RS58910B1 - Antitela koja neutrališu virus jcv - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] U jednom aspektu, opis se odnosi na antitela i njihove upotrebe.

OSNOVA

[0002] JC poliomavirus (JCV) je uzročnik demijelinizujuće bolesti centralnog nervnog sistema, progresivne multifokalne leukoencefalopatije (PML). Incidenca bolesti PML može da se poveže sa oslabljenim imunim sistemom ili lečenjem imunosupresivima. Trenutno, ne postoji specifična antivirusna terapija koja je dokazano efikasna u lečenju PML.

Suzuki et al. Virology 286, 100-112 (2001) ispituje raspodelu receptora za JC virus upotrebom, između ostalog, antitela protiv VP1 virusa JCV i lečenje pomoću sijalidaze.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0003] Na osnovu opisa koji je ovde sadržan, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo koje neutrališe JC-virus usmereno protiv proteina VP1 kapsida JCV (JCV-VP1), pri čemu navedeno monoklonsko antitelo sadrži:

varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu CDR1 koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 31, aminokiselinsku sekvencu CDR2 koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 35, i aminokiselinsku sekvencu CDR3 koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 9; i

varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu CDR1 koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 17, aminokiselinsku sekvencu CDR2 koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 3, i aminokiselinsku sekvencu CDR3 koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 4.

[0004] U sledećem aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo prema pronalasku za upotrebu u postupku za lečenje subjekta koji ima jedan ili više znakova ili simptoma progresivne multifokalne leukoencefalopatije (PML), ili ima PML.

[0005] U nekim primerima izvođenja, antitelo je antitelo poreklom iz zeca.

[0006] U nekim primerima izvođenja, antitelo je humanizovano.

[0007] U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži Fc-region IgG1.

[0008] U nekim primerima izvođenja, antitelo ima efektorsku funkciju.

[0009] U nekim primerima izvođenja, aspekti pronalaska odnose se na izolovano antitelo koje sadrži SEQ ID NO:15 (399-1 N31G) i SEQ ID NO:20 (399-h, C35A V50A).

[0010] U nekim primerima izvođenja, aspekti pronalaska odnose se na izolovano antitelo koje sadrži sekvencu koja ima najmanje 80% homologije sa SEQ ID NO:15 (399-1 N31G) i sekvencu koja ima najmanje 80% homologije sa SEQ ID NO:20 (399-h, C35A V50A).

[0011] U nekim primerima izvođenja, aspekti pronalaska odnose se na izolovano antitelo koje sadrži sekvencu koja ima najmanje 90% homologije sa SEQ ID NO:15 (399-1 N31G) i sekvencu koja ima najmanje 90% homologije sa SEQ ID NO:20 (399-h, C35A V50A).

[0012] U nekim primerima izvođenja, aspekti pronalaska odnose se na izolovano antitelo koje sadrži sekvencu koja ima najmanje 95% homologije sa SEQ ID NO:15 (399-1 N31G) i sekvencu koja ima najmanje 95% homologije sa SEQ ID NO:20 (399-h, C35A V50A).

[0013] U nekim primerima izvođenja, aspekti pronalaska odnose se na izolovano antitelo koje sadrži sekvencu koja ima do 10 mutacija u poređenju sa SEQ ID NO:15 (399-1 N31G) i sekvencu koja ima do 10 mutacija u poređenju sa SEQ ID NO:20 (399-h, C35A V50A).

[0014] U nekim primerima izvođenja, aspekti pronalaska odnose se na izolovano antitelo koje ima sledeću sekvencu lakog lanca:

i/ili sledeću sekvencu teškog lanca:

[0015] U nekim primerima izvođenja, signalna sekvenca lakog lanca je MRVPAQLLGLLLLWLPGARC (SEQ ID NO:68).

[0016] U nekim primerima izvođenja, signalna sekvenca teškog lanca je MDFGLSWVFLVLVLKGVQC (SEQ ID NO:69).

[0017] U nekim primerima izvođenja, aspekti pronalaska odnose se na antitelo prema pronalasku za upotrebu u lečenju subjekta koji ima jedan ili više znakova ili simptoma progresivne multifokalne leukoencefalopatije (PML), ili ima PML, gde postupak sadrži davanje jednog ili više antitela koja su ovde opisana subjektu koji ima jedan ili više znakova ili simptoma PML, ili ima PML, u terapijski efikasnoj količini za lečenje PML.

[0018] U nekim primerima izvođenja, antitelo prolazi kroz krvno-moždanu barijeru.

[0019] U nekim primerima izvođenja, lečenje rezultuje smanjenjem virusnog opterećenja, poboljšanim rezultatom na EDSS skali, poboljšanim rezultatom na Karnofsky skali, poboljšanom MRI slikom, ili poboljšanjem kognicije. U nekim primerima izvođenja, subjekt se podvrgava, ili je bio podvrgnut, imunoterapijskom lečenju. U nekim primerima izvođenja, subjekt je imunokompromitovan.

[0020] Predmetni pronalazak i primeri njegovog izvođenja prikazani su u priloženim patentnim zahtevima.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0021] Slike su samo ilustrativne i nisu neophodne za ostvarivanje pronalaska koji je opisan u ovom tekstu.

Slika 1 prikazuje rezultate sposobnosti monoklonskih antitela poreklom iz zeca da neutrališu JCV i BKV virus u testu inhibicije infektivnosti na humanim astrocitima.

Slika 2 prikazuje rezultate sposobnosti monoklonskih antitela poreklom iz zeca da neutrališu virus JCV i BKV u testu inhibicije infektivnosti na humanom bubrežnom proksimalnom tubularnom epitelu.

Slika 3 daje pregled EC50, EC80 i EC90 antitela protiv JCV i BKV u različitim testovima.

Slika 4 prikazuje rezultate sposobnosti monoklonskih antitela poreklom iz zeca da se vežu za protein JCV-VP1 divljeg tipa i mutante JCV-VP1 L55F, S269F, Q271H, K60E i D66H.

Slika 5 prikazuje rezultate ispitivanja vezivanja zečjeg monoklonskog antitela 399 i humanizovanog antitela BIIB048 (= H0L0), H0V50AL2N31Ai H0V50AL2N31Aza nekoliko JCV-VP1 divljeg tipa i mutantnih JCV-VP1 upotrebom testa ELISA.

Slika 6 prikazuje rezultate ispitivanja vezivanja humanizovanih antitela BIIB048 (= H0L0), i H0V50AL2N31Aza nekoliko JCV-VP1 divljeg tipa i mutantnih JCV-VP1 upotrebom testa ELISA. Slika 7 donosi pregled kombinovane učestalosti mutacije VP1 virusa JCV.

Slika 8 pokazuje sposobnost antitela H0L0 da suprimira infektivnost JCV.

Slika 9 prikazuje pregled preparata virusa za test infektivnosti.

Slika 10 prikazuje pregled testa infektivnosti virusnog mutanta.

Slika 11 prikazuje rezultate testa infektivnosti virusnog mutanta kao što pokazuje Western blot. Slika 12 prikazuje rezultate testa infektivnosti virusnog mutanta kao što pokazuje Western blot. Slika 13 prikazuje rezultate testa infektivnosti virusnog mutanta kao što pokazuje Western blot. Slika 14 prikazuje rezultate testa infektivnosti virusnog mutanta kao što pokazuje Western blot. Slika 15 prikazuje pregled ELISA testa vezivanja JCV-VLP1.

Slika 16 prikazuje pregled ELISA testa vezivanja JCV-VLP1.

Slika 17 prikazuje rezultate ELISA testa vezivanja JCV-VLP1.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0022] U nekim slučajevima, aspekti opisa odnose se na antitela koja se vezuju za jedan ili više proteina virusa JC (JCV). U nekim slučajevima, JCV-vezujuća antitela su neutrališuća antitela koja snižavaju ili inhibiraju jednu ili više funkcija JCV. U nekim slučajevima, neutrališuće antitelo inhibira replikaciju, proliferaciju, i/ili infektivnost JCV. U nekim slučajevima, neutrališuće antitelo indukuje klirens virusa pomoću imunog sistema, blokira interakcije virus-receptor, i/ili izaziva poremećaj virusnih kapsida.

[0023] U nekim slučajevima, antitela koja se vezuju za kapsidni protein JCV, na primer protein VP1 virusa JCV, su neutrališuća antitela. U nekim slučajevima, antitela koja se vezuju za vezivni džep za sijalinsku kiselinu proteina VP1 virusa JCV su neutrališuća antitela. Iznenađujuće, antitelo koje neutrališe JCV koje se vezuje za VP1 može da bude efikasno protiv dve ili više različitih varijanti JCV, uključujući varijante koje imaju jednu ili više izmena aminokiselinske sekvence u vezivnom džepu za sijalinsku kiselinu u proteinu VP1.

[0024] Neutrališuće antitelo može da bude korisno u sprečavanju, kontrolisanju, i/ili lečenju jednog ili više stanja povezanih sa infekcijom virusom JCV. Infekcija virusom JCV je veoma rasprostranjena kod ljudi. Primarna infekcija virusom JCV može da se dogodi asimptomatski tokom detinjstva. JCV može da se širi po celom telu, verovatno putem viremije, i smatra se da JCV često perzistira uglavnom u mozgu i bubrežnom tkivu. Dok je infekcija JCV kod većine osoba asimptomatska, kod nekih osoba infekcija može da rezultuje ozbiljnim stanjima (kao što je PML), čak i smrću. Osobe najpodložnije PML su osobe koje su imunokompromitovane (npr.,pacijenti sa AIDS-om) ili osobe koje se leče imunosupresivima (na primer posle transplantacije organa ili za lečenje stanja povezanog sa zapaljenjem kao što je multipla skleroza). Neutrališuća antitela opisana u ovom dokumentu mogu da se koriste za lečenje pacijenata koji su pod rizikom za razvoj stanja povezanog sa JCV. U nekim slučajevima, imunokompromitovani pacijent može da se leči antitelom koje neutrališe JCV da bi se smanjio rizik od PML ili drugog stanja povezanog sa JCV, čak i ako lečenje ne uklanja sve viruse JCV iz organizma pacijenta. Treba napomenuti da inhibicijom proliferacije JCV (npr., replikacija i/ili rasprostiranje JCV u telu subjekta), rizik od stanja povezanog sa JCV može da bude smanjen i/ili kontrolisan kao deo programa lečenja imunokompromitovanog pacijenta. U nekim slučajevima, kod pacijenta koji prima imunosupresivni lek (npr., Tysabri) može da se prati pojava jednog ili više znakova ili simptoma stanja povezanog sa JCV (npr., PML). Ako se znak ili simptom detektuju, može da se primeni antitelo koje neutrališe JCV. U nekim slučajevima, imunosupresivno lečenje takođe može da bude obustavljeno ili redukovano da bi se pacijentovom imunom sistemu omogućilo da se oporavi i suprotstavi infekciji ili proliferaciji virusa JCV. Međutim, treba napomenuti da antitelo koje neutrališe JCV može da se koristi u različitim terapijskim postupcima za lečenje ili prevenciju infekcija virusom JCV i/ili stanja povezanih sa JCV, kao što je u ovom dokumentu detaljnije opisano. Takođe treba napomenuti da antitelo koje neutrališe JCV može da se koristi kao reagens, na primer reagens za test, za detekciju prisustva proteina ili virusa JCV u uzorku. U nekim slučajevima, ovde opisana antitela mogu da se koriste kao reagensi za detekciju ili kvantitativno određivanje virusa.

[0025] U nekim slučajevima, određene varijante JCV su povezane sa povećanim rizikom od bolesti ili poremećaja uzrokovanog infekcijom virusom JCV. Na primer, određene mutacije u vezivnom džepu za sijalinsku kiselinu proteina VP1 virusa JCV povezane su sa povećanim rizikom za PML. U nekim slučajevima, antitelo koje neutrališe JCV je specifično za jednu ili više varijanti JCV. U nekim slučajevima, antitelo koje neutrališe JCV vezuje se za nekoliko varijanti JCV sa dovoljnim afinitetom da bude terapijski efikasno protiv tih varijanti. U nekim slučajevima, antitelo koje neutrališe JCV vezuje se za vezivni džep za sijalinsku kiselinu virusa JCV. Treba napomenuti da je objavljeno da vezivni džep za sijalinsku kiselinu predstavlja domen virusa koji interaguje sa receptorom. U nekim slučajevima, vezivni džep za sijalinsku kiselinu uključuje aminokiseline 55-76 i aminokiseline 265-273 u JCV (Videti npr., Gee et al., 2004, JBC 279: 49172-49176). U nekim slučajevima, antitelo koje neutrališe JCV vezuje se za nekoliko varijanti JCV gde svaka ima jednu ili više aminokiselinskih izmena u vezivnom džepu za sijalinsku kiselinu. Međutim, u nekim slučajevima, određene aminokiselinske izmene u vezivnom džepu za sijalinsku kiselinu redukuju vezivanje (i inhibiciju) antitela koje neutrališe JCV. U nekim slučajevima, subjekt se podvrgava skriningu za infekciju virusom JCV. U nekim slučajevima, subjekt se podvrgava skriningu za infekciju varijantom JCV. U nekim slučajevima, kod subjekta (na primer subjekta za koga se zna da je inficiran virusom JCV) može da se prati pojava jedne ili više varijanti JCV koje nose veći rizik. Pozitivan rezultat na infekciju virusom JCV i/ili prisustvo određenih varijanti JCV u uzorku uzetom od pacijenta može da se koristi kao osnova za započinjanje lečenja antitelom koje neutrališe JCV. Međutim, treba napomenuti da u nekim slučajevima antitelo koje neutrališe JCV može da se primeni kod pacijenta na osnovu povećanog rizika od infekcije i/ili proliferacije JCV, i/ili povećanog rizika od stanja povezanog sa JCV, bez obzira na to da li je urađen test za detekciju JCV kod pacijenta.

