SK15202001A3

SK15202001A3 - Antagonisty alfa4 podjednotky integrínu na liečenie fibrózy

Info

Publication number: SK15202001A3
Application number: SK1520-2001A
Authority: SK
Inventors: Philip Gotwals; Roy R. Lobb
Original assignee: Biogen, Inc.
Priority date: 1999-04-22
Filing date: 2000-04-21
Publication date: 2002-09-10
Also published as: AU783054B2; BR0010669A; IL206829A0; KR100746522B1; CN1332714C; HUP0201015A2; NO20015122L; PT1173201E; JP2014065747A; KR20070102760A; CA2370814A1; WO2000064474A1; YU74901A; KR100837715B1; IL182908A0; BG65578B1; AU4480000A; IL206830A; US20040037827A1; JP2002542300A

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka antagonistov VLA-4 integrínu alebo ich fragmentov na liečenie fibrotických ochorení u človeka alebo zvierat.

Doterajší stav techniky

Fibronektín a kolagén sú proteíny, ktoré sú nevyhnutné na udržanie integrity extracelulárneho matrixu v spojivovom tkanive. Tvorba týchto proteínov je vysoko regulovaný proces a jeho narušenie môže viesť k vývoju tkanivovej fibrózy. Aj keď vytváranie fibrózneho tkaniva je súčasťou normálneho prospešného procesu hojenia po poranení, za určitých okolností môže abnormálna akumulácia fibrózneho materiálu nakoniec viesť k zlyhaniu orgánu (Border a kol.,

1994) New Engl. J. Med.

331:1286-1292) . k stereotypnej hemostáza, po a aktivovaných

Poškodenie fyziologickej orgánu vedie ktoréhokolvek reakcii: doštičkami indukovaná ktorej nasleduje prísun zápalových buniek fibroblastov. Cytokíny pochádzajúce z buniek týchto typov riadia vytváranie nového extracelulárneho matrixu a krvných ciev (granulačné tkanivo). Vytváranie granulačného tkaniva je velmi starostlivo hierarchicky usporiadaný program, v ktorom je stimulovaná expresia inhibítorov proteáz a proteínov extracululárneho matrixu, a naopak expresia proteáz je redukovaná, čo v dôsledku vedie k akumulácii extracelulárneho matrixu.

Ústredným bodom vývoja fibrotického ochorenia, či už induko2 vaného alebo spontánneho, je stimulácia aktivity fibroblastov. Prísun zápalových buniek a aktivovaných fibroblastov do poškodeného orgánu je závislý na schopnosti buniek týchto typov interagovať s intersticiálnym matrixom zloženým predovšetkým s fibronektínu a kolagénu. Tieto interakcie typu bunka-bunka alebo bunka-extracelulárny matrix sú sprostredkované molekulami bunkovej adhézie patriacimi do niekoľkých rodín molekúl, jedna z týchto rodín obsahuje integríny. Integríny sú štruktúrne a funkčne príbuzné glykoproteíny zložené z rôznych a (doteraz známe al, a2 až all) a β (βΐ a β7) heterodimérnych transmembránových receptorových domén, ktoré sa v rôznych kombináciách vyskytujú u cicavcov prakticky vo všetkých typoch buniek (pozri prehľadné publikácie E.C. Butcher, Celí, 67, 1033 (1991); D. Cox a kol., The Pharmacology of Integrins, Medicinal Research Rev. Vol. 195 (1994) a V.W. Engleman a kol., Celí Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets in Ann. Revs. Medicinal Chemistri, Vol. 31, J.A. Bristol, Ed.; Acad. Press. NY, 1996, p. 191). Opísané sú dva integríny obsahujúce dve podjednotky a4 a pomenovali sa α4β1 (VLA-4) a α4β7 .

Fibróza pľúcneho interstícia (IPF, interstitial pulmonary fibrosis) je dôsledkom mnohých ochorení pľúcneho interstícia a vedie k zníženiu pľúcnej kapacity a zhoršeniu vitálnej výmeny plynov v pľúcach. Bez ohladu na etiológiu sú pre IPF charakteristické zápalové a fibroproliferatívne zmeny v pľúcach a nadmerná akumulácia kolagénu v interstíciu. U pacientov s IPF sa všeobecne prejavuje v priebehu aktívnej fázy pľúcnej fibrózy výskyt novo získaných (regrutovaných) imunitných a zápalových buniek, čo ukazuje na to, že pulmonálna fibróza je výsledkom chybnej reparácie po počiatočnom zápale tkaniva. Regrutovanie zápalových buniek sa v mnohých prípadoch podieľa na počiatočnom zápale. Okrem toho tieto bunky hrajú velmi zložitú úlohu v regulácii reparačného procesu. V každom prípade regrutovanie zápalových a imunitných buniek do pľúc hrá dôležitú úlohu vo vyvolaní fibrotickej reakcie. Prísun zápalových buniek a aktivovaných fibroblastov do poškodených pľúc závisí od schopnosti týchto buniek interagovať so zložkami ECM. Presun a stav aktivácie leukocytov sú modulované pôsobením rôznych integrínov. Zabránenie prísunu zápalových buniek do plúc môže byť kritickým krokom v potlačení následnej fibrotickej reakcie.

Mnohé z ochorení spojených s proliferáciou fibrózneho tkaniva sú často ako chronické, tak aj oslabujúce, ako napr. kožné ochorenia ako je skleroderma. Iné, vrátane napr. pulmonálnej fibrózy, môžu byť aj fatálne v dôsledku toho, že v súčasnosti dostupná liečba má významné vedľajšie účinky, a všeobecne je neúčinná na spomalenie alebo zastavenie progresie fibrózy [Nagler a kol., 1996, Am. J. Respir. Crit. Čare Med., 154:1082-86]. Existuje teda veľká potreba nových antifibrotických liekov.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka liečenia fibróz. Pôvodcovia vynálezu skúmali možné účinky antagonistov integrínov obsahujúcich podjednotky al a a4 na patogenézu fibróz tak, že podávali integríny obsahujúce al alebo a4 podjednotku myšiam s pľúcnou fibrózou. Osožný účinok týchto antagonistov ako na celkovú akumuláciu kolagénu, tak aj na rozsah fibrotických lézií v pľúcach, viedol k predpokladu, že integriny obsahujúce podjednotku al a/alebo a4 sú vhodné na antifibrotickú terapiu.

Jeden aspekt vynálezu sa týka podávania účinného množstva kompozície, ktorá obsahuje antagonistu interakcie medzi integrínom nesúcim podjednotku a4 a ligandom pre integrín nesúci podjednotku a4, pacientovi, ktorý trpí fibrotickým ochorením. Antagonista je agens viažuci integrín a4 alebo agens viažuci ligand integrínu a4. Výhodné agens viažuce integrín a4 je vybrané zo skupiny obsahujúcej: a) protilátkový homológ antagonizujúci interakciu ako VLA-4 tak α4β7 s príslušnými a4 ligandami, b) pro4 tilátkový homológ antagonizujúci interakciu VLA-4 s jeho cc4 ligandom, a c) protilátkový homológ antagonizujúci interakciu α4β7 s jeho a.4 ligandom. V iných uskutočneniach vynálezu je protilátkový homológ vybraný zo skupiny obsahujúcej humánnu protilátku, chimerickú protilátku, humanizovanú protilátku a ich fragmenty.

Ďalší aspekt predloženého vynálezu sa týka znižovania nárastu leukocytov vo vzorke tekutiny z bronchoalveolárneho výplachu vyvolaného fibrotickým ochorením, keď sa pacientovi trpiacemu fibrotickým ochorením podáva účinné množstvo antagonistu interakcie medzi integrínom nesúcim podjednotku a.4 a ligandom integrínu nesúceho podjednotku α4. V niektorých uskutočneniach vynálezu je agens viažuci integrín a4 kódovaný sekvenciou nukleovej kyseliny, ktorá obsahuje nukleovú kyselinu hybridizujúcu za stringentných podmienok s definovanými sekvenciami nukleových kyselín vybraných zo skupiny sekvencii uvedených v tabulke 6 patentu US 5 840 299 alebo s komplementom týchto sekvencii nukleových kyselín. V inom aspekte vynálezu je agens viažuci integrín a4 kódovaný sekvenciou nukleovej kyseliny, ktorá obsahuje nukleovú kyselinu hybridizujúcu za definovaných stringentných podmienok so sekvenciou nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptidovú sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej isté polypeptidy definované v patente US 5 932 214 alebo tvorené v bunkách línie ATCC CRL 11175.

Všetky citované články vrátane patentov sú formou citácie zahrnuté v predloženej prihláške.

Detailný opis vynálezu

Definície

Na jasnejší a presnejší opis vynálezu sú ďalej uvedené definície niektorých pojmov a termínov, ktoré sa používajú v opise vynálezu a v nárokoch predloženej prihlášky.

V detailnom opise vynálezu sa používajú nasledujúce termíny:

Superrodina integrínového veľmi oneskoreného antigénu (VLA, very late antigén) je tvorená štruktúrne a funkčne príbuznými glykoproteínmi zloženými z (a a β) heterodimérnych, transmembránových receptorových molekúl, vyskytujúcich sa v rôznych kombináciách takmer vo všetkých typoch cicavčích buniek (pozri prehľady: E.C. Butcher, Celí, 67, 1033 (1991); D. Cox a kol., The PharmacoloQV of Integrins. Medicinal Research Rev. (1994) and V.W. Engleman a kol., Celí Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets. in Ann. Report in Medicinal Chemistry, Vol. 31, J.A. Bristol, Ed.; Acad. Press, NY, 1996, p. 191). Rodina VLA integrínov obsahuje (to znamená doteraz sú známe) integrín VLA-1, -2, -3, -4, -5, -6, -9 a -11, kde každá molekula obsahuje reťazec βΐ nekovalentne naviazaný na reťazec a (al, a2, a3, a4, a5, a6 atď.).

integrín α4β1 VLA-4, a4bľ

Integrín α4β1 sa vyskytuje na bunkovom povrchu ako receptor pre VCAM-1; fibronektín a možno aj ďalšie ligandy (tieto ligandy sú jednotlivo aj súborne nazvané a4 ligandami). Termín (zamenitelne používaný s označením integrín alebo α4β1) označuje polypeptidy, ktoré sú schopné viazať sa na VCAM-1 a členov rodiny proteinov extracelulárneho matrixu, najmä fibronektín, alebo ich homológy alebo fragmenty, aj keď odborníkom je jasné, že môžu existovať ďalšie ligandy pre VLA-4 a môžu byť analyzované obvyklými metódami. Avšak je známe, že podjednotka a4 môže asociovať s ďalšími podjednotkami βΐ, takže integrín a4 (alebo integrín a4 alebo integrín obsahujúci podjednotku a4 (prípadne integrín obsahujúci podjednotku a4) označuje také integríny, kde je podjednotka a4 asociovaná s niektorou z podjednotiek β. Ďalším príkladom integrínu a4 okrem VLA4 je tiež α4β7 (pozri Labb a Adams, citované skôr). Podobne termín integrín al alebo integrín obsahujúci podjednotku al označuje integríny, v ktorých je podjednotka al asociovaná s niektorou podjednotkou β.

Antagonista integrínu je akákoľvek zlúčenina, ktorá inhibuje väzbu integrinov obsahujúcich podjednotku al a/alebo a4 s integrinovým ligandom a/alebo receptorom. Antiintegrinová protilátka alebo proteín obsahujúci homológ protilátky (ako je diskutované ďalej v texte) a ďalšie molekuly, ako sú napr. rozpustné formy ligandových proteínov pre integríny, sú užitočné. K rozpustným formám ligandových proteínov pre integríny obsahujúce podjednotku a4 patrí rozpustný VCAM-1, fúzny proteín obsahujúci VCAM-1, alebo bifunkčný fúzny proteín VCAM-l/Ig. Napr. rozpustná forma integrínového ligandu alebo jeho fragmentu sa môže podávať, aby viazala integrín, a výhodne tak kompetovala o väzbové miesta pre integrín na bunkách, takže toto podávanie má podobný účinok ako podávanie antagonistu ako je napr. antiintegrínová protilátka (napr. proti VLA-1, VLA-4). Zvlášť potom rozpustné integrínové mutanty, ktoré viažu ligandy, ale nespúšťajú na integríne závislú signalizačnú dráhu, spadajú do predmetu predloženého vynálezu. Také mutanty integrínu pôsobia ako kompetitívne inhibítory integrínových proteínov divého typu a je možné ich preto považovať za antagonisty. Inými typmi antagonistov užitočných podľa vynálezu sú malé molekuly, ako sú definované ďalej v texte.

Vynález sa ďalej týka molekúl, ktoré antagonizujú pôsobenie viac ako jedného integrínu obsahujúceho podjednotku a4, ako sú napr. malé molekuly alebo protilátkové homológy, ktoré antagonizujú ako VLA-4 tak aj α4β7 alebo iné kombinácie integrinov obsahujúcich podjednotku a4. Ďalej sa vynález týka molekúl, ktoré antagonizujú pôsobenie viac ako jedného integrínu obsahujúceho podjednotku al. Vynález sa týka tiež kombinácie molekúl, keď kombinácia antagonizuje pôsobenie viac ako jedného integrínu, ako je napr. kombinácia niekolkých malých molekúl alebo protilátkových homológov, ktoré v kombinácii antagonizujú ako VLA-4 tak α4β7 alebo ďalšie kombinácie integrinov obsahujúcich podjednotku α4.

Niektoré antagonisty integrínov môžu byť fúzované alebo inak spojené napr. s protilátkovými homológmi ako sú imunoglobulíny alebo ich fragmenty, bez obmedzenia konkrétnou štruktúrou integrínu alebo ligandu alebo ďalšej molekuly. Takže v zmysle vynálezu akékoľvek agens schopné vytvárať chimérické proteíny (pozri definície uvedené ďalej) a súčasne schopné viazať integrínové ligandy, ktoré účinne blokuje alebo obaľuje (poťahuje) integrín obsahujúci podjednotku a4 a/alebo al, je považované za ekvivalent antagonistov uvedených v príkladoch vynálezu.

Termín protilátkový homológ (alebo homológ protilátky) znamená intaktnú protilátku zloženú z ľahkých a ťažkých imunoglobulínových reťazcov spojených disulfidickými väzbami. Termín protilátkový homológ zahŕňa tiež proteín obsahujúci jeden alebo viac polypeptidov vybraných zo skupiny obsahujúcej ľahké reťazce imunoglobulínu, ťažké reťazce imunoglobulínu a ich fragmenty viažuce antigén, ktoré sú schopné viazať jeden alebo viac antigénov (to znamená integrín alebo integrínový ligand). Polypeptidové zložky homológu protilátky, ktorý je zložený z viac ako jedného polypeptidu, môžu byť prípadne viazané disulfidickými mostíkmi alebo inak kovalentne zosietené. Taktiež k homológom protilátok patria intaktné imunoglobulíny typov IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (vrátane ich subtypov) , pričom ľahké reťazce týchto imunoglobulínov sú typov χ alebo λ. K homológom protilátok patria tiež časti intaktných imunoglobulínov, ktoré si ponechávajú väzbovú špecifitu pre antigén, napr. fragmenty Fab, Fab' a F(ab')2, fragmenty F(v), monoméry alebo diméry ťažkých reťazcov, monoméry alebo diméry ľahkých reťazcov alebo ich kombinácie .

Termín homológ humanizovanej protilátky označuje homológ protilátky pripravený s použitím technológie rekombinantnéj DNA (génového inžinierstva) , kde niektoré alebo všetky aminokyseliny ťažkého alebo ľahkého reťazca imunoglobulínu cicavca iného ako človeka, ktoré nie sú potrebné pre väzbu antigénu, sa substituovali zodpovedájúcimi aminokyselinami ťažkého alebo ľahkého humánneho imunoglobulínu. Termín homológ humánnej protilátky označuje homológ protilátky, kde všetky aminokyseliny ťažkého alebo ľahkého reťazca imunoglobulínu (bez ohladu na to, či sú potrebné pre väzbu antigénu) sú získané z humánneho zdroja.

Termín homológ humánnej protilátky označuje homológ protilátky pripravený technológiou rekombinantnej DNA, kde všetky aminokyseliny ťažkého alebo ľahkého reťazca imunoglobulínu sú získané z humánneho zdroja.

Termín agonista integrínu označuje akúkoľvek zlúčeninu, ktorá aktivuje integrínový ligand.

Aminokyselina je monomérna jednotka peptidu, polypeptidu alebo proteínu. V prirodzene sa vyskytujúcich peptidoch, polypeptidoch a proteínoch sa vyskytuje 20 aminokyselín, ktoré sú všetky L-izoméry. Termín aminokyselina zahŕňa tiež analógy aminokyselín a D-ízoméry aminokyselín vyskytujúcich sa v proteínoch a ich analógy.

Termín kovalentne naviazaný používaný v opise znamená to, že špecifické skupiny alebo časti (napr. PEGylovaný, fragment imunoglobulínu/antagonista integrínu a4 a/alebo al) sú buď vzájomne priamo kovalentne viazané alebo sú spojené kovalentne prostredníctvom vmedzerenej skupiny alebo časti alebo skupín alebo častí ako je napr. tzv. spacer. Táto vmedzerená skupina alebo skupiny sa nazývajú spojovacie skupiny. Termín konjugovaný sa v opise vynálezu používa zameniteľné s termínom kovalentne naviazaný. Spacer potom označuje skupinu, ktorá je vmedzerená medzi aminokyselinu alebo inú zložku integrínového antagonistu alebo jeho fragmentu a zvyšok molekuly. Spacer teda oddeľuje aminokyselinu alebo inú zložku od zvyšku molekuly, a zabraňuje modifikácii plynúcej z interferencie funkcií proteínov, a uľahčuje spojenie aminokyseliny alebo inej zložky s ďalšou skupinou alebo časťou.

Expresná kontrolná sekvencia je sekvencia kontrolujúca expresiu, to znamená sekvencia nukleotidov, ktorá riadi a reguluje expresiu génov, s ktorými je operatívne spojená.

Expresný vektor je polynukleotid, ako je DNA plazmid alebo fág (najobvyklejšie prípady), ktorý dovoľuje expresiu aspoň jedného génu, keď je vektor vnesený do hostiteľskej bunky. Vektor môže ale nemusí byť schopný replikácie v hostiteľskej bunke.

Termín účinné množstvo činidla podlá vynálezu označuje také množstvo, ktoré poskytuje požadovaný výsledok alebo prejavuje požadovaný vplyv na určité ochorenie, ktoré je liečené.

Termín funkčný ekvivalent aminokyselinového zvyšku je

I) aminokyselina, ktorá má rovnaké reakčné vlastnosti ako aminokyselina, ktorá je nahradená funkčným ekvivalentom,

II) aminokyselina antagonistu podľa vynálezu, ktorá má podobné vlastnosti ako aminokyselina, ktorá je nahradená funkčným ekvivalentom, a

III) molekula iná ako aminokyselina, ktorá má. podobné vlastnosti ako aminokyselinový zvyšok, ktorý je nahradený funkčným ekvivalentom.

Prvý polynukleotid kódujúci proteínového antagonistu podľa vynálezu je funkčne ekvivalentný v porovnaní s druhým polynukleotidom kódujúcim antagonistický proteín, ak spĺňa aspoň jednu z nasledujúcich podmienok:

a) funkčne ekvivalentný je prvý polynukleotid, ktorý hybridizuje s druhým polynukleotidom za štandardných hybridizačných podmienok a/alebo je degenerovaný vzhľadom na sekvenciu druhého polynukieotidu. Najvýhodnejšie ide o polynukleotid, ktorý kóduje proteínový mutant majúci aktivitu proteínového antagonistu ir.tegrínu,

b) funkčne ekvivalentný je prvý polynukleotid, ktorý kóduje expresiu aminokyselinovej sekvencie kódovanej druhým polynukleotidom.

