ES2263485T3 - Terapia para insuficiencia renal cronica utilizando uno o mas angtagonistas de integrinas. - Google Patents

Abstract

La utilización de un anticuerpo anti-VLA4 antagonista de integrina o un fragmento del mismo que se une a una subunidad alfa4 que contiene la integrina para la preparación de una composición farmacéutica para tratar a un mamífero con, o en riesgo de, insuficiencia renal crónica.

Description

Terapia para insuficiencia renal crónica utilizando uno o más antagonistas de integrinas.

Campo de la invención

La presente invención está relacionada generalmente con los usos médicos para el tratamiento de enfermedades renales. En particular, la invención está relacionada con los usos médicos para el tratamiento de enfermedades que sitúan a los mamíferos, incluyendo a los humanos, en riesgo de insuficiencia renal crónica. Estos usos involucran la administración de ciertos antagonistas de integrinas.

Antecedentes de la invención

Muchos procesos fisiológicos requieren que las células entren en contacto íntimo con otras células o con la matriz extracelular. Tales eventos de adhesión pueden ser necesarios para la activación, migración (p. ej., migración de leucocitos), proliferación y diferenciación celulares. La interacción célula-célula y célula-matriz están mediadas a través de varias familias de moléculas de adhesión celular, una de las cuales incluye las integrinas.

Las moléculas de adhesión celular tienen un papel esencial tanto en los procesos normales como en los fisiopatológicos. Por lo tanto, para un agente terapéutico efectivo y seguro que inhiba la interacción célula-célula y célula-matriz es esencial la localización de moléculas específicas y relevantes en ciertas enfermedades sin interferir con la función celular normal.

Por ejemplo, la migración de leucocitos hacia los glomérulos es una característica típica de la glomerulonefritis humana (GN) y los leucocitos son mediadores clave del daño renal. Se ha observado una migración similar de leucocitos en modelos animales de GN. Véase Allen et al., Journal of Inmunology, 162: 5519-5527 (1999) y las referencias citadas en éste. Hemos demostrado previamente que el bloqueo de la integrina VLA-4 inhibe la nefritis nefrotóxica aguda en un modelo de rata de esta enfermedad (Allen et al., supra; Tam, F.W.K. et al., Nephrol. Dial. Transplant. 14: 1658-1666 (1999).

Aunque existe alguna información sobre el papel de las integrinas en la enfermedad renal aguda, no existe información actualizada disponible que clarifique la importancia de las moléculas de adhesión celular en la enfermedad renal crónica. A priori, uno no puede asumir que la importancia de una molécula de adhesión celular en la enfermedad renal aguda indicará necesariamente que tales moléculas son importantes en la enfermedad renal crónica (véanse los Ejemplos).

La insuficiencia renal crónica (IRC) puede definirse como una reducción progresiva, permanente y significativa de la tasa de filtración glomerular (TFG) debido a la pérdida significativa y continuada de nefronas. La insuficiencia renal crónica comienza normalmente a partir de un punto en el que la disminución permanente de la función renal es de al menos un 50-60%) como resultado de una agresión a los tejidos renales que provoca la pérdida significativa de nefronas. La agresión inicial puede estar o no asociada con un episodio de insuficiencia renal aguda o puede estar asociada con cualquiera de varios trastornos renales incluyendo, entre otros: enfermedad renal terminal, nefropatía crónica diabética, glomerulopatía diabética, hipertrofia renal diabética, nefrosclerosis hipertensiva, glomerulosclerosis hipertensiva, glomerulonefritis crónica, nefritis hereditaria, displasia renal y rechazo crónico tras un trasplante de aloinjerto renal. Sin tener en cuenta la naturaleza de la agresión inicial, la insuficiencia renal crónica manifiesta una "ruta común final" de signos y síntomas a medida que se pierden las nefronas y la TFG disminuye progresivamente. Este deterioro progresivo de la función renal es lento, alargándose normalmente muchos años o décadas en pacientes humanos, pero al parecer inevitable.

Molina et al., Journal of Immunology, 153:2313-2320 (1994) describen la prevención de la nefritis inducida por cloruro de mercurio en la rata parda Noruega mediante el tratamiento con anticuerpos contra la integrina alfa-4. Se especula que los tratamientos diseñados para interferir con la integrina VLA4 pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.

La patente WO 98/04247 describe varios compuestos útiles para la inhibición y prevención de la adhesión celular y de patologías mediadas por la adhesión celular que pueden ser útiles para el tratamiento de muchas enfermedades inflamatorias y autoinmunes.

Taylor et al., Blood, 89:4078-4084 (1997) describen un anticuerpo monoclonal para el receptor plaquetario de GPIIb/IIIa que protege contra la anemia hemolítica microangiopática y el fallo renal microvascular trombótico en babuinos tratados con proteína de unión a C4b y una infusión subletal de Escherichia coli.

Rabb et al., Cell Adhesion and Communication, 6:13-20 (1998) describen el patrón de expresión de la leucointegrina alfa d/beta_{2} en la superficie de células de pacientes en hemodiálisis.

En humanos, a medida que progresa la insuficiencia renal crónica, y la TFG continúa descendiendo hasta menos de un 10% de lo normal (p. ej., 5-10 ml/min), el sujeto entra en enfermedad renal terminal (ESRD).

Durante esta fase, la incapacidad de las nefronas restantes para eliminar de forma adecuada los productos de desecho de la sangre, mientras retiene los productos útiles y mantiene el equilibrio de fluidos y electrolitos, lleva a un deterioro en que empiezan a fallar rápidamente muchos sistemas de órganos y, particularmente, el sistema cardiovascular. Llegado a este punto, la insuficiencia renal progresará rápidamente hasta la muerte a menos que el sujeto reciba un tratamiento renal sustitutivo (es decir, hemodiálisis crónica, diálisis peritoneal continua o trasplante renal).

Aproximadamente, 600 pacientes por millón reciben diálisis crónica cada año en los Estados Unidos, con un coste medio de 60.000 a 80.000 \textdollar por paciente y año. De los nuevos casos de enfermedad renal terminal cada año, aproximadamente del 28 al 33% son debidos a nefropatía diabética (o glomerulopatía diabética o hipertrofia renal diabética), del 24 al 29% son debidos a nefrosclerosis hipertensiva (o glomerulosclerosis hipertensiva) y del 15 al 22% son debidos a glomerulonefritis. La tasa de supervivencia a los 5 años, para todos los pacientes en diálisis crónica es aproximadamente del 40%, pero para los pacientes mayores de 65 años,la tasa cae hasta aproximadamente el 20%. Por lo tanto, existe una necesidad de tratamientos que puedan prevenir la pérdida progresiva de la función renal, que ha provocado que casi doscientos mil pacientes en Estados Unidos dependan de la diálisis crónica, y que conduce a la muerte prematura de cientos de miles cada año.

Resumen de la invención

Hemos encontrado que las moléculas de adhesión celular como las integrinas, no solo son importantes en la etiología de la enfermedad renal aguda, sino que también lo son en la etiología de IRC. La presente invención está dirigida a los usos médicos de los agentes definidos en las reivindicaciones anexadas, para el tratamiento de mamíferos con, o en riesgo de, insuficiencia renal crónica. Los agentes también pueden ser útiles para el tratamiento de mamíferos en riesgo de necesidad de un tratamiento renal sustitutivo. Tales sujetos incluye sujetos ya afectados de insuficiencia renal crónica o que ya han recibido tratamiento renal sustitutivo, así como cualquier sujeto del que se espere que sufra una pérdida progresiva de la función renal asociada con la pérdida progresiva del funcionamiento de nefronas funcionales.

Los usos que emplean los compuestos de esta invención se centran en parte en el descubrimiento que los anticuerpos anti-VLA-4 antagonistas de integrinas pueden utilizarse en el tratamiento de sujetos en riesgo, como se ha definido aquí, de insuficiencia renal crónica o de necesidad de tratamiento renal sustitutivo.

Los agentes terapéuticos renales de la invención pueden administrarse mediante cualquier vía de administración que sea compatible con el agente seleccionado, y puede formularse con cualquier excipiente famacéuticamente aceptable apropiado para la vía de administración. Las vías preferidas de administración son la parenteral y, en particular, la subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y renal incracapsular. Se espera que las dosis diarias de los agentes terapéuticos renales estén en el rango de alrededor de 0,1-50 mg/kg de peso corporal y, más preferiblemente, de alrededor de 1-3 mg/kg de peso corporal, aunque las dosis concretas pueden variar dependiendo del agente terapéutico renal empleado en particular y la condición médica y antecedentes particulares del sujeto. Las dosis pueden darse una o varias veces a la semana en intervalos de 1, 2 o 4 semanas. Los tratamientos de la presente invención son útiles en la prevención, inhibición o retraso de la pérdida progresiva de la función de las nefronas funcionales y de la consiguiente pérdida progresiva de la función renal, que caracteriza la insuficiencia renal crónica. Como tales, estos tratamientos son de gran valor en la prevención o retraso de la necesidad de diálisis crónica o tratamiento renal sustitutivo en sujetos con insuficiencia renal crónica, o en la reducción de la frecuencia necesaria de diálisis renal crónica en sujetos con enfermedad renal terminal.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra las mediciones de creatinina sérica durante la fase de insuficiencia renal crónica del modelo animal en ratas que reciben un antagonista soluble de TGF beta (cuadrado oscuro) frente a ratas que reciben el control negativo.

La Figura 2 es una gráfica que muestra el % medio de área glomerular fibrosada (estimado para 50 glomérulos consecutivos) y el número de cuadrantes glomerulares ocupados por fibrina durante la fase de insuficiencia renal crónica del modelo animal en ratas que reciben un antagonista soluble de TGF beta (cuadrado oscuro) frente a ratas que reciben el control negativo.

La Figura 3 muestra las curvas de supervivencia en la fase de insuficiencia renal crónica del modelo animal en ratas que reciben un control negativo y ratas que reciben anticuerpo anti-VLA-1.

La Figura 4 muestra las curvas de supervivencia en la fase de insuficiencia renal crónica del modelo animal en ratas que reciben un anticuerpo anti-VLA-4 (cuadrados) y ratas que reciben un control negativo (círculos).

Descripción detallada de la invención 1. Definiciones

Para señalar con más claridad y de forma más concisa el objeto de la invención reivindicada, se proporcionan las siguientes definiciones de los términos específicos utilizados en la siguiente descripción escrita y en las reivindicaciones anexas.

La superfamilia de las integrinas de antígeno muy tardío (VLA) está formada por glicoproteínas estructural y funcionalmente relacionadas que consisten en moléculas receptoras transmembrana heterodiméricas (alfa y beta) que se encuentran en varias combinaciones en casi cada tipo de célula de mamífero. Para revisiones véase: E.C. Butcher, Cell, 67, 1033 (1991); D. Cox et al., "The Pharmacology of the Integrins". Medicinal Research Rev. Vol. 195 (1994) y V.W. Engleman et al., "Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets" en Ann. Rev. Medicinal Chemistry, Vol. 31, J.A. Bristol, Ed.; Acad. Press, NY, 1996, p. 191. Las integrinas de la familia VLA incluyen VLA-1, -2, -3, -4, -5 y -6, en que cada una de las moléculas comprende una cadena beta 1 unida de forma no covalente a una cadena alfa, (alfa1, alfa2, alfa3, alfa4, alfa5, alfa6), respectivamente.

En particular, la integrina alfa1-beta1 es un receptor de superficie celular para el colágeno I, colágeno IV, laminina y posiblemente otros ligandos (los últimos términos referidos individual y colectivamente como "ligandos de integrina alfa-1" o "ligando(s) VLA-1", aunque el término "colágeno" se utilizará para incluir todos los ligandos de integrina alfa-1, apreciándose por los expertos en la materia que existen otros ligandos para la integrina alfa-1 y que se pueden analizar utilizando métodos convencionales). La integrina alfa1-beta1, además de soportar la adhesión y migración dependientes de colágeno, es probable que también sea un receptor de colágeno clave de las células derivadas del mesénquima que pueden estar involucradas en el remodelado de la MEC tras una lesión (Gotwals et al., J. Clin. Invest. 97: 2469-2477 (1996)). La capacidad de las células de contraerse y organizar las matrices de colágeno es un componente clave de cualquier respuesta de cicatrización de heridas. El término "integrina a1b1" (o "VLA-1" o "a1b1" o "integrina a1b1", utilizadas indistintamente) se refieren aquí a polipéptidos, u homólogos o a fragmentos de los mismos, que son capaces de unirse a miembros de las proteínas de la matriz extracelular tales como la laminina o el colágeno, u homólogos o fragmentos de tales proteínas de la matriz extracelular.

La integrina alfa 4 beta 1 es un receptor de la superficie celular para VCAM-1, fibronectina y posiblemente otros ligandos (estos ligandos de forma individual y de forma colectiva se refieren como "ligando(s) alfa4"). El término "integrina a4b1" (o "VLA-4" o "a4b1" o "integrina a4b1", se utilizan indistintamente) aquí se refieren a polipéptidos, u homólogos o fragmentos de los mismos, que son capaces de unirse a VCAM-1 y miembros de las proteínas de la matriz extracelular, más particularmente fibronectina, u homólogos o fragmentos de tales proteínas de la matriz extracelular, aunque los expertos en la materia apreciarán que existen otros ligandos para VLA-4 y que pueden analizarse utilizando métodos convencionales. Sin embargo, se sabe que la subunidad alfa4 se asociará con otras subunidades beta, además de beta1, por lo que podemos definir el término "integrina alfa 4" como aquellas integrinas cuya subunidad alfa4 se asocia con una u otra subunidad beta. Un ejemplo de integrina "alfa4" es alfa4beta7 (R. Lobb y M. Hemler, J. Clin. Invest., 94:1722-1728 (1994). Tal como se usa aquí, el término "integrina" significa VLA-1 o VLA-4, así como integrinas que contienen beta1, beta7 o cualquier otra subunidad beta.

Un "antagonista" de integrinas, como se ha descrito aquí, incluye cualquier compuesto que inhiba la unión de las integrinas con un ligando de integrina o receptor. La invención se refiere exclusivamente a los usos del anticuerpo anti-VLA-4 antagonista de integrinas, o fragmentos del mismo, como se definen en las reivindicaciones. Son útiles los anticuerpos anti-integrinas o las proteínas que contienen homólogos de anticuerpos (comentados anteriormente), así como otras moléculas como son las formas solubles de las proteínas que son ligandos para integrinas. Entre estas últimas se encuentran las siguientes: VCAM-1 soluble o péptidos de colágeno, proteínas de fusión VCAM-1 o proteínas de fusión VCAM-1 Ig bifuncionales. Por ejemplo, una forma soluble de un ligando de integrina, o de un fragmento del mismo, puede administrarse para unirse a integrinas y competir preferiblemente por un sitio de unión de integrinas sobre las células, produciendo por lo tanto efectos similares a la administración de antagonistas como los anticuerpos anti-integrinas (p. ej., VLA-1I o VLA-4). En particular, los mutantes de integrina solubles que se une a ligando pero no provocan una señal dependiente de integrina están incluidos dentro del alcance de la invención. Estos mutantes de integrina pueden actuar como inhibidores competitivos de las proteínas integrinas de tipo salvaje y están considerados "antagonistas" También se describen los usos que emplean moléculas que antagonizan la acción de más de una integrina, como moléculas pequeñas u homólogos de anticuerpos que antagonizan ambas integrinas alfa4 (p. ej., VLA-4) y VLA-1, u otra combinación de integrinas. También se describen los usos que emplean una combinación de moléculas de tal modo que la combinación antagoniza la acción de más de una integrina, como los métodos que utilizan varias moléculas pequeñas u homólogos de anticuerpos que en combinación antagonizan ambas integrinas alfa 4 (p. ej., VLA-4) y VLA-1, u otra combinación de integrinas.

