CZ20013754A3

CZ20013754A3 - Pouľití kompozice obsahující antagonistu alfa-4 podjednotky integrinu pro výrobu léku k léčení fibrotických onemocnění

Info

Publication number: CZ20013754A3
Application number: CZ20013754A
Authority: CZ
Inventors: Philip Gotwals; Roy R. Lobb
Original assignee: Biogen, Inc.
Priority date: 1999-04-22
Filing date: 2000-04-21
Publication date: 2002-07-17
Also published as: BG106118A; KR20070050979A; ATE298249T1; CN100360183C; GEP20063844B; IS6105A; IL145898A; US20040037827A1; YU74901A; EE200100549A; ES2243259T3; NO20015122D0; WO2000064474A1; JP2014065747A; EA200101116A1; CN1596979A; JP2002542300A; CN1356911A; KR20070102760A; CN1679935A

Description

Použití kompozice obsahující antagonistů alfa-4 podjednotky integrinu pro výrobu léku k léčení fibrotických onemocnění

Tato přihláška si nárokuje právo priority z prozatímní přihlášky US č. 60/130,847 podané 22. dubna 1999 a přihlášky č. 60/137,214 podané 1. ledna 1999.

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká antagonistů VLA-4 integrinu nebo jejich fragmentů pro léčení fibrotických onemocnění u člověka nebo zvířat.

Dosavadní stav techniky

Fibronektin a kolagen jsou proteiny, které jsou nezbytné k udržení integrity extracelulární matrix v pojivové tkáni. Tvorba těchto proteinů je vysoce regulovaný proces a jeho narušení může vést k vývoji tkáňové fibrózy. I když vytváření fibrózní tkáně je součástí normálního prospěšného procesu hojení po poranění, za určitých okolností může abnormální akumulace fibrózního materiálu nakonec vést k selhání orgánu (Border et al. (1994) New Engl. J. Med. 331:1286-1292). Poškození kteréhokoliv orgánu vede k stereotypní fyziologické reakci: destičkami indukovaná hemostáza, po které následuje přísun zánětových buněk a aktivovaných fibroblastů. Cytokiny pocházející z buněk těchto typů řídí vytváření nové extracelulární matrix a krevních cév (granulační tkáň). Vytváření granulační tkáně je velmi pečlivě hierarchicky uspořádaný program, ve kterém je stimulována exprese matrix jsou patřícími do několika rodin molekul, integriny. Integriny jsou inhibitorů proteáz a proteinů extracelulární matrix, a naopak exprese proteáz je redukována, což v důsledku vede k akumulaci extracelulární matrix.

Ústředním bodem vývoje fibrotického onemocnění, a ή již indukovaného nebo spontánního, je stimulace aktivity fibroblastů. Přísun zánětových buněk a aktivovaných fibroblastů do poškozeného orgánu je závislý na schopnosti buněk těchto typů interagovat s intersticiální matrix složené především z fibronektinu a kolagenu. Tyto interakce typu buňka-buňka nebo buňka-extracelulární zprostředkovány molekulami buněčné adheze jedna z těchto rodin obsahuje strukturně a funkčně příbuzné glykoproteiny složené z různých alfa (dosud známy alfal, alfa2 až alfall) a beta (betal a beta7) heterodimerních transmembránových receptorových domén, které se v různých kombinacích vyskytují u savců prakticky ve všech typech buněk (viz přehledné publikace E. C. Butcher, Cell, 67, 1033 (1991);

D. Cox et al. , The Pharmacology of Integrins, Medicinal Research Rev. Vol. 195 (1994) and V. W. Engleman et al., Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets in Ann, Revs. Medicinal Chemistry, Vol. 31, J. A. Bristol, Ed.; Acad. Press, NY, 1996, p.191). Byly popsány dva integriny obsahující dvě podjednotky alfa4 a byly pojmenovány alfaébetal (VLA-4) a alfa4beta7.

Fibróza plicního intersticia, IFP (Interstitial pulmonární fibrosis) je důsledkem mnohých onemocnění plicního intersticia a vede ke snížení plicní kapacity a zhoršení vitální výměny plynů v plicích. Bez ohledu na etiologii jsou pro IPF charakteristické zánetlivé a fibroproliferativní změny v plicích a nadměrná akumulace kolagenu v intersticiu.

U pacientů s IPF se obecně projevuje v průběhu aktivní fáze

- 3 J ·· • · · · · plicní fibrózy výskyt nově rekrutovaných imunitních a zánětových buněk, což ukazuje na to, že pulmonární fibróza je výsledkem chybné reparace po počátečním zánětu tkáně. Rekrutování zánětových buněk se v mnoha případech podílí na počátečním zánětu. Kromě tyto buňky hrají velmi složitou roli v regulaci reparačního procesu. V každém případě rekrutování zánětových a imunitních buněk do plic hraje důležitou roli ve vyvolání fibrotické reakce. přísun zánětových buněk a aktivovaných fibroblastů do poškozených plic závisí na schopnosti těchto buněk interagovat se složkami ECM. Přesun a stav aktivace leukocytů jsou modulovány působením různých integrinu. Zabánění přísunu zánětových buněk do plic může být kritickým krokem v potlačení následné fibrotické reakce.

Mnohé z nemocí spojených s proliferaci fibrózní tkáně jsou často jak chronické tak i oslabující, jako např. kožní nemoci jako je skleroderma. Jiné, včetně např. pulmonární fibrózy, mohou být i fatální v důsledku toho, že v současnosti dostupná léčba má významné vedlejší účinky, a obecně je neúčinná ke zpomalení nebo zastavení progrese fibrózy [Nagler et al. 1996, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 154:1082-86]. Existuje tudíž silná potřeba nových antifibrotických léků.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká léčení fibróz. Původci vynálezu zkoumali možné účinky antagonistů integrinů obsahujících podjednotky alfal a alfa4 na patogenezi fibróz tak, že podávali integriny obsahující alfal nebo alfa4 podjednotku myším s plicní fibrózou. Prospěšný účinek těchto antagonistů jak na celkovou akumulaci kolagenu tak i na rozsah fibrotických lézí v plicích vedl k předpokladu, že integriny obsahující podjednotku alfal a/nebo alfa4 jsou vodným cílem pro antifibrotickou terapii.

Jeden aspekt vynálezu se týká podávání účinného množství přípravku, který obsahuje antagonistů interakce mezi integrinem nesoucím podjednotku alfa4 a ligandem pro integrin nesoucí podjednotku alfa4, pacientovi, který trpí fibrotickým onemocněním. Antagonista je agens vázající integrin alfa4 nebo agens vázající ligand integrinu alfa4. Výhodné agens vázající integrin alfa4 je vybráno ze skupiny obsahující: a) protilátkový homolog antagonizující interakci jak VLA-4 tak alfa4beta7 s příslušnými alfa4 ligandy b) protilátkový homolog Antagonizující interakci VLA-4 s jeho alfa4 ligandem, a c) protilátkový homolog antagonizující interakci alfa4beta7 s jeho alfa4 ligandem. V jiných provedeních vynálezu je protilátkový homolog vybrán ze skupiny obsahující humánní protilátku, chimérickou protilátku, humanizovanou protilátku a jejich fragmenty.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká snižování nárůstu leukocytů ve vzorku tekutiny z bronchoalveolární laváže vyvolaného fibrotickým onemocněním, kdy se pacientovi trpícímu fibrotickým onemocněním podává účinné množství antagonisty interakce mezi integrinem nesoucím podjednotku alfa4 a ligandem integrinu nesoucího podjednotku alfa4.

V některých provedeních vynálezu je agens vázající integrin alfa4 kódováno sekvencí nukleové kyseliny, která obsahuje nukleovou kyselinu hybridizující za stringentních podmínek s definovanými sekvencemi nukleových kyselin vybraných ze skupiny sekvencí uvedených v tabulce 6 Patentu US 5,840,299 nebo s komplementem těchto sekvencí nukleových kyselin.

V jiném aspektu vynálezu je agens vázající integrin alfa4 kódováno sekvencí nukleové kyseliny, která obsahuje nukleovou kyselinu hybridizující za definovaných stringentních podmínek ι ·· • I · t

- 5 se sekvencí nukleové kyseliny kódující polypeptidovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující jisté polypeptidy definované v Patentu US 5,932,214 nebo tvořené v buňkách linie ATCC CRL 11175.

Všechny citované články včetně patentů jsou formou citace zahrnuty v předkládané přihlášce.

Definice

Pro jasnější a přesnější popis vynálezu jsou dále uvedeny definice některých pojmů a termínů, které jsou užívány v popisu vynálezu a v nárocích předkládané přihlášky.

V detailním popisu vynálezu jsou užívány následující termíny:

Superrodina integrinového velmi pozdního antigenu (VLA, very latě antigen) je tvořena strukturně a funkčně příbuznými glykoproteiny složenými z (alfa a beta) heterodimerních, transmembránových receptorových molekul, vyskytujících se v různých kombinacích téměř ve všech typech savčích buněk (viz přehledy: E. C. Butcher, Cell, 67, 1033 (1991); D. Cox et al., The PharmacoloQV of Integrins. Medicinal Research Rev. (1994) and V. W. Engleman et al. , 'Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets.' in Ann. Report in Medicinal Chemistry, Vol. 31, J. A. Bristol, Ed.; Acad. Press, NY, 1996, p. 191). Rodina VLA integrinů obsahuje (tj. dosud jsou známy) integrin VLA-1, -2, -3, -4, -5, -6, -9 a -11, kde každá molekula obsahuje řetězec βΐ nekovalentně navázaný k řetězci alfa (al, a2, a3, a4, a5, a6 atd.).

Integrin alfa4betal (α4β1) se vyskytuje na buněčném povrchu jako receptor for VCAM-1; fibronektin a možná i další ligandy (tyto ligandy jsou jednotlivě i souborně nazvány alfa4 ligandy). Termín integrin α4β1 s označeními integrin VLA-4, a4bl (zaměnitelně užívaný nebo alfa4betal)

9 9 9

9 9

9 9 9 označuje polypeptidy, které jsou schopné vázat se na VCAM-1 a členy rodiny proteinů extracelulární matrix, zejména fibronektin, nebo jejich homology nebo fragmenty, ačkoliv odborníkům je jasné, že mohou existovat další ligandy pro VLA-4 a mohou být analyzovány obvyklými metodami. Avšak je známo, že podjednotka alfa4 může asociovat s dalšími podjednotkami betal, takže integrin alfa4 (nebo integrin cc4 nebo integrin obsahující podjednotku alfa4 (případně integrin obsahující podjednotku a.4) označuje takové integriny, kde je podjednotka alfa4 asociována s některou z podjednotek beta. Dalším příkladem je integrinu alfa4 kromě VLA4 je také alfa4beta7 (viz Labb a Adams, cit. výše) . Podobně termín integrin alfal nebo integrin obsahující podjednotku alfal označuje integriny, ve kterých je podjednotka alfal asociována s některou podjednotkou beta.

Antagonista integrinu je jakákoliv sloučenina, která inhibuje vazbu integrinů obsahujících podjednotku alfal a/nebo alfa4 s integrinovým ligandem a/nebo receptorem. Anti-integrinová protilátka nebo protein obsahující homolog protilátky (jak budou diskutovány dále v textu) a další molekuly, jako jsou např. rozpustné formy ligandových proteinů pro integriny, jsou užitečné. K rozpustným formám ligandových proteinů pro integriny obsahující podjednotku alfa4 patří rozpustný VCAM-1, fúzní protein obsahující VCAM-1, nebo bifunkční fúzní protein VCAM-l/lg. Např. rozpustná forma integrinového ligandu nebo jeho fragmentu může být podávána, aby vázala integrin, a výhodně tak kompetovala o vazebná místa pro integrin na buňkách, takže toto podávání má podobný účinek jako podávání antagonisty jako je např. anti-integrinová protilátka (např. proti VLA-1, VLA-4). Zvláště pak rozpustné integrinové mutanty, které váží ligandy, ale nespouštějí na integrinu závislou signalizační dráhu, spadají do předmětu

9 * · · 9 Λ * 9 9 9 9 9 9 9 9 · * · · · · předkládaného vynálezu. Takové mutanty integrinu působí jako kompetitivní inhibitory integrinových proteinů divokého typu a lze je proto považovat za antagonisty. Jinými typy antagonistů užitečných podle vynálezu jsou malé molekuly, jak budou definovány dále v textu.

Vynález se dále týká molekul, které antagonizují působení více než jednoho integrinu obsahujícího podjednotku alfa4, jako jsou např. malé molekuly nebo protilátkové homology, které antagonizují jak VLA-4 tak i alfa4beta7 nebo jiné kombinace integrinů obsahujících podjednotku alfa4. Dále se vynález týká molekul, které antagonizují působení více než jednoho integrinu obsahujícího podjednotku alfal. Vynález se také týká kombinace molekul, kdy kombinace antagonizuje působení více než jednoho integrinu, jako je např. kombinace několika malých mul nebo protilátkových homologů, které v kombinaci antagonizují jak VLA-4 tak alfa4beta7 nebo další kombinace integrinů obsahujících podjednotku alfa4.

Někteří antagonisté integrinů mohou být fúzováni nebo jinak spojeni např. s protilátkovými homology jako jsou imunoglobuliny nebo jejich fragmenty, bez omezení konkrétní strukturou integrinu nebo ligandu nebo další molekuly. Takže ve smyslu vynálezu jakékoliv agens schopné vytvářet chimérické proteiny (viz definice uvedená dále) a současně schopné vázat integrinové ligandy, které účinně blokuje nebo obaluje (potahuje) integrin obsahující podjednotku alfa4 a/nebo alfal, je považováno za ekvivalent antagonistů uvedených v příkladech vynálezu.

Termín protilátkový homolog (zaměnitelně homolog protilátky) znamená intaktní protilátku složenou z lehkých a těžkých imunoglobulinových řetězců spojených disulfidickými vazbami. Termín protilátkový homolog zahrnuje také protein obsahující jeden nebo více polypeptidů vybraných ze skupiny obsahující lehké řetězce imunoglobulínu, těžké řetězce imunoglobulínu a jejich fragmenty vázající antigen, které jsou schopné vázat jeden nebo více antigenů (tj . integrin nebo integrinový ligand). Polypeptidové složky homologu protilátky, který je složen z více než jednoho polypeptidu, mohou být případně vázány disulfidickými můstky nebo jinak kovalentně zesítěny. Tudíž k homologům imunog lobu líny typů IgA, IgG, protilátek patří intaktní IgE, IgD, IgM (včetně jejich subtypů), přičemž lehké řetězce těchto imunoglobulinů jsou typů kappa nebo lambda. K homologům protilátek patří také části intaktních imunoglobulinů, které si ponechávají vazebnou specifitu pro antigen, např. fragmenty Fab, Faba F(ab')2, fragmenty F(v), monomery nebo dimery těžkých řetězců, monomery nebo dimery lehkých řetězců nebo jejich kombinace.

Termín homolog humanizované protilátky označuje homolog protilátky připravený s využitím technologie rekombinantní DNA (genového inženýrství) , kde některé nebo všechny aminokyseliny těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulínu savce jiného než člověka, které nejsou nutné pro vazbu antigenu, byly substituovány odpovídajícími aminokyselinami těžkého nebo lehkého humánního imunoglobulínu. Termín homolog humánní protilátky označuje homolog protilátky, kde všechny aminokyseliny těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulínu (bez ohledu na to, jestli jsou nutné pro vazbu antigenu) jsou získány z humánního zdroje.

Termín homolog humánní protilátky označuje homolog protilátky připravený technologií rekombinantní DNA, kde všechny aminokyseliny těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulínu jsou získány z humánního zdroje.

Termín agonista integrinů označuje sloučeninu, která aktivuje integrinový ligand.

j akoukoliv

Aminokyselina

J^e monomerni jednotka peptidu, polypeptidů nebo proteinu, peptidech, polypeptidech a aminokyselin, které jsou

V přirozeně se vyskytujících proteinech se vyskytuje 20 všechny L-isomery. Termín aminokyselina zahrnuje také analogy aminokyselin a D-isomery aminokyselin vyskytujících se v proteinech a jejich analogy.

Termín kovalentně navázaný užívaný v popisu znamená to, že specifické skupiny nebo části (např. PEGylovaný, fragment imunoglobulinu/antagonista integrinu alfa4 a/nebo alfal) jsou buďto vzájemně přímo kovalentně vázány nebo jsou spojeny kovalentně prostřednictvím vmezeřené skupiny nebo části nebo skupin či částí jako je např. tzv. spacer. Tato vmezeřená skupina nebo skupiny se nazývají spojovací skupina. Termín konjugovaný se v popisu vynálezu užívá zaměnitelně s termínem kovalentně navázaný. Spacer pak označuje skupinu, která je vmezeřená mezi aminokyselinu nebo jinou složku integrinového antagonisty nebo jeho fragmentu a zbytek molekuly. Spacer tedy odděluje aminokyselinu nebo jinou složku od zbytku molekuly, a zabraňuje modifikaci plynoucí z interference funkcí proteinů, a usnadňuje spojení aminokyseliny nebo jiné složky s další skupinou nebo částí.

Expresní kontrolní sekvence je sekvence kontrolující expresi, tj. sekvence nukleotidů, která řídí a reguluje expresi genů, se kterými je operativně spojena.

Expresní vektor je polynukleotid, jako je DNA plazmid nebo fág (nej obvyklejší případy), který dovoluje expresi alespoň jednoho genu, když je vektor vnesen do hostitelské buňky. Vektor může ale nemusí být schopen replikace v hostitelské buňce.

Termín účinné množství činidla nebo přípravku označuje takové množství, které poskytuje požadovaný výsledek nebo projevuje požadovaný vliv na určité onemocnění, které je

a a

- 10 léčeno.

Termín funkční ekvivalent aminokyselinového zbytku je

I) aminokyselina mající stejné reakční vlastnosti jako aminokyselina, která je nahrazena funkčním ekvivalentem,

II) aminokyselina antagonisty podle vynálezu, mající podobné vlastnosti jako aminokyselina, která je nahrazena funkčním ekvivalentem, a III) molekula jiná než aminokyselina mající podobné vlastnosti jako aminokyselinový zbytek, který je nahrazen funkčním ekvivalentem.

První polynukleotid kódující proteinového antagonistu podle vynálezu je funkčně ekvivalentní ve srovnání s druhým polynukleotidem kódujícím antagonistický protein, pokud splňuje alespoň jednu z následujících podmínek:

a) funkčně ekvivalentní je první polynukleotid, který hybridizuje s druhým polynukleotidem za standardních hybridizačnich podmínek a/nebo je degenerovaný vzhledem k sekvenci druhého polynukleotidu. Nejvýhodněji jde o polynukleotid, který kóduje proteinovou mutantu mající aktivitu proteinového antagonisty integrinu,

b) funkčně ekvivalentní je první polynukleotid, který kóduje expresi aminokyselinové sekvence kódované druhým polynukleotidem.

