PT100735B - Anticorpos recombinantes para terapia humana - Google Patents

Description

Este pedido é uma continuação parcial do pedido de patente Norte-americano, de Newman e al., com o número de série 07/856.281, apresentado em 23 de Março de 1992, que é uma cor tinuação parcial do pedido de patente Norte-america com o número de série 07/735.064, apresentado em 25 de Julho de 1991, os quais são aqui ambos incorporados na sua totalidade, inclt indo desenhos,como referência. A presente invenção refere-se a anticorpos recombinantes úteis para o tratamento de seres humanos e a métodos para a produção de tais anticorpos.

Fundamentos da Invenção

Anticorpos monoclonais murinos são utilizados no diagnóstico da doença humana, e na solução de problemas básicos de investigação biológica. Esses reagentes são também usados nos ensaios clínicos, como tratamentos para doenças humanas, tanto agudas como crónicas, incluindo leucemias, linfornas, tu ftores sólidos (por exemplo, do cólon, da mama, hepático), SIDA e doenças auto-imunes.

Têm sido criados anticorpos quiméricos rato/humano que se demonstra apresentarem características de ligação do anti corpo de rato parental e funções efectoras associadas à regiãc constante humana. Vêr, por exemplo, Cabilly e col., Patente Jorte-americana 4.816.567; Shoemaker e col., Patente Norteamericana 4.978.745; Beavers e col., Patente Norte-americana i.975.369; e Boss e al., Patente Norte-americana 4.816.397,t£ ias aqui incorporadas como referência. Geralmente, esses ant^ corpos quiméricos são construídos por meio de preparação de ima biblioteca de genes genómica a partir do ADN extraído de libridomas murinos pré-existentes. Nishimura e al.,. 47 Câncer research 999. 1987. A biblioteca é pesquizada em busca de re35

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giões de genes variáveis, tendo de cadeias pesadas como de cadeias leves que exibam os padrões de rearranjo correctos d fragmento de anticorpo. Os genes, da região variável clonado são então lígadsõ num vector de expressão que contem caixas clonadas do gene quiméricos são então expressos numa linha d células escolhida, usualmente uma linha de meiloma muríno.

Tais anticorpos quiméricos têm sido utilizados na ter humana. Anticorpos contra esses anticorpos têm.

sido produzidos, num certo número de casos, pelo recipie: te humano . Tais anticorpos anti-anticorpo quimérico são pre judiciais ao tratamento continuado com o anticorpo quimérico.

Erlich e al., 34 Clinicai Chemistry 1681, 1988, Erlic le al., 7 Hybridoma 385. 1988, Erlich a al., 6 Hybridoma 151, 1987 e Erlich e al., 1 Human Antibody Hybridoams 23. 1990 (que não é considerado como pedido) declaram que se espera que os anticorpos pumanos sejam um aperfeiçoamento monoclonais de rato o tratamento Lam igualmente que os anticorpos Uexemplo, anticorpos monoclonais pia to, no enta:

Mod. 71 - 20.000 ex. - ?0/0β em relação aos humano in vivo.

técnica anterior para o presente monoclonais anticorpos Eles postude primatas não-humanos, por de chimpanzé,não tolerados os humanos devido a serem estruturalmente semelhantes aos anticorpos humanos. Dado que os anticorpos humanos não são tmunogénicos nos macacos Rhesus (isto é, não induzem uma resposta de anticorpos),prevêm anticorpos de primatas não serão 25 kmunogénicos para os humanos. Eles indicam que o ensaio dos anticorpos nos seres humanos é desnecessário, se um anticorpo fie primata tiver uma estrutura de região constante idêntica à [imunoglobulina humana ou, pelo menos, uma estrutura não mais diferente de uma imunoglobulina humana do que os diferentes 30 anticorpos humanos diferem uns dos outros. Assim, eles sugerem que os anticorpos de chimpanzé podem ser úteis na terapia humana..

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Resumo da Invenção

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A presente invenção refere-se a métodos para a amplif! cação e clonação e clonação de genes codificadores das porções fixadoras de antigénios da região variável da imunolobulina de macacos do Velho Mundo (refidos aqui comomacaco‘,' por exemplo babuíno ou macaca), a fusão desses genes com os genes codificadores da região constante colonada humana, de chimpar zé ou de outro macaco ( e genes codificadores estruturais humanos, chimpanzé ou outro macaco), e a sua expressão como ar ticorpos recombinantes de humanos/macacos, ou anticorpos recombinantes apenas de macaco. Além disso, a invenção refere-se à utilização de tais anticorpos recombinantes (termo esse que inclui anticorpos produzidos por fusão do ADN de dois diferentes genes de anticorpo, mesmo da mesma espécie, por exen pio, dois genes diferentes de anticorpos de macaco, por exemplo Rhesus e cinocéfalos, para dar um anticorpo recombinante macaco-macaco) como agentes imunoterápicos para o tratamento da doença humana, a invenção baseia-se na descoberta de que os macacos evolucionariamente distantes (por exemplo,babuínos oti, símicos do tipo macaco (incluindo macacos cinocéfalos e Rhesus)), ao contrário do Chimpanzé, não só são suficientemen te diferentes dos humanos para permitirem que anticorpos con tra os antigénios humanos sejam criados nesses macacos, mesmo até contra antigénios humanos relativamente conservados, por exemplo, CD4eCD54, como são suficientemente semelhantes aos humanos para terem anticorpos semelhantes aos anticorpos humanos, de maneira que não há resposta imune do prospedeiro anti-anticorpo quando tais anticorpos de macaco, ou anticorpos recombinantes deles derivados, são introduzidos num ser humano.

Diferentemente de anticorpos anteriormente usados para a terapêutica humana, os anticorpos da presente invenção não sofrem de diversos incovenientes, por exemplo, 1) imunorgnici dade e indução de resposta anti-anticorpo humano (AAH)aquandc

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 da administração repetida necessária para tratar estados crónicos , 2) semi-vida relativamente curta em comparação com a dos anticorpos humanos e 3) falta de funções efectoras con. as células ou complemento humanos. A ausência destes incon venientes é uma vantagem significativa para o tratamento humano com anticorpos obtidos por meio da presente invenção. Por exemplo, no caso das doenças humanas crónicas, incluindc as doenças autoimunes ou qualquer doença em que seja necessá ria a administração prolongada de um anticorpo, um dos mai£ res obstáculos à terapia repetitiva com anticorpos é resposta hospedeira ao anticorpo terapêutico. As respostas AAh são muitas vezes imprevisíveis de um paciente para outro. Tais respostas são predominantemente, embora não exclusivamente, dirigidas contra a região constante da molécula de anticorpo e uma vez que ocorra interfere com ou reduz a ef£ cácia de qualquer outro tratamento posterior com esse anticorpo ou outro anticorpo do mesmo isotipo.

Os problemas de AAH poderiam ser potencialmente ultrapassados por meio da utilização de anticorpos monoclonais humanos, no entanto j.es. ta abordagem sofre das limitações éticas, clínicas e imunológicas existentes sobre a imunização de sujeitos humanos com muitos antigénios de escolha (por exemplo, antigénios humanos, frase que inclui porções antigénicas ou imunogénicas de quaisquer proteínas, polipéptideos ou seus equivalentes, presentes num humano) para a geração de anticorpo. A abordagem dos requerentes para ultrapassar esse problema inclui a geração de anticorpos com a superfície apropriada e a função efectora desejada e a sua utilização na produção de anticorpos recombinantes. Esses anticorpos recombinantes incluem, geralmente, uma porção apropriada da região variável de um anticorpo derivado de um macaco imunizado e a região constante de um anticorpo de um humano ou de um chimpanzé. Deste modo, as especificidades eelevadas afinidades dos anticorpos monoclonaig são mantidas e a região constante de humano ou chimpanzé apro30

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Mod. 71 -20.000 ex. - 90)08 priada que apresenta as funções efectoras desejadas pode ser fácilmente escolhida.

A presente invenção baseia-se ainda num método para a amplificação dos genes da imunoglobulina do macaco, por exemplo, por meio de reacção da cadeia de polimerase (ARN), do ARN extraído de macaco por meio da utilização de iniciadores oligonucleótidos sintéticos específicos para as famílias de genes de cadeia pesada ou leve da região variável. Os genes ou porções apropriadas amplificados (por exemplo,r£ gião determinadora da complementaridade (RDC)-regiões codifí cadoras; vêr Winter, Pedido de Patente Britânica N² GB2188638A, aqui incorporado como referência) são colonados num vector de expressão contendo um gene de região constante humana ou de chimpanzé, para a produção de um anticorpo recombinante macaco/humano, ou um vector contendo um gene de re gião constante de macaco, para a produção de anticorpo recom binante total de macaco, do isotipo desejado. Estes anticorpos representam agentes imunoterapêuticos capazes de localizar e/ou matar células alvo apropriadas (por exemplo,células de tumor) no seguimento da administração in vivo.

Portanto, num primeiro aspecto, a invenção apresenta um método para a colocação de uma porção reconhecedora do an tigénio de uma região variável de um gene de anticorpo de ma caco. Este método inclui o proporcionar-se ácido nucleíco, po:? exemplo, ARN do macaco, formar-se ADNc para oARN (utilizando^ -se transcritase inversa), fornecer-se um iniciador complementar à sequência ADNc que codifica uma sequência 5*inicial do gene do anticorpo, porem-se em contacto o ADNc e o inicia dor para se formar um complexo hídrico e amplificar o ADNc para se produzir ácido nucleíco que codifica a região variável do gene do anticorpo de macaco.

Por porção reconhecedora do antigénioquer-se significar uma ou mais porções de uma região variável de um anticorpo de macaco, que são responsáveis pela ligação e/ou reconhecimento do antigénio alvotjcy spítope ou idiotipo) do an

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 ticorpo. Ele inclui, por exemplo, as regiões RDC (vêr abaixo) ou toda a região variável, ou qualquer combinação dessas duas regiões que inclua quaisquer modificações nas regiões codifi cadoras que possam ser induzidas, para tornarem a região mais semelhante ao humano do que ao macaco, sem alterar as proprie dades de ligação específicas do anticorpo. Se apenas fôr usada uma porção da região variável total, então as porções restantes, por exemplo, a chamada estrutura·,· são fornecidas a partir de um outro anticorpo, preferivelmente um anticorpo hu nano ou de chimpanzé (ver abaixo) e na técnica acima referida

As frases”região variável, sequência inicial, região constanteeestruturasão aqui utilizadas da maneira re conhecida geralmente na técnica, de que se fornecem exemplos abaixo e na técnica referida acima e são aqui incorporados co no referência.

Em formas de realização preferidas, a sequência inicial é uma sequência inicial humana, de chimpanzé ou de macaco com aproximadamente 60 bases, de que se fornecem exemplos na Fig. 1.

Os requerentes verificaram que as sequências iniciais ia região variável de macaco, chimpanzé e humana, são suficiantemente semelhantes para que os iniciadores construídos para ima sejam adequados a amplificação das outras. No método , o ARN é suficientemente amplificado para produzir ácido nucleíco bastante para colocar esse ácido nucleíco no interior do sector, para posterior clonação.