Tal como se describe aquí, ciertos antagonistas de integrina, como por ejemplo un homólogo de anticuerpo como una inmunoglobulina o un fragmento de la misma, pueden fusionarse o conjugarse de otra manera y no se limitan a un tipo particular o estructura de integrina o ligando u otra molécula. Cualquier agente capaz de formar una proteína de fusión (como se define más abajo), capaz de unirse a ligandos de integrinas y que bloquea de forma efectiva o recubre la integrina VLA- 1 o alfa 4 (p. ej., VLA-4) se considera como un equivalente de los antagonistas descritos aquí.

El término "homólogo de anticuerpo" incluye anticuerpos intactos que consisten en cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas unidas mediante puentes disulfuro. El término "homólogo de anticuerpo" también pretende abarcar una proteína que comprende uno o más polipéptidos seleccionados a partir de cadenas ligeras de inmunoglobulina, cadenas pesadas de inmunoglobulina y fragmentos de unión a antígeno de las mismas que son capaces de unirse a uno o más antígenos (es decir, integrinas o ligandos de integrina). Los polipéptidos componentes de unhomólogo de anticuerpo compuesto por más de un polipéptido pueden estar opcionalmente unidos mediante puentes disulfuro o entrelazados de forma covalente. Por lo tanto, los "homólogos de anticuerpo" incluyen inmunoglobulinas intactas de lostipos IgA, IgG, IgE, IgD e IgM (así como subtipos de los mismos), en los que las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de los tipos kappa o lambda. Los "homólogos de anticuerpo" también incluyen porciones de anticuerpos intactos que retienen la especificidad de unión a antígeno, por ejemplo fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos F(v), monómeros o dímeros de cadena ligera y pesada o mezclas de los mismos.

Un "homólogo de anticuerpo humanizado" es un homólogo de anticuerpo, producido mediante teconología de DNA recombinante, en el que todos los aminoácidos de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina humana, o algunos de ellos, que no son necesarios para la unión del antígeno se han sustituido por los aminoácidos correspondientes de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina de mamífero no humano.

Tal como aquí se emplea, un "homólogo de anticuerpo humano" es un homólogo de anticuerpo producido mediante tecnología de DNA recombinante en el que todos los aminoácidos de una cadena pesada o ligera de inmuoglobulina provienen de una fuente humana (sin tener en cuenta si estos aminoácidos son necesarios para la unión antigénica o no).

Un "aminoácido" es una unidad monomérica de un péptido, polipéptido o proteína. Existen veinte aminoácidos que se encuentran en péptidos, polipéptidos y proteínas que se dan de forma natural, siendo todos ellos L-isómeros. El término también incluye análogos de los aminoácidos y D-isómeros de los aminoácidos proteicos y sus análogos.

El término "actividad biológica de los antagonistas" siginifica que los antagonistas de la invención, o equivalentes funcionales o variantes de los mismos, son capaces de prevenir, inhibir, retrasar o paliar de forma significativa la pérdida progresiva de la función renal en un modelo animal estándar de insuficiencia renal crónica, o son capaces de causar una mejora clínicamente significativa en un marcador estándar de función renal cuando se administra a un mamífero con insuficiencia renal crónica o con riesgo de sufrirla.

El término "cilindros anchos" se refiere a los elementos formados que pueden estar presentes en la orina y que son masas cilíndricas de materiales aglutinados que representan de forma característica un molde o "cilindro" del lumen de un túmulo contorneado distal o de un túmulo colector. Sin embargo, en sujetos con IRC la hipertrofia de los túmulos puede dar lugar a la presencia de "cilindros anchos" o "cilindros de insuficiencia renal" que son de 2 a 6 veces el diámetro de los cilindros normales y a menudo presentan una apariencia cérea homogénea. El examen microscópico del sedimento urinario en busca de la presencia de elementos formados es un procedimiento estándar en los análisis de orina.

La "biodisponibilidad" se refiere a la capacidad de un compuesto para ser absorbido por el cuerpo tras su administración. Por ejemplo, un primer compuesto tiene una mayor biodisponibilidad que un segundo compuesto si, cuando ambos se administran en cantidades iguales, el primero es absorbido en la sangre en mayor proporción que el segundo.

"Crónico" significa que persiste durante un periodo de por lo menos tres meses y, más preferiblemente, al menos seis. De este modo, por ejemplo, un sujeto con una TFG medida inferior al 50% de la TFG esperada de forma crónica es un sujeto en el que la TFG se ha medido y se ha hallado inferior al 50% de la TFG esperada en por lo menos dos mediciones separadas por tres meses al menos y, más preferiblemente, por al menos seis, y para el cual no hay ninguna razón médicamente de peso para creer que la TFG era considerablemente mayor (p. ej., 10%) durante el periodo intermedio. Los expertos comprenderán que, por lo que respecta a modelos animales, el término "crónico" puede significar periodos temporales diferentes que dependen del tipo de modelo animal. El término "acoplado de forma covalente" significa que las porciones especificadas de la invención (p. ej., fragmento de inmunoglobulina/antagonista de integrina) se encuentran directamente unidas entre sí de forma covalente, o bien están indirectamente unidas de forma covalente entre sí a través de una porción o porciones intermedias, como un puente, espaciador o una o varias porciones de unión. Las porciones intermedias se denominan "grupo de acoplamiento". El término "conjugado" se utiliza de forma intercambiable con "acoplado de forma covalente".

La "secuencia de control de expresión" es una secuencia de polinucleótidos que controla y regula la expresión de genes cuando se encuentra unida de forma funcional a estos genes. Un "vector de expresión" es un polinucleótido, como un plásmido de DNA o un fago (entre otros ejemplos comunes), que permite la expresión de por lo menos un gen cuando el vector de expresiones introducido dentro de una célula huésped. El vector puede ser o no capaz de replicarse en una célula.

La frase "proteína de señalización extracelular" significa cualquier proteína que o bien es secretada por una célula o bien está asociada a la membrana celular y, al unirse al receptor para esta proteína en una célula diana, desencadena una respuesta en la célula diana.

Una "cantidad efectiva" de un agente de la invención es aquella que produce un resultado o ejerce una influencia sobre el trastorno en particular que está siendo tratado.

Un "equivalente funcional" de un residuo aminoacídico es (i) un aminoácido con unas propiedades reactivas similares a las del residuo aminoacídico que se reemplazaba con el equivalente funcional; (ii) un aminoácido de un antagonista de la invención, teniendo el aminoácido propiedades similares a las del residuo aminoacídico que se reemplazaba con el equivalente funcional o (iii) una molécula no aminoacídica con unas propiedades similares a las del residuo aminoacídico que se reemplazaba con el equivalente funcional. Un primer polinucleótido que codifica un antagonista proteináceo de la invención es "funcionalmente equivalente" comparado con un segundo polinucleótido que codifica la proteína antagonista si al menos cumple una de las siguientes condiciones: 1. el "equivalente funcional" es un primer polinucleótido que híbrida con el segundo polinucleótido bajo condiciones de hibridación estándar o es una degeneración de la primera secuencia polinucleotídica. Se prefiere especialmente que codifique una proteína mutante que posea la actividad de una proteína antagonista de integrina; 2. el "equivalente funcional" es un primer polinucleótido que lleva el código para la expresión de una secuencia aminoacídica codificada por el segundo polinucleótido.

Los antagonistas de integrina aquí descritos incluyen, entre otros, los agentes que aquí aparecen nombrados así como sus equivalentes funcionales. Por lo tanto, el término "equivalente funcional", tal como se utiliza aquí, se refiere a un antagonista de integrina o a un polinucleótido que codifica el antagonista de integrina que tiene el mismo efecto beneficioso, o incluso uno mejorado, sobre el sujeto receptor que el antagonista de integrina del cual se considera equivalente funcional. Como comprenderá cualquier experto en la materia, una proteína funcionalmente equivalente se puede producir mediante técnicas recombinantes, p. ej., expresando un "DNA funcionalmente equivalente". En consecuencia, la presente invención abarca proteínas integrinas codificadas por DNA que se dan de forma natural, así como por DNA que no se dan de forma natural que codifican la misma proteína codificada por el DNA que sí se da de forma natural. Debido a la degeneración de las secuencias codificadoras de nucleótidos, es posible utilizar otros polinucleótidos para codificar la proteína integrina. Estos incluyen todas las secuencias anteriores, o porciones de ellas, que están alteradas por la sustitución de diferentes codones que codifican el mismo residuo aminoacídico de la secuencia, produciendo de este modo un cambio silencioso. Estas secuencias alteradas se consideran equivalentes a las primeras. Por ejemplo, Phe (F) está codificada por dos codones, TTC o TTT, Tyr (Y) está codificada por TAC o TAT y His (H) está codificada por CAC o CAT. Por otro lado, Trp (W) está codificado por un único codón, TGG. Consecuentemente, se puede comprender que para una secuencia de DNA dada que codifique una integrina en particular habrá muchas secuencias degeneradas de DNA que codificarán para la misma. Estas secuencias degeneradas de DNA se tienen en cuenta en el alcance de esta invención.

El término "fusión" o "proteína de fusión" se refiere a una unión colineal y covalente de dos o más proteínas, o fragmentos de las mismas, a través de sus esqueletos peptídicos individuales o, más preferiblemente, a través de la expresión genética de una molécula polinucleotídica que codifica estas proteínas. Es preferible que las proteínas o fragmentos de las mismas provengan de fuentes diferentes de modo que este tipo de proteína de fusión se denomina una molécula "quimérica". Por lo tanto, las proteínas de fusión preferidas son proteínas quiméricas que incluyen un antagonista de integrina o un fragmento unido de forma covalente a una segunda porción que no sea un antagonista de integrina. Las proteínas de fusión de la invención preferidas pueden incluir porciones de anticuerpos intactos que retengan una especificidad de unión antigénica, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos F(v), monómeros o dímeros de cadena pesada, monómeros o dímeros de cadena ligera, dímeros formados por una cadena pesada y una ligera, y similares.

También se describen proteínas de fusión que son quiméricas y que contienen una porción antagonista de integrina fusionada o, si no, unida a todas las regiones bisagra y regiones constantes, o parte de ellas, de una cadena ligera de inmunoglobulina, una pesada o ambas. Por tanto, esta patente describe una molécula que incluye: (1) una porción antagonista de integrina, (2) un segundo péptido, p. ej. uno que aumente la solubilidad o la vida in vivo de la porción antagonista de integrina, p. ej. un miembro de la super familia de las inmunoglobulinas o un fragmento o porción del mismo, p. ej. una porción o un fragmento de IgG, p. ej. la región constante de la cadena pesada de la IgG1 humana, p. ej. CH2, CH3 y regiones bisagra. De forma específica, un "antagonista de integrina/fusión de Ig" es una proteína que contiene una molécula de la invención biológicamente activa antagonista de integrina (p. ej. un ligando VLA-4 soluble, o un fragmento del mismo biológicamente activo) unida a un extremo N-terminal de una cadena de inmunoglobulina en la que una porción del extremo N-terminal de la inmunoglobulina es reemplazado con el antagonista de integrina. Una especie de un antagonista de integrina/fusión de Ig es una "integrina/fusión de Fc" que es una proteína que contiene un antagonista de integrina de la invención unido al menos a una parte del dominio constante de una inmunoglobulina. Una fusión Fc preferida contiene un antagonista de la integrina de la invención unido a un fragmento de un anticuerpo que contiene el dominio C Terminal de las cadenas pesadas de inmunoglobulina.

El término "proteína de fusión" también se refiere a un antagonista de integrina unido químicamente, a través de una molécula mono o heterofuncional, a una segunda mitad que no es antagonista de integrina (lo que conduce a una molécula "quimérica") y se realiza de novo a partir de proteína purificada como se describe a continuación. De esta forma, un ejemplo de molécula quimérica de unión química, en contraste con una de unión recombinante, y que sea una proteína de fusión puede incluir: (1) una porción localizadora de una subunidad de integrina alfa 4, (p. ej., una porción de VCAM-1 capaz de unirse a VLA-4) sobre la superficie de células portadoras de VLA-4; (2) una segunda molécula que aumenta la solubilidad o la vida in vivo de la porción de localización, (p. ej., un polímero polialquilenglicol como el polietilenglicol (PEG)). La porción de localización alfa 4 puede ser cualquier ligando natural alfa 4 o un fragmento del mismo, p. ej., un péptido VCAM-1 o una secuencia de aminoácidos conservativa similar.

Un "promotor heterólogo", como se utiliza aquí, es un promotor que no está asociado de forma natural a un gen o un ácido nucleico purificado.

"Homología", como se utiliza aquí, es sinónimo del término "identidad" y se refiere a la similitud de secuencia entre dos polipéptidos, moléculas o ácidos nucleicos. Cuando una posición de las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma base o subunidad de monómero de aminoácido (por ejemplo, si una posición en cada una de los dos moléculas de DNA está ocupada por adenina, o una posición en cada uno de los dos polipéptidos está ocupada por una lisina), se considera que las moléculas respectivas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función consistente en el número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas multiplicadas por 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones de dos secuencias coinciden o son homólogas, las secuencias son homólogas al 60%. A modo de ejemplo, las secuencias de DNA CTGACT y CAGGTT comparten un 50% de homología (coinciden 3 de las 6 posiciones totales). Generalmente, se realiza la comparación cuando dos secuencias están alineadas para obtener la máxima homología. Dicho alineamiento puede realizarse, por ejemplo, mediante el método de Karlin y Altschul, descrito más detalladamente a continuación. Las secuencias homólogas comparten residuos idénticos o similares, considerando como residuos similares las sustituciones conservativas o "mutaciones puntuales permitidas" de los correspondientes residuos de aminoácido de una secuencia de referencia alineada. Teniendo esto en cuenta, se considera una "sustitución conservativa" de un residuo de una secuencia de referencia a aquellas sustituciones física o funcionalmente similares a los correspondientes residuos de referencia, p. ej., de similar tamaño, forma, carga eléctrica, propiedades químicas (incluyendo la capacidad de formar enlaces covalentes o de hidrógeno) o similares. Son sustituciones conservativas particularmente preferidas aquellas que cumplen el criterio de definición de "mutación puntual aceptada" de Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Suppl. 3, capítulo 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C. (1978). Los términos "homología" e "identidad" son intercambiables en este documento y se refieren a la similitud de secuencias ente dos secuencias de polipéptidos. La homología o identidad puede determinarse comparando una posición en cada secuencia que esté alineada con el propósito de comparación. Cuando una posición de la secuencia comparada está ocupada por el mismo residuo de aminoácido, puede decirse que los polipéptidos son idénticos en esa posición; cuando el sitio equivalente está ocupado por el mismo aminoácido (p. ej., idéntico) o un aminoácido similar (p. ej., similar en su forma estérica y su naturaleza electrónica), puede decirse que las moléculas son homólogas en esa posición. Un porcentaje de homología o identidad entre secuencias es una función del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las secuencias. Una secuencia "no relacionada" o "no homóloga" comparte menos de un 40% de identidad, aunque preferiblemente menos de un 25%, con las secuencias de la presente invención.

El "porcentaje de homología" de dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de ácidos nucleicos está determinado mediante el algoritmo de alineamiento de Karlin y Altschul (Proc. Nat. Acad. Sci., USA 87: 2264 (1990)) como modificaron Karlin y Altschul (Proc. Nat. Acad. Sci., USA 90: 5873 (1993). Este algoritmo se incorpora en los programas NBLAST o XBLAST de Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990). Las búsquedas BLAST se realizan mediante el programa NBLAST, score = 100, wordlength = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a un ácido nucleico de la invención. Las búsquedas BLAST de proteínas se realizan mediante el programa XBLAST, score = 50, wordlength = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a un polipéptido de referencia. Para la obtención de alineaciones con huecos con el fin de comparar, se utiliza Gapped BLAST como describe Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389 (1997). Al utilizar BLAST y Gapped BLAST, se utilizarán los parámetros por defecto de los respectivos programas (XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

El término "aislado" (que se utiliza de forma intercambiable con "sustancialmente puro"), cuando se aplica a ácidos nucleicos, es decir secuencias de polinucleótidos que codifican antagonistas de las integrinas, se refiere a un nucleótido de RNA o de DNA, una fracción de polinucleótido genómico, cDNA o un polinucleótido sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (i) no está asociado con la totalidad de un polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza (p. ej., está presente en una célula huésped como vector de expresión, o una parte del mismo); o (ii) está unido a un ácido nucleico o a otra subunidad química diferente a las que está unido en la naturaleza; o (iii) no existe en la naturaleza. Por "aislado" también se entiende una secuencia de polinucleótidos que está: (i) amplificada in vitro mediante, por ejemplo, una reacción en cadena de la polimerasa (PCR); (ii) sintetizada de forma química; (iii) producida de forma recombinante mediante clonación; o (iv) purificada, como mediante escisión y separación
en gel.