Všeobecne antagonista integrínu zahŕňa, avšak nie je obmedzený len na ne, všetky činidlá uvedené v opise a tiež ich funkčné ekvivalenty. Termín funkčný ekvivalent sa tu týka antagonistu integrínu alebo polynukleotidu kódujúceho antagonistu integrínu, ktoré majú rovnaký alebo lepší prospešný účinok na príjemcu ako pôvodný antagonista integrínu, ku ktorému sa funkčný ekvivalent vzťahuje. Odborníkovi je jasné, že funkčne ekvivalentný proteín sa môže pripraviť rekombinantnou technikou, to znamená expresiou funkčne ekvivalentnej DNA. Takže predložený vynález zahŕňa proteíny kódované prirodzene sa vyskytujúcou DNA, a tiež kódovanej DNA, ktorá sa prirodzene nevyskytuje, ale kóduje rovnaký proteín ako je kódovaný prirodzene sa vyskytujúcou DNA. V dôsledku degenerácie nukleotidových kódujúcich sekvencií sa môžu použiť iné polynukleotidy na kódovanie rovnakých integrínových proteínov. K nim patria celé alebo časti uvedených sekvencii, ktoré sa zmenili substitúciou rôznych kodónov, ktoré kódujú rovnaký aminokyselinový zvyšok v sekvencii, ide teda o tzv. umlčanú zámenu. Také zmenené sekvencie sa považujú za ekvivalenty týchto sekvencii. Tak napr. Phe (F) je kódovaný dvoma kodónmi, a síce TTC alebo TTT, Tyr (Y) je kódovaný TAC alebo TAT a His (H) je kódovaný CAC alebo CAT. Na druhej strane Trp (W) je kódovaný jediným kodónom TGG. Takže je jasné, že pre danú sekvenciu DNA kódujúcu konkrétny integrín existuje mnoho degenerovaných sekvencii, ktoré ho kódujú. Tieto degenerované sekvencie spadajú taktiež do rozsahu predloženého vynálezu.

Termín chimérický, ak sa týka antagonistu podľa vynálezu znamená, že tento antagonista obsahuje spojenie (chemickým zosietením alebo kovalentnou väzbou alebo väzbou iného typu) dvoch alebo viacerých proteínov majúcich rôznorodú štruktúru a/alebo pochádzajúcich z rôznorodých zdrojov. Tak napr. chimérický antagonista a4 integrínu môže obsahovať jednu časť, ktorou je antagonista a4 integrínu alebo jeho fragment a ďalšiu časť, ktorá nie je antagonistom a4 integrínu. Rovnako tak chimérický antagonista al integrínu môže obsahovať jednu časť, ktorou je antago11 nista al integrínu alebo jeho fragment a ďalšiu časť, ktorá nie je antagonistom al integrínu.

Druhom chimérického proteínu je fúzny proteín alebo skrátene fúzia, čo je kolineárne kovalentné spojenie dvoch alebo viacerých proteínov alebo ich fragmentov prostredníctvom ich peptidovej kostry, a to najvýhodnejšie prostredníctvom expresie polynukleotidovej molekuly kódujúcej tieto proteíny. Takže k výhodným fúznym proteínom patria chimérické proteíny, ktoré obsahujú antagonistu integrínu a4 (alebo al) alebo jeho fragment kovalentne naviazaný k druhej časti, ktorá nie je antagonistom integrínu cc4 (alebo al) . Výhodné fúzne proteíny podlá vynálezu obsahujú časti intaktných protilátok, ktoré si uchovávajú väzbovú špecifitu pre antigén, ako sú napr. fragmenty Fab, Fab', F(ab')2 a F(v), monoméry alebo diméry ťažkých alebo ľahkých reťazcov, diméry pozostávajúce z jedného ťažkého a jedného ľahkého reťazca a pod..

Najvýhodnejšie fúzne proteíny sú chimérické proteíny obsahujúce jednu časť, ktorou je antagonista integrínu, fúzovanú alebo inak spojenú s celým alebo časťou kĺbového a konštantného úseku ľahkého reťazca imunoglobulínu, ťažkého reťazca imunoglobulínu alebo obidvoch. Takže predložený vynález sa týka molekuly, ktorá obsahuje: (1) časť predstavujúcu antagonistu integrínu, (2) druhý peptid, napr. taký, ktorý zvyšuje rozpustnosť alebo in vivo biologický polčas antagonistu integrínu, ako je napr. člen superrodiny imunoglobulínov alebo jeho fragment alebo časť, to znamená napr. fragment alebo časť IgG, napr. konštantný úsek ťažkého reťazca humánneho IgGl, napr. úseky CH2, CH3 a kĺbový úsek. Špecificky fúzia antagonistu integrínu/Ig je proteín obsahujúci molekulu biologicky aktívneho antagonistu integrínu podľa vynálezu (napr. rozpustný ligand VLA-4 alebo VLA-1) alebo jeho biologicky aktívny fragment naviazaný na N-koniec imunoglobulínového reťazca, pričom časť N-konca imunoglobulínu je nahradená antagonistom integrínu. Druhom fúzie antagonistu in12 tegrínu/Ig je fúzia integrín/Fc, čo je proteín obsahujúci molekulu biologicky aktívneho antagonistu integrínu podľa vynálezu naviazanú na aspoň časť konštantnej domény imunoglobulínu. Výhodná Fc fúzia obsahuje antagonistu integrínu podľa vynálezu, ktorý je naviazaný k fragmentu protilátky obsahujúcemu C-koncovú doménu ťažkého reťazca imunoglobulínu.

Termín fúzny proteín znamená tiež antagonistu integrínu, ktorý je chemicky spojený prostredníctvom mono- alebo heterofunkčnej molekuly s druhou časťou, ktorá nie je antagonistom integrínu (čím vzniká chimérická molekula) a je vytvorený de novo z purifikovaných proteínov, ako je opísané ďalej. Jedným príkladom chemicky spojenej (ha rozdiel od rekombinantné spojenej) chimérickej molekuly je fúzny proteín, ktorý obsahuje: (1) časť zameriavajúcu podjednotku <x4 integrínu, to znamená časť VCAM-1 schopnú viazať sa na VLA-4 na povrchu buniek nesúcich VLA-4, (2) druhú molekulu, ktorá zvyšuje rozpustnosť alebo in vivo biologický polčas zameriavacej časti, ako je napr. polyalkylénglykolový polymér, napr. polyetylénglykol (PEG). Časť zameriavajúca podjednotku ct4 je prirodzene sa vyskytujúci a4 ligand alebo jeho fragment, napr. VCAM-1 peptid alebo podobná sekvencia s konzervatívnymi substitúciami aminokyselín.

Termín heterológny promótor označuje promótor, ktorý nie je v prirodzenom stave spojený s génom alebo purifikovanou nukleovou kyselinou.

Termín homológia (a teda aj homológny) sa tu používa ako synonymum s termínom identita (identický) a týka sa sekvenčnej podobnosti dvoch polypeptidových molekúl alebo molekúl nukleovej kyseliny. Keď je jedna určitá pozícia v dvoch porovnávaných sekvenciách obsadená rovnakou zásadou alebo aminokyselinou (napr. pozícia v dvoch molekulách DNA je obsadená adenínom alebo pozícia v dvoch polypeptidoch je obsadená lyzínom), potom dve porovnávané molekuly sú v tejto pozícii homológne. Percento homológie medzi dvoma sekvenciami je funkciou počtu zhodných alebo homológnych pozícií, ktoré majú dve sekvencie, deleným celkovým počtom pozícií a vynásobeným 100. Tak napr. ak 6 z 10 pozícií je zhodných alebo homológnych, potom tieto sekvencie sú na 60% homológne. Alebo napr. DNA sekvencia CTGACT a CAGGTT majú 55% homológiu (3 pozície zo 6 sa zhodujú). Všeobecne sa porovnanie uskutočňuje, keď sú sekvencie vzájomne priradené tak, aby sa dosiahla maximálna homológia. Také priradenie a porovnanie je možné uskutočniť metódou podľa Karlin a Altschul, ktorá je ďalej podrobnejšie opísaná.

Homológne sekvencie majú zhodné alebo podobné zvyšky aminokyselín, kde podobné aminokyselinové zvyšky sú konzervatívne substitúcie alebo povolené bodové mutácie zodpovedajúcich aminokyselinových zvyškov vzhľadom na priradenú referenčnú sekvenciu. V tomto zmysle konzervatívna substitúcia aminokyselinového zvyšku v referenčnej sekvencií znamená substitúciu aminokyselinou, ktorá je fyzicky alebo funkčne podobná zodpovedajúcemu referenčnému zvyšku, teda napr. má podobnú veľkosť, tvar, elektrický náboj, chemické vlastnosti vrátane schopnosti vytvárať kovalentné alebo vodíkové väzby a pod.. Zvlášť výhodné sú kovalentné substitúcie, ktoré spĺňajú kritériá definované ako prijateľné bodové mutácie v publikácii Dayhoff a kol., Atlas of Protein Seguence and Structure 5, Suppl. 3, Chapter 22: 352-354, NAt. Biomed. Res. foundation, Washington D.C., 1978.

Homológia aj identita sú zameniteľné pojmy a týkajú sa sekvenčnej podobnosti dvoch polypeptidových sekvencií. Homológia aj identita sa môžu stanoviť porovnaním pozícií v každej z dvoch sekvencií, ktoré sú pre potreby porovnania navzájom priradené. Ak je pozícia v porovnávaných sekvenciách obsadená zhodným aminokyselinovým zvyškom, potom sú polypeptidy v tejto pozícii identické, ak je ekvivalentná pozícia obsadená rovnakou aminokyselinou (to znamená identickou) alebo podobnou aminokyselinou (napr. podobnou z hľadiska stérickej a/alebo elektrónovej povahy), potom sú polypeptidy v tejto pozícii homológne. Percento homológie alebo identity je funkciou počtu zhodných alebo homológnych pozícií, ktoré majú obidve sekvencie. Nepríbuzné alebo nehomológne sekvencie majú menej ako 40% identitu, výhodne menej ako 25% identitu so sekvenciou podľa vynálezu.

Percento homológie dvoch aminokyselinových sekvencií alebo dvoch sekvencií nukleových kyselín sa stanovuje použitím priradzovacíeho algoritmu podľa Karlin a Altschul (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 2264 (1990), v modifikácii podľa Karlin a Altschul (Proc. Nat. Acad. Sci., USA 90: 5873 (1993). Tento algoritmus je inkorporovaný v programoch NBLAST alebo XBLAST podľa Altschul a kol., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990). Vyhľadanie homológnej nukleotidovej sekvencie zo sekvencií podľa vynálezu sa uskutočňuje programom NBLAST s nastavením parametrov skóre = 100, dĺžka slova = 12. Vyhľadávanie proteínov homológnych k referenčnému peptidu sa uskutočňuje programom XBLAST s nastavením parametrov skóre = 50, dĺžka slova =3. Na získanie priradenia s medzerami sa používa program Gapped BLAST podľa Altschul a kol., Nucleic Acids Res., 25: 3389 (1997). Pri aplikovaní programov BLAST a GappedBLAST sa použili štandardné parametre týchto programov (XBLAST a NBLAST, pozri http://www/ncbi.nim.nih.gov).

Termín izolovaný (zameniteľný s termínom v podstate čistý), ak sa týka nukleových kyselín, to znamená polynukleotidových sekvencií kódujúcich polypeptidy, znamená RNA alebo DNA polynukleotid, časť genómového polynukleotidu, cDNA alebo syntetický polynukleotid, ktorý v dôsledku svojho pôvodu alebo zaobchádzania s ním: I) nie je spojený so všetkými polynukleotidmi s ktorými je spojený v prírode (napr. je prítomný v hostiteľskej bunke ako expresný vektor alebo jeho časť), alebo II) je spojený s inou nukleovou kyselinou alebo chemickou skupinou, než s ktorými je spojený v prírode, alebo III) nevyskytuje sa v prírode. Ako izolovaná sa ďalej označuje polynukleotidová sekvencia, ktorá je I) amplifikovaná in vitro napr. metódou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), II) chemicky syntetizovaná, III) rekombinantne pripravená klonovaním alebo IV) purifikovaná, napr. štiepením a separáciou na géli. Takže v podstate čistá nukleová kyselina je nukleová kyselina, ktorá nie je bezprostredne súvisle spojená s jednou alebo obidvoma sekvenciami, s ktorými je normálne spojená v prirodzenom stave v genóme organizmu, z ktorého je izolovaná. V podstate čistá DNA tiež zahŕňa rekombinantnú DNA, ktorá je súčasťou hybridného génu kódujúceho dodatočné integrinové sekvencie.

Izolovaný (plne zameniteľný s termínom v podstate čistý), ak sa týka polypeptidov, znamená polypeptid alebo jeho časť, ktorý v dôsledku svojho pôvodu alebo zaobchádzania s ním: I) je prítomný v hostiteľskej bunke ako expresný produkt časti expresného vektora, alebo II) je spojený s proteínom alebo inou chemickou skupinou, ktoré sa odlišujú od tých, s ktorými je spojený v prírode, alebo III) nevyskytuje sa v prírode. Ako izolovaný sa ďalej označuje proteín, ktorý je I) chemicky syntetizovaný alebo II) exprimovaný v hostiteľskej bunke a purifikovaný od asociovaných proteínov. Termín všeobecne znamená polypeptid, ktorý sa separoval od ostatných proteínov a nukleových kyselín, s ktorými je v prírodnom stave asociovaný. Výhodne je polypeptid separovaný aj od látok ako sú napr. protilátky alebo gélová matrica (napr. polyakrylamid), ktoré sa používajú k purifikácii.

Multivalentný proteínový komplex je niekoľko integrínových antagonistov (jeden alebo viac). Antiintegrínový protilátkový homológ alebo jeho fragment môže byť zosietený alebo naviazaný na ďalší protilátkový homológ alebo fragment. Pritom môže ísť o rovnaké alebo rôzne proteiny a rovnaké alebo rôzne protilátkové homológy alebo fragmenty.

Mutant (mutácia a pod.) sa týka akejkoľvek zmeny v genetickom materiáli organizmu, najmä akejkoľvek zmeny (napr. delécie, substitúcie, adície alebo alterácie) v polynukleotidovej sekvencii proteínu divého typu. Termín muteín označuje mutovaný proteín a používa sa zameniteľné s termínom mutácia.

Termín operatívne spojená znamená v prípade polynukleotidovej sekvencie (DNA, RNA), že sekvencia je operatívne spojená s expresnou kontrolnou sekvenciou, keď expresná kontrolná sekvencia riadi a reguluje transkripciu a transláciu tejto polynukleotidovej sekvencie. Termín operatívne spojená tiež znamená, že pred polynukleotidovou sekvenciou, ktorá má byť exprimovaná, je vhodný počiatočný signál (start-signál), napr. kodón ATG, a že sekvencia je v zhodnom čítacom rámci, ktorý umožňuje expresiu polynukleotidovej sekvencie pod kontrolou expresnej kontrolnej sekvencie, a teda vedie k produkcii požadovaného polypeptidu kódovaného polynukleotidovou sekvenciou.

Farmakologický agens je definovaný ako jedna alebo viac zlúčenín alebo iných chemických indivíduí, ktoré sa podávajú pacientovi (naviac s antagonistom podlá vynálezu), a ktoré ovplyvňujú pôsobenie antagonistu. Termín farmakologický agens teda označuje taký agens, ktorý sa podáva v priebehu kombinovanej terapie, keď sa antagonista podľa vynálezu podáva buď pred, po alebo súčasne s jedným alebo viacerými farmakologickými agensami.

Proteín je polymér zložený v podstate z ktorýchkolvek dvadsiatich proteínových aminokyselín. Aj keď termín polypeptid sa často používa na označenie relatívne velkých polypeptidov a termín peptid sa často používa na označenie relatívne malých polypeptidov, použitie týchto termínov v odbore sa často prekrýva a je odlišné. V tomto opise sa termín proteín používa na označenie ako peptidov tak aj proteínov a polypeptidov, ak nie je výslovne uvedené inak.

Takže termíny peptid(y), proteín(y) a polypeptid(y) sú v tomto opise používané zamenitelne. Tiež termíny polynukleotidová sekvencia a nukleotidová sekvencia sú tu používané zameniteľné .

Rekombinantný znamená, že proteín pochádza z rekombinantného cicavčieho expresného systému. Pretože integríny nie sú glykozylované ani neobsahujú disulfidické väzby, môžu byť exprimované vo väčšine prokaryotických a eukaryotických expresných systémov.

Termín “malá molekula je definovaný v časti A2 .

Termín povrchová aminokyselina znamená akúkoľvek aminokyselinu, ktorá je vystavená rozpúšťadlu, keď je proteín zostavený do svojej natívnej formy.

Hybridizačné podmienky sú podmienky určené koncentráciou solí a teplotou, v podstate zhodné s podmienkami 0,5xSSC až 5xSSC a 65°C ako pre vlastnú hybridizáciu tak premývanie. Tu používaný termín štandardné hybridizačné podmienky je preto operačná definícia zahŕňajúca rad hybridizácií. Takže podmienky s vysokou stringenciou (prísnosťou) zahŕňajú hybridizáciu v pufri pre skríning plakov (obsahuje 0,2% polyvinylpyrolidón, 0,2% Ficoll 400, 0,2% hovädzí sérový albumín, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, IM NaCI, 0,1% difosforečnan sodný, 1% SDS) s 10% dextránsulfátom a 100 μς/ml denaturovanej sonikovanej DNA lososej spermy pri 65°C počas 12 až 20 hodín a premývanie v 75 mM NaCl/7,5 mM citrát sodný (0,5xSSC)/l% SDS pri 65°C. Podmienky s nízkou stringenciou znamenajú napr. hybridizáciu v pufri na skríning plakov s 10% dextránsulfátom a 110 μg/ml denaturovanej sonikovanej DNA lososej spermy pri 55°C počas 12 až 20 hodín a premývanie v 300 mM NaCl/30 mM citrát sodný (2xSSC)/1% SDS pri 55°C (pre podrobnosti pozri Ausubel a kol., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, Inc., 1989, kapitoly 6.3.1 až 6.3.6, 1989) .

Termín terapeutická kompozícia obsahujúcu antagonistu podlá vynálezu kompatibilné prísady. Terapeutická kompozícia obsahuje ďalej tiež excipienty ako je voda, minerály a nosiče, ako sú napr. proteiny.

Termín pacient s fibrotickým ochorením sa týka pacienta trpiaceho fibrózou vnútorných orgánov, kožným fibróznym ochorením, dermálnou fibrózou a fibrotickým ochorením oka (avšak tento označuje kompozíciu a ďalšie biologicky výpočet nie je obmedzujúci). K fibróze vnútorných orgánov (napr. pečene, plúc, obličiek, srdca, krvných ciev, gastrointestinálneho traktu) dochádza pri ochoreniach ako je pulmonálna fibróza, myelofibróza, cirhóza pečene, mesangiálna proliferatívna glomerulonefritída, kosákovitá glomerulonefritída, diabetická nefropatia, fibróza renálneho interstícia, renálna fibróza pacientov na cyklosporíne, nefropatia asociovaná s HIV.

K dermálnym fibróznym ochoreniam patrí (avšak výpočet nie je obmedzujúci) skleroderma; morfea, keloidy, hypertrofické jazvy, familiárny kutánny kolagenóm, a névy v spojivovom tkanive kolagénového typu. K fibrotickým ochoreniam oka patrí napr. diabetická retinopatia, jazvy po chirurgickom zákroku (napr. po filtračnej operácii glaukómu alebo krížovej operácii oka) a proliferatívna vitreoretinopatia. Ďalšie fibrotické ochorenia, ktoré je možné liečiť prípravkami podlá vynálezu, sú: reumatoidná artritída, choroby spojené s dlhotrvajúcou bolesťou kĺbov a opotrebovaním kĺbov, progresívna systémová skleróza, polymyozitída, dermatomyozitída, eozinofilná fascitída, morfea, Raynaudov syndróm a nazálna polypóza. Naviac k fibrotickým ochoreniam, ktoré je možné liečiť prípravkami podlá vynálezu, patrí inhibícia nadmernej tvorby jaziev, u ktorých je známa tvorba keloidov alebo hypertrofické zjazvenie; inhibícia alebo prevencia zjazvenia alebo nadmerného zjazvenia v priebehu hojenia rôznych typov rán, vrátane chirurgických rezov, chirurgických rezov brušnej steny a traumatických lacerácií, prevencia alebo inhibícia zjazvenia alebo uzáveru artérii po vykonaní angioplastiky, prevencia alebo inhibícia nadmerných jaziev alebo tvorby fibrózneho tkaniva spojenej so srdcovou fibrózou po infarkte a hypersenzitívna vaskulopatia.