Num segundo aspecto,a invenção apresenta um método para produção de um anticorpo para o antigénio humano , antigélio esse que não é imunogénico nos humanos. 0 método envolve 2 desenvolvimento num macaco de um anticorpo de macaco ao anantigénio humano e o isolamento do ácido nucleíco de macaco jue codifica uma porção reconhecedora do antigénio de uma região variável do anticorpo de macaco. Proporciona-se ácido nu 21eíco humano que codifica uma região constante humana de um anticorpo o qual é ligado ao ácido nucleíco do macaco para

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 formar ácido nucleíco recombinante. este ácido nucleíco recombinante é então expresso para produzir o anticorpo desejado. Alternativamente, pode ser usado ácido nucleíco codofícador da região constante de chimpanzé ou de macaco para formar o anticorpo recombinante. Há poucas diferenças, se é que há algumas, na sequência de aminoácidos das regiões constantes humana e do chimpanzé (isto é, são homólogas ) e as diferenças presentes entre os humanos e os macacos podem ser fácilmente alteradas por meio de técnicas normalizadas, se o ácido nucleíco codificador da região constante do macaco for para formar o anticorpo recombinante. Tudo o que é importante na invenção é que seja produzido um anticorpo que seja menos imu nogénico do que a região constante do macaco, de forma que não se produza nenhuma resposta imune significativa, quando o anticorpo recombinante for introduzido num humano. (Tais regiões do anticorpo serão aqui referidas como homólogas.). Assim, o anticorpo recombinante é construído para ser funcional mente igual, na sua sequência de aminoácidos, ao anticorpo hu mano, isto é, tem uma região constante homóloga a uma região de anticorpo humano ou de chimpanzé. Resumindo, o anticorpo é um anticorpo tão humano quanto necessário para reduzir a possibilidade de uma resposta imunológica indesejada ao anticorpo e contém uma porção fixadora do antigénio de um anticor pode macaco.

Por ''‘não imiii.nogénioquer-se significar que o anticorpo não provoca uma resposta ao anticorpo de magnitude suficiente para reduzir a eficácia da administração continuada do anticorpo na maioria dos humanos durante um tempo suficiente para se conseguir eficácia terapêutica, em comparação, por exemplo com um anticorpo quimérico ou murino-humano ou surino-humano. De preferência não é observado qualquer resposta de anticorpo Em formas de realização preferidas, o método inclui a imortalização de uma célula do macaco que é responsável pela produção do anticorpo de macaco, por exemplo, por fusão de hi bridoma, transformação virai com Herpes papio, clonação sim30

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 pies com uma célula B (também denominada imortalização tran sitória) e produção de uma biblioteca de imunoglobulinas re combinantes. Noutras formas de realização preferidas, o méto_ do inclui a selecção de uma célula B do macaco vinda de um leucócito de sangue periférico do baço, da medula óssea ou de um nódulo linfático; a selecção de um clone que produza o anticorpo apropriado; a recuperação dos genes de imunoglobulina, que codificam esse anticorpo, da linha de células imo£ talizadas; e a reexpressão dos genes numa linha produtora de células (isto é, uma linha de células que ocasione uma porção do anticorpo, suficiente para ser útil em terapia humana) .

Num terceiro aspecto, a invenção apresenta um anticor po recombinante formado a partir de uma região constante,tan to de humano como de chimpanzé e de uma porção reconhecedora de antigénio de uma região variável de macaco, ou de uma pri^ meira região constante de macaco e uma segunda porção reco nhecedora de antigénio de uma região variável de um macaco di^ ferente.

Num aspecto relacionado,a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal, ou um Fab, (Fab)₂, um dimero de cadeia leve ou pesada, ou um seu fragmento recombinante mínimo, como seja um Fv ou um ACS (anticorpo de cadeia simples) ou outro seu fragmento imunologicamente activo (por exemplo, uma região RDC), para um antigénio humano formado por uma célula B de macaco imortalizada. Tais fragmentos são úteis como agen tes imuno supressores. Alternativamente, o anticorpo da invenção pode ter ligada a si uma molécula efectora ou regista dora. Por exemplo, um anticorpo de acordo com a invenção pode ter um macrociclo, para quelar um átomo de metal pesado, ou uma toxina, como o rícino, ligado a ele por uma estrutura covalente de ponte. Além disso, o fragmento Fc ou o domínio CH3 de uma molécula completa de anticorpo, pode ser substituído por uma molécula de enzima ou de toxina e uma parte da cadeia de imunoglobulina pode estar ligada a uma molécula po

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 lipeptídea efectora ou registadora. Anticorpos bi-específicos podem também ser construídos por processos normalizados.

Num outro aspecto, a invenção apresenta composições farmacêuticas em que os anticorpos da presente invenção são fornecidos para usos terapêuticos ou profiláticos. Tais anti^ corpos podem também ser fornecidos como imunotoxinas isto é, moléculas que são caracterizadas por dois componentes e são particularmente úteis para matar células escolhidas in vitro ou in vivo. Um componente é um agente citotóxico que é gerajL mente fatal para uma célula quando ligado ou absorvido. 0 se_: gundo componente , conhecido como veículo de administração fornece os meios para a introdução do agente tóxido num tipo de células particular, tal como as células de carcioma. Geralmente os dois componentes encontram-se ligados quimicamente um ao outro, por meio de uma variedade de processos químicos ou genéticos. Por exemplo, quando o agente citotóx_i do é uma proteína e o segundo componente é uma imunoglobulina intacta, o encadeamento pode ser feito por meio de recticuladores hetero-bifuncionais, por exemplo,carbodiimida,glua taraldeído e semelhantes , a produção de várias imunotoxinas é bem conhecida da técnica.

Num outro aspecto relacionado, a invenção apresenta á eidos nucleícos que codiffcanr. um anticorpo recombinante humano/macaco. Em formas de realização preferidas, o ácido nucleíco codifica uma região de humano ou de chimpanzé e uma porção reconhecedora do antigénico variável do macaco; e o ácido nucleico é purificado, isto é, separado dos componentes biológicos com os quais ocorre naturalmente ou, mais pre_ ferivelmente,é fornecido numa solução homogénea.

Ainda num outro aspecto, a invenção apresenta um anti^ corpo enxertado na RDC, formado por pelo menos uma das regiões determinadoras da. complementaridade (RDCs), quer dizer , re síduos aminoácidos (utilizando-se o sistema normalizado de rotulagem do aminoácido de Kabat) 31-35 (RDC 1), 50-65 (RDC

2) e 95-102 (RDC3) da cadeia pesada específica e resíduos

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 aminoácidos 24-34 (RDC 1), 50-56 (RDC 2) e 89-97 (RDC 3) da cadeia leve especificada de uma região variável de macaco do Velho Mundo e uma estrutura de região da imunoglobulina de uma segunda espécie. 0 anticorpo enxertado em RDC é capaz de fixar o mesmo antigénio que o anticorpo de macaco original. A região constante do anticorpo é derivada de uma imunoglobulina humana de chimpanzé. A metodologia para a execução deste aspecto é descrita, de uma forma geral, por Jones e al., 321 Nature 522, 1986. Tais enxertos RDC podem ser alterados , se se desejar, parause assegurar que apareçam mais seire lhantes a humanos, de modo que a probabilidade de instigação de reacção adversa ao anticorpo seja diminuída.

Em formas de realização preferidas, o método inclui a imortalização ou selecção de uma célula de um macaco, a qual é responsável pela produção de um anticorpo de macaco, e a recuperação dos genes da imunoglobulina da célula; clonação e sequenciação dos genes do anticorpo responsáveis pela produção do anticorpo; selecção de uma sequência de estrutura de região variável humana (preferivelmente com a homologia mais próxima dada estrutura da região variável do macaco); e substituição das sequências RDC de macaco por sequências RDC humanas e pequenas modificações na região de estrutura humana, podem ser incluídas, para se manter a afinidade do anticorpo com o seu antigénio.

Por pequenas modificações quer-se significar que me nos que um total de 6 aminoácidos da estrutura pode ser sub£ tituído por outros aminoácidos. Usualmente tais substituições ou modificações apenas são feitas quando os aminoácidos estão envolvidos nas interações conformacionais que mantém a estrutura numa forma apropriada, de modo a que o antigénio desejado seja reconhecido pelo anticorpo. Tais modificações reflectirão, geralmente, os aminoácidos diferentes presentes no anticorpo do macaco, em comparação com o anticorpo humano. Por exemplo, a sequência de aminoácido de um anticorpo humano imediatamente anterior à cadeia pesada RDC ;

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92-94, é geralmente cisteína-alanina-arginina (sabe-se que a arginina é substituída, numa minoria de anticorpos, por seri_ na ou treonina); nalguns anticorpos, a sequência do macaco é cisteína-alanina-serina; assim, neste exemplo, pode ser preferido utilizar-se serina no aminoácido 94 (ver Fig. 9D).

Num outro aspecto, a invenção apresenta um método para o tratamento de um humano que tem um antigénio particular, por exemplo, um antigénio associado com doença. 0 método inclui a administração de uma quantidade terapeuticamente ef_i caz de um anticorpo recombinante específico para um antigénio particular, em que o anticorpo recombinante é um que tem uma região constante de humano ou de chimpanzé e uma porção reconhecedora do antigénio de uma região variável de macaco, ou uma primeira região constante de macaco e uma porção reconhecedora do antigénio de uma segunda região variável de um macaco diferente.

Em formas de realização preferidas dos aspectos acima referidos, o antigénio é um antigénio de tumor, um antigénio envolvido num distúrbio imune, um antigénio envolvido numa res posta auto-imune, um receptor expresso numa célula hospedeira, ou um antigénio seleccionado de entre os antigénios humanos CD58, VLA4 (integrina c/4pl), CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, receptor de célula T humana, CD3, CD8, CD23, CD41, CD44, CD45, CD71, TNF^, TNFjJ, antigénio Tn, IL-1, IL-8, C5a, moléculas de adesão, por exemplo, VCAM, CD54,CD28, CDlla, CDllc, CD18 e CDllb, o produto oncogénico neu, MDR-1 (glicoproteína-P), TGFot e o seu receptor e PDGF; e o anticor po recombinante é activo para esvaziar (matar ou eliminar) células indesejáveis (por exemplo, anti-CD4) actuando como célula complementar ou célula assassina, ou como agente cit£ tóxico ou para provocar a fixação do receptor Fc por um fag£ cito. Alternativamente, o anticorpo bloqueia ou estimula as funções receptoras, ou neutraliza os produtos solúveis activos, tais como uma ou mais das interleucinas, TNF e C5a.

Noutros aspectos, a invenção apresenta composições

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Docket n²198/158 farmacêuticas dos anticorpos acima indicados ou seus fragmen tos. Composições ou produtos'cte acordo com a invenção podem ser convenientemente fornecidos sob a forma de soluções adequadas para administração parentérica, nasal ou oral. As pre parações apropriadas de anticorpos podem ser misturadas com preparações adequadas de agentes, resultando numa utilidade clínica aumentada.

Outras caracteristicas e vantagens da invenção tornar -se-ão aparentes a partir da descrição que se segue das suas formas de realização preferidas e das reivindicações.

Descrição de Formas de Realização Preferidas

Em primeiro lugar serão resumidamente descritos os de senhos.