El término "aislado" (que se utiliza de forma intercambiable con "sustancialmente puro"), cuando se aplica a polipéptidos se refiere a un polipéptido o a una porción del mismo que, en virtud de su origen o manipulación : (i) está presente en una célula huésped como el producto de expresión de una porción de un vector de expresión; o (ii) está unido a una proteína o a otra subunidad química distinta a la que está unido en la naturaleza; o (iii) no existe en la naturaleza, por ejemplo, una proteína que está manipulada químicamente mediante la adición como mínimo de una porción hidrofóbica a la proteína de forma que esta queda en una forma que no existe en la naturaleza. Por "aislada" también se entiende una proteína que está: (i)sintetizada químicamente o (ii) expresada en una célula huésped y purificada aparte de las proteínas asociadas y contaminantes. El término generalmente se refiere a un polipéptido que se ha separado de otras proteínas y ácidos nucleicos con los que suele encontrarse en estado natural. Preferiblemente, el polipéptido también se separa de substancias como los anticuerpos o las matrices de gel (poliacrilamida) que se utilizan para purificarlo.

Un "complejo de proteínas multivalente" se refiere a una diversidad de antagonistas de integrinas (es decir, uno o más). Por ejemplo, un homólogo de anticuerpo anti-integrina o un fragmento del mismo puede estar ligado de forma cruzada o unido a otro homólogo de anticuerpo o fragmento. Cada proteína puede ser igual o diferente y cada homólogo de anticuerpo o fragmento puede ser igual o diferente.

El término "mutante" se refiere a cualquier cambio en el material genético de un organismo, en particular cualquier cambio (es decir, deleción, sustitución, adición, o alteración) en una secuencia de polinucleótidos de tipo salvaje, o cualquier cambio en una proteína de tipo salvaje. El término "muteína" se utiliza de forma intercambiable con "mutante".

"Unido de forma operativa": Una secuencia de polinucleótidos (DNA, RNA) está unida de forma operativa a una secuencia de control de expresión cuando la secuencia de control de expresión controla y regula la transcripción y la traducción de dicha secuencia de polinucleótidos. El término "unido de forma operativa" incluye la presencia de una señal de inicio apropiada (p. ej., ATG) frente a la secuencia de polinucleótidos a expresar, y el mantenimiento del marco de lectura correcto para permitir la expresión de la secuencia de polinucleótidos bajo el control de la secuencia de control de expresión y la producción del polipéptido deseado codificado por la secuencia de polinucleó-
tidos.

Una "proteína" es cualquier polímero que consiste esencialmente en cualesquiera de los 20 aminoácidos. Aunque el término "polipéptido" se utiliza frecuentemente para polipéptidos relativamente grandes y el término "péptido" para polipéptidos pequeños, la utilización de estos términos en el campo es variada y se solapa. El término "proteína", como se utiliza aquí, se refiere a péptidos, proteínas y polipéptidos, excepto en caso de que se indique lo contrario. Los términos "péptido", "proteína" y "polipéptido" aquí se utilizan indistintamente.

Los términos "secuencia de polinucleótidos" y "secuencia de nucleótidos" también se utilizan de forma indistinta en este texto.

"Recombinante", como se utiliza aquí, significa que una proteína proviene de sistemas de expresión recombinantes. Dado que las integrinas no están gicosiladas ni contienen uniones disulfuro, pueden expresarse en la mayoría de los sistemas de expresión procariotas y eucariotas.

Una "molécula pequeña" se define como en la sección IIA2.

Una secuencia "espaciadora" se refiere a una porción que puede insertarse entre un aminoácido a modificar con un homólogo de anticuerpo o fragmento y el resto de la proteína. Se designa un espaciador para proporcionar una separación entre la modificación y el resto de la proteína de forma que se evita que la modificación interfiera con la función de la proteína, o facilite su modificación para unirse con una porción de homólogo de anticuerpo o cualquier otra porción.

Un "ácido nucleico sustancialmente puro" es un ácido nucléico que no está situado de forma inmediatamente contígua a una de las dos secuencias codificadoras, o a ambas, a las que suele estar contíguo normalmente en el genoma del organismo del que procede en estado natural. El DNA sustancialmente puro también incluye un DNA recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica secuencias de integrina adicionales.

La expresión "aminoácido de superficie" se refiere a cualquier aminoácido que se exponga a un disolvente cuando la proteína esté plegada en su forma nativa.

Las "condiciones de hibridación" se refieren generalmente a condiciones de salinidad y temperatura sustancialmente equivalentes a 0,5 X SSC hasta aproximadamente 5X SSC y 65ºC tanto para hibridación como lavado. La expresión "condiciones de hibridación estándar", como se utiliza aquí, es por lo tanto una definición operativa y abarca una variedad de condiciones dehibridación. Aún así, las condiciones "altamente astringentes" incluyen la hibridación con tampón plaque screen (0,2% polivinilpirrolidona, 0,2% FicoII 400; 0,2% albúmina sérica bovina, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5); NaCl 1 M; 0,1% pirofosfato sódico; 1% SDS); 10% sulfato de dextrano y 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón sonicado desnaturalizado a 65ºC durante 12-20 horas, y lavado con NaCl 75 mM/citrato sódico 7,5 mM (0,5 x SSC)/1% SDS a 65ºC. Las condiciones de "baja astringencia" incluyen la hibridación con tampón plaque screen, 10% sulfato de dextrano y 110 \mug/ml de DNA de esperma de salmón sonicado desnaturalizado a 55ºC durante 12-20 horas, y el lavado con NaCl 300 mM/citrato sódico 30 mM (2,0 X SSC)/1% SDS a 55ºC. Véase también Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. New York, Secciones 6.3.1- 6.3.6, (1989).

Un "sujeto con, o en riesgo de, insuficiencia renal crónica" también puede necesitar tratamiento renal sustitutivo (es decir, hemodiálisis crónica, diálisis peritoneal continua o transplante de rinón), si el sujeto es un paciente humano y hay un pronóstico razonable de que este sufra una disminución progresiva de la función renal asociada a la pérdida progresiva de nefronas funcionales. Los conocedores de las técnicas habituales de medicina humana o veterinaria pueden determinar si un sujeto de un ensayo clínico o de un modelo animal presenta, o presenta el riesgo de, insuficiencia renal crónica. Los sujetos con, o con riesgo de, insuficiencia renal crónica (o con riesgo de necesitar un tratamiento renal sustitutivo) incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: sujetos que pueden considerarse afectados de insuficiencia renal crónica, enfermedad renal terminal, neuropatía diabética crónica, nefroesclerosis hipertensiva, glomerulonefritis crónica, nefritis hereditaria, displasia renal; sujetos con una biopsia que indica hipertrofia glomerular, hipertrofia tubular, glomeruloesclerosis crónica, esclerosis tubulointerstitial crónica; sujetos con una prueba de ultrasonidos, RMI, TAC, u otra examinación no invasiva que indica fibrosis renal o riñón más pequeño de lo normal. Los expertos en la materia conocen las demás indicaciones de sujetos con, o con riesgo de, IRC. Por ejemplo, pueden ser criterios para determinar si un paciente presenta, o corre el riesgo de presentar, IRC: sujetos con un número inusual de cilindros anchos presente en el sedimento urinario; sujetos con una TFG crónicamente inferior al 50%, más particularmente inferior al 40%, 30% o 20%, de la TFG esperada para el sujeto; los sujetos humanos varones que pesan al menos 50 kg y tienen una TFG crónicamente inferior a aproximadamente 50 ml/min, y más particularmente inferior a unos 40 ml/min, 30 ml/min o 20 ml/min; los sujetos humanos femeninos que pesan al menos 40 kg y tienen una TFG crónicamente inferior a unos 40 ml/min, y más particularmente inferior a 30 ml/min, 20 ml/min o 10 ml/min; sujetos con una cifra de nefronas funcionales inferior al 50%, y más particularmente inferior al 40%, 30% o 20% del número de nefronas funcionales que posea un sujeto sano pero similar en los demás aspectos; sujetos que tienen sólo un riñón; y sujetos que han recibido un transplante de riñón.

Una "composición terapéutica", como se utiliza aquí, se define como una que contiene las proteínas de la invención y otros ingredientes biológicamente compatibles. La composición terapéutica puede contener excipientes como agua, minerales y transportadores como proteínas.

Se considera que un antagonista de la invención es "terapéuticamente eficaz" y que una cantidad del agente es "terapéuticamente efectiva" si la administración de esa cantidad del agente a un sujeto es suficiente para producir una mejora clínica significativa en un marcador renal estándar de la función renal (p. ej., un modelo animal o un paciente humano) con, o con riesgo de, insuficiencia renal crónica. Dichos marcadores de la funcion renal están bien descritos en la literatura médica e incluye, sin estar limitados a éstos, tasas de aumento en niveles BUN, tasas de aumento de la creatinina en suero, medidas estáticas de BUN, medidas estáticas de creatinina en suero, tasas de filtración glomerular (TFG), tasas de BUN/creatinina, concentración de sodio (Na+) en suero, tasas de creatinina en orina/plasma, tasas de urea en orina/plasma, osmolalidad de la orina, eliminación diaria de orina, y similares (véase, por ejemplo, Brenner y Lazarus (1994), en Harrison's Principles of Internal Medicine, edición l3, Isselbacher et al., eds., McGraw Hill Text, New York; Luke y Strom (1994), en Internal Medicine, cuarta Edición, J.H. Stein, ed., Mosby-Year Book, Inc. St. Louis.)

Tasa de Filtracón Glomerular (TFG). La "tasa de filtración glomerular" o "TFG" es proporcional a la tasa de aclaramiento de orina de una sustancia transportada por el plasma y no unida a proteínas plasmáticas, que se filtra de forma libre a través de los glomérulos y ni se secreta ni se reabsorbe por los túmulos renales. De esta forma, como se utiliza aquí, la TFG preferiblemente se define mediante la siguiente ecuación:

TFG = \frac{U_{conc} \ x \ V}{P_{conc}}

donde U_{conc} es la concentración en orina del marcador, P_{conc} es la concentración de plasma del marcador, y V es la tasa de flujo de orina en ml/min. Opcionalmente, la TFG se corrige para el área de la superficie corporal. De esta forma, los valores de TFG utilizados aquí pueden contemplarse como en unidades de ml/min/1,73 m^{2}.

La medida preferida de TFG es el aclaramiento de inulina pero, debido a la dificultad para medir las concentraciones de esta sustancia, en los casos clínicos generalmente se utiliza el aclaramiento de creatinina. Por ejemplo, para un varón humano sano de talla media (70 kg, 20-40 años), se espera que la TFG medida por aclaramiento de creatinina sea de aproximadamente 125 ml/min con concentraciones plasmáticas de creatinina de 0,7-1,5 mg/dL. Para una mujer de comparable, de talla media, se espera que la TFG medida por aclaramiento de creatinina sea de aproximadamente 115 ml/min con niveles de creatinina de 0,5-1,3 mg/dL. En momentos de buena salud, los valores de TFG permanecen relativamente estables hasta los 40 años, cuando la TFG generalmente empieza a decrecer con la edad. En los sujetos que alcanzan edades de 85 o 90 años, la TFG puede estar reducida hasta el 50% de los valores comparables a la edad de 40 años.

Tasa de Filtración Glomerular Esperada (TFG_{esp}). Se puede obtener una estimación de la "TFG esperada" o "TFGesp" considerando la edad del sujeto, peso, sexo, área corporal, grado de musculatura, y la concentración plasmática de determinados compuestos marcadores (p. ej., creatinina) determinados mediante un análisis de sangre. De esta forma, a modo de ejemplo, una TFG esperada o TFG_{esp} puede estimarse como:

TFG_{esp} = \frac{(140-edad) \ x \ peso(kg)}{72 \ x \ P_{conc} \ (mg/dl)}

Esta estimación no toma en consideración factores como el área corporal, grado de musculatura o porcentaje de grasa corporal. Aún así, utilizando los niveles de creatinina plasmática como marcador, esta fórmula se ha utilizado para humanos varones como un medio barato para estimar la TFG. Dado que la creatinina se produce en el músculo estriado, la TFG o TFG_{esp} de sujetos humanos hembra se estima con la misma ecuación multiplicada por 0,85 para tener en cuenta las diferencias esperadas en masa muscular. (Véase Lemann, et al. (1990) Am. J. Kidney Dis. 16(3):236-243.)

"De tipo salvaje" se refiere a la secuencia de polinucleótidos normales en la forma natural de un exón de proteína, o una porción de la misma, o secuencia proteica, o porción de la misma, en su forma normal in vivo.

La práctica de la presente invención empleará, excepto en caso de que se indique lo contrario, las técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, microbiología, DNA recombinante, química proteica e inmunología que se empleen en el campo. Estas técnicas están descritas en la literatura. Excepto en caso de que se indique lo contrario, todas las referencias citadas en la Descripción Detallada están incorporadas aquí a modo de referencia.

Descripción de las realizaciones preferidas General

La presente invención depende, en parte, del descubrimiento de que la eficacia de ciertos antagonistas de las integrinas sobre sujetos con, o con riesgo de, insuficiencia renal aguda, no predice la eficacia en caso de insuficiencia renal crónica. Estos hallazgos se resumen en los Ejemplos. Además, se ha descubierto que ciertos antagonistas de las integrinas pueden reducir las tasas mortalidad y morbilidad y evitar, inhibir, retrasar o paliar la pérdida progresiva de la función renal que caracteriza la insuficiencia renal crónica. De forma breve, se desarrolló un modelo animal de enfermedad renal con dos fases –una primera fase de inflamación del hígado mediada por inmunología (gromerulonefritis aguda progresiva) que duró aproximadamente 10 días, seguida de una fase secundaria de nefritis tubulointersticial acompañada por glomeruloesclerosis progresiva que duró hasta que murieron de IRC aproximadamente el día 40. Se descubrió que los antagonistas a TGFbeta (que es un mediador conocido de la fibrosis en CRF y se expresa a partir del día 11 en este modelo) no eran eficaces en el modelo animal durante la fase aguda, pero sí eran eficaces en la fase crónica. Se observó una disparidad similar entre las fases aguda y crónica utilizando un anticuerpo anti VLA-1. De esta forma, no cabría esperar encontrar antagonistas a las integrinas alfa 4 con eficacia en ambas fases.

A. Antagonistas de Integrinas

Para los propósitos de la presente descripción, un antagonista de integrina puede ser un antagonista de cualquier interacción entre una integrina y su correspondiente ligando o receptor. Un antagonista de integrina es un antagonista de interacción de las integrinas alfa 4 con sus ligandos, como la interacción VCAM-1/VLA-4 o la interacción MadCAM/alfa4beta7 (véase Lobb y Hemier, supra). Este es un agente, p. ej., un polipéptido u otra molécula, que puede inhibir o bloquear la unión mediada por VCAM-1 o VLA-4 o que puede modular de otra manera la función de VCAM- 1 o VLA-4, p. ej., mediante inhibición o bloqueo de la transducción de señal VLA-4-mediada por ligando de VLA-4 y que es efectiva en el tratamiento de la insuficiencia renal crónica, preferiblemente de la misma manera que los anticuerpos anti-VLA-4. De forma similar, será un agente p. ej., un polipéptido u otra molécula, que puede inhibir o bloquear las uniones mediadas por MadCAM o alfa4beta7 o puede modular de otra manera las funciones de MadCAM o alfa4 beta7, p. ej., inhibiendo o bloqueando la transducción de señal de alfa4 beta7 mediada por ligando alfa4 beta7 o la transducción de señal de MadCAM mediada por ligando MadCAM y que es efectiva para el tratamiento de la insuficiencia renal crónica.