[0026] Snižavanje replikacije, proliferacije, infektivnosti i/ili bilo koje druge funkcije virusa JC uzrokovano antitelom može da se meri (npr., upotrebom in vitro i/ili in vivo testa) poređenjem jedne ili više funkcija JCV u prisustvu naspram odsustva antitela. U nekim slučajevima, neutrališuće antitelo može da rezultuje snižavanjem jedne ili više virusnih funkcija (npr., replikacije, proliferacije, infekcije, itd.) za oko 5%, oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, ili više.

Antitela:

[0027] U nekim slučajevima, antitelo je monoklonsko antitelo protiv VLP virusa JCV. U nekim slučajevima, antitelo je specifično za JCV. U nekim slučajevima, antitelo je specifično za VP1 virusa JCV.

[0028] U nekim slučajevima, neutrališuće antitelo koje je specifično za JCV ima neutrališuće dejstvo na aktivnost JCV koje je značajno veće od njegovog neutrališućeg dejstva na aktivnost jednog ili više drugih virusa, na primer, srodnog virusa (npr., BK virus). Međutim, u nekim slučajevima, neutrališuće antitelo može da se veže za jedan ili više virusa sa dovoljnim afinitetom da bude korisno za lečenje jedne ili više različitih virusnih infekcija.

[0029] U nekim slučajevima, antitelo je monoklonsko antitelo. U nekim slučajevima, antitelo je humanizovano. U nekim slučajevima, antitelo ima sekvencu R399 ili R411 kao što je ovde opisano.

[0030] U nekim slučajevima, antitelo sadrži jednu ili više od sledećih CDR sekvenci: CDR1: SEQ ID NO:2, 7, 16-18, 31-33; CDR2: SEQ ID NO:3, 8, 34-37; CDR3: SEQ ID NO:4, 9.

[0031] U nekim slučajevima, antitelo sadrži jednu ili više od sledećih CDR sekvenci: CDR1: SEQ ID NO:40, 45, 61-63; CDR2: SEQ ID NO:41, 46, 64, 65; CDR3: SEQ ID NO:42, 47.

[0032] U nekim slučajevima, antitelo sadrži jednu ili više od sledećih CDR sekvenci: CDR1: QASQSIGXNLA (SEQ ID NO:18, 399-1 N31X), CDR1: GFSFDRNYWIX (SEQ ID NO:33, 399-h C35X), CDR2: LASYLAS (SEQ ID NO:3, 399-1), CDR2: XISAGGSGNTYYATWAKG (SEQ ID NO:37, 399-h C50X), CDR3: QSSYYSPNDNA (SEQ ID NO:4, 399-1), CDR3: FYSGGGYYAGYFTL (SEQ ID NO:9, 399-h), i CDR sekvence sa do dve aminokiselinske mutacije u poređenju sa SEQ ID NO:18, 33, 3, 37, 4 i 9.

[0033] U nekim slučajevima, antitelo sadrži jednu ili više od sledećih CDR sekvenci: CDR1: QASQSIGGNLA (SEQ ID NO:17, 399-1 N31G), CDR1: GFSFDRNYWIA (SEQ ID NO:31, 399-h C35A), CDR2: LASYLAS (SEQ ID NO:3, 399-1), CDR2: AISAGGSGNTYYATWAKG (SEQ ID NO:35, 399-h C50A), CDR3: QSSYYSPNDNA (SEQ ID NO:4, 399-1), CDR3: FYSGGGYYAGYFTL (SEQ ID NO:9, 399-h), i CDR sekvence sa do dve aminokiselinske mutacije u poređenju sa SEQ ID NO:17, 31, 3, 35, 4 i 9.

[0034] U nekim slučajevima, antitelo sadrži jednu ili više od sledećih CDR sekvenci: CDR1: QASQSIGGNLA (SEQ ID NO:17, 399-1 N31G), CDR1: GFSFDRNYWIA (SEQ ID NO:31, 399-h C35A), CDR2: LASYLAS (SEQ ID NO:3, 399-1), CDR2: AISAGGSGNTYYATWAKG (SEQ ID NO:35, 399-h C50A), CDR3: QSSYYSPNDNA (SEQ ID NO:4, 399-1), i CDR3: FYSGGGYYAGYFTL (SEQ ID NO:9, 399-h).

[0035] U nekim slučajevima, antitelo sadrži jedan ili više od sledećih CDR: CDR3: QSSYYSPNDNA (SEQ ID NO:4, 399-1), i CDR3: FYSGGGYYAGYFTL (SEQ ID NO:9, 399-h) i CDR sekvence sa do dve aminokiselinske mutacije u poređenju sa SEQ ID NO:4 i 9.

[0036] U nekim slučajevima, antitelo sadrži sledeće CDR: CDR1: QASQSIGGNLA (SEQ ID NO:17, 399-1 N31G), CDR2: LASYLAS (SEQ ID NO:3, 399-1), i CDR3: QSSYYSPNDNA (SEQ ID NO:4, 399-1).

[0037] U nekim slučajevima, antitelo sadrži sledeće CDR: CDR1: GFSFDRNYWIA (SEQ ID NO:31, 399-h C35A), CDR2: AISAGGSGNTYYATWAKG (SEQ ID NO:35, 399-h C50A), i CDR3: FYSGGGYYAGYFTL (SEQ ID NO:9, 399-h).

[0038] U nekim slučajevima, antitelo sadrži jedan ili više od sledećih CDR: CDR1: QASQSIGGNLA (SEQ ID NO:17, 399-1 N31G), CDR1: GFSFDRNYWIA (SEQ ID NO:31, 399-h C35A), CDR2: LASYLAS (SEQ ID NO:3, 399-1), CDR2: AISAGGSGNTYYATWAKG (SEQ ID NO:35, 399-h C50A), CDR3: QSSYYSPNDNA (SEQ ID NO:4, 399-1), i CDR3: FYSGGGYYAGYFTL (SEQ ID NO:9, 399-h).

[0039] U nekim slučajevima, antitelo ima sledeći CDR3 teškog lanca: FYSGGGYYAGYFTL (SEQ ID NO:9, 399-h), i/ili sledeći CDR3 lakog lanca: QSSYYSPNDNA (SEQ ID NO:4, 399-1).

[0040] U nekim slučajevima, antitelo ima sledeći CDR2 teškog lanca: AISAGGSGNTYYATWAKG (SEQ ID NO:35, 399-h C50A), i/ili sledeći CDR2 lakog lanca: LASYLAS (SEQ ID NO:3, 399-1).

[0041] U nekim slučajevima, antitelo ima sledeći CDR1 teškog lanca: GFSFDRNYWIA (SEQ ID NO:31, 399-h C35A), i/ili sledeći CDR1 lakog lanca: QASQSIGGNLA (SEQ ID NO:17, 399-1 N31G).

[0042] U nekim slučajevima, urađena je jedna ili više promena u cilju humanizacije: pozicija 8 u CDR1 varijabilnog lakog lanca, videti npr., SEQ ID NO: 16-18.

[0043] U nekim slučajevima, antitelo ima varijabilni region teškog lanca koji ima jednu od sledećih SEQ ID NO:6, 19-30. U nekim slučajevima, antitelo ima varijabilni region lakog lanca koji ima jednu od sledećih SEQ ID NO:1, 11-15.

[0044] U nekim slučajevima, antitelo ima varijabilni region teškog lanca koji ima jednu od sledećih SEQ ID NO:43, 51-60. U nekim slučajevima, antitelo ima varijabilni region lakog lanca koji ima jednu od sledećih SEQ ID NO: 38, 48-50.

[0045] U nekim primerima izvođenja, antitelo ima varijabilni region teškog lanca koji ima SEQ ID NO:20. U nekim primerima izvođenja, antitelo ima varijabilni region lakog lanca koji ima SEQ ID NO:15.

[0046] U nekim slučajevima, jedna ili više od sledećih promena u cilju humanizacije učinjena je u varijabilnom regionu lakog lanca na sledećim aminokiselinama Phe na poziciji 2, Asn na poziciji 22, Gln na poziciji 70 i Val na poziciji 75, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 13-15. U nekim slučajevima, jedna ili više od sledećih promena u cilju humanizacije učinjena je u varijabilnom regionu lakog lanca na sledećim aminokiselinama Phe na poziciji 2, Asn na poziciji 22, Gln na poziciji 70 i Val na poziciji 75, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 13-15.

[0047] U nekim primerima izvođenja, antitelo može da bude VP-1-vezujuće antitelo suštinski cele dužine ili njegov funkcionalni fragment. Na primer, ako je fragment antitela koje se vezuje za VP-1 dovoljan da omogući specifično vezivanje antitela koje specifično vezuje VP-1-vezujuće antitelo, to je funkcionalno antitelo koje se vezuje za VP-1 i može da se koristi u postupcima i kompletima prema opisu. U nekim primerima izvođenja, fragment antitela može da se koristi ako se vezuje u meri dovoljnoj da inhibira funkciju JCV i/ili da bude upotrebljiv kao sredstvo za detekciju JCV. Stručnjak u ovoj oblasti će moći da identifikuje fragmente antitela koje se vezuje za VP-1 i da odredi da li fragment antitela koje se vezuje za VP-1 predstavlja funkcionalni fragment antitela koje se vezuje za VP-1 samo upotrebom rutinskih procedura i testova vezivanja (npr., testovi kompeticije upotrebom antitela koje se vezuje za VP-1 suštinski cele dužine kao što je opisano u ovom dokumentu.

[0048] U nekim primerima izvođenja, antitelo može da bude himerno antitelo koje sadrži varijabilni region (npr., humanizovani varijabilni region) iz prve vrste (npr., zeca) i Fc region iz druge vrste (npr., čoveka). Kao što će stručnjaku u ovoj oblasti biti očigledno, predmetni opis obezbeđuje i fragmente F(ab')2, Fab, Fv i Fd; himerna antitela u kojima su Fc i/ili FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 regioni lakog lanca zamenjeni homologim humanim ili nehumanim sekvencama; himerni F(ab')2 fragment antitela u kome su FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 regioni lakog lanca zamenjeni homologim humanim ili nehumanim sekvencama; himerni Fab fragment antitela u kome su FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 i/ili CDR3 regioni lakog lanca zamenjeni homologim humanim ili nehumanim sekvencama; i himerni Fd fragment antitela u kome su FR i/ili CDR1 i/ili CDR2 regioni lakog lanca zamenjeni homologim humanim ili nehumanim sekvencama.

[0049] U određenim slučajevima, antitelo koje neutrališe JCV može da bude jednolančano anti-VP1 antitelo, antitelo sa jednim domenom, ili Nanobody™. Karakteristike svakog od ovih tipova antitela i postupci za njihovu upotrebu su dobro poznati u stanju tehnike. Nanobodies™ su najmanji funkcionalni fragmenti antitela i dobijeni su od prirodnih jednolančanih antitela (videti Ablynx, Belgija; ablynx.com). Tehnologija Nanobody™ je razvijena nakon otkrića da kamelide (kamile i lame) poseduju jedinstveni repertoar potpuno funkcionalnih antitela kojima nedostaju laki lanci. Struktura Nanobody™ se sastoji od jednog varijabilnog domena (VHH), regiona zgloba, i dva konstantna domena (CH2 i CH3). Klonirani i izolovani VHH domen je stabilan polipeptid koji poseduje potpuni kapacitet vezivanja antigena kao originalni teški lanac. Nanobodies™ kombinuju svojstva uobičajenih antitela sa svojstvima niskomolekulskih lekova. Nanobodies™ pokazuju visoku ciljnu specifičnost i nisku inherentnu toksičnost. Dodatno, Nanobodies™ su veoma stabilna, mogu da se primene i drugim sredstvima osim injekcije, i lako se proizvode. U određenim slučajevima, terapijsko antitelo koje neutrališe JCV, fragment za imobilizaciju, i/ili fragment za detekciju mogu da budu humanizovana antitela Nanobody™.