Obecně antagonista integrinu zahrnuje, avšak není omezen pouze na ně, všechna činidla zmíněná v popisu a také jejich funkční ekvivalenty. Termín funkční ekvivalent se zde týká antagonisty integrinu nebo polynukleotidu kódujícího antagonistu integrinu, které mají stejný nebo lepší prospěšný účinek na příjemce jako původní antagonista integrinu, k němuž se funkční ekvivalent vztahuje. Odborníkovi je jasné, že funkčně ekvivalentní protein může být připraven rekombinantní technikou, tj. expresí funkčně ekvivalentní DNA. Tudíž předkládaný vynález zahrnuje proteiny kódované přirozeně se degenerace užít jiné vyskytující DNA, a také kódované DNA, která se přirozeně nevyskytuje, ale kóduje stejný protein jako je kódován přirozeně se vyskytující DNA. V důsledku nukleotidových kódujících sekvencí se mohou polynukleotidy pro kódování stejných integrinových proteinů. K nim patří celé nebo části uvedených sekvencí, které byly změněny substitucí různých kodonů, které kódují stejný aminokyselinový zbytek v sekvenci, jde tedy o tzv. umlčenou záměnu. Takové změněné sekvence se považují za ekvivalenty těchto sekvencí. Tak např. Phe (F) je kódován dvěma kodony, a sice TTC nebo TTT, Tyr (Y) je kódován TAC nebo TAT a His (H) je kódován CAC nebo CAT. Na druhé straně Trp (W) je kódován jediným kodonem TGG. Tudíž je jasné, že pro danou sekvenci DNA kódující konkrétní integrin existuje mnoho degenerovaných sekvencí, které ho kódují. Tyto degenerované sekvence spadají taktéž do rozsahu předkládaného vynálezu.

Termín chimérický, pokud se týká antagonisty podle vynálezu, znamená, že tento antagonista obsahuje spojení (chemickým zesítěním nebo kovalentní vazbou nebo vaznou jiného typu) dvou nebo více proteinů majících různorodou strukturu a/nebo pocházejících z různorodých zdrojů. Tak např. chimérický antagonista alfa4 integrinu může obsahovat jednu část, kterou je antagonista alfa4 integrinu nebo jeho fragment a další část, která není antagonistou alfa4 integrinu. A stejně tak chimérický antagonista alfal integrinu může obsahovat jednu část, kterou je antagonista alfal integrinu nebo jeho fragment a další část, která není antagonistou alfal integrinu.

Druhem chimérického proteinu je fúzní protein nebo zkráceně fúze, což je kolineární kovalentní spojení dvou nebo více proteinů nebo jejich fragmentů prostřednictvím jejich peptidové kostry, a to nejvýhodněji prostřednictvím • · exprese polynukleotidové molekuly kódující tyto proteiny. Takže k výhodným fúzním proteinům patří chimérické proteiny, které obsahují antagonistu integrinu alfa4 (nebo alfa 1) nebo jeho fragment kovalentně navázaný k druhé části, která není antagonistou integrinu alfa4 (nebo alfa 1) . Výhodné fúzní proteiny podle vynálezu obsahují části intaktních protilátek, které si uchovávají vazebnou specifitu pro antigen, jako jsou např. fragmenty Fab, Fab', F(ab')2 a F(v), monomery nebo dimery těžkých nebo lehkých řetězců, dimery sestávající z jednoho těžkého a jednoho lehkého řetězce apod.

Nejvýhodnější fúzní proteiny jsou chimérické proteiny obsahující jednu část, kterou je antagonista integrinu, fúzovanou nebo jinak spojenou s celým nebo částí kloubového a konstantního úseku lehkého řetězce imunoglobulinu, těžkého řetězce imunoglobulinu nebo obou. Takže předkládaný vynález se týká molekuly, která obsahuje: (1) část představující antagonistu integrinu, (2) druhý peptid, např. takový, který zvyšuje rozpustnost nebo in vivo antagonisty integrinu, jako je např imunoglobulinu nebo jeho fragment nebo část, tj . např. fragment nebo část IgG, např. konstantní úsek těžkého řetězce humánního IgGl, např. úseky CH2, CH3 a kloubový úsek. Specificky fúze antagonista integrinu/Ig je protein obsahující molekulu biologicky aktivního antagonisty integrinu podle vynálezu (např. rozpustný ligand VLA-4 nebo VLA-1) nebo jeho biologicky aktivní fragment navázaný na N-konec imunoglobulinového řetězce, přičemž část imunoglobulinu je nahrazena antagonistou integrinu fúze antagonista integrinu/Ig je fúze integrin/Fc, což je protein obsahující molekulu biologicky aktivního antagonisty integrinu podle vynálezu navázanou na alespoň část konstantní domény imunoglobulinu. Výhodná Fc fúze obsahuje antagonistu biologický poločas člen superrodiny

N-konce

Druhem integrinu podle vynálezu, který je navázán k fragmentu protilátky obsahujícímu C-koncovou doménu těžkého řetězce imunoglobulinu.

Termín fúzní protein také znamená antagonistů integrinu, který je chemicky spojen prostřednictvím mono- nebo heterofunkční molekuly s druhou částí, která není antagonistou integrinu (čímž vzniká chimérická molekula) a je vytvořen de novo z purifikovaných proteinů, jak bude popsáno dále. Jedním příkladem chemicky spojené (na rozdíl od rekombinantně spojené) chimérické molekuly je fúzní protein, který obsahuje: (1) část zaměřující podjednotku alfa4 integrinu, tj . část VCAM-1 schopnou vázat se na VLA-4 na povrchu buněk nesoucích VLA-4, (2) druhou molekulu, která zvyšuje rozpustnost nebo in vivo biologický poločas zaměřovači části, jako je např. polyalkylenglykolový polymer, např. polyethylenglykol (PEG). Část zaměřující podjednotku alfa4 je přirozeně se vyskytující alfa4 ligand nebo jeho fragment, např. VCAM-1 peptid nebo podobná sekvence s konzervativními substitucemi aminokyselin.

Termín heterologní promotor označuje promotor, který není v přirozeném stavu spojen s genem nebo purifikovanou nukleovou kyselinou

Termín homologie (a tedy i homologní) je zde užíván jako synonymum s termínem identita (identický) a týká se sekvenční podobnosti dvou polypeptidových molekul nebo molekul nukleové kyseliny. Když je jedna určitá pozice ve dvou srovnávaných sekvencích obsazena stejnou baží nebo aminokyselinou (např. pozice ve dvou molekulách DNA je obsazena adeninem nebo pozice ve dvou polypeptidech je obsazena lysinem), pak dvě srovnávané molekuly jsou v této pozici homologní. Procento homologie mezi dvěma sekvencemi je funkcí počtu shodných nebo homologních pozic sdílených dvěma * · ♦ 9

sekvencemi dělený celkovým počtem pozic a vynásobený 100. Tak např. jestliže 6 z 10 pozic je shodných nebo-li homologních, pak tyto sekvence jsou z 60 % homologní. Nebo např. DNA sekvence CTGACT a CAGGTT sdílejí 50% homologii (3 pozice ze 6 se shodují). Obecně se srovnání provádí, když jsou sekvence vzájemně přiřazeny tak, aby bylo dosaženo maximální homologie. Takové přiřazení a srovnání lze provést metodou podle Karlin a Altschul, která je dále podrobněji popsána.

Homologní sekvence sdílejí shodné nebo podobné zbytky aminokyselin, kde podobné aminokyselinové zbytky jsou konzervativní substituce nebo povolené bodové mutace odpovídajících aminokyselinových zbytků vzhledem k přiřazené referenční sekvenci. V tomto smyslu konzervativní substituce aminokyselinového zbytku v referenční sekvenci znamená substituci aminokyselinou, která je fyzicky nebo funkčně podobná odpovídajícímu referenčnímu zbytku, tedy např. má podobnou velikost, tvar, elektrický náboj, chemické vlastnosti včetně schopnosti vytvářet kovalentní nebo vodíkové vazby apod. Zvláště výhodné jsou kovalentní substituce, které splňují kritéria definovaná jako přijatelné bodové mutace v publikaci Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure 5, Suppl. 3, Chapter 22: 352-354, NAt. Biomed. Res. foundation, Washington D.C., 1978.

Homologie i identita jsou zaměnitelné pojmy a týkají se sekvenční podobnosti dvou polypeptidových sekvencí. Homologie i identita mohou být stanoveny srovnáním pozic v každé ze dvou sekvencí, které jsou pro účel srovnání navzájem přiřazeny. Pokud je pozice ve srovnávaných sekvencích obsazena shodným aminokyselinovým polypeptidy v této pozici identické, pozice obsazena stejnou aminokyselinou (tj . identickou) nebo podobnou aminokyselinou (např. podobnou z hlediska sterické zbytkem, pak jsou pokud je ekvivalentní

• 9 · • » · · · a/nebo elektronové povahy), pak jsou polypeptidy v této pozici homologní. Procento homologie nebo identity je funkcí počtu shodných nebo homologních pozic sdílených oběma sekvencemi. Nepříbuzné nebo nehomologní sekvence sdílejí méně než 40% identitu, výhodně méně než 25% identitu se sekvencí podle vynálezu.

Procento homologie dvou aminokyselinových sekvencí nebo dvou sekvencí nukleových kyselin se stanovuje užitím přiřazovacího algoritmu podle Karlin a Altschul (Proč. Nat. Acad. Sci. USA 87: 2264 (1990), v modifikaci podle Karlin a Altschul (Proč. Nat. Acad. Sci., USA 90: 5873 (1993). Tento algoritmus je inkorporován v programech NBLAST nebo XBLAST podle Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990). Vyhledání homologní nukleotidové sekvence se sekvencí podle vynálezu se provádí programem NBLAST s nastavením parametrů skóre = 100, délka slova = 12. Vyhledávání proteinů homologních k referenčnímu peptidu se provádí programem XBLAST s nastavením parametrů skóre = 50, délka slova = 3. Pro získání přiřazení s mezerami se užívá program Gapped BLAST podle Altschul et al. , Nucleic Acids Res., 25: 3389 (1997). Při užití programů BLAST a GappedBLAST byly užity standardní parametry těchto programů (XBLAST a NBLAST, viz http://www/ncbi.nim.nih.gov).

Termín izolovaný (zaměnitelný s termínem v podstatě čistý), pokud se týká nukleových kyselin, tj. polynukleotidových sekvencí kódujících polypeptidy, znamená RNA nebo DNA polynukleotid, část genomového polynukleotidu, cDNA nebo syntetický polynukleotid, který v důsledku svého původu nebo zacházení s ním: I) není spojen se všemi polynukleotidy se kterými je spojen v přírodě (např. je přítomen v hostitelské buňce jako expresní vektor nebo jeho část), nebo II) je spojen s jinou nukleovou kyselinou nebo chemickou skupinou, než se kterými je spojen v přírodě, nebo III) nevyskytuje se v přírodě. Jako izolovaná se dále označuje polynukleotidová sekvence, která je I) amplifikovaná in vitro např. metodou polymerázové řetězové reakce (PCR), II) chemicky syntetizovaná, III) rekombinantně připravená klonováním nebo IV) purifikovaná, např. štěpením a separací na gelu. Takže v podstatě čistá nukleová kyselina je nukleová kyselina, která není bezprostředně souvisle spojena s jednou nebo oběma sekvencemi, se kterými je normálně spojena v přirozeném stavu v genomu organismu, ze kterého je izolována. V podstatě čistá DNA také zahrnuje rekombinantní DNA, která je součástí hybridního genu kódujícího dodatečné integrinové sekvence.

Izolovaný (plně zaměnitelný s termínem v podstatě čistý), pokud se týká polypeptidů, znamená polypeptid nebo jeho část, který v důsledku svého původu nebo zacházení s ním: I) je přítomen v hostitelské buňce jako expresní produkt části expresního vektoru), nebo II) je spojen s proteinem nebo jinou chemickou skupinou, které se odlišují od těch, se kterými je spojen v přírodě, nebo III) nevyskytuje se v přírodě. Jako izolovaný se dále označuje protein, který je I) chemicky syntetizovaný nebo II) exprimovaný v hostitelské buňce a purifikován od asociovaných proteinů. Termín obecně znamená polypeptid, který byl separován od ostatních proteinů a nukleových kyselin, se kterými je v přírodním stavu asociován. Výhodně je polypeptid separován i od látek jako jsou např. protilátky nebo gelová matrice (např. polyakrylamid), které se užívají k purifikací.

Multivalentní proteinový komplex je několik integrinových antagonistů (jeden nebo více). Anti-integrinový protilátkový homolog nebo jeho fragment může být zesítěn nebo navázán na další protilátkový homolog nebo fragment. Přitom se může jednat o stejné nebo různé proteiny a stejné nebo různé protilátkové homology nebo fragmenty.

»999 9

Mutanta (mutace apod.) v genetickém materiálu organizmu, (např. delece, substituce, v polynukleotidové

Termín operativně polynukleotidové sekvence se týká jakékoliv změny zejména jakékoliv změny adice nebo alterace) sekvenci proteinu divokého typu. Termín mutein označuje mutovaný protein a užívá se zaměnitelně s termínem mutace.

spojena znamená v případě (DNA, RNA) , že sekvence je operativně spojena s expresní kontrolní sekvencí, když expresní kontrolní sekvence řídí a reguluje transkripci a translaci této polynukleotidové sekvence. Termín operativně spojena také znamená, že před polynukleotidovou sekvencí, která má být exprimována, je vhodný počáteční signál (start-signál), např. kodon ATG, a že sekvence je ve shodném čtecím rámci, který umožňuje expresi polynukleotidové sekvence pod kontrolou expresní kontrolní sekvence, a tudíž vede k produkci požadovaného polypeptidu kódovaného polynukleotidovou sekvencí.

Farmakologické agens je definováno jako jedna nebo více sloučenin nebo jiných chemických individuí, která se podávají pacientovi (navíc s antagonistou podle vynálezu) a která ovlivňují působení antagonisty. Termín farmakologické agens tedy označuje takové agens, které se podává v průběhu kombinované terapie, kdy se antagonista podle vynálezu podává buďto před, po a nebo současně s jedním nebo více farmakologickými agens.

Protein je polymer složený v podstatě z kterýchkoliv z dvaceti proteinových aminokyselin. I když termín polypeptid se často užívá k označení relativně velkých polypeptidů a termín peptid se často užívá k označení

relativně malých polypeptidů, použití těchto termínů v oboru se často překrývá a je odlišné. V tomto popisu se termín protein užívá k označení jak peptidů tak i proteinů a polypeptidů, pokud není výslovně uvedeno jinak.

Takže termíny peptid(y), protein(y) a polypeptid(y) jsou v tomto popisu užívány zaměnitelně. Také termíny polynukleotidová sekvence a nukleotidová sekvence jsou zde užívány zaměnitelně.

Rekombinantní znamená, že protein pochází z rekombinantního savčího expresního systému. Jelikož integriny nejsou glykosylované ani neobsahují disulfidické vazby, mohou být exprimovány ve většině prokaryotických a eukaryotických expresních systémů.

Termín malá molekula byl definován v části A2.

Termín povrchová aminokyselina znamená jakoukoliv aminokyselinu, která je vystavena rozpouštědlu, když je protein sestaven do své nativní formy.

Hybridizační podmínky jsou podmínky určené koncentrací solí a teplotou v podstatě shodné s podmínkami 0,5xSSC až 5xSSC a 65 °C jak pro vlastní hybridizaci tak promývání. Termín standardní hybridizační podmínky zde užívaný je proto operační definice zahrnující řadu hybridizaci. Nicméně podmínky s vysokou stringencí (přísností) zahrnují hybridizaci v pufru pro screening plaků (obsahuje 0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll 400, 0,2% hovězí sérový albumin, 50mM Tris-HCl, pH 7,5, 1M NaCl, 0,1% difosforečnan sodný, 1% SDS) s 10% dextransulfátem a 100 μg/ml denaturované sonikované DNA lososího spermatu při 65 °C po 12 až 20 hodin a promývání v 75mM NaCl/7,5mM citrát sodný (0,5xSSC)/l% SDS při 65 °C. Podmínky s nízkou stringencí znamenají např.

hybridizaci v pufru pro screening plaků s 10% dextransulfátem a 110 μg/ml denaturované sonikované DNA lososího spermatu při °C po 12 až 20 hodin a promývání v 300mM NaCl/30mM citrát sodný (2xSSC)/l% SDS při 55 °C (pro podrobnosti viz Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, Inc.,1989, kapitoly 6.3.1 až 6.3.6., 1989)

Termín léčivý přípravek označuje přípravek obsahující antagonistů podle vynálezu a další biologicky kompatibilní přísady. Léčivý přípravek obsahuje dále také excipienty jako je voda, minerály a nosiče, jako jsou např. proteiny.

Pacient s fibrotickým onemocněním se týká pacienta trpícího fibrózou vnitřních orgánů, kožním fibrózním onemocněním, dermální fibrózou a fibrotickým onemocněním oka (avšak tento výčet není omezující). K fibróze nitřních orgánů (např. jater, plic, ledvin, srdce, krevních cév, gastrointestinálního traktu) dochází při nemocech jako je pulmonární fibróza, myelofibróza, cirhóza jater, mesangiální proliferativní glomerulonefritida, srpkovitá glomerulonefritida, diabetická nefropatie, fibróza renálního intersticia, renální fibróza pacientů na cyklosporinu, nefropatie asociovaná s HIV.

K dermálním fibrózním onemocněním patří (avšak výčet není omezující) skleroderma; morfea, keloidy, hypertrofické jizvy, familiární kutánní kolagenom, a névy v pojivové tkáni kolagenového typu. K fibrotickým onemocněním oka patří např. diabetická retinopatie, jizvení po chirurgickém zákroku (např. po filtrační operaci glaukomu nebo křížové operaci oka) a proliferativní vitreoretinopatie. Další fibrotická onemocnění, která lze léčit přípravky podle vynálezu, jsou: revmatoidní artritida, nemoci spojené s dlouhotrvající bolestí kloubů a chátráním kloubů, progresivní systémová skleróza, polymyositida, dermatomyositida, eosinofilní fascitida, morfea, Raynaudův syndrom a nasální polypóza. Navíc k fibrotickým onemocněním, která lze léčit přípravky podle vynálezu, patří inhibice nadměrné tvorby jizev, u kterých je známa tvorba keloidů nebo hypertrofické jizvení; inhibice nebo prevence jizvení nebo nadměrného jizvení v průběhu hojení různých typů ran, včetně chirurgických řezů, chirurgických řezu břišní stěny a traumatických lacerací, prevence nebo inhibice jizvení nebo uzávěru arterií po provedení angioplastiky, prevence nebo inhibice nadměrných jizev nebo tvorby fibrózní tkáně spojené se srdeční fibrózou po infarktu a hypersensitivní vaskulopatie.

Účinné množství je takové množství, které je dostatečné k navození prospěšného nebo požadovaného účinku. Účinné množství může být podáno v jedné dávce nebo ve více dávkách. V terapeutickém smyslu účinné množství antagonisty podle vynálezu je množství dostatečné ke zmírnění, potlačení, stabilizaci, zvrácení, zpomalení nebo zpoždění progrese onemocnění podle přijatých standardů pro dané onemocnění. Detekce a měření ukazatelů účinnosti terapie se provádí celou řadou různých diagnostických metod, např. fyzikálním vyšetřením včetně krevních testů, testů pulmonární funkce, rentgen hrudníku, vyšetření CT; bronchoskopie, bronchoalveolární laváž, biopsie plic.