Por ejemplo, un antagonista de la interacción de VCAM-1/VLA-4 es un agente que presenta una o más de las siguientes propiedades: (1) recubre, o se une al, VLA-4 sobre la superficie de las células portadoras VLA-4 (es decir, linfocitos) con suficiente especificidad para inhibir la interacción ligando de VLA-4/VLA-4, p. ej., la interacción VCAM-1/VLA-4; (2) recubre, o se une al, VLA-4 sobre la superficie de las células portadoras VLA-4 (es decir, linfocitos) con suficiente especificidad para modificar, y preferiblemente inhibir, la transducción una señal mediada por VLA-4, p. ej. la señal mediada por VLA-4/VCAM- 1; (3) recubre, o se une al, ligando de VLA-4 (p. ej., VCAM- 1) sobre las células endoteliales con suficiente especificicidad para inhibir la interacción VLA 4/VCAM-1; 4) recubre, o se une al, ligando de VLA-4 (p. ej., VCAM- 1) con suficiente especificicidad para modificar, y preferiblemente inhibir, la transducción de las señales VLA-4 mediadas por ligando de VLA-4, p. ej. la señalización VLA-4 mediada por VCAM-1. El antagonista descrito presenta una o las dos propiedades 1 y 2. En otros casos el antagonista presenta una o las dos propiedades 3 y 4. Además, se puede administrar más de un antagonista a un paciente, p. ej., un agente que se une a VLA-4 puede combinarse con un agente que se une a VCAM-1.

Como se explica aquí, los antagonistas empleados en los presentes casos descritos no están limitados a un tipo particular de estructura de molécula, de forma que cualquier agente capaz de unirse a integrinas alfa 4 (p. ej., VLA-4 o alfa4beta7) sobre la superficie de células o a un ligando de alfa4 como VCAM- 1 o MadCAM sobre la superficie de células portadoras de ligando de alfa4 y que bloquea de forma efectiva o recubre la integrina alfa 4 (p. ej., VLA-4 o alfa4beta7) o ligando de alfa 4 (p. ej., VCAM- 1 o MadCAM, respectivamente), un "agente que se une a integrinas alfa4" o un "agente que se une a ligandos de integrinas alfa4", se considerará un equivalente de los antagonistas utilizados en los presentes ejemplos.

Por ejemplo, son útiles los anticuerpos o los homólogos de anticuerpos (descritos anteriormente) así como las formas solubles de las proteínas naturales de unión a VLA-4 y a VCAM-1. Las formas solubles de las proteínas naturales de unión a VLA-4 incluyen péptidos VCAM 1 solubles, proteínas de fusión de VCAM-1, proteínas de fusión de VCAM-1/Ig bifuncionales (p. ej., las moléculas "quiméricas" descritas anteriormente), fibronectina, fibronectina con segmento de conexión alternativo que no es del tipo de unión III y péptidos de fibronectina que contienen la secuencia aminoacídica EILDV o una secuencia sustitutiva similar conservativa. Las formas solubles de las proteínas naturales de unión a VCAM-1 incluyen péptidos VLA-4 solubles, proteínas de fusión de VLA-4, proteínas de fusión de VLA-4/Ig bifuncionales y similares. Como se utiliza aquí, un "péptido VLA-4 soluble" o un "péptido VCAM-1 soluble" es un polipéptido VLA-4 o VCAM-1 incapaz de unirse por si mismo a una membrana. Dichos polipéptidos solubles incluyen, por ejemplo los polipéptidos VLA-4 y VCAMI que carecen de un dominio transmembrana capaz de fijar el polipéptido o están modificados de forma que el dominio transmembrana no es funcional. Estos agentes de unión pueden actuar compitiendo con la proteína de superficie celular de unión a VLA-4 o alterando de otra forma la función de VLA-4. Por ejemplo, se puede administrar una forma soluble de VCAM-1 (véase, p. ej., Osborn et al. 1989, Cell. 59: 1203-1211) o un fragmento de la misma para unirse a VLA-4, y preferiblemente competir por el sitio de unión de VLA-4 sobre las células portadoras de VCAM-1, produciendo así efectos similares a la administración de antagonistas como moléculas pequeñas o anticuerpos anti-VLA-4. A parte, el término "antagonista de la interacción colágeno/VLA-1" se refiere a un agente, p. ej., un polipéptido u otra molécula, que puede inhibir o bloquear la unión mediada por colágeno o VLA-1, o que puede modular de otra manera la función del colágeno o de VLA-1, p. ej., mediante inhibición o bloqueo de VLA- 1, de la transducción mediada por señal de VLA-1 o la transducción de señal de colágeno mediada por colágeno y que es efectivo en el tratamiento de insuficiencia renal crónica, preferiblemente de la misma forma que los anticuerpos anti-VLA-1. Un antagonista de la interacción ligando de VLA-1 (p. ej., colágeno)/VLA-1 es un agente que presenta una o más de las siguientes propiedades: (1)recubre, o se une al, VLA-1 sobre la superficie de las células portadoras VLA-1 con suficiente especificidad para inhibir la interacción colágeno/VLA-1; (2) recubre, o se une al, VLA-1 sobre la superficie de las células portadoras de VLA-1 con suficiente especificidad para modificar, y preferiblemente inhibir, la transducción de señal mediada por VLA-1, p. ej. la señal mediada por VLA-1/colágeno; (3) recubre, o se une al, ligando de VLA-1 (p. ej., colágeno) con suficiente especificicidad para inhibir la interacción colágeno/VLA-1; 4) recubre, o se une al, colágeno con suficiente especificicidad para modificar, y preferiblemente inhibir, la transducción de las señales VLA-1 mediadas por colágeno. Preferiblemente, los antagonistas descritos tienen una de las propiedades 1 y 2, o las dos. De forma alternativa, se prefiere que el antagonista tenga una o las dos propiedades 3 y 4.

Además, se puede administrar más de un antagonista a un paciente, p. ej., un agente que se une a VLA-1 puede combinarse con un agente que se une a colágeno. Como se explica aquí, los antagonistas de VLA-1 aquí descritos no están limitados a un tipo particular de estructura de molécula, de forma que, para los propósitos de la invención, cualquier agente capaz de unirse a VLA-1 sobre la superficie de células portadoras de VLA-1 (o a colágeno) y que bloquea de forma efectiva o recubre la VLA-1 o sus ligandos considerados como equivalentes a antagonistas de VLA-1 utilizados en los presentes ejemplos. Por ejemplo, son útiles los anticuerpos o los homólogos de anticuerpos (descritos posteriormente) así como las formas solubles de las proteínas naturales de unión a VLA-1 y sus respectivos ligandos. Las formas solubles de las proteínas naturales de unión a VLA-1 incluyen péptidos de colágeno solubles, proteínas de fusión de colágeno, proteínas de fusión de colágeno/Ig bifuncionales o una secuencia sustitutiva de aminoácidos similar conservativa. Las formas solubles de las proteínas naturales de unión de colágeno incluyen péptidos VLA-1 solubles, proteínas de fusión de VLA-1, proteínas de fusión de VLA-1/Ig bifuncionales y similares. Como se utiliza aquí, un "péptido VLA-1 soluble" o un "péptido de colágeno soluble" es un polipéptido VLA-1 o de colágeno incapaz de unirse por si mismo a una membrana. Dichos polipéptidos solubles incluyen, por ejemplo los polipéptidos VLA-1 que carecen de un dominio transmembrana capaz de fijar el polipéptido o están modificados de forma que el dominio transmembrana no es funcional. Estos agentes de unión pueden actuar compitiendo con la proteína de superficie celular de unión a VLA-1 o alterando de otra forma la función de VLA-1.

En otro ejemplo descrito, se puede unir o fusionar colágeno, o un fragmento del mismo capaz de unirse a VLA-1 sobre la superficie de células portadoras de VLA-1, a una segunda subunidad, para formar una molécula quimérica antagonista de VLA-1. La segunda subunidad puede ser un péptido, un fragmento de un péptido soluble, preferiblemente un péptido humano, más preferiblemente una proteína plasmática, o un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas. En realizaciones particularmente preferidas, el segundo péptido es una IgG o una porción o fragmento de la misma, p. ej., la región constante de la cadena pesada de la IgGI humana e incluye como mínimo las bisagras, los dominios CH2 y CH3.

1. Homólogos de Anticuerpos Anti-integrina

En otras realizaciones preferidas, los antagonistas empleados en las utilizaciones de la invención que se unen, incluyendo bloqueo o recubrimiento, a las integrinas alfa 4 de la superficie celular (como la VLA-4) o a los ligandos de la superficie celular para integrinas alfa 4 (como VCAM-1) son anticuerpos monoclonales anti-VLA-4 o anti-VCAM-1 u homólogos de anticuerpos, como se definen previamente. Los anticuerpos y homólogos preferidos para el tratamiento, en particular para el tratamiento de humanos, incluyen homólogos de anticuerpos humanos, homólogos de anticuerpos humanizados, homólogos de anticuerpos quiméricos, fragmentos de anticuerpos Fab, Fab', F(ab')2 y F(v), y monómeros o dímeros de cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo o mezclas de los mismos. En el método de la invención son agentes de unión preferidos los anticuerpos monoclonales frente VLA-4 o VLA-1.

2. Moléculas pequeñas antagonistas de las integrinas

El término "molécula pequeña" antagonista de las integrinas se refiere a agentes que no forman parte de la invención que imitan la acción de los péptidos (es decir, moléculas orgánicas que pueden contener o no enlaces peptídicos) y son capaces de alterar la interacción integrina/ligando de integrina mediante, por ejemplo, bloqueo de VLA-4 mediante unión a receptor de VLA-4 sobre la superficie de células o bloqueo de VCAM-1 mediante unión de receptores de VCAM-1 de superficie celular. Las moléculas pequeñas de VLA-4 y VCAM-1 (o de VLA-1 y colágeno) pueden ser péptidos, compuestos semipeptídicos o compuestos no peptídicos, como moléculas orgánicas pequeñas que son antagonistas de la interacción VCAM-1/VLA-4 o colágeno/VLA-1. Una "molécula pequeña", como se define aquí, no pretende incluir anticuerpos u homólogos de anticuerpos. El peso molecular de las moléculas pequeñas de ejemplo, generalmente es inferior a 2000, aunque con esto no se pretende limitar ningún tamaño específico siempre que la molécula se ajuste a la definición funcional.

Por ejemplo, pueden emplearse las moléculas pequeñas como oligosacáridos que imitan al dominio de unión de un ligando de VLA-4 y se ajustan al dominio de receptor de VLA-4. (Véase, J.J. Devlin et. al., 1990, Science 249: 400-406 (1990), J.K. Scott y G.P. Smith, 1990, Science 249: 386-390, y la Patente Estadounidense 4 833 092 (Geysen). De forma contraria, se pueden utilizar moléculas pequeñas que imitan el dominio de unión de un ligando de VCAM-1 y se ajustan al dominio del receptor de VCAM-1.

Se pueden encontrar ejemplos de otras moléculas útiles en Kornoriya et al. ("The Minimal Essential Sequence for a Cell Type-Specific Adhesion Site (CSI) Within the Alternatively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronectin Is Leucine-Aspartic Acid-Valine", J. Biol. Chem., 266 (23), pp. 15075-79 (1991)). Identificaron la secuencia mínima de aminoácidos activos para unirse a VLA-4 y sintetizaron varios péptidos superpuestos basados en la secuencia aminoacídica de la región CS-1 (el dominio de unión a VLA-4) de una especie particular de fibronectina. Identificaron un péptido de 8 aminoácidos, Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr, así como dos pentapéptidos más pequeños superpuestos, Glu-Ile-Leu-Asp-Val y Leu-Asp-Val-Pro-Ser, que poseían actividad inihibitoria de la adhesión celular dependiente de fibronectina. Después se demostró que ciertos péptidos mayores que contenían la secuencia LDV eran activos in vivo (T. A. Ferguson et al., "Two Integrin Binding Peptides Abrogate T-cell Mediated Immune Responses In Vivo", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, pp. 8072-76 (1991); y S. M. Wahl et al., "Synthetic Fibronectin Peptides Suppress Arthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion and Recruitment", J. Clin. Invest., 94, pp. 655-62 (1994)). También se ha descrito un pentapéptido cíclico; Arg-Cys-Asp-TPro-Cys (en el que TPro denota 4-tioprolina), que puede inhibir tanto la adhesión de VLA-4 y VLA-5 a la fibronectina. (Véase, p. ej., D.M. Nowlin et al. "A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits Alfa4Beta1 Integrin-mediated Cell Adhesion", J. Biol. Chem., 268(27), pp. 20352-59 (1993); y publicación PCT PCT/US91/04862). Este pentapéptido se basó en la secuencia tripeptídica Arg-Gly-Asp de la fibronectina que se sabía que era un motivo común en el sitio de reconocimiento para diversas proteínas de la matriz extracelular. Se han descrito ejemplos de otros inhibidores de VLA-4, por ejemplo, en Adams et al. "Cell Adhesion Inhibitors", PCT US97/13013, que describe compuestos peptidílicos lineales que contienen beta-aminoácidos que presentan actividad inhibidora de la adhesión celular. Las Solicitudes Internacionales de Patentes WO 94/15958 y WO 92/00995 describen compuestos cíclicos y compuestos peptidomiméticos con la actividad de inhibición de la adhesión celular. Las Publicaciones de Patentes Internacionales WO 93/08823 y WO 92/08464 describen compuestos inhibidores de la adhesión celular que contienen guanidinilo, urea y tiourea. La Patente Estadounidense Núm. 5,260,277describe compuestos guanidílicos moduladores de la adhesión celular. Se han descrito otros antagonistas peptidílicos de VLA-4 en D. Y. Jackson et al., "Potent a4beta1 peptide antagonists as potential anti-inflammatory agents", J. Med. Chem., 40, 3359 (1997); H. Shroff et al., "Small peptide Inhibitors of alfa4beta7 mediated MadCAM-1 adhesion to lymphocyte", Bio. Med, Chem. Lett., 1: 2495 (1996); Patente Estadounidense 5 510 332, Publicaciones PCT WO 98/53814, WO 97/103094, WO 97/02289, WO 96/40781, WO 96/22966, WO96/20216, WO96/01644, WO96106108, y WO95/15973. Se puede producir este tipo de agentes de moléculas pequeñas sintetizando diversos péptidos (p. ej., de 520 aminoácidos de longitud), compuestos semi-peptídicos o compuestos orgánicos no-peptídicos, y cribando dichos compuestos en función de su capacidad para inhibir la interacción VLA-14/VCAM. Véase en general la Patente Estadounidense Núm. 4 833 092, Scott y Smith, "Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library", Science, 249, pp. 386-90 (1990), y Devlin et al., "Random PeptideLibraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules", Science, 249, pp. 40407 (1990).