[0050] U nekim slučajevima, primer antitela koje neutrališe JCV ima jedan ili više CDR, npr., sva tri CDR teškog lanca (HC) i/ili sva tri CDR lakog lanca (LC) određenog antitela opisanog u ovom dokumentu, ili CDR koji su, ukupno uzevši, najmanje 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, ili 99% identični takvom antitelu, npr., CDR1: SEQ ID NO:2, 7, 16-18, 31-33; CDR2: SEQ ID NO:3, 8, 34-37; CDR3: SEQ ID NO:4, 9, i CDR1: SEQ ID NO:40, 45, 61-63; CDR2: SEQ ID NO:41, 46, 64, 65; CDR3: SEQ ID NO:42, 47. U nekim slučajevima, primer antitela koje neutrališe JCV ima jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR, npr., sva tri CDR teškog lanca (HC) i/ili sva tri CDR lakog lanca (LC) određenog antitela opisanog u ovom dokumentu.

[0051] U nekim slučajevima, primer antitela koje neutrališe JCV ima jedan ili više CDR, npr., sva tri CDR teškog lanca (HC) i/ili sva tri CDR lakog lanca (LC) određenog antitela opisanog u ovom dokumentu, ili CDR koji uključuju jedan, do dva, do tri, do četiri, do pet, do šest, do sedam, do osam, do devet ili do deset aminokiselinskih izmena u poređenju sa npr., CDR1: SEQ ID NO:2, 7, 16-18, 31-33; CDR2: SEQ ID NO:3, 8, 34-37; CDR3: SEQ ID NO:4, 9, i CDR1: SEQ ID NO:40, 45, 61-63; CDR2: SEQ ID NO:41, 46, 64, 65; CDR3: SEQ ID NO:42, 47. U jednom slučaju, hipervarijabilne petlje H1 i H2 imaju istu kanonsku strukturu kao ovde opisano antitelo. U jednom slučaju, hipervarijabilne petlje L1 i L2 imaju istu kanonsku strukturu kao ovde opisano antitelo.

[0052] U jednom slučaju, aminokiselinska sekvenca varijabilnog domena HC i/ili LC je najmanje 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci varijabilnog domena HC i/ili LC ovde opisanog antitela, npr., SEQ ID NO 1, 6, 11-15, 19-30 i 43, 51-60, 38, 48-50. Aminokiselinska sekvenca varijabilnog domena HC i/ili LC može da se razlikuje za najmanje jednu aminokiselinu, ali ne više od deset, osam, šest, pet, četiri, tri, ili dve aminokiseline od odgovarajuće sekvence antitela opisanog u ovom dokumentu, npr.,SEQ ID NO 1, 6, 11-15, 19-30 i 43, 51-60, 38, 48-50. Na primer, razlike mogu da budu primarno ili u potpunosti u okvirnim regionima.

[0053] Aminokiselinske sekvence sekvenci varijabilnog domena HC i LC mogu da budu kodirane sekvencom koja hibridizuje pod strogim uslovima sa sekvencom nukleinske kiseline koja je ovde opisana, ili sa onom koja kodira varijabilni domen, ili sa nukleinskom kiselinom koja kodira ovde opisanu aminokiselinsku sekvencu. U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske sekvence jednog ili više okvirnih regiona (npr., FR1, FR2, FR3, i/ili FR4) varijabilnog domena HC i/ili LC su najmanje 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99, ili 100% identične odgovarajućim okvirnim regionima varijabilnih domena HC i LC antitela opisanog u ovom dokumentu. U jednom primeru izvođenja, jedan ili više okvirnih regiona teškog ili lakog lanca (npr., HC FR1, FR2, i FR3) su najmanje 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ili 100% identični sekvenci odgovarajućih okvirnih regiona humanog antitela germinativne linije.

[0054] Izračunavanja "homologije" ili "identičnosti sekvence" između dve sekvence (izrazi se u ovom tekstu koriste kao sinonimi) može da se izvede kao što sledi. Sekvence se poravnaju u svrhu optimalnog poređenja (npr., mogu da se uvedu praznine u jednu ili obe od prve i druge aminokiselinske sekvence ili sekvence nukleinske kiseline za optimalno poravnanje i nehomologe sekvence mogu da se zanemare u svrhe poređenja). Optimalno poravnanje se određuje kao najbolji rezultat upotrebom GAP programa u programskom paketu GCG sa matricom bodovanja Blossum 62 sa kaznom za prazninu od 12, kaznom za dužinu praznine od 4, i kaznom za pomeranje okvira od 5. Nakon toga, porede se aminokiselinske rezidue ili nukleotidi na odgovarajućim aminokiselinskim pozicijama ili nukleotidnim pozicijama. Kada je pozicija u prvoj sekvenci zauzeta istom aminokiselinskom reziduom ili nukleotidom kao odgovarajuća pozicija u drugoj sekvenci, tada su molekuli identični na toj poziciji (u značenju koje je ovde upotrebljeno, "identičnost" aminokiselina ili nukleinskih kiselina ekvivalentna je "homologiji" aminokiselina ili nukleinskih kiselina). Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele sekvence.

[0055] Iskusni stručnjak će razumeti da konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu da budu uvedene u antitela koja neutrališu JCV da bi se dobile funkcionalno ekvivalentne varijante ovih antitela, npr., varijante koje zadržavaju funkcionalne sposobnosti inhibiranja jedne ili više funkcija JCV. U značenju koje je ovde primenjeno, "konzervativna aminokiselinska supstitucija" odnosi se na aminokiselinsku supstituciju koja ne menja relativno naelektrisanje ili karakteristike veličine proteina u kome je izvedena aminokiselinska supstitucija. Varijante mogu da se pripreme prema postupcima za izmenu polipeptidne sekvence poznatim stručnjaku u ovoj oblasti kao što su one koje se mogu naći u referencama koje prikazuju takve postupke, npr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, ili Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York. Primeri funkcionalno ekvivalentnih varijanti antitela koja neutrališu JCV uključuju konzervativne aminokiselinske supstitucije u aminokiselinskim sekvencama proteina koje su ovde opisane. Konzervativne aminokiselinske supstitucije uključuju supstitucije izvedene između aminokiselina u okviru sledećih grupa: (a) M, I, L, V; (b) F, Y5 W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; i (g) E, D.

[0056] U značenju koje je ovde primenjeno, izraz "hibridizuje pod strogim uslovima" opisuje uslove hibridizacije i pranja. Uputstva za izvođenje reakcija hibridizacije mogu se naći u Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6,. U toj referenci su opisani vodeni i nevodeni uslovi i mogu da se koriste bilo koji od njih. Strogi uslovi hibridizacije mogu da uključuju hibridizaciju u 6X SSC na oko 45°C, praćenu jednim ili većim brojem pranja u 0.2X SSC, 0.1% SDS na 65°C, ili suštinski slične uslove.

[0057] Funkcionalna svojstva antitela, na primer, neutralizacija JCV, mogu da se ispitaju npr., kao što je opisano u ovom dokumentu, ili upotrebom drugih tehnika za procenu replikacije, umnožavanja, infektivnosti, i/ili drugih funkcija JCV.

[0058] U nekim slučajevima, može da se koristi kombinacija dva ili više antitela. U nekim slučajevima, jedno ili više antitela može da se koristi u kombinaciji sa jednim ili više drugih sredstava. U nekim slučajevima, mogu da se koriste tetravalentna antitela, antitela kuplovana sa transporterima kroz krvno-moždanu barijeru, antitela kuplovana sa kontrastnim bojama, i/ili radioaktivno obeležena antitela (npr., kao markeri prisustva JCV kod pacijenata).

Dobijanje antitela i antigen-vezujućih fragmenata:

[0059] Antitela koja neutrališu JCV mogu da se stvore imunizacijom, npr., upotrebom životinje kao što je zec. VLP virusa JCV, ili protein VLP (npr.,VP1) mogu da se koriste kao imunogen. U nekim slučajevima, može da se koristi VLP ili protein VLP koji ima sekvencu divljeg tipa ili normalnu sekvencu. U nekim slučajevima, VLP ili protein VLP koji ima jednu ili više mutacija (na primer u vezivnom džepu za sijalinsku kiselinu u VP1) može da se koristi kao imunogen.

[0060] Izrazi "antitelo" i "imunoglobulin" se u ovom dokumentu koriste kao sinonimi. Antitelo ili imunoglobulin sadrži bar varijabilni domen teškog lanca, a normalno sadrži bar varijabilne domene teškog lanca i lakog lanca. Osnovne strukture imunoglobulina kičmenjaka su relativno dobro shvaćene. Videti, npr., Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988). Antitela ili imunoglobulini uključuju široke klase polipeptida koji mogu da se razlikuju biohemijski. Stručnjaci u ovoj oblasti će znati da su teški lanci klasifikovani kao gama, mi, alfa, delta, ili epsilon, uz neke potklase među njima (npr., gama1-gama4). Priroda ovog lanca određuje "klasu" antitela kao IgG, IgM, IgA IgG, ili IgE, redom. Potklase imunoglobulina (izotipovi) npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, itd. su dobro okarakterisane i poznato je da one daju funkcionalnu specijalizaciju. Stručnjaku u ovoj oblasti je lako da zapazi modifikovane verzije svake od ovih klasa i izotipova u pogledu predmetnog opisa i antitela koja neutrališu JCV različitih klasa mogu da se dobiju ili konstruišu kao što je opisano u ovom dokumentu. Treba napomenuti da su sve imunoglobulinske klase obuhvaćene obimom predmetnog pronalaska. Međutim, diskusija koja sledi će uopšteno biti usmerena na IgG klasu imunoglobulinskih molekula. U pogledu IgG, standardni imunoglobulinski molekul sadrži dva identična polipeptida lakog lanca molekulske težine od približno 23 000 Daltona, i dva identična polipeptida teškog lanca molekulske težine 53 000-70 000. Četiri lanca su tipično povezana disulfidnim vezama u "Y" konfiguraciju u kojoj laki lanci uokviruju teške lance koji polaze od ušća "Y" i nastavljaju se kroz varijabilni region.

[0061] Laki lanci su klasifikovani kao kapa ili lambda. Svaka klasa teškog lanca može da bude vezana ili sa kapa ili sa lambda lakim lancem. Uopšteno, laki i teški lanci su kovalentno vezani jedan za drugi, i "repni" delovi dva teška lanca su vezani jedan za drugi kovalentnim disulfidnim vezama ili nekovalentnim vezama kada su imunoglobulini stvoreni pomoću hibridoma, B-ćelija ili genetski konstruisanih ćelija-domaćina. U teškom lancu, aminokiselinske sekvence polaze od N-terminalnog kraja na račvastim krajevima Y konfiguracije ka C-terminalnom kraju na dnu svakog lanca.

[0062] I laki i teški lanci su podeljeni na regione strukturne i funkcionalne homologije. Izrazi "konstantni" i "varijabilni" koriste se u funkcionalnom značenju. U tom smislu, biće razumljivo da varijabilni domeni i lakog (VL) i teškog (VH) lanca određuju prepoznavanje i specifičnost za antigen. Nasuprot tome, konstantni domeni lakog lanca (CL) i teškog lanca (CH1, CH2 ili CH3) daju važna biološka svojstva kao što su izlučivanje, pokretljivost kroz placentu, vezivanje za Fc receptor, vezivanje za komplement, i slično. Po konvenciji, numerisanje domena konstantnog regiona se povećava kako postaju udaljeniji od mesta vezivanja antigena ili amino-terminalnog kraja antitela. N-terminalni deo je varijabilni region, a na C-terminalnom delu je konstantni region; CH3 i CL domeni zapravo sadrže karboksi-terminalni kraj teškog, odnosno lakog lanca.

[0063] Kao što je opisano u ovom dokumentu, varijabilni region omogućava antitelu da selektivno prepozna i specifično veže epitope na antigenima. To znači da se VL domen i VH domen, ili podset regiona koji određuju komplementarnost (CDR) antitela kombinuju da bi obrazovali varijabilni region koji definiše trodimenzionalno mesto vezivanja antigena. Ova kvaternarna struktura antitela obrazuje mesto vezivanja antigena prisutno na kraju svake ručice Y. Specifičnije, mesto vezivanja antigena definisano je pomoću tri CDR na svakom od VH i VL lanaca. U nekim slučajevima, npr., kod određenih imunoglobulinskih molekula dobijenih od kamelida ili konstruisanih na osnovu imunoglobulina kamelida, kompletan imunoglobulinski molekul može da se sastoji samo od teških lanaca, bez lakih lanaca. Videti, npr., Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993).