Účinné množstvo je také množstvo, ktoré je dostatočné na navodenie prospešného alebo požadovaného účinku. Účinné množstvo môže byť podané v jednej dávke alebo vo viacerých dávkach. V terapeutickom zmysle účinné množstvo antagonistu podľa vynálezu je množstvo dostatočné na zmiernenie, potlačenie, stabilizáciu, zvrátenie, spomalenie alebo oneskorenie progresie ochorení podlá prijatých štandardov pre dané ochorenie. Detekcia a meranie ukazovateľov účinnosti terapie sa uskutočňuje celým radom rôznych diagnostických metód, napr. fyzikálnym vyšetrením vrátane krvných testov, testov pulmonálnej funkcie, rôntgen hrudníka, vyšetrenie CT; bronchoskopia, bronchoalveolárny výplach, biopsia pľúc.

Praktické uskutočnenie predloženého vynálezu vyžaduje, ak nie je špecificky uvedené inak, obvyklú techniku bunkovej a molekulárnej biológie, bunkových kultúr, mikrobiológie, rekombinantnej DNA, proteínovej chémie, farmakológie a imunológie, ktoré sú odborníkom známe a sú dostatočne opísané v odbornej literatúre. Ak nie je uvedené inak, publikácie citované v predloženej prihláške sú celé zahrnuté formou odkazu.

Opis výhodných uskutočnení predloženého vynálezu

Predložený vynález je založený na zistení, že antagonisty integrinov obsahujúcich podjednotku al a/alebo a.4 a ich fragmenty sa môžu využiť na liečenie pulmonálnej fibrózy.

A. Antagonisty integrínu

Pre potreby predloženého vynálezu je antagonistom integrínu antagonista akejkoľvek interakcie medzi integrínom a ním rozpoznávaným ligandom alebo receptorom, ktorý tak mení (to znamená celkom ruší, spomaľuje alebo inak modifikuje) normálne funkcie indukované interakciami ligand-receptor). V jednom výhodnom uskutočnení je antagonistom integrínu antagonista interakcií a4 integrinov s ich ligandami, napr. interakcia VCAM-l/VLA-4. Je to agens, napr. polypeptid alebo iná molekula, ktorá môže inhibovať alebo blokovať väzbu sprostredkovanú VCAM-1 a/alebo VLA-4 alebo môže iným spôsobom modulovať funkcie VCAM-1 a/alebo VLA-4, napr. tým, že inhibuje alebo blokuje signálnu transdukciu VLA-4 sprostredkovanú ligandom VLA-4 alebo signálnu transdukciu VCAM-1 sprostredkovanú ligandom VCAM-1, a ktoré je účinné pri liečení akútnych poškodení mozgu, výhodne rovnakým spôsobom ako anti-VLA-4 protilátky.

Antagonista interakcie VCAM-l/VLA-4 je agens, ktoré má aspoň jednu z nasledujúcich vlastností: (1) pokrýva VLA-4 alebo sa viaže na VLA-4 na povrchu buniek nesúcich VLA-4 (napr. endotelových buniek) so špecificitou dostatočnou na inhibíciu interakcie VLA-4-iigand/VLA-4, napr. interakcie VCAM-l/VLA-4; (2) pokrýva alebo sa viaže na VLA-4 na povrchu buniek nesúcich VLA-4 (napr. lymfocytov) so špecificitou dostatočnou na modifikáciu, výhodne inhibíciu, transdukcie signálu sprostredkovanej VLA-4, napr. signalizácie sprostredkovanej VLA-4/VCAM-1; (3) pokrýva alebo sa viaže na VLA-4 ligand (napr. VCAM-1) na endotelových bunkách so špecificitou dostatočnou na inhibíciu interakcie VLA-4/VCAM-1; (4) pokrýva alebo sa viaže na VLA-4 ligand (napr. VCAM-1) so špecificitou dostatočnou na modifikáciu, výhodne inhibíciu signálnej transdukcie VLA-4 sprostredkovanej VLA-4 ligandom, napr. signálnej transdukcie VLA-4 sprostredkovanej VCAM-1. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu má antagonista jednu alebo obidve z vlastností 1 a 2. V inom výhodnom uskutočnení má antagonista jednu alebo obidve z vlastností 3 a 4. Naviac sa môže použiť viac ako jeden antagonista, napr. agens viažuci VLA-4 sa môže kombinovať s agensom viažucim VCAM-1.

Ďalším uskutočnením antagonistu integrínu je antagonista interakcie integrínov al s ich ligandami, napr. interakcia kolagén/VLA-1. Je to agens, napr. polypeptid alebo iná molekula, ktorá môže inhibovať alebo blokovať väzbu sprostredkovanú kolagénom a/alebo VLA-1 alebo môže iným spôsobom modulovať funkcie kolagénu a/alebo VLA-1, napr. tým, že inhibuje alebo blokuje signálnu transdukciu VLA-1 sprostredkovanú ligandom VLA-1 alebo signálnu transdukciu kolagénu sprostredkovanú ligandom kolagénu. Antagonista interakcie kolagér./VLA-l je agens, ktoré má aspoň jednu z nasledujúcich vlastností: (1) pokrýva alebo sa viaže na VLA-1 na povrchu buniek nesúcich VLA-1 (napr. kolagén) so špecificitou dostatočnou na inhibíciu interakcie VLA-l-ligand/VLA-1, napr. interakciu kolagén/VLA-1; (2) pokrýva alebo sa viaže na VLA-1 na povrchu buniek nesúcich VLA-1 so špecificitou dostatočnou na modifikáciu, výhodne inhibíciu, transdukcie signálu sprostredkovanú VLA-1, napr. signalizácie sprostredkovanej VLA-l/kolagén; (3) pokrýva alebo sa viaže na VLA-1 ligand (napr. kolagén) so špecificitou dostatočnou na inhibíciu interakcie VLA-l/kolagén; (4) pokrýva alebo sa viaže na VLA-1 ligand so špecificitou dostatočnou na modifikáciu, výhodne inhibíciu signálnej transdukcie VLA-1 sprostredkovanej VLA-1 ligandom, napr. signálnej transdukcie VLA-1 sprostredkovanej kolagénom. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu má antagonista al jednu alebo obidve z vlastností 1 a 2. V inom výhodnom uskutočnení má antagonista jednu alebo obidve z vlastností 3a 4. Naviac sa môže použiť viac ako jeden antagonista, napr. agens viažuci VLA-1 sa môže kombinovať s agensom viažucim kolagén.

Ako je už uvedené, antagonista podlá vynálezu nie je obmedzený konkrétnym typom alebo štruktúrou molekuly, takže antagonistom podľa vynálezu a v zhode s príkladmi alebo ekvivalentom agensu podľa vynálezu je akékoľvek agens schopné viazať sa na a4 integríny (napr. VLA-4) na povrchu buniek alebo na a4 ligand (ako je napr. VCAM-1 na povrchu buniek nesúcich a4 ligand), a ktoré účinne blokuje alebo pokrýva a4 integrín (napr. VLA-4) alebo a4 ligand (napr. VCAM-1), a nazýva sa agens viažuci integrín a4 a prípadne agens viažuci ligand a4 integrínu.

Napríklad protilátky a protilátkové homológy (podrobnejšie ešte ďalej) a tiež rozpustné formy prirodzených väzbových proteínov pre VLA-4 a VCAM-1 sú užitočné podľa vynálezu. K rozpustným formám prirodzených väzbových proteinov pre VLA-4 patria rozpustné VCAM-1 peptidy, fúzny proteín VCAM-1, bifunkčný fúzny proteín VCAM-l/Ig (napr. chimérická molekula opísaná skôr), fibronektín, fibronektín majúci alternatívne zostrihnutý spojovací segment odlišný od typu III, a fibronektínové peptidy obsa22 hujúce aminokyselinovú sekvenciu E1LDV alebo podobnú konzervatívne substituovanú aminokyselinovú sekvenciu. K rozpustným formám prírodných väzbových proteínov pre VCAM-1 patria rozpustné peptidy VLA-4, VLA-4 fúzne proteíny, bifunkčný fúzny proteín VLA-4/Ig a pod.. Termín rozpustný peptid VLA-4 alebo rozpustný peptid VCAM-1 označuje polypeptid VLA-4 alebo VCAM-1, ktorý nie je schopný zakotvenia v membráne. K takým rozpustným polypeptidom patria napr. polypeptidy VLA-4 a VCAM, ktorým chýba dostatočný úsek membránovej domény na ukotvenie polypeptidu v membráne alebo sú modifikované tak, že membránová doména je nefunkčná. Tieto väzbové agensy pôsobia tak, že kompetujú s väzbovými proteínmi pre VLA-4 na bunkovom povrchu alebo iným spôsobom menia funkciu VLA-4. Napr. rozpustná forma VCAM-1 (pozri napr. Osborn a kol., 1989, Celí, 59: 1203-1211) alebo jej fragment sa môžu podávať, aby viazali VLA-4, a výhodne tak kompetovali o väzbové miesta pre VLA-4 na bunkách nesúcich VCAM-1, čo vedie k účinku podobnému podaniu antagonistov ako sú malé molekuly alebo anti-VLA-4 protilátky.

1. Homológy anti-integrínových protilátok

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je antagonistom podľa vynálezu, ktorý viaže, a teda blokuje alebo poťahuje integríny al a/alebo a4 na bunkovom povrchu (ako sú napr. VLA-1, VLA-4 alebo α4β7) a/alebo ligandy na bunkovom povrchu pre integrín al a/alebo a4 (ako je kolagén alebo VCAM-1, v uvedenom poradí) anti-VLA-1 alebo anti-VLA-4 a/alebo anti-kolagén alebo anti-VCAM-1 monoklonálna protilátka alebo homológ takej protilátky, ako už boli definované v texte. K výhodným protilátkam a protilátkovým homológom, najmä na použitie v humánnej terapii, patria humánne protilátkové homológy, humanizované protilátkové homológy, chimérické protilátkové homológy, protilátkové fragmenty Fab; Fab', F(ab')2 a F (v), monoméry alebo diméry ťažkého alebo ľahkého reťazca protilátky alebo ich kombinácie. Výhodné väzbové agensy podľa vynálezu sú monoklonálne protilátky proti VLA-4.

2. Malé molekuly ako antagonisty integrínu

Termín malá molekula antagonistu integrínu označuje chemické agens (to znamená organickú molekulu) schopné narušiť interakciu integrín/ligand integrínu, napr. tým, že blokuje interakcie VLA-4/VCAM väzbou na VLA-4 alebo väzbou na VCAM-1 na povrchu buniek. Tieto malé molekuly sa môžu tiež viazať na príslušné receptory VLA-4 a VCAM-1. Malé molekuly inhibujúce VLA-4 a VCAM-1 sú samé peptidy, semipeptidové zlúčeniny alebo zlúčeniny nepeptidovej povahy, ako napr. malé organické molekuly, ktoré antagonizujú interakcie VCAM-l/VLA-4. Malá molekula v zmysle predloženého vynálezu nezahŕňa protilátky ani protilátkové homológy. Všeobecne je molekulová hmotnosť malých molekúl obvykle menšia ako 1000.

Napríklad sa môžu použiť malé molekuly ako sú oligosacharidy napodobňujúce väzbovú doménu VLA-4 ligandu a pasujúce do receptorovej domény VLA-4 (pozri J. J. Devlin a kol., 1990, Science 249: 400-406 (1990); J.K. Scott a G.P. Smith, 1990, Science 249: 386-390, a patent US 4 833 092 (Geysen), všetky tieto publikácie sú zahrnuté formou odkazu). Naopak sa môžu použiť malé molekuly napodobňujúce väzbovú doménu VCAM-1 ligandu a pasujúce do receptorovej domény VCAM-1.

Ďalšie príklady malých molekúl užitočných podľa predloženého vynálezu je možné nájsť v publikácii Komoriya a kol. (The Minimal Essential Sequence for a Major Celí Type Specific Adhesion Site (CS1) Within Alternatively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronektin Is Leucine Aspartic Acid-Valine, J. Biol. Chem., 266 (23), pp. 15075-79 (1991)). Títo autori identifikovali minimálne sekvencie aminokyselín nevyhnutné pre väzbu VLA-4 a syntetizovali rôzne prekrývajúce sa peptidy založené na aminokyselinovej sekvencii úseku CS-1 (väzbová doména VLA-4) konkrétnych druhov fibronektínu. Identifikovali peptid z 8 aminokyselín, Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr, a tiež dva menšie prekrývajúce sa pentapeptidy, Glu-Ile-Leu-Asp-Val a Leu-Asp-Val24

-Pro-Ser, ktoré vykazujú inhibičnú aktivitu pre bunkovú adhéziu závislú od fibronektínu. Určité väčšie peptidy obsahujúce sekvenciu LDV sa identifikovali ako aktívne in vivo (T.A. Ferguson a kol., Two Integrín Binding Peptides Abrogate T-cell-Mediated Immune Reaction In Vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, pp. 8072-76 (1991); a S.M. Wahi a kol., Synthetic Fibronectin Peptides Suppress Arthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion and Recruitment, J. Clin. Invest., 94, pp. 655-62 (1994)). Opísaný bol tiež cyklický pentapeptid, Arg-Cys-Asp-TPro-Cys (kde TPro je 4-tioprolín), ktorý inhibuje ako VLA-4 tak VLA-5 adhéziu na fibronektín (pozri napr. D.M. Nowlin a kol., A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits α4β1 Integrinmediated Celí Adhesion, J. Biol. Chem., 268(27); pp. 20352-59 (1993); a PCT/US91/04862) . Tento pentapeptid je založený na tripeptidovej sekvencii Arg-Gly-Asp z fibronektínu, ktorá je známa ako spoločný motív v rozpoznávacom mieste pre niekoľko proteínov extracelulárneho matrixu. Príklady ďalších VLA-4 inhibítorov sú uvedené napr. v Adams a kol. Celí Adhesion Inhibitors, PCT/US97/13013, kde sú opísané lineárne peptidylové zlúčeniny obsahujúce β-amínokyseliny s inhibičnou aktivitou na bunkovú adhéziu. Medzinárodné patentové prihlášky WO 94/15958 a WO 92/00995 opísali cyklické peptidy a peptidomimetické zlúčeniny s inhibičnou aktivitou pre bunkovú adhéziu. Medzinárodné patentové prihlášky WO 93/08823 a WO 92/08464 opisujú zlúčeniny inhibujúce bunkovú adhéziu obsahujúcu guanidinyl, močovinu a tiomočovinu. Patent US 5 260 277 opisuje guanidinylovú zlúčeninu modulujúcu bunkovú adhéziu. Ďalšie peptidylové antagonisty VLA-4 sú opísané v D.Y. Jackson a kol., Potent α4β1 peptide antagonists as potential anti-inflammatory agens', J. Med. Chem., 40, 3359 (1997); H. Shroff a kol., 'Smeli peptide inhibitors of α4β7 mediated MadCAM-1 adhesion to lymphocytes, Bio. Med. Chem. Lett., 1, 2495 (1996); Patent US 5 510 332, PCT Publikácie WO 98/53814, WO 97/03094, WO 97/02289, WO 96/40781, WO 96/22966, WO 96/20216, WO 96/01644, WO 96/06108 a WO 95/15973.

Také malé molekuly sa môžu pripraviť tak, že sa syntetizuje množstvo peptidov (napr. dĺžky 5 až 20 aminokyselín), semi-peptidových zlúčenín alebo organických zlúčenín nepeptidovej povahy, a potom sa uskutoční skríning týchto zlúčenín na schopnosť inhibovať príslušnú interakciu VLA-l/kolagén alebo VLA-4/VCAM-1 (pozri patent US 4 833 092, Scott and Smith, Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library, Science, 249, pp. 386-90 (1990), a Devlin a kol·., Random Peptide Libraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules, Science, 249, pp. 40407 (1990) .

B. Metódy prípravy homológov anti-integrínových protilátok

Metódy prípravy monoklonálnych protilátok (mAb), vrátane napr. antiintegrínových monoklonálnych protilátok, sú dobre známe (pozri napr. Mendrick a kol·., 1995, Lab. Invest. 72: 367-375 (mAb k myšej anti-αΐβΐ a θηίί-α2β1); Sonnenberg a kol., 1987, J. Biol. Chem. 262: 10376-10383 (mAb k myšej anti-αββΐ); Yao a kol. 1996, J. Celí Sci 1996, 109: 3139-50 (mAb k myšej 8ηίί-α7β1); Hemler a kol. 1984, J. Immunol. 132: 3011-8 (mAb k humánnemu αϊβΐ) ; Pischel a kol. 1987, J. Immunol. 138: 226-33 (mAb k humánnemu α2β1); Wayner a kol., 1988, J. Celí. Biol. 107: 1881-91 (mAb k humánnemu α3β1); Hemler a kol. 1987, J. Biol. Chem. 262: 11478-85 (mAb k humánnemu α4β1); Wayner a kol., 1988, J. Celí. Biol., 107: 1881-91 (mAb k humánnemu α5β1); Sonnenberg a kol.,

1987, J. Biol. Chem., 262: 10376-10383 (mAb k humánnemu αδβΐ);

A. Wang a kol., 1996, Am. J. Respir. Celí. Mol. Biol. 15: 664-672 (mAb k humánnemu α9β1); Davies a kol., 1989, J. Celí. Biol. 109: 1817-26 (mAb k humánnemu ανβΐ); Sanchez-Madrid a kol. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 748993 (mAb k humánnemu αΙ,β2); Diamond a kol. 1993, J. Celí. Biol. 120: 1031-43 (mAb k humánnemu αΜβ2); Stacker a kol. 1991, J. Immunol. 146: 648-55 (mAb k humánnemu αΧβ2); Van der Vieren a kol., 1995, Immunity 3:

683-90 (mAb k humánnemu αϋβ2); Bennett a kol. 1983, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80: 2417-21 (mAb k humánnemu aIIbP3); Hessle a kol., 1984, Differentiation 26: 49-54 (mAb k humánnemu α6β4); Weinacker a kol., 1994, J. Biol. Chem. 269: 6940-8 (mAb k humánnemu ανβ5); Weinacker a kol., 1994, J. Biol. Chem. 269: 6940-8 (mAb k humánnemu ανββ); Cerf-Bensussan a kol. 1992, Eur. J. Immunol. 22: 273-7 (mAb k humánnemu αΕβ7); Nishimura a kol., 1994, J. Biol. Chem., 269: 28708-15 (mAb k humánnemu ανβδ); Bossy a kol., 1991, EMBO J. 10: 2375-85 (polyklonálne antisérum k humánnemu α8β1); Camper a kol., 1998, J. Biol. Chem. 273: 20383-20389 (polyklonálne antisérum k humánnemu αΙΟβΙ).

Výhodné antagonisty integrínu podľa predloženého vynálezu môžu byť exprimované z intaktnej alebo skrátenej genómovej alebo cDNA alebo zo syntetickej DNA v prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských bunkách. Dimérne proteíny sa izolujú z kultivačného média a/alebo sú zostavené a dimerizované in vitro, aby vytvorili biologicky aktívnu molekulu. Heterodiméry sa môžu vytvárať in vitro kombináciou samostatných odlišných polypeptidových reťazcov. Alternatívne sa môžu heterodiméry pripravovať v jedinej bunke koexpresiou nukleových kyselín kódujúcich jednotlivé odlišné polypeptidové reťazce (pozri napr. WO 93/09229 alebo patent US 5 411 941, uvedené niekoľko postupov prípravy rekombinantných heterodimérnych proteínov). K výhodným hostiteľským bunkám patria, bez toho aby bol však výpočet takto obmedzený, prokaryoty ako E. coli, alebo eukaryoty ako kvasinky, Saccharomyces, bunky hmyzu alebo cicavčie bunky ako CHO, COS alebo BSC. Odborníkovi je zrejmé, že sa môžu použiť aj iné bunky.