Praktické provedení předkládaného -vynálezu vyžaduje, pokud není specificky uvedeno jinak, obvyklé techniky buněčné a molekulární biologie, buněčných kultur, mikrobiologie, rekombinantní DNA, proteinové chemie, farmakologie a imunologie, které jsou odborníkům známy a jsou dostatečně popsány v odborné literatuře. Pokud není uvedeno jinak, publikace citované v předkládané přihlášce jsou celé zahrnuty formou odkazu.

Popis výhodných provedení předkládaného vynález

Předkládaný vynález je založen na objevu, že antagonisté integrinů obsahujících podjednotku alfal a/nebo alfa4 a jejich fragmenty mohou být využity k léčení pulmonární fibrózy.

VCAM-1/VLA-4. Je molekula, která

A. Antagonisté integrinu

Pro účely předkládaného vynálezu je antagonista integrinu antagonista jakékoliv interakce mezi integrinem a jím rozpoznávaným ligandem nebo receptorem, který tak mění (tj. zcela ruší, zpomaluje nebo jinak modifikuje) normální funkce indukované interakcemi ligand-receptor). V jednom výhodném provedení je antagonistou integrinu antagonista interakcí alfa4 integrinů s jejich ligandy, např. interakce to agens, např. polypeptid nebo jiná může inhibovat nebo blokovat vazbu zprostředkovanou VCAM-1 a/nebo VLA-4 nebo může jiným způsobem modulovat funkce VCAM-1 a/nebo VLA-4, např. tím, že inhibuje nebo blokuje signální transdukci VLA-4 zprostředkovanou ligandem VLA-4 nebo signální transdukci VCAM-1 zprostředkovanou ligandem VCAM-1, a které je účinné při léčení akutních poškození mozku, výhodně stejným způsobem jako antiVLA-4 protilátky.

Antagonista interakce VCAM-l/VLA-4 je agens, které má alespoň jednu z následujících vlastností: (1) pokrývá VLA-4 nebo se váže na VLA-4 na povrchu buněk nesoucích VLA-4 (např. endotelových buněk) se specificitou dostatečnou pro inhibici interakce VLA-4-ligand/VLA-4, např. interakce VCAM-l/VLA-4; (2) pokrývá nebo se váže na VLA-4 na povrchu buněk nesoucích VLA-4 (např. lymfocytů) se specificitou dostatečnou pro modifikaci, výhodně inhibici, transdukce signálu zprostředkované VLA-4, např. signalizace zprostředkované

VLA-4/VCAM-1; (3) pokrývá nebo se váže na VLA-4 ligand (např.

* · 9 · 9 · 9 • · 9 · · 9 · · · • · 9 · 9 9 9 ··· 9«· 999 9999 99 999

VCAM-1) na endotelových buňkách se specificitou dostatečnou pro inhibici interakce VLA-4/VCAM-1; (4) pokrývá nebo se váže na VLA-4 ligand (např. VCAM-1) se specificitou dostatečnou pro modifikaci, výhodně inhibici signální transdukce VLA-4 zprostředkované VLA-4 ligandem, např. signální transdukce VLA-4 zprostředkované VCAM-1. Ve výhodném provedení vynálezu má antagonista jednu nebo obě z vlastností 1 a 2. V jiném výhodném provedení má antagonista jednu nebo obě z vlastností 3 a 4. Navíc může být užit více než jeden antagonista, např. agens vázající VLA-4 se může kombinovat s agens vázajícím VCAM-1.

Dalším provedením antagonisty integrinu je antagonista interakce integrinů alfal s jejich ligandy, např. interakce kolagen/VLA-1. Je to agens, např. polypeptid nebo jiná molekula, která může inhibovat nebo blokovat vazbu zprostředkovanou kolagenem a/nebo VLA-1 nebo může jiným způsobem modulovat funkce kolagenu a/nebo VLA-1, např. tím, že inhibuje nebo blokuje signální transdukci VLA-1 zprostředkovanou ligandem VLA-1 nebo signální transdukci kolagenu zprostředkovanou ligandem kolagenu. Antagonista interakce kolagen/VLA-1 je agens, které má alespoň jednu z následujících vlastností: (1) pokrývá nebo se váže na VLA-1 na povrchu buněk nesoucích VLA-1 (např. kolagen) se specificitou dostatečnou pro inhibici interakce VLA1-ligand/VLA-l, např. interakce kolagen/VLA-1; (2) pokrývá nebo se váže na VLA-1 na povrchu buněk nesoucích VLA-1 se specificitou dostatečnou pro modifikaci, výhodně inhibici, transdukce signálu zprostředkované VLA-1, např. signalizace zprostředkované VLA-l/kolagen; (3) pokrývá nebo se váže na VLA-1 ligand (např. kolagen) se specificitou dostatečnou pro inhibici interakce VLA-l/kolagen; (4) pokrývá nebo se váže na VLA-1 ligand se specificitou dostatečnou pro modifikaci, • 0

0 0 0 000 • 0 » 00 • 0 · 0 · · ·

0 0 0 »000 0 0 0 0 výhodně inhibici signální transdukce VLA-1 zprostředkované VLA-1 ligandem, např. signální transdukce VLA-1 zprostředkované kolagenem. Ve výhodném provedení vynálezu má antagonista alfa 1 jednu nebo obě z vlastností 1 a 2. V jiném výhodném provedení má antagonista jednu nebo obě z vlastností 3 a 4. Navíc může být užít více než jeden antagonista, např. agens vázající VLA-1 se může kombinovat s agens vázajícím kolagen.

Jak již bylo zmíněno, antagonista podle vynálezu není omezen konkrétním typem nebo strukturou molekuly, takže antagonistou podle vynálezu a ve shodě s příklady nebo ekvivalentem agens podle vynálezu je jakékoliv agens schopné vázat se na alfa4 integriny (např. VLA4) na povrchu buněk nebo na alfa4 ligand (jako je např. VCAM-1 na povrchu buněk nesoucích alfa4 ligand) a které účinně blokuje nebo pokrývá alfa4 integrin (např. VLA-4) nebo alfa4 ligand (např. VCAM-1), a nazývá se agens vázající integrin alfa4 a případně agens vázající ligand alfa4 integrinů.

Tak např. protilátky a protilátkové homology (podrobněji ještě dále) a také rozpustné formy přirozených vazebných proteinů pro VLA-4 a VCAM-1 jsou užitečné podle vynálezu. K rozpustným formám přirozených vazebných proteinů pro VLA-4 patří rozpustné VCAM-1 peptidy, fúzní protein VCAM-1, bifunkční fúzní protein VCAM-l/Ig (např. chimérická molekula popsaná výše), fibronektin, fibronektin mající alternativně sestřižený spojovací segment odlišný od typu III, a fibronektinové peptidy obsahující aminokyselinovou sekvenci EILDV nebo podobnou konzervativně substituovanou aminokyselinovou sekvenci. K rozpustným formám přírodních vazebných proteinů pro VCAM-1 patří rozpustné peptidy VLA-4, VLA-4 fúzní proteiny, bifunkční fúzní protein VLA-4/Ig apod. Termín rozpustný peptid VLA-4 nebo rozpustný peptid VCAM-1 ««··

- 24 označuje polypeptid VLA-4 nebo VCAM-1, který není schopen zakotvení v membráně. K takovým rozpustným polypeptidům patří např. polypeptidy VLA-4 a VCAM, kterým chybí dostatečný úsek membránové domény pro ukotvení polypeptidu v membráně nebo jsou modifikovány tak, že membránová doména je nefunkční. Tato vazebná agens působí tak, že kompetují s vazebnými proteiny pro VLA-4 na buněčném povrchu nebo jiným způsobem mění funkci VLA-4. NApř. rozpustná forma VCAM-1 (viz např. Osborn et al. 1989, Cell, 59: 1203-1211) nebo její fragment se mohou podávat, aby vázala VLA-4, a výhodně tak kompetovala o vazebná místa pro VLA-4 na buňkách nesoucích VCAM-1, což vede k účinku podobnému podání antagonistů jako jsou malé molekuly nebo anti-VLA-4 protilátky.

1. Homology anti-Integrinových protilátek

V dalším výhodném provedení vynálezu je antagonistou podle vynálezu, který váže, a tudíž blokuje nebo potahuje, integriny alfal a/nebo alfa4 na buněčném povrchu (jako jsou např. VLA-1, VLA-4 nebo alfa4beta7) a/nebo ligandy na buněčném povrchu pro integrin alfal a/nebo alfa4 (jako je kolagen nebo VCAM-1, v uvedeném pořadí) anti-VLA-1 nebo anti-VLA-4 a/nebo anti-kolagen nebo anti-VCAM-1 monoklonální protilátka nebo homolog takové protilátky, jak byly definovány dříve v textu. K výhodným protilátkám a protilátkovým homologům, zejména pro použití v humánní terapii, patří humánní protilátkové homology, humanizované protilátkové homology, chimérické protilátkové homology, protilátkové fragmenty Fab; Fab', F(ab')2 a F(v), monomery nebo dimery těžkého nebo lehkého řetězce protilátky nebo jejich kombinace. Výhodná vazebná agens podle vynálezu jsou monoklonální protilátky proti VLA-4.

* · ·· ·· « · · · ·· • · · · · · · • ·· · ····· • · · » · · · ···· ··* ··· ·4·· ·» ···

2. Malé molekuly jako antagonisté integrinu

Termín malá molekula antagonisty integrinu označuje chemické agens (tj. organickou molekulu) schopné narušit interakci integrin/ligand integrinu, např. tím, že blokuje interakce VLA-4/VCAM vazbou na VLA-4 nebo vazbou na VCAM-1 na povrchu buněk. Tyto malé molekuly se mohou také vázat na příslušné receptory VLA-4 a VCAM-1. Malé molekuly inhibující VLA-4 a VCAM-1 jsou samy peptidy, semipeptidové sloučeniny nebo sloučeniny nepeptidové povahy, jako např. malé organické molekuly, které antagonizují interakce VCAM-l/VLA-4. Malá molekula ve smyslu předkládaného vynálezu nezahrnuje protilátky ani protilátkové homology. Obecně je molekulová hmotnost malých molekul obvykle menší než 1000.

Např. mohou být užity malé molekuly jako jsou oligosacharidy napodobující vazebnou doménu VLA-4 ligandu a pasující do receptorové domény VLA-4 (viz J.J. Devlin et al.; 1990, Science 249: 400-406 (1990); J.K. Scott and G.P. Smith, 1990, Science 249: 386-390, a Patent US 4,833,-092 (Geysen), všechny tyto publikace jsou zahrnuty formou odkazu). Naopak se mohou použít malé molekuly napodobující vazebnou doménu VCAM-1 ligandu a pasující do receptorové domény VCAM-1.

Další příklady malých molekul užitečných podle předkládaného vynálezu lze nalézt v publikaci Komoriya et al. {The Minimal Essential Sequence for a Major Cell TypeSpecific Adhesion Site (CS1) Within Alternatively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronektin Is LeucineAspartic Acid-Valine, J. Biol. Chem., 266 (23), pp. 15075-79 (1991)). Tito autoři identifikovali minimální sekvence aminokyselin nezbytné pro vazbu VLA-4 a syntetizoval různé překrývající se peptidy založené na aminokyselinové sekvenci úseku CS-1 (vazebná doména VLA-4) konkrétních druhů

9

9 fibronektinu. Identifikovali peptid z 8 aminokyselin, GluIle-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr, a také dva menší překrývající se pentapeptidy, Glu-Ile-Leu-Asp-Val a Leu-Asp-Val-Pro-Ser, které vykazují inhibiční aktivitu pro buněčnou adhezi závislou na fibronektinu. Určité větší peptidy obsahující sekvenci LDV byly identifikovány jako aktivní in vivo (T. A. Ferguson et al., Two Integrin Binding Peptides Abrogate T-cell-Mediated Immune Reaction In Vivo, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, pp. 8072-76 (1991); a S. M. Wahi et al. , Synthetic Fibronectin Peptides Suppress Arthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion and Recruitment, J. Clin. Invest., 94, pp. 655-62 (1994)). Byl také popsán cyklický pentapeptid, Arg-Cys-AspTPro-Cys (kde TPro je 4-thioprolin), který inhibuje jak VLA-4 tak VLA-5 adhezi na fibronektin (viz např. D.M. Nowlin et al. A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits Alfa4Betal Integrinmediated Cell Adhesion, J. Biol. Chem., 268(27); pp. 20352-59 (1993); a PCT/US91/04862) . Tento pentapeptid byl založen na tripeptidové sekvenci Arg-Gly-Asp z fibronektinu, která byla známa jako společný motiv v rozpoznávacím místě pro několik proteinů extracelulární matrix. Příklady dalších VLA-4 inhibitorů byly uvedeny např. v Adams et al. Cell Adhesion Inhibitors, PCT/US97/13013, kde jsou sloučeniny obsahující popsány lineární beta-aminokyseliny peptidylové s inhibiční aktivitou na buněčnou adhezi.

Mezinárodní patentové přihlášky WO 94/15958 a WO 92/00995 popsaly cyklické s inhibiční aktivitou patentové přihlášky sloučeniny inhibující peptidy a peptidomimetické sloučeniny na buněčnou adhezi. Mezinárodní WO 93/08823 a WO 92/08464 popisují buněčnou adhezi obsahující guanidinyl, močovinu a thiomočovinu. Patent US č. 5,260,277 popisuje guanidinylovou sloučeninu modulující buněčnou adhezi. Další peptidyloví antagonisté VLA-4 byly popsáni v D. Y. Jackson et al., Potent α4βΐ peptide antagonists as potential anti-inflammatory agens',

J. Med. Chem.. 40, 3359 (1997); H. Shroff et al. , 'Smáli peptide inhibitors of α4β7 mediated MadCAM-1 adhesion to lymphocytes, Bio. Med. Chem. Lett., 1, 2495 (1996); Patent US 5,510,332, PCT Publikace WO98/53814, W097/03094, W097/02289,

WO96/40781, WO96/22966, WO96/20216, WO96/01644, W096/06108 a

WO95/15973.

Takové malé molekuly mohou být připraveny tak, že se syntetizuje množství peptidů (např. délky 5 až 20 aminokyselin), semi-peptididových sloučenin nebo organických sloučenin nepeptidové povahy, a pak se provede screening těchto sloučenin na schopnost inhibovat příslušnou interakci VLA-l/kolagen nebo VLA-4/VCAM-1 (viz Patent US č. 4,833,092, Scott and Smith, Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library, Science, 249, pp. 386-90 (1990), a Devlin et al., Random Peptide Libraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules, Science, 249, pp. 40407 (1990).

B. Metody přípravy homologů anti-integrinových protilátek

Metody přípravy monoklonálních protilátek (mAb), včetně např. antiintegrinových monoklonálních protilátek, jsou dobře známy (viz např. Mendrick et al. 1995, Lab. Invest. 72:367-375 (mAb k myší anti-αΐβΐ and 3^ί-α2βΐ) ; Sonnenberg et al. 1987 J. Biol. Chem. 262:10376-10383 (mAb k myší anti-αββΐ) ; Yao et al. 1996, J Cell Sci 1996 109:3139-50 (mAb k myší anti-<^l) ;

Hemler et al. 1984, J Immunol 132:3011-8 (mAb k humánnímu αϊβΐ) ; Pischel et al. 1987 J Immunol 138:226-33 (mAb k humánnímu α2βΐ); Wayner et al. 1988, J Cell Biol 107:1881-91 (mAb k humánnímu α3β1); Hemler et al. 1987 J Biol Chem

262:11478-85 (mAb k humánnímu α4β1); Wayner et al. 1988 J Cell

Biol 107:1881-91 (mAb k humánnímu α5β1); Sonnenberg et al.

« ·

- 28 1987, J. Biol. Chem. 262:10376-10383 (mAb k humánnímu α6β1); A Wang et al. 1996 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:664-672 (mAb k humánnímu α9βΐ); Davies et al. 1989 J Cell Biol 109:1817-26 (mAb k humánnímu ανβΐ); Sanchez-Madrid et al. 1982, Proč Nati Acad Sci USA 79:748993 (mAb k humánnímu αΏβ2) ; Diamond et al. 1993, J Cell Biol 120:1031-43 (mAb k humánnímu αΜβ2); Stacker et al. 1991 J Immunol 146:648-55 (mAb k humánnímu αΧβ2) ; Van der Vieren et al 1995 Immunity 3:683-90 (mAb k humánnímu αΏβ2) ; Bennett et al. 1983 Proč Nati Acad Sci USA 80:2417-21 (mAb k humánnímu αΙ3^β3) ; Hessle et al. 1984, Differentiation 26:49-54 (mAb k humánnímu αδβ4); Weinacker et al. 1994 J Biol Chem 269:6940-8 (mAb k humánnímu ανβ5) ; Weinacker et al. 1994 J Biol Chem 269:6940-8 (mAb k humánnímu ανβ6); Cerf-Bensussan et al 1992 Eur J Immunol 22:273-7 (mAb k humánnímu αΕβ7); Nishimura et al. 1994 J Biol Chem 269:28708-15 (mAb k humánnímu ανβ8) ; Bossy et al. 1991 EMBO J 10:2375-85 (polyklonální antisérum k humánnímu αδβΐ); Camper et al.1998 J. Biol. Chem. 273:20383-20389 (polyklonální antisérum k humánnímu αΙΟβΙ).

Výhodní antagonisté integrinu podle předkládaného vynálezu mohou být exprimováni z intaktní nebo zkrácené genomické nebo cDNA nebo ze syntetické DNA v prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buňkách. Dimerní proteiny se izolují z kultivačního média a/nebo sestaveny a dimerizovány in vitro, aby vytvořily biologicky aktivní molekulu. Heterodimery se mohou vytvářet in vitro kombinací samostatných odlišných polypeptidových řetězců. Alternativně se mohou heterodimery připravovat v jediné buňce koexpresí nukleových kyselin kódující jednotlivé odlišné polypeptidové řetězce (viz např. WO93/09229 nebo Patent US 5,411,941,

uvedeno několik postupů přípravy rekombinantních heterodimerních proteinů). K výhodným hostitelským buňkám patří, aniž by však byl výčet takto omezen, prokaryota jako

E. coli, nebo eukaryota jako kvasinky, Saccharomyces, hmyzí buňky nebo savčí buňky jako CHO, COS nebo BSC. Odborníkovi je zřejmé, že mohou být užity i jiné buňky.