Métodos para producir Homólogos de Anticuerpos Anti-Integrina

Los expertos dominan la tecnología para producir anticuerpos monoclonales, incluyendo, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-integrina. Véase, por ejemplo, Mendrick et al. 1995, Lab. Invest. 72:367-375 (Anticuerpos monoclonales para anti-\alpha1\beta1 y anti-\alpha2\beta1 murinos); Sonnenberg et al. 1987 J. Biol. Chem. 262:10376-10383 (Anticuerpos monoclonales para anti-\alpha6\beta1 murino); Yao et al. 1996, J Cell Sci 1996 109:3139-50 (Anticuerpos monoclonales para anti-\alpha7\beta1 murino); Hemler et al. 1984, J Immunol 132:3011-8 (Anticuerpos monoclonales para \alpha1\beta1 humano); Pischel et al. 1987 J Immunol 138:226-33 (Anticuerpos monoclonales para \alpha2\beta1 humano); Wayner et al. 1988, J Cell Biol 107:1881-91 (Anticuerpos monoclonales para \alpha3\beta1 humano); Hemler et al. 1987 J Biol Chem 262:11478-85 (Anticuerpos monoclonales para \alpha4\beta1 humano); Wayner et al. 1988 J Cell Biol 107:1881-91 (Anticuerpos monoclonales para \alpha5\beta1 humano); Sonnenberg et al. 1987, J. Biol. Chem. 262:10376-10383 (Anticuerpos monoclonales para \alpha6\beta1 humano); A Wang et al. 1996 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:664-672 (Anticuerpos monoclonales para \alpha9\beta1 humano); Davies et al. 1989 J Cell Biol 109:1817-26 (Anticuerpos monoclonales para \alphaV\beta1 humano); Sanchez-Madrid et al. 1982, Proc Natl Acad Sci USA 79:7489-93 (Anticuerpos monoclonales para \alphaL\beta2 humano); Diamond et al. 1993, J Cell Biol 120:1031-43 (Anticuerpos monoclonales para \alphaMb\beta humano); Stacker et al. 1991 J Immunol 146:648-55 (Anticuerpos monoclonales para \alphaX\beta2 humano); Van der Vieren et al 1995 Immunity 3:683-90 (Anticuerpos monoclonales para \alphaD\beta2 humano); Bennett et al. 1983 Proc Natl Acad Sci USA 80:2417-21 (Anticuerpos monoclonales para \alphaIIbe\beta3 humano); Hessle et al. 1984, Differentiation 26:49-54 (Anticuerpos monoclonales para \alpha6\beta4 humano); Weinacker et al. 1994 J Biol Chem 30 269:6940-8 (Anticuerpos monoclonales para \alphaV\beta5 humano); Weinacker et al. 1994 J Biol Chern 269:6940 (Anticuerpos monoclonales para \alphaV\beta6 humano); Cerf-Bensussan et al 1992 Eur J Immunol 22:273-7 (Anticuerpos monoclonales para \alphaE\beta7 humano); Nishimura et al. 1994 J Biol Chem 269:28708-15 (Anticuerpos monoclonales para \alphaV\beta8 humano); Bossy et al. 1991 EMBO J 10:2375-85 (Antisueros monoclonales para \alpha8\beta1 humano); Camper et al. 1998 J. Biol. Chem. 273:20383-20389 (Antisueros monoclonales para \alpha10\betal humano).

Los antagonistas de integrinas preferidos aquí contemplados pueden expresarse a partir de cDNA genómico intacto o truncado o a partir de DNA sintéticos en células huésped procariotas o eucariotas. Las proteínas diméricas pueden aislarse a partir del medio de cultivo o volverse a plegar y dimerizarse in Vitro para formar composiciones biológicamente activas. Se pueden formar heterodímeros in vitro combinando cadenas de polipéptidos distintas y separadas. De forma alternativa, se pueden formar heterodímeros en una célula sola co-expresando ácidos nucleicos que codifican cadenas de polipéptidos distintas y separadas. Véanse, por ejemplo, la WO93/09229, o la Patente Estadounidense. Núm. 5 411 941, que contienen ejemplos de distintos protocolos de producción de diversas proteínas heterodiméricas recombinantes. Las células huésped preferidas en la actualidad incluyen, sin limitar en ningún caso, procariotas como E. coli, o eucariotas como levaduras, Saccharomyces, células de insecto, o células de mamíferos, como las células CHO, COS o BSC. El experto en la materia es capaz de apreciar que se pueden utilizar otras células huésped de forma ventajosa. Pueden hallarse descripciones detalladas de las proteínas útiles en la invención, incluyendo como producirlas, usarlas y probar su actividad condrogénica, en muchas publicaciones, como las Patentes Estadounidenses Núm. 5 266 683 y 5 011 691.

Se conoce la tecnología para producir homólogos de anticuerpos monoclonales. De forma breve, se fusiona una línea celular inmortal (generalmente células de mieloma) con linfocitos (generalmente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con células enteras que expresan un antígeno dado, p.ej., VLA-4, y se someten a cribaje los sobrenadantes del hibridoma resultante, en busca de anticuerpos contra el antígeno. Véase, en general, Kohler et al., 1975, Nature, 265: 295-297. La inmunización puede realizarse mediante procedimientos estándar. La dosis unitaria y el régimen de inmunización dependen de la especie de mamífero inmunizada, su estado inmune, la masa corporal del mamífero, etc. Generalmente, se extrae la sangre de los mamíferos inmunizados se analiza el suero de cada muestra sanguínea en busca de anticuerpos particulares, utilizando las pruebas de cribado apropiadas. Por ejemplo, los anticuerpos anti-VLA-4 pueden identificarse mediante inmunoprecipitación de lisados de células que expresan VLA-4, marcados con 125I. (Véase Sanchez-Madrid et al. 1986, Eur. J. Imnmunol., 16: 1343-1349 y Hemler et al. 1987, J. Biol. Chem., 262, 11478-11485). Los anticuerpos anti-VLA-4 también pueden identificarse mediante citometría de flujo, p.ej., midiendo la tinción de células de Ramos incubadas con un anticuerpo que se crea capaz de reconocer VLA-4(véase, Elices et al., 1990, Cell, 60: 577-584). Los linfocitos utilizados en la producción de células de hibridoma generalmente se aíslan de mamíferos inmunizados cuyo sueros ya han sido determinados como positivos para la presencia de anticuerpos anti-VLA-4 mediante este tipo de ensayos de cribado.

Generalmente, la línea celular inmortal (p.ej., una línea celular de mieloma) deriva de las mismas especies de mamíferos que los linfocitos. Las líneas de células inmortales preferidas son las líneas celulares de mieloma de ratón que son sensibles a medios de cultivos que contienen hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Generalmente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan con esplenocitos de ratón mediante polietilenglicol de peso molecular 1500 ("PEG 1500"). Después las células de hibridoma resultantes de la fusión se seleccionan utilizando medio HAT, que mata las células no fusionadas y las células fusionadas no productivas (los esplenocitos no fusionados mueren tras algunos días porque no están transformados). Los hibridomas que producen un anticuerpo deseado se detectan mediante cribaje de los sobrenadantes del cultivo de hibridoma. Por ejemplo, los hibridomas preparados para producir anticuerpos anti-VLA-4 pueden cribarse poniendo a prueba el sobrenadante del cultivo de hibridoma en busca de anticuerpos secretados que tengan la capacidad de unirse a las líneas celulares recombinantes que expresan la subunidad alfa 4 (véase, Elices et al., supra).

Para producir homólogos de anticuerpo anti-VLA-4 o VLA-1 que son inmunoglobulinas intactas, las células de hibridoma que se determinaron como positivas en los ensayos de cribado se cultivaron en un medio de nutrientes bajo las condiciones y el tiempo suficientes para permitir que las células de hibridoma secretasen los anticuerpos monoclonales al medio de cultivo. Las técnicas de cultivo de tejido y los medios de cultivo adecuados para células de hibridoma se conocen. El sobrenadante del cultivo de hibridoma acondicionado puede recogerse y los anticuerpos anti-VLA-4 o VLA- 1 pueden seguir purificándose opcionalmente mediante métodos conocidos.

De forma alternativa, el anticuerpo deseado puede producirse inyectando las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón inmunizado. Las células de hibridoma proliferan en la cavidad peritoneal, secretando el anticuerpo que se acumula como fluido ascítico. El anticuerpo puede recogerse retirando el fluido ascítico de la cavidad peritoneal, mediante una jeringa.

Anteriormente se han descrito diversos anticuerpos monoclonales anti-VLA-4. Véase, p.ej., Sanchez-Madrid et al, 1986, supra; Hemler et al., 1987, supra; Pulido et al., 1991, J. Biol. Chem., 266 (16), 10241-10245). Estos anticuerpos monoclonales anti-VLA-4 como HP 1/2 y otros anticuerpos anti-VLA-4 (p.ej., HP2/1, HP2/4, L25, P4C2, P4G9) capaces de reconocer la cadena beta de VLA-4 son útiles en los métodos de tratamiento de acuerdo con la presente invención. Se prefieren los anticuerpos anti-VLA-4 que reconocen los epítopos de cadena alfa 4 de VLA-4 implicados en la unión a VCAM- 1 y los ligandos de fibronectina (es decir, anticuerpos que se pueden unir a VLA-4 en un sitio implicado en el reconocimiento de ligando y el bloqueo de VCAM-1 y la unión de fibronectina). Dichos anticuerpos se han definido como anticuerpos B específicos de epítopo (B1 o B2)(Pulido et al., 1991, supra) y también son anticuerpos anti-VLA-4 de acuerdo con la presente invención. En la Patente Estadounidense Núm. 5 855 888 se han descrito homólogos de anticuerpos de la invención comercialmente disponibles, que son anticuerpos anti-VLA 1.

Los homólogos completos de anticuerpos monoclonales humanos frente a VLA-4 o VLA-1 son otro agente de unión preferido que puede bloquear o recubrir los ligandos de VLA-4 o VLA-1 en el método de la invención. Pueden prepararse en su forma intacta mediante esplenocitos humanos in vitro, como describe Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147, 86-95. De forma alternativa, pueden prepararse mediante clonación de repertorio como se describe en Persson et al., 20 1991, Proc. Nat. Acad. Sci.USA, 88: 2432-2436 o en Huang y Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227-236.

La Patente Estadounidense Núm. 5 798 230 (25 de agosto de 1998, "Process for the preparation of human monoclonal antibodies and their use") describe la preparación de anticuerpos monoclonales humanos a partir de células B humanas. De acuerdo con este proceso, se inmortalizan células B humanas productoras de anticuerpo mediante infección con un virus de Epstein-Barr, o un derivado del mismo, que expresa el antígeno nuclear 2 del virus Epstein-Barr (EBNA2). Después se elimina la función EBNA2, que se requiere para la inmortalización, lo que resulta en un aumento de la producción de anticuerpo.

En otro método para producir anticuerpos humanos completos, la Patente Estadounidense Núm. 5 789 650 (4 de agosto de 1998, "Transgenic non-human animals for producing Heterologous antibodies") describe animales no humanos transgénicos capaces de producir anticuerpos heterólogos y animales transgénicos no humanos con genes de inmunoglobulinas endógenos inactivados. Los genes de inmunoglobulinas endógenas se suprimen mediante polinucleótidos antisentido o mediante antisuero dirigido contra inmunoglobulinas endógenas. Los anticuerpos heterólogos están codificados por genes de inmunoglobulina que generalmente no se encuentran en el genoma de esas especies de animales no humanos. En un animal no humano se introducen una o más secuencias que contienen transgenes de cadenas pesadas de inmunoglobulinas humanas heterólogas desorganizadas, formando así un animal transgénico capaz de reorganizar de forma funcional las secuencias transgénicas de inmunoglobulina y producir un repertorio de anticuerpos de diversos isotipos codificados por genes de inmunoglobulina humanos. Este tipo de anticuerpos humanos heterólogos se produce en las células B que después de ello se inmortalizan, p.ej., fusionándolas con una línea celular como la de mieloma o manipulando dichas células B mediante otras técnicas para perpetuar una célula capaz de producir homólogos de anticuerpos completamente humanos, heterólogos y monoclonales.

También se pueden utilizar grandes librerias de disposición de fagos humanos para aislar anticuerpos de alta afinidad que pueden desarrollarse para terapia en humanos, mediante tecnología estándar de fagos.

Otro agente de unión preferido que puede bloquear o recubrir ligandos de integrina en el método de la invención es un homólogo de anticuerpo recombinante humanizado con especificidad anti integrina. Según los métodos anteriores de preparación de los verdaderos "anticuerpos quiméricos" (en los que la regiones constantes enteras y las regiones variables enteras proceden de diferentes fuentes), se describió una nueva aproximación en PE 0239400 (Winter et al.) donde los anticuerpos se alteran mediante sustitución (dentro de una región variable dada) de sus regiones determinantes complementarias (CDR) de una especie por las de otra. Este proceso puede utilizarse, por ejemplo, para sustituir las CDR de los dominios de región variable de Ig humana ligeros y pesados por CDR alternativos de dominios de región variable murinos. Estas regiones variables alteradas de Ig después se pueden combinar con regiones constantes de Ig humana para crear anticuerpos totalmente humanos en su composición excepto por los CDR murinos sustituidos. Estos anticuerpos CDR-sustituidos en principio serían menos propicios a elicitar una respuesta inmune en humanos, comparados con los anticuerpos quiméricos, porque los anticuerpos CDR-sustituidos contienen considerablemente menos componentes no humanos. El proceso para humanizar anticuerpos monoclonales humanos a través de "adición" de CDR se ha denominado "reshaping". (Riechmann et al., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536).

Normalmente, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo murino se insertan en las regiones correspondientes en un anticuerpo humano, ya que son las CDR (tres en las cadenas pesadas del anticuerpo, tres en las cadenas ligeras) las regiones del anticuerpo de ratón que se unen a un antígeno específico. La inserción de las CDR se logra mediante ingeniería genética en la que las secuencias de DNA de CDR se determinan por clonación de segmentos genéticos de la región variable (V) de la cadena pesada y ligera murina, y se transfieren entonces a las regiones V humanas correspondientes mediante mutagénesis dirigida al sitio. En el estadio final del proceso, se añaden los segmentos genéticos de la región humana constante del isotipo deseado (normalmente gamma I para CH y kappa para CL) y los genes de las cadenas pesada y ligera humanizadas se coexpresan en células de mamífero para producir anticuerpos solubles humanizados.

La transferencia de estos CDR a un anticuerpo humano confiere a este anticuerpo las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo murino original. Las seis CDR del anticuerpo murino están montadas estructuralmente sobre una región "marco" V. La razón por la que el injerto de CDR tiene éxito es porque las regiones marco entre los anticuerpos de ratón y humanos pueden tener estructuras 3-D muy similares con puntos de unión similares para los CDR, de tal forma que se pueden intercambiar las CDR. Tales homólogos de anticuerpo humanizados pueden prepararse, como se muestra en Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525; Riechmann, 1988, Nature 332, 323-327; Queen et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 10029; y Orlandi et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 3833.

No obstante, se cree que ciertos aminoácidos dentro de las regiones marco interactúan con las CDR e influyen en la afinidad de unión general sobre el antígeno. La inserción directa de CDR de un anticuerpo murino para producir un anticuerpo recombinante humanizado sin ninguna modificación de la región marco V humana a menudo resulta en una pérdida parcial o completa de la afinidad de unión. En ciertos casos, parece que es crítico alterar los residuos en las regiones marco del anticuerpo aceptor para poder obtener actividad de unión.

Queen et al., 1989 (supra) y WO 90/07861 (Protein Design Labs) han descrito la preparación de un anticuerpo humanizado que contiene residuos modificados en las regiones marco del anticuerpo aceptor mediante la combinación de CDR de un MAb murino (anti-Tac) con las regiones constantes y marco de la inmunoglobulina humana. Se ha demostrado una solución al problema de la pérdida de afinidad de unión que a menudo es consecuencia de la inserción directa de CDR sin ninguna modificación de los residuos de la región marco V humana; la solución incluye dos pasos clave. Primero, las regiones marco V humanas se eligen mediante análisis computacional en busca de una homología óptima de secuencia de proteínas a la región marco V del anticuerpo murino original, en este caso, el Mab anti-Tac. En el segundo paso, la estructura de la región V murina se modela por ordenador para visualizar los residuos de aminoácido marco que es probable que interactúen con los CDR murinos y estos residuos de aminoácidos murinos se sobreimponen al marco homólogo humano. Véase también Protein Design Labs Patente Estadounidense
5,693,762.