[0064] Kod prirodnih antitela, šest "regiona koji određuju komplementarnost" ili "CDR" prisutnih u svakom antigen-vezujućem domenu su kratke, nesusedne sekvence aminokiselina koje su specifično razmeštene tako da obrazuju antigen-vezujući domen kako antitelo zauzima svoju trodimenzionalnu konfiguraciju u vodenoj sredini. Preostale aminokiseline u antigen-vezujućim domenima, označene kao "okvirni" regioni, pokazuju manje intermolekularne varijabilnosti. Okvirni regioni uglavnom zauzimaju konfiguraciju beta-naborane ploče, a CDR regioni obrazuju petlje koje spajaju, i u nekim slučajevima čine deo strukture beta-naborane ploče. Na taj način okvirni regioni deluju tako što obrazuju skafolde koji obezbeđuju postavljanje CDR u ispravnu orjentaciju interlančanim, nekovalentnim interakcijama. Antigen-vezujući domen obrazovan postavljanjem CDR u odgovarajući položaj definiše površinu komplementarnu epitopu na imunoreaktivnom antigenu. Ova komplementarna površina podstiče nekovalentno vezivanje antitela sa njemu srodnim epitopom. Stručnjak u ovoj oblasti može lako da identifikuje aminokiseline koje sačinjavaju CDR, odnosno okvirne regione, za svaki dati varijabilni region teškog ili lakog lanca, budući da su oni precizno definisani (videti, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); i Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987).

[0065] Treba napomenuti da antitela dobijena kao što je opisano u ovom dokumentu mogu da se izmene da bi se uklonio ili zamenio jedan ili više CDR. U nekim slučajevima, mogu da budu stvoreni antigen-vezujući fragmenti koji zadržavaju antigenu specifičnost, ali im nedostaje jedan ili više od šest CDR antitela celokupne dužine. Alternativno, jedan ili više CDR iz antitela može da bude zadržan (na primer CDR3) i jedan ili više od drugih CDR može da bude konstruisan i/ili zamenjen drugačijim CDR regionom, na primer, da bi se izmenila antigen-vezujuća specifičnost i/ili afinitet.

[0066] U slučaju kada postoje dve ili više definicija izraza koji je upotrebljen i/ili prihvaćen u ovoj oblasti, definicija izraza koja se ovde koristi namenjena je da uključuje sva takva značenja, osim ako nije jasno navedeno suprotno. Specifičan primer je upotreba izraza "region koji određuje komplementarnost" ("CDR") za opisivanje nesusednih antigen-kombinujućih mesta nađenih u varijabilnom regionu polipeptida teškog i lakog lanca. Ovaj konkretni region opisan je kod Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) i kod Chothia et al., J. Mol. Biol.196:901-917 (1987), gde definicije uključuju preklapanje ili podsetove aminokiselinskih rezidua kada se porede jedne sa drugima. Ipak, upotreba bilo koje od definicija za označavanje CDR antitela ili njegovih varijanti obuhvaćena je terminom koji je ovde definisan i koristi se u ovom tekstu. Precizni brojevi rezidua koje obuhvataju određeni CDR variraće u zavisnosti od sekvence i veličine CDR. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu rutinski da odrede koje rezidue sačinjavaju određeni CDR date aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona antitela.

[0067] Kabat et al. su takođe definisali sistem numeracije za sekvence varijabilnog domena koji je primenljiv na svako antitelo. Stručnjak u ovoj oblasti može nedvosmisleno da dodeli ovaj sistem "numeracije po Kabatu" bilo kojoj sekvenci varijabilnog domena, bez oslanjanja na eksperimentalne podatke van same sekvence. U značenju koje je ovde primenjeno, "numeracija po Kabatu" se odnosi na sistem numeracije prikazan kod Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Osim ako nije drugačije naznačeno, pozivanje na numeraciju pozicija specifične aminokiselinske rezidue u neutrališućem antitelu ili antigen-vezujućem fragmentu, varijanti, ili njihovom derivatu prema predmetnom opisu, uključujući predmetni pronalazak, odnosi se na sistem numeracije po Kabatu.

[0068] Kod vrsta koje pripadaju kamelidama, varijabilni region teškog lanca, označen kao VHH, obrazuje ceo antigen-vezujući domen. Glavne razlike između VHH varijabilnih regiona kamelida i onih dobijenih iz konvencionalnih antitela (VH) uključuju (a) više hidrofobinih aminokiselina u kontaktnoj površini lakog lanca u VH, u poređenju sa odgovarajućim regionom u VHH, (b) duži CDR3 u VHH, i (c) čestu pojavu disulfidnih veza u CDR1 i CDR3 u VHH.

[0069] Kao što je opisano u ovom dokumentu, antitela koja vezuju JCV ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante, ili derivati uključuju, ali nisu ograničeni na poliklonska, monoklonska, multispecifična, humana, humanizovana, primatizovana, ili himerna antitela, jednolančana antitela, epitop-vezujuće fragmente, npr., Fab, Fab' i F(ab')2, Fd, Fv, jednolančane Fv (scFv), jednolančana antitela, disulfidno-vezane Fv (sdFv), fragmente koji sadrže ili VL ili VH domen, fragmente proizvedene pomoću biblioteke ekspresije Fab, i anti-idiotipska (anti-Id) antitela (uključujući, npr., anti-Id antitela na ovde opisana neutrališuća antitela). ScFv molekuli su poznati u stanju tehnike i opisani su, npr., u SAD pat. br.5,892,019. JCV neutrališući imunoglobulinski molekuli ili molekuli antitela mogu da budu bilo kog tipa (npr., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, i IgY), klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili potklase imunoglobulinskog molekula.

[0070] Fragmenti antitela koje neutrališe JCV, uključujući jednolančana antitela, mogu da sadrže varijabilni region/regione pojedinačno, ili u kombinaciji sa celim ili delom sledećeg: regiona zgloba, CH1, CH2, i CH3 domena. Takođe, antigen-vezujući fragmenti koji neutrališu JCV mogu da sadrže bilo koji kombinaciju varijabilnog/varijabilnih regiona sa regionom zgloba, CH1, CH2, i CH3 domenima.

[0071] U značenju koje je ovde primenjeno, izraz "deo teškog lanca" uključuje aminokiselinske sekvence dobijene od teškog lanca imunoglobulina. Polipeptid koji sadrži deo teškog lanca sadrži bar jedno od: CH1 domena, domena zgloba (npr., gornji, srednji, i/ili donji region zgloba), CH2 domena, CH3 domena, ili njegove varijante ili fragmenta. Na primer, vezujući polipeptid za upotrebu u pronalasku može da sadrži polipeptidni lanac koji sadrži CH1 domen; polipeptidni lanac koji sadrži CH1 domen, bar deo domena zgloba i CH2 domen; polipeptidni lanac koji sadrži CH1 domen i CH3 domen; polipeptidni lanac koji sadrži CH1 domen, bar deo domena zgloba i CH3 domen, ili polipeptidni lanac koji sadrži CH1 domen, bar deo domena zgloba, CH2 domen i CH3 domen. U drugom promeru izvođenja, polipeptid prema pronalasku sadrži polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen. Dalje, vezujućem polipeptidu za upotrebu u pronalasku može da nedostaje bar deo CH2 domena (npr., ceo ili deo CH2 domena). Kao što je gore prikazano, stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da ovi domeni (npr., delovi teškog lanca) mogu da budu modifikovani tako da variraju u aminokiselinskoj sekvenci u odnosu na prirodni imunoglobulinski molekul.

[0072] U značenju koje je ovde primenjeno, izraz "deo lakog lanca" uključuje aminokiselinske sekvence dobijene od lakog lanca imunoglobulina. Poželjno, deo lakog lanca sadrži bar jedan od VL ili CL domena.

[0073] Neutrališuća antitela, ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante, ili derivati opisani u ovom tekstu mogu da budu opisani ili specifikovani u smislu jednog ili više epitopa ili delova antigena, npr., ciljnog polipeptida proteina VP1 virusa JCV koji oni prepoznaju ili specifično vezuju. Deo ciljnog polipeptida koji specifično interaguje sa antigen-vezujućim domenom antitela je "epitop", ili "antigena determinanta". Ciljni epitop može da sadrži jedan epitop, ali tipično sadrži bar dva epitopa, i može da uključuje bilo koji broj epitopa, u zavisnosti od veličine, konformacije i tipa antigena. Osim toga, treba zapaziti da "epitop" na ciljnom polipeptidu može da bude, ili da uključuje nepolipeptidne elemente, npr., "epitop" može da uključuje bočni lanac ugljenih hidrata.

[0074] Smatra se da je minimalna veličina peptidnog ili polipeptidnog epitopa za antitelo oko četiri do pet aminokiselina. Peptidni ili polipeptidni epitopi poželjno sadrže najmanje sedam, poželjnije najmanje devet i najpoželjnije između najmanje oko 15 do oko 30 aminokiselina. Budući da CDR može da prepozna antigeni peptid ili polipeptid u njegovom tercijarnom obliku, aminokiseline koje sadrži epitop ne moraju da budu susedne, i u nekim slučajevima, ne moraju čak da budu na istom peptidnom lancu. U nekim slučajevima, peptidni ili polipeptidni epitop koji prepoznaju neutrališuća antitela opisan u ovom dokumentu sadrži sekvencu od najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, poželjnije najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 25, ili između oko 15 do oko 30 susednih ili nesusednih aminokiselina proteina VLP (npr., VP1) virusa JCV. (Videti npr., WO2010/090757).

[0075] Pod "specifično vezuje" uopšteno se podrazumeva da se antitelo vezuje za epitop preko svog antigen-vezujućeg domena, i da vezivanje podrazumeva neku komplementarnost između antigenvezujućeg domena i epitopa. Prema ovoj definiciji, kaže se da se antitelo "specifično vezuje" za epitop kada se vezuje za taj epitop, preko svog antigen-vezujućeg domena radije nego što bi se vezalo za nasumični, nesrodni epitop. Izraz "specifično" se ovde koristi za kvalifikaciju relativnog afiniteta sa kojim se određeno antitelo vezuje za određeni epitop.

[0076] Kaže se da antitelo kompetitivno inhibira vezivanje referentnog antitela za dati epitop ako se preferencijalno vezuje za taj epitop do mere da blokira, u izvesnom stepenu, vezivanje referentnog antitela za epitop. Kompetitivna inhibicija može da se odredi bilo kojim postupkom poznatim u ovoj oblasti, na primer, pomoću kompetitivnog ELISA testa. Može se reći da antitelo kompetitivno inhibira vezivanje referentnog antitela za dati epitop za najmanje 90%, najmanje 80%, najmanje 70%, najmanje 60%, ili najmanje 50%.

[0077] U značenju koje je ovde primenjeno, izraz "afinitet" odnosi se na meru jačine vezivanja pojedinačnog epitopa sa CDR regionom imunoglobulinskog molekula. Videti, npr., Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) na stranama 27-28. U značenju koje je ovde primenjeno, izraz "aviditet" odnosi se na ukupnu stabilnost kompleksa između populacije imunoglobulina i antigena, to jest, jačinu funkcionalnog kombinovanja smeše imunoglobulina sa antigenom. Videti, npr., Harlow na stranama 29-34. Aviditet je povezan sa afinitetom pojedinačnih imunoglobulinskih molekula u populaciji sa specifičnim epitopima, i takođe sa valencama imunoglobulina i antigena. Na primer, interakcija između bivalentnog monoklonskog antitela i antigena sa visoko-ponavljajućom strukturom epitopa, kao što je polimer, imala bi visok aviditet.

[0078] Neutrališuća antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati opisani u ovom dokumentu mogu takođe da budu opisani ili specifikovani u smislu njihove unakrsne reaktivnosti. U značenju koje je ovde primenjeno, izraz "unakrsna reaktivnost" odnosi se na sposobnost antitela, specifičnog za jedan antigen, da reaguje sa drugim antigenom; meru povezanosti između dve različite antigene supstance. Tako, antitelo je unakrsno reaktivno ako se vezuje za epitop drugačiji od onog koji je indukovao njegovo obrazovanje. Unakrsno reaktivni epitop uopšteno sadrži mnoge od istih komplementarnih strukturnih karakteristika kao induktivni epitop, u nekim slučajevima, može zapravo da odgovara bolje od originalnog.