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Desenhos

A Fig. 1 é uma representação tabular de 20 codãos em nove sequências iniciais Ig de cadeia pesada diferentes de dez sequências iniciais Ig de cadeia pesada de macaco;

A Fig. 2 é uma representação diagramática da estrutura de várias cadeias Ig que mostram a posição relativa das regiões inicial, variável e constante com as posições dos pontos de restrição e iniciadores usadas para a amplificação;

A Fig. 3 é uma representação diagramática de um vector de caixa de cadeia pesada para expressão de anticorpos humanos ou quiméricos;

A Fig. 4 é uma representação diagramática de um vector de caixa de cadeia ligeira designado para expressão de anticorpos humanos ou quiméricos;

A Fig. 5 e a 6 são representações diagramáticas de vectores designados para a expressão da imunoglobulina de ADNc de cadeia leve kapa ou lambda, respectivamente. Nestes vectores, os genes da imunoglobulina estão organizados numa configuração em tandem, utilizando-se a fosfotransferase de

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 neomicina como o marcador seleccionável;

As Fig. 7-1, 7-2 e 8 mostram a sequência de ácido nuc leíco de diversos iniciadores de sequência inicial úteis na presente invenção (esses iniciadores correspondem, na Fig. 8, aos listados como SEQ:ID n²s 1-12 infra;

As Fig. 9A a 9H são comparações entre as regiões huma na e de macaco nas sequências VH1, VH2, VH3, VH4e VH5 e sequências VKI e VKII e V lambda III, respectivamente;

A Fig. 10 é uma comparação entre as sequências VH3 hu mana e de macaco, com uma comparação com a sequência humana VH2;

A Fig. 11 é uma um anticorpo de acordo CD4;

A Fig. 12 é uma de fixação de 1F3 pelo representação gráfica da fixação de com a invenção a um antigénio humano representação gráfica de uma inibição anticorpo representado na Fig. 10;

As Figs. 13 e 14 são porções das sequências nucleótidas respectivamente das regiões anti-CD4 VH e VL;

A Fig. 15 é um gráfico que mostra a actividade anti

-CD54; e

A Fig. 16 é um histograma que compara características da expressão de plasmídios.

Anticorpos de Macaco

Macacos do Velho Mundo incluem os referidos como babu ínos e macacos símios (incluindo o macaco Rhesus e o macaco cinocéfalo). A presente invenção fornece pormenores quanto ao uso da invenção reivindicada com vários genes de macaco. Esses exemplos não são limitativos da invenção e podem ser facilmente aplicados a outros macacos do Velho Mundo.

Com referencia à Fig. 2, está representada de uma forma diagramática a estrutura geral de genes que codifica as cadeias pesada, kapa leve e lambda leve da imunoglubulina. Cada uma dessas cadeias é formada por um codão de partida ATG

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Mod. 71 -20.000 ex.-90/08 seguido por uma sequência inicial de aproximadamente 60 bases, uma região que codifica uma região variável da imunogl£ bulina e uma região constante dessa imunoglobulina. Exemplos de diferentes sequências iniciais, ou péptidos de sinalização de cadeias pesadas, estão representadas na Fig. 1. Estas sequências e o seu equivalente nos macacos, podem ser determinadas por meio de técnicas normalizadas, bem conhecidas dos técnicos do ramo e conforme descrito abaixo.

As sequências representadas na porção inferior da Fig. 1 são sequências iniciais humanas. Os requerentes verificaram que a construção dos iniciadores complementares a essas regiões iniciais, permite a amplificação dos genes Ig de macacos. De forma semelhante, os iniciadores homólogos às sequências iniciais de macaco (ver, por exemplo, a porção sup£ rior da Fig. 1) podem ser usados na amplificação de genes de imunoglobulina de macaco e também para amplificação dos genes da imunoglobulina humana.

Por meio da utilização de tais indicadores em processos normalizados de amplificação, os genes que codificam os diversos genes de imunoglobulina do macaco podem ser facilmente isolados e as sequências que codificam as regiões var£ áveis dos anticorpos determinadas. Fornecem-se abaixo exemplos de tais processos. Os resultados da análise fornecidos abaixo são apresentados nas Figs. 9A a 9H e na Fig. 10. Surpreendentemente, os requerentes verificam que, a despeito da capacidade para produzir anticorpos para antigénios humanos relativamente conservados nos macacos, as sequências das estruturas regionais variáveis dos anticorpos assim produzidos, eram indistinguíveis das dos anticorpos humanos. Ou seja, a quantidade de variabilidade na sequência de imunoglobulina observada para os macacos era semelhante à observada para os humanos e foi impossível determinar qual o anticorpo que era derivado de um humano ou de um macaco, sem análise à própria fonte.

Assim, por exemplo, com referência à Fig. 10, a sequên

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 cia de aminoácido da região VH3 do humano foi comparada com a do macaco. Os anticorpos humanos apresentam uma variação de homologia entre elas próprias, situada entre 83-98%, enquanto que as do macaco eram homólogas entre 90-95% com a re gião VH3 humana. Em contrapartida,áaregião VH2 humana era ho móloga à VH3 humana em 60%. [Neste desenho, como nos outros desenhos, a presença do mesmo aminoácido em qualquer localização, está representada por um traço, enquanto que a presen ça de um aminoácido diferente é indicado pelo código normal de uma letra. As posições a que não pode ser atribuído nenhum aminoácido de consenso estão representadas por um x.J Sq melhantemente, a homologia para VH1, VH2, VH3, VH4, VH5 e pa ra VKI e VKII e Vlambda III está representada nas Figs. 9A - 9H, respectivamente. Mais uma vez, foi observada homologia significativa entre a região de imunoglobulina do macaco e a do humano, em cada região variável que inclua sequências de região J de imunoglobulina. Tal homologia elevada é semelhante à observada entre os anticorpos humanos.

A metodologia pela qual as sequências foram determina, das é apresentada abaixo, nos exemplos. Os técnicos do ramo reconhecerão que esses exemplos não são limitativos nesta in venção e que resultados e anticorpos monoclonais ou quiméricos idênticos se podem obter por processos semelhantes, bem conhecidos dos técnicos. Ver, por exemplo, as patentes Nortq -americanas 4.816.567; 4.978.745; 4.975.369; 4.816.397, supra. Por exemplo, após após a clonação de um gene codificador de uma região variável de macaco, tal gene é facilmente ligado a um que codifica uma região constante de macaco ou humana e os genes fundidos expressos numa linha de célula produtora, para produzir o anticorpo desejado. São fornecidos abaixo exemplos de tais processos.

Nos exemplos seguintes, o primeiro passo no método en volve o isolamento do ARN total do sangue periférico ou célu las do braço do macaco. Células B de macacos imunizados podem ser obtidas do sangue periférico ou dos nódulos linfáti30

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 cos e usadas directamente, ou podem ser preferencialmente ex pandidas. A expansão pode envolver a transformação de vírus Herpes papio, fusão com uma célula heteróloga de mieloma com selecção subsquente, ou clonação simples de células B sob di. luição limitadora em presença de células T humanas estimuladas .

ARN total é então convertido em ADNc de cordão simples (ss) por meio de transcriptase invertida, utilizando iniciadores oligonucleótidos não específicos (oligo-dT ou exâ meros aleatórios) ou específicos (região constante de imunoglobulina CHI ou CK Clambda). 0 ADNc de cordão simples produ zido por meio desta reacção, é amplificado por meio da utili zação da reacção da cadeia de polimerase em que o ADNc ss, juntamente com trifosfatos de dioxinucleótido, uma polimerase de ADN (por exemplo uma polimerase termoestável) e iniciadores específicos, são usados para amplificar genes de cadeia pesada ou leve da imunoglobulina da região variável. Os iniciadores usados são oligocleótidos sintéticos encadeados simples que variam entre 20 e 40 bases, contendo algumas bases degeneradas que se fixam às sequências iniciais 5' da imu noglobulina. Seis iniciadores diferentes de sequências inici^ ais 5' (ver, Fig. 7-1 que incorpora um ponto de restrição de enzima (por exemplo, Sall) foram criadas para amplificação de famílias de cadeia pesada na região variável, baseadas na sua semelhança com as famílias genéticas de cadeia pesada va riãvel humana. Para cada um dos seis iniciadores de sequência inicial 5', é utilizado um iniciador 3' específico para o domínio da região constante do isótipo relevante (por exem pio, IgG, IgM, IgA ou IgE) que também incorpora um ponto de restrição de enzima (por exemplo, Nhel). De forma semelhante, para as cadeias leves kapa e lambda do macaco, são usados ou tros pares de iniciadores para a amplificação da região vari ável de cadeia leve apropriada (Fig. 7-2).

Outros conjuntos de iniciadores podem ser utilizados a fim de incorporar pontos de restrição únicos, diferentes,

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Docket η^ρ198/158

para permitir a clonação direccional do ADN amplificado por RCP, num vector de expressão apropriado que possua o mesmo ponto de restrição. Um conjunto de iniciadores ligados à extremidade 3' de sequência inicial de cadeia pesada do anticorpo, que incorpora um ponto Mlul, ou um conjunto de inicia^ dores que se ligam às primeiras 23 bases da estrutura um, que incorpora um ponto Xhol, podem também ser usados e estão dejs critos na Fig. 7-1. Os genes de cadeia pesada e leve da imunoglobulina da região variável de macaco, podem ser clonados num vector de transporte, directamente depois de amplificação por RCP, para permitir, se necessário, mais manipulações moleculares, ou ser clonados directamente num vector de expressão que contenha genes de cadeia pesada ou leve da região constante humana. A configuração molecular dos genes de imunoglobulina no vector de expressão pode ser genómica, em que a imunoglobulina promotora/melhoradora e outras regiões regula doras se encontram presentes, bem como sequências seccionadas dadoras/receptoras nas junções intrão/exão. Alternativamente, podem ser inseridos genes quiméricos de imunoglobulina numa configuração de ADNc que utilize sequências virais promotoras/mglhoradoras heterólogas.

Exemplo 1: Sequência de Anticorpos de Macaco

As Figs. 7 e 8 mostram os iniciadores, respectivamente com e sem pontos de restrição, utilizados na amplificação por RCP dos genes de imunoglobulina de macaco e/ou ADNc humanos. Fornecem-se abaixo detalhes dos processos. ARN foi iso lado de células do baço, sangue periférico e nódulos linfát_i cos de macaco, utilizando-se o método normal do isocianato de guanidínio. A fracção de ARN total isolada por este método foi então usada como um modelo para as reacções de amplificação subsquentes. Uma alíquota do ARN foi incubada em pre sença de 200 unidades de transcritase inversa de vírus de leucemia murina de Moloney e iniciadores oligonucleótidos

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Docket n-198/158

Mod. 71 -20.000 e*.-90/08 ( 50-100 picomoles) não específicos (hexâmeros oligo-dT ou aleatórios) ou específicos (região de imunoglobulina IgG CHI ou região constante de cordão kapa CK), para gerarem um cordão de ADNc simples sem sentido codificador. 0 ADNc de cordão simples produzido por esta reacção foi então amplificado uti. lizando-se a reacção da cadeia de polimerase (RCP). Uma alíquota do ADNc de cordão simples foi incubada juntamente com trifosfatos de deoxinucleótido (20/íM), uma polimerase de ADN termo-estável (s-5 unidades) e iniciadores oligonucleótidos sintéticos derivados de humanos (50 picomoles), para amplifi car os genes, tanto de cadeia pesada como da leve, da imunoglobulina da região variável.