Se puede utilizar una aproximación diferente (Tempest et al., 1991, Biotechnology 9, 266-271) y utilizar, como estándar, las regiones V marco derivadas de las cadenas pesada y ligera NEWM y REI, respectivamente, para el injerto de CDR sin introducción radical de residuos de ratón. Una ventaja de utilizar la aproximación de Tempest et al. para construir los anticuerpos humanizados basados en NEWM y RBI es que las estructuras tridimensionales de las regiones variable NEWM y RBI son conocidas a partir de la cristalografía por rayos X y así se pueden modelar las interacciones específicas entre los CDR y los residuos de la región marco V.

Independientemente de la aproximación escogida, los ejemplos de los homólogos de anticuerpos humanizados iniciales preparados hasta la fecha muestran que no es un proceso sencillo. No obstante, aún sabiendo que estos cambios en el marco pueden ser necesarios, no es posible predecir, en base a los conocimientos previos disponibles, qué residuos del marco necesitan ser alterados, si los hay, para obtener anticuerpos recombinantes humanizados funcionales con la especificidad deseada. Los resultados hasta el momento nos indican que los cambios necesarios para conservar la especificidad y/o afinidad son únicos para un anticuerpo dado y que no pueden predecirse en base a la humanización de un anticuerpo diferente.

Los antagonistas de VLA-4 preferidos, útiles en la presente invención, incluyen homólogos de anticuerpo recombinante humanizado y quiméricos (es decir, inmunoglobulinas intactas y porciones de las mismas) con especificidad de epítopo B que han sido preparados y están descritos en PCT US94/00266, depositada el 7 de Enero de 1994. El material de partida para la preparación de homólogos de anticuerpo anti-integrina humanizados y quiméricos (Variable de ratón - Constante humana), puede ser un anticuerpo monoclonal anti-integrina murino como se ha descrito antes, un anticuerpo monoclonal anti-integrina disponible comercialmente (p.ej., HP2/1, Amae International, Inc., Westbrook, Maine), o un anticuerpo monoclonal anti-integrina preparado de acuerdo con las presentes explicaciones. Por ejemplo, se las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo HP 1/2 anti-VLA-4 se han clonado, secuenciado y expresado en combinación con regiones constantes de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina humana. Tal anticuerpo HP 1/2 anti-VLA-4 es similar en especificidad y potencia al anticuerpo murino HP 1/2, y puede ser útil en los métodos de tratamiento de acuerdo con la presente invención.

Otros homólogos de anticuerpo anti-VLA-4 humanizados preferidos están descritos en Athena Neurosciences, Inc. en PCT/US95/01219 (27 Julio 1995) y la Patente Estadounidense 5.840.299. Estos anticuerpos anti-VLA-4 humanizados comprenden una cadena ligera humanizada y una cadena pesada humanizada. La cadena ligera humanizada comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) con las secuencias de aminoácidos de las correspondientes regiones determinantes de complementariedad de una cadena ligera de inmunoglobulina 21-6 de ratón (CDR1: KTSQDINKYMA; CDR2: YTSALQP; CDR3: LQYDNLWT), y de una región marco variable de una secuencia de región marco variable de una cadena ligera kappa humana, excepto que, en al menos una posición de aminoácido, la posición de aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente de la cadena ligera de inmunoglobulina 21-6 de de una región marco variable de ratón. La cadena pesada humanizada comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) con las secuencias de aminoácidos de las correspondientes regiones determinantes de complementariedad de una cadena pesada de inmunoglobulina 21-6 de ratón (CDR1: DTYIH; CDR2: RIDPANGYTKYDPKFQG; CDR3: EGYYGNYGVYAMDY), y de una región marco variable de una secuencia de región marco variable de una cadena pesada excepto que en al menos una posición de aminoácido, la posición está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente de la cadena pesada de inmunoglobulina 21-6 de de una región marco variable de ratón. Véase también Leger, OJ et al., Hum. Antibodies 8: 3-16 (1997) que describe un anticuerpo humanizado (AN 100226) contra la integrina humana alfa4.

Los usos de la presente invención pueden emplear antagonistas codificados por cualquier secuencia de ácido nucleico que hibridan bajo condiciones astringentes con secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos dirigidos contra las integrinas que contienen la subunidad alfa4. Por ejemplo, un antagonista de la presente invención puede ser una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones de alta astringencia con una o más de aquellas secuencias de ácido nucleico que están en la Tabla 6 de la Patente Estadounidense 5,840,299 o el complementario de una o más de estas secuencias. Los antagonistas también pueden ser una proteína codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibrida bajo condiciones de alta astringencia con ácidos nucleicos que codifican Id de Sec Núm.: 2 o Id de Sec Núm.: 4 encontradas en la Patente Estadounidense 5,932,214. Además, los antagonistas también pueden ser una proteína codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibrida bajo condiciones de alta astringencia con ácidos nucleicos que codifican un dominio variable del anticuerpo producido por la línea celular ATCC CRL 11175.

De forma alternativa, un antagonista de la presente invención puede ser una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones de baja astringencia con una o más de aquellas secuencias de ácido nucleico que están en la Tabla 6 de la Patente Estadounidense 5,840,299 o el complementario de una o más de estas secuencias. Los antagonistas también pueden ser una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones de baja astringencia con ácidos nucleicos que codifican Id de Sec Núm.: 2 o Id de Sec Núm.: 4 que se encuentran en la Patente Estadounidense 5,932,214. Además, los antagonistas también pueden ser una proteína codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibrida bajo condiciones de baja astringencia con ácidos nucleicos que codifican un dominio variable del anticuerpo producido por la línea celular ATCC CRL 11175.

Aplicaciones Terapéuticas

La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con los materiales transportadores para producir una forma de dosis única variará dependiendo del huésped a tratar, y del modo particular de administración. No obstante, se deberá entender que la dosis específica y el régimen de tratamiento para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, tasa de excreción, combinación de fármacos, y el juicio del médico y la severidad de la enfermedad particular a ser tratada. La cantidad de ingrediente activo puede depender también del agente terapéutico o profiláctico, si lo hay, con el que el ingrediente se coadministra. La dosificación y tasa de dosis de los compuestos de esta invención efectiva para prevenir suprimir o inhibir la adhesión celular dependerá de una variedad de factores, como la naturaleza del inhibidor, el tamaño del paciente, la finalidad del tratamiento, la naturaleza de la patología a tratar, la composición farmacéutica utilizada, y el juicio del médico que está tratando. Son útiles los niveles de dosificación del ingrediente activo entre alrededor de 0,001 y alrededor de 100 mg/kg de peso corporal por día, preferiblemente entre alrededor de 0,1 y alrededor de 50 mg/kg de peso corporal. Más preferiblemente, el agente de unión de la integrina alfa4, si es un anticuerpo o un derivado de anticuerpo, se administrará a una dosis en el rango de entre alrededor de 0,1 mg/kg de peso corporal y alrededor de 20 mg/kg de peso corporal, preferiblemente en el rango de entre alrededor de 1 mg/kg de peso corporal y alrededor de 3 mg/kg de peso corporal y en intervalos de cada 1-14 días. Para agentes de unión a moléculas pequeñas o que no sean anticuerpos, el rango de dosis estará preferiblemente entre cantidades molares equivalentes a estas cantidades de anticuerpo. Preferiblemente, una composición de anticuerpo se administra en una cantidad efectiva para proporcionar un nivel en plasma de anticuerpo de al menos 1 mg/ml. La optimización de las dosificaciones puede determinarse mediante la administración de los agentes de unión, seguida de la valoración del recubrimiento de las células positivas de integrina mediante el agente durante el tiempo tras la administración de una determinada dosis in vivo.

La presencia del agente administrado se detectará in vitro (o ex vivo) observando la incapacidad o disminución de la capacidad de las células del individuo para unir el mismo agente que ha sido marcado (p.ej., mediante un fluorocromo). La dosificación preferida producirá un recubrimiento detectable de la gran mayoría de células positivas de integrina. Preferiblemente, el recubrimiento se mantiene en el caso de un homólogo de anticuerpo para un periodo de 1-14 días.

Sujetos para el tratamiento

De manera general, los diversos usos de la presente invención pueden estar destinados a cualquier sujeto mamífero con insuficiencia renal crónica, o en riesgo de sufrirlo, o en riesgo de necesitar un tratamiento renal sustitutivo (es decir, diálisis crónica o transplante renal). Los sujetos mamíferos susceptibles de ser tratados según los métodos de la invención incluyen, entre otros, sujetos o pacientes humanos. Sin embargo, la invención puede utilizarse además para el tratamiento de mamíferos domesticados que se mantienen como animales de compañía (p. ej., perros, gatos, caballos), que poseen un valor comercial importante (p. ej., vacas lecheras, ganado vacuno de carne, animales para competiciones deportivas), que poseen un valor científico significativo (p. ej., especímenes de especies en peligro de extinción, libres o en cautividad) o que igualmente tienen algún valor. Además, de forma general, los sujetos para el tratamiento con los métodos de la presente invención no necesitan presentar indicaciones para el tratamiento con los agentes terapéuticos renales de la invención más que aquellas indicaciones asociadas a un riesgo de insuficiencia renal crónica. Es decir, por lo demás, se supone que los sujetos a tratar no deben presentar indicaciones para el tratamiento con los agentes de la invención. En algunos casos, sin embargo, los sujetos pueden mostrar una presentación inicial con otros síntomas (p. ej., osteodistrofia) para los que sería indicado el tratamiento con los agentes de la presente invención. En estos casos, el tratamiento debería ajustarse de forma correspondiente para evitar una administración excesiva de dosis. Cualquier profesional de la medicina o la veterinaria es capaz de reconocer sujetos que se pueden encontrar en una situación de riesgo considerable de insuficiencia renal crónica o de riesgo considerable de la necesidad de un tratamiento renal sustitutivo. En particular, se espera que los estudios clínicos y preclínicos, además de la experiencia acumulada, relacionados con el método de tratamiento aquí descrito y con otros, den información al profesional experto para decidir si un sujeto dado se encuentra o no en riesgo de insuficiencia renal crónica o en riesgo de necesitar tratamiento renal sustitutivo, y si cualquier tratamiento en particular es más adecuado para las necesidades del sujeto, incluido el tratamiento según la presente invención.

En general, se puede considerar que un sujeto mamífero puede encontrarse con insuficiencia renal crónica, o en riesgo de sufrirla, o en riesgo de necesitar tratamiento renal sustitutivo, si a ese sujeto se le ha diagnosticado que padece, o se consideraría que padece, un trastorno que conduce de forma característica a una pérdida progresiva de la función renal asociada con una pérdida progresiva de nefronas funcionales. Entre otros, estos trastornos incluyen: enfermedad renal en estadio final, nefropatía diabética crónica, glomerulopatía diabética, hipertrofia renal diabética, nefrosclerosis hipertensiva, glomerulosclerosis hipertensiva, glomerulonefritis crónica, nefritis hereditaria, displasia renal y rechazo crónico tras el trasplante de aloinjerto renal y similares. Estos, y otras enfermedades y trastornos conocidos en el campo, conducen de forma característica a una pérdida progresiva de nefronas funcionales y a el inicio de una insuficiencia renal crónica.

Es posible que los profesionales de la medicina o la veterinaria frecuentemente basen una decisión de pronóstico, diagnóstico o tratamiento en el análisis de una muestra de biopsia renal. Estas biopsias proporcionan una riqueza de información útil para el diagnóstico de trastornos renales aunque, debido a lo invasivo del procedimiento y al trauma adicional que le puede suponer a un riñón enfermo, es posible que no sea apropiado para todos los sujetos. Sin embargo, se puede reconocer a los sujetos con insuficiencia renal crónica, o en riesgo de sufrirla, o en riesgo de necesitar tratamiento sustitutivo renal, mediante indicaciones histológicas de biopsias renales incluidas, entre otras, la hipertrofia glomerular, hipertrofia tubular, glomerulosclerosis, esclerosis tubulointersticial y similares.

Otras técnicas menos invasivas para la evaluación de la morfología renal incluyen pruebas mediante RMI, TAC y ultrasonidos. También existen técnicas de exploración que utilizan agentes de contraste o de detección por imagen (p. ej., colorantes radiactivos), pero hay que resaltar que algunos de estos son particularmente tóxicos para los tejidos y estructuras renales y, por lo tanto, su utilización puede estar contraindicada en sujetos con insuficiencia renal crónica, o en riesgo de sufrirla. Estas técnicas de exploración no invasivas pueden emplearse para detectar trastornos como la fibrosis o esclerosis renal, la necrosis renal focal, los cistos renales o la hipertrofia renal grave, que indicarían que el sujeto padece, o está en riesgo de padecer, insuficiencia renal crónica, o en riesgo de necesitar tratamiento renal sustitutivo.

Con frecuencia, las decisiones relacionadas con el pronóstico, diagnóstico o el tratamiento están fundamentadas en indicaciones clínicas sobre la función renal. Una de estas indicaciones es la presencia en el sedimento urinario de una cantidad anormal de cilindros "anchos" o "de insuficiencia renal", lo cual es indicativo de una hipertrofia tubular y sugiere la existencia de la hipertrofia renal compensadora que caracteriza a la insuficiencia renal crónica. Una indicación mejor de la función renal es la tasa de filtración glomerular (TFG), que se puede medir directamente cuantificando la tasa de aclaramiento de marcadores particulares, o que se puede inferir a partir de mediciones indirectas.

Las aplicaciones de la presente invención no deben restringirse a sujetos con una presentación de unas medidas concretas de TFG cualesquiera, o cualquier otro marcador en particular de la función renal. Es más, no es necesario determinar la TFG de un sujeto, o de cualquier otro marcador en particular de la función renal, antes de aplicar los tratamientos de la presente invención. No obstante, la medición de la TFG se considera un sistema preferido de valoración de la función renal.

Como es ampliamente conocido en el campo, la TFG refleja la tasa de aclaramiento de un compuesto marcador o de referencia del plasma a la orina. De manera característica, el compuesto marcador a considerar es uno que sea filtrado libremente por los glomérulos, pero que no sea secretado o reabsorbido de forma activa por los túbulos renales y que no se encuentre unido de forma significativa a proteínas circulantes. La tasa de aclaramiento se define de forma característica según la fórmula, antes presentada, que relaciona el volumen de orina producido en un periodo de veinticuatro horas y la concentración relativa del marcador en orina y plasma. Más precisamente, la TFG también debería corregirse según el área de la superficie corporal. El compuesto de referencia "patrón de referencia" es la inulina debido a sus propiedades de filtración y su falta de unión a las proteínas plasmáticas. Sin embargo, la concentración de este compuesto es difícil de cuantificar en orina o sangre. Por lo tanto, en lugar de la inulina a menudo se utilizan las tasas de aclaramiento de otros compuestos, incluida la creatinina. Además, habitualmente se emplean varias fórmulas que intentan simplificar la estimación de la TFG real omitiendo consideraciones de las concentraciones reales del marcador en orina, de los volúmenes reales diarios de orina producidos o del área real de la superficie corporal. Estos valores pueden reemplazarse por cálculos basados en otros factores, por valores de referencia establecidos para el mismo sujeto o por valores estándar para sujetos similares. Sin embargo, estos cálculos se deben utilizar con precaución ya que pueden llevar a asunciones inadecuadas basadas en la función renal de sujetos normales o sanos. Además, para calcular las tasas de aclaramiento renal se utiliza el aclaramiento del p-aminohipurato (PAH).

Se han desarrollado varios métodos y fórmulas que describen un valor esperado de la TFG par un sujeto sano con ciertas características. En concreto, se dispone de fórmulas que proporcionan un valor esperado de la TFG basada en los niveles plasmáticos de creatinina, la edad, el peso y el sexo del sujeto. Por supuesto, es posible utilizar otras fórmulas y se pueden realizar tablas de valores estándar para sujetos de una edad, peso, sexo o concentración plasmática de creatinina dados. Actualmente también hay disponibles métodos más nuevos para medir o estimar la TFG (p. ej., utilizando tecnologías de RMN o RMI) y se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención (véase, p. ej., los Núms. de Pat. estaounidense: 5 100 646 y 5 335 660).