[0079] Na primer, određena antitela imaju izvestan stepen unakrsne reaktivnosti, ako se vezuju za srodne, ali ne i identične epitope, npr., epitope sa najmanje 95%, najmanje 90%, najmanje 85%, najmanje 80%, najmanje 75%, najmanje 70%, najmanje 65%, najmanje 60%, najmanje 55% i najmanje 50% identičnosti (izračunato primenom metoda poznatih u ovoj oblasti i opisanih u ovom dokumentu) sa referentnim epitopom. Za antitelo se može reći da ima malo ili nimalo unakrsne reaktivnosti ako se ne vezuje za epitope sa manje od 95%, manje od 90%, manje od 85%, manje od 80%, manje od 75%, manje od 70%, manje od 65%, manje od 60%, manje od 55%, i manje od 50% identičnosti (izračunato primenom metoda poznatih u ovoj oblasti i opisanih u ovom dokumentu) sa referentnim epitopom. Antitelo se može smatrati "visoko specifičnim" za određeni epitop, ako se ne vezuje za bilo koji drugi analog, ortolog, ili homolog tog epitopa.

[0080] Neutrališuća antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati opisani u ovom dokumentu mogu takođe da budu opisani ili specifikovani u smislu njihovog afiniteta vezivanja za polipeptid. Na primer, antitelo koje neutrališe JCV može da se vezuje za peptid virusa JCV (npr., peptid VP1) sa konstantom disocijacije ili Kd manjom od 10<-2>M, 10<-3>M, 10<-4>M, 10<-5>M, 10<-6>M, 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M, 10<-10>M, 10<-11>M, 10<-12>M, 10<-13>M, 10<-14>M, ili 10<-15>M.

[0081] Neutrališuća antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati opisani u ovom dokumentu mogu da budu "multispecifični", npr., bispecifični, trospecifični ili veće multispecifičnosti, što znači da prepoznaju i vezuju dva ili više različitih epitopa prisutnih na jednom ili više različitih antigena (npr., proteina) u isto vreme. Prema tome, odrednica da li je neutrališuće antitelo "monospecfično" ili "multispecifično", npr., "bispecifično", odnosi se na broj različitih epitopa sa kojima vezujući polipeptid reaguje. Multispecifična antitela mogu da budu specifična za različite epitope ciljnog polipeptida opisanog u ovom dokumentu ili mogu da budu specifična za ciljni polipeptid kao i za heterologe epitope, kao što je heterologi polipeptid ili materijal čvrste podloge.

Humanizacija:

[0082] U nekim primerima izvođenja, životinjsko antitelo (npr., zečje antitelo) može da bude modifikovano, na primer zamenom Fc regiona Fc regionom iz druge vrste (na primer humanim Fc regionom). U nekim primerima izvođenja, takođe može da se izvede jedna ili više promena u cilju humanizacije (na primer u jednom ili više okvirnih regiona antitela).

[0083] U nekim primerima izvođenja, antitela opisana u ovom dokumentu mogu da budu konstruisana delimičnom zamenom okvirnog regiona i izmenom sekvence. U nekim primerima izvođenja, CDR regioni se dobijaju od antitela druge klase i/ili druge vrste u odnosu na okvirne regione. U nekim primerima izvođenja, konstruisano antitelo sadrži jedan ili više "donorskih" CDR iz nehumanog antitela poznate specifičnosti koji su nakalemljeni u okvirni region humanog teškog ili lakog lanca. Može da bude neophodna zamena svih CDR regiona kompletnim CDR regionima iz donorskog varijabilnog regiona da bi se antigen-vezujući kapacitet preneo sa jednog varijabilnog domena na drugi. Radije, može da bude neophodno samo prenošenje onih rezidua koje su neophodne za održavanje aktivnosti ciljnog vezujućeg mesta. Uzimajući u obzir objašnjenja data u, npr., SAD pat. br. 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, i 6,180,370, dobijanje funkcionalno konstruisanog ili humanizovanog antitela će biti u okviru kompetencija stručnjaka u ovoj oblasti, ili izvođenjem rutinskih eksperimenata ili ispitivanjem metodom pokušaja i greške.

[0084] EP 239 400 (Winter et al.) opisuje menjanje antitela supstitucijom (u datom varijabilnom regionu) njihovih regiona koji određuju komplementarnost (CDR) koji potiču iz jedne vrste onima iz druge. Predviđa se da je manje verovatno da antitela sa supstituisanim CDR izazovu imuni odgovor kod ljudi u poređenju sa pravim himernim antitelima, jer antitela sa supstituisanim CDR sadrže značajno manje nehumanih komponenata. (Riechmann et al., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536). Tipično, CDR regioni mišjeg antitela su supstituisani u odgovarajuće regione u humanom antitelu upotrebom tehnologije rekombinantne nukleinske kiseline za proizvodnju sekvenci koje kodiraju željeno supstituisano antitelo. Mogu da se dodaju genski segmenti humanog konstantnog regiona željenog izotipa (obično gama I za CH i kapa za CL) i geni za humanizovani teški i laki lanac se koeksprimiraju u sisarskim ćelijama da bi se proizvelo rastvorljivo humanizovano antitelo.

[0085] Queen et al., 1989 Proc Natl Acad Sci U S A. Dec;86(24): 10029-33 i WO 90/07861 su opisali postupak koji uključuje izbor humanih V okvirnih regiona pomoću kompjuterske analize za optimalnu proteinsku sekvencu homologije sa V okvirnim regionom originalnog mišjeg antitela, i modelovanje tercijarne strukture mišjeg V regiona za vizualizaciju aminokiselinskih rezidua okvirnog regiona za koje je verovatno da će interagovati sa mišjim CDR. Ove mišje aminokiselinske rezidue se zatim superponiraju na homologi humani okvirni region. Videti takođe SAD pat. br.

5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; i 5,530,101. Tempest et al., (1991, Biotechnology 9, 266-271) koristi, kao standard, V okvirne regione dobijene iz NEWM i REI teških, odnosno lakih lanaca za kalemljenje CDR bez radikalnog uvođenja mišjih rezidua. Prednost upotrebe pristupa prema Tempest et al., za konstruisanje humanizovanih antitela na bazi NEWM i REI je to što su trodimenzionalne strukture varijabilnih regiona NEWM i REI poznate na osnovu kristalografije xzraka i na taj način mogu da budu modelovane specifične interakcije između CDR i rezidua V okvirnog regiona. Međutim, treba imati na umu da slični pristupi mogu da budu zasnovani na jednoj ili više drugih poznatih struktura antitela (npr., na bazi jedne ili više Fab struktura). U nekim primerima izvođenja, može da se koristi okvirni region humane germinativne linije (npr., kao što je u ovom tekstu opisano za antitelo 399).

[0086] U nekim primerima izvođenja, zečji VH region (npr., antitelo 399 opisano u ovom dokumentu) ima okvirni region 1 i/ili okvirni region 3 koji je kraći od odgovarajućih humanih okvirnih regiona. U nekim primerima izvođenja, odgovarajuće aminokiselinske delecije mogu da se izvedu u humanizovanim varijantama zečjih antitela. U nekim primerima izvođenja, ove delecije nemaju veliki efekat na afinitet. Na primer, slični afiniteti vezivanja nađeni su za H4 (sličan humanom, bez delecija) i H9 (više sličan zečjem, sa delecijama).

[0087] U nekim primerima izvođenja, zečje antitelo može da bude modifikovano (npr., kao deo postupka humanizacije) uklanjanjem jedne ili više disulfidnih veza. U skladu sa tim, jedna ili više Cys rezidua u VL i CL domenima može da bude zamenjena humanim reziduama u nekim primerima izvođenja bez gubitka funkcije. Neograničavajući primer za ovo opisan je u ovom dokumentu (npr.,videti primere). Takođe postoji disulfidna veza između CDR H1 i CDR H2 (rezidue 35a i 50) koja je očuvana u mnogim zečjim VH domenima (približno trećina VH sekvenci). U nekim primerima izvođenja, jedna ili obe Cys rezidue iz ovog para mogu da budu zamenjene drugim reziduama bez gubitka afiniteta.

[0088] Nehumana antitela mogu da budu modifikovana da uključuju supstitucije koje insertuju humane imunoglobulinske sekvence, npr., konsenzusne humane aminokiselinske rezidue na određenim pozicijama, npr., na jednoj ili više od sledećih pozicija (poželjno najmanje pet, deset, dvanaest, ili sve): (u FR varijabilnog domena lakog lanca) 4L, 35L, 36L, 38L, 43L, 44L, 58L, 46L, 62L, 63L, 64L, 65L, 66L, 67L, 68L, 69L, 7OL, 71L, 73L, 85L, 87L, 98L, i/ili (u FR varijabilnog domena teškog lanca) 2H, 4H, 24H, 36H, 37H, 39H, 43H, 45H, 49H558H, 6OH, 67H, 68H, 69H, 7OH, 73H, 74H, 75H, 78H, 91H, 92H, 93H, i/ili 103H (prema numeraciji po Kabatu). Videti, npr., SAD patent br.6,407,213.

Proizvodnja antitela:

[0089] Monoklonska (npr., monoklonsko zečje, mišje, himerno, humanizovano, potpuno humano, itd.) antitela koja neutrališu JCV mogu da se proizvedu upotrebom tehnika poznatih u ovoj oblasti. U nekim primerima izvođenja, potpuno humana antitela mogu da se proizvedu, npr., upotrebom humanih splenocita pripremljenih in vitro, kao što je opisano kod Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147, 86-95. Oni mogu da budu pripremljeni kloniranjem repertoara kao što je opisano kod Persson et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 2432-2436 ili kod Huang and Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227-236. US 5,798,230. Velike neimunizovane humane biblioteke prikaza na fagu mogu takođe da se koriste za izolovanje visokoafinitetnih antitela koja mogu da se razviju kao humani terapeutici upotrebom standardne fagne tehnologije (videti, npr., Vaughan et al, 1996 Nat Biotechnol. Mar;14(3):309-14; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; i Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8; objavljena SAD patentna prijava br. 2003-0232333). Antitela mogu da se proizvedu u prokariotskim i eukariotskim ćelijama. U nekim primerima izvođenja, antitela (npr., scFv) se eksprimiraju u ćelijama kvasca kao što je Pichia (videti, npr., Powers et al. (2001) J Immunol Methods. 251:123-35), Hanseula, ili Saccharomyces.

[0090] U nekim primerima izvođenja, antitela, posebno antitela cele dužine, npr., IgG, proizvode se u sisarskim ćelijama. Primer sisarskih ćelija-domaćina za rekombinantnu ekspresiju uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući dhfr- CHO ćelije, opisane kod Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, koje se koriste sa DHFR selektabilnim markerom, npr., kao što je opisano kod Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), limfocitne ćelijske linije, npr., NSO ćelije mijeloma i SP2 ćelije, COS ćelije, K562, i ćelije iz transgene životinje, npr., transgenog sisara. Na primer, može da se koristi epitelijalna ćelija mlečne žlezde.

[0091] Pored sekvence/sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju imunoglobulinski domen, rekombinantni ekspresioni vektori mogu da nose dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama-domaćinima (npr., oridžini replikacije) i geni za selektabilne markere. Gen za selektabilni marker olakšava selekciju ćelija-domaćina u koje je uveden vektor (videti npr., SAD patent br.4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017). Primeri gena za selektabilne markere uključuju gen za dihidrofolat reduktazu (DHFR) (za upotrebu u dhfr- ćelijama-domaćinima sa selekcijom metotreksatom/amplifikacijom) i neo gen (za G418 selekciju).

[0092] U primeru sistema za rekombinantnu ekspresiju antitela (npr., antitela cele dužine ili njegovog antigen-vezujućeg dela), rekombinantni ekspresioni vektor koji kodira i teški lanac antitela i laki lanac antitela uvodi se u dhfr-CHO ćelije transfekcijom posredovanom kalcijum fosfatom. U rekombinantnom ekspresionom vektoru, geni za teški i laki lanac antitela su svaki operativno vezani za regulatorne elemente pojačivača/promotora (npr., dobijene iz SV40, CMV, adenovirusa i slično, kao što je regulatorni element pojačivač CMV/promotor AdMLP ili regulatorni element pojačivač SV40/promotor AdMLP) za pokretanje visokih nivoa transkripcije gena. Rekombinantni ekspresioni vektor takođe nosi gen DHFR, koji omogućava selekciju CHO ćelija koje su transficirane vektorom upotrebom selekcije metotreksatom/amplifikacije. Selektovane ćelije-domaćini transformanti se kultivišu da se omogući ekspresija teških i lakih lanaca antitela i intaktno antitelo se izdvaja iz medijuma kulture. Za pripremu rekombinantnog ekspresionog vektora, transfekciju ćelija-domaćina, selekciju transformanata, kultivaciju ćelija-domaćina i izdvajanje antitela iz medijuma kulture koriste se standardne tehnike molekularne biologije. Na primer, neka antitela mogu da budu izolovana afinitetnom hromatografijom sa proteinom A ili proteinom G. U nekim primerima izvođenja, varijabilni regioni zečjeg antitela su klonirani i eksprimirani u CHO ćelijama.