Utilizando-se pares de iniciadores representados na Fig. 8, diversas sequências representativas de imunoglobulina de cadeia pesada ou leve da região variável do cinomólogo de um determinado número de famílias de genes, foram amplifi cadas. Essas sequências amplificadas foram clonadas no ponto EcoRV do vector plasmídio p-Bluescript (pBS, comercializado por Stratagene, CA) e usadas para a sequenciação do ADN. A sequenciação do ADN foi executada utilizando-se o ADN do plas_ mídio que continha um enxerto clonado sob a forma de um mo dg lo ADN de cordão duplo e o método normal de sequenciação de finalização da cadeia.

Sequências representativas de imunoglobulina de macaco cinomólogo encontram-se representadas nas Figs. 9A - 9H. Incluída nas Figs. 9A - 9H encontra-se a sequência de aminoácido de consenso para os genes da região variável humana, que representa cada uma das famílias principais de genes da região variável. É representada a percentagem de homologia de cada uma das sequências de macaco com a sequência de consenso humana, excluindo as regiões de domínio constante e as regiões RDC. 0 nível de homologia entre as sequências humanas e de macaco para uma determinada família, é tão elevada como entre duas sequências humanas dentro dessa família. E por ig so impossível distinguir entre sequências de imunoglobulina

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 da região variável originária de macacos do Velho Mundo e as originárias de humanos, apenas com base em comparação de sequências .

Isolamento do ARN

Células B antigénio específicas de macaco foram obtidas de diversas formas: por fusão de cédulas de nódulos linfáticos de macaco imunizado quanto à linha de células associa das de fusão de heteromieloma humano/rato K5H6/B5 e subsquen te rastreio das linhas de hibridoma, por meio de células B transformadas viralmente, ou por meio de técnicas de clonagem de célula B simples in vitro. No último caso, o desenvol. vimento de uma célula B simples de macaco foi suportado in vitro por co-cultivação. com células T humanas que foram e£ timuladas por meio de anticorpos. Uma célula B simples foi colocada em cada uma das cavidades de um prato de cultura de tecidos de 96 cavidades, juntamente com aproximadamente 150.000 células T humanas estimuladas tratadas com mitomicina C estimulada anti-CD3. Após um período de incubação de duas semanas' ?, a célula B simples expandiu-se até pelo menos 200 células de plasma diferenciadas. 0 sobrenadante da cultu ra dessas cavidades, foi ensaiado para detecção^da presença de imunoglobulina, por meio da técnica ELISA, com utilização de um anticorpo de captura de cabra anti-imunoglobulina de maca co.

Células, tanto de células antigénicas específicas trans formadas viralmente como de hibridomas, foram desenvolvidas em número suficiente para a extração do ARN. As cavidades da técnica de clonação in vitro da célula B simples que eram positivas quanto à imunoglobulina, foram removidas, lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato de pH 7,5 e centrifugadas (10Õ0 x g 10 minutos). As células lavadas foram suspensas em lOOy/L de solução de lise (4 M de isocianato de guanidino, 25mM de citrato de sódio de pH 7,0, 0,5·% de sarco

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Docket η⁹ 198/158

sina de sódio, O,1M de 2- mercaptoetanol). ÍQ/CL de acetato de sódio 2M, pH 4,0, foram adicionados e misturados. A proteína foi removida por meio da adição de 100Λ 1 de fenol saturado com água, mis_ turando-se e juntando-se 20Λ1 de clorofórmio/álcool isoamíM co (49:1). Depois de se terem centrifugado e incubado em gelo durante 15 minutos, as amostras foraja centrifugadas a 10.000 x g durante 20 minutos. A fase aquosa foi transferida para um tubo novo, misturada com um volume igual de isopropa nol e incubada durante 1 hora a -20² C. 0 precipitado foi re colhido por centrifugação a 10.000 x g durante 15 minutos com etanol a 70% , recentrifãgado e o produto comprimido seco num Speedivac (Savant). 0 ARN seco foi redissolvido uma se gunda vez em 100Λ1 de tampão de lise. Um volume igual de is£ propanol foi adicionado e incubado a -20²C durante uma hora. 0 precipitado foi recolhido por centrifugação a 10.000 x g durante 15 minutos e lavado com etanol a 70%. 0 produto comprimido foi seco num Speedivac (Savant) e armazenado a 20² C em etanol a 7²% até à utilização.

Sintese do ADNc de cordão simples

ARN total extraído das células originadas numa única cavidade, foi dissolvido em 32Λ1 de água bi-destilada a que é adicionado 1.Λ1 (50-100 picomoles) de iniciador (indife^ rentemente, iniciadores hexâmeros aleatórios, oligo dT ou es pecíficos para a 3' imunoglobulina) e 10,41 de tampão de trans critase inversa 5* (0,25 de Tris-HCl pH 8,3, 0,375 M KC1, 15mM de MgCl₂, 50mM de ditiotreitol). A mistura foi aquecida a 65²C durante 5 minutos, após o que foi colocada em gelo du rante 2 minutos. Depois de aquecida foram adicionados, 1Λ1 de ARNsin (Promega), 5/£l de 5mM de trifosfatos de deoxinucle ótido, e 1Λ1 (200 unidades) de transcriptase de leucemia murina de Moloney (BRL) e a mistura foi incubada a 37²C durante 1,5 horas. Após terminar a reacção de transcriptase inver sa, a mistura de ADNc/ARN de cordão simples foi extraída com

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fenol/clorofórmio e passada através de uma coluna giratória de tal lml SEPHADEX G-25. 0 material que passou através da coluna foi usado como modelo ss do ADNc para amplificação RCP.

Amplificação do ADNc ss

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08

3-ΙΟ,ηΙ ss foram misturados com lCyi de tampão 10X RCP (500mM KC1, lOOmM de Tris-HCl pH 8,3. 15mM de MgCl₂), 1,6^1 de l,25mM de trifosfatos de deoxinucleótico, 50 picomoles de iniciador específico de imunoglobulina 5* , 50 .picomoles de iniciador específico da imunoglobulina 3¹ e 2-5 unidades de polimerase de ADN termostável (Synthetic Genetics). 0 volume da reacção foi trazido para 100_^l com água e coberto com 100/vl de óleo mineral. A mistura de reacção foi incubada às seguintes temperaturas, durante os tempos especificados.

94²C durante 1 minuto

48^QC durante 2 minutos

72² C durante 2 minutos

Este ciclo foi repetido 30-35 vezes. Os produtos ampH ficados foram examinados por meio de electroforese de gel de agarose, utilizando um geld® agarose a 1,2% e pesos molécula res normais. Os genes da imunoglobulina amplificada da região variável situam-se aproximadamenfê entre os marcadores dos 350-500 pb. Os produtos amplificados com RCP foram então uti^ lizados para clonação no vector plasmídio apropriado.

Exemplo 2: Clonação de Genes de anticorpo de Macaco

Dado que as sequências de genes da região variável do macaco, ao nível do ADNc,são indistinguíveis dos membros humanos da familia genética equivalente, as respostas imunes de macaco/humano, se as houver, é duvidoso que sejam diferen tes das montadas contra as moléculas de anticorpo humano.

A tecnologia da RCP pode ser usada para introduzir pon

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Docket n² 198/158

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 tos de restição de enzimas específicos, que incluem (sem a eles se restigirem) Sall, Bgill, Kpnl e Nhel, nas sequências da região variável do Velho Mundo durante a reacção de ampli ficação RCP, utilizando-se iniciadores baseados nos da Fig.6. Genes clonados pré-existentes foram amplificados a partir do seu vector .específico, utilizando-se esses iniciadores para introduzir o ponto de restrição específico, que foi posterior mente usado para clonar o gene num vector de expressão. Alternativamente, esses iniciadores usados para amplificar directamente a partir do ARN celular.

São de dois tipos os vectores de expressão que podem ser construídos. 0 primeiro (ver Figs. 3 e 4) permite que a imunoglobulina do ADNc clonada das regiões variáveis de maca cos, seja enxertada numa caixa vector, utilizando pontos de restrição únicos, em que os elementos do gene de imunoglobuli. na estão numa configuração genómica. Este tipo de vector incorpora um promotor de imuglobulina , fazendo os dois exões a sequência inicial da imunoglobulina, dois pontos de clonação Spel e Nhel, sequências dadoras encaixadas a jusante, una região melhoradora da imunoglobulina, um gene daregião constante humana (de cadeia pesada ou leva) e sinais da poli-ade nilação a jusante. Além disso, incluem uma origem ou replica ção bacteriana, um gene de beta-lactamase para a selecção bacteriana e um gene de fosfotransferease da neomicina para a selecção de G418, um gene transferease de fosforibosil xan tina-guanina (Ffg) para a selecção do ácido micofenólico em células de amífero. os vectores de expressão de cadeia pesada e leve utilizam fosfotransferease de neomicina (Neo) e gq nes de transferease de fosfiribosil xantina- guanina (Tfg), respectivamente, como o marcador seleccionável.

segundo tipo de sistema de expressão (ver Figs. 5 e 6) utiliza os genes da imunoglobulina numa configuração de ADNc. Ou seja, não se encontram presentes nenhum itrões nem pontos encaixados entre a sequência 5' inicial e as sequências 3’ da região constante, este tipo de vector -utiliza se30

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Docket n² 198/158

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Mod. 71 - 2'0.000 ex. - 90/08 quências promotoras/beneficiadoras virais heterólogas, genes accionadores de imunoglobulina de cadeia pesada ou leve arranjados em tandem, sequências de poliadenilação e um marcador selecionável de célula de mamifero (Neo). 0 gene Neo p£ de ser modificado para enfraquecer a sua translação, por exemplo, por meio da modificação do codão, a montante e adja. cente ao ponto de partida do gene, de ACC para TCT. Além dis. sç encontra-se presente um gene de redutase do dihidrofolato (rdhf) para subsequente amplificação genética com metitrexato . Genes da região variável da imunoglobulina de macaco a serem clonados em vectores de expressão configurados em ADNc, foram amplificados,a partir de sequências pré-existentes clonadas no vector de transporte (PBS), ou directamente a partir do ARN, com iniciadores contendo os pontos de restrição Sall ou MluI e Nhel, para a cadeia pesada, ou Bgll e Kpnl ou BsiWIpara as daceias leves Kapa ou lam bda. ostros pontos únidos de restrição potenciais não são,no entanto, excluídos.

Genes quiméricos de imunoglobulina de cadeia pesada ou leve foram introduzidos separada ou sequencialmente (para construções genómicamente configuradas), ou no mesmo vector por electroporação numa linha de células produtoras. A electrp poração foi usada para introduzir construções de ARN linear^ zado, em células ováricas de hamsteres chineses (OHC) ou em células de mieloma do rato, seguida por clonação de célula sim pies dos transfectantes em pratos de cultura de tecidos de 96 cavidades. As condições da electroporação, utilizando um aparelho de electroporação ΒΤΧ,-100 (BTX, san Diego) e uma cuvete de plástico descartável de lml, forneceu resultados óptimos quanto aos transfectantes de uma determinada quantidade de vector ADN. As células OHC que foram adaptadas para se desenvolverem em suspensão num meio sem soro (CHO-SSFM II menos hipoxantina e timidina, Gibco), foram usadas nas construções que continham elementos reguladores virais.