Napríklad anti-VLA-4 protilátky sa môžu identifikovať imunoprecipitáciou 1251-značených bunkových lyzátov z buniek exprimujúcich VLA-4 (pozri Sanchez-Madrid a kol., 1986, Eur. J. Immunol., 16: 1343-1349 a Hemler a kol., 1987, J. Biol. Chem., 262,

1147811485). Protilátky anti-VLA4 môžu byť tiež identifikované prietokovou cytometriou, napr. meraním fluorescenčného farebného značenia buniek Ramos inkubovaných protilátkou, o ktorej sa domnievame, že rozpoznáva VLA-4 (pozri Elices a kol., 1990 Celí., 60: 577-584). Lymfocyty používané na prípravu hybridómových buniek sú typicky izolované z imunizovaných cicavcov, ktorých sérum už bolo v takom skríningovom teste nájdené pozitívne na prítomnosť anti-VLA-4 protilátok.

Typicky sa nesmrteľné bunkové línie (napr. línie myelómových buniek) získavajú z rovnakých cicavcov ako lymfocyty. Výhodnou nesmrteľnou bunkovou líniou je línia myších myelómových buniek, ktoré sú senzitívne na kultivačné médium obsahujúce hypoxantín, aminopterín a tymidín (médium HAT). Typicky sú tieto HAT-senzitívne myšie myelómové bunky fúzované s myšími splenocytmi použitím polyetylénglykolu s molekulovou hmotnosťou 1500 (PEG 1500). Hybridómové bunky vzniknuté fúziou sú selektované použitím média HAT, ktoré usmrtí nefúzované a neproduktívne fúzované myelómové bunky (nefúzované splenocyty odumierajú po niekoľkých dňoch, pretože nie sú transformované). Hybridómy produkujúce požadovanú protilátku sa detegujú skríningom supernatantov hybridómových kultúr. Tak napr. hybridómy pripravené k produkcii anti-VLA-4 protilátok sa skrínujú tak, že sa testuje supernatant bunkovej kultúry na secernované protilátky majúce schopnosť viazať na bunkovú líniu exprimujúcu rekombinantnú podjednotku a4 (pozri Elices a kol., citované skôr).

Na produkciu anti-VLA-4 protilátkových homológov, ktorými sú intaktné imunoglobulíny, sa hybridómové bunky pozitívne v takých testoch kultivovali v takom médiu, takých podmienkach a po taký čas, ktoré boli dostatočné na to, aby hybridómové bunky secernovali monoklonálne protilátky do kultivačného média. Techniky tkanivových kultúr a kultivačné médiá vhodné pre hybridómové bunky sú odborníkom známe. Upravený supernatant z hybridómovej kultúry sa odoberie a anti-VLA-4 protilátky sa môžu prípadne ďalej purifikovať známymi metódami.

Alternatívne sa požadované protilátky pripravujú injekciou hybridómových buniek do peritoneálnej dutiny neiraunizovanej myši. Hybridómové bunky proliferujú v peritoneálnej dutine a secernujúce protilátky sa hromadia v ascitálnej tekutine. Protilátky sa potom získajú odsatím ascitálnej tekutiny z peritoneálnej dutiny injekčnou striekačkou. Už skôr sa opísalo niekolko myších monoklonálnych anti-VLA-4 protilátok, pozri napr. Sanchez-Madrid a kol., 1986, pozri skôr; Hemler a kol., 1987, pozri skôr; Pulido a kol., 1991, J. Biol. Chem., 266 (16), 10241-10245); Issekutz and Wykretowicz, 1991, J. Immunol., 147: 109 (TA-2 mAb). Tieto anti-VLA-4 monoklonálne protilátky a ďalšie anti-VLA-4 protilátky (pozri napr. patent US 5 888 507 Biogen, Inc. vrátane tam citovaných odkazov) schopné rozpoznávať a a/alebo β reťazec VLA-4 sú užitočné tiež podľa predloženého vynálezu. Výhodné sú protilátky anti-VLA-4, ktoré rozpoznávajú epitopy a4 reťazca VLA-4 podieľajúce sa na väzbe ligandov VCAM-1 a fibronektínu (to znamená protilátky, ktoré sú schopné sa viazať na VLA-4 v mieste, ktoré sa zúčastňuje rozpoznania ligandu, a tým blokovať väzbu VCAM-1 a fibronektínu). Také protilátky sú definované ako protilátky špecifické pre epitop B (BI alebo B2) (Pulido a kol., 1991, pozri skôr) a sú to také anti-VLA-4 protilátky podľa predloženého vynálezu.

Ďalšími· vhodnými väzbovými agensami podľa predloženého vynálezu, ktoré blokujú alebo pokrývajú VLA-4 ligand, sú plne humánne monoklonálne protilátkové homológy proti VLA-4. Na ich prípravu sa používajú in vitro inštruované (primed) humánne splenocyty, ako opísali Boerner a kol., 1991, J. Immunol., 147, 86-95. Alternatívne sa môžu pripraviť repertoárovým klonovaním, ako opísali Persson a kol., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 2432- -2436 alebo Huang and Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227-236. Patent US 5 798 230 (25. august 1998, Proces for the preparation of human monoclonal antibodies and their use) opisuje prípravu humánnych monoklonálnych protilátok z humánnych B lymfocytov. Pri tejto metóde sú humánne B lymfocyty produkujúce protilátku imortalizované tým, že sú infikované vírusom Epstein-Barr, alebo jeho derivátom, ktorý exprimuje jadrový antigén vírusu Epstein-Barr 2 (EBNA2). Funkcia EBNA2, potrebná na imortalizáciu, je neskôr vyradená, čo vedie k zvýšeniu tvorby protilátok.

V ďalšej metóde produkcie plne humánnych protilátok (patent US 5 789 650 (4. august 1998, Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies) sa opisujú transgénne zvieratá s výnimkou človeka, schopné vytvárať heterológne protilátky majúce inaktivované endogénne imunoglobulínové gény. Endogénne imunoglobulínové gény sú suprimované použitím antisense polynukleotidov a/alebo antisérom namiereným proti endogénnym imunoglobulínom. Heterológne protilátky sú kódované imunoglobulínovými génmi, ktoré sa normálne nevyskytujú v genóme daného druhu transgénneho zvieraťa. Jedna alebo viac sekvencii obsahujúcich transgén nepreorganizovaného génu ťažkého reťazca heterológneho humánneho imunoglobulínu sa vnesie do zvieraťa, s výnimkou človeka, a tak sa vytvorí transgénne zviera schopné funkčného preorganizovania sekvencii transgénneho imunoglobulínu a produkcie repertoáru protilátok rôznych izotypov kódovaných humánnymi imunoglobulínovými génmi. Také heterológne humánne protilátky sú produkované v B lymfocytoch, ktoré sú potom imortalizované, to znamená fúzované s imortalizovanou bunkovou líniou ako sú napr. myelómové bunky, alebo manipuláciou B lymfocytov inými technikami, keď sa vytvorí permanentná bunková línia schopná produkovať monoklonálne heterológne plne humánne protilátkové homológy.

Veľké neimunizované humánne phage display knižnice sa tiež môžu využiť na izoláciu protilátok s vysokou afinitou, ktoré je možné pripraviť ako humánne terapeutiká štandardnými metódami fágových knižníc a expresie vo fágu (phage display) (pozri Vaughan a kol., 1996).

Ešte ďalšie výhodné väzbové agens podlá vynálezu blokujúce alebo poťahujúce ligandy integrínu je humanizovaný rekombinantný protilátkový homológ majúci anti-integrínovú špecifitu. Po pô30 vodných metódach prípravy pravých chimérických protilátok (kde vždy celý konštantný a celý variabilný úsek pochádzal z odlišného zdroja) je v dokumente EP 0239400 (Winter a kol.) opísaný nový prístup, keď sú protilátky zmenené substitúciou (vo vnútri daného variabilného úseku) úseku určujúceho komplementaritu (CDR) jedného druhu týmto úsekom z iného druhu. Tento postup je možné napr. použiť na substitúciu CDR z variabilných úsekov domén ťažkého a Iahkého reťazca humánneho Ig alternatívnymi CDR z variabilných úsekov príslušných domén myšej protilátky. Tieto zmenené variabilné úseky Ig sa potom kombinujú s konštantnými úsekmi humánneho Ig, a tak sa pripravia protilátky, ktoré sú z hľadiska zloženia plne humánne, okrem substituovaného úseku myšej CDR. Predpokladalo sa, že tieto CDR-substituované protilátky budú s ovela menšou pravdepodobnosťou vyvolávať imunitnú reakciu u ľudí v porovnaní s uvedenými pravými chimérickými protilátkami, lebo CDR-substituované protilátky obsahujú výrazne menej zložiek iného ako humánneho pôvodu. Spôsob humanizácie monoklonálnych protilátok prostredníctvom tzv. vrúblovania CDR sa nazval prestavba (pozri Riechmann a kol., 1988, Náture 332, 323-327; Verhoeyen a kol., 1988, Science 239, 15341536).

Typicky sa úseky určujúce komplementaritu (CDR) myšej protilátky transplantujú do zodpovedajúcich úsekov humánnej protilátky, pretože práve CDR (tri v ťažkom reťazci a tri v ľahkom reťazci protilátky) sú tie úseky myšej protilátky, ktoré sa viažu na špecifický antigén. Transplantácia CDR sa uskutočňuje metódami genetického inžinierstva, keď sa DNA sekvencie pre CDR určia klonovaním génových segmentov variabilných (V) úsekov ťažkých a ľahkých reťazcov myších protilátok a potom sa prenesú do zodpovedajúcich humánnych V úsekov miesto-cielenou mutagenézou. V záverečnej fáze tohto postupu sa pridajú génové segmenty humánnych konštantných úsekov požadovaného izotypu (obvykle γ I pre CH a χ pre CL) a gény humanizovaných ťažkých a ľahkých reťazcov sú koexprimované v cicavčích bunkách, kde produkujú rozpustné humanizované protilátky.

Prenos myších CDR do humánnych protilátok poskytuje týmto protilátkam antigénne väzbové vlastnosti pôvodných myších protilátok. Šesť úsekov CDR v myšej protilátke je umiestnených štruktúrne vo V úseku rámcovej oblasti. Dôvodom, prečo je vrúblovanie CDR úspešné, je to, že rámcové oblasti myších a humánnych protilátok majú veľmi podobné 3-D štruktúry s podobnými bodmi pripojenia CDR, takže CDR môžu byť ľahko zamenené. Také humanizované protilátkové homológy je možné pripraviť napr. ako opísali Jones a kol., 1986, Náture 321, 522-525; Riechmann, 1988, Náture 332, 323-327; Queen a koľ., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 10029; a Orlandi a koľ., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 3833.

Predsa len určité aminokyseliny vo vnútri rámcovej oblasti interagujú s CDR, a tak ovplyvňujú celkovú väzbovú afinitu k antigénu. Priamy prenos CDR z myšej protilátky s cieľom pripraviť rekombinantnú humanizovanú protilátku bez akejkoľvek modifikácie V úsekov rámcovej oblasti humánnej protilátky, často vedie k čiastočnej alebo aj úplnej strate väzbovej afinity. V mnohých prípadoch bola kritickým momentom zámena aminokyselinových zvyškov v rámcovej oblasti akceptorovej protilátky, aby sa získala protilátka s väzbovou afinitou.

Queen a kol., 1989 (pozri už uvedenú publikáciu) a dokument WO 90/07861 (Proteín Design Labs) opísali prípravu humanizovanej protilátky, ktorá obsahuje modifikované zvyšky v rámcovej oblasti akceptorovej protilátky, tým, že sa kombinovali úseky CDR z myšej monoklonálnej protilátky (anti-Tac) s konštantnými úsekmi a rámcovou oblasťou humánneho imunoglobulínu. Ukazálo sa tak jedno riešenie problému straty väzbovej afinity, ku ktorej často dochádza pri priamom prenose CDR bez príslušnej modifikácie zvyškov V úseku humánnej rámcovej oblasti, pričom toto riešenie obsahuje dva základné kroky. V prvom kroku sa pomocou počítačovej analýzy vyberú V úseky humánnej rámcovej oblasti, ktoré majú optimálnu homológiu proteínovej sekvencie s V úsekom rámcovej oblasti pôvodnej myšej protilátky, v opisovanom prípade monoklonálnej protilátky anti-Tac. V druhom kroku sa pomocou počítača modeluje terciárna štruktúra V úsekov myšej protilátky, aby sa vizualizovali aminokyselinové zvyšky rámcovej oblasti protilátky, ktoré by mohli interagovať s myšími CDR, a tieto aminokyselinové zvyšky z myšej sekvencie sú prenesené na homológny humánny rámcový úsek (pozri patenty US 5 693 762; 5 693 761; 5 585 089 a 5 530 101 (Proteín Design Labs) .

Môže sa tiež využiť odlišný postup (Tempest a kol., 1991, Biotechnology 9, 266-271) a využiť ako štandard V úseky z rámcovej oblasti z ťažkých a ľahkých reťazcov NEWM a REI na vrúblovanie CDR bez radikálneho vnášania aminokyselinových zvyškov myších sekvencií. Výhodou postupu konštrukcie humanizovaných protilátok založených na NEWM a REI, ako ho opísali Tempest a kol., je to, že trojrozmerné štruktúry variabilných úsekov NEWM a REI sú známe z rôntgenovej kryštalografie, a je teda možné modelovať špecifické interakcie medzi CDR a aminokyselinovými zvyškami V úseku rámcovej oblasti.

Bez ohľadu na použitý prístup príklady doteraz pripravených počiatočných homológov humanizovaných protilátok ukázali, že taká príprava nie je jednoduchý proces. Avšak aj keď uznáme, že nejaké zmeny v rámci protilátky sú potrebné, nie je možné na základe dostupných znalostí a stavu techniky predpovedať, ktoré aminokyselinové zvyšky, ak nejaké, z rámcového úseku protilátky majú byť zmenené, aby sa získala funkčná humanizovaná rekombinantná protilátka s požadovanou špecificitou. Doterajšie výsledky ukazujú, že zmeny potrebné na zachovanie špecificity a afinity sú väčšinou jedinečné pre danú protilátku a nie je ich možné predvídať na základe humanizácie inej protilátky.

K antagonistom integrínu obsahujúceho podjednotku a4 užitočným podľa predloženého vynálezu patria chimérické a humanizované rekombinantné protilátkové homológy (to znamená intaktné imunoglobulíny a ich častí) so špecificitou B epitopu, ktoré sa pripravili a sú opísané v patente US 5 932 214 (monoklonálny HP1/2). Východiskovým materiálom na prípravu chimérických (myšie variabilné - humánne konštantné) a humanizovaných homológov anti-integrínových protilátok sú myšie monoklonálne anti-integrínové protilátky ako sú opísané skôr, monoklonálne anti-integrínové protilátky komerčne dostupné (napr. HP2/1, Amae International; Inc., Westbrook, Maine), alebo monoklonálne anti-integrínové protilátky pripravené podľa predloženého vynálezu. Ďalšie výhodné humanizované anti-VLA4 protilátkové homológy sú opísané v Medzinárodnej patentovej prihláške PCT/US95/01219, Athena Neurosciences, Inc. (27. júla 1995) a v patente US 5 840 299 (publikácie vložené formou odkazu). Tieto humanizované anti-VLA-4 protilátky obsahujú humanizovaný lahký reťazec a humanizovaný ťažký reťazec. Humanizovaný ľahký reťazec obsahuje tri úseky určujúce komplementaritu (CDR1, CDR2 a CDR3) majúcu aminokyselinové sekvencie zo zodpovedajúcich úsekov určujúcich komplementaritu z myšieho lahkého reťazca imunoglobulínu 21.6 a rámec variabilného úseku z rámca variabilného úseku humánneho lahkého χ reťazca, s výnimkou aspoň jednej pozície, ktorá je obsadená rovnakou aminokyselinou ako je prítomná v ekvivalentnej pozícii v rámcovom úseku variabilnej oblasti lahkého reťazca imunoglobulínu 21.6. Humanizovaný ťažký reťazec obsahuje tri úseky určujúce komplementaritu (CDR1, CDR2 a CDR3) majúcu aminokyselinové sekvencie zo zodpovedajúcich úsekov určujúcich komplementaritu z myšieho ťažkého reťazca imunoglobulínu 21.6 a rámec variabilného úseku z rámca variabilného úseku humánneho ťažkého reťazca, s výnimkou aspoň jednej pozície, kde je pozícia obsadená rovnakou aminokyselinou aká je prítomná v ekvivalentnej pozícii v rámcovom úseku variabilnej oblasti ťažkého reťazca imunoglobulínu 21.6.

V spôsoboch podľa predloženého vynálezu sa používajú antagonistické molekuly, kódované sekvenciami nukleových kyselín, ktoré hybridizujú za stringentných podmienok so sekvenciami nukleových kyselín kódujúcich protilátky namierené proti integ34 rínom obsahujúcim podjednotku a4. Napríklad anatagonista podlá predloženého vynálezu je proteín, ktorému zodpovedajúca nukleová kyselina hybridizuje za podmienok vysokej stringencie s jednou alebo viacerými sekvenciami nukleových kyselín opísaných v tabuľke β v patente US 5 840 299, alebo sekvenciou komplementárnou s jednou alebo viacerými z týchto sekvencii. Antagonista môže byť tiež proteín, ktorého nukleová kyselina hybridizuje za podmienok vysokej stringencie s nukleovou kyselinou kódujúcou sekvenciu SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 4 z patentu US 5 932 214. Ďalej antagonista je aj proteín, ktorého nukleová kyselina hybridizuje za podmienok vysokej stringencie s nukleovou kyselinou kódujúcou variabilnú doménu protilátky produkovanej bunkovou líniou ATCC CRL 11175.

Alternatívne je antagonistom podľa predloženého vynálezu proteín, ktorému zodpovedajúca nukleová kyselina hybridizuje za podmienok nízkej stringencie s jednou alebo viacerými sekvenciami nukleových kyselín opísaných v tabuľke 6 v patente US 5 840 299, alebo sekvenciou komplementárnou s jednou alebo viacerými z týchto sekvencii. Antagonista môže byť tiež proteín, ktorého nukleová kyselina hybridizuje za podmienok nízkej stringencie s nukleovou kyselinou kódujúcou sekvenciu SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 4 z patentu US 5 932 214. Ďalej antagonista je aj proteín, ktorého nukleová kyselina hybridizuje za podmienok nízkej stringencie s nukleovou kyselinou kódujúcou variabilnú doménu protilátky produkovanej bunkovou líniou ATCC CRL 11175.

C. Príprava fragmentov a analógov

Fragmenty izolovaných antagonistov a4 integrínu (to znamená fragmenty tu opísaných protilátkových homológov) je možné tiež účinne pripravovať rekombinantnými metódami, proteolytickým štiepením alebo chemickou syntézou, a síce použitím postupov, ktoré sú odborníkom známe. Použitím rekombinantných techník sa vnútorné alebo výsledné fragmenty polypeptidu pripravujú odstránením jedného alebo viacerých nukleotidov z jedného konca (v prípade terminálneho fragmentu) alebo obidvoch koncov (v prípade vnútorného fragmentu) z DNA sekvencie kódujúcej izolovaný polypeptid. Expresia takto mutovanej DNA poskytuje polypeptidové fragmenty. Štiepenie endonukleázami, ktoré okusujú konce, môže tiež poskytnúť DNA kódujúce spektrum rôznych fragmentov. DNA kódujúce fragmenty proteínu sa môžu pripraviť tiež náhodným (nešpecifickým) strihaním DNA alebo štiepením restriktázami alebo kombináciou obidvoch postupov. Proteínové fragmenty môžu tiež byť pripravené priamo z intaktných proteínov. Peptidy sa môžu špecificky štiepiť proteolytickými enzýmami, ku ktorým patrí (pričom výpočet nie je obmedzujúci) plazmín, trombín, trypsín, chymotrýpsín a pepsín. Každý z týchto enzýmov je špecifický pre určitý typ peptidovej väzby, ktorú štiepi. Trypsín katalyzuje hydrolýzu peptidových väzieb, kde je karbonylová skupina zo zásaditej aminokyseliny, obvykle arginínu alebo lyzínu. Pepsín a chymotrypsín katalyzujú hydrolýzu peptidových väzieb z aromatických aminokyselín ako je tryptofán, tyrozín a fenylalanín. Alternatívne sady naštiepených proteínových fragmentov sa pripravia tým, že sa zabráni štiepeniu v miestach, ktoré sú citlivé k proteolytickým enzýmom. Tak napr. reakcia ε-aminoskupiny lyzínu s etyltrifluórtioacetátom v mierne zásaditom roztoku vedie k zablokovaniu aminokyselinových zvyškov, ku ktorým priľahlá peptidová väzba už ďalej nie je hydrolyticky štiepiteľná trypsínom. Proteíny môžu byť modifikované, aby vytvárali peptidové väzby, ktoré sú citlivé k proteolytickým enzýmom. Napr. alkylácia cysteínových zvyškov β-haloetylamínmi poskytuje peptidové väzby, ktoré nie sú hydrolyzované trypsínom (Lindley, (1956) Náture 178, 647). Naviac sa môžu použiť chemické činidlá, ktoré štiepia peptidové reťazce v miestach špecifických zvyškov. Napr. brómkyán štiepi peptidy v metionínovom zvyšku (Gross and Witkip, (1961), J. Am. Chem. Soc. 83, 1510). Takže pôsobením rôznych kombinácií modifikujúcich proteolytických enzýmov a/alebo chemických činidiel na proteíny, môžu byť proteíny rozložené na fragmenty požadovaných dĺžok, ktoré sa neprekrývajú, alebo na prekrývajúce sa fragmenty požadovaných dĺžok.