[0093] Antitela mogu da uključuju i modifikacije, npr., modifikacije koje menjaju funkciju Fc, npr., da bi se smanjila ili ukinula interakcija sa Fc receptorom ili sa CIq, ili oba. Na primer, humani konstantni region IgG1 može da bude mutiran na jednoj ili više rezidua, npr., jednoj ili više rezidua 234 i 237, npr., prema numeraciji u SAD patentu br. 5,648,260. Drugi primeri modifikacija uključuju one opisane u SAD patentu br.5,648,260.

[0094] Za neka antitela koja uključuju Fc domen, sistem za proizvodnju antitela može da bude dizajniran za sintetisanje antitela u kojima je Fc region glikozilisan. Na primer, Fc domen IgG molekula je glikozilisan na asparaginu 297 u CH2 domenu. Ovaj asparagin je mesto za modifikaciju oligosaharidima biantenarnog tipa. Ova glikozilacija učestvuje u efektorskim funkcijama posredovanim receptorima Fcγ i komplementom CIq (Burton and Woof (1992) Adv. Immunol.

51:1-84; Jefferis et al. (1998) Immunol. Rev. 163:59-76). Fc domen može da se proizvede u sisarskom ekspresionom sistemu koji pravilno glikoziliše reziduu koja odgovara asparaginu 297. Fc domen može da uključuju i druge eukariotske posttranslacione modifikacije.

[0095] Antitela mogu takođe da se proizvedu pomoću transgene životinje. Na primer, SAD patent br. 5,849,992 opisuje postupak za ekspresiju antitela u mlečnoj žlezdi transgenog sisara. Konstruiše se transgen koji uključuje promotor specifičan za mleko i nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo od interesa i signalnu sekvencu za izlučivanje. Mleko koje proizvode ženke takvih transgenih sisara sadrži, sekretovano u njemu, antitelo od interesa. Antitelo može da bude prečišćeno iz mleka, ili za neke primene, korišćeno direktno.

[0096] U određenim slučajevima, radije nego da se humanizuje postojeće antitelo ili antigenvezujući fragment iz druge vrste, može da se imunizuje životinja koja sadrži ćelije koje proizvode imunoglobulin koje imaju prirodne, humane, ili delimično humane imunoglobulinske lokuse. U nekim slučajevima, nehumana životinja sadrži najmanje deo humanog imunoglobulinskog gena. Na primer, moguće je konstruisati životinjske sojeve koji su deficijentni u proizvodnji životinjskog antitela upotrebom velikih fragmenata humanih lokusa za Ig. Upotrebom tehnologije hibridoma, mogu da budu proizvedena i selektovana antigen-specifična monoklonska antitela dobijena od gena sa željenom specifičnošću.

Terapijske primene:

[0097] U nekim slučajevima, neutrališuća antitelo opisano u ovom dokumentu može da se primeni kod subjekta koji je podvrgnut terapiji imunosupresivnim lekom. U nekim slučajevima, antitelo koje neutrališe JCV može da se koristi za sprečavanje razvoja ili napredovanja PML kod subjekta koji je podvrgnut lečenju od multiple skleroze (MS). Na primer, subjekt koji se leči natalizumabom ili srodnim antitelom koje se vezuje za VLA-4, može da bude kandidat za lečenje antitelom koje neutrališe JCV.

[0098] Natalizumab i srodna antitela koja se vezuju za VLA-4 opisana su, npr., u US 5,840,299. Antitela mAb 21.6 i HP 1/2 predstavljaju primere mišjih monoklonskih antitela koja vezuju VLA-4. Natalizumab je humanizovana verzija mišjeg mAb 21.6 (videti, npr., SAD patent br. 5,840,299). Humanizovana verzija HP1/2 je takođe opisana (videti, npr., SAD patent br.6,602,503). Opisano je i nekoliko dodatnih monoklonskih antitela koja vezuju VLA-4, kao što su HP2/1, HP2/4, L25 i P4C2 (npr., u SAD patentu br. 6,602,503; Sanchez-Madrid et al., 1986 Eur. J. Immunol, 16:1343-1349; Hemler et al., 1987 J. Biol. Chem. 2:11478-11485; Issekutz and Wykretowicz, 1991, J. Immunol, 147: 109 (TA-2 mab); Pulido et al, 1991 J. Biol. Chem., 266(16):10241-10245; i SAD patentu br.5,888,507). Mnoga korisna antitela koja vezuju VLA-4 interaguju sa VLA-4 na ćelijama, npr., limfocitima, ali ne dovode do agregacije ćelija. Međutim, zapaženo je da druga anti-VLA-4-vezujuća antitela izazivaju takvu agregaciju. HP1/2 ne izaziva ćelijsku agregaciju. Antitelo HP1/2 MAb (Sanchez-Madrid et al., 1986 Eur. J. Immunol., 16:1343-1349) ima izuzetno veliku jačinu, blokira interakciju VLA-4 sa VCAM1 i sa fibronektinom, i ima specifičnost za epitop B na VLA-4. Ovo antitelo i druga B epitop-specifična antitela (kao B1 ili B2 epitop-vezujuća antitela; Pulido et al., 1991 J. Biol. Chem., 266(16): 10241-10245) predstavljaju jednu klasu korisnih VLA-4-vezujućih antitela.

[0099] U nekim slučajevima, subjekt je čovek. U nekim slučajevima, subjekt je nehumana životinja, na primer nehumani sisar (npr., miš, pacov, zec, koza, itd.).

Primene:

[0100] U nekim slučajevima, neutrališuće antitelo može da se primeni kod subjekta za sprečavanje ili lečenje infekcije virusom JC, i/ili za sprečavanje ili lečenje PML.

[0101] U nekim slučajevima, aspekti opisa odnose se na kompozicije antitela koje inhibiraju aktivnost virusa JC, na primer, koje inhibiraju jedno ili više od proliferacije virusa (npr., virusnu replikaciju), stope mutacija i infektivnosti. U nekim slučajevima, takve kompozicije mogu da se koriste za lečenje ili supresiju stanja povezanih sa aktivnošću virusa JC kod subjekata koji su inficirani virusom JC, ili za snižavanje rizika od infekcije virusom JC. Takve kompozicije mogu da se koriste za sprečavanje virusne infekcije sa JCV, za sprečavanje povećanja virusne aktivnosti JCV (npr., aktivne infekcije mozga sa JCV), za sprečavanje proliferacije virusa JC, za sprečavanje simptoma udruženih sa virusnom infekcijom, za lečenje subjekta inficiranog virusom JC, ili za lečenje subjekta koji je pod rizikom od infekcije virusom JC, ili za lečenje subjekta kod koga se razvila bolest ili stanje povezano sa infekcijom virusom JC (npr., PML). Kompozicije prema opisu takođe mogu da se primene kod subjekta kod koga postoji rizik od virusne infekcije ili rizik od povećanja aktivnosti virusa (npr., proliferacije virusa, na primer u mozgu ili CNS), bez obzira na to da li je poznato da je subjekt zaista bio izložen, ili inficiran virusom.

[0102] U nekim slučajevima, jedna ili više kompozicija antitela mogu da se primene kod subjekata koji imaju kompromitovani imuni sistem. Treba napomenuti da imuni sistem pacijenata može da bude kompromitovan zbog lečenja imunosupresivnim terapijskim sredstvom i/ili zbog bolesti ili stanja koje utiče na imuni sistem. U nekim slučajevima, jedna ili više kompozicija antitela mogu da se primene kod subjekta koji ima rizik od PML zbog kompromitovanog imunog sistema, bez obzira da li je poznato da je subjekt zaražen JCV, ili za koga se zna da je bio izložen JCV. Prema tome, kompozicije opisa mogu da budu primenjene kod subjekata koji primaju imunosupresivni tretman za bolest ili stanje. U nekim slučajevima, kompozicije opisa mogu da se primene kod pacijenata sa multiple sklerozom (MS) koji se leče jednim ili većim brojem imunosupresivnih sredstava (npr., natalizumab). Međutim, u nekim slučajevima, kompozicije opisa mogu da budu primenjene kod subjekata koji imaju oslabljeni imuni sistem uzrokovan samom bolešću ili stanjem, pre nego imunosupresivnim tretmanom. Na primer, subjekti inficirani imuno-kompromitujućim patogenom (npr., virus kao što je HIV) mogu da se leče jednom ili većim brojem kompozicija antitela opisanih u ovom dokumentu.

[0103] Treba napomenuti da dok nije neophodno da JCV status subjekta bude poznat, poznavanje statusa bi moglo da bude korisno u nekim slučajevima. U nekim slučajevima, efikasnost takvog lečenja ili terapije može da se prati detekcijom i/ili praćenjem prisustva JCV kod subjekta.

[0104] U nekim slučajevima, jedna ili više kompozicija antitela može da se primeni kod subjekta pre, tokom, i/ili nakon što subjekt primi i imunomodulatornu terapiju (npr., tretman koji inhibira imuni sistem subjekta). Prema tome, u nekim slučajevima, jedno ili više jedinjenja, opisanih u ovom dokumentu kao efikasna za inhibiranje replikacije virusa JC, mogu da se primene kod subjekta pre započinjanja imunomodulatorne terapije. Na primer, terapijski režim sa jednom ili više kompozicija opisa može da bude započet pre imunomodulatornog tretmana protiv bolesti ili u pripremi za transplantaciju da bi se sprečio ili smanjio bilo kakv rizik od replikacije ili proliferacije virusa JC udružen sa imunomodulatornim tretmanom.

[0105] U nekim slučajevima, jedna ili više kompozicija opisa mogu da se primene same, ili u kombinaciji sa drugim kompozicijama opisanim u ovom dokumentu, ili zajedno sa drugim terapijskim sredstvima (npr., jedno ili više imunosupresivnih terapijskih sredstava). Kompozicije opisa mogu da budu obezbeđene (npr., primenjene) u farmaceutskim preparatima. Kompozicije opisa mogu da budu obezbeđene u kompletima.

[0106] U nekim slučajevima, subjekt koji se leči (ili koji će započeti tretman) imunosupresivnim sredstvom ispituje se na jednu ili više indicija infekcije virusom JCV. Ako se detektuje jedna ili više indicija infekcije virusom JCV, kod subjekta može da se obavi procena prisustva jedne ili više varijanti JCV udruženih sa PML kao što je opisano u ovom dokumentu. Ako indicije virusa JCV nisu detektovane, kod subjekta može da se prati tokom vremena, npr., svake 4 nedelje, mesečno, svaka tri meseca, svaka 4 meseca, svakih 6 meseci, ili svakih 12 meseci, prisustvo bilo kakve indicije infekcije virusom JCV. Ako se detektuje infekcija virusom JCV, kod subjekta može dodatno da se obavi procena prisustva jedne ili više varijanti JCV. Ako se detektuje varijanta JCV udružena sa povećanim rizikom od PML, subjekt može dalje da se prati da bi se detektovali bilo kakvi rani znaci PML i/ili režim tretmana može da se izmeni kao što je ovde detaljnije opisano.

[0107] U nekim slučajevima, neutrališuće antitelo može da bude korisno za usporavanje progresije stanja (npr., PML) koje je udruženo sa infekcijom virusom JCV. U nekim slučajevima, odlaganje progresije PML ili drugog stanja udruženog sa JCV omogućava imunom odgovoru subjekta da se bori protiv infekcije virusom JCV. Na primer, ako je kod subjekta koji je podvrgnut imunoterapiji ili lečenju lekom koji je imunosupresivan, dijagnostikovana infekcija virusom JCV, i/ili jedan ili više znakova ili simptoma PML (npr., rani stadijum PML), tada subjekat može da se leči primenom jedne ili više kompozicija antitela opisanih u ovom dokumentu. U nekim slučajevima, lečenje imunoterapijom ili lekom koji je imunosupresivan se redukuje ili prekida tokom vremena primene antitela koje neutrališe JCV. Ovo može da omogući imunom sistemu subjekta da se oporavi i pomogne u borbi protiv infekcije virusom JCV ili progresije bolesti.

Nukleinske kiseline koje kodiraju primere antitela:

[0108] U nekim slučajevima, sledeća sekvenca nukleinske kiseline upotrebljena je za kodiranje teškog lanca neutrališućeg antitela:

[0109] U nekim slučajevima, sledeća sekvenca nukleinske kiseline upotrebljena je za kodiranje lakog lanca neutrališućeg antitela:

Ćelijske linije korisne za eksprimiranje antitela:

[0110] U nekim primerima izvođenja, jedno ili više neutrališućih antitela mogu da budu eksprimirana u ćelijama CHO ili HEK293. Međutim, može da se koristi bilo koja pogodna ćelijska linija.

Putevi primene:

[0111] U nekim slučajevima, opis obezbeđuje postupke za inhibiciju replikacije virusa, gde postupci obuhvataju dovođenje u kontakt ćelije koja sadrži virus JC sa kompozicijom antitela.