Např. anti-VLA-4 protilátky mohou být identifikovány imunoprecipitací 1251-značených buněčných lyzátů z buněk exprimujících VLA-4 (viz Sanchez-Madrid et al. 1986, Eur. J. Immunol., 16: 1343-1349 a Hemler et al. 1987, J. Biol. Chem., 262, 1147811485). Protilátky anti-VLA-4 mohou být také identifikovány průtokovou cytometrií, např. měřením flourescenčního barevného značení buněk Ramos inkubovaných protilátkou, o které se domníváme, že rozpoznává VLA-4 (viz Elices et al. , 1990 Cell, 60: 577-584). Lymfocyty užívané k přípravě hybridomových buněk jsou typicky izolovány z imunizovaných savců, jejichž sérum již bylo v takovém screeningovém testu shledáno pozitivní na přítomnost antiVLA-4 protilátek.

Typicky se nesmrtelné buněčné linie (např. linie myelomových buněk) získávají ze stejných savců jako lymfocyty. Výhodnou nesmrtelnou buněčnou linií je linie myších myelomových buněk, které jsou sensitivní na kultivační médium obsahující hypoxantin, aminopterin a thymidin (médium HAT). Typicky jsou tyto HAT-sensitivní myší myelomové buňky fúzovány s myšími splenocyty užitím polyethylenglykolu s molekulovou hmotností 1500 (PEG 1500). Hybridomové buňky vzniklé fúzí jsou selektovány užitím média HAT, které usmrtí nefúzované a neproduktivně fúzované myelomové buňky (nefúzované splenocyty odumírají po několika dnech, protože nejsou transformované). Hybridomy produkující požadovanou protilátku se detekují screeningem supernatantů hybridomových kultur. Tak např.

hybridomy připravené k produkci anti-VLA-4 protilátek se screenují tak, že se testuje supernatant buněčné kultury na secernované protilátky mající schopnost vázat na buněčnou linii exprimující rekombínantní podjednotku alfa4 (viz Elices et al., cit. výše).

Pro produkci anti-VLA-4 protilátkových homologů, kterými jsou intaktní imunoglobuliny, se hybridomové buňky pozitivní v takových testech kultivovaly v takovém médiu, takových podmínkách a po takovou dobu, které byly dostatečné k tomu, aby hybridomové buňky secernovaly monoklonální protilátky do kultivačního média. Techniky tkáňových kultur a kultivační média vhodná pro hybridomové buňky jsou odborníkům známy. Upravený supernatant z hybridomové kultury se odebere a antiVLA-4 protilátky se mohou případně dále purifikovat známými metodami.

Alternativně se požadované protilátky připravují injekcí hybridomových buněk do peritoneální dutiny neimunizované myši. Hybridomové buňky proliferují v peritoneální dutině a secernuji protilátky se hromadí v ascitální tekutině. Protilátky se pak získají odsátím ascitální tekutiny z peritoneální dutiny injekční stříkačkou. Již dříve bylo popsáno několik myších monoklonálních anti-VLA-4 protilátek, viz např. Sanchez-Madrid et al., 1986, viz výše; Hemler et al. , 1987, viz výše; Pulido et al. , 1991, J. Biol. Chem., 266 (16) , 10241-10245); Issekutz and Wykretowicz, 1991, J. Immunol., 147: 109 (TA-2 mAb) . Tyto anti-VLA-4 monoklonální protilátky a další anti-VLA-4 protilátky (viz např. Patent US 5,888,507 - Biogen, lne. Včetně odkazů tam citovaných) schopné rozpoznávat alfa a/nebo beta řetězec VLA-4 jsou užitečné také podle předkládaného vynálezu. Výhodné jsou protilátky anti-VLA-4, které rozpoznávají epitopy alfa4 řetězce VLA-4 podílející se na vazbě ligandů VCAM-1 a fibronektinu (tj.

protilátky, které jsou schopny se vázat na VLA-4 v místě, které se účastní rozpoznání ligandu a tím blokovat vazbu VCAM-1 a fibronektinu). Takové protilátky byly definovány jako protilátky specifické pro epitop B (Bl nebo B2) (Pulido et al. , 1991, viz výše) a jsou to také anti-VLA-4 protilátky podle předkládaného vynálezu.

Dalšími výhodným vazebnými agens podle předkládaného vynálezu, která blokují nebo pokrývají VLA-4 ligand, jsou plně humánní monoklonální protilátkové homology proti VLA-4. Pro jejich přípravu se užívají in vitro instruované (primed) humánní splenocyty, jak popsali Boerner et al. , 1991, J.

Immunol., 147, 86-95. Alternativně mohou být připraveny repertoárovým klonováním, jak popsali Persson et al., 1991,

Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 2432-2436 nebo Huang and

Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227-236. Patent US 5,798,230 (25. srpen 1998, Proces for the preparation of human monoclonal antibodies and their use) popisuje přípravu humánních monoklonálních protilátek z humánních B lymfocytů. Při této metodě jsou humánní B lymfocyty produkující protilátku imortalizovány tím, že jsou infikovány virem Epstein-Barrové, nebo jeho derivátem, který exprimuje jádrový antigen viru Epstein-Barrové 2 (EBNA2). Funkce EBNA2, nutná pro imortalizaci, je později vyřazena, což vede ke zvýšení tvorby protilátek.

V další metodě produkce plně humánních protilátek (Patent US 5,789,650 (4. srpen 1998, Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies) se popisují transgenní zvířata s výjimkou člověka schopná vytvářet heterologní protilátky mající inaktivované endogenní imunoglobulinové geny. Endogenní imunoglobulinové geny jsou suprimovány užitím antisense polynukleotidů a/nebo antisérem namířeným proti endogenním imunoglobulínům. Heterologní protilátky jsou • · » · ·· ·· · • 9·· · · · · · * ·« • · · · 9 · ·

9 9 · · * » · · • ί β · · » «

9999 999 999 9999 99 999 kódovány imunoglobulinovými geny, které se normálně nevyskytují v genomu daného druhu transgenního zvířete. Jedna nebo více sekvencí obsahujících transgen nepřeorganizovaného genu těžkého řetězce heterologního humánního imunoglobulinu se vnese do zvířete, s výjimkou člověka, a tak se vytvoří transgenní zvíře schopné funkčního přeorganizování sekvencí transgenního imunoglobulinu a produkce repertoáru protilátek různých isotypů kódovaných humánními imunoglobulinovými geny. Takové heterologní humánní protilátky jsou produkovány v B lymfocytech, které jsou pak imortalizovány, tj . fúzovány s imortalizovanou buněčnou linií jako jsou např. myelomové buňky, nebo manipulací B lymfocytů jinými technikami, kdy se vytvoří permanentní buněčná linie schopná produkovat monoklonální heterologní plně humánní protilátkové homology.

Velké neimunizované humánní phage display knihovny se také mohou využít pro izolaci protilátek s vysokou afinitou, které lze připravit jakožto humánní terapeutika standardními metodami fágových knihoven a exprese ve fágu (phage display) (viz Vaughan et al, 1996).

Ještě další výhodné vazebné agens podle vynálezu blokující nebo potahující ligandy integrinů je humanizovaný rekombinantní protilátkový homolog mající anti-integrinovou specifitu. Po původních metodách přípravy pravých chimérických protilátek (kde vždy celý konstantní a celý variabilní úsek pocházel z odlišného zdroje) byl v dokumentu EP 0239400 (Winter et al.) popsán nový přístup, kdy jsou protilátky změněny substitucí (uvnitř daného variabilního úseku) úseku určujícího komplementaritu (CDR) jednoho druhu tímto úsekem z jiného druhu. Tento postup lze např. užít k substituci CDR z variabilních úseků domén těžkého a lehkého řetězce humánního Ig alternativními CDR z variabilních úseků příslušných domén myší protilátky. Tyto změněné variabilní

úseky Ig se pak kombinují s konstantními úseky humánního Ig, a tak se připraví protilátky, které jsou z hlediska složení plně humánní, kromě substituovaného úseku myší CDR. Předpokládalo se, že tyto CDR-substituované protilátky budou s mnohem menší pravděpodobností vyvolávat imunitní reakci u lidí ve srovnání se zmíněnými pravými chimérickými protilátkami, nebot CDRsubstituované protilátky obsahují výrazně méně složek jiného než humánního původu. Způsob humanizace monoklonálních protilátek prostřednictvím tzv. roubování CDR byl nazván přestavba (viz Riechmann et al., 1988, Nátuře 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 15341536).

Typicky se úseky určující komplementaritu (CDR) myší protilátky transplantují do odpovídajících úseků humánní protilátky, jelikož právě CDR (tři v těžkém řetězci a tři v lehkém řetězci protilátky) jsou ty úseky myší protilátky, které se váží na specifický antigen. Transplantace CDR se provádí metodami genetického inženýrství, kdy se DNA sekvence pro CDR určí klonováním genových segmentů variabilních (V) úseků těžkých a lehkých řetězců myších protilátek a pak se přenesou do odpovídajících humánních V úseků místně cílenou mutagenezí. V závěrečné fázi tohoto postupu se přidají genové segmenty humánních konstantních úseků požadovaného isotypu (obvykle gama I pro CH a kapa pro CL) a geny humanizovaných těžkých a lehkých řetězců jsou koexprimovány v savčích buňkách, kde produkují rozpustné humanizované protilátky.

Přenos myších CDR do humánních protilátek poskytuje těmto protilátkám antigenně vazebné vlastnosti původních myších protilátek. Šest úseků CDR v myší protilátce je umístěno strukturně ve V úseku rámcové oblasti. Důvodem, proč je roubování CDR úspěšné, je to, že rámcové oblasti myších a humánních protilátek mají velmi podobné 3-D struktury s podobnými body připojení CDR, takže CDR mohou být snadno zaměněny. Takové humanizované protilátkové homology lze připravit např. jak popsali Jones et al., 1986, Nátuře 321, 522-525; Riechmann, 1988, Nátuře 332, 323-327; Queen et al. , 1989, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 86, 10029; and Orlandi et al., 1989, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 86, 3833.

Nicméně se má za to, že určité aminokyseliny uvnitř rámcové oblasti interaguji s CDR a tak ovlivňují celkovou vazebnou afinitu k antigenu. Přímý přenos CDR z myší protilátky s cílem připravit rekombinantní humanizovanou protilátku bez jakékoliv modifikace V úseků rámcové oblasti humánní protilátky často vede k částečné nebo i úplné ztrátě vazebné afinity. V mnoha případech byla kritickým momentem záměna aminokyselinových zbytků v rámcové oblasti akceptorové protilátky, aby se získala protilátka s vazebnou afinitou.

Queen et al. , 1989 (viz výše) a dokument WO 90/07861 (Protein Design Labs) popsali přípravu humanizované protilátky, která obsahuje modifikované zbytky v rámcové oblasti akceptorové protilátky, tím, že se kombinovaly úseky CDR z myší monoklonální protilátky (anti-Tac) s konstantními úseky a rámcovou oblastí humánního imunoglobulinu. Bylo tak ukázáno jedno řešení problému ztráty vazebné afinity, ke které často dochází při přímém přenosu CDR bez příslušné modifikace zbytků V úseku humánní rámcové oblasti, přičemž toto řešení obsahuje dva základní kroky. V prvním krou se pomocí počítačové analýzy vyberou V úseky humánní rámcové oblasti, které mají optimální homologii proteinové sekvence s V úsekem rámcové oblasti původní myší protilátky, v popisovaném případě monoklonální protilátky anti-Tac. V druhém kroku se pomocí počítače modeluje terciární struktura V úseků myší protilátky, aby se vizualizovaly aminokyselinové zbytky rámcové oblasti protilátky, které by mohly interagovat s myšími CDR, a tyto aminokyselinové zbytky z myší sekvence jsou přeneseny na • · «· ·· «··

homologní humánní rámcový úsek (viz patenty US 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089 a 5,530,101 (Protein Design Labs).

Může se také využít odlišný postup (Tempest et al.,1991, Biotechnology 9, 266-271) a využít jako standard V úseky z rámcové oblasti z těžkých a lehkých řetězců NEWM a REI pro roubování CDR bez radikálního vnášení aminokyselinových zbytků myších sekvencí. Výhodou postupu konstrukce humanizovaných protilátek založených na NEWM a REI, jak ho popsali Tempest et al. , je to, že trojrozměrné struktury variabilních úseků NEWM a REI jsou známy z rentgenové krystalografie a je tudíž možné modelovat specifické interakce mezi CDR a aminokyselinovými zbytky V úseku rámcové oblasti.

Bez ohledu na použitý přístup příklady počátečních homologů humanizovaných protilátek dosud připravených ukázaly, že taková příprava není jednoduchý proces. Avšak i když uznáme, že nějaké změny v rámci protilátky jsou nutné, není možné na základě dostupných znalostí a stavu techniky předpovědět, které aminokyselinové zbytky, pokud nějaké, z rámcového úseku protilátky mají být změněny, aby byla získána funkční humanizovaná rekombinantní protilátka s požadovanou specificitou. Dosavadní výsledky ukazují, že změny nutné k zachování specificity a afinity jsou většinou jedinečné pro danou protilátku a nelze je předvídat na základě humanizace jiné protilátky.

K antagonistúm integrinu obsahujícího podjednotku alfa4 užitečným podle předkládaného vynálezu patří chimérické a humanizované rekombinantní protilátkové homology (tj . intaktní imunoglobuliny a jejich části) se specificitou B epitopů, které byly připraveny a jsou popsány v Patentu US 5,932,214 (monoklonální HPl/2). Výchozím materiálem pro přípravu chimérických (myší variabilní - humánní konstantní) a humanizovaných homologů anti-integrinových protilátek jsou « · « myší monoklonální anti-integrinové protilátky jak byly dříve popsány, monoklonální anti-integrinové protilátky komerčně dostupné (např. HP2/1, Amae International; lne., Westbrook, Maine), nebo monoklonální anti-integrinové protilátky výhodné popsány

Athéna připravené podle předkládaného vynálezu. Další humanizované anti-VLA4 protilátkové homology byly v Mezinárodní patentové přihlášce PCT/US95/01219,

Neurosciences, Inc.(27. červenec 1995) a Patentu US 5,840,299 (publikace vloženy formou odkazu). Tyto humanizované anti-VLA4 protilátky obsahují humanizovaný lehký řetězec a humanizovaný těžká řetězec. Humanizovaný lehký řetězec obsahuje tři úseky určující komplementaritu (CDR1, CDR2 a CDR3) mající aminokyselinové sekvence z odpovídajících úseků určujících komplementaritu z myšího lehkého řetězce imunoglobulinu 21.6 a rámec variabilního úseku z rámce variabilního úseku humánního lehkého kapa řetězce, s výjimkou alespoň jedné pozice, která aminokyselinou jako je přítomna v rámcovém úseku variabilní oblasti lehkého imunoglobulinu 21.6. Humanizovaný těžký řetězec obsahuje tři úseky určující komplementaritu (CDR1, CDR2 a CDR3) mající aminokyselinové sekvence z odpovídajících úseků určujících komplementaritu z myšího těžkého řetězce imunoglobulinu 21.6 a rámec variabilního úseku z rámce variabilního úseku humánního těžkého řetězce, s výjimkou alespoň jedné pozice, kde je pozice obsazena stejnou aminokyselinou jaká je přítomna v ekvivalentní pozici v rámcovém úseku variabilní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu 21.6.

Ve způsobech podle předkládaného vynálezu se užívají antagonistické molekuly, kódované sekvencemi nukleových kyselin, které hybridizují za stringentních podmínek se sekvencemi nukleových kyselin kódujících protilátky namířené je obsazena v ekvivalentní stejnou pozici řetězce proti integrinům obsahujícím podjednotku alfa4. NApř. antagonista podle předkládaného vynálezu je protein, jemuž odpovídající nukleová kyselina hybridizuje za podmínek vysoké stringence s jednou nebo více sekvencemi nukleových kyselin popsaných v tabulce 6 v Patentu US 5,840,299, nebo sekvencí komplementární s jednou nebo více z těchto sekvencí. Antagonista může být také protein, jehož nukleová kyselina hybridizuje za podmínek vysoké stringence s nukleovou kyselinou kódující sekvenci id. č. 2 nebo sekvenci id. č. 4 z Patentu US 5,932,214. Dále antagonista je i protein, jehož nukleová kyselina hybridizuje hybridizuje za podmínek vysoké stringence s nukleovou kyselinou kódující variabilní doménu protilátky produkované buněčnou linií ATCC CRL 11175.

Alternativně je antagonistou podle předkládaného vynálezu protein, jemuž odpovídající nukleová kyselina hybridizuje za podmínek nízké stringence s jednou nebo více sekvencemi nukleových kyselin popsaných v tabulce 6 v Patentu US 5,840,299, nebo sekvencí komplementární s jednou nebo více z těchto sekvencí. Antagonista může být také protein, jehož nukleová kyselina hybridizuje za podmínek nízké stringence s nukleovou kyselinou kódující sekvenci id. č. 2 nebo sekvenci id. č. 4 z Patentu US 5,932,214. Dále antagonista je i protein, jehož nukleová kyselina hybridizuje za podmínek nízké stringence s nukleovou kyselinou kódující variabilní doménu protilátky produkované buněčnou linií ATCC CRL 11175.

C. Příprava fragmentů a analogů

Fragmenty izolovaných antagonistů alfa4 integrinů (tj . fragmenty protilátkových homologů zde popsaných) lze také účinně připravovat rekombinantními metodami, proteolytickým štěpením nebo chemickou syntézou, a sice užitím postupů, které jsou odborníkům známy. Při užití rekombinantních technik se

vnitřní nebo koncové fragmenty polypeptidů připravují odstraněním jednoho nebo více nukleotidů z jednoho konce (v případě terminálního fragmentu) nebo obou konců (v případě vnitřního fragmentu) z DNA sekvence kódující izolovaný polypeptid. Exprese takto mutované DNA poskytuje polypeptidové fragmenty. Štěpení endonukleázami, které okusují konce, může také poskytnout DNA kódující spektrum různých fragmentů. DNA kódující fragmenty proteinu mohou být připraveny také náhodným (nespecifickým) stříháním DNA nebo štěpením restriktázami nebo kombinací obou postupů. Proteinové fragmenty také mohou být připraveny přímo z intaktních proteinů. Peptidy mohou být specificky štěpeny proteolytickými enzymy, ke kterým patří (přičemž výčet není omezující) plasmin, trombin, trypsin, chymotrypsin a pepsin. Každý z těchto enzymů je specifický pro určitý typ peptidové vazby, kterou štěpí. Trypsin katalyzuje hydrolýzu peptidových vazeb, kde je karbonylová skupina z bazické aminokyseliny, obvykle argininu nebo lysinu. Pepsin a chymotrypsin katalyzují hydrolýzu peptidových vazeb z aromatických aminokyselin jako je tryptofan, tyrosin a fenylalanin. Alternativní sady fragmentů se připraví tím, že se která jsou citlivá k proteolytickým enzymům. Tak např. ε-aminoskupiny lysinu s ethyltrifluorothioacetátem bazickém roztoku vede k zablokování aminokyselinových zbytků, k nimž přilehlá peptidová vazba již dále není hydrolyticky štěpitelné trypsinem. Proteiny mohou být modifikovány, aby vytvářely peptidové vazby, které jsou citlivé k proteolytickým enzymům. Např. alkylace cysteinových zbytků β-haloethylaminy poskytuje peptidové vazby, které nejsou hydrolyzovány trypsinem (Lindley, (1956) Nátuře 178, 647) . Navíc mohou být užita chemická činidla, která štěpí peptidové řetězce v místech specifických zbytků. Např. bromkyan štěpí peptidy naštěpených proteinových zabrání štěpení v místech, reakce v mírné v methioninovém zbytku (Gross and Witkip, (1961) J. Am. Chem:

Soc. 83, 1510). Takže působením různých modifikujících proteolytických enzymů a/nebo činidel na proteiny mohou být proteiny rozloženy na fragmenty požadovaných délek, které se nepřekrývají, nebo na překrývající se fragmenty požadovaných délek.