Fragmenty môžu byť tiež syntetizované chemicky, použitím metód, ktoré sú odborníkom známe, ako je napr. Merrifieldova chemická syntéza na pevnej fáze používajúca Fmoc alebo t-Boc (pozri Merrifield, Recent Progress in Hormone Research 23:451 (1967)) .

Príklady metód známych zo stavu techniky, ktoré umožňujú prípravu a testovanie fragmentov a analógov, sú diskutované ďalej. Tieto alebo analogické metódy je možné použiť na prípravu a skríning fragmentov a analógov izolovaných antagonistov integrínu a4, ktoré majú biologickú aktivitu. Príklad metódy na testovanie toho, či fragmenty a analógy antagonistov integrínu obsahujúcich podjednotku a.4 majú biologickú aktivitu, je uvedený v sekcii IV a v príkladoch.

D. Príprava zmenených DNA sekvencií a peptidových sekvencií: náhodné metódy

Varianty aminokyselinových sekvencií proteínov sa môžu pripraviť náhodnou mutagenézou DNA, ktorá kóduje proteín alebo jeho určitú časť. K užitočným metódam patria PCR mutagenézy a saturačné mutagenézy. Knižnica náhodných variantov aminokyselinových sekvencií sa môže tiež pripraviť použitím syntézy sady degenerovaných oligonukleotidových sekvencií. Metódy prípravy variantov aminokyselinových sekvencií daného proteínu použitím zmenených DNA sekvencií alebo peptidových sekvencií sú odborníkom dobre známe. Nasledujúce príklady sú uvedené na ilustráciu týchto postupov a predložený vynález nijako neobmedzujú. Odborníkovi je jasné, že pre tento cieľ je možné použiť aj iné metódy.

PCR mutagenéza:

Pozri napr. Leung a kol., (1989) Technique 1, 11-15.

Saturačná mutagenéza:

Jedna z metód je všeobecne opísaná v Mayers a kol., (1989)

Science 229, 242.

Mutagenéza s degenerovanými oligonukleotidmi:

Pozri napr. Harang, S.A., (1983) Tetrahedron 39, 3; Itakura a kol., (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 323 a Itakura a kol.,

Rekombinantné DNA, Proc. 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules, pp. 273-289 (A.G. Walton, ed.), Elsevier, Amsterdam, 1981.

E: Príprava zmenených sekvencii DNA a peptidových sekvencii:

Priame metódy

Nenáhodná alebo cielená mutagenéza poskytuje špecifické sekvencie alebo mutácie v špecifických častiach polynukleotidových sekvencii, ktoré kódujú izolované polypeptidy, čím vznikajú varianty, ktoré zahŕňajú delécie inzercie alebo substitúcie aminokyselinových zvyškov známej aminokyselinovéj sekvencie izolovaného polypeptidu. Mutované miesta môžu byť modifikované individuálne alebo v sériách napr. tým, že sa (1) substituujú sa najskôr konzervatívnymi aminokyselinami a potom sa uskutočňujú radikálnejšie zmeny v závislosti od získaných výsledkov, (2) uskutoční sa delécia cieľového aminokyselinového zvyšku, alebo (3) do susedstva vybraného miesta sa vložia aminokyselinové zvyšky rovnakej alebo odlišnej triedy, alebo sa kombinujú kroky 1 až 3.

Je jasné, že metódy miesto-cielenej mutagenézy sú jedným spôsobom, ako vniesť do danej polypeptidovej sekvencie N-koncový cysteín (alebo jeho funkčný ekvivalent), aby sa pripravilo miesto na pripojenie hydrofóbnej skupiny.

Alanínová skenovacia mutagenéza:

Pozri Cunningham and Wells, (1989) Science 244, 1081-1085.

Mutagenéza sprostredkované oligonukleotidmi:

Pozri napr. Adelman a kol., (1983) DNA 2, 183.

Kazetová mutagenéza:

Pozri Wells a kol., (1985) Gene 34, 315.

Kombinačná mutagenéza:

Pozri napr. Ladner a kol., WO 88/06630.

Stratégia Fág Display

Pozri napr. prehľadná publikácia Marsk a kol., J. Biol. Chemistry: 267 16007-16010 (1992).

F. Ďalšie varianty antagonistov integrínu

Varianty sa môžu líšiť od ostatných tu opísaných antagonistov integrínu v aminokyselinovej sekvencii alebo spôsobom, ktorý sa netýka sekvencie, a alebo obidvoma spôsobmi. Najvýhodnejšie polypeptidy podlá vynálezu obsahujú modifikácie inej ako sekvenčnej (nesekvenčnej) povahy, ku ktorým patrí in vivo alebo in vitro chemická derivatizácia (napr. ich N-konca), a tiež prípadne zmeny acetylácie, metylácie, fosforylácie, amidácie, karboxylácie alebo glykozylácie.

K ďalším analógom patria proteíny alebo ich biologicky aktívne fragmenty, ktorých sekvencia sa líši od sekvencii opísaných v patentoch US 5 840 299, 5 888 507 a 5 932 214 (zahrnuté formou odkazu) alebo v medzinárodnej prihláške PCT US/94/00266 jednou alebo viacerými substitúciami konzervatívnej alebo nekonzervatívnej aminokyseliny, alebo deléciami alebo inzerciami, ktoré nenarušujú biologickú aktivitu izolovaného proteínu. Ku konzervatívnym substitúciám typicky patria substitúcie jednej aminokyseliny inou aminokyselinou s podobnými vlastnosťami, ako napr. substitúcie v rámci nasledujúcich skupín aminokyselín: valín, alanín a glycín; leucín a izoleucín; asparágová a glutámová kyselina; asparagín a glutamín; serín a treonín; lyzín a arginín; a fenylalanín a tyrozín. Ku skupine nepolárnych hydrofóbnych aminokyselín patrí alanín, leucín, izoleucín, valín, prolín, fenylalanín, tryptofán a metionín. Skupina polárnych neutrálnych aminokyselín obsahuje glycín, serín, treonín, cysteín, tyrozín, asparagín a glutamín. Ku skupine pozitívne nabitých (zásaditých) aminokyselín patrí arginín, lyzín a histidín. Ku skupine negatívne nabitých (kyslých) aminokyselín patrí asparágová a glutámová kyselina. Ďalšie konzervatívne zámeny sú odborníkovi ihneď zrejmé. Tak napr. aminokyselinu alanín je možné konzervatívne substituovať ktoroukolvek aminokyselinou zo skupiny obsahujúcej D-alanín, glycín, β-alanín, L-cysteín a D-cysteín. Lyzín je možné nahradiť ktoroukolvek aminokyselinou zo skupiny obsahujúcej D-lyzín, arginín, D-arginín, homoarginín, metionín, D-metionín, ornitín a D-ornitín.

Ďalšími analógmi vhodnými pre predložený vynález sú analógy modifikované tak, aby sa zvýšila stabilita peptidu. Také analógy obsahujú napr. jednu alebo viac nepeptidových väzieb (ktoré nahradzujú pôvodné peptidové väzby) v peptidovej sekvencii. Patria sem tiež: analógy obsahujúce aminokyselinové zvyšky iné ako v prírode sa vyskytujúce L-aminokyseliny, ako sú napr. D-aminokyseliny alebo aminokyseliny nevyskytujúce sa v prírode alebo syntetické aminokyseliny ako sú napr. β- alebo γ-aminokyseliny alebo cyklické analógy aminokyselín. Inkorporácia D-aminokyseliny namiesto pôvodnej L-aminokyseliny v izolovanom polypeptide môže zvýšiť jeho rezistenciu k proteázam (pozri patent US 5 219 990).

K výhodným protilátkovým homológom patria aminokyselinové sekvencie, ktoré majú aspoň 60%, 80%, 90%, 95%, 98% alebo 99% homológiu s aminokyselinovou sekvenciou protilátky PS/2 (pozri príklady) alebo obsahujú aminokyselinovú sekvenciu s aspoň 60%, 80%, 90%, 95%, 98% alebo 99% homológiou s aminokyselinovými sekvenciami opísanými v patente US 5 840 299 (SEQ ID NO: 15 variabilný úsek ľahkého reťazca, alebo SEQ ID NO: 17 variabilný úsek ťažkého reťazca) alebo v patente US 5 932 214 (SEQ ID NO: 2 alebo 4) a v medzinárodnej patentovej prihláške WO 94/16094 (sekvencia vyskytujúca sa v anti-VLA4 protilátke produkovanej uloženou bunkovou líniou ATCC CRL 11175) .

G. Formy polymérových konjugátov

Podlá predloženého vynálezu je možné použiť jedinú molekulu polyméru na konjugáciu a antagonistu integrínu al alebo a4, avšak je možné pripojiť aj viac ako jednu molekulu polyméru. Konjugované kompozície antagonistu integrínu a4 podlá vynálezu sú užitočné ako na in vivo, tak aj iné ako in vivo aplikácie. Naviac je možné, aby konjugované polyméry používali ešte ďalšie akékoľvek iné kupóny, časti alebo ďalšie konjugované molekuly podľa výsledného cieľa zvolenej aplikácie. Tak napr. v niektorých aplikáciách môže byť užitočné kovalentne naviazať na polymér funkčnú skupinu, ktorá poskytuje polyméru rezistenciu proti degradácii UV-žiarením, alebo antioxidačné vlastnosti alebo iné vlastnosti. Ďalším príkladom aplikácie môže byť výhodná funkcionalizácia polyméru, aby bol reaktívny a mohol sa zosietením naviazať na molekulu liečiva, čím sa môžu zlepšiť rôzne vlastnosti celkového konjugovaného materiálu. Teda polymér môže obsahovať akékoľvek funkčné skupiny, opakujúce sa skupiny, väzby alebo iné základné štruktúry, ktoré nevylučujú jeho účinnú konjugáciu s kompozíciou antagonistu integrínu a4 pre zamýšľaný cieľ. Ďalšie výhody predloženého vynálezu budú zrejmé z ďalšieho opisu a z patentových nárokov.

Príklady polymérov, ktoré je možné výhodne použiť v predloženom vynáleze na dosiahnutie požadovaných vlastností kompozícií sú opísané ďalej na príklade niektorých reakčných schém. V kovalentne viazaných konjugátoch antagonista/polymér môže byť polymér funkcionalizovaný a potom naviazaný na volné aminoskupiny antagonistami, čím sa vytvoria labilné väzby.

Antagonisty integrínov obsahujúcich podjednotku a4 alebo al sú najvýhodnejšie konjugované prostredníctvom koncových reaktív41 nych skupín na polymér, aj keď konjugácia sa môže tiež vetviť z vnútorných, teda nekoncových reaktívnych skupín. Polymér s reaktívnou skupinou (skupinami) je označovaný ako aktivovaný polymér. Reaktívna skupina selektívne reaguje s voľnou aminoskupinou alebo inou reaktívnou skupinou v molekule antagonistu. Aktivovaný polymér sa nechá reagovať tak, že k napojeniu dôjde na akejkoľvek dostupnej aminoskupine antagonistu integrínu· ako je napr. α-aminoskupina alebo ε-aminoskupina lyzínu. Voľné karboxylové skupiny, vhodne aktivované karbonylové skupiny, guanidylová skupina, oxidované sacharidy a merkaptoskupiny antagonistu integrínu a4 (ak sú dostupné) môžu sa tiež využiť ako miesta pripojenia.

Aj keď polymér môže byť pripojený kdekoľvek na molekulu antagonistu integrínu, výhodné miesto na naviazanie polyméru na antagonistu integrínu (najmä ak ide o proteín) je N-koniec antagonistu integrínu. Sekundárne miesto (miesta) je na alebo v blízkosti C-konca a alebo prostredníctvom cukrových skupín (ak nejaké v molekule sú). Takže predložený vynález zahŕňa (I) konjugáty antagonistov integrínu al a a4 s N-koncovo naviazaným polymérom, (II) konjugáty antagonistov integrínu al a a4 s C-koncovo naviazaným polymérom, (III) konjugáty spojené prostredníctvom sacharidu, a tiež (IV) konjugáty antagonistov integrínu al a a4 s C-koncovo, N-koncovo aj cez cukor naviazaným polymérom.

Všeobecne sa používa 1,0 až 10 molov aktivovaného polyméru na 1 mól antagonistu, v závislosti od koncentrácie antagonistu. Výsledné množstvo je rovnováhou medzi maximalizáciou rozsahu reakcie a minimalizáciou nešpecifických modifikácií produktu, a súčasne určením reakcie, ktorá udrží optimálnu aktivitu, a pritom bude podľa možností optimálny polčas antagonistu. Výhodne je zachovaných aspoň 50% biologickej aktivity antagonistu, najvýhodnejšie je zachovaných 100%.

Reakcia sa môže uskutočňovať akýmkoľvek odborníkovi známym spôsobom vhodným na reakciu biologicky aktívneho materiálu s inertnými polymérmi. Všeobecne taký spôsob zahŕňa prípravu aktivovaného polyméru (ktorý má aspoň jednu koncovú hydroxylovú skupinu) a potom reakciu antagonistu s aktivovaným polymérom, čím vznikne rozpustný proteín vhodný na formuláciu do prípravku. Tieto modifikačné reakcie sa uskutočňujú rôznymi metódami v jednom alebo viacerých krokoch.

Ako už bolo uvedené skôr, v niektorých uskutočneniach vynálezu sa používa N-koniec antagonistu integrínu na pripojenie k polyméru. Vhodné konvenčné metódy sú k dispozícii na selektívnu prípravu N-koncovo modifikovaných antagonistov integrínu al alebo a4. Príkladom jednej takej metódy je metóda redukčnej alkylácie, keď sa využíva odlišná reaktivita rôznych typov primárnych aminoskupín (ε aminoskupiny na lyzíne oproti aminoskupinám na N-konci metionínu) prístupných na derivatizáciu na vhodných antagonistoch integrínu. Za vhodných selekčných podmienok je možné dosiahnuť v podstate selektívnu derivatizáciu vhodného antagonistu integrínu na jeho N-konci polymérom obsahujúcim karbonylovú skupinu. Reakcia sa uskutočňuje pri pH, ktoré dovoľuje využiť výhodu rozdielnych pKa pre ε-aminoskupiny lyzínových zvyškov a α-aminoskupinu N-koncového zvyšku v molekule antagonistu integrínu. Tento spôsob chemickej modifikácie je odborníkom dobre známy.

Stratégia naviazania polyalkylénglykolových polymérov ako je napr. PEG na C-koniec antagonistov integrínu al alebo a4 (napr. proteínov) môže byť buď chemické naviazanie alebo genetická manipulácia miesta, ktoré sa môže využiť na napojenie polymérovej časti. Tak napr. inkorporácia Cys do miesta v blízkosti alebo na C-konci proteínu umožní špecifickú modifikáciu použitím maleimidom, vinylsulfonom alebo haloacetátom aktivovaných derivátov polyalkylénglykolu (napr. PEG), ktoré sú odborníkom známe. Tieto deriváty sa môžu použiť na špecifickú modifikáciu geneticky vnesených cysteínových zvyškov vďaka vysokej selektivite týchto činidiel pre Cys. K ďalším stratégiám, predstavujúcim

K ďalším alternatívy pre modifikáciu C-konca antagonistu integrínu podľa vynálezu patrí inkorporácia histidovej značky (tag), ktorá potom môže byť zacielená (ľancy a kol., (1996) Chem. & Biol. 3: 551) alebo ďalších glykozylačných miest v proteíne.

Metódy zameriavania cukrov ako miest chemickej modifikácie sú tiež dobre známe a je teda pravdepodobné, že polyalkylénglykolové polyméry môžu byť priamo a špecificky pridané k cukrom (ak také sú) na molekule antagonistu integrínu, ktoré boli aktivované oxidáciou. Napr. polyetylénglykol-hydrazid sa môže pripraviť vo forme relatívne stabilných hydrazónových reťazcov kondenzáciou s aldehydmi a ketónmi. Táto vlastnosť sa využila na modifikáciu proteínov prostredníctvom oxidovaných oligosacharidových reťazcov (pozri Andresz, H. a kol., (1978), Macromol. Chem. 179: 301). Konkrétne pôsobením nitritu na PEG-karboxymetylhydrazid sa pripraví PEG-karboxymetylazid, čo je elektrofilne aktívna skupina reagujúca s aminoskupinami. Táto reakcia sa môže využiť na prípravu polyalkylénglykolom modifikovaných proteínov (pozri patent US 4 101 380 a 4 179 337) .

Na vytvorenie kompozícií obsahujúcich multivalentné antagonisty integrínu al alebo a4 je možné tiež použiť odborníkom známy postup sprostredkovaný tiolovým linkerom (spojkou) na zosietenie proteínov. Konkrétne reaktívne aldehydové skupiny na sacharidových častiach molekuly sa vytvoria pomocou jodistanu sodného, vytvoria sa cystamíncvé konjugáty prostredníctvom týchto aldehydov a indukuje sa zc-sietenie prostredníctvom tiolových

skupín	na	cystamínoch (pozri	Pepinsky,	B. a kol. ,	(1991), J.
Biol.	Chem,	., 266:	18244-18249	a Chen, L	.L. a kol.,	(1991), J.
Biol.	Chem.	., 266:	18237-18243)	. Teda je	tento chemický postup

vhodný tiež na modifikácie polyalkylénglykolovými polymérmi, keď linker je inkorporovaný do sacharidu a polyalkylénglykolový polymér je pripojený k linkeru. Aj keď linkery obsahujúce aminotiol alebo hydrazín umožňujú pripojenie jednej polymérovej skupiny, štruktúra linkera môže byť menená tak, aby bolo možné pripojiť viac polymérov a/alebo bola zmenená priestorová orientácia polyméru vzhladom na molekulu antagonistu integrínu.

V praktickom uskutočnení vynálezu sa výhodne do požadovaných polymérnych systémov inkorporujú polyalkylénglykolové zvyšky alkylpolyalkylénglykolov s alkylovou skupinou obsahujúcou 1 až 4 atómy uhlíka, výhodne polyetylénglykol (PEG), alebo poly(oxy)alkylénglykolové zvyšky z takých glykolov. Takže polymér, ku ktorému je protein pripojený, môže byť homopolymér polyetylénglykolu (PEG) alebo je to polyoxyetylovaný polyol, v každom prípade za predpokladu, že ide o polymér rozpustný vo vode pri teplote miestnosti. K príkladom takých polymérov, ktoré však nie sú obmedzujúce, patria homopolyméry polyalkylénoxidu ako je PEG alebo polypropylénglykoly, polyoxyetylénované glykoly, ich kopolyméry a blokové kopolyméry, za predpokladu, že blokové kopolyméry si uchovávajú rozpustnosť vo vode. K príkladom polyoxyetylovaných polyoiov patrí polyoxyetylovaný glycerol, polyoxyetylovaný sorbitol, polyoxyetylovaná glukóza a pod.. Glycerolová kostra polyoxyetylovaného glycerolu je zhodná s kostrou vyskytujúcou sa v prírode, napr. v mono-, di- a triglyceridoch živočíchov a človeka. Teda takto rozvetvená kostra by nemala byť v tele rozpoznávaná ako cudzorodé činidlo.