[0112] U određenim slučajevima, antitelo ili preparat antitela primenjuje se intravenski. U drugim slučajevima, antitelo ili preparat antitela primenjuje se oralno. Alternativni putevi primene uključuju sublingvalne, intramuskularne i transdermalne primene. Prema tome, preparati predmetnog opisa mogu da se daju oralno, parenteralno, topikalno, ili rektalno. Oni se, naravno, daju u oblicima koji su pogodni za svaki put primene.

[0113] Izrazi "parenteralna primena" i "primenjen parenteralno" u značenju koje je ovde primenjeno označavaju načine primene drugačije od enteralne i topikalne primene, obično injekcijom, i uključuju, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijalnu, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijačnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidalnu, intraspinalnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.

[0114] Izrazi "sistemska primena", "sistemski primenjen", "periferna primena" i "periferno primenjen", u značenju koje je ovde korišćeno, označavaju primenu antitela, leka ili drugog materijala drugačiju od primene direktno u centralni nervni sistem, kod koje on ulazi u pacijentov sistem i, time, podleže metabolizmu i drugim sličnim procesima, na primer, subkutanu primenu.

[0115] Kompozicije antitela mogu da se primene kod ljudi i drugih životinja za terapiju bilo kojim pogodnim putem primene. Stvarni dozni nivoi neutrališućih antitela mogu da se prilagode da bi se dobila količina koja je efikasna u postizanju željenog terapijskog odgovora za konkretnog pacijenta, kompoziciju i način primene, a koja nije toksična za pacijenta.

[0116] Odabrani dozni nivo će zavisiti od mnoštva faktora uključujući aktivnost određenog antitela, brzine klirensa antitela, trajanja lečenja, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala korišćenih u kombinaciji sa određenim antitelom, uzrasta, pola, težine, stanja, opšteg zdravlja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora koji su dobro poznati u oblasti medicine.

[0117] Lekar ili veterinar sa prosečnim znanjem u ovoj oblasti može lako da odredi i prepiše potrebnu efikasnu količinu kompozicije antitela. Na primer, lekar ili veterinar može da započne sa dozama kompozicija antitela na nivoima nižim od onih potrebnih za postizanje željenog terapijskog dejstva, a zatim da postepeno povećava doziranje do postizanja željenog dejstva.

[0118] U nekim slučajevima, kompozicija antitela prema opisu daje se subjektu hronično. Hronični tretmani uključuju bilo koji oblik ponovljene primene tokom produženog perioda vremena, kao što su ponovljene primene tokom jednog ili više meseci, između mesec i godinu dana, jedne ili više godina, ili duže. U nekim slučajevima, hronični tretman uključuje primenu kompozicije antitela opisa ponovljeno tokom života subjekta. U određenim slučajevima, hronični tretmani uključuju redovne primene, na primer jednom ili više puta dnevno, jednom ili više puta nedeljno, ili jednom ili više puta mesečno. Uopšteno, pogodna doza kao dnevna doza kompozicije antitela opisa biće ona količina koja predstavlja najnižu dozu koja može da proizvede terapijsko dejstvo. Takva efikasna doza će uopšteno zavisiti od faktora koji su opisani iznad u tekstu. U nekim slučajevima, može da se koristi najmanje 0.5-1 mg/kg. Međutim, mogu da se koriste i veće ili manje količine. U nekim slučajevima, efikasna doza antitela opisanog u ovom dokumentu može da bude oko 100 mg/kg ili više. U nekim slučajevima, može da se koristi 300 do 600 mg/kg.

[0119] Preparati neutrališućeg antitela mogu da budu formulisani za primenu na bilo koji pogodan način za upotrebu u humanoj ili veterinarskoj medicini, po analogiji sa drugim antitelima. U nekim slučajevima, aspekti opisa takođe se odnose na postupak za pravljenje leka za upotrebu u lečenju subjekta, npr., za lečenje ili prevenciju infekcije virusom JCV, ili za inhibiciju replikacije ili proliferacije JCV. Takvi preparati mogu da se koriste za profilaktički tretman subjekta koji ima rizik od infekcije, ili se sumnja da ima infekciju virusom JCV ili ima rizik za PML (npr., za lečenje subjekta pre, tokom, i/ili nakon što subjekt primi imunomodulatornu terapiju). Prema tome, jedna ili više kompozicija antitela opisanih u ovom dokumentu koje modulišu replikaciju ili proliferaciju DNK virusa kao što je opisano u ovom dokumentu mogu da se koriste za pripremu leka za upotrebu u bilo kom od postupaka za lečenje opisanih u ovom dokumentu. U nekim slučajevima, opis obezbeđuje upotrebu jedne ili više kompozicija antitela opisa (npr., identifikovanog kao inhibitorno za replikaciju JCV) za proizvodnju leka ili farmaceutika za lečenje sisara (npr., čoveka) koji ima jedan ili više simptoma, ili ima rizik od infekcije, replikacije i/ili proliferacije JCV (npr., jedan ili više simptoma aktivnosti JCV). Prema tome, aspekti opisa odnose se na upotrebu jedne ili više kompozicija antitela opisanih u ovom dokumentu za pripremu leka za lečenje ili prevenciju PML kod subjekta. U skladu sa tim, opis se odnosi i na jednu ili više kompozicija antitela opisanih u ovom dokumentu za upotrebu kao lek. Opis se odnosi i na jednu ili više ovih kompozicija antitela za upotrebu u postupcima opisanim u ovom dokumentu, na primer u postupcima za inhibiciju replikacije JCV, ili lečenje ili prevenciju bolesti udružene sa replikacijom ili proliferacijom JCV (npr., kod subjekata koji će biti, su, i/ili su bili lečeni najmanje jednom imunomodulatornom kompozicijom).

Dijagnostičke primene i kompleti:

[0120] U nekim slučajevima, antitela opisana u ovom dokumentu mogu da se koriste kao reagensi za detekciju za dijagnostiku in vivo, i/ili spregnuti sa kontrastnim reagensima za radiologiju.

[0121] U nekim slučajevima, aspekti opisa uključuju upotrebu imobilizovanog ili neimobilizovanog, anti-JCV antitela (npr., VP-1-vezujućeg antitela) kao detekcionih fragmenata za procenu prisustva i/ili nivoa JCV u uzorku. Testovi za detekciju mogu da uključuju upotrebu jednog ili više obeleženih detekcionih fragmenata (npr., antitelo koje se vezuje za VP-1 koje sadrži ili je vezano za detektabilnu oznaku). Detektabilna oznaka se definiše kao bilo koji fragment koji može da se detektuje upotrebom testa. Antitela i funkcionalni fragmenti antitela opisa mogu da budu spregnuti sa specifičnim sredstvima za obeležavanje za detekciju vezivanja standardnim postupcima za kuplovanje. Može da se koristi širok opseg detektabilnih oznaka, kao što su one koje obezbeđuju neposrednu detekciju (npr., radioaktivna oznaka, fluorofor, [npr. zeleni fluorescentni protein (GFP), crveni fluorescentni protein (RFP), itd.], hromofor, oznaka za optičku ili elektronsku gustinu, itd.) ili indirektnu detekciju (npr., enzimska oznaka kao peroksidaza rena, itd.). Neograničavajući primeri detektabilnih oznaka koje su vezane za, ili ugrađene u antitela uključuju: enzime, radioaktivne oznake, fluorescentne oznake, fosforescentne molekule, hemiluminescentne molekule, hromofore, luminescentne molekule, fotoafinitetne molekule i obojene čestice ili ligande kao što je biotin, itd. U nekim slučajevima, postupci za detekciju prema opisu mogu da uključuju elektrohemiluminescentne metode (ECL).

[0122] Brojni postupci mogu da se koriste za detekciju oznake, u zavisnosti od prirode oznake i drugih komponenata testa. Oznake mogu direktno da se detektuju preko optičke ili elektronske gustine, radioaktivnih emisija, prenosa energije bez zračenja, itd., ili da se indirektno detektuju pomoću konjugata antitela, konjugata streptavidin-biotin, itd. Mnoge dodatne detektabilne oznake su poznate u stanju tehnike, kao i postupci za njihovo vezivanje za antitela.

[0123] Obeležena antitela mogu da budu antitela koja se koriste in vitro, npr., u imunoeseju kao što je ELISA. Takva detektabilno obeležena antitela mogu da budu antitela koja imaju detektabilnu oznaku ugrađenu u antitelo ili mogu da budu antitela koja su vezana za sekundarni vezujući ligand i/ili za enzim (enzimska oznaka) koji će stvoriti detektabilni (npr., obojeni) proizvod nakon kontakta sa hromogenim supstratom. Primeri pogodnih enzima uključuju, ali nisu ograničeni na, ureazu, alkalnu fosfatazu, hidrogen peroksidazu (rena) ili glukoza oksidazu. Primeri pogodnih sekundarnih vezujućih liganda uključuju, ali nisu ograničeni na jedinjenja biotina i/ili avidina i streptavidina. Upotreba takvih oznaka je dobro poznata stručnjacima u ovoj oblasti i opisana je, na primer, u SAD pat. br.3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 i 4,366,241.

[0124] Brojni postupci za vezivanje ili konjugaciju antitela za njegovu detektabilnu oznaku poznati su u stanju tehnike. Postupak za vezivanje može da uključuje upotrebu metal-helatnog kompleksa koji uključuje, na primer, organsko helirajuće sredstvo kao što je anhidrid dietilentriaminpentasirćetne kiseline (DTPA); etilentriamintetrasirćetna kiselina; N-hloro-ptoluensulfonamid; i/ili tetrahloro-3alfa-6alfa-difenilglikouril-3 vezan za antitelo (videti, na primer, SAD pat. br. 4,472,509 i 4,938,948). Monoklonska antitela takođe mogu da reaguju sa enzimom u prisustvu sredstva za kuplovanje kao što je glutaraldehid ili perjodat. Antitela mogu da budu obeležena fluoresceinskim markerima u prisustvu ovih sredstava za kuplovanje ili reakcijom sa izotiocijanatom. U drugim slučajevima, antitela mogu da budu obeležena derivatizacijom, na primer, selektivnim uvođenjem sulfhidrilnih grupa u Fc region antitela, upotrebom reakcionih uslova koji ne menjaju mesto prepoznavanja antitela.

[0125] Detekcija detektabilne oznake u testu opisa u ovom dokumentu je označena i kao detektovanje "signala". Postupci za detekciju signala u imunoeseju su dobro poznati u ovoj oblasti. U nekim slučajevima, signal testa može da bude detektovan upotrebom čitača za ploče sa više bunarčića (npr., čitač mikroploča) za procenu količine i/ili lokacije signala. Detekcija signala može da bude optička detekcija ili druga sredstva za detekciju pogodna za detektovanje detektabilnih oznaka koje se koriste u ovom opisu.

[0126] Predmetni pronalazak je dodatno ilustrovan sledećim primerima, koje ni na koji način ne treba razumeti kao ograničavajuće.

PRIMERI

Primer 1: Antitelo i CDR sekvence

[0127] Antitela R399 i R411 su stvorena imunizacijom zeca pomoću JCV virusu-sličnih čestica (VLP). VLP čestice korišćene za imunizaciju sadržale su mutaciju L55F na MAD1 osnovi. Slezina jednog od četiri zeca je korišćena za stvaranje monoklonskih antitela. Dobijena antitela su podvrgnuta skriningu za inhibiciju infektivnosti uključujući antitela R117, R322, R399, R411 i R497. Selektovana antitela su podvrgnuta skriningu za sposobnost vezivanja za mutantne VLP čestice i R399 je selektovan kao snažan inhibitor sa širokom specifičnošću za poznate virusne mutante. Antitela R399 i R411 su selektovana za kloniranje i humanizaciju. Humanizacija je rezultovala u 3 laka lanca i 10 teških lanaca i za R399 i za R411.

Sekvence zasnovane na 399

V-lakog lanca i CDR regioni (podvučeno) u 399

Humani akceptorski okvirni region V-lakog lanca (CDR regioni su podvučeni)

[0129] SEQ ID NO:5 huIGKV1-13x02

V-teškog lanca i CDR (podvučeno) u 399

[0130]

SEQ ID NO:6399_vh

SEQ ID NO:7399_vh_CDR1

GFSFDRNYWIC

SEQ ID NO:8399_vh_CDR2

CISAGGSGNTYYATWAKG

SEQ ID NO:9399_vh_CDR3

FYSGGGYYAGYFTL

Humani akceptorski okvirni region V-teškog lanca (CDR regioni su podvučeni)

[0131] SEQ ID NO:10 IGHV3-30-3x01

HUMANIZOVANI DIZAJN ZA 399

[0132]

• Laki lanac: okvirni region huIGKV1-13x02 // 399 VL CDR regioni

• Teški lanac: okvirni region IGHV3-30-3x01 // 399 VH CDR regioni

• Povratne mutacije u okvirnom regionu označene su malim podebljanim slovima i istaknute.