Fragmenty mohou být také syntetizovány chemicky užitím metod, které jsou odborníkům známy, jako je např. Merrifieldova chemická syntéza na pevné fázi užívající Fmoc nebo t-Boc (viz Merrifield, Recent Progress in Hormone Research 23:451(1967).

Příklady metod známých ze stavu techniky, které umožňují přípravu a testování fragmentů a analogů, budou diskutovány dále. Tyto nebo analogické metody lze užít pro příparvu a screening fragmentů a analogů izolovaných antagonistů integrinu alfa4, které mají biologickou aktivitu. Příklad metody pro testování toho, zda fragmenty a analogy antagonistů integrinu obsahujících podjednotku alfa4 mají biologickou aktivitu, je uveden v sekci IV a v příkladech.

kombinací chemických

D. Příprava změněných DNA sekvencí a Peptidových sekvencí: náhodné metody

Varianty aminokyselinových sekvencí proteinů mohou být připraveny náhodnou mutagenezí DNA, která kóduje protein nebo jeho určitou část. K užitečným metodám patří PCR mutageneze a saturační mutageneze. Knihovna náhodných variant aminokyselinových sekvencí může být také připravena užitím syntézy sady degenerovaných oligonukleotidových sekvencí. Metody přípravy variant aminokyselinových sekvencí daného proteinu užitím změněných DNA sekvencí nebo peptidových sekvencí jsou odborníkům dobře známy. Následující příklady jsou uvedeny pro ilustraci těchto postupů a předkládaný

vynález nijak neomezují. Odborníkovi je jasné, že pro tento účel lze užít i jiné metody.

PCR Mutageneze:

viz např. Leung et aL, (1989) Technique 1, 11-15. Saturační mutageneze:

Jedna z metod je obecně popsána v Mayers et al. , (1989)

Science 229, 242.

Mutageneze s degenerovanými oligonukleotidy:

Viz např.	Harang, S.A.,	(1983) Tetrahedron 39, 3; Itakura
et al., (1984)	Ann. Rev. Biochem. 53	i, 323 and	Itakura et al.,
Rekombinantní	DNA, Proč.	3rd	Cleveland	Symposium on
Macromolecules,	pp. 273-289	(A.G.	Walton,	ed.), Elsevier,

Amsterdam,1981.

E: Příprava změněných sekvencí DNA a peptidových sekvencí: Přímé metody

Nenáhodná neboli cílená mutageneze poskytuje specifické sekvence nebo mutace ve specifických částech polynukleotidových sekvencí, které kódující izolované polypeptidy, čímž vznikají varianty, které zahrnují delece inzerce nebo substituce aminokyselinových zbytků známé aminokyselinové sekvence izolovaného polypeptidu. Mutovaná místa mohou být modifikována individuálně nebo v sériích např. tím, že se (1) substituuje se nejdříve konzervativními aminokyselinami a pak se provádějí radikálnější změny v závislosti na získaných výsledcích, (2) provede delece cílového aminokyselinového zbytku, nebo (3) do sousedství vybraného místa se vloží aminokyselinové zbytky stejné nebo odlišné třídy, nebo se kombinují kroky 1 až 3.

Je jasné, že metody místně cílené mutageneze jsou jedním způsobem, jak vnést do dané polypeptidové sekvence N-koncový

0 0 0 0 0 0

0000 000 000 0000 «0 000 cystein (nebo jeho funkční ekvivalent), aby se připravilo místo pro připojení hydrofobní skupiny.

Alaninová skenovací mutageneze:

viz Cunningham and Wells, (1989) Science 244, 1081-1085.

Mutageneze zprostředkovaná oligonukleotidy:

Viz např. Adelman et al., (1983) DNA 2, 183.

Kazetová mutageneze:

Viz Wells et al., (1985) Gene 34, 315.

Kombinační mutageneze:

Viz např. Ladner et al., WO 88/06630 Strategie Fág Display

Viz např. přehledná publikace Marks et al., J. Biol. Chemistry: 267 16007-16010 (1992).

F. další varianty antagonistů integrinů

Varianty se mohou lišit od ostatních antagonistů integrinů zde opsaných v aminokyselinové sekvenci nebo způsobem, který se netýká sekvence, a nebo oběma způsoby. Nejvýhodnější polypeptidy podle vynálezu obsahují modifikace jiné než sekvenční (nesekvenční) povahy, ke kterým patří in vivo nebo in vitro chemická derivátizace (např. jejich N-konce), a také případně změny acetylace, metylace, fosforylace, amidace, karboxylace nebo glykosylace.

K dalším analogům patří proteiny nebo jejich biologicky aktivní fragmenty, jejichž sekvence se liší od sekvencí popsaných v patentech US 5,840,299, 5,888,507 a 5,932,214 (zahrnuty formou odkazu) nebo v mezinárodní přihlášce PCT US/94/00266 jednou nebo více substitucemi konzervativní nebo nekonzervativní aminokyseliny, nebo delecemi nebo inzercemi, které nenarušují biologickou aktivitu izolovaného proteinu. Ke konzervativním substitucím typicky patří substituce jedné aminokyseliny jinou aminokyselinou s podobnými vlastnostmi, jako např. substituce v rámci následujících skupin aminokyselin: valin, alanin a glycin; leucin a isoleucin; asparagová a glutamová kyselina; asparagin a glutamin; serin a threonin; lysin a arginin; a fenylalanin a tyrosin. Ke skupině nepolárních hydrofobních aminokyselin patří alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan, a methionin. Skupina polárních neutrálních aminokyselin obsahuje glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin, a glutamin. Ke skupině pozitivně nabitých (bazických) aminokyselin patří arginin, lysin, a histidin. Ke skupině negativně nabitých (kyselých) aminokyselin patří asparagová a glutamová kyselina. Další konzervativní záměny jsou odborníkovi ihned zřejmé. Tak např. aminokyselinu alanin lze konzervativně substituovat kteroukoliv aminokyselinou ze skupiny obsahující D-alanin, glycin, beta-alanin, L-cystein, a D-cystein. Lysin lze nahradit kteroukoliv aminokyselinou ze skupiny obsahující D-lysin, arginin, D-arginin, homoarginin, methionin, D-methionin, ornithin a D-ornithin.

Dalšími analogy vhodnými pro předkládaný vynález jsou analogy modifikované tak, aby byla zvýšena stabilita peptidů. Takové analogy obsahují např. jednu nebo více nepeptidových vazeb (které nahrazují původní peptidové vazby) v peptidové sekvenci. Patří sem také: analogy obsahující aminokyselinové zbytky jiné než v přírodě se vyskytující L-aminokyseliny, jako jsou např. D-aminokyseliny nebo aminokyseliny nevyskytující se v přírodě nebo syntetické aminokyseliny jako jsou např. beta nebo gama aminokyseliny nebo cyklické analogy aminokyselin. Inkorporace D-aminokyseliny místo původní L-aminokyseliny v izolovaném polypeptidu může zvýšit jeho rezistenci k proteázám (viz Patent US 5,219,990).

K výhodným protilátkovým homologům patří aminokyselinové sekvence, které mají alespoň 60%, 80%, 90%, 95%, 98% nebo 99% homologii s aminokyselinovou sekvencí protilátky PS/2 (viz příklady) nebo obsahují aminokyselinovou sekvenci s alespoň 60%, 80%, 90%, 95%, 98% nebo 99% homologii s aminokyselinovými sekvencemi popsanými v Patentu US 5,840,299 (sekvence id. č. 15 - variabilní úsek lehkého řetězce, nebo sekvence id. č. 17 variabilní úsek těžkého řetězce) nebo v Patentu US

5,932,214 (sekvence id. č. 2 nebo 4) a v mezinárodní patentové přihlášce WO94/16094 (sekvence vyskytující se v anti-VLA4 protilátce produkované uloženou buněčnou linií ATCC CRL 11175).

G. Formy polymerových konjugátů

Podle předkládaného vynálezu je možné užít jedinou molekulu polymeru pro konjugaci a antagonistou integrinu alfal nebo alfa4, avšak je možné připojit i více než jednu molekulu polymeru. Konjugované přípravky antagonisty integrinu alfa4 podle vynálezu jsou užitečné jak pro in vivo tak i jiné než in vivo aplikace. Navíc je možné, aby konjugované polymery užívaly ještě další jakékoliv jiné další kupony, části nebo další konjugované molekuly podle finálního účelu zvolené aplikace. Tak např. v některých aplikacích může být užitečné kovalentně navázat na polymer funkční skupinu, která poskytuje polymeru rezistenci vůči degradaci UV-zářením, nebo antioxidační vlastnosti nebo jiné vlastnosti. Dalším příkladem aplikace může být výhodná funkcionalizace polymeru, aby byl reaktivní a mohl se zesítěním navázat na molekulu léčiva, čímž se mohou zlepšit různé vlastnosti celkového konjugovaného materiálu. Tudíž polymer může obsahovat jakékoliv funkční skupiny, opakující se skupiny, vazby nebo jiné základní struktury, které nevylučují jeho účinnou konjugaci *

s přípravkem antagonisty integrinu alfa4 pro zamýšlený účel.

Další výhody předkládaného vynálezu budou patrné z dalšího popisu a z patentových nároků.

Příklady polymerů, které lze výhodně užít v předkládaném vynálezu pro dosažení požadovaných vlastností přípravků jsou popsány dále na příkladu některých reakčních schémat. V kovalentně vázaných konjugátech antagonista/polymer může být polymer funkcionalizován a pak navázán na volné aminoskupiny antagonisty, čímž se vytvoří labilní vazby.

Antagonisté integrinu obsahujících podjednotku alfa4 nebo alfal jsou nevýhodněji konjugováni prostřednictvím koncových reaktivních skupin na polymer, i když konjugace se může také větvit z vnitřních, tedy nekoncových reaktivních skupin. Polymer s reaktivní skupinou (skupinami) je označován jako aktivovaný polymer. Reaktivní skupina selektivně reaguje s volnou aminoskupinou nebo jinou reaktivní skupinou v molekule antagonisty. Aktivovaný polymer se nechá reagovat tak, že k napojení dojde na jakékoliv dostupné aminoskupině antagonisty integrinu jako je např. alfa aminoskupina nebo epsilon-aminoskupina lysinu. Volné karboxylové skupiny, vhodně aktivované karbonylové skupiny, guanidylová skupina, oxidované sacharidy a merkaptoskupiny antagonisty integrinu alfa4 (pokud jsou dostupné) mohou být také využity jako místa připojení.

I když polymer může být připojen kdekoliv na molekulu antagonisty integrinu, výhodné místo pro navázání polymeru na antagonistu integrinu (zejména pokud jde o protein) je N-konec antagonisty integrinu. Sekundární místo (místa) je na nebo v blízkosti C-konce a nebo prostřednictvím cukerných skupin (pokud nějaké v molekule jsou). Takže předkládaný vynález zahrnuje: (i) konjugáty antagonistů integrinu alfal a alfa4 s N-koncově navázaným polymerem, (ii) konjugáty antagonistů integrinu alfal a alfa4 s C-koncově navázaným polymerem, ···« ··· polymeru. selektivní (III) konjugáty spojené prostřednictvím sacharidu, a také (IV) konjugáty antagonistú integrinu alfal a alfa4 s C-koncově, N-koncově i přes cukr navázaným polymerem.

Obecně se užívá 1,0 až 10 mol aktivovaného polymeru na 1 mol antagonisty, v závislosti na koncentraci antagonisty. Konečné množství je rovnováhou mezi maximalizací rozsahu reakce a minimalizací nespecifických modifikací produktu, a současně určením reakce, která udrží optimální aktivitu, a přitom bude podle možností optimální poločas antagonisty. Výhodně je zachováno alespoň 50 % biologické aktivity antagonisty, nejvýhodněji je zachováno 100 %.

Reakce se může provádět jakýmkoliv odborníkovi známým způsobem vhodným pro reakci biologicky aktivního materiálu s inertními polymery. Obecně takový způsob zahrnuje přípravu aktivovaného polymeru (který má alespoň jednu koncovou hydroxylovou skupinu) a pak reakci antagonisty s aktivovaným polymerem, čímž vznikne rozpustný protein vhodný pro formulaci do přípravku. Tato modifikační reakce se provádějí různými metodami v jednom nebo více krocích.

Jak bylo již zmíněno výše, v některých provedeních vynálezu se užívá N-konec antagonisty integrinu pro připojení k Vhodné konvenční metody jsou k dispozici pro přípravu N-koncově modifikovaných antagonistú integrinu alfal nebo alfa4. Příkladem jedné takové metody je metoda redukční alkylace, kdy se využívá odlišné reaktivity různých typů primárních aminoskupin (epsilon aminoskupiny na lysinu oproti aminoskupinám na N-konci methioninu) přístupných pro derivatizaci na vhodných antagonistech integrinu. Za vhodných selekčních podmínek lze dosáhnout v podstatě selektivní derivátizace vhodného antagonisty integrinu na jeho N-konci polymerem obsahujícím karbonylovou skupinu. Reakce se provádí při pH, které dovoluje využít výhodu rozdílných pKa pro epsilon-aminoskupiny lysinových zbytků a alfa-aminoskupinu

N-koncového zbytku v molekule antagonisty integrinu. Tento způsob chemické modifikace je odborníkům dobře znám.

Strategie navázání polyalkylenglykolových polymerů jako je např. PEG na C-konec antagonistů integrinu alfal nebo alfa4 (např. proteinů) může být buďto chemické navázání nebo genetická manipulace místa, které může být využito k napojení polymerové části. Tak např. inkorporace Cys do místa v blízkosti nebo na C-konci proteinu umožní specifickou modifikaci užitím maleimidem, vinylsulfonem nebo haloacetátem aktivovaných derivátů polyalkylenglykolu (např. PEG) , které jsou odborníkům známy. Tyto deriváty se mohou užít pro specifickou modifikaci geneticky vnesených cysteinových zbytků díky vysoké selektivitě těchto reagens pro Cys. K dalším strategiím, představujícím alternativy pro modifikaci C-konce antagonisty integrinu podle vynálezu patří inkorporace histidové značky (tag), která pak může být zacílena (Fancy et aL, (1996) Chem. & Biol. 3: 551) glykosylačních míst v proteinu.

Metody zaměřování cukrů jakožto modifikace jsou také dobře známy a je tedy pravděpodobné, že polyalkylenglykolové polymery mohou být přímo a specificky přidány k cukrům (pokud takové jsou) na molekule antagonisty integrinu, které byly aktivovány oxidací. Např. polyethylenglykol-hydrazid může být připraven ve formě relativně stabilních hydrazonových řetězců kondenzací Tato vlastnost byla využita pro prostřednictvím nebo dalších míst chemické s aldehydy modifikaci a ketony, proteinů oxidovaných oligosacharidových řetězců (viz Andresz, H. et al., (1978),

Macromol. Chem. 179: 301). Konkrétně působením nitritu na PEGkarboxymethylhydrazid se připraví PEG-karboxymethylazid, což je elektrofilně aktivní skupina reagující s aminoskupinami.

*» * » ·· ·» • · · · ··« · · ·· • « · · » · • ·· · ·»·· • · · · «4 ···· ··· ··« <»··· «« «

Tato reakce může být využita pro přípravu polyalkylenglykolem modifikovaných proteinů (viz Patent US 4,101,380 a 4,179,337).

Pro vytvoření přípravků obsahujících multivalentní antagonisty integrinu alfal nebo alfa4 lze také užít odborníkům známého postupu zprostředkovaného thiolovým linkerem (spojkou) pro zesítění proteinů. Konkrétně reaktivní aldehydové skupiny na sacharidových částech molekuly se vytvoří pomoc jodistanu sodného, vytvoří se cystaminové konjugáty prostřednictvím těchto aldehydů a indukuje se zesítění prostřednictvím thiolových skupin na cystaminech (viz Pepinsky, B. et al. , (1991), J. Biol. Chem., 266: 18244-18249 and Chen, L.L: et al. , (1991) J. Biol. Chem., 266: 1823718243). Tudíž je tento chemický postup také vhodný pro modifikace polyalkylenglykolovými polymery, kdy linker je inkorporován do sacharidu a polyalkylenglykolový polymer je připojen k linkeru. I když linkery obsahující aminothiol nebo hydrazin umožňují připojení jedné polymerové skupiny, struktura linkeru může být měněna tak, aby bylo možné připojit více polymerů a/nebo byla změněna prostorová orientace polymeru vzhledem k molekule antagonisty integrinu.

V praktickém provedení vynálezu se výhodně do požadovaných polymerních systémů inkorporují polyalkylenglykolové zbytky alkylpolyalkylenglykolů s alkylovou skupinou obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, výhodně polyethylenglykol (PEG), nebo póly(oxy)alkylenglykolové zbytky z takových glykolů. Takže polymer, ke kterému je protein připojen, může být homopolymer polyethylenlykolu (PEG) nebo je to polyoxyethylovaný polyol, v každém případě za předpokladu, že jde o polymer rozpustný ve vodě při teplotě místnosti. K příkladům takových polymerů, které však nejsou omezující, patří homopolymery polyalkylenoxidu jako je PEG nebo polypropylenglykoly, polyoxyethylenované glykoly, jejich • · · · · · · ···« ··· ··· «·*· »1 9··

- 48 kopolymery a blokové kopolymery, za předpokladu, že blokové kopolymery si uchovávají rozpustnost ve vodě. K příkladům polyoxyethylovaných polyolů patří polyoxyethylovaný glycerol, polyoxyethylovaný sorbitol, polyoxyethylovaná glukóza apod. Glycerolová kostra polyoxyethylovaného glycerolu je shodná s kostrou vyskytující se v přírodě, např. v mono-, di- a triglyceridech živočichů a člověka. Tudíž takto rozvětvená v těle rozpoznávána jako cizorodé kostra by činidlo.

Jako dextran, neměla být alternativa k polyalkylenoxidům polyvinylpyrrolidony, polyakrylamidy, polyvinylalkoholy, polymery založené na sacharidech a další. Odborníkovi je zřejmé, že výše uvedené výčty jsou pouze ilustrativní a že vynález zahrnuje jakékoliv další polymerní materiály popsaných vlastností.

Polymer nemusí mít nějakou konkrétní molekulovou hmotnost, ale je výhodné, když molekulová hmotnost leží v rozmezí 300 až 100 000, výhodněji 10 000 až 40 000. Zejména velikosti 20 000 a více jsou výhodné pro zabránění ztrát proteinů při filtraci v ledvinách.