Ako alternatíva k polyalkylénoxidom sa môže použiť dextrán, polyvinylpyrolidóny, polyakrylamidy, polyvinylalkoholy, polyméry založené na sacharidoch a ďalšie. Odborníkovi je zrejmé, že skôr uvedené výpočty sú len ilustratívne a že vynález zahŕňa akékoľvek ďalšie polymérne materiály opísaných vlastností.

Polymér nemusí mať nejakú konkrétnu molekulovú hmotnosť, ale je výhodné, keď molekulová hmotnosť leží v rozsahu 300 až 100 000, výhodnejšie 10 000 až 40 000. Najmä veľkosti 20 000 a viac sú výhodné na zabránenie strát proteínov pri filtrácií v obličkách.

Derivatizácia polyalkyléngiykolu má rad výhodných vlastností na formuláciu konjugátov antagonistu integrínu s polymérom podlá vynálezu, ktoré sú spojené s nasledujúcimi vlastnosťami polyal45 kylénglykolových derivátov: majú lepšiu rozpustnosť vo vode, a súčasne nevyvolávajú antigénnu alebo imunogénnu reakciu, vysoký stupeň biologickej kompatibility, absencia biologickej degradácie polyalkylén-glykolových derivátov in vivo a ľahké vylučovanie zo živých organizmov.

Naviac v inom aspekte predloženého vynálezu sa môže použiť antagonista integrínu al alebo a4 kovalentne naviazaný na polymérovú zložku, kde povaha konjugátu je taká, že obsahuje štiepitelné kovalentné chemické väzby. To potom umožňuje riadiť časový priebeh odštiepenia polyméru od antagonistu integrínu. Kovalentná väzba medzi liečivom, to znamená antagonistom integrínu a polymérom sa môže štiepiť chemickou alebo enzymatickou reakciou. Produkt polymér-antagonista integrínu si pritom uchováva prijateľnú hladinu aktivity. Súčasne sú prítomné v konjugovanom polymére časti polyetylénglykolu, ktoré poskytnú produktu polymér-antagonista integrínu vysokú rozpustnosť vo vode a predĺžený čas cirkulácie v krvnom obehu. V dôsledku týchto zlepšených vlastností je možné podľa vynálezu uvažovať pri in vivo aplikáciách o parenterálnom, nazálnom alebo perorálncm podávaní obidvoch druhov aktívnych molekúl polymér-antagonista integrínu, s. po hydrolytickom štiepení je možné očakávať dobrú biologickú dostupnosť antagonistu integrínu samotného.

Odborníkovi je jasné, že tu opísané reäkčné schémy sú len na ilustratívne potreby a nie sú nijako obmedzujúce vzhľadom na reakcie a štruktúry, ktoré sa môžu použiť na modifikácie antagonistov integrínu al alebo a4, aby sa. dosiahla dobrá rozpustnosť, stabilita a afinita k bunkovej membráne pri parenterélnom a perorálnom podávaní. Aktivita a stabilita týchto konjugátov antagonistov integrínu podľa predloženého vynálezu môže do istej miery kolísať, keď sa použijú polyméry s rôznou veľkosťou molekuly. Rozpustnosť konjugátov sa môže meniť v závislosti od podielu a veľkosti polyetylénglykolového fragmentu vloženého do polymérnej kompozície.

III. Využitie vynálezu

Množstvo účinnej látky, ktoré sa kombinuje s nosičovým materiálom do jednotkovej liekovej formy závisí od toho, aký pacient sa má liečiť a aký je zvolený spôsob podávania. Je treba však rozumieť, že konkrétne dávky a liečebný režim určitého pacienta sú závislé od mnohých faktorov, ako je napr. aktivita konkrétnej použitej účinnej látky, vek, hmotnosť, pohlavie a aktuálny stav pacienta, diéta, čas podávania, rýchlosť vylučovania, kombinácia s liečivami, závažnosť liečeného ochorenia a názor ošetrujúceho lekára. Množstvo účinnej látky bude tiež závisieť od profylaktických alebo liečivých prípravkov, ktoré sú podávané súčasne.

Liečenie kompozíciou podía vynálezu spočíva v tom, že sa pacientovi podáva účinné množstvo antagonistu podía vynálezu. Používajú sa také dávky, ktoré predstavujú účinné, netoxické množstvo. Odborník je schopný použitím rutinných postupov určiť optimálne dávky na liečenie konkrétneho ochorenia.

Farmaceutické prípravky

Prípravky obsahujúce antagonistu podlá vynálezu sa podávajú výhodne parenterálne. Termín parenterálne podávanie zahŕňa podávanie subkutánne, intravenózne, intramuskulárne, infra-artikulárne, intrasynoviálne, intrasternálne, intratekálne, intrahepatickou a intrakraniálnou injekciou alebo injekciou priamo do lézie alebo infúzne podávanie. Požadovaná dávka je podaná pacientovi jedenkrát alebo viackrát za deň intravenózne, perorálne, rektálne, parenterálne, intranazálne, topicky alebo inhaláciou. Požadovaná dávka môže byť tiež podaná kontinuálnou intravenóznou infúziou.

Protilátkové homológy sa výhodne podávajú ako sterilné farmaceutické kompozície obsahujúce farmaceutický prijateľný nosič, čo je ktorýkoľvek zo známych nosičov ako je voda, soľný roztok, fosfátom pufrovaný soľný roztok, dextróza, glycerol, etanol a ďalšie, alebo ich kombinácie. Zlúčeniny podía predloženého vy47 nálezu sa môžu použiť vo forme farmaceutický prijateľných soli odvodených z anorganických alebo organických kyselín a zásad. K príkladom takých kyslých solí patrí acetát, adipát, alginát, aspartát, benzoát, benzénsulfonát, bisulfát, butyrát, citrát, kamforát, kamforsulfonát, cyklopentánpropionát, diglukonát, dodecylsulfát, etánsulfonát, fumarát, glukoheptanoát, glycerofosfát, hemisulfát, heptanoát, hexanoát, hydrochlorid, hydrobromid, hydrojodid, 2-hydroxyetánsulfonát, laktát, maleát, metánsulfonát, 2-naftalénsulfonát, nikotinát, oxalát, pamoát, pektinát, persulfát, 3-fenylpropionát, pikrát, pivalát, propionát, sukcinát, tartrát, tiokyanát, tozylát a undekanoát. K zásaditým soliam patria amóniové soli, soli alkalických kovov, ako sú sodné a draselné soli, soli kovov alkalických zemín, ako sú vápenaté a horečnaté soli, soli s organickými zásadami, ako sú napr. dicyklohexylamínové soli, N-metyl-Z?-glukamín, tris (hydroxymetyl)metylamín a soli s aminokyselinami ako je arginín, lyzín atď.. Zásadité skupiny obsahujúce dusík môžu byť kvarterizované činidlami ako sú halogenidy nižších alkylov, ako sú metyl-, etyl-, propyl- a butylchlorid, -bromid a -jodid; dialkylsulfáty ako je dimetyl-, dietyl, dibutyl a diamylsulfát, halogenidy s dlhším reťazcom ako sú decyl-, lauryl-, myristyl- a stearyl chlorid, -bromid a jodid, aralkylhalogenidy ako sú benzyla fenyletylbromid a ďalšie. Získajú sa tak prípravky rozpustné alebo dispergovateľné vo vode alebo v oleji.

Farmaceutické kompozície podlá predloženého vynálezu obsahujú ktorúkoľvek zo zlúčenín podľa vynálezu alebo jej farmaceutický prijateľný derivát, spolu s akýmkoľvek farmaceuticky prijateľným nosičom. Termín nosič v opise vynálezu označuje farmaceutický prijateľné adjuvans a vehikulá. K farmaceutický prijateľným nosičom vhodným na uskutočnenie predloženého vynálezu patria (avšak výpočet nie je obmedzujúci) ionomeniče, oxid hlinitý, stearát hlinitý, lecitín, sérové proteiny, ako je napr. humánny sérový albumín, pufrovacie látky ako sú napr. fosfáty; glycín, kyselina sorbová, sorbát draselný, čiastočné glyceridové zmesi rastlinných nasýtených mastných kyselín, vody, solí alebo elektrolytov ako je napr. protamínsulfát, hydrogénfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan draselný, chlorid sodný, zinočnaté soli, koloidný oxid kremičitý, kremičitan horečnatý, polyvinylpyrolidón, látky založené na celulóze, polyetylénglykol, sodná sol karboxymetylcelulózy, polyakryláty, vosky, blokové polyméry, polyetylénpolyoxypropylén, polyetylénglykol a tuk z ovčej vlny.

Farmaceutické kompozície podľa predloženého vynálezu môžu byť tiež vo forme sterilných injekčných prípravkov, ako je napr. sterilná injikovateľná vodná alebo olejová suspenzia. Taká suspenzia sa formuluje odborníkovi známym postupom za pomoci vhodných dispergujúcich, zvlhčovacích alebo suspendujúcich činidiel. Sterilné injikovateľné prípravky môžu byť tiež sterilné injikovatelné roztoky alebo suspenzie v netoxickom parenterálne prijateľnom rozpúšťadle alebo riedidle, ako je napr. roztok v 1,3-butándiole. K vhodným farmaceutický prijateľným vehikulom a rozpúšťadlám, ktoré sa môžu použiť, patrí voda, Rinaerov roztok a izotonický roztok chloridu sodného. Okrem toho sterilné, stále oleje sú používané ako obvykle, ako rozpúšťadlá alebo suspendačné médiá. Na tento účel sa môže použiť akýkoľvek nedráždivý stály olej, vrátane syntetických mono- alebo diglyceridov. Mastné kyseliny, ako je kyselina olejová a jej glyceridové deriváty sú užitočné na prípravu injikovatelných prípravkov, rovnako tak ako prírodné farmaceutický prijateľné oleje, ako je olivový olej, ricínový olej, zvlášť ich polyoxyetylované verzie.

Farmaceutické kompozície podľa vynálezu sa môžu podávať perorálne. Ak sa podávajú perorálne, môžu sa podávať v každej perorálne prijateľnej dávkovej forme, vrátane (výpočet nie je limitujúci) toboliek, tabliet, vodných suspenzií alebo roztokov. V prípade tabliet na perorálne použitie obvykle používané nosiče zahŕňajú laktózu a kukuričný škrob. Sú tiež typicky pridávané lubrikanty, ako napríklad stearát horečnatý. Na perorálne podávanie vo forme toboliek zahŕňajú použiteľné riedidlá laktózu a usušený kukuričný škrob. Keď je na perorálne použitie vyžadovaná vodná suspenzia, aktívna zložka je spojená s emulgátormi a suspendujúcimi činidlami. Ak je žiaduce, môžu sa tiež pridať určité sladidlá, príchute alebo farbivá.

Zvláštne kompozície podľa vynálezu sú kompozície, keď antagonista podľa vynálezu je formulovaný do vezikulov ako sú napr. kompozície obsahujúce lipozómy. Lipozómy sú vezikuly (mechúriky) vytvorené amfipatickými molekulami ako sú napr. polárne lipidy, napr. fosfatidylcholíny, etanolamíny a seríny, sfingomyelíny, kardiolipíny, plazmalogény, fosfatidové kyseliny a cerebrozidy. Lipozómy sa vytvoria, keď sa vhodné amfipatické molekuly nechajú napučiavať vo vode alebo vodnom roztoku, aby vytvorili tekuté kryštály s obvykle viacvrstvovou štruktúrou obsahujúcou niekoľko dvojvrstiev vzájomne separovaných vodou (označované ako surové lipozómy). Iným známym typom sú lipozómy tvorené jedinou dvcjvrstvou obaľujúcou vodnú fázu, ktoré sa nazývajú jednovrstvové vezikuly. Ak je vo vodnej fáze v priebehu napučiavania lipidov prítomný vo vode rozpustný materiál, je zachytený vo vodnej vrstve medzi lipidovými dvoj vrstvami.

Zvlášť vhodnou metódou na formuláciu antagonistov podlá vynálezu do lipozómcvých prípravkov je metóda opísaná v európskom patente EP-A-253 619, ktorý je zahrnutý formou odkazu. Pri tejto metóde sa lipozómy s jedinou dvojvrstvou obaľujúcou účinnú látku pripravia tým, že sa lipidová zložka rozpustí v organickom médiu, a organický roztok lipidovej zložky sa pod tlakom vstrekuje do vodnej zložky za súčasného premiešavania organickej a vodnej zložky vysokorýchlostným homogenizátorom alebo iným miešacím zariadením, pričom sa spontánne vytvárajú lipozómy. Lipozómy s jednou dvojvrstvovou obaľujúcou účinnou zložkou sa môžu použiť na topickú aplikáciu buď priamo alebo vo vhodnom farmaceutický prijateľnom nosiči. Viskozita lipozómov sa môže zvýšiť pridaním jedného alebo viacerých zahusťovacích činidiel, ako je napr. xantáncvá guma, hydroxypropylcelulóza, hydroxypropylmetylcelulóza alebo ich zmesi.

Vodná zložka je buď samotná voda, alebo môže obsahovať elektrolyty, pufrovacie systémy a ďalšie zložky ako napr. konzervačné látky. K vhodným elektrolytom patria soli kovov, ako napr. soli alkalických kovov alebo soli kovov alkalických zemín. Výhodné soli sú chlorid vápenatý, chlorid sodný a chlorid draselný. Koncentrácia elektrolytov môže byť rôzna, od 0 do 260 mM, výhodne 5 mM až 160 mM. Vodná zložka je umiestnená do vhodnej nádoby, ktorá umožňuje uskutočňovať homogenizáciu, ktorá sa realizuje silnou turbulenciou, v priebehu vstrekovania organickej zložky. Homogenizácia dvoch zložiek sa uskutočňuje v nádobe, alternatívne sa vodná a organická zložka vstrekujú oddelene do miešacieho zariadenia, ktoré je umiestnené mimo nádoby. V takom prípade sa lipozómy tvoria v tomto miešacom zariadení a v nádobe sa len zhromažďujú.

Organickú zložku tvorí vhodné netoxické farmaceutický prijateľné rozpúšťadlo ako je napr. etanol, glycerol, propylénglykol a polyetylénglykol, a vhodný fosfolipid, ktorý je rozpustný v rozpúšťadle. K vhodným fosfolipidom patrí napr. lecitín, fosfatidylcholín, fosfatidylserín, fosfatidyletanolamín, fosfatidylinositol, lyzofosfatidylcholín a fosfatidylglycerol. Ďalšie lipofilné prísady sa môžu použiť na selektívnu modifikáciu vlastností lipozómov. K príkladom takých prísad patrí napr. stearylamín, kyselina fosfatidová, tokoferol, cholesterol a lanolínové extrakty.

Naviac sa do organickej zložky môžu pridávať ďalšie prísady, napr. zabraňujúce oxidácii fosfolipidov. K takým prísadám patrí napr. tokoferol, butylovaný hydroxyanizol, butylovaný hydroxytoluén, askorbylpalmitát a askorbyloleát. Tiež sa môžu pridať konzervačné činidlá ako kyselina benzoová, metylparabén alebo propylparabén .

Okrem opísaných kompozícií sa pre vynález môžu využiť aj obväzové formy, ako napr. náplaste, ovínadlá, obväzy, gázové vankúšiky a pod., obsahujúce vhodné množstvo liečiva, to znamená anti-VLA protilátky. V niektorých prípadoch sa môžu použiť náplaste, ovínadlá, obväzy, gázové vankúšiky a pod., ktoré sa impregnovali topickým prípravkom obsahujúcim liečivý prípravok.

Farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu sa môžu tiež podávať ako nazálny aerosól alebo inhalovaním s použitím nebulizéra, inhalátora suchého prášku alebo inhalátora s odmeranými dávkami. Také kompozície sa pripravujú postupmi dobre známymi v odbore formulácie farmaceutických prípravkov a môžu sa pripraviť obvykle ako roztoky vo fyziologickom roztoku, s využitím benzylalkoholu alebo ďalších vhodných konzervačných prostriedkov, činidiel podporujúcich absorpciu na zvýšenie biologickej dostupnosti prípravku, fluorovaných uhľovodíkov a/alebo ďalších obvyklých solubilizačných alebo dispergujúcich činidiel.

V iných uskutočneniach kompozície obsahujúce zlúčeninu podlá vynálezu môžu ďalej obsahovať ďalšie činidlo vybrané zo skupiny zahŕňajúcej kortikosteroidy, protizápalové činidlá, imunosupresíva, antimetabolity a imunomodulátory. Špecifické zlúčeniny v každej z týchto skupín môžu byť vybrané z akýchkoľvek zlúčenín uvedených v príslušnej skupine v publikácii Comprehensive Medicinal Chemistry (Pergamon Press, Oxford, England, ss. 970-986, 1990), pričom tento opis uvedených látok je zahrnutý formou odkazu. Patria sem také zlúčeniny, ako napríklad teofylín, sulfasalazín, a aminosalicyláty (protizápalové látky); cyklosporín, FK-506 a rapamycín (imunosupresíva); cykiofosfamid a metotrexát (antimetabolity); steroidy (inhalačné, perorálne alebo topické) a interferóny (imunomodulátory).

Dávkovanie zlúčenín podlá vynálezu a liečebný režim potrebné na dosiahnutie požadovaného liečebného účinku závisia od celého radu faktorov, ako je napr. povaha použitej zlúčeniny, vek, telesná hmotnosť, pohlavie a všeobecný zdravotný stav pacienta, diéta, čas podávania, rýchlosti vylučovania, vážnosť konkrétneho liečeného ochorenia, požadovaný liečebný ciel a úsudok ošetrujúceho lekára.

Použiteľná hladina dávok aktívnej zložky je v rozsahu asi

0,001 a asi 100 mg/kg telesnej hmotnosti denne, výhodne v rozsahu asi 0,1 a asi 50 mg/kg telesnej hmotnosti denne. Najvýhodnejšie, VLA-4 viažuce činidlo, keď ide o protilátku alebo jej derivát, je podávané v dávke 0,1 mg/kg telesnej hmotnosti/deň až 20 mg/kg telesnej hmotnosti/deň, výhodne 0,1 mg/kg až 10 mg/kg telesnej hmotnosti/deň v režime jedenkrát za 1 až 14 dní. V prípade malých molekúl alebo väzbových činidiel iných ako protilátok sú ekvivalentami dávok určených pre protilátková kompozícia podávaná v množstve, ktoré poskytuje účinnú hladinu protilátky v plazme aspoň 1 mg/ml. Optimalizáciu dávok je možné určiť na základe podávania väzbového činidla a následného vyhodnotenie potiahnutia buniek pozitívnych na integrín činidlom v priebehu času po podaní danej dávky in vivo.

vhodné dávky molárnymi protilátky. Výhodne je

Prítomnosť podávaného agensu môže byť detegovaná in vitro (alebo tiež ex vivo) pomocou neschopnosti alebo zníženej schopnosti buniek pacienta viazať rovnaké činidlo, ktoré bolo samé označené (napr. fluorochrómom). Výhodné dávkovanie by malo viesť k detegovatelnému potiahnutiu prevažnej väčšiny buniek pozitívnych na integrín. Výhodne by toto potiahnutie buniek malo pretrvávať v prípade protilátkového homológa počas 1 až 14 dní.