CDR regioni, prema definiciji Chothia, su podvučeni.

[0133] Svi mogući parovi ili humanizovani lanci R399 podvrgnuti su skriningu za vezivanje za MAD1 VLP čestice virusa JCV. Kao kandidati su selektovani svi oni koji su vezani sa visokim afinitetom i CDR graftovana verzija H0L0. Taj molekul je ispitan za vezivanje za različite mutante VLP i kod nekih mutanata zapažene su razlike u afinitetu vezivanja. Većina opisanih varijanti imala je malo do nimalo dejstva na vezivanje, ili su bile štetne. Neke su poboljšale vezivanje, a naročito je varijanta lakog lanca N31A imala značajno poboljšano vezivanje za VP1 S269F mutanta VLP.

[0134] Zečja antitela često sadrže disulfidne veze koje premošćuju regione varijabilnog regiona teškog lanca od aminokiseline cys35 do aminokiseline cys50 (Numeracija cys35 i cys50 odnosi se na originalnu sekvencu kod zeca. Cys 35 i Cys50 odgovaraju pozicijama 36 odnosno 51 u humanizovanim sekvencama okvirnog regiona). Cisteini su uklonjeni u graftovanoj verziji CDR humanizovanog R399 doprinoseći gubitku afiniteta prema 269F VLP česticama. Te supstitucije su bile C35A odnosno C50V. U cilju uklanjanja disulfida, stvoren je C50A (putem stvaranja V50A na CDR graftovanom molekulu) i nije bilo gubitka afiniteta prema 269F VLP česticama. Verzija N31A lakog lanca i V50A teškog lanca na H0L2 pozadini su kombinovane za stvaranje antitela "50/31-A". Antitelo 50/31-A ima obnovljeno vezivanje za 269F VLP čestice i nema značajne promene u vezivanju za druge mutante. Međutim, 50/31-A slabo prepoznaje S269Y VLP čestice. Pod pretpostavkom da postoji sterička prepreka, stvorena je varijanta V50G teškog lanca i kombinovana sa L2-N31A da bi se dobilo antitelo "50/31-G". Antitelo 50/31-G se vezuje za S269F i Y i nema značajne promene u vezivanju za druge mutante.

SEQ ID NO:37399_vh_CDR2 C50X XISAGGSGNTYYATWAKG

MUTACIJE U PREOBLIKOVANOM VL

[0135]

L0 do L1

[0136] Pozicija može da se prevede u numeraciju prema Kabatu.

MUTACIJE U PREOBLIKOVANOM VH

[0137]

H0 do H1

H1 do H2

Konstrukti H3-H9

[0138] Postoji nekoliko neuobičajenih svojstava zečjih VH domena koja nisu zapažena u humanim VH domenima. Ova svojstva uključuju:

• Skraćeni N-terminalni kraj. U ovom zečjem VH domenu, okvirni region 1 je kraći za jednu reziduu od tipičnog humanog VH domena. Umesto povratne mutacije, neki humanizovani konstrukti su napravljeni više nalik zečjem 399 delecijom Val2. Mutanti V2Δ su istaknuti u gore navedenim konstruktima.

• Skraćeni okvirni region 3. U ovom zečjem VH domenu, okvirni region 3 je takođe kraći za jednu reziduu od okvirnog regiona 3 u većini poznatih humanih VH domena. Budući da region petlje okvirnog regiona 3 blizu CDR 1 može ponekad da prepozna antigen, ovaj region nekih humanizovanih konstrukata je skraćen i zamenjen zečjom sekvencom. Korišćene su kombinovane mutacije/delecije (D72T/N73S/K75Δ/N76T) da bi ovaj region VH domena bio više nalik zečjem 399. Skraćeni okvirni regioni 3 su istaknuti u gore navedenim konstruktima.

• Disulfidna veza između Cys35a i Cys50. Ova disulfidna veza se ne javlja u humanim VH domenima. Rezidue Cys35a i Cys50 su zamenjene sa Ser/Ala odnosno Val, u nekim konstruktima. Ove aminokiseline su istaknute u gore navedenim sekvencama.

Sekvence zasnovane na 411

Humani akceptorski okvirni region

[0142]

DIZAJN HUMANIZACIJE ZA 411

[0143]

• Laki lanac: okvirni region IGKV1D-13x01 // jcv411_vl CDR regioni

• Teški lanac: okvirni region IGHV3-30-3x01 // jcv411_vh CDR regioni

• Povratne mutacije u okvirnom regionu označene su malim podebljanim slovima i istaknute.

CDR regioni, prema definiciji Chothia, su podvučeni.

SEQ ID NO:48 L0 = CDR graft

SEQ ID NO:50 L2

SEQ ID NO:52 H1

MUTACIJE U PREOBLIKOVANOM VL

[0144]

L0 do L1

MUTACIJE U PREOBLIKOVANOM VH

[0145]

H0 do H1

Konstrukti H3-H9

[0146] Postoji nekoliko neuobičajenih svojstava zečjih VH domena koja nisu zapažena u humanim VH domenima. Ova svojstva uključuju:

• Skraćeni N-terminalni kraj. U ovom zečjem VH domenu, okvirni region 1 je kraći za jednu reziduu od tipičnog humanog VH domena. Umesto povratne mutacije, neki humanizovani konstrukti su napravljeni više nalik zečjem 399 delecijom Val2. Mutanti V2A su istaknuti u gore navedenim konstruktima.

• Skraćeni okvirni region 3. U ovom zečjem VH domenu, okvirni region 3 je takođe kraći za jednu reziduu od okvirnog regiona 3 u većini poznatih humanih VH domena. Budući da region petlje okvirnog regiona 3 blizu CDR 1 može ponekad da prepozna antigen, ovaj region nekih humanizovanih konstrukata je skraćen i zamenjen zečjom sekvencom. Korišćene su kombinovane mutacije/delecije (D72T/N73S/K75Δ/N76T) da bi ovaj region VH domena bio više nalik zečjem 399. Skraćeni okvirni regioni 3 su istaknuti u gore navedenim konstruktima.

• Disulfidna veza između Cys35a i Cys50. Ova disulfidna veza se ne javlja u humanim VH domenima. Rezidue Cys35a i Cys50 su zamenjene sa Ser/Ala odnosno Val, u nekim konstruktima. Ove aminokiseline su istaknute u gore navedenim sekvencama.

Primer 2: Test neutralizacije

[0147] Ispitivana je sposobnost monoklonskih antitela zečjeg porekla da neutrališu viruse JCV i BKV u testu udvostručavanja na humanim astrocitima. Sposobnost antitela da inhibiraju virus i ćelije prikazana je na slici 1 (humani astrociti) i slici 2 (ćelije humanog bubrežnog proksimalnog tubularnog epitela). Slika 3 daje pregled EC50, EC80 i EC90 antitela protiv JCV i BKV u različitim testovima.

Primer 3: Vezivanje monoklonskih antitela zečjeg porekla za JCV-VP1

[0148] Ispitivana je sposobnost monoklonskih antitela zečjeg porekla da se vežu za JCV-VP1 protein divljeg tipa i sledeće mutante JCV-VP1; L55F, S269F, Q271H, K60E i D66H. Ispitivanja vezivanja sprovedena su u ELISA testu. Rezultati su prikazani na slici 4.

Primer 4: Vezivanje humanizovanih verzija monoklonskih antitela 399 zečjeg porekla za JCV-VP1 određeno pomoću testa ELISA

[0149] CDR regioni monoklonskog antitela 399 zečjeg porekla su graftovani u humanizovane akceptorske sekvence V-teškog lanca i V-lakog lanca, kao što je opisano u primeru 1. Vezivanje zečjeg monoklonskog antitela 399 i humanizovanog antitela BIIB048 (= H0L0), H0V50AL2N31Ai H0V50AL2N31Aza brojne proteine divljeg tipa i mutante JCV-VP1 procenjivano je upotrebom ELISA testa. Rezultati su sumirani na slici 5.

Primer 5: Vezivanje humanizovanih verzija monoklonskih antitela 399 zečjeg porekla za JCV-VP1 određeno pomoću afinitetnih eksperimenata Biacore

[0150] CDR regioni monoklonskog antitela 399 zečjeg porekla su graftovani u humanizovane akceptorske sekvence V-teškog lanca i V-lakog lanca, kao što je opisano u primeru 1. Vezivanje humanizovanih antitela BIIB048 (= H0L0) i H0V50AL2N31Aza brojne proteine divljeg tipa i mutante JCV-VP1 procenjivano je upotrebom afinitetnih eksperimenata Biacore. Određeno je vezivanje obe verzije antitela, i Fab i Mab. Rezultati su sumirani na slici 6.

Primer 6: Test infektivnosti

[0151] Sposobnost antitela H0L0 da suprimira infektivnost JCV procenjivana je pri različitim koncentracijama virusa i određene su vrednosti IC50i IC90antitela. Rezultati su prikazani na slici 8.

Primer 7: Test infektivnosti sa virusima sa mutiranim JCV-VP1

[0152] Procenjivana je sposobnost antitela BIIB48 (H0L0) i hu399 50-31G (H0V50AL2N31A) da suprimiraju infektivnost JCV-VP1 mutanata. Uslovi testa prikazani su na slici 9 i slici 10. Očitavanje eksperimenata je urađeno pomoću Western-Blot-ova. Rezultati Western blot-ova su prikazani na slikama 11-12 (redovno izlaganje) i slikama 13-14 (prekomerno izlaganje).

Primer 8: Vezivanje humanizovanih antitela za viruse sa mutiranim JCV-VP1

[0153] Sposobnost antitela BIIB48 (H0L0) i hu39950-31G (H0V50AL2N31A) da se vežu za različite JCV-VP1 mutante procenjivana je pomoću ELISA testa. Uslovi testa su prikazani na slici 15 i slici 16. Vrednosti EC50(u nM) date su na slici 17.

Ekvivalenti

[0154] Smatra se da je gore navedena pisana specifikacija dovoljna da omogući stručnjaku da primeni ovaj pronalazak. Obim predmetnog pronalaska ne treba da bude ograničen datim primerima, pošto su primeri namenjeni samo kao ilustracija jednog aspekta pronalaska i drugi funkcionalno ekvivalentni primeri izvođenja obuhvaćeni obimom pronalaska. Različite modifikacije pronalaska, pored onih koje su ovde prikazane i opisane, biće očigledne stručnjacima u ovoj oblasti iz prethodnog opisa i obuhvaćene su obimom priloženih patentnih zahteva.

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Izolovano monoklonsko antitelo koje neutrališe virus JC usmereno protiv proteina VP1 iz kapsida JCV (JCV-VP1), naznačeno time, što navedeno monoklonsko antitelo sadrži:

varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu CDR1 koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 31, aminokiselinsku sekvencu CDR2 koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 35, i aminokiselinsku sekvencu CDR3 koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 9; i

varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu CDR1 koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 17, aminokiselinsku sekvencu CDR2 koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 3, i aminokiselinsku sekvencu CDR3 koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 4.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time, što je najmanje jedna aminokiselinska sekvenca okvirnog regiona varijabilnog domena teškog lanca najmanje 90% identična najmanje jednoj aminokiselinskoj sekvenci odgovarajućeg okvirnog regiona aminokiselinske sekvence varijabilnog domena teškog lanca koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 20.

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time, što navedeno antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 20.

4. Antitelo prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time, što navedeno antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 20.

5. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time, što je najmanje jedna aminokiselinska sekvenca okvirnog regiona varijabilnog domena lakog lanca najmanje 90% identična najmanje jednoj aminokiselinskoj sekvenci odgovarajućeg okvirnog regiona aminokiselinske sekvence varijabilnog domena lakog lanca koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 15.

6. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time, što navedeno antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 15.

7. Antitelo prema patentnom zahtevu 6, naznačeno time, što navedeno antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 15.

8. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time, što navedeno antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 20 i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca koja je identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 15.

9. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time, što je antitelo himerno antitelo.

10. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time, što antitelo sadrži Fc-region IgG1.

11. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, za upotrebu u postupku za lečenje subjekta koji ima jedan ili više znakova ili simptoma progresivne multifokalne leukoencefalopatije (PML), ili ima PML.

12. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačeno time, što antitelo prolazi krvnomoždanu barijeru.

13. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 11 ili 12, naznačeno time, što lečenje rezultuje smanjenjem virusnog opterećenja, poboljšanim rezultatom na EDSS skali, poboljšanim rezultatom na Karnofsky skali, poboljšanom MRI slikom, ili poboljšanjem kognicije.

14. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 11-13, naznačeno time, što se subjekt podvrgava, ili je bio podvrgnut, imunoterapijskom lečenju.

15. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 11-14, naznačeno time, što je subjekt imunokompromitovan.