg i.p.) a pľúca sa spracovali na bronchoalveolárny výplach a biochemické a histopatologické štúdie.

Stanovenie celkového počtu buniek a hladiny proteínu v tekutine z bronchoalveolámeho výplachu

Po kanylácii trachey sa pľúca vypláchli 5 ml izotonického roztoku soli, podaného v piatich 1 ml alikvotoch. Roztok sa aplikoval injekčnou striekačkou kanylou, pritom sa jemne masírovala hrudná stena a tekutina sa odsala. Odsatá tekutina sa centrifugovala pri 1500 g počas 20 minút v 4 °C a resuspendovala v izotonickom soľnom roztoku. Obsah proteínu vo vzorke tekutiny z bronchoalveolámeho výplachu sa určil metódou podľa Lowry a kol., J. Biol. Chem. 1193: 265-275 (1951), pričom ako štandard sa použil hovädzí sérový albumín. Celkový počet leukocytov v suspenzii sa stanovil pomocou počítača Coulter (Model F, Coulter Electronics; Inc., Hialeah, FE).

Stanovenie hydroxyprolínu

Pľúca zvierat použité na biochemické štúdie sa perfundovali in situ cez pravú komora ľadovo chladným izotonickým soľným roztokom, aby sa odstránila krv z pľúcnych ciev otvorom v ľavom srdcovom ušku. Pľúcne laloky sa potom rýchlo zbavili neparenchymatického tkaniva a okamžite sa zmrazili v tekutom dusíku a uložili do -80 °C. Neskôr sa zamrazené pľúca roztopili a homogenizovali v 0,1 M KC1, 0,02 M Tris (pH 7,6) v homogenizátore Polytron. Obsah hydroxyprolínu v homogenáte z pľúc ako meradlo obsahu kolagénu sa kvantifikoval metódou podľa Woessner, Árch. Biochem. Biophys. 93: 440-447 (1961).

Histopatologická štúdia

Po výplachu pľúc sa otvorila hrudná dutina a pľúca sa en bloc spolu so srdcom vybrali. Pľúca sa perfundovali fíxážou 1 % glutaraldehyd-paraformaldehyd v 0,12 M kakodylátovom pufŕi so 400 m Osm pri tlaku 30 cm H₂O. Pľúca sa fixovali za tohto tlaku 2 hodiny a potom uložili v tejto fixáži s uzatvorenou tracheou. Pred zaliatím sa pľúca oddelili od srdca a akékoľvek iné ako pľúcne tkanivo sa odstránilo tupou preparáciou. Tkanivové bločky sa odrezali aspoň v dvoch sagitálnych rezoch (2 až 3 mm hrubých) z pravého kraniálneho, pravého kaudálneho a ľavého pľúcneho laloka z každého zvieraťa. Každý bločok mal čelnú plochu asi 1 cm². Bločky sa dehydratovali v etanolovom rade a potom zaliali do parafínu. Z parafínových bločkov sa potom pripravili rezy (s hrúbkou 5 pm) a zafarbili hematoxylínom a eozínom na histologické vyšetrenie.

Analýza dát a ich interpretácia

Dáta sa analyzovali v podobe priemerných hodnôt so smerodajnou odchýlkou a strednou chybou priemeru. Na posúdenie štatistickej významnosti rozdielov medzi skupinami sa použil Študentov t-test, rozloženie chi-kvadrát, korelačný koeficient, analýza rozdielu (ANOVA) a viacrozmerné testy v počítačovom štatistickom softvéri SAS/STAT (SAS/STAT Guide, 6* Ed. Čary, N.C. pp. 183-260 (1985)).

Výsledky

V tejto štúdii sa testovala hypotéza, že neutralizačné protilátky k integrínu αϊβΐ (antia^l) redukujú bleomycínom indukovanú (BL-indukovanú) pľúcnu fíbrózu in vivo. Samcom C57/BL6 myší sa intratracheálne (IT) injikoval soľný roztok (SA) alebo BL v dávke 0,08 U/0,1 ml a potom nasledovala intraperitoneálna (IP) injekcia protilátky (100 pg v 0,2 ml) trikrát týždenne. 21 dní po IT instilácii sa myši utratili a vykonal sa bronchoalveolárny výplach (BAL) a biochemické a histopatologické analýzy.

Histopatologické vyšetrenie pľúc

Očakávalo sa, že u myší po podaní soľného roztoku alebo kontrolnej protilátky IgG nebudú zrejmé žiadne lézie a interalveoláme steny budú normálneho vzhľadu. Naproti tomu po podaní bleomycínu a kontrolného IgG budú mať lézie rôzneho druhu od multifokálnej lokalizácie v proximálnom laloku až po difúznu distribúciu, ku ktorej dochádza niekedy v pohrudnici. Podľa očakávania pľúca myší po podaní bleomycínu a protilátky proti al integrínu mali byť viac alebo menej podobné ako v skupine B. U skupiny D sa očakával len obmedzený počet fibrotických lézií s miernym multifokálnym septálnym zhustením a malými agregátmi mononukleámych buniek.

Aj keď je predložený vynález z dôvodu dôkladného vysvetlenia a dobrého porozumenia opísaný veľmi podrobne a tiež opísaný formou ilustratívnych príkladov, odborníkovi je jasné, že je možné vykonať rôzne zmeny a modifikácie v rámci rozsahu vynálezu. Takže tu uvedené príklady nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je vymedzený pripojenými patentovými nárokmi.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Použitie kompozície obsahujúcej homológ protilátky, ktorý je antagonistom interakcie medzi integrínom nesúcim podjednotku a4 a ligandom pre integrín nesúci podjednotku o4, na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie fibrózy u subjektu.

2. Použitie podľa nároku 1, kde fibrózou je fibróza vnútorného orgánu.

3. Použitie podľa nároku 2, kde vnútorným orgánom je pečeň, pľúca, oblička, krvné cievy srdca, alebo gastrointestinálny trakt.

4. Použitie podľa nároku 1, kde subjekt trpí pľúcnou fibrózou, myelofibrózou, cirhózou pečene, mezangiálnou proliferatívnou glomerulonefŕitídou, kosáčikovitou glomerulonefritídou, diabetickou nefropatiou, renálnou intersticiálnou fibrózou, alebo nefropatiou spojenou s Hl V.

5. Použitie podľa nároku 1, kde fibrózou je dermálna fibróza.

6. Použitie podľa nároku 5, kde subjekt trpí sklerodermou, morfeou, keloidmi, hypertrofickými jazvami, vrodeným kutánnym kolagenómom, alebo névom spojivového tkaniva kolagénového typu.

7. Použitie podľa nároku 1, kde fibrózou je fibróza oka.

8. Použitie podľa nároku 7, kde subjekt trpí diabetickou retinopatiou, postoperačným zjazvením alebo proliferatívnou vitreoretinopatiou.

9. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 8, kde kompozícia obsahuje o4 homológ protilátky.

10. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde homológ protilátky je humanizovaný, humánny alebo chimérický homológ protilátky.

11. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 10, kde farmaceutická kompozícia je upravená na podanie:

(a) v dávke od 0,1 mg/kg za deň do 10 mg/kg za deň;

(b) počas dávkovacieho obdobia od jedného do štrnásť dní; a (c) v množstve postačujúcom na udržanie hladiny homológu protilátky v plazme 1 mg/ml alebo vyššej.

12. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 11, kde homológom protilátky je humanizovaná myšia 21-6 protilátka.

13. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 12, kde subjektom je človek.