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Mod. 71 - 20.OCO ex. - 90/08

Sub-clonação de genes de Ig da região variável

Os produtos da reacção RCP foram extraídos com formol/clorofórmio e passados através de uma coluna giratória de lml de SEPHADEX G-25. Se o fragmento de ADN era para ser clonado de topo num plasmídio, adicionaram-se 1/1 de MgCl₂ 1M, 0,5 ml de trifosfatos de deoxinucleótido 1,25 mM e 1/1 de polimerase de ADN de Klenow (5 unidades) à mistura de reacção RCP total (100/1) e incubado a 37²C durante 15 minutos até se preencherem quaisquer apêndices 5' foram fosforiladas como segue; 5/.1 de ATP lOmM , lp-1 de quinase polinucleótido T4 (10 unidades) foram adicionados à mistura de reacção total e incubadas a 37²C durante 30 minutos. Fragmentos amplificados que continham pontos de restrição internos foram, pri meiramente, cortados com o enzima de restrição apropriado e usados directamente para a ligação sem fosforilação. Em ambcs os casos, o fragmento a ser clonado foi extraído com fenol/ /clorofórmio antes da ligação ao vector apropriado.

Para a reacção de ligação , misturam-se 10% do fragmento do enzima fosforilado ou de restrição cortado por RCP amplificado, com aproximadamente 2ng de vector apropriado (volume total 8/1) , préviamente digerido com o enzima ou en« zimas de restrição. Para a clonação de topo foi asado pBluescript digerido com EcoRV. Para clonação de extremidade clonada foi usado vector TCAE 5,2 ou 6,0 ou pGenex-H ou pGenexL, cortado com os enzimas de restrição apropriados, 1/1 de tampão de ligação 10X (500 mM de Tri-HCI pH 7,6 100 mM de MgCl₂, 10 mM de ATP, 10 mM de ditiotreítol) , 1/1 de ligase de ADN T4 (1 unidade) foi adicionado e a reacção foi deixada continuar a 14²C de um dia para o outro. 0 material ligado foi usado para transformar as células de E.coli HB101 competentes, utilizando-se o método normalizado de transformação por meio de cloreto de cálcio. As bactérias transformadas fo ram seleccionadas por desenvolvimento em placas de agar LB contendo ampicilina. As colónias individuais foram seleccionadas e desenvolvidas de um dia para o outro em meio LB con30

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 contendo ampicilina e plasmídio de ADN, extraído por meio da utilização do método normalizado de lise alcalina. Após a aná Lise de restrição para se determinar quais os cones que continham enxertos de imunoglobulina, o ADN foi preparado para sequenciação.

Sequenciação dos genes clonados

Os genes imunoglobulina da região variável clonados foram sequenciados utilizando-se um método normalizado de ter minação de cadeia. Plasmídio de ADN de cordão duplo, contendo o enxerto clonado, foi usado como modelo de sequenciação. Antes da sequenciação, o ADN de cordão duplo foi quimicamente desnaturado. 0 ADN foi sequenciado utilizando-se polimera. se de ADN T7 SEQUENASE (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH), deoxiATP alfa rádio-marcada e os seguintes iniciadores de sequenciação: (5' CAGAGCTGGGTACGTCCTCA 3’) E (5' GGCCCAGAGGTGCTCTTGG 3’) para a região variável da imunoglobulina G de cadeia pesada nas direcções 5' para 3' e 3' para 5', respectivamente. (5' CAGAGCTGGGTACGTGAACC 3'0) e (5' GGCTTGAACTCCTCAGAGG 3') para região variável da imunoglq bulina lambda de cadeia leve, nas direcções 5' para 3' e 3' para 5', respectivamente. Os produtos de reacção foram separados em geis de poliacrilamída a 6% e lidos.

Os resultados da sequenciação de um certo número de genes da região variável da imunoglobulina pesada e leve dos macacos do Velho Mundo estão resumidos nas Figs. 9A-9H. A cio nação e a sequenciação de genes da imunoglobulina de cinomólogo foram anteriormente descritas na literatura. Nem, portanto, foi possível definir o grau de homologia entre os genes da região V humana e do cinomólogo. A homologia entre o gene lambda variável simples do chimpanzé e sua contrapartida genómica humana foi descrita, apenas demonstrando uma diferença de 2% nas regiões de estrutura.

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08

Transfecção e selecção

Depois de se sequenciar os genes da região variável de cadeias pesada e leve clonadas, foram sub-clonadas em vec tores apropriados para expressão. Esses podem ser vectores construídos com elementos reguladores da imunoglobulina numa configuração genómica (conforme representado nas Figs. 3 e 4), ou com elementos reguladores virais utilizando uma confi guração ADNc (Figs. 5 e 6). Pontos de restrição apropriados (Spel e Nehl) podem ser designados nos iniciadores de amplificação RCP durante o passo de amplificação inicial, ou, inversamente, podem ser usados iniciadores de amplificação con tendo pontos de restrição para amplificar os genes da imunoglobulina dos vectores de transporte em que tiverem sido clç nados. Alternativamente, os genes da imunoglobulina da região variável podem ser clonados directamente em vectores de expressão depois da amplificação por RCP do ARN, de forma que a subclonação é desnecessária.

Electroporação

A electroporação foi usada tanto para co-transfectar as construções genómicas de cadeia pesada e leve, como para transfectar sequencialmente construções genómicas de cadeia pesada e leve em células Sp2/0. Nas transfecções sequenciais a electroporação da construção de cadeia leve quimérica foi seguida por selecção em ácido micofenólico. A pesquisa dos sobrenadantes das culturas dos clones, desenvolvidos em placas de 96 cavidades, para a produção de cadeia leve, com anti-soros contra cadeia ligeira da região constante humana por meio da utilização de uma técnica ELISA, permitiu a seleção dos clones que expresavam a cadeia leve mais elevada. A ele£ troporação subsquente dos transfectantes de cadeia leve com um vector contendo construções de imunoglobulina quimérica de cadeia pesada macaco/humana, permitiu a seleção de trans30

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Docket n²198/158

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 fectomas que expressavam o anticorpo quimérico dos desejados isotipo e especificidade.

A construção de cadeia leve pGENEX-L (Figs. 3 e 4) foi transfectado na linha celular Sp2/0 de mieloma murino, por meio de electroporação, como se segue. Células Sp2/0 na concentração de 1 x 10^/ml em tampão de transfecção (272 mM de sucrose, 7 mM de fosfato de sódio pH 7,4, 1 mM de MgCl_a), fo ram misturadas com 50 g de pGENEX-L contendo o gene clonado de cadeia leve apropriado, o qual tinha sido previamente ljL nearizado por digestão com o enzima de restrição PvuII. As células foram colocadas numa cuvete de espectrofotometria de plástico descartável de 1 ml e instalaram-se na cuvete eléctrodos de placa separados um do outro 3,5 mm. Utilizando-se um aparelho de transfecção BTX-100 (BTX,Inc.), foi aplicado às células um impulso de corrente durante 500 microsegundos, de modo que ocorresse a morte de aproximadamente 50% das células. Este valor foi determinado antes da transfecção por meio da aplicação dos impulsos com voltagens crescentes às células, na ausência de ADN e medição do número de células sobreviventes 24 horas mais tarde. Fez-se o traçado gráfico da voltagem em relação à viabilidade das células e a tensão correspondente à morte de 50% das células foi usada para todas as experiências subsquentes de electroporação. Utilizando-se o aparelho BTX-100 verificou-se que o valor óptimo era um impulso a uma amplitude de 200 para 500 microsegundos. De. pois submetidas a impulsos, deixaram-se as células recuperar em gelo durante 15 minutos, antes de serem transferidas para placas de cultura de tecidos de 96 cavidades, em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), contendo 5% de soro de feto de vitela e 10% de meio condicionado para Sp2/0. As células foram colocadas nas placas a uma concentração, à qual o desenvolvimento celular foi observado em aproximadamente 1 de cada 3 cavidades, após a selecção com o medicamento adequ£ do. Este parâmetro foi determinado para cada uma das experiências de electroporação, por meio da colocação em placa de

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Docket n⁹198/158

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 números variáveis de células electroporadas por cavidade (1000 - 10.000) e selecção das células que tinham incorporado o plasmídio. 0 número de cavidades em cada uma das placas, que mostrou desenvolvimento celular, foi contado após 2-3 s£ manas de selecção. Assim, o número apropriado de células que forneceram 1 em cada 3 cavidades positivas com uma dada con centração de um plasmídio particular, foi determinado para uso em futuras experiências.

Directamente depois da electroporação, as células foram colocadas num meio sem medicamento. Meio fresco, contendo, ou G418 ou ácido micofenólico, respectivamente para as células que apresentavam actividade de fosfotransferase de niomicina ou de fototransferase de guanasilo, foi adicionado dois dias depois da electroporação. As células foram alimentadas de dois em dois dias durante a primeira semana e depois duas vezes por semana. A concentração de medicamento a usar foi determinada por incubação das células na presença de aumentos da concentração de medicamento e vigiando a viabilida. de da célula. A concentração de medicamento utilizado foi du pia da que forneceu 100% de mortes. Para as Sp2/0 foi necessário aproximadamente 1 _^g de ácido micofenólico/ml e para as G418 aproximadamente 800J4 ug/ml.

As células foram electroporadas de diversas maneiras, tanto os vectores genómicos de cadeia pesada como os de cadeia leve (pGenex-H e pGenex-L) foram co-electroporados ou a cadeia leve foi electroporada isoladamente. Neste último caso, os clones foram pesquisados para a detecção da expressão de alto nível de imunoglobulina quimérica de cadeia leve, uti lizando-se uma técnica ELISA. Esses clones foram então desen volvidos e electroporados com um vector contendo cadeias pesadas. Quando se usaram construções de genes em tandem de ADNc, o vector de expressão (TCAE5,2 ou TCAE6) foi primeiramente linearizado por digestão com o enzima de restrição Notl. Uma única electroporação foi suficiente para se conseguir a integração tanto de genes de cadeias pesadas como das

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Docket n-198/158

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 leves. Passadas 2-3 semanas os sobrenadantes das cavidades que continuaram a desenvolver-se em presença do medicamento apropriado, foram ensaiados quanto à secreção de imunoglobulina quimérica de cadeia leve ou imunoglobulina total por meio de uma técnica ELISA. Os genes de imunoglobulina numa configuração de ADNc, foram electroporados fosse em células Sp2/0, conforme descrito acima, fosse em células do ovário de hamsteres chineses (OHC) adaptadas para se desenvolverem em suspenção num meio sem soro. As células OHC foram electroporadas por meio da utilização de um aparelho de eletroporação BTX 600, regulado em condições de se conseguirem números máximos de colónias de G418 resistentes. Essas foram 210 vóltios, 400JÍ F e 13 ómios. Após a electroporaçao, as células : foram contadas, lavadas em tampão de transfecção, ressuspensas no mesmo tampão e colocadas em gelo durante 15 minutos. As células foram ajustadas 1 χ 10? células vivas/ml e4oo1 de suspensão celular foram colocados numa cuvete estéril des_ cartável de 0,4 ml (BTX Inc.). 25j/g de vector de ADN Notyl linearizado TCAE 5,2 ou TCAE 6, contendo genes clonados da região variávél da imunoglobulina de macaco, foram ressuspen sos em tampão TE (10 mM de Tris, 1 mM de EDTA, pH 8,0) a 1J4 g/ml e adicionados à suspensão celular. A electroporaçao foi levada a efeito por meio da descarga do aparelho, com uti lização do botão automático de carga e impulso. A cuvete foi colocada em gelo durante 15 minutos, as células diluídas em 120 mis de meio sem soro e colocadas em seis placas de 96 ca vidades (200j/ 1 por cavidade, contendo aproximadamente 6.667 células télectroporadas ou 3.333 células vivas por cavidade). Foram estabelecidos parâmetros independentes de electroporação para esta linha de células e a selecção por G418 foi a 400 JU g/ml.