Derivatizace polyalkylenglykolu má řadu výhodných vlastností pro formulaci konjugátů antagonisty integrinu s polymerem podle vynálezu, které jsou spojeny s následujícími vlastnostmi polyalkylenglykolových derivátů: mají lepší rozpustnost ve vodě, a současně nevyvolávají antigenní nebo imunogenní reakci, vysoký stupeň biologické kompatibility, absence biologické degradace polyalkylen-glykolových derivátů in vivo a snadné vylučování z živých organismů.

Navíc v j iném aspektu předkládaného vynálezu může být použit antagonista integrinu alfal nebo alfa4 kovalentně navázaný na polymerovou složku, kde povaha konjugátu je taková, že obsahuje štěpítelné kovalentní chemické vazby. To

· · •	9 • ·	• ·· ·· « · • 9	·· • · • *	• • · •
•	•	• ·	• ·	•
··♦·	>·«

pak umožňuje řídit časový průběh odštěpení polymeru od antagonisty integrinu. Kovalentní vazba mezi léčivem, tj. antagonistou integrinu, a polymerem může být štěpena chemickou nebo enzymatickou reakcí. Produkt polymer-antagonista integrinu si přitom uchovává přijatelnou hladinu aktivity. Současně jsou přítomny v konjugovaném polymeru části polyethylenglykolu, které poskytnou produktu polymerantagonista integrinu vysokou rozpustnost ve vodě a prodlouženou dobu cirkulace v krevním oběhu. V důsledku těchto zlepšených vlastností lze podle vynálezu uvažovat při in vivo aplikacích o parenterálním, nazálním nebo perorální podávání obou druhů aktivních molekul polymer-antagonista integrinu, a po hydrolytickém štěpení lze očekávat dobrou biologickou dostupnost antagonisty integrinu samotného.

Odborníkovi je jasné, že zde popsaná reakční schémata jsou jen pro ilustrativní účely a nejsou nijak omezující vzhledem k reakcím a strukturám, které se mohou použít pro modifikace antagonistů integrinu alfal nebo alfa4, aby bylo dosaženo dobré rozpustnosti, stability a afinity k buněčné membráně při parenterálním a perorálním podávání. Aktivita a stabilita těchto konjugátů antagonistů integrinu podle předkládaného vynálezu může do jisté míry kolísat, když se použijí polymery s různou velikostí molekuly. Rozpustnost konjugátů se může měnit v závislosti na podílu a velikosti polyethylenglykolového fragmentu vloženého do polymerního přípravku.

III. Využití vynálezu

Množství účinné látky, které se kombinuje s nosičovým materiálem do jednotkové lékové formy závisí na tom, jaký pacient má být léčen a jaký je zvolen způsob podávání. Je třeba však rozumět, že konkrétní dávky a léčebný režim • 9 · 9 9 9 9 9 • i 9 9 99*9 9 • 9 9 9 · 9 9 ···· 999 999 9999 99 999

- 50 určitého pacienta jsou závislé na mnoha faktorech, jako je např. aktivita konkrétní použité účinné látky, věk, hmotnost, pohlaví a aktuální stav pacienta, dieta, doba podávání, rychlost vylučování, kombinace s léčivy, závažnost léčeného onemocnění a názor ošetřujícího lékaře. Množství účinné látky bude také záviset na profylaktických nebo léčivých přípravcích, které jsou podávány současně.

Léčení přípravkem podle vynálezu spočívá v tom, že se pacientovi podává účinné množství antagonisty podle vynálezu. Užívají se takové dávky, které představují účinné, netoxické množství. Odborník je schopen užitím rutinních postupů určit optimální dávky pro léčení konkrétní nemoci.

Farmaceutické přípravky

Přípravky obsahující antagonistů podle vynálezu se podávají výhodně parenterálně. Termín parenterální podávání zahrnuje podávání subkutánní, intravenózní, intramuskulární, infra-artikulární, intrasynoviální, intrasternální, intrathekální, intrahepatickou a intrakraniální injekcí nebo injekcí přímo do léze nebo infúzní podávání. Požadovaná dávka je podána pacientovi jedenkrát nebo vícekrát za den intravenozně, perorálně, rektálně, parenterálně, intranazálně, topicky nebo inhalací. Požadovaná dávka může být také podána kontinuální intravenózní infúzí.

Protilátkové homology se výhodně podávají jakožto sterilní farmaceutické přípravky obsahující farmaceuticky přijatelný nosič, což je kterýkoliv ze známých nosičů jako je voda, solný roztok, fosfátem pufrovaný solný roztok, dextróza, glycerol, ethanol a další, nebo jejich kombinace. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu se mohou užít ve formě farmaceuticky přijatelných solí odvozených z anorganických nebo organických kyselin a bází. K příkladům takových kyselých

• ♦		1	•	Φ· *·
•	•
	«>	•	•	• «	♦
«		• ·	«	• · *	•
•		•	•	• ·	•
• ··	•	• · ·				e ·

solí patří acetát, adipát, alginát, aspartát, benzoát, benzenesulfonát, bisulfát, butyrát, citrát, kamforát, kamforsulfonát, cyklopentanpropionát, diglukonát, dodecylsulfát, ethansulfonát, fumarát, glukoheptanoát, glycerofosfát, hemisulfát, heptanoát, hexanoát, hydrochlorid, hydrobromid, hydrojodid, 2-hydroxyethansulfonát, laktát, maleát, methansulfonát, 2-naftalensulfonát, nikotinát, oxalát, pamoát, pektinát, persulfát, 3-fenylpropionát, pikrát, pivalát, propionát, sukcinát, tartrát, thiokyanát, tosylát a undekanoát. K bazickým solím patří amoniové soli, soli alkalických kovů, jak jsou sodné a draselné soli, soli kovů alkalických zemin, jako jsou vápenaté a hořečnaté soli, soli s organickými bázemi jako jsou např. dicyklohexylaminové soli, N-methyl-D-glukamin, tris(hydroxymethyl)methylamin a soli a aminokyselinami jako je arginin, lysin atd. Také bazické skupiny obsahující dusík mohou být kvarterizovány činidly jako jsou halogenidy nižších alkylů, jako jsou methyl-, ethyl-, propyl- a butylchlorid, -bromid a -jodid; dialkylsulfáty jako je dimethyl-, diethyl, dibutyl a diamylsulfát, halogenidy s delším řetězcem jako jsou decyl-, lauryl-, myristyl- a stearyl chlorid, -bromid a jodid, aralkylhalogenidy jako jsou benzyl- a fenylethylbromid a další. Tak se získají přípravky rozpustné nebo dispergovatelné ve vodě nebo v oleji,

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu obsahují kteroukoliv ze sloučenin podle vynálezu nebo její farmaceuticky přijatelný derivát, společně s jakýmkoliv farmaceuticky přijatelným nosičem. Termín nosič v popisu vynálezu označuje farmaceuticky přijatelná adjuvans a vehikula. K farmaceuticky přijatelným nosičům vhodným pro provedení předkládaného vynálezu patří (avšak výčet není omezující) iontoměniče, oxid hlinitý, stearát hlinitý, lecitin, sérové proteiny, jako je např. humánní sérový

- 52 « »

albumin, pufrovací látky jak jsou např. fosfáty; glycin, kyselina sorbová, sorbát draselný, částečné glyceridové směsi rostlinných nasycených mastných kyselin, vody, solí nebo elektrolytů jak je např. protaminsulfát, hydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan draselný, chlorid sodný, zinečnaté soli, koloidní oxid křemičitý, křemičitan hořečnatý, polyvinylpyrrolidon, látky založené na celulóze, polyethylenglykol, sodná sůl karboxymethylcelulózy, polyakryláty, vosky, blokové polymery polyethylenpolyoxypropylen, polyethylenglykol a tuk z ovčí vlny .

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu mohou být také ve formě sterilních injekčních přípravků, jako je např. sterilní injikovatelná vodná nebo olejová suspenze. Taková suspenze se formuluje odborníkovi známým postupem za pomoci vhodných dispergujících, zvlhčovačích nebo suspendujících činidel. Sterilní injikovatelná přípravky mohou být také sterilní injikovatelné roztoky nebo suspenze v netoxickém parenterálně přijatelném rozpouštědle nebo ředidle, jako je např. roztok v 1,3-butandiolu. K vhodným farmaceuticky přijatelným vehikulům a rozpouštědlům, která se mohou užít, patří voda, Ringerův roztok a isotonický roztok chloridu sodného. Kromě toho sterilní, stálé oleje jsou užívány jako obvykle jako rozpouštědla nebo suspendační média. Pro tento účel se může užít jakýkoliv nedráždivý stálý olej, včetně syntetických mono- nebo diglyceridů. Mastné kyseliny, jako je kyselina olejová, a její glyceridové deriváty jsou užitečné pro přípravu injikovatelných přípravků, stejně tak jako přírodní farmaceuticky přijatelné oleje jako je olivový olej, ricínový olej, obzvláště jejich polyoxyethylovane verze.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu, mohou být podávány perorálně. Jestliže jsou podávány perorálně, mohou být podávány v každé perorálně přijatelné dávkové formě včetně « ·

99 9 9 9 9

9 · 9 9 (výčet není limitující) tobolek, tablet, vodných suspenzí nebo roztoků. V případě tablet pro perorální použití obvykle používané nosiče zahrnují laktózu a kukuřičný škrob. Jsou také typicky přidávány lubrikanty, jako například stearát hořečnatý. Pro perorální podávání ve formě tobolek zahrnují použitelná ředidla laktózu a usušený kukuřičný škrob. Když je pro perorální použití vyžadována vodná suspenze, aktivní složka je spojena s emulgátory a suspendujícími činidly. Je-li žádoucí, mohou být také přidány určitá sladidla, příchutě nebo barviva.

Zvláštní přípravky podle vynálezu jsou přípravky, kdy antagonista podle vynálezu je formulován do vezikulů jako jsou např. přípravky obsahující lipozómy. Lipozómy jsou vezikuly (měchýřky) vytvořené amfipatickými molekulami jako jsou např. polární lipidy, např. fosfatidylcholiny, ethanolaminy a -šeřiny, sfingomyeliny, kardiolipiny, plasmalogeny, fosfátidové kyseliny a cerebrosidy. Lipozómy se vtvoří, když se vhodné amfipatickými molekuly ponechají bobtnat ve vodě nebo vodném roztoku, aby vytvořily tekuté krystaly s obvykle vícevrstevnou strukturou obsahující několik dvojvrstev vzájemně separovaných vodou (označované jako surové lipozómy). Jiným známým typem jsou lipozómy tvořené jedinou dvojvrstvou obalující vodnou fázi, které se nazývají jednovrstevné vezikuly. Pokud je ve vodné fázi v průběhu bobtnání lipidů přítomen ve vodě rozpustný materiál, je zachycen ve vodné vrstvě mezi lipidovými dvojvrstvami.

Zvláště vhodnou metodou pro formulaci antagonistů podle vynálezu do lipozómových přípravků je metoda popsaná v Evropském patentu EP-A-253,619, který je zahrnut formou odkazu. Při této metodě se lipozómy s jedinou dvojvrstvou obalující účinnou látku připraví tím, že se lipidová složka rozpustí v organickém médiu, a organický roztok lipidové

9 ·	•	*	9» «9	9
• • • • · » ·	• 9 • « ··	• • 9	• · · • · · · • · ·	• W 9 ··

složky se pod tlakem vstřikuje do vodné složky za současného promíchávání organické a vodné složky vysokorychlostním homogenizátorem nebo jiným míchacím zařízením, přičemž se spontánně vytvářejí lipozómy. Lipozómy s jednou dvojvrstvou obalující účinnou složku se mohou užít pro topickou aplikaci buďto přímo nebo ve vhodném farmaceuticky přijatelném nosiči. Viskozita lipozómů může být zvýšena přidáním jednoho nebo více zahušúovacích činidel jako je např. xanthanová guma, hydroxypropylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza nebo jejich směsi.

Vodná složka je buďto samotná voda nebo může obsahovat elektrolyty, pufrovací systémy a další složky jako např. konzervační látky. K vhodným elektrolytům patří soli kovů jako např. soli alkalických kovů nebo soli kovů alkalických zemin. Výhodné soli jsou chlorid vápenatý, chlorid sodný a chlorid draselný. Koncentrace elektrolytů může být různá, od 0 do 2 60 mM, výhodně 5 mM až 160 mM. Vodná složka je umístěna do vhodné nádoby, které umožňuje provádět homogenizaci, která se realizuje silnou turbulencí, v průběhu vstřikování organické složky. Homogenizace dvou složek se provádí v nádobě, alternativně se vodná a organická složka vstřikují odděleně do míchacího zařízení, které je umístěno mimo nádobu. V takovém případě se lipozómy tvoří v tomto míchacím zařízení a v nádobě se jen shromažďují.

Organickou složkou tvoří vhodné netoxické farmaceuticky přijatelné rozpouštědlo jako je např. ethanol, glycerol, propylenglykol a polyethylenglykol, a vhodný fosfolipid, který je rozpustný v rozpouštědle. K vhodným fosfolipidům patří např. lecitin, fosfatidylcholin, fosfatydylserin, fosfatidylethanolamin, fosfatidylinositol, lysofosfatidylcholin a fosfatidylglycerol. Další lipofilní přísady mohou být užity pro selektivní modifikaci vlastností lipozómů.

• 4

- 55 přísady, např. přísadám patří askorbyloleát. jako kyselina obinadla, obsahuj ící vhodné množství V některých případech mohou inhalátoru připravuj i

K příkladům takových přísad patří např. stearylamin, kyselina fosfátidová, tokoferol, cholesterol a lanolinové extrakty.

Navíc se do organické složky mohou přidávat další zabraňující oxidaci fosfolipidů. K takovým např. tokoferol, butylovaný hydroxyanisol, butylovaný hydroxytoluen, askorbylpalmitát a

Také se mohou přidat konzervační činidla benzoová, methylparaben nebo propylparaben.

Kromě výše popsaných přípravků se pro vynález mohou využít i obvazové formy, jako např. náplasti, obvazy, gázové polštářky apod., léčiva, tj . anti-VLA protilátky, být užity náplasti, obinadla, obvazy, gázové polštářky apod., které byly impregnovány topickým přípravkem obsahujícím léčivý přípravek.

Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu mohou být také podávány jako nazální aerosol nebo inhalováním s použitím nebulizéru, inhalátoru suchého prášku nebo s odměřenými dávkami. Takové přípravky se postupy dobře známých v oboru formulace farmaceutických přípravků a mohou být připraveny obvykle jako roztoky ve fyziologickém roztoku, s využitím benzylalkoholu nebo dalších vhodných konzervačních prostředků, činidel podporujících absorpci pro zvýšení biologické dostupnosti přípravku, fluorovaných uhlovodíků a/nebo dalších obvyklých solubilizačních nebo dispergujících činidel.

V jiných provedeních přípravky obsahující sloučeninu podle vynálezu mohou dále obsahovat další činidlo vybrané ze skupiny zahrnující kortikosteroidy, protizánětlivá činidla, imunosupresiva, antimetabolity a imunomodulátory. Specifické sloučeniny v každé z těchto skupin mohu být vybrány z jakýchkoliv sloučenin uvedených v příslušné skupině v publikaci Comprehensive Medicinal Chemistry (Pergamon Press, Oxford, England, ss. 970-986, 1990), přičemž tento popis uvedených látek je zahrnut formou odkazu. Patří sem také sloučeniny, jako například theofylin, sulfasalazin a aminosalicyláty (protizánětlivé látky); cyklosporin, FK-506, a rapamycin (imunosupresiva); cyklofosfamid a metotrexát (antimetabolity); steroidy (inhalační, perorální nebo topické) a interferony (imunomodulátory).

Dávkování sloučenin podle vynálezu a léčebný režim nutné pro dosažení požadovaného léčebného účinku závisí na celé řadě faktorů, jako je např. povaha použité sloučeniny, věk, tělesná hmotnost, pohlaví a obecný zdravotní stav pacienta, dieta, čas podávání, rychlosti vylučování, vážnost konkrétní léčené nemoci, požadovaný léčebný cíl a úsudek ošetřujícího lékaře.

Hladina dávek aktivní složky mezi přibližně 0,001 a přibližně 100 mg/kg tělesné hmotnosti denně, výhodně mezi přibližně 0,1 a přibližně 50 mg/kg tělesné hmotnosti denně je užitečná. Nejvýhodněji, VLA-4 vázající činidlo, když jde o protilátku nebo její derivát, je podáváno v dávce 0,1 mg/kg tělesné hmotnosti/den až 20 mg/kg tělesné hmotnosti/den, výhodně 0,1 mg/kg až 10 mg/kg tělesné hmotnosti/den v režimu jedenkrát za 1 až 14 dnů. V případě malých molekul nebo vazebných činidel jiných než protilátek jsou vhodné dávky molárními ekvivalenty dávek určených pro protilátky. Výhodně je protilátkový přípravek podáván v množství, které poskytuje účinnou hladinu protilátky v plazmě alespoň 1 mg/ml. Optimalizaci dávek lze určit na základě podávání vazebného činidla a následného vyhodnocení potažení buněk pozitivních na integrin činidlem v průběhu času po podání dané dávky in vivo.

Přítomnost podávaného agens může být detekována in vitro (nebo také ex vivo) pomocí neschopnosti nebo snížené schopnosti buněk pacienta vázat stejné činidlo, které bylo » 0» · 0 «0 • · #00 * • 0 « 0 0 0 · 0 » 0 * 0 samo označeno (např. fluorochromem). Výhodné dávkování by mělo vést k detekovatelnému potažení převážné většiny buněk pozitivních na integrin. Výhodně by toto potažení buněk mělo přetrvávat v případě protilátkového homologů po dobu 1 až 14 dnů.

Odborník může snadno testovat antagonistů podle vynálezu, zda má požadovaný účinek. Odborník k tomu užije např. standardní testy pro vyhodnocení klinického zotavování (např. laváž a užití FACS skenování na vazbu protilátek, zlepšení nucené vitální plicní kapacity). Tak např. buňky obsažené ve vzorku pacientovy plicní tkáně se mohou testovat na přítomnost agens in vitro (nebo ex vivo) užitím druhého činidla pro detekci podávaného agens. Může to být např. fluorochromem značená protilátka specifická k podávanému agens, která se pak měří standardní FACS analýzou (třídění fluorescencí aktivovaných buněk). Alternativně přítomnost podávaného agens může být detekována in vitro (nebo také ex vivo) pomocí neschopnosti nebo snížené schopnosti buněk pacienta vázat které bylo samo označeno (např. Výhodné dávkování by mělo vést k detekovatelnému potažení převážné většiny buněk pozitivních na integrin. Výhodně by toto potažení buněk mělo přetrvávat v případě protilátkového homologů po dobu 1 až 14 dnů.