Odborník môže ľahko testovať antagonistu podľa vynálezu, či má požadovaný účinok. Odborník na to použije napr. štandardné testy na vyhodnotenie klinického zotavovania (napr. výplach a použitie FACS skenovania na väzbu protilátok, zlepšenie nútenej vitálnej pľúcnej kapacity). Tak napr. bunky obsiahnuté vo vzorke pacientovho pľúcneho tkaniva sa môžu testovať na prítomnosť agensu in vitro (alebo ex vivo) použitím druhého činidla na detekciu podávaného agensu. Môže to byť napr. fluorochrómom značená protilátka špecifická k podávanému agensu, ktorá sa potom meria štandardnou FACS analýzou (triedenie fluorescenciou aktivovaných buniek). Alternatívne prítomnosť podávaného agensu môže byť detegovaná in vitro (alebo tiež ex vivo) pomocou neschopnosti alebo zníženej schopnosti buniek pacienta viazať rovnaké činidlo, (napr. fluorochrómom). Výhodné k detegovateľnému potiahnutiu pozitívnych na integrín. Výhodne by pretrvávať v prípade protilátkového ktoré bolo samotné označené dávkovanie by malo viesť prevažnej väčšiny buniek toto potiahnutie buniek malo homológa počas 1 až 14 dní.

Nasledujúce príklady vynálezu a v žiadnom prípade slúžia na ilustráciu ho nijako neobmedzujú.

predloženého

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Zvieracie modely pľúcnej fibrózy

Existuje mnoho dôkazov účasti zápalových buniek a mediátorov v pulmonálnej fibróze na modeli hlodavcov s bleomycínom (BL) . Tento model fibrózy je príťažlivý najmä preto, že vytvára charakteristický obraz fibrózy s mnohými zložkami ako u humánnej fibrózy, a tiež preto, že BL-indukovaná pulmonálna fibróza je dobre známym nežiaducim účinkom v humánnej chemoterapii. Intratracheálna (IT) instilácia (nakvapkanie) BL u hlodavcov sa často používa na výskum mechanizmov fibrogenézy a na skríning potenciálnych antifibrotických zlúčenín. Aj keď pôvodnou príčinou BL-indukovanej pľúcnej toxicity je vytváranie kyslíkových radikálov (ROS), akonáhle sa naviažu na železo a DNA, proces vedúci k výslednej manifestácii pulmonálnej fibrózy zahŕňa uvoľnenie rôznych zápalových mediátorov (Girl a Wang., Comments Toxicol., 3: 145-176 (1989)). Patogenéza BL-indukovaného poškodenia pľúc začína edémom, hemorágiou a bunkovým infiltrátom s prevládajúcimi neutrofilmi a makrofágmi. Nadmerná akumulácia zápalových leukocytov v cievnych, intersticiálnych a alveolárnych priestoroch pľúc potom spôsobuje poškodenie ciev a parenchýmu tvorbou ROS a proteolytických enzýmov. Neutrofily obsahujú značné množstvá myeloperoxidázy (MPO), ktorá oxiduje Cl na kyselinu chlórnu (HOCI) v reakcii s ^0? a je známe, že práve HOCI pochádzajúca z neutrofilov spôsobuje bunkovú toxicitu. ROS pochádzajúce z makrofágov a neutrofilov sú schopné stimulovať produkciu prozápalových fibrogénnych cytokínov, ktoré sprostredkovávajú zosilnenú fibroproliferatívnu reakciu (Phan a Kunkel., Exp. Lung Res., 18: 29-43 (1992)). Okrem rozsiahlej infiltrácie zápalových buniek je fibrotický proces ďalej charakterizovaný hyperproliferatívnou reakciou aktivovaných fibroblastov. Fibroblastom podobné bunky sú primárne zodpovedné za absolútne zvýšenie obsahu kolagénu v pľúcach a abnormality v ultraštruktúre a priestorovej distribúcii rôznych typov kolagénu.

Príklad 2

Inhibícia fibrózy použitím antagonistu integrínu obsahujúceho podjednotku a4

Materiály a metódy

V tomto experimente sa použila nešpecifická kontrolná protilátka (1E6) a protilátka proti integrínu obsahujúcemu podjednotku ct4 (PS2). 1E6 je myšia anti-humánna LFA3 (doména 1) monoklonálna IgGl protilátka (pozri Miiler, Hochman, Meier, Tizard, Bixler, Rosa, and Wallner (1992) J. Exp. Med. 178: 211-222. PS/2 sa pripravila metódou podľa Miyake a koľ., J. Exp. Med., 173: 599-607 (1991)).

Samci myší C573L/6 bez chronického respiračného ochorenia s hmotnosťou 25 až 30 g sa zakúpili od firmy Charles River Laboratory. Sulfát biecmycínu (predávaný pod chráneným označením Blenoxane) bol dar od firmy Bristol Laboratories (Syracuse, NY). L- [3,4-3H] prolín slúžiaci na označenie prokolagénového substrátu prolylhydroxylázy sa získal od firmy NEN Life Science Products (Boston, MA). Z-fix, pufrovaný vodný roztok zinkformalínu sa získal od firmy Anazech, LTD (Battle Creek, MI). Všetky ostatné reagencie boli v štandardnej čistote chemických reagencií alebo lepšie a získali sa zo štandardných komerčných zdrojov.

Ošetrovanie experimentálnych zvierat

Myši sa umiestnili v klietkach po 4 zvieratách a zaobchádzalo sa s nimi v súlade s príslušnými pokynmi (NIEI Guidelines for Animal Welfare). Myši sa pred ošetrením nechali 1 týždeň, aby sa aklimatizovali. Udržiaval sa cyklus 12 hodín svetlo/12 hodín tma a zvieratá mali neobmedzený prístup k vode aj k potrave (Rodent Laboratory Chow). Zvieratá sa náhodne rozdelili do 4 experimentálnych skupín: 1) SA + SA; 2) BL + IE6; 3) BL + SA; a 4) BL + +PS2. Myši sa intratracheálne (IT) injikovali jednou dávkou fyziologického roztoku alebo BL dávkou 0,08 jednotiek/100 μΙ/myš pri anestézii xylazínom a ketamínom. Po IT instilácii myši dostali IP injekciu IE6, SA alebo PS2 (100 μρ/0,2 ml/myš) trikrát týždenne. Dvadsať dní po IT instilácii BL sa myši utratili v anestézii pentobarbitálom a tekutina z bronchoalveolárneho výplachu (BALF) sa podrobila biochemickej a histopatologickej analýze.

Príprava BALF a piúcneho tkaniva

Po anestézii sa otvorila brušná dutina a potom sa uskutočnila exsangvinácia zostupnej abdominálnej aorty. Pľúca sa pripravili na výplach kanyláciou trachey tupou ihlou nasadenou na injekčnú striekačku. Pľúcny výplach sa uskutočnil 3 ml chladného izotonického roztoku soli, podaného v 1 ml alikvotoch. Alikvot BALF sa rozdelil na odpočet celkového počtu buniek. Zostávajúca BALF sa centri fugovala pri 1500 g počas 20 minút v 4°C, a výsledný supernatant sa rozdelil na alikvóty a uložil do -70°C. Po výplachu sa pľúcne laloky rýchlo zbavili neparenchymatického tkaniva a okamžite zmrazili v tekutom dusíku a uložili do -70°C.

Neskôr sa zamrazené pľúca roztopili a homogenizovali v 0,1 M

KC1, 0,02 M Tris (pH 7,6) v homogenizátori Polytron (Brinkmann

Instruments Inc., Westbury, NY). Homogenát sa dôkladne premiešal opakovaným obrátením a výsledné objemy homogenátu (4-5 ml) sa zaznamenali. Homogenát sa rozdelil na niekolko alikvotov a uložil do -70°C na neskoršie biochemické analýzy.

Stanovenie obsahu malóndialdehydových ekvivalentov a hydroxyprolínu v pľúcach

Malóndialdehydové ekvivalenty v pľúcach sa stanovili z celkového množstva produktov reagujúcich s tiobarbiturovou kyselinou v nefrakcionovanom homogenáte postupom podľa Ohkawa a kol., Anál. Biochem., 95: 351 (1979). Pre test hydroxyprolínu v pľúcach sa 1 ml homogenátu precipitoval s 0,25 ml ladovo vychladenej 50% (hmotn./objem) trichlóroctovej kyseliny, centrifugoval a precipitát sa hydrolyzoval v 2 ml 6 N HCI počas 18 hodín v 110°C. Obsah hydroxyprolínu sa potom meral postupom podľa Woessner, J.F., Árch. Biochem. Biophys., 93: 440 (1961).

Stanovenie aktivít prolylhydroxylázy (EC 1.14.11.2)

Príprava substrátu (prokolagén) prolylhydroxylázy a spôsob testovania prolylhydroxylázy sú opísané v Giri, S.N. a kol., Exp. Mol. Pathol. 39: 317 (1983). Stručne zhrnuté, čerstvo vybrané tíbie z 10 dňových kuracích embryí sa značili [3H]prolínom v kultivačnom médiu bez prolínu pri 37°C počas 6 hodín. Po odstránení neinkorporovanej značky opláchnutím sa tkanivo homogenizovalo a centrifugovalo pri 3000 g počas 20 minút v 4°C. Výsledný supernatant sa extenzívne dialyzoval, aby sa odstránila neinkorporovaná značka. Značený prokolagénový substrát sa rozdelil na alikvoty a uložil v -70°C. Inkubačná zmes pre enzýmový test v celkovom objeme 2 ml obsahovala síran železnatoamónny (0,1 mmol/1), α-ketoglutarovú kyselinu (0,1 mmol/1), [3H]prolín-prokolagén (200 000 dpm), homogenát pľúcneho tkaniva (0,2 ml), kyselinu askorbovú (0,5 mmol/1), a TRIS-HC1 pufor (0,1 mol/1, pH 7,8). Reakcia sa zastavila pridaním 0,2 ml 50% trichlóroctovej kyseliny po 30 minútach v 37°C v metabolickej trepačke podľa Dubnoffa. V priebehu reakcie sa uvoľňovala tríciovaná voda v stechiometrickom pomere k prolylhydroxylácii a použila sa ako meradlo enzymatickej aktivity. Tríciovaná voda v reakčnom systéme sa separovala vákuovou destiláciou celej reakčnej zmesi a odmerala sa jej rádioaktivita. Enzymatické aktivita sa vyjadrila v dpm tríciovanej vody uvoľnenej z celkového objemu pľúc za 30 minút.

Stanovenie počtov buniek v BALF

Celkový počet buniek v BALF sa stanovil postupom, ktorý opísali Wang, Q. a kol., Lab. Invest., 67: 234-242 (1992). Celkový počet leukocytov v BALF sa určil pomocou počítača Coulter (Model F, Coulter Electronics; Inc., Hialeah, FL) podľa inštrukcií výrobcu.

Test na proteín v BALF

Obsah proteínu v BALF supernatante sa určil použitím proteínového testu Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) , pričom ako štandard sa použil hovädzí sérový albumín.

Histopatologická a imunohistochemická analýza

Tri až štyri zvieratá z každej skupiny sa náhodne vybrali na histopatoiogické a imunohistochemické vyšetrenie na konci experimentu. Otvorila sa im brušná dutina a potom sa uskutočnila exsangvinácia zostupnej abdominálnej aorty. Ihneď potom sa pľúca pripravili na histologickú analýzu podía Wang a kol. (pozri už uvedenú publikáciu). Po kanylácii trachey tupou ihlou sa otvorila pľúcna dutina a pľúca so srdcom sa vybrali en bloc. Pľúca sa fixovali roztokom Z-fix tracheou pri tlaku 30 cm H₂O. Pravý kraniálny a kaudálny lalok a ľavý lalok pľúc sa neskôr blokovali, zaliali do parafínu a narezali na 7 pm rezy a zafarbili hematoxylínom a eozínom. Na imunohistochemické farbenie na aSMA, sa rezy pľúcneho tkaniva deparafinovali a blokovala sa endogénna peroxidáza. Rezy určené na farbenie sa potom ošetrili blokujúcim kozím sérom počas 30 minút a inkubovali 16 hodín primárnou monoklonálnou anti-aSMA protilátkou (Sigma Chemical Co., St Louis, MO).

Štatistická analýza dát

Dáta sa vyjadrili v prepočte na celé pľúca a sú uvedené ako priemerné hodnoty ± stredná chyba (SE). Dáta zo štyroch skupín zvierat sa porovnali použitím dvojfaktorovej analýzy rozdielu (SIGMASTAT) metódou podľa Student-Newman-Keulse. Hodnota P < 0,05 sa považovala za štatisticky významnú.

Výsledky

Peroxidácia lipidov v pľúcach myší

Obsah malóndialdehydových ekvivalentov v pľúcach bol ako index peroxidácie lipidov testovaný u rôznych skupín myší. BL instilácia významne zvýšila obsah malóndialdehydových ekvivalentov v pľúcach myší ako v skupine BL+IE6 tak aj BL+SA na rozdiel od skupín SA+SA a BL+PS2 (dáta neuvedené). Ošetrenie PS2 účinne blokovalo BL-indukovanú peroxidáciu lipidov, pretože hladina malóndialdehydových ekvivalentov v pľúcach u skupiny BL+PS2 nebola odlišná od skupiny SA+SA.

Obsah hydroxyprolínu v pľúcach myší

Obsah hydroxyprolínu v pľúcach, kľúčový index hladiny kolagénu v pľúcach sa stanovil pre 4 skupiny myší. IT instilácia BL významne zvýšila hladinu hydroxyprolínu v pľúcach v skupine BL+IE6 a BL+SA na 185% a 205% kontrolnej skupiny SA+SA, v uvedenom poradí. BL indukované zvýšenie hydroxyprolínu v pľúcach u skupiny BL+PS2 sa významne znížilo o 35% podávaním PS2 v porovnaní so skupinou BL+SA. Hladina hydroxyprolínu v pľúcach skupiny BL+TR nebola významne vyššia ako kontrolná skupina IT SA (SA+SA).

Aktivita prolylhydroxylázy v pľúcach myší

Aktivita prolylhydroxylázy v pľúcach myší rôznych skupín ukazuje, že BL samotný významne zvyšuje aktivitu prolylhydroxyiázy v skupine BL+SA na 207% kontrolnej skupiny SA+SA. PS2 významne znížila zvýšenie prolylhydroxylázovej aktivity vyvolanej podaním BL u skupiny BL+SA.

Celkový počet buniek v BALF

Celkové počty buniek v BALF u rôznych skupín myší, 21 dní po IT instilácii soľného roztoku alebo BL ukázali, že podanie BL zvýšilo celkové počty buniek v BALF skupín BL+IE6 a BL+SA v porovnaní s kontrolnou skupinou (SA+SA), aj keď len skupina BL+IE6 mala počty štatisticky významne vyššie ako skupina SA+SA. Počet buniek v BALF v skupine BL+PS2 sa nelíšil od skupiny SA+SA.

Obsah proteínov v BALF

Obsah proteínov v supernatante BALF meraný u 4 experimentálnych skupín myší odhalil, že IT instilácia BL štatisticky významne zvýšila obsah proteínov v BALF u všetkých ošetrených skupín v porovnaní s kontrolnou skupinou SA+SA. Avšak podanie PS2 v skupine BL+PS2 znížilo BL-indukované zvýšenie proteínu v supernatante BALF, aj keď tento rozdiel nebol štatisticky významný.

Histopatológia pľúc myší

Histologické vyšetrenie myších pľúc ukázalo normálne pľúcne parenchymatické tkanivo u skupiny SA+SA. Avšak pľúca myší zo skupín BL+ΙΕβ a BL+SA prejavovali difúznu alveolitídu a multifokálnu intersticiálnu fibrózu obsahujúcu akumulovanú extracelulárnu fibróznu hmotu. Pľúca myší z týchto skupín mali zosilnené interalveolárne steny a zápalové bunky v susedných vzdušných priestoroch. V porovnaní so skupinami BL+IE6 a BL+SA, pľúca myší skupiny BL+PS2 mali oveľa menej fibrotických lézii, aj keď nie60 ktoré laloky vykazovali mierny stupeň intersticiálnej fibrózy.

Imunohistochemické farbenie na aSMA v pľúcach myši

Na stanovenie akumulácie fibroblastov a fibroblastom podobných buniek u myší po ošetrení sa skúmala expresia aSMA v pľúcnom tkanive použitím monoklonálnej protilátky proti aSMA. V pľúcach kontrolných zvierat sa imunopozitivita objavila vo vrstvách vaskulárneho a bronchiálneho hladkého svalstva. V pľúcach ošetrených BL a kontrolnou protilátkou alebo solným roztokom boli extenzívne a intenzívne imunopozitívne oblasti vo fibrotických oblastiach, ako v interstíciu, tak aj v pohrudnici. Avšak pľúca ošetrené BL a PS2 javili výrazne znížené imunofarbenie aSMA, v porovnaní so skupinami BL+IE6 a BL+SA.

Diskusia

IPF je invalidizujúce ochorenie a zle odpovedá na súčasnú terapiu. V predloženej štúdii sú poskytnuté dôkazy, že integrín obsahujúci podjednotku a4 je ďalším možným cieľom v terapii IPF. Všeobecne sa predpokladá, že leukocyty v pľúcach sa podieľajú na rozvoji pulmonálnej fibrózy tým, že secernujú ROS, fibrogénne cytokíny a rastové faktory. Prenos a stav aktivácie leukocytov sú modulované rôznymi povrchovými proteínmi ako sú napr. integríny. Je jasné, že interakcie bunka-bunka a tiež interakcie bunka-ECM sú kritické pre patogenézu pulmonálnej fibrózy. Konzistentným nálezom u pacientov s aktívnou pulmonálnou fibrózou a u zvieracích modelov fibrotických pľúcnych ochorení je akumulácia zvýšeného počtu imunitných a zápalových buniek v oblastiach s prebiehajúcou fibrózou.

VLA-4 je exprimovaný na všetkých cirkulujúcich leukocytoch a viaže sa na adhezívnu molekulu vaskulárnych buniek (VCAM-1), čo je člen génovej superrodiny Ig exprimovaný na endotelových bunkách aktivovaných cytokínom, a na matrixový proteín fibronektín. α4β7 je exprimovaný na podmnožine T a B lymfocytov, zabijačských lymfocytoch (natural kilier) a eozinofiioch. Viaže sa na adrezín vaskulárnej mukózy (MAdCAM-1), čo je člen rodiny adhezívnych molekúl podobných mucínu, a tiež na VCAM-1 a fibronektín. Štúdie in vitro ukázali, že interakcia VLA-4 s VCAM-1 sa podieľa na adherencii mononukleárnych leukocytov a eozinofilov k endotelu a na transendotelovej migrácii, a že α4β7 sa primárne podieľa na regrutovaní leukocytov do lymfoidného tkaniva spojeného s črevom.

V predloženej štúdii liečebné podávanie PS2 viedlo k zníženiu BL-indukovaného zvýšenia celkových leukocytov v BALF. Zníženie leukocytov v pľúcach myší skupiny BL+PS2 by mohlo byť zodpovedné za zmenšenie zápalového poškodenia a fibrózy pľúc u myší po podaní BL. BL-indukované poškodenie pľúc sa významne znížilo po podaní PS2, ako ukazujú výsledky merania peroxidácie lipidov v pľúcach. Zvýšenie kolagénu v pľúcach sa spojilo so zvýšením počtu fibroblastov v interstíciu a samotných alveolárnych priestoroch. Mnohé z týchto buniek podobných fibroblastom sú myofibroblasty, ktoré majú odlišný fenotyp, ku ktorému patrí expresia aSMA, kontraktilného proteínu, ktorý sa vyskytuje normálne v bunkách hladkého svalstva a je zrejme významný pre fibrogenézu a hojenie rán.

Významným zistením tejto štúdie je tiež to, že podávanie PS2 zoslabilo BL-indukovanú proliferáciu myofibroblastov. Bez ohľadu na konkrétnu teóriu, podávanie protilátky proti α-integrínu znižuje hladinu rastových faktorov v pľúcach, ktoré sú uvoľňované infiltrujúcimi leukocytmi alebo priamo ovplyvňuje chovanie myofibroblastov. V každom prípade redukovaná proliferácia myofibroblastov viedla k zníženiu akumulácie kolagénu v pľúcach u zvierat indukovaných podaním BL v skupine BL+PS2.