Pesquisa para a produção de anticorpo

A presença de anticorpo humano, de macaco ou quimérico, segregado pelos transfectantes, foi ensaiada por meio de

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 uma técnica ELISA, como segue: placas de fundo raso de 96 cavidades (Dynatech) foram revestidas com TgG ou Kapa anti-humana de cabra a 200 ng/cavidade em Tampão de RevestimetLto (carbonato de sódio 0,8 mg/ml, bicarbonato de sódio 1,55 mg/ml, pH 9,6) e incubadas durante pelo menos 16 horas a 4²C. 0 tampão de revestimento foi removido e as cavidades bloqueadas com 120j/L de Tampão de Bloqueio (1% de albumina de soro bovino em solução salina tamponada com fosfato contendo 0,2% de azeto de sódio) e incubada a 37²C durante 1 ho ra . Até 125^1 de sobrenadante de cultura celular foram adicionados às cavidades que continham tampão de bloqueio e incubadas 2 horas a 37²C. As placas foram então lavadas cinco vezes com STF (salina tamponada com fosfato). 100J£1 de peroxidase de rábano silvestre-IgG (ou capa) anti-humana marcada de cabra, diluída a 1:1000 a 1:5000 em Tampão de Diluição (1% de albumina de soro bovino, 0,05% de Tween-20, 0,02% de azeto de sódio em STF) foram adicionados. As placas foram incubadas a 37²C durante 1 hora, depois lavadas cinco vezes com STF. 0 anticorpo quimérico foi detectado com 100j/l de pé roxido de hidrogénio e o substrato, 3,3', 5,5'- tetrametilbenzidina (1:1 v/v) por cavidade. A reacção de côr foi termi nadapassados 2 a 5 minutos com 100ji/l de ácido sulfúrico 2M por cavidade.

Os técnicos do ramo podem fácilmente executar metodologia equivalentes às acima descritas. Bxemplos de tal teclogia incluem a imortalização de células por meio de hibridoma de fusão, conforme acima descrito, com a linha de células KSH6/B5 descrita por Carroll e al., 164 J.Experimental Medicine 1566, 1986, ou linha de células equivalente, tal co mo a SPAZ4 (fornecida por Sandoz, ver, Ehrlich e al., 34 Clin. Chem. 1681, 1988). linhas de células semelhantes podem ser fácilmente construídas por meio de técnicas normalizadas, com utilização de metologia públicamente disponível. Alternativamente, os genes da imunoglobulina podem ser clonados a partir de: (a) células imortalizadas por transformação vi30

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 ral com Herpes papio, conforme descrito por Markova e al., 30 Voor Virusol 549, 1985, ou comumvirus equivalente, (b) por clonação de célula B simples para proporcionar uma imortalização transitória, conforme descrito por Amaroso e Lipske 145 J.Immunology 3155, 1990, ou (c) por meio da utilização de livrarias de um bacteriófago recombinante de imunoglobuli na, conforme descrito por Huse e al., 246 Science 1275, 1989 e McCafferty e al., 348 Nature 552, 1990. A pesquiza do anti corpo contendo clones apropriado pode ser executada por meio das técnicas acima descritas, ou técnicas equivalentes bem conhecidas dos técnicos do ramo e o gene de imunoglobulina desejado pode ser extraído da linha de células imortalizadas. Além disso, o anticorpo produzido pelas células B isoladas de macaco, pode ser usado em terapia humana sem manipulação para formar um anticorpo quimérico.

A região constante humana pode ser obtida por técnicos normalizados, com qualquer isotipo que se deseje, bem conhecido dos técnicos do ramo e a região variável de um anticorpo de macaco ser ligada a essa região constante humana. Anticorpos quiméricos particularmente úteis contra receptores superficiais celulares específicos, que podem ser usados na imunoterapia dos humanos, incluem CD4, ICAMs, CD19, CD20, CDS, CDlla, CDllb. CD28, CD18, CD45, CD71, e TCR.

Exemplo 3: Clonação e Expressão de um Anticorpo Quimé rico Macaco/Humano sem Especificidade para o CD4.

que se segue é um exemplo específico dos métodos e anticorpos desta invenção.

Geração de Linhas de Células B imortalizadas de Macacc

Um macaco cinomólogo adulto (White Sands New México Primate Center) foi imunizado intramuscularmente, em pontos múltiplos, com 15O-3OO^g de CD4 solúvel (CD4s) ou membranas celulares (1* 10θ células) da linha de células CD4 positiva

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supTl, utilizando um auxiliar normalizado. A imunização foi repetida todas as 2-3 semanas , num total de seis vezes. 0 macaco foi forçado por meio de uma injecção de 100 jig de CD4í na região inguinal de uma coxa e uma semana mais tarde o nódulo linfático de drenagem da mesma coxa foi removido cirúrgicamente. Os linfócitos foram removidos do nódulo linfático por meio da separação do tecido e lavagem com meio MEMD (Meie de Eagle Modificado por Dubecco). a suspensão celular foi pas sada através de uma gaze de naylon e recolhida por centrifugação a 1000 x g durante 10 minutos. 8

Aproximadamente 1 x 10 ,. ..

lmfocitos tampão de cloreto de Tris-amónio (16 mM, foram suspensos em pH 7,5) e aquecido até 37²C durante 5 minutos para a lise dos eritrócitos . Os

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 linfócitos foram recolhidos por centrifugação e ressuspensos em ester de metil leucina-L (EML) e incubados a 37²C du rante 45 minutos. As células tratadas com EHL foram filtra20 das através de uma tela de naylon e centrifugadas. Adicionou se 1 ml de soro de feto de vitela e as células foram suspensas e lavadas duas vezes com RPMI sem soro. As células foram contadas e misturadas num único tubo centrífugo cónico de 50 ml, juntamente com o número igual de células de heteromieloma K6H6/BS, préviamente lavados duas vezes em meio sem soro. As células foram cuidadosamente suspensas em 1 ml de PEG a 50% (polietileno glicol) adicionado lentamente com agitação suave durante um período de 1 minuto. As células foram então ressuspensas por meio de adição de 20 ml de meio sem soro, ao longo de umperíodo de 5 minutos, com mistura suave para diluir o PEG. Depois de serem lavadas duas vezes com meio de soro, as células de novo suspensas a uma concentração de 5 χ 10⁵/0,l ml em meio de RPMI, contendo 20% de soro de feto de vitela e gentamicina e colocadas em placas de cultura de micro-tecidos de 96 cavidades a 0,1 ml por cavidade. Um volume igual de meio HAT (0,1 ml) foi adicionado a cada uma das ca vidades e os híbridos foram deixados desenvolver durante 1430

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Pesquisa de Híbridos de Célula Fundida para a produção de Anti-CD4

-17 dias antes da pesquisa.

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 ensaio para determinar a especificidade anti-CD4 foi como se segue: placas ELISA foram revestidas com CD4s recombinante a uma concentração de 100 ng por cavidade e bloquedas com 1% de albumina de soro de bovino em STF. 50 Jd 1 de aliquotas de sobrenadante de hibridosa foram removidas de ca da uma das cavidades e deixadas incubar com as placas revestidas com CD4s durante 60.minutos. A fixação foi detectada por incubação com Ig anti-humana de cabra ou anti-macaco de ca125 bra marcada com I durante 60 minutos. Depois de serem lavadas quatro vezes com água destilada, as cavidades foram me didas com um contador gama. As cavidades positivas foram reensaiadas em duplicado e as células de hibridoma dessas cavidades foram sub-clonadas tres vezes , primeiro a 5 células por cavidade e depois, duas vezes, a 1 célula por cavidade. Nesta fase, as cavidades positivas quanto ao anti-CD4s foram pesquisadas quanto à capacidade para fixarem CD4 à super fície da célula. Isso foi feito por meio de inibição da fixa ção de um anti-CD4 murino monoclonal, denominado 1F3, à linha de células, positivas quanto ao CD4, supTl. Em resumo, isso foi feito por meio da co-incubação de diferentes quantidades

125 de anti-CD4 de macaco e lOng de 1F3 marcado com I, com x l²^ células supTl/cavidade, numa placa de 96 cavidades. Após a incubação durante 1 hora à temperatura ambiente (cerca de 20-250C) as células foram removidas por vácuo para o interior de filtros de fibra de vidro. Depois de lavagem extensiva com STF, os filtros foram submetidos a medição num contador gama, para se determinar qual a inibição da fixação de 1F3 às células supTl pelos sobrenadantes do hibridoma de macaco.

Foi escolhido um clone candidato, que produziu um an34

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Mod. 71 -20.000 ex.-90/08 ticorpo que apresentou uma inibição forte em relação ao 1F3. 0 clone escolhido foi isotipado utilizando-se reagentes humanos de isotipia e verificou-se que era uma IgG2 que possuía uma cadeia leve lambda. Esta linha de células foi desen volvida até se obterem números maiores para a clonação dos seus genes de imunoglobulina.

Clonação de Genes da Região Variável de Cadeia Pesada e Leve de Células B Imortalizadas de Macaco

ARN total foi isolado de 1 χ 10 células B imortalizadas de macaco, utilizando-se o método do isotiocianato de guanidínio acima descrito. Um décimo do ARN foi usado para produzir um ADNc de cordão simples, utilizando-se um iniciador de oligonucleótido oligo-dt e transcriptase inversa, também conforme descrito acima. Um décimo da quantidade, de ADNc ss foi usada para estabelecer as reacções RCP. Cada uma das seis reacções RCP incluiu uma de seis iniciadores de oli nucleótidos específicos quanto à família 5' contendo um ponto de restrição Sal I, juntamente com um oligonucleótido da região constante da IgG 3' contendo um ponto Nhe I, ambos representados na Figura 7-1. Similarmente, cinco reacções RCP utilizando um de cinco iniciadores oligonucleótidos de sequência lambda inicial 5' contendo um ponto Bgl II e um iniciador da região constante lambda 3' contendo um ponto Avr II, foram efectuadas. As condições de reacção foram con forme aeima descrito. Cada uma das reacções RCP foi efectua 'J da em triplicado 0s produtos de cada uma das reacções de am plificação de cadeia pesada e de cadeia leve foram executadas em geis de agarose a 1,2%. 0 iniciador de cadeia pesada VH4 (Seq. Id N² 13: 5' ACTAAGICGACATGAAACACCTGTGGTTCTT 3') e iniciador lambda (Seq.Id.N²:14: 5' ATCACAGATCTCTCACCATGAC CTGCTCCCCTCTCCTCC 3 ' ) deram bandas fortes na e.lectrof orese em gel de agarose. Os produtos dessas reacções foram usadas para clonar no vector TCAE 6, que contém sequências de IgG e da região constante lambda humana.