Následující příklady slouží pro ilustraci předkládaného vynálezu a v žádném případě ho nijak neomezují.

stejné činidlo, fluorochromem).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Zvířecí modely plicní fibrózy

Existuje mnoho důkazů účasti zánětových buněk a mediátorú v pulmonární fibróze na modelu hlodavců s bleomycinem (BL) . Tento model fibrózy je přitažlivý zejména proto, že vytváří charakteristický obraz fibrózy s mnoha složkami jako u humánní fibrózy, a také proto, že BL-indukovaná pulmonární fibróza je dobře známým nežádoucím účinkem v humánní chemoterapii Intratracheální (IT) instilace (nakapání) BL u hlodavců se často užívá pro výzkum mechanismů fibrogeneze a pro screening potenciálních antifbrotických sloučenin. Přestože původní příčinou BL-indukované plicní toxicity je vytváření kyslíkových radikálů (ROS), jakmile se naváží na železo a DNA, proces vedoucí ke konečné manifestaci pulmonární fibrózy zahrnuje uvolnění různých zánětových mediátorú (Girl and Wang., Comments Toxicol., 3: 145-176 (1989)). Pathogeneze BLindukovaného poškození plic začíná edémem, hemoragií a buněčným infiltrátem s převládajícími neutrofily a makrofágy. Nadměrná akumulace zánětových leukocytů v cévních, intersticiálních a alveolárních prostorech plic pak způsobuje poškození cév a parenchymu tvorbou ROS a proteolytických enzymů. Neutrofily obsahují značná množství myeloperoxidázy (MPO), která oxiduje Cl na kyselinu chlornou (HOC1) v reakci s H₂O₂ a je známo, že právě H0C1 pocházejíc z neutrofilů způsobuje buněčnou toxicitu. ROS pocházející z makrofágů a neutrofilů jsou schopny stimulovat produkci prozánětových fibrogenních cytokinů, které zprostředkovávají zesílenou fibroproliferativní reakci (Phan and Kunkel., Exp. Lung Res.,

18: 29-43 (1992)). Kromě rozsáhlé infiltrace zánětových buněk je fibrotický proces dále charakterizován hyperproliferativní reakcí aktivovaných fibroblastů. Fibroblastům podobné buňky jsou primárně zodpovědné za absolutní zvýšení obsahu kolagenu v plicích a abnormality v ultrastruktuře a prostorové distribuci různých typů kolagenu.

Příklad 2

Inhibice fibrózy užitím antagonisty integrinů obsahujícího podjednotku alfa4

Materály a metody

Nespecifická kontrolní protilátka (1E6) a protilátka proti integrinů obsahujícímu podjednotku alfa4 (PS2) byly použity v tomto experimentu. 1E6 je myší anti-humánní LFA3 (doména 1) monoklonální IgGl protilátka (viz Miller, Hochman, Meier, Tizard, Bixler, Rosa, and Wallner (1992) J. Exp. Med. 178: 211-222. PS/2 byla připravena metodou podle Miyake et al. , J. Exp. Med., 173: 599-607 (1991).

Samci myší C57BL/6 bez chronické respirační nemoci o hmotnosti 25 až 30 g byly zakoupeni od firmy Charles River Laboratory. Sulfát bleomycinu (prodáván pod chráněným označením Blenoxane) byl dar od firmy Bristol Laboratories, (Syracuse, NY) . The L-[3,4-3H]prolin sloužící ke značení prokolagenového substrátu prolylhydroxylázy byl opatřen od firmy NEN Life Science Products (Boston, MA) . Z-fix, pufrovaný vodný roztok zinkformalinu byl opatřen od firmy Anatech, LTD (Battle Creek, MI) . Všechny ostatní reagencie byly ve standardní čistotě chemických reagencií nebo lepší a byly získány ze standardních komerčních zdrojů.

Ošetřování experimentálních zvířat

Myši byly umístěny v klecích po 4 zvířatech a zacházelo se s nimi v souladu s příslušnými pokyny (NIEI Guidelines for Animal Welfare). Myši byly před ošetřením ponechány 1 týden, aby se aklimatizovaly. Byl udržován cyklus 12 hodin světlo/12 hodin tma a zvířata měla neomezený přístup k vodě i k potravě (Rodent Laboratory Chow). Zvířata byla náhodně rozdělena do 4 experimentálních skupin: 1) SA + SA; 2) BL + IE6; 3) BL + SA; and 4) BL + PS2 . Myši byly intratracheálně (IT) inj ikovány jednou dávkou fyziologického roztoku nebo BL dávkou 0,08 jednotek/100 μΙ/myš při anestezi xylazinem a ketaminem. Po IT instilaci myši dostaly IP injekci IE6, SA nebo PS2 (100 μg/ 0,2 ml/myš) třikrát týdně. Dvacet dnů po IT instilaci BL byly myši utraceny v anestezi pentobarbitalem a tekutina z bronchoalveolární laváže (BALF) byla podrobena biochemické a histopatologické analýze.

Příprava BALF a plicní tkáně

Po anestezi byla otevřena břišní dutina a pak byla provedena exsangvinace sestupné abdominální aorty. Plíce byly připraveny pro laváž kanylací trachey tupou jehlou nasazenou na injekční stříkačku. Plicní laváž byla provedena 3 ml chladného isotonického roztoku soli podaného v lml alikvotech. Alikvot BALF byl rozdělen pro odečet celkového počtu buněk. Zbývající BALE byla centrifugována při 1500 g po 20 minut ve 4° C, a výsledný supernatant byl rozdělen na alikvoty a uložen do -70 °C. Po laváži byly plicní laloky rychle zbaveny neparenchymatické tkáně a okamžitě zmrazený v tekutém dusíku a uloženy do -70 °C.

Později byly zamražené plíce roztátý a homogenizovány v 0,1 M KC1, 0,02M Tris (pH 7,6) v homogenizátoru Polytron

I ««»

- 61 (Brinkmann Instruments lne., Westbury, NY). Homogenit byl důkladně promíchán opakovaným obracením a výsledné objemy homogenátu (4-5 ml) byly zaznamenány. Homogenit byl rozdělen

na několik	alikvotů	a uložen do -70	°C pro pozdější
biochemické	analýzy.
Stanovení	obsahu	ma1ondi a1dehydových	ekvivalentů a

hydroxyprolinu v plicích

Malondialdehydové ekvivalenty v plicích byly stanoveny z celkového množství produktů reagujících s thiobarbiturovou kyselinou v nefrakcionovaném homogenátu postupem podle Ohkawa et al., Anal. Biochem., 95: 351 (1979). Pro test hydroxyprolinu v plicích byl 1 ml homogenátu precipitován s 0,25 ml ledově vychlazené 50% (hmot./objem) trichloroctové kyseliny, centrifugován a precipitát byl hydrolyzován ve 2 ml 6 N HCl po dobu 18 hodin ve 110 °C. Obsah hydroxyprolinu by pak měřen postupem podle Woessner, J.F., Arch. Biochem. Biophys., 93: 440 (1961).

Stanovení aktivit prolylhydroxylázy (EC 1.14.11.2).

Příprava substrátu (prokolagen) prolylhydroxylázy a způsob testování prolylhydroxylázy byly popsány v Giri, S.N. et al. , Exp. Mol. Pathol. 39: 317 (1983). Stručně shrnuto, tibie čerstvě vyjmuté z lOdenních kuřecích embryí byly značeny [3H]prolinem v kultivačním médiu bez prolinu při 3 7 °C po 6 hodin. Po odstranění neinkorporované značky opláchnutím byla tkáň homogenizována a centrifugována při 3000 g po 20 minut ve 4 °C. Výsledný supernatant byl extenzivně dialyzován, aby se odstranila neinkorporovaná značka. Značený prokolagenový substrát byl rozdělen na alikvoty a uložen v -70 °C. Inkubační směs pro enzymový test v celkovém objemu 2 ml síranu železnatoamonného (0,1 mmol/1), alfa -ketoglutarovou kyselinu (0,1 mmol/1), [3H]prolin-prokolagen (200 000 dpm), homogenát plicní tkáně (0,2 ml), kyselinu askorbovou (0,5 mmol/l), a TRIS-HCl pufr (0,1 mol/1, pH 7,8). Reakce byla zastavena přidáním 0,2 ml 50% trichloroctové kyseliny po 30 minutách ve 37 °C v metabolické třepačce podle Dubnoffa. V průběhu reakce se uvolňovala triciovaná voda ve stechiometrickém poměru k prolylhydroxylaci a byla užita jako měřítko enzymatické aktivity. Triciovaná voda v reakčním systému byla separována vakuovou destilací celé reakční směsi a byla změřena její radioaktivita. Enzymatická aktivita byla vyjádřena v dpm triciované vody uvolněné z celkového objemu plic za 30 minut.

Stanovení počtů buněk v BALF

Celkový počet buněk v BALF byl stanoven postupem, který popsali Wang, Q. et al. , Lab. Invest., 67: 234-242 (1992). Celkový počet leukocytů v BALF byl určen pomocí počítače Coulter (Model F, Coulter Electronics; lne., Hialeah, FL) podle instrukcí výrobce.

Test na protein v BALF

Obsah proteinu v BALF supernatantu byl určen užitím proteinového testu Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), přičemž jako standard byl užit hovězí sérový albumin.

Histopatologická a imunohistochemická analýza

Tři až čtyři zvířata z každé skupiny byla náhodně vybrána pro histopatologické a imunohistochemické vyšetření na konci experimentu. Byla otevřena břišní dutina a pak byla provedena exsangvinace sestupné abdominální aorty. Ihned potom byly plíce připraveny pro histologickou analýzu podle Wang et al.(viz výše). Po kanylací trachey tupou jehlou byla otevřena plicní dutina a plíce se srdcem byly vyjmuty en bloc. Plíce

- 63 ♦ • · »· » byly fixovány roztokem Z-fix tracheou při tlaku 30 cm H₂O. Pravý kraniální a kaudální lalok a levý lalok plic byly později blokovány, zality do parafínu a nařezány na 7μπι řezy a obarveny hematoxylinem a eosinem. Pro imunohistochemické barvení na alfaSMA, byly řezy plicní tkáně deparafinovány a byla blokována endogenní peroxidáza. Řezy určené k barvení pak byly ošetřeny blokujícím kozím sérem po 30 minut a byly inkubovány 16 hodin primární monoklonální anti-alfaSMA protilátkou (Sigma Chemical Co., St Louis, MO).

Statistická analýza dat

Data byla vyjádřena v přepočtu na celé plíce a jsou uvedena jako průměrné hodnoty ± střední chyba (SE) . Data ze čtyř skupin zvířat byla porovnána užitím dvoufaktorové analýzy variance (SIGMASTAT) metodou podle Student-Newman-Keulse. Hodnota P < 0,05 byla považována za statisticky významnou.

Výsledky

Peroxidace lipidů v plicích myší

Obsah malondialdehydových ekvivalentů v plicích byl jakožto index peroxidace lipidů testován u různých skupin myší. BL instilace významně zvýšila obsah malondialdehydových ekvivalentů v plicích myší jak ve skupině BL+IE6 tak i BL+SA na rozdíl od skupin SA+SA a BL+PS2 (data neuvedena). Ošetření PS2 účinně blokovalo BL-indukovanou peroxidaci lipidů, jelikož hladina malondialdehydových ekvivalentů v plicích u skupiny BL+PS2 nebyla odlišná od skupiny SA+SA.

Obsah hydroxyprolinu v plicích myší

Obsah hydroxyprolinu v plicích, klíčový index hladiny kolagenu v plicích byl stanoven pro 4 skupiny myší. IT «

♦

instilace BL významně zvýšila hladinu hydroxyprolinu v plicích ve skupině BL+IE6 a BL+SA na 185 % a 205 % kontrolní skupiny SA+SA, v uvedeném pořadí. BL-indukované zvýšení hydroxyprolinu v plicích u skupiny BL+PS2 bylo významně sníženo o 35 % podáváním PS2 ve srovnání se skupinou BL+SA. Hladina hydroxyprolinu v plicích skupiny BL+TR nebyla významně vyšší než kontrolní skupina IT SA (SA+SA).

Aktivita prolylhydroxylázy v plicích myší

Aktivita prolylhydroxylázy v plicích myší různých skupin ukazuje, že BL samotný významně zvyšuje aktivitu prolylhydroxylázy ve skupině BL+SA na 207 % kontrolní skupiny SA+SA. PS2 významně snížila zvýšení prolylhydroxylázové aktivity vyvolané podáním BL u skupiny BL+SA.

Celkový počet buněk v BALF

Celkové počty buněk v BALF u různých skupin myší 21 dnů po IT instilaci solného roztoku nebo BL ukázaly, že podání BL zvýšilo celkové počty buněk v BALF skupin BL+IE6 a BL+SA ve srovnání s kontrolní skupinou (SA+SA), ačkoliv jen skupina BL+IE6 měla počty statisticky významně vyšší než skupina SA+SA. Počet buněk v BALF ve skupině BL+PS2 se nelišil od skupiny SA+SA.

Obsah proteinů v BALF

Obsah proteinů v experimentálních skupin

BL merený u instilace supernatantu BALF myší odhalil, IT statisticky významně zvýšila obsah proteinů v BALF u všech ošetřených skupin ve srovnání s kontrolní skupinou SA+SA. Avšak podání PS2 ve skupině BL+PS2 snížilo BL-indukované zvýšení proteinu v supernatantu BALF, i když tento rozdíl nebyl statisticky významný.

Histopatologie plic myší

Histologické vyšetření myších plic ukázalo normální plicní parenchymatickou tkáň u skupiny SA+SA. Avšak plíce myší ze skupin BL+ΙΕβ a BL+SA projevovaly difúzní alveolitidu a multifokální intersticiální fibrózu obsahující akumulovanou extracelulární fibrózní hmotu. Plíce myší z těchto skupin měly zesílené interalveolární stěny a zánětové buňky v sousedních vzdušných prostorech. Ve srovnání se skupinami BL+IE6 a BL+SA, plíce myší skupiny BL+PS2 měly mnohem méně fibrotických lézí, ačkoliv některé laloky vykazovaly mírný stupeň intersticiální fibrózy.

Imunohistochemické barvení na alfaSMA v plicích myší

Pro stanovení akumulace fibroblastú a fibroblastúm podobných buněk u myší po ošetření byla zkoumána exprese of alfaSMA v plicní tkáni užitím monoklonální protilátky proti alfaSMA. V plicích kontrolních zvířat se imunopozitivita objevila ve vrstvách vaskulárního a bronchiálního hladkého svalstva. V plicích ošetřených BL a kontrolní protilátkou nebo solným roztokem byly extenzivní a intenzivní imunopozitivní oblasti ve fibrotických oblastech jak intersticia tak i pleury. Avšak plíce ošetřené BL a PS2 jevily výrazně snížené imunobarvení alfaSMA, ve srovnání se skupinami BL+IE6 a BL+SA.

Diskuse

IPF je invalidizující nemoc a špatně odpovídá na současnou terapii. V předkládané studii jsou poskytnuty důkazy, že integrin obsahující podjednotku alfa4 je dalším možným cílem v terapii IPF. Obecně se předpokládá, že leukocyty v plicích se podílejí na rozvoji pulmonární fibrózy tím, že secernují ROS, fibrogenní cytokiny a růstové faktory. Přenos a stav aktivace leukocytů jsou modulovány různými povrchovými proteiny jako jsou např. integriny. Je jasné, že interakce buňka-buňka a také interakce buňka-ECM jsou kritické pro patogenezi pulmonární fibrózy. Konzistentním nálezem u pacientů s aktivní pulmonární fibrózou a u zvířecích modelů fibrotických plicních onemocnění je akumulace zvýšeného počtu imunitních a zánětových buněk v oblastech s probíhající fibrózou.

VLA-4 je exprimován na všech cirkulujících leukocytech a váže se na adhezivní molekulu vaskulárních buněk (VCAM-1), což je člen genové superrodiny Ig exprimovaný na endotelových buňkách aktivovaných cytokinem, a na matrixový protein fibronektin. Alfa4beta7 je exprimován na podmnožině T a B lymfocytů, žabíječských Iymfocytech (natural killer) a eosinofilech. Váže se na adresin vaskulární mukózy (MAdCAM-1), což je člen rodiny adhezivních molekul podobných mucinu, a také na VCAM-1 a fibronektin. Studie in vitro ukázaly, že interakce VLA-4 s VCAM-1 se podílí na adherenci mononukleárních leukocytů a eosinofilů k endoteliu a na transendoteliální migraci, a že alfa4beta7 se primárně podílí na rekrutování leukocytů do lymfoidní tkáně pojené se střevem.

V předložené studii léčebné podávání PS2 vedlo ke snížení BL-indukovaného zvýšení celkových leukocytů v BALF. Snížení leukocytů v plicích myší skupiny BL+PS2 by mohlo být zodpovědné za zmenšení zánětlivého poškození a fibrózy plic u myší po podání BL. BL-indukované poškození plic bylo významně sníženo po podání PS2, jak ukazují výsledky měření peroxidace lipidů v plicích. Zvýšení kolagenu v plicích bylo spojeno se zvýšením počtu fibroblastů v intersticiu a samotných alveolárních prostorech. Mnohé z těchto buněk podobných fibroblastúm jsou myofibroblasty, které mají odlišný fenotyp, ke kterému patří exprese alfaSMA, kontraktilního proteinu, který se vyskytuje normálně v buňkách hladkého svalstva a je zřejmě významný pro fibrogenezi a hojení ran.

Významným zjištěním této studie také bylo to, že podávání PS2 zeslabilo BL-indukovanou proliferaci myofibroblastů. Bez ohledu na konkrétní teorii, podávání protilátky proti alfaintegrinu snižuje hladinu růstových faktorů v plicích, které jsou uvolňovány infiltrujícími leukocyty nebo přímo ovlivňuje chování myofibroblastů. V každém případě redukovaná proliferace myofibroblastů vedla ke snížení akumulace kolagenu v plicích u zvířat indukovaných podáním BL ve skupině BL+PS2.

Příklad 3

Inhibice fibrózy podáváním antagonisty integrinu obsahujícího podjednotku alfal

Ošetřování zvířat

Samci myší C57/BL6 o hmotnosti 28 až 30 g byli umístěni po 4 zvířatech v plastových klecích v zařízení schváleném pro tento účel příslušnými úřady (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care). Myši byly před ošetřením ponechány 1 týden, aby se aklimatizovaly. Byl udržován cyklus 12 h/12 h světlo/tma a zvířata měla neomezený přístup k vodě i k potravě (Rodent Laboratory Chow 5001, Purina Mills, lne., St. Louis, MO) . V místnosti s klecemi byl filtrovaný vzduch a světelný režim 12 hodin světlo/12 hodin tma. Zvířata byla náhodně rozdělena do 4 experimentálních skupin:

SKUPINA	OŠETŘENI
A	Solný roztok + pufrovaný solný roztok
B	Solný roztok + kontrolní protilátka IgG
C	Bleomycin + kontrolní protilátka IgG
D	Bleomycin + protilátka anti-alfalbetal-integrin

Sulfát bleomycinu byl rozpuštěn v apyrogenním sterilním isotonickém solném roztoku těsně před intratracheální (IT) f instilací. Myším z příslušných skupin bylo při anestezi methoxyfluranem podáno intratracheálně buďto 100 μΐ sterilního isotonického roztoku nebo 0,08 bleomycinu ve 100 μΐ roztoku. Protilátky (4 mg/kg) byly podávány intraperitoneální injekcí myším z příslušných skupin třikrát týdně v průběhu 21 dnů po instilací. Pak byla zvířata všech skupin utracena předávkováním pentobarbitalu sodného (100-125 mg/kg i.p.) a plíce byly zpracovány pro bronchoalveolární laváž a biochemické a histopatologické studie.