Príklad 3

Inhibícia fibrózy podávaním antagonistu integrínu obsahujúceho podjednotku al

Ošetrovanie zvierat

Samci myší C57/BL6 s hmotnosťou 28 až 30 g sa umiestnili po 4 zvieratách v plastových klietkach v zariadení schválenom pre tento ciel príslušnými úradmi (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Čare). Myši sa pred ošetrením nechali 1 týždeň, aby sa aklimatizovali. Udržiaval sa cyklus 12 hodín svetlo/12 hodín tma a zvieratá mali neobmedzený prístup k vode aj k potrave (Rodent Laboratory Chow 5001, Purina Mills, Inc., St. Louis, MO). V miestnosti s klietkami bol filtrovaný vzduch a svetelný režim 12 hodín svetlo/12 hodín tma. Zvieratá sa náhodne rozdelili do 4 experimentálnych skupín:

Skupina	Ošetrenie
A	Soľný roztok + pufrovaný soľný roztok
B	Soľný roztok + kontrolná protilátka IgG
C	Bleomycín + kontrolná protilátka IgG
D	Bleomycín + protilátka anti-aipi-integrín

Sulfát bleomycínu sa rozpustil v apyrogénnom sterilnom izotonickom soľnom roztoku tesne pred intratracheálnou (IT) instiláciou. Myšiam z príslušných skupín sa pri anestézii metoxyfluránom podalo intratracheálne buď 100 μΐ sterilného izotonického roztoku alebo 0,08 bleomycínu v 100 μΐ roztoku. Protilátky (4 mg/kg) sa podávali intraperitoneálnou injekciou myšiam z príslušných skupín trikrát týždenne v priebehu 21 dní po instilácii. Potom sa zvieratá všetkých skupín utratili predávkovaním pentobarbitalu sodného (100 až 125 mg/kg i.p.) a pľúca sa spracovali na bronchoalveolárny výplach a biochemické a histopatologické štúdie.

Stanovenie celkového počtu buniek a hladiny proteínu v tekutine z bronchoalveolárneho výplachu

Po kanylácii trachey sa pľúca vypláchli 5 ml izotonického roztoku soli, podaného v piatich 1 ml alikvotoch. Roztok sa aplikoval injekčnou striekačkou kanylou, pritom sa jemne masírovala hrudná stena a tekutina sa odsala. Odsatá tekutina sa centrifugovala pri 1500 g počas 20 minút v 4°C a resuspendovala v izotonickom soľnom roztoku. Obsah proteínu vo vzorke tekutiny z bronchoalveolárneho výplachu sa určil metódou podľa Lowry a kol., J. Biol. Chem. 1193: 265-275 (1951), pričom ako štandard sa použil hovädzí sérový albumín. Celkový počet leukocytov v suspenzii sa stanovil pomocou počítača Coulter (Model F, Coulter Electronics; Inc., Hialeah, FL) .

Stanovenie hydroxyprolínu

Pľúca zvierat použité na biochemické štúdie sa perfundovali in situ cez pravú komoru ľadovo chladným izotonickým soľným roztokom, aby sa odstránila krv z pľúcnych ciev otvorom v ľavom srdcovom ušku. Pľúcne laloky sa potom rýchlo zbavili neparenchymatického tkaniva a okamžite sa zmrazili v tekutom dusíku a uložili do -80°C. Neskôr sa zamrazené pľúca roztopili a homogenizovali v 0,1 M KC1, 0,02 M Tris (pH 7,6) v homogenizátore Polytron. Obsah hydroxyprolínu v homogenáte z pľúc ako meradlo obsahu kolagénu sa kvantifi koval metódou podľa Woessner, Árch. Biochem. Biophys. 93: 440-447 (1961).

Histopatologická štúdia

Po výplachu pľúc sa otvorila hrudná dutina a pľúca sa en bloc spolu so srdcom vybrali. Pľúca sa perfundovali fixážou 1% glutaraldehyd-paraformaldehyd v 0,12 M kakodylátovom pufri so 400 m Osm pri tlaku 30 cm H₂O. Pľúca sa fixovali za tohto tlaku 2 hodiny a potom uložili v tejto- fixáži s uzatvorenou tracheou. Pred zaliatím sa pľúca oddelili od srdca a akékoľvek iné ako pľúcne tkanivo sa odstránilo tupou preparáciou. Tkanivové bločky sa odrezali aspoň v dvoch sagitálnych rezoch (2 až 3 mm hrubých) z pravého kraniálneho, pravého kaudálneho a ľavého pľúcneho laloka z každého zvieraťa. Každý bločok mal čelnú plochu asi 1 cm². Bločky sa dehydratovali v etanolovom rade a potom zaliali do parafínu. Z parafínových bločkov sa potom pripravili rezy (s hrúbkou 5 μπι) a zafarbili hematoxylínom a eozínom na histologické vyšetrenie.

Analýza dát a ich interpretácia

Dáta sa analyzovali v podobe priemerných hodnôt so smerodajnou odchýlkou a strednou chybou priemeru. Na posúdenie štatistickej významnosti rozdielov medzi skupinami sa použil Študentov t-test, rozloženie chi-kvadrát, korelačný koeficient, analýza rozdielu (ANOVA) a viacrozmerné testy v počítačovom štatistickom softvéri SAS/STAT (SAS/STAT Guide, 6^ch Ed. Čary, N.C. pp. 183-260 (1985)) .

Výsledky

V tejto štúdii sa testovala hypotéza, že neutralizačné protilátky k integrínu αϊβΐ (antiaipi) redukujú bleomycínom indukovanú (BL-indukovanú) pľúcnu fibrózu in vivo. Samcom C57/BL6 myší sa intratracheálne (IT) injikoval soľný roztok (SA) alebo BL v dávke 0,08 U/0,1 ml a potom nasledovala intraperitoneálna (IP) injekcia protilátky (100 μρ v 0,2 ml) trikrát týždenne. 21 dní po IT instilácii sa myši utratili a vykonal sa bronchoalveolárny výplach (BAL) a biochemické a histopatologické analýzy.

Histopatologické vyšetrenie pľúc

Očakávalo sa, že u myší po podaní soľného roztoku alebo kontrolnej protilátky IgG nebudú zrejmé žiadne lézie a interalveolárne steny budú normálneho vzhľadu. Naproti tomu po podaní bleomycínu a kontrolného IgG budú mať lézie rôzneho druhu od multifokálnej lokalizácie v proximálnom laloku až po difúznu distribúciu, ku ktorej dochádza niekedy v pohrudnici. Podlá očakávania pľúca myši po podaní bleomycínu a protilátky proti al integrínu mali byť viac alebo menej podobné ako v skupine B. U skupiny D sa očakával len obmedzený počet fibrotických lézií s miernym multifokálnym septálnym zhustením a malými agregátmi mononukleárnych buniek.

Aj keď je predložený vynález z dôvodu dôkladného vysvetlenia a dobrého porozumenia opísaný veľmi podrobne a tiež opísaný formou ilustratívnych príkladov, odborníkovi je jasné, že je možné vykonať rôzne zmeny a modifikácie v rámci rozsahu vynálezu. Takže tu uvedené príklady nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je vymedzený pripojenými patentovými nárokmi.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY príslušnými protilátky,

1. Použitie kompozície obsahujúcej protilátku alebo homológ protilátky, ktorá/ý antagonizuje interakciu VLA-4 a α4β7 s ich oí4 ligandmi, alebo protilátku alebo homológ ktorá/ý antagonizuje interakciu VLA-4 ligandom, alebo protilátku alebo homológ protilátky, s j eho ktorá/ý antagonizuje interakciu α4β7 s jeho ligandom na prípravu farmaceutickej kompozície fibrotické ochorenie.

na liečenie subjektu, ktorý ma

2. Použitie podlá nároku 1, protilátky je vybraná/ý zo kde protilátka alebo homológ skupiny obsahujúcej ľudskú protilátku, chimérickú protilátku, humanizovanú protilátku a ich fragmenty.

3. Použitie podľa nároku 1, kde dávka kompozície farmaceutickej kompozície je taká, aby posytovala okolo 0,1 až 20 mg na kilogram telesnej hmotnosti.

4. Použitie protilátky alebo homológu protilátky, ktorá/ý antagonizuje interakciu medzi a4 podjednotku nesúcim integrinom a ligandom pre integrín nesúci podjednotku a4 na prípravu farmaceutickej kompozície na zníženie zvýšených leukocytov indukovaných fibrotickým ochorením vo vzorke tekutiny z bronchoalveolárneho výplachu.

5. Použitie podľa nároku 4, kde protilátka alebo homológ protilátky antagonizuje interakciu VLA-4 a α4β7 s ich príslušnými ligandmi alebo antagonizuje interakciu VLA4 s jeho ligandom alebo antagonizuje interakciu α4β7 s jeho ligandom.

6. Použitie podľa nároku 4, kde protilátka alebo homológ protilátky je vybraná/ý zo skupiny obsahujúcej ľudskú protilátku, chimérickú protilátku, humanizovanú protilátku alebo ich fragmenty.

7. Spôsob podľa nároku 4, kde protilátkový homológ farmaceutickej kompozície sa podáva v dávke 0,1 až 20 mg/kg telesnej hmotnosti jedinca.

8. Použitie podľa nároku 7, kde protilátka lebo homológ protilátky sa podáva v takej dávke, ktorá účinne poskytne dávku malých molekúl 0,1 až 30 mg/kg telesnej hmotnosti.

9. Použitie podľa nárokov 1 alebo 4, kde protilátka alebo homológ protilátky je humanizovaná protilátka, ktorej časť je kódovaná sekvenciou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleovú kyselinu, ktorá hybridizuje za podmienok vysokej stringencie so sekvenciou nukleovej kyseliny vybranou zo skupiny sekvencii : PCR priméry na konštrukciu preformovanej ľudskej variabilnej oblasti 21.6:

k Variabilná oblasť lahkého reťazca

1, Priméry na syntézu verzie „a

21.6VLal (39-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 22):

5' GAT GGT GAC TCT ATC TCC TAC AGA TGC AGA CAC TGA GGA 3'

21 6VLa2 (32-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 23):

5' CTG TAG GAG ATA GAG TCA CCA TCA CTT GCA AG 3'

21.6VLa3 (39^-[nér} (Sekvencia SEQ ID NO: 24):

5’ AGG AGC TTT TCC AGG TCT CTC TTG GTA CCA AGC CAT ATA 3'

21.6VLa4 (41-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 25):

5' ACC AAC AGA CAC CTG GAA AAG CTC CTA CGC TCC TCA TAC AT 3’

21 6VLa5 (^40_mér> (Sekvencia SEQ ID NO: 26):

5’ GCA. GGC TCC TGA TGG TGA AAG TAT AAT CTC TCC CAG ACC C 3‘

21.6VLa6 (42-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 27):

5' ACT TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCT GAA GAT ATT GCA ACT 3 ' c»τ n (59-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 28) :

21«oVLä/

5' CCG AGG ATC CAC TCA CCT TTG ATT TCC ACC TTG GTG CCT TGA CCG AAC GTC CAC ACA TT 3'

2. Priméry na syntézu verzie „b

21 6VLbl ^(33-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 29): zmeny H-49 na Y- 49 5 ’ CCA AAA GCT CCT AGG CTG CTC ATA TAT TAC ACA 3'

21.6VLb2 (38-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 30): zmeny ACC-101 na

ACA-101, aby sa zrušilo Styl miesto

5· CCG ACG ATC CAC TCA CGT TTG ATT TCC ACC TTT GTG CC 3'

B. Variabilná oblasť ťažkého reťazca

1. Priméry na syntézu verzie „a

21.6VHal (51-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 31):

5' AAC CCA GTG TAT ATA GGT GTC TTT AAT GTT GAA ACC GCT AGC TTT ACA GCT 3’

21.6VHa2 ^(67_mér> (Sekvencia SEQ ID NO: 32):

5' AAA CAC ACC TAT ATA CAC TGG GTT AGA CAG GCC CCT GGC CAA AGG CTG GAG TGG ATG GGA AGG ATT G 3'

21.6VHa3 (26-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 33):

5¹ GAC CCG GCC CTG GAA CTT CGG GTC AT 3' íou λ (66-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 34):

21.oVHdA

5’ CAC CCG AAG TTC CAG GCC CGG GTC ACC ATC ACC GCA GAC ACC TCT GCC AGC ACC GCC TAC ATC GAA 3' (64-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 35):

21.6VHa5

5' CCA TAC CAT AGA CCC CGT ACT TAC CAT AAT ATC CCT CTC TGG CGC AGT AGT ACA CTG CAG TGT C 3'

21.6VHaó ^(63_rnér) (Sekvencia SEQ ID NO: 36):

S' GGT AAC TAC GGG GTC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC CTT GTC ACC GTC TCC TCA 3'

2. Priméry na syntézu verzie „b

21.6VHb <^37_mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 37): zmeny R-44 na G-44 5¹ CCA GGG CCG GGT CAC CAT CAC CAG AGA CAC CTC TGC C 3'

3. Priméry na syntézu verzie „c

21.6VHC (27-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 38): zmeny Y-98 na F-98 5¹ CAG GCC CCT GCC CAA GGG CTG GAG TGC 3 '

C. Variabilné oblasti lahkého aj ťažkého raťazca

Priméry hybridizujúce s okolitým p(JC19 DNA vektorom , (17-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 39), sense primér

APvH X

5' TAC GCA AAC CGC CTC TC 3'

APCR4 (1θ^-Γηθ^Γ) (Sekvencia SEQ ID NO: 40), antisense primér S' GAC TGC ACC ATA TGC GGT 3' alebo so sekvenciami komplementárnymi k uvedeným sekvenciám nukleových kyselín.

10. Použitie podlá nárokov 1 alebo 4, kde protilátka alebo homológ protilátky je humanizovaná protilátka, ktorej časť je kódovaná sekvenciou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleovú kyselinu, ktorá hybridizuje za podmienok nízkej stringencie so sekvenciou nukleovej kyseliny vybranou zo skupiny sekvencii nukleovej kyseliny:

PCR priméry na konštrukciu preformovanej ľudskej variabilnej oblasti 21.6:

A. Variabilná oblasť ľahkého reťazca

1, Priméry na syntézu verzie „a

21 6VLal (39-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 22):

5' GAT GGT GAC TCT ATC TCC TAC AGA TGC AGA CAG ľGA GGA 3'

21 6VLa2 (32-mér> (Sekvencia SEQ ID NO: 23):

5' CTG TAG GAG ATA GAG TCA CCA TCA CTT GCA AG 3'

21 6VLa3 <^39_mér> (Sekvencia SEQ ID NO: 24):

5’ AGG AGC TTT TCC AGG TGT CTG TTG GTA CCA AGC CAT ATA 3'

21 6VLa4 (^41_mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 25):

5' ACC AAC AGA CAC CTG GAA AAG CTC CTA GGC TCC TCA TAC AT 3'

21 6VLa5 (40-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 26):

5’ GCA GGC TGC TGA TGG TGA AAG TAT AAT CTC TCC CAG ACC C 3‘

21.6VLa6 (^42-m®^r) (Sekvencia SEQ ID NO: 27):

5' ACT TTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT ATT GCA ACT 3'

21,6VLa7 (mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 28):

5 ' CCG AGG ATC CAC TCA CGT TTG ATT TCC ACC TTG GTG CCT TGA CCG AAC GTC CAC AGA TT 3’

ΊΟ

2. Priméry na syntézu verzie „b

21.6VLbl (33-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 29): zmeny H-49 na Y- 49 5' GGA AAA GCT CCT AGG CTG CTC ATA TAT TAC ACA 3¹

21.6VLb2 <^38_mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 30): zmeny ACC-101 na

ACA-101, aby sa zrušilo Styl miesto

S' CCG AGG ATC CAC TCA CGT TTG ATT TCC ACC TTT GTG CC 3'

B· Variabilná oblasť ťažkého reťazca j. Priméry na syntézu verzie „a”

21.6VHal (51-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 31):

5' AAC CCA GTG TAT ATA GGT GTC TTT AAT GTT GAA ACC GCT AGC TTT ACA GCT

3'

21 6VHa2 (^67-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 32):

S’ AAA GAC ACC TAT ATA CAC TCG GTT AGA CAC CCC CCT GCC CAA AGG CTG GAG

TGG ATG GGA AGG ATT G 3'

21,6VHa3 (26-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 33):

5' GAC CCG GCC CTG GAA CTT CGG GTC AT 3’

21 6VHa4 (⁶⁸-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 34):

5' GAC CCG AAG TTC CAG GGC CGG GTC ACC ATC ACC GCA GAC ACC TCT GCC AGC

ACC GCC TAC ATG GAA 3¹

21.6VHa5 (64-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 35):

5' CCA TAG CAT AGA CCC CGT AGT TAC CAT AAT ATC CCT CTC TGG CGC AGT AGT

ACA CTG CAC TGT C 3 '

21.6VHaó(63-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 36):

5' GGT AAC TAC GGG GTC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC CTT GTC ACC GTC TCC TCA 3'

2. Priméry na syntézu verzie „b

21 6VHb (^37-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 37): zmeny R-44 na G-44 5' CCA GGG CCG GGT CAC CAT CAC CAG AGA CAC CTC TGC C 3 '

3. Priméry na syntézu verzie „c

21.6VHC (27-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 38): zmeny Y-98 na F-98 5' CAG GCC CCT GGC CAA GGG CTG GAG TGG 3'

Variabilné oblasti ľahkého aj ťažkého raťazca

Priméry hybridizujúce s okolitým pUC19 DNA vektorom _Än__o. (17-tnér) (Sekvencia SEQ ID NO: 39), sense primér APCR1

5' TAC GCA AAC CGC CTC TC 3'

APCR4 (18-mér) (Sekvencia SEQ ID NO: 40), antisense primér 5’ GAG TGC ACC ATA TGC GGT 3’ alebo so sekvenciami komplementárnymi k uvedeným sekvenciám nukleových kyselín.

11. Použitie podľa nárokov 1 alebo 4, kde protilátka alebo homológ protilátky je humanizovaná protilátka, ktorej časť je kódovaná sekvenciou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleovú kyselinu, ktorá hybridizuje za podmienok nízkej stringencie so sekvenciou nukleovej kyseliny kódujúcou sekvenciu polypeptidu vybranú zo skupiny obsahujúcej:

(2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 120 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 2:

Val Lys Leu Gin . Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Leu Ser Cys ’Thr Ala Ser Gly Phe Asn íle Lys Asp Thr Tyr 20 25 30 Het His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp íle Gly 35 40 45 Arg íle Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gin 50 55 60 Val Lys Ala Thr íle Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Trp Leu 65 70 75 80 Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys Ala 85 90 95 Asp Gly Het Trp Val Ser Thr Gly Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 I²⁰ (2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 106 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín

Op. is s ;ekv encie: SEQ ID NO: 4 : Ser íle Val Met Thr Gin Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Thr Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu íle 35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ila Ser Thr Val Gin Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gin Gin Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr 85 90 95 Ihr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu íle

100 105 a variabilnú doménu protilátky produkovanej bunkovou líniou ATCC CRL 11175.

12. Použitie podlá nárokov 1 alebo 4, kde protilátka alebo homológ protilátky je humanizovaná protilátka, ktorej časť je kódovaná sekvenciou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleovú kyselinu, ktorá hybridizuje za podmienok vysokej stringencie so sekvenciou nukleovej kyseliny kódujúcou polypeptidovú sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej:

(2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 120 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 2:

Val Lys Leu Gin . Gin , Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly ¹ Ala . Ser 1 5 10 15 Val Lys Leu Ser Cys •Thr Ala Ser Gly Phe Asn íle Lys Asp Thr Tyr 20 25 30 Het His Tm Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp íle Gly 35 40 45 Arg íle Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gin 50 55 SO Val Lys Ala Thr íle Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Trp Leu 65 70 75 80 Gin Leu. Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr lyr Cys Ala 85 90 95 Asp Gly Mec Trp Val Ser Thr Gly Tyr . Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Thr ' Val Thr Val Ser Ser

115 120 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) DÍžka: 106 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 4:

Ser íle Val Met Thr Gin Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr íle Thr Cy₅ Lys Ala Ser Gin Ser Val Thr Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Set Pro Lys Leu Leu íle 35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr íle Ser Thr Val Gin Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gin Gin Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu íle

13. Použitie antagonistu VLA-1 na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie fibrózy.