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A clonação dos genes das duas regiões variáveis no vector de expressão TCAE 6 foi feita sequencialmente. Em primeiro lugar,o produto da RCP de cadeia pesada e o vector TCAE 6 foram digeridos com os enzimas de restrição Sal I e Nhe I, os produtos extraídos com fenol/clorofórmio e passados através de uma coluna giratória SEPHADEX G-25. 0 produto da RCP foi ligado ao vector de corte de um dia para o outro a 14²C, em presença de ligase de ADN T4. Aproximadamente 500 ng do ADN total foram ligados num volume de lOjjíl, com uma proporção molar enxerto/vector de 10:1. 0 material foi usado para transformar as competentes células Blue XL-1(Stratagene) e as células transformadas foram colocadas em placas de agar LB contendo 50qg/ml de ampicilina. As colónias de bactérias resistentes à ampicilina foram recolhidas e desenvolvidas sob a forma de miniculturas de 5 ml. 0 ADN do plasmídio foi extra ído de cada uma dessas culturas por meio de um método normalizado de lise alcalina, cortado com os enzimas de restrição Sal I e Nhe I e os produtos passados num gel de agarose a 1,2%. 0s plasmídios com enxertos de aproximadamente 450 pb, foram utilizados como modelos para a clonação subsquente das regiões variáveis de cadeia leve. Os produtos da região RCP de cadeia leve, bem como o plasmídio que continha o enxerto de cadeia pesada, foram cortados com os enzimas de restrição Bgl II e Avr II e ligados uns aos outros. As miniculturas de plasmídio foram pesquisadas por meio de corte com Bgl II e Avr II. As digestões que forneceram um enxerto de aproximada, mente 400-450 pb foram classificados como positivos. Os plajs mídios contendo simultaneamente enxertos Sal I/Nhe I e Bgl II/Avr II foram desenvolvidos em maiores quantidades para a sequenciação do ADN.

Os vectores de expressão dos tandens de anticorpos qui méricos TCAE 5,2 e TCAE 6 foram derivados do vector CLDN,que ele próprio é um derivado do vector RLDNlOb (253 Science 77-79, 1991). 0 RLDNlOb, por sua vez, é um derivado do vector de expressão TND (7 DNA 651-661, 1988).

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RLDNlOb difere do vector TND da seguinte maneira. A caixa transcritiva (promotor, ADNc e região de poliadenilação) da redutase de dihidrofolato (RDHF) foi colocada entre a caixa activadora do tecido plasminogénio ( caixa de expres são AP-t) e a caixa da fosfotransferase da neomicina (NEO), de modo que as três caixas se encontrassem em tandem e com a mesma orientação transcritiva. Além disso, o promotor genéti co RDHF em CLDN foi substituído pelo promotor principal da globina beta do rato (3 Mol.Cell.Bíol. 1246-54, 1983) e o ADNc do AP-t foi substituído por um poli-encadeador. As três caixas transcritivas eucarióticas (Expressão, RDHF, NEO) podem ser separadas do ADN do plasmídio bacteriano (derivado pUC9) por digestão com a endonuclease de restrição Notl.

CLDN difere do RLDNlOb porque o LTR de Rous, na frer te do poli-encadeador, foi substituído pelo intensificador do promotor genético precoce imediato do citomegalovirus humano (41 Cell, 521, 1985).

Os vectores de expressão TCAE 5,2 e TCAE 6 diferem do CLDN por:

1) Conterem quatro caixas transcritivas (em vez de três), numa ordem em tandem:

(a) Uma região constante de imunoglobulina humana de cadeia leve, derivada por meio de amplificação do ADNc por meio de uma reacção de cadeia de polimerase. No TCAE 5,2 esta é a região constante kapa de imunoglobulina humana de cadeia leve (numeração de aminoácidos de Kabat 108-214, aloti po Km3) e no TCAE 6 a região constante lambda da imunoglobulina humana de cadeia leve (numeração de aminoácidos de ICábat 108-215, genotipo =z menos, menos Mcg, alotipo I<e menos).

(b) Uma região constante de imunoblobulina humana de cadeia pesada; em ambas as construções a imunoglobulina humana de cadeia pesada foi uma região constante gama 1 (numeração de aminoácidos de Kabat 114-478 alotipo Gmla, Gmlz), que foi derivada por meio de amplificação de ADNc por uma reacção de cadeia de polimerase.

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 (c) RDHF; contendo os seus próprios promotor eucariótico e região de poliadenilação.

(d) NEO; também contém os seus próprios promotoi eucariótico e região de poliadenilação.

3) As caixas de imunoglobulina humana de cadeias leves e pesadas contêm fixadores de ADN específicos que per mitem a inserção de regiões variáveis de imunoglobulina pesada e leve que mantêm o quadro de leitura transcritiva e não alteram os aminoácidos normalmente encontrados nas cadeias de imunoglobulina. A incorporação das modificações des_ critas, leva à construção dos vectores TCAE 5,2 e TCAE 6. A clonação dos genes da região variável da imunoglobulina de cadeia leve e pesada, da linha de células E9,1 do hetero-hi bridoma anti-CD4, no TCAE 6 levou à construção que se encon tra depositada no ATCC. A construção, que foi depositada, contém a região variável da imunoglobulina de cadeia pesada do macaco cinomólogo e a região variável da imunoglobulina de cadeia leve do macaco cinomólogo, cujas sequências são mostradas nas Figuras 13 e 14, respectivamente, clonadas da linha de células E9,1 de hibridoma anti~CD4. A região constante de cadeia pesada é de origem humana, do isotipo gama 1 e dos alotipos Gmla, Gmlz. A região constante lambda de cadeia leve é também de origem humana, do genotipo Oz menos, mcg menos e do alotipo Ke menos. Os genes da imunoglobulina são clonados no vector de expressão de mamíferos TCAE 6, representado na Figura 6, que, quando electroporado na linha de células de mamíferos OHC, produziu um anticorpo quimérico anti -CD4 macaco/humano. A construção de ADN aqui descrita, foi usada para transformar a estirpe bacteriana Blue XL-1, seleccionada na ampicilina antibiótica e depositada como uma suspensão celular bacteriana em meio estéril LB contendo 15% de glicerol.

Outro sistema de expressão útil é um em que o gene que codifica um marcador selectivo é modificado para melhorar o rendimento de sistemas recombinantes que codificam uma

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 sequência desejada. Por exemplo, o prejuizo da iniciação da translação de um marcador seleccionável dominante, resulta em menos colónias resistentes aos medicamentos, quando comparado com um vector não prejudicado, mas cada uma das colónias individuais expressa níveis significativamente mais altos de produto genético co-encadeado do que no vector não prejudicado. Por exemplo, a iniciação da translação do gene da fosfotransferase da neomicina (gene da resistência G418) foi modificado, de um Kozak de consenso (sequência -ccAccATGG) para um Kozak fraco (sequência-ccTccATG). 0 prejuizo da ini_ ciação translativa do gene de resistência G418 resultou em: 1) uma redução significativa (5 vezes) do número de colónias resistentes G418, obtidas da mesma quantidade de plasmídio ADN transfectado por célula e 2) um aumento significativo da quantidade de produto genético co-encadeado, expresso em cada clone. Nos casos clones que continham o Kozak de consenso_? 73% das colónias pesquizadas produziriam menos de 25 ng/ml, com apenas 3% a produzirem mais do que 100 ng/ml. Para os clones com o Kozak alterado , mais fraco, 8% das colónias pesquizadas produziram menos do que 25 ng/ml, em comparação com 63% das colónias que produziram mais do que 100 ng/ml. Especificamente, com referencia à Fig.16 (onde o TCAE 5,2 tem um kozak de consenso e o TCAE 12 tem um Kozak inferior) 258 colónias foram derivadas de 2 electroporações de 25^g de ADN que contêm, um gene de fosfotransferase de neomicina com um ponto de translação de consenso (não modificado). 201 dessas colónias (78%) não expressaram quaisquer produtos genéticos detectáveis (isto é, <25 ng/ml de imunoglobulina quimérica) e apenas 8 colónias (3%) expressaram mais do que 100 ng/ml. 98 colónias foram derivadas de 6 electroporações de 25/4ug de ADN que contêm o gene da transferase de neomicina com um ponto de partida da translação alterado. 63% dessas colónias estavam a expressae mais do que 100 mg/ml e apenas colónias expressaram menos do que 25 ng/ml.

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Sequênciação do ADN

ADN do plasmídio foi preparado a partir de culturas de 100 ml. Foi depois purificado por precipitação (1 volume) com uma mistura de 2.5M de cloreto de sódio e 20% de polieti ⁵ “ leno glicol (6 volumes) em gelo,durante 15 minutos. Após cen trifugação a 10.000 x g durante 20 minutos, o resíduo foi lavado com etanol a 70%, recentrifugado e seco num Seedivac (Savant). 0 resíduo de ADN foi ressuspenso em água desionizada numa concentração de 150- 250/<g/ml. A sequência foi levada a efeito em 5/g de ADN de cordão duplo, utilizando-se a técnica de Sanger. Foram utilizados os iniciadores de sequen ciação que eram homólogos às sequênias internas do vector de expressão, a montante e a jusante dos enxertos, tanto de cadeia leve como de cadeia pesada. Os enxertos foram sequencia.

dos tanto nas direcções 5' a 3' como nas 3' a 5'. Dois clones de cadeia leve anti-CD4 e dois clones de cadeia pesada anti-CD4, gerados cada um deles de reacções RCP separadas , foram sequenciados paralelamente , a fim de se determinar se determinar se alguma modificação nucleótida havia sido intro

Λ duzida durante a reacção RCP. Ambos os clonos escolhidos de cadeia pesada e ambos os de cadeia leve, revelaram ser idênticos em todo o seu comprimento, confirmando que nenhuns erros haviam sido introduzidos durante o processo de amplificação. A sequência das cadeias anti-CD4 pesada e leve estão ⁵ representadas nas Figuras 13 e 14 e nas Listagens de Sequências N² 15 e 16.