De manera general, sin tener en cuenta el modo en que se ha medido o estimado la TFG, es posible considerar que un sujeto padece insuficiencia renal crónica, o está en riesgo de padecerla, o en riesgo de necesitar tratamiento renal sustitutivo, cuando el sujeto presenta de forma crónica una TFG menor a cerca del 50% de la TFG esperada para ese sujeto. El riesgo se considera mayor a medida que la TFG disminuye. Por lo tanto, se considera que un sujeto se encuentra cada vez más en riesgo si este presenta una TFG que de forma crónica es menor de alrededor del 40%, 30% o 20% de la TFG esperada. Es posible considerar que un sujeto humano masculino con un peso de al menos unos 50 kg padece insuficiencia renal crónica, o se encuentra en riesgo de padecerla, o en riesgo de necesitar tratamiento renal sustitutivo, cuando el sujeto presenta de forma crónica una TFG menor a cerca de 50 ml/min. El riesgo se considera mayor a medida que la TFG disminuye. Por lo tanto, se considera que un sujeto se encuentra cada vez más en riesgo si este presenta una TFG que de forma crónica es menor a unos 40, 30 o 20 ml/min. Es posible considerar que un sujeto humano femenino con un peso de al menos unos 40 kg padece insuficiencia renal crónica, o se encuentra en riesgo de padecerla, o en riesgo de necesitar tratamiento renal sustitutivo, cuando el sujeto presenta de forma crónica una TFG menor a cerca de 40 ml/min. El riesgo se considera mayor a medida que la TFG disminuye. Por lo tanto, se considera que un sujeto se encuentra cada vez más en riesgo si este presenta una TFG que de forma crónica es menor a unos 30, 20 o 10 ml/min. En general, se puede considerar que un sujeto padece insuficiencia renal crónica, o se encuentra en riesgo de padecerla, o en riesgo de necesitar tratamiento renal sustitutivo, si ese sujeto posee un número de nefronas funcionales menor al 50% del número de nefronas funcionales de un sujeto sano, aunque por otro lado similar. Igualmente, el riesgo se considera mayor a medida que el número de nefronas funcionales sigue disminuyendo. De este modo, se considera que un sujeto se encuentra cada vez más en riesgo si este presenta un número de nefronas funcionales menor de alrededor del 40, 30 o 20% del para un sujeto equivalente pero sano.

Finalmente, es importante destacar que los sujetos que poseen un único riñón, sea cual sea la manera en que perdieron el otro (p. ej., traumatismo físico, extracción quirúrgica, defecto de nacimiento), pueden considerarse prima facie en riesgo de insuficiencia renal crónica o de necesidad de tratamiento renal sustitutivo. Esto es particularmente así en el caso de los sujetos que han perdido un riñón debido a una enfermedad o trastorno que puede afectar al riñón restante. Del mismo modo, los sujetos que ya son receptores de un trasplante renal, o que ya están siendo tratados con diálisis crónica (p. ej., hemodiálisis crónica o diálisis peritoneal continua ambulatoria), pueden considerarse en riesgo de insuficiencia renal crónica o de necesidad de otro tratamiento renal sustitutivo.

Formulaciones y Métodos de Tratamiento

Los agentes antagonistas de integrinas de la presente invención se pueden administrar por cualquier vía que sea compatible con el agente terapéutico renal empleado en particular. Por lo tanto, según sea apropiado, la administración puede ser oral o parenteral, incluidas las vías de administración intravenosa, intraperitoneal y renal intracapsular. Además, la administración puede realizarse mediante inyecciones periódicas de un bolus de los agentes descritos aquí, o puede llevarse a cabo de forma más continua mediante administración intravenosa o intraperitoneal a partir de una reserva externa (p. ej., una bolsa i.v.) o interna (p. ej., un implante biodegradable o una bomba implantada). En un método de acuerdo con la invención, se prefiere que los antagonistas de integrinas se administren de manera parenteral. El término "parenteral" como aquí se utiliza incluye técnicas de inyección o infusión por vía aerosólica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal.

Los agentes de la invención pueden proporcionarse a un individuo mediante cualquier sistema adecuado, preferiblemente de forma directa (p. ej., localmente, como mediante inyección o administración tópica en un locus tisular) o sistémica (p. ej., de forma parenteral u oral). En el caso de que el agente se deba administrar de forma parenteral, como mediante administración intravenosa, subcutánea o intramuscular, este preferiblemente forma parte de una solución acuosa. La solución es fisiológicamente aceptable si, junto con la administración del agente deseado al sujeto, aún así esta no afecta de forma adversa al equilibrio electrolítico o volumétrico del sujeto. Por tanto, el medio acuoso para el agente puede contener salino fisiológico normal (p. ej., NaCl 0,9%, 0,15 M, pH 7-7,4).

La administración de los antagonistas de integrinas se realiza preferiblemente en forma de composición farmacéutica esteril que contiene un excipiente farmacéuticamente aceptable, que puede ser cualquiera de los excipientes conocidos como agua, salino, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, o combinaciones de los mismos. Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse en forma de sales farmacéuticamente aceptables derivadas de ácidos y bases orgánicos o inorgánicos. Entre estas sales ácidas se incluyen las siguientes: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, alcanforato, alcanforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanesulfonato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenil-propionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Las sales básicas incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos (como las sales de sodio y potasio), sales de metales alcalinotérreos (como las sales de calcio y magnesio), sales con bases orgánicas (como las sales de diciclohexilamina, N-metil-D-glucamina, tris(hidroxi-metil)metilamina) y sales con aminoácidos como arginina, lisina y similares. Los grupos básicos que contienen nitrógeno también se pueden cuaternizar con agentes como: haluros de alquilo inferior, como cloruro de metilo, etilo, propilo o butilo, bromuros y yoduros; sulfatos de dialquilo, como sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo y diamilo; haluros de cadena larga, como cloruros de decilo, latirilo, miristilo y estearilo, bromuros y yoduros; haluros de aralquilo, como bromuros de bencilo y fenetilo y otros. De esta manera se obtienen productos solubles o dispersables en agua o aceite.

Las composiciones farmacéuticas aquí descritas contienen cualquiera de los compuestos de la presente invención, o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos, junto con cualquier excipiente farmacéuticamente aceptable. El término "excipiente" como aquí se emplea incluye adyuvantes y vehículos aceptables. Los excipientes farmacéuticamente aceptables que se pueden utilizar en las composiciones farmacéuticas de esta invención incluyen, entre otras, intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas plasmáticas como la albúmina sérica humana, sustancias tamponadoras como los fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos saturados vegetales, agua, sales o electrolitos como sulfato de prolamina, fosfato ácido de disodio, fosfato ácido de potasio, cloruro sódico, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, pirrolidona de polivinilo, sustancias con base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, copolímeros de bloques de polietilen-polioxipropileno y lanolina.

Las composiciones farmacéuticas aquí descritas pueden estar en forma de preparaciones inyectables estériles, por ejemplo, una suspensión inyectable estéril acuosa u oleaginosa. Esta suspensión se puede formular según las técnicas conocidas en el campo utilizando agentes de dispersión o humectantes adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentra el agua, la solución Ringer y la solución isotónica de cloruro sódico. Además, habitualmente se utilizan aceites fijados estériles como medio disolventes o de suspensión. Con este fin es posible emplear cualquier aceite insípido fijado incluyendo mono y diglicéridos sintéticos. En la preparación de inyectables los ácidos grasos, como el ácido oleico y sus derivados glicéridos, son de utilidad del mismo modo que los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, como el aceite de oliva o de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones oleaginosas también pueden contener un diluyente o dispersante alcohólico de cadena larga.

Las composiciones farmacéuticas aquí descritas, en particular las moléculas pequeñas antagonistas de integrinas, pueden administrarse por vía oral o parenteral. En el primer caso, se pueden administrar en cualquier forma de dosis oralmente aceptable incluyendo, entre otras, cápsulas, comprimidos o suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de comprimidos de administración oral, los excipientes normalmente utilizados son la lactosa y el almidón de maíz. También se suelen añadir agentes lubricantes como el estearato magnésico. Para la administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen la lactosa y el almidón de maíz seco. En el caso de necesitar suspensiones acuosas para su administración oral, el ingrediente activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también se pueden añadir ciertos agentes edulcorantes, aromatizantes o colorantes. También es posible utilizar parches tópicos transdérmicos.

Las composiciones farmacéuticas aquí descritas también pueden administrarse a través de aerosoles nasales o de la inhalación mediante un nebulizador, un inhalador de polvo seco o un inhalador de dosis fija. Estas composiciones se preparan de acuerdo con técnicas ampliamente conocidas en el campo de la formulación farmacéutica y pueden prepararse en forma de soluciones en salino, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de absorción para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarbonos u otros agentes solubilizantes o de dispersión convencionales. De acuerdo con otra realización, las composiciones que contienen un compuesto de esta invención pueden contener también un agente adicional seleccionado a partir del grupo formado por corticosteroides, antiinflamatorios, inmunosupresores, antimetabolitos y inmunomoduladores. Se pueden seleccionar compuestos de estas clases a partir de cualquiera de los que aparecen clasificados bajo los títulos de grupo adecuados del "Comprehensive Medicinal Chemistry", Pergamon Press, Oxford, England, pp. 970-986 (1990), los detalles del cual se incluyen aquí en forma de referencia bibliográfica. Algunos compuestos específicos son: teofilina, sulfasalazina y aminosalicilatos (antiinflamatories); ciclosporina, FK-506 y rapamicina (inmunosupresores); ciclofosfamida y metotrexato (antimetabolitos); esteroides (inhalados, orales o tópicos) e interferones (inmunomoduladores).

Es posible preparar soluciones útiles para la administración parenteral mediante cualquiera de los métodos conocidos en el campo farmacéutico, descritos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Gennaro, A., ed.), Mack Pub., 1990. Como podrá apreciar cualquier experto en la materia, las composiciones formuladas contienen cantidades terapéuticamente efectivas del agente renal terapéutico. Es decir, contienen cantidades que proporcionan concentraciones adecuadas del agente a los tejidos renales durante un tiempo suficiente para prevenir, inhibir, retrasar o paliar la pérdida permanente o progresiva de la función renal, o en todo caso proporcionar una eficacia terapéutica. Como también apreciará el experto, la concentración de los compuestos descritos en una composición terapéutica de la presente invención variará en función de un número de factores, incluida la eficacia biologica del agente seleccionado, las características químicas (p. ej., la hidrofobicidad) de los compuestos empleados, la formulación de los excipientes del compuesto, la vía de administración y el tratamiento previsto, incluido tanto si el ingrediente activo se administra directamente dentro de una cápsula renal o como si se administra de forma sistémica. Es probable que la posología preferida a administrar también dependa de variables como el estado de los tejidos renal, el alcance de la pérdida de la función renal y el estatus general de salud del sujeto en particular. Las dosis pueden administrarse de forma continua, o diaria, pero actualmente se prefiere que estas se administren una, dos o tres veces por semana durante el tiempo que persista la respuesta satisfactoria (medida, por ejemplo, mediante la estabilización o la mejora de la función renal a través de marcadores médicos adecuados o índices de calidad de vida) También cabe utilizar dosis menos frecuentes como, por ejemplo, dosis mensuales. En el caso de sujetos que por otro lado necesitan sesiones de hemodiálisis continuas, bisemanales o trisemanales, no se consideran excesivamente inapropiadas las infusiones intravenosas o intraperitoneales continuas, bisemanales o trisemanales. Además, para poder facilitar infusiones frecuentes, puede ser aconsejable la implantación de un stent semipermanente (p. ej., intravenoso, intraperitoneal o intracapsular).

Por supuesto, los agentes renales terapéuticos de la invención se pueden administrar solos o en combinación con otras moléculas de las que se conoce que son beneficiosas para el tratamiento de las condiciones aquí descritas. Cuando se utiliza en combinación con otros agentes, puede ser aconsejable alterar las dosis de los agentes renales terapéuticos de la presente invención del modo que corresponda.

Modelos Animales

Los agentes de la presente invención también se pueden ensayar en modelos animales de insuficiencia renal crónica. Los modelos de mamífero de insuficiencia renal crónica en, por ejemplo, ratones, ratas, conejillos de indias, gatos, perros, ovejas, cabras, cerdos, vacas, caballos y primates no humanos, se pueden crear causando una lesión o daño directo o indirecto adecuado en los tejidos renales del animal. Los modelos animales de insuficiencia renal crónica se pueden crear, por ejemplo, realizando una nefrectomia parcial (p. ej., 5/6) que reduzca la cantidad de nefronas funcionales hasta un nivel que inicie una hipertrofia renal compensadora, una mayor pérdida de nefronas y el deterioro progresivo de la función renal que caracteriza la insuficiencia renal crónica. Finalmente, se puede evaluar la eficacia terapéutica de los agentes de la presente invención como causantes de una mejora clínicamente significativa de un marcador estándar de la función renal cuando se administran a un sujeto mamífero (p. ej., un paciente humano) con insuficiencia renal crónica o en riesgo de padecerla. Estos marcadores de la función renal se conocen ampliamente en la literatura médica e incluyen, entre otros, los siguientes: tasas del aumento de los niveles de BUN, tasas del incremento en creatinina sérica, mediciones estáticas de BUN, mediciones estáticas de creatinina sérica, tasas de filtración glomerular (TFG), proporciones de BUN/creatinina, concentraciones séricas de sodio (Na+), proporciones de orina/plasma para la creatinina, proporciones de orina/plasma para la urea, osmolaridad de la orina, producción diaria de orina y similares (véase, por ejemplo, Brenner y Lazarus (1994), en Harrison's Principles of Internal Medicine, l3 edición.

La técnica de la invención, incluidos los aspectos y realizaciones adicionales preferidos de la misma, se comprenderán todavía mejor a partir de los siguientes ejemplos, que aquí se presentan exclusivamente para ilustrar y no se deben entender como limitadores de la invención de ningún modo.

Ejemplos Ejemplo 1 Modelo Animal de Insuficiencia Renal

La inyección de suero (NTS) con una titulación alta de membrana basal glomerular anti-rata (GBM) en ratas WKY conduce a la deposición de IgG de conejo en ratas GBM en las que actúa como un antígeno sembrado e inicia una respuesta inflamatoria agresiva, caracterizada por la regulación positiva de citoquinas proinflamatorias y moléculas de adhesión como JCAM-1 y VCAM-1, junto con el reclutamiento de leucocitos en los glomérulos. El influjo de células es predominantemente monocítico, con células CD8+ también presentes, aunque estas no son las células T clásicas. Algunas coexpresan CD8 y el marcador ED1 de monocito de rata /macrófago (equivalente a CD68), lo que sugiere que representan a un subtipo de macrófagos.

El influjo de células se pone en marcha en el día 1 de este modelo de nefritis nefrotóxica (NTN), y el pico de cuentas de leucocitos glomerulares en el día 3-4. El daño renal es evidente en forma de proteinuria en el día 4, y la necrosis fibrinoide y la formación de crecientes sucede dentro de los glomérulos en el día 7.

Los infiltrados intersticiales se forman en el día 11, a medida que el proceso inflamatorio se desborda de los glomérulos. Esta nefritis tubulointersticial "secundaria" también se ha observado en humanos con glomerulonefritis primaria y a menudo denota un pronóstico desfavorable. El aclaramiento de creatinina (CNC) empieza a descender y la creatinina en suero aumenta en la tercera semana de NTN. La fibrosis dentro de los glomérulos y la compartimentación intersticial empeora progresivamente hasta que acaece la muerte alrededor del día 40 desde el CRF.