Stanovení celkového počtu buněk a hladiny proteinu b tekutině z broncoalveolární laváže

Po kanylaci trachey byly plíce vypláchnuty 5 ml isotonického roztoku soli podaného v pěti lml alikvotech. Roztok byl aplikován injekční stříkačkou kanylou, přitom byla jemně masírována hrudní stěna a tekutina byla odsáta. Odsátá tekutina byla centrifugována při 1500g po 20 minut ve 4 ⁰ C, a resuspendována v isotonickém solném roztoku. Obsah proteinu v ve vzorku tekutiny z bronchoalveolární laváže byl určen metodou podle Lowry et al. , J Biol. Chem. 1193: 265-275 (1951), přičemž jako standard byl užit hovězí sérový albumin.

Celkový počet leukocytů v suspenzi byl stanoven pomocí počítače Coulter (Model F, Coulter Electronics; lne., Hialeah,

FL) .

Stanovení hydoxyprolinu

Plíce zvířat použité pro biochemické studie byly perfundovány in šitu přes pravou komoru ledově chladným isotonickým solným roztokem, aby se odstranila krev z plicních cév otvorem v levém srdečním oušku. Plicní laloky pak byly rychle zbaveny nepařenchymatické tkáně a okamžitě zmrazený v tekutém dusíku a uloženy do -80 °C. Později byly zamražené plíce roztátý a homogenizovány v 0,1 M KCl, 0,02M Tris (pH 7,6) v homogenizátoru Polytron. Obsah hydroxyprolinu v homogenátu z plic jakožto měřítko obsahu kolagenu byl kvantifikován metodou podle Woessner, Arch. Biochem. Biophys. 93: 440-447 (1961).

Histopatologická studie

Po laváži plic byla otevřena hrudní dutina a plíce byly en bloc společně se srdcem vyjmuty. Plíce byly perfundovány fixáží 1% glutaraldehyd-paraformaldehyd v 0,12M kakodylátovém pufru se 400 mOsm při tlaku 30 cm H₂0. Plíce byly fixovány za tohoto tlaku 2 hodiny a pak uloženy v této fixáži s uzavřenou Před zalitím byly plíce odděleny od srdce a jiná než plicní tkáň byla odstraněna tupou Tkáňové bločky byly odříznuty alespoň ve dvou řezech (2 až 3 mm tlustých) z pravého kraniálního, pravého kaudálního a levého plicního laloku z každého zvířete. Každý bloček měl čelní plochu asi 1 cm². Bločky byly dehydratovány v ethanolové řadě a pak zality do parafínu. Z parafínových bločků pak byly připraveny řezy (o síle 5 μπι) a obarveny hematoxylinem a eosinem pro histologické vyšetření.

tracheou, jakákoliv preparací. sagitálních

Analýza dat a jejich interpretace

Data byla analyzována v podobě průměrných hodnot se směrodatnou odchylkou a střední chybou průměru. Pro posouzení statistické významnosti rozdílů mezi skupinami byl užit Studentův t-test, rozložení chi-kvadrát, korelační koeficient, analýza variance (ANOVA) a vícerozměrné testy v počítačové statistickém softwaru SAS/STAT (SAS/STAT Guide, 6th Ed. Cary, N.C. pp. 183-260 (1985)).

Výsledky

V této studii se testovala hypotéza, že neutralizační protilátky k integrinu αϊβΐ (antialpl) redukují bleomycinem indukovanou (BL-indukovanou) plicní fibrózu in vivo. Samcům C57/BL6 myší byl intratracheálně (IT) injikován solný roztok (SA) nebo BL v dávce 0,08 U/0,1 ml a pak následovala intraperitoneální (IP) injekce protilátky (100 μg ve 0,2 ml) třikrát týdně. 21 dnů po IT instilaci byly myši utraceny a byla provedena bronchoalveolární laváž (BAL) a biochemické a histopatologické analýzy.

Histopatologické vyšetření plic

Očekávalo se, že u myší po podání solného roztoku nebo kontrolní protilátky IgG nebudou patrny žádné leze a interalveolární stěny budou normálního vzhledu. Naproti tomu po podání bleomycinu a kontrolního IgG budou mít léze různého druhu od multifokální lokalizace v proximálním laloku až po difúzní distribuci, ke které dochází někdy v pleuře. Podle očekávání plíce myší po podání bleomycinu a protilátky proti alfal integrinu měly být více či méně podobné jako ve skupině B (viz výše) . U skupiny D se očekával jen omezený počet fibrotických lézí s mírným multifokálním zluštěním stěn a malými agregáty mononukleárů.

- 71 Přestože byl předkládaný vynález z důvodu důkladného vysvětlení a dobrého porozumění popsán velmi podrobně a také popsán formou ilustrativních příkladů, odborníkovi je jasné, že lze provést různé změny a modifikace v rámci rozsahu vynálezu. Tudíž zde uvedené příklady nijak neomezují rozsah vynálezu, který je vymezen připojenými patentovými nároky.

- 72 Tabulka 6 (uvedena v patentu US č. 5 840 299 a v přihlášce

PCT/US96/18807 publikované jako WO 97/18838)

PCR primery pro konstrukci “přestavěných” 21.6 variabilních úseků

A. Variabilní úsek lehkého řetězce

1. Primery pro syntézu verze “a”

21.6VLal (39mer) (sekvence 5' GAT GGT GAC TCT ATC TCC	id. č. TAC AGA	22) TGC AGA	CAG	TGA GGA	3'
21.6VLa2 (32mer, (sekvence 5' CTG TAG GAG ATA GAG TCA	id. č. CCA TCA	23) CTT	GCA	AG	3 ¹
21.6VLa3 (39mer) (sekvence S‘ AGG AGC TTT TCC AGG TGT	id. č. CTG TTG	24) GTA	CCA	AGC	CAT	ATA	3'
21.6VLa4 (41mer) (sekvence 5' ACC AAC AGA CAC CTG GAA	id. č. AAG CTC	25) CTA	GGC	TGC	TCA	TAC	AT 3 ¹
21.6VLa5 (40mer)(sekvence 5’ GCA GGC TGC TCA TGG TGA	id. č. AAG TAT	26) AAT	CTC	TCC	CAG	ACC	C 3'
21.6VLa6 (42mer) (sekvence 5’ ACT TTC ACC ATC AGC AGC	id. č. CTG CAG	27) CCT	GAA	GAT	ATT	GCA	ACT 3 '
21.6VLa7 (59mer) (sekvence 5' CCG AGG ATC CAC TCA CGT	id. č. TTG ATT	28) TCC	ACC	TTG	GTG	CCT	TGA CCG

CAC ACA TT 3'

2. Primery pro syntézu verze “b”

21.6VLbl (33mer) (sekvence id. č. 29, změna H-49 na Y-49)

5* CGA AAA GCT CCT AGG CTG CTC ATA TAT TAC ACA 3'

21.6VLb2 (3Bmer (sekvence id. č. 30, změna ACC-101 na ACA-101 pro odstranění místa Styl)

5· CCG AGG ATC CAC TCA CGT TTG ATT TCC ACC TTT GTG CC 3·

B. Variabilní úsek těžkého řetězce

1. Primery pro syntézu verze “a”

21.6VHal (Slmer) (sekvence id. č. 31)

5· AAC CCA GTG TAT ATA GGT GTC TTT AAT GTT GAA ACC GCT AGC TTT ACA GCT

	21.6VHa2 (67mer> (sekvence	id.	Č.	32)
	5‘ AAA GAC ACC TAT ATA CAC	TGG	GTT	AGA	CAG	GCC	CCT	GGC	CAA	AGG	CTG GAG
TGG	ATG GGA AGG ATT G 3'
	21.6VHa3 (26mer) (sekvence	id.	Č.	33)
	5' GAC CCG GCC CTG GAA CTT	CGG	GTC	AT	5 ·
	21.6VHa4 (66mer) (sekvence	id.	Č .	34)
	5 * GAC CCG AAG TTC CAG GGC	CGG	GTC	ACC	ATC	ACC	GCA	GAC	ACC	TCT	GCC AGC
ACC	GCC TAC ATG GAA 3'
	21.6VHa5 <64mer) (sekvence	id.	Č .	35)
	5’ CCA TAG CAT AGA CCC CGT	ACT	TAC	CAT	AAT	ATC	CCT	CTC	TGG	CGC	AGT AGT
ACA	CTG CAG TGT C 3¹
	21.6VHaó (63mer) (sekvence	id.	Č.	36)
	5' GGT AAC TAC GGG GTC TAT	GCT	ATG	GAC	TAC	TGG	GGT	CAA	GGA	ACC	CTT GTC

ACC GTC TCC TCA 3'

2. Primery pro syntézu verze “b”

21.6VHb <37mer)(sekvence id. č. 37, změna R-44 na G—44) 5' CCA GGG CCG GGT CAC CAT CAC CAG AGÁ CAC CTC TGC C 3‘

3. Primery pro syntézu verze “c”

21.6VHC (27mer)(sekvence id. č. 38, změna Y=98 na F-98) 5' CAG GCC CCT GGC CAA GGG CTG GAG TGG 3'

C. Variabilní úseky jak lehkého tak těžkého řetězce

Primery hybridizující se sousedící pUC19 vektorovou DNA

APCRl (17mer (sekvence id. č. 39, sense primer)

5' TAC GCA AAC CGC CTC TC 3'

APCR4 (lfimer (sekvence id. č. 40, anti-sense primer) 5' GAG TGC ACC ATA TGC GGT 3'

SEZNAM SEKVENCÍ

Následující sekvence id. č. 2 a 4 byly popsány v patentu US č. 5 932 214 a v přihlášce PCT/US93/00030 publikované jako WO 93/13798.

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

4	(A) (B) (D)	DÉLKA: 120 aminokyselin TYP: aminokyseliny TOPOLOGIE: lineární
	(ii)	TYP	MOLEKULY: protein
	(xi)	POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 2:

Val

Lys

Leu

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Leu Val

Lys

Pro

Gly

Ala

. Ser

1

5

10

15

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly

Phe Asn

Ile

Lys

Asp

Thr

Tyr

20

25

30

Met

His

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Pro

Glu

Gin Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

35

40

45

Arg

Ile

Asp

Pro

Ala

Ser

Gly

Asp

Thr

Lys Tyr

Asp

Pro

Lys

Phe

Gin

50

55

60

Val

Lys

Ala

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Thr

Ser Ser

Asn

Thr

Ala

Trp

Leu

65

70

75

80

Gin

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser i

Olu

Asp '

Thr Ala

Val

Tyr '

Tyr

Cys .

Ala

85

90

95

Asp Gly Met Trp Val Ser Thr Gly Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gin

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

		9 • ·	99 9 ·	« •	• · • 9	·« 99 • *9 ·
		•	9 ·	•	• 9	9 9· *
		•	9 9	• ·	99999*9 · ·
		•	9 ·	9	•	• »99
		9 9 9	9 9		» ·	9 99 9999
	- 75 -
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM	ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 106	aminokyselin
(B) TYP: aminokyseliny
(D) TOPOLOGIE:	lineární
(ii) TYP MOLEKULY: protein
(xi) POPIS SEKVENCE	SEKVENCE S ID.	č.	4:
Ser Ile Val Met Thr Gin	Thr Pro Lys Phe Leu	Leu	Val	Ser	Ala	Gly
1 5	10				15
Asp Arg Val Thr Ile Thr	Cys Lys Ala Ser Gin	Ser	Val	Thr	Asn	Asp
20	25			30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin	Lys Pro Gly Gin Ser	Pro	Lys	Leu	Leu	Ile
35	40		45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg	Tyr Thr Gly Val Pro	Asp	Arg	Phe	Thr	Gly
50	55	60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp	Phe Thr Phe Thr Ile	Ser	Thr	Val	Gin	Ala
65 70	75					80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr	Phe Cys Gin Gin Asp	Tyr	Ser	Ser	Pro	Tyr
85	90				95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105

- 76 ·«· · · » · · · * • · · · · ······· · · • · · · · · · · · ··· ·· ·· · ·· ····

Následující sekvence id. č. 22 až 40 byly popsány v tabulce 6 a v seznamu sekvencí v patentu US č. 5 840 299 a v přihlášce PCT/US96/18807 publikované jako WO 97/18838.

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 22:

GATGGTGACT CTATCTCCTA CAGA7GCAGA CAG7GAGGA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 23:

CTGTAGGAGA TAGAGTCACC ATCACTTGCA AG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 24:

AGGAGCTTTT CCAGGTGTCT GTTGGTACCA AGCCATATA

·

99*9

- 77 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 41 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 25:

ACCAACAGAC ACCTGGAAAA GCTCCTAGGC TGCTCATACA T (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 26:

I

GCAGGCTGCT GATGGTGAAA GTATAATCTC TCCCAGACCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 27:

ACTTTCACCA TCAGCAGCCT GCAGCCTGAA GATATTGCAA CT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 59 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární fc · »

·· • fc · ·

- 78 * fc fc · • fc fcfc • · fc fc • fc ♦ • · fc • · · • fc fcfcfcfc (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 28:

• CCGAGGATCC ACTCACGTTT GATTTCCACC TTGGTGCCTT GACCGAACGT CCACAGATT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 29:

GGAAAAGCTC CTAGGCTGCT CATATATTAC ACA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 30:

CCGAGGATCC ACTCACGTTT GATTTCCACC TTTGTGCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 51 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 31:

AACCCAGTGT ATATAGGTGT CTTTAATGTT GAAACCGCTA GCTTTACAGC T

»»*· ·· ·· « · · · • · · • · ·

4 9

9444

- 79 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 67 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 32:

aaagacacct atatacactg ggttagacag gcccctggcc aaaggctgga gtggatggga

AGGATTG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 33:

GACCCGGCCC TGGAACTTCG GGTCAT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 66 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 34:

GACCCGAAGT TCCAGGGCAG GGTCACCATC ACCGCAGACA CCTCTGCCAG CACCGCCTAC

ATGGAA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 64 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární ··

4 • ·

4* · • · *

9 9 9 · ····

9 9 ·· 4 • 4 94

4 4 4

4 · • 44

4 4 • · 9994 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 35:

CCATAGCATA GACCCCGTAG TTACCATAAT ATCCCTCTCT GGCGCAGTAG TAGACTGCAG TGTC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 63 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 36:

GGTAACTACG GGGTCTATGC 7ATGGACTAC TGCGGTCAAG GAACCCTTGT CACCGTCTCC TCA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 37 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 37:

CCAGGGCCGG GTCACCATCA CCAGAGACAC CTCTGCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 38:

CAGGCCCCTG GCCAAGGGCT GGAGTGG

99

4 4 9 • 99

9 · *

4 9

944 94 • 4

- 81 9« 4

9 9

9 9 ·

4 9 4 49 • 44 «

9 9

4

9

9 9

4444 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 39:

TACGCAAACC GCCTCTC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 bp (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH VLÁKNA: jednořetezcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (primer) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 40:

GAGTGCACCA TATGCGGT

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY • · · • » • · ··»·

Použití kompozice, která obsahuje protilátku nebo protilátkový homolog antagonizující interakci jak VLA-4 tak i alfa4beta7 s příslušnými alfa-4 ligandy, nebo protilátku nebo protilátkový homolog antagonizující interakci VLA-4 s jeho ligandem, nebo protilátku nebo protilátkový homolog antagonizující interakci alfa4beta7 s jeho ligandem, pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení fibrotických onemocnění.

Použití podle nároku 1, kdy protilátka nebo protilátkový homolog je vybrán ze skupiny obsahující humánní protilátky, chimérické protilátky, humanizované protilátky, a jejich fragmenty.

Použití podle nároku 1, kdy farmaceutický přípravek je v lékové formě poskytující dávku 0,1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti.

Použití protilátky nebo protilátkového homologů, který antagonizuje interakci integrinu nesoucího podjednotku alfa4 s ligandem pro integrin nesoucí podjednotku alfa4, pro výrobu farmaceutického přípravku pro snížení fibrotickým onemocněním indukovaného zvýšení leukocytů ve vzorku tekutiny z bronchoalveolární laváže.

Použití podle nároku 4, kdy protilátka nebo protilátkový homolog antagonizuje interakci jak VLA-4 tak i alfa4beta7 s příslušnými ligandy, nebo antagonizuje interakci VLA-4 • · · · s jeho ligandem, nebo antagonizuje interakci alfa4beta7 s jeho ligandem.
6. Použití podle nároku 4, kdy protilátka nebo protilátkový homolog je vybrán ze skupiny obsahující humánní protilátky, chimérické protilátky, humanizované protilátky, a jejich fragmenty.
7. Použití podle nároku 4, kdy farmaceutický přípravek je v lékové formě poskytující dávku protilátky nebo protilátkového homologů 0,1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta.
8. Použití podle nároku 7, kdy farmaceutický přípravek je v lékové formě poskytující dávku malých molekul 0,1 až 30 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta.
9. Použití podle nároku 1 nebo 4, kdy protilátka nebo protilátkový homolog je humanizovaná protilátka, jejíž část je kódována sekvencí nukleové kyseliny obsahující nukleovou kyselinu hybridizující za podmínek vysoké stringence se sekvencí nukleové kyseliny vybranou ze skupiny sekvencí popsaných zde jako sekvence id. č. 22 až 40 nebo sekvencí komplementární.
10. Použití podle nároku 1 nebo 4, kdy protilátka nebo protilátkový homolog je humanizovaná protilátka, jejíž část je kódována sekvencí nukleové kyseliny obsahující nukleovou kyselinu hybridizující za podmínek nízké stringence se sekvencí nukleové kyseliny vybranou ze skupiny sekvencí popsaných zde jako sekvence id. č. 22 až 40 nebo sekvencí komplementární.

• · » « ··
11. Použití podle nároku 1 nebo 4, kdy protilátka nebo protilátkový homolog je humanizovaná protilátka, jejíž část je kódována sekvencí nukleové kyseliny obsahující nukleovou kyselinu hybridizující za podmínek nízké stringence se sekvencí nukleové kyseliny kódující sekvenci polypeptidu vybraného ze skupiny obsahující a) sekvenci id. č. 2, b) sekvenci id. č. 4, a c) variabilní doménu protilátky produkované buněčnou linií ATCC CRL 11175.
12. Použití podle nároku 1 nebo 4, kdy protilátka nebo protilátkový homolog je humanizovaná protilátka, jejíž část je kódována sekvencí nukleové kyseliny obsahující nukleovou kyselinu hybridizující za podmínek vysoké stringence se sekvencí nukleové kyseliny kódující sekvenci polypeptidu vybraného ze skupiny obsahující: a) sekvenci id. č. 2, b) sekvenci id. č. 4, a c) variabilní doménu protilátky produkované buněčnou linií ATCC CRL 11175.
13. Použití antagonisty VLA-1 pro výrobu farmaceutického přípravku k léčení fibrózy.