Brevemente, se compraron ratas macho Wistar-Kyoto (WKY) con edades comprendidas entre 6 y 8 semanas (peso 200-250 g) de los Charles River Laboratories y se alimentaron con comida de ratas estándar y agua ad libitum. Se prepara suero heterólogo nefrotóxico (NTS) mediante métodos estándar. Por ejemplo, se aislaron glomérulos de rata, se sonicaron y se liofilizaron para proporcionar una preparación de membrana basal glomerular de rata (GMB) con menos de un 5% de contaminación tubular. Se inmunizaron conejos blancos Albino New Zealand con GBM de rata en CFA, luego se estimuló a intervalos mensuales con GBM hasta obtener antisuero anti-GBM de titulación alta en los sangrados de prueba. Entonces se inyecta un total de 0,1 ml de NTS i.v. en ratas WKY, conduciendo al desarrollo de nefritis nefrotóxica, como se ha descrito antes. Los detalles de este modelo se pueden encontrar en Tam, F.W.K. et al., Nephrology Dialysis Transplantation 14: 1658-1666 (1999).

Valoración de la Enfermedad Renal Parámetros Funcionales

Albuminuria/proteinuria: refleja la filtración glomerular y, en menor grado, la insuficiencia del metabolismo tubular de proteína filtrada. La interpretación de tales datos puede ser difícil ya que es el producto de dos variables independientes; el aumento de la permeabilidad de GBM lleva a una mayor proteinuria, pero la menor tasa de filtración glomerular reduce la proteinuria glomerular.

La orina se acumuló en jaulas metabólicas durante 24 h antes de la recogida. La concentración de albumina en orina se determinó mediante inmunoelectroforesis en cohete. La concentración de proteína en orina se determinó mediante precipitación de ácido sulfosalicílico.

Creatinina en suero y aclaramiento de creatinina (CrCl): Se recogió sangre periférica para determinar la concentración de creatinina en suero utilizando reactivos de Olympus y un analizador Olympus AU600 (Olympus, Eastleigh, U.K.). También se determinó la concentración de creatinina en orina (Bayer RA-XT, Newbury, U.K.) para permitir el cálculo del aclaramiento de creatinina.

Supervivencia: Los criterios de valoración de estos estudios son la muerte súbita y la eutanasia para aliviar el sufrimiento. Los animales se observaron diariamente mediante un observador independiente, y ciego para el estudio, y los animales moribundos se sacrificaron si le pareció necesario al tercer participante. En la práctica, alrededor de la mitad de los animales en los estudios de supervivencia alcanzan el criterio de valoración de "muerte".

Parámetros Histológicos

Las secciones teñidas con hematoxilina y eosina permiten la valoración bruta de la cicatrización glomerular, pérdida túbulos, infiltrados intersticiales inflamatorios y fibrosis intersticial utilizando escalas de puntuación arbitrarias.

Fibrosis glomerular: estimamos mediante computadora el % de áreas renales corticales teñidas de color verde mediante histoquímica de Masson-Trichrome, que ofrece una vía para valorar la carga de colágeno dentro del riñón. Los glomérulos individuales también pueden seleccionarse como el área de interés para calcular la fibrosis glomerular específica. Para cuantificar la fibrosis intersticial dentro del glomérulo, se tiñeron las secciones de riñón incluidas en parafina utilizando un método estándar tricrómico (Amarillo Martius, Escarlata Cristal Brillante y Azul Anilina). Para cuantificar la deposición de fibrina glomerular (p.ej., necrosis fibrinoide), las secciones de riñón incluidas en parafina se tiñeron utilizando Amarillo Martius, que tiñe la fibrina de color rojo/naranja. Las secciones se examinaron bajo un aumento de X200 utilizando un microscopio Olympus BX4O (Olympus Optical, London, U.K.) montado con una cámara digital Photonic (Photonic Science, East Sussex, U.K.). Las imágenes se capturaron y analizaron utilizando el programa Image-Pro Plus TM (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

La cuantificación del % de áreas renales corticales teñidas de color marrón tras la tinción de inmunoperoxidasa de las secciones de riñón para el dominio ED(A) de la fibronectina parece discriminar entre IRC de distintas gravedades funcionales. De forma similar, la inmunohistoquímica del colágeno de tipo III permite el cálculo del % de área renal cortical teñida.

La expresión de la actina alfa del músculo liso glomerular (SMA) se midió mediante inmunofluorescencia. Esta proteína define una población de células "miofibroblásticas" dentro de los glomérulos, que se cree que son puntos clave en la fibrosis glomerular. La cuantificación de la tinción inmunofluorescente para la alfa-SMA se correlaciona bien con las puntuaciones tricrómicas de Masson de fibrosis glomerular.

Ejemplo 2 Efectos Antagonistas de TGFbeta en estadios agudos frente a los crónicos

El TGFbeta presenta un papel bien establecido en la patogénesis de insuficiencia renal. Utilizamos un receptor TGFbeta de tipo II dimérico soluble de conejo en un tallo de Fc humana (véase Smith, P.D., et. al., Circ. Res. 84: 1212 - 1222 (1999)) para actuar como un antagonista de TGF beta in vivo. El receptor de TGFbeta soluble como una fusión de Fc se proporcionó por inyección i.p. cada tercer día a partir del día -1 a 5 mg/kg. La administración continuó mientras duró el experimento, con PBS utilizado como control. Se indujo NTN como antes en 12 ratas en el día 0 y la mitad de las ratas se sacrificaron en el día 9, el resto se sacrificó el día 21. No se observaron efectos significativos en la albuminuria ni en el aclaramiento de creatinina, aunque hubo una tendencia en la disminución de la necrosis fibrinoide en los glomérulos en los tiempos estudiados. No se encontraron diferencias en las cuentas crecientes entre grupos. La inmunohistoquímica mostró que el antagonista de TGF beta no posee efectos significativos sobre: 1) los infiltrados celulares glomerulares (macrófagos EDI+ o células CD8+); 2) activación de macrófagos glomerulares (expresión de sintetasa inducible por óxido nítrico); o 3) proliferación celular glomerular (expresión de Ki67) (Datos no presentados aquí).

En el estudio de la insuficiencia renal crónico, se indujo NTN en 12 ratas, y se proporcionó un receptor TGFbeta de tipo II dimérico soluble de conejo en un tallo de Fc humana en una dosis de 1 mg/kg mediante inyección i.p. en días alternos desde el día 14 hasta el día 35, cuando se sacrificaron las ratas. Seis de las doce ratas inducidas con NTS sirvieron como controles recibiendo IgG humana en dosis comparables. La creatinina en suero fue significativamente menor en ratas que reciben el antagonista de TGF beta soluble en los días 28 y 35(véase la Figura 1). El contaje de la presencia o no de los aumentos glomerulares no mostró diferencias entre grupos, pero esto fue debido al retraso en el inicio del tratamiento en este experimento lo que indica que casi todos los glomérulos presentan alguna anormalidad. En la Figura 2 se muestra la media del % del área glomerular fibrotizada (estimada para 50 glomérulos consecutivos) y el número de cuadrantes glomerulares ocupados por fibrina.

Ejemplo 3 Efectos del Homólogo de Anticuerpo Anti-VLA-1 sobre los Estadios Crónicos frente a los Agudos

Los anticuerpos contra VLA-1 se evaluaron en estudios a corto plazo extendiéndose hasta el día 10. Se administró un anticuerpo de hámster (Ha3 1/8) contra la integrina VLA-1 alfa 1 de rata en el día -1 y luego a los días 1, 3, 6 y 8. También se administró un anticuerpo control (HA4/8). A una dosis de 2,5 mg/kg i.p. no se observaron efectos significativos sobre la albuminuria entre antagonista y control. Tampoco se observaron efectos sobre la necrosis fibrinoide glomerular o la formación de crecientes con ningún anticuerpo a cualquier dosis.

El estudio crónico siguió un protocolo similar al del estudio del receptor TGFbeta soluble anterior, excepto que los anticuerpos se proporcionaron en los días 14-28. Se indujeron 24 ratas con NTS en el día 0, diez recibieron
anti-VLA-1 (Ha3 1/8) en los días 14-28, diez recibieron anticuerpo control (Ha4/8) durante el mismo periodo. Cuatro ratas se sacrificaron en el día 14 para la histología basal. Diez ratas se sacrificaron en el día 35 para la histología (5 tratadas y 5 control). Diez ratas permanecieron en un brazo de supervivencia y todas murieron o fueron sacrificadas por razones humanitarias. Una rata en el grupo mab anti-VLA-1 murió debido a la anestesia.

El ritmo de enfermedad en este experimento fue menor al visto previamente, por lo que la muerte aconteció más tarde de lo normal. Las curvas de supervivencia (Figura 3) divergieron de tal forma que todas las ratas control habían muerto alrededor del día 75 y las 4 ratas en el grupo mab anti-VLA-1 continuaron pareciendo saludables aún después de 125 días.

Ejemplo 4 Efectos del Homólogo de Anticuerpo Anti-alfa-4 sobre los Estadios Crónicos frente a los Agudos

En la fase aguda de este modelo, hemos mostrado anteriormente que los antagonistas de la integrina alfa-4 atenúan de forma significativa el daño renal (albuminuria, necrosis glomerular fibrinoide y formación de crecientes). Véase Allen, A.R. et al., J. Immunology 162: 5519-5527 (1999).

Para dirigir el papel de los antagonistas de las integrinas alfa 4 en la mediación del daño renal crónico, progresivo en este modelo, utilizamos un protocolo similar al mostrado en el Ejemplo 2 para la TGF beta II soluble. Utilizamos anticuerpo TA-2 murino (una IgG1 murina anti-integrina alfa4 de rata comprada a PharMingen (San Diego)) que bloquea la adhesión de leucocitos mediada por VLA-4/alfa4beta7. La dosis utilizada fue de 2,5 mg/kg, se ha demostrado que es efectiva en estudios agudos, y se administra i.p. en días alternos. En este estudio, 24 ratas recibieron NTS y 12 recibieron mab control TA-2 entre los días 5 y13. Las otras 12 recibieron TA-2 o mab control entre los días 13 y 21. Todas las ratas se sacrificaron en el día 30. De forma notable, la albuminuria se redujo de forma significativa durante los periodos de administración de TA-2, aunque los grupos convergieron tras el cese del tratamiento con anticuerpos. La puntuación del daño histológico sugiere una menor cicatrización glomerular en los días 13-21 en las ratas tratadas con TA-2 frente a los controles (p=0,06). Hubo una tendencia en la disminución de la creatinina en suero y mayor CrCl en receptores de TA-2.

Tras este estudio de IRC continuamos con uno más largo, con el fin de examinar la supervivencia y posterior histología, ya que las curvas de CrCl parecieron divergir en el día 30. Como en el ejemplo 2, se indujeron 24 ratas con NTS i.v. y 4 se sacrificaron en el día 14 para proporcionar histología basal. El anticuerpo anti-alfa 4 TA-2 se administró a diez ratas entre los días 14 y 24, y diez ratas recibieron el anticuerpo control coincidente con el isotipo (anticuerpo anti-IgG I LFA3 humano 1E6 obtenido de Biogen, Inc.). Para la histología se sacrificaron cinco ratas de cada grupo en el día 35 y el resto entró en un estudio de supervivencia como se ha descrito previamente. La supervivencia fue significativamente mejor (supervivencia media de 68 frente a 49 días, rango log p=001) en ratas que recibieron TA-2 frente a los controles (Figura 4). La proteinúria en los receptores de TA-2 fue mayor en el día 35 en adelante (puede que sea marcadora de la tasa de filtración glomerular mejor conservada) y el CrCl se conservaron mejor en estas ratas que en los controles (p<0.05 en el día 35). Las puntuaciones de cicatrización intersticial fueron significativamente inferiores en ratas que reciben mab anti-alfa 4 frente a las ratas control (p<0,05) y se observaron unas diferencias más pequeñas en la cicatrización glomerular y la expresión de actina glomerular alfa en el músculo liso, cuando se puntuaron las secciones teñidas de forma adecuada con un programa de ordenador de análisis de imágenes. Utilizando técnicas similares, la extensión de la deposición de fibronectina cortical ED(A) también se redujo en receptores de mab anti-alfa4, aunque no se encontraron diferencias en la deposición cortical del colágeno de tipo M entre los dos grupos. Las cuentas de leucocitos glomerulares fueron significativamente mayores en receptores anti-alfa4, lo que refleja probablemente una peor cicatrización en las ratas control (datos no mostrados aquí).

Claims (13)

1. La utilización de un anticuerpo anti-VLA4 antagonista de integrina o un fragmento del mismo que se une a una subunidad alfa4 que contiene la integrina para la preparación de una composición farmacéutica para tratar a un mamífero con, o en riesgo de, insuficiencia renal crónica.

2. La utilización de la reivindicación 1, en la que dicho anticuerpo anti-VLA4 es una inmunoglobulina IgG.

3. La utilización de la reivindicación 1 o 2, en la que dicho anticuerpo anti-VLA4 es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal humanizado, un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo quimérico.

4. La utilización de la reivindicación 1, en la que el fragmento es un fragmento Fab, Fab', F(ab')_{2}, o Fv.

5. La utilización de un anticuerpo anti-VLA4 antagonista de integrina o un fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho anticuerpo posee una porción del mismo codificada por

(a) una secuencia de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo de secuencias:

1

20

o el complemento de dichas secuencias de ácido nucleico; o

(b) una secuencia de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptido seleccionada del grupo que consiste en:

3

4

(iii) un dominio variable del anticuerpo producido por la línea celular ATCC CRL 11175.

6. La utilización de un anticuerpo anti-VLA4 antagonista de integrina o un fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un mamífero con, o en riesgo de, insuficiencia renal crónica en el que el anticuerpo comprende:

(a) una cadena ligera humanizada que comprende tres regiones determinantes de complementariedad con las secuencias de aminoácidos de las correspondientes regiones determinantes de complementariedad de una cadena ligera de inmunoglobulina 21-6 de ratón, y de una región marco variable de una secuencia de región marco variable de una cadena ligera kappa humana, excepto que en al menos una posición de aminoácido, el aminoácido está ocupado por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente de la cadena ligera de inmunoglobulina 21-6 de de una región marco variable de ratón; y

(b) una cadena pesada humanizada que comprende tres regiones determinantes de complementariedad con las secuencias de aminoácidos de las correspondientes regiones determinantes de complementariedad de una cadena pesada de inmunoglobulina 21-6 de ratón, y de una región marco variable de una secuencia de región marco variable de una cadena pesada excepto que en al menos una posición de aminoácido, la posición está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente de la cadena pesada de inmunoglobulina 21-6 de de una región marco variable de ratón.

7. La utilización de un anticuerpo anti-VLA4 antagonista de integrina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un mamífero con, o en riesgo de, insuficiencia renal crónica, en la que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado AN 100226.

8. La utilización de dos o más antagonistas de integrinas, en la que al menos dos de los antagonistas incluyen un primer antagonista de integrina que antagoniza la interacción entre una subunidad que contiene alfa4 y su ligando afín o receptor, y un segundo antagonista de integrina que antagoniza la interacción entre otra subunidad que contiene alfa que no sea alfa4 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un mamífero con, o en riesgo de, insuficiencia renal crónica, en el que el primer y el segundo antagonista de integrina son anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a una integrina que contiene la subunidad alfa4.

9. La utilización de la reivindicación 8, en la que el primer antagonista de integrina es un anticuerpo humanizado, en el que la cadena ligera humanizada y la cadena pesada comprende cada una tres regiones determinantes de complementariedad de una inmunoglobulina 21-6 de ratón, con una porción de la misma codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo de secuencias:

5

6

10. La utilización de la reivindicación 8, en la que el primer antagonista de integrina es un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen a una integrina que contiene la subunidad alfa4, dicho homólogo de anticuerpo posee una porción del mismo que codifica una secuencia de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptido seleccionada del grupo que consiste en:

7

8

(c) un dominio variable del anticuerpo producido por la línea celular ATCC CRL 11175.

11. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en que dicho mamífero está afligido con una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en insuficiencia renal crónica, enfermedad renal de estadio final, nefropatía diabética crónica, glomerulopatía diabética, hipertrofia diabética renal, nefrosclerosis hipertensiva, glomerulosclerosis hipertensiva, glomerulonefritis crónica, nefritis hereditaria, y displasia renal.

12. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el mamífero es un humano.

13. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que la composición es adecuada para administrar de forma parenteral, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o a través de una vía renal intracapsular.