Expressão de Anti-CD4 Quimérico de Macaco/Humano

Os vectores de expressão TCAE 5,2 e TCAE 6, não só po_ dem ser usados para a expressão estável e integrada na linha de células Sp/O e CHO como, porque incluem a origem SV40 podem também ser expressos trasitoriamente na linha de células COS. A expressão das células COS foi efectuada como segue as células COS foram semeadas um dia antes da transfecção,

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 de forma a que estivessem 50-70% confluentes no dia seguinte 0 meio de cultura foi removido e as células lavadas duas vezes com Tampão de Transfecção (TT - 140 mM NaCl, 25 mM Tris, 5 mM de KC1, 0,5 mM NazHPO^, 1 mM MgCl_â lmM CaCl₂ ).//30 g de plasmídio de TCAE 6 purificado com cloreto de césio, contendo o anti-CD4 quimérico humano/macaco de cadeias de imonoglo bulina pesada e leve, foram misturados com 3ml de dextrano DEAE por prato (i mg/ml em TT). 0 ADN foi deixado incubar com as células durante 1 hora a 37²C. A solução de ADN foi removida e recolocado um 3ml de glicerol a 20% durante 1,52.5 minutos, apds o que as células foram lavadas duas vezes comTT. As células foram incubadas em Sml de meio fresco contendo 100 uM de cloroquina durante 3-5 horas a 37²C, após o que foram lavadas duas vezes com meio e incubado com MEMD du rante 72 horas. 0 sobrenadante (100/(1/ das células COS trans fectadas foi ensaiado a diversas diluições para detecção do anticorpo por meio de uma técnica baseada na ELISA, lambda de cabra anti-humana foi utilizada para revestir placas de ensaio de 96 cavidades e usou-se uma IgG anti-humana de cabra marcada com peroxidase como anticorpo de detecção, sob condições ELISA normalizadas, verificou-se que as células COS produziram entre 10 e 40 gn/ml de anticorpo quimérico humano/macaco. Volumes maiores de sobrenadante foram concentrados 10 vezes e usados num ERI (ensaio radio-imonológo) de fixação directa a células supTl positivas quando ao CD4. 0 anticorpo parental completo de macaco e uma imunoglobulina humana irrevelante foram usados, respectivamente, como controlos positivo e negativo (Fig.11). Além disso, o anti-CD4 de macaco e o anti-CD4 quimérico macacao/humano, foram usados para inibir a fixação de um anticorpo anti-CD4 de rato de alta afinidade (1F3) (Fig.12). Pode ver-se que o anticorpo recombinante macaco/humano (ATCC N²______), não só se fixa às células positivas quanto ao CD4, como consegue inibir a fixação do 1F3 às células positivas quanto ao CD4, aproximadamente às mesmas concentrações do anticorpo completo de ma30

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 caco ou do proprio 1F3.

que se segue é um exemplo dos métodos e anticorpos de acordo com a presente invenção.

Exemplo 4: Geração de Anticorpos de Macaco Contra Antigénios de Linfócitos Humanos

Um macaco cinomólogo adulto (White Sands New México Primate Center) fói imunizado intramuscularmente, gm pontos 8 múltiplos, com 5 ^x 10 de linfócitos humanos positivos quanto ao CD54. As células usadas foram, alternadamente, células SB (linha B humana) e linfócitos periféricos humanos activados, activados por pré-incubação com uma mistura de mitogénio de erva dos cancros (2,5 mg/ml), monoacetato de forbol (40nM) e fito-hemaglutinina(4 mg/cavidade) com a inclusão de um auxiliar normalizado. A imunização foi repetida em cada 2-3 semanas, ao longo de um periodo de 8 meses. 0 soro dos animais imunizados foi pesquisado em diversas alturas por meio da inibição da fixação de um anticorpo murino, 84H10, que se sabe que se fixa ao ICAM-1. Uma quantidade saturante de 84H10 foi ligada a células de ovário de hamsteres chineses (OHC), préviamente transfectadas com um vector de expres são contendo ADN-c CD54 humano e escolhido pela elevada espressão do CD54 da superfície celular, juntamente com dilui ções crescentes de macaco. A inibição da fixação 84H10 está representada na Fig.15.

Outros anticorpos monoclonais murinos que reconhecem os antigénios linfócitos humanos, foram ensaiados por meio de inibição, utilizando-se soros de macaco obtidos pelos mes mos métodos de imunização.

Utilização

Os anticorpos produzidos de forma acima descrita, ou por meio de técnicas equivalentes, podem ser purificados por

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Mod. 71 -20.000 ex. - 90(08 uma combinação de cromatografia de afinidade e de exclusão de tamanho, para caracterização em ensaios biológicos funcic nais. Esses ensaios incluem a determinação da especificidade e afinidade de fixação, bem como uma função efectora associada ao isotipo expresso, por exemplo, ADCC, ou fixação complementar. Tais anticorpos podem ser usados como agentes terapêuticos passivos ou activos contra um certo número de doenças humanas, incluindo linfoma da célula B, doenças infecciosas, incluindo a SIDA, doenças auto-imunes e inflamatc rias e transplantação. Os anticorpos podem ser usados, ou ns sua forma nativa ou como parte de um complexo anticorpo/quelato, anticorpo/medicamento ou anticorpo ou anticorpo/toxina, Adicionalmente, anticorpos completos ou fragmentos de anticorpo (Fabz. Fab. Fv) podem ser usados como reagentes formadores de imagens ou vacinas potenciais ou imunogénios, em imunoterapia activa, para a geração de respostas anti-idiotípicas.

A quantidade de anticorpo útil para produzir um efeito terapêutico, pode ser determinada por meio de técnicas nor malizadas, bem conhecidas dos técnicos do ramo. Geralmente, os anticorpos serão fornecidos pela técnica normalizada num tampão farmaceuticamente aceitável e podem ser administrados por qualquer via desejada. Devido à eficácia dos anticorpos que aqui se reivindicam e à sua tolerância pelos humanos, é possível administrarem-se estes anticorpos repetitivamente, a fim de se combaterem diversas doenças ou estados doentios de um ser humano.

Os anticorpos recombinantes anti-CD4 (ou seus fragmen tos) da presente invenção, são também úteis para induzir a imuno supressão, isto é, para provocarem a supressão de um sistema imune de um humano ou de um animal. Esta invenção re fere-se, portanto, a um método para se provocar, profilática ou terapeuticamente, a imuno supressão, num ser humano ou ou tro animal que o necessite, por meio da administração de uma quantidade eficaz, não tóxica de um tal anticorpo de acordo

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Docket n²198/158

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 com a presente invenção, a esse humano ou outro animal.

A capacidade dos compostos da presente invenção para induzirem a imuno supressão, pode ser demonstrada em ensaios normalizados, utilizados com esse fim, por exemplo, um ensaio misto de reacção linfócita ou um ensaio que meça a inibição da proliferação das células T, medida por meio da absorção da timidina.

facto de os anticorpos da presente invenção terem utilidade na indução da imuno supressão, significa que são úteis no tratamento ou prevenção da resistência aos ou rejei. ção dos orgãos ou tecidos transplantados (por exemplo, rim, coração, pulmão, medula óssea, pele, córnea, etc.); o tratamento ou prevenção das doenças auto-imunes, inflamatórias, proliferantes e hiper-proliferantes e de manifestações cutâneas de doenças medicadas imunológicamente (por exemplo,artrite reumatóide, lupus eritematoso, lupus eritematoso sistémico, tiróidite de Hashimoto, esclerose múltipla, mistenia grave, diabetes do tipo 1, uveite, síndroma nefrótico, psoriase, dermatite atópica dermatite de contacto e outros dermatites , dermatite seborreia, Lichen planus, pemplugus, pemphigus bolhosa, epidermólise bolhosa, urticária, angio-edeamas, vasculitídes, eritema, eosinófilias cutâneas, alopecia areata etc); o tratamento de doença obstrutora das vias respiratórias reversível, inflamações intestinais e alergias (por exemplo, doenças celíacas, proctite, gastroenterite eosinofila, mastocitose, doença de Crohn e colite ulcerante) e alergias relacionadas com os alimentos (por exemplo, enxaqueca, rinite e eczema).

Um técnico do ramo será capaz, por experimentação de rotina, de determinar qual será a quantidade não tóxica, de anticorpo, para provocar a imuno supressão. No entanto, geralmente, uma dosagem eficaz situar-se-à entre cerca de 0,05 e 100 miligramas por quilograma de peso corporal, por dia.

Os anticorpos (ou seus fragmentos) da presente invenção deverão sertambém úteis para o tratamento de tumores nos

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 mamíferos. Mais especificamente, eles deverão ser úteis para reduzir o tamanho do tumor, inibir o crescimento do tumor e/ou prolongar o tempo de sobrevivência de animais portadores de tumores. Consequentemente, esta invenção refere-se também a um método de tratamento dos tumores em humanos e outros animais, por meio da administração a tais humanos ou animais, de uma quantidade eficaz, não tóxida, de um anticorpo. Um técnico do ramo será capaz de, por meio de experimentação de rotina, determinar qual será uma quantidade eficaz, não tóx£ da, de anticorpo,para fins de tratamento de tumores carcinogénicos. Geralmente, porém, espera-se que uma dosagem eficaz se situe entre os limites de cerca de 0,05 a 100 miligramas por quilogarma de peso e por dia .

0s anticorpos de acordo com a invenção, podem ser administrados <a um humano ou outro animal de acordo com os métodos de tratamento anteriormente mencionados, numa quantidade suficiente para produzir tal efeito num grau terapêutico ou profilático. Tais anticorpos de acordo com a invenção podem ser administrados a esse humano ou outro animal numa forma de dosagem convencional, preparada por combinação do anticorpo da invenção com um veículo ou diluente farmacêutico aceitável convencional, de acordo com técnicas conhecidas, Um técnico do ramo reconhecerá que a forma e o carácter do veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, é ditado pela quantidade de ingrediente activo com o qual deverá ser combinado, pela via de administração e outras variáveis conhecidas .

A via de administração do anticorpo (ou seu fragmento) da invenção pode ser oral, parentérica, por inalação ou tópi ca . 0 termo parentérica, conforme aqui utilizado, inclui a administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, rectaX vaginal ou intraperitoneana. As formas subcutanêa e intramus cular da administração parentérica são geralmente preferidas.

Os regimes de dosagem parentérica e oral diária, para o emprego dos compostos da invenção na indução profilática

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Docket n²198/158

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 ou terapêutica da imuno supressão, ou para tratar terapeuticamente tumores carcinogénicos, situar-se-á geralmente entre os limites de cerca de 0,05 a 100, mas preferivelmente cerca de 0,5 a 10 miligramas por quilograma de peso corporal e por dia.

anticorpo de acordo com a invenção pode também ser administrado por inalação. Por inalação quer-se significar a administração por inalação intranasal ou oral. Formas de dosagem apropriadas para tal administração, tais como uma for mulação de aerossol ou um inalador de dosagem medida, podem ser preparadas por técnicas convencionais. A quantidade de dosagem preferida de um composto de acordo com a invenção a ser empregue, situa-se geralmente dentro dos limites de cerca de 10 a 100 miligramas.

anticorpo de acordo com a invenção pode também ser administrado topicamente. Por administração tópica quer-se significar a administração não sistémica e inclui a aplicação de um anticorpo (ou seu fragmento) composto de acordo com a invenção, externamente, na epiderme, na cavidade bocal e por instilação de tal anticorpo no ouvido, olho e nariz e onde não penetre significativamente na corrente sanguínea. Por administração sistémica quer-se significar a administração oral, intravenosa, intraperitoneana e intramuscular. A quantidade de um anticorpo necessária para efeito terapêutico ou profilático variará, evidentemente, com o anticorpo es colhido, a natureza e gravidade do estado a ser tratado e do animal a ser submetido ao tratamento e está, em última análise, sujeita ao critério do médico. Uma dose tópica adequada de um anticorpo de acordo com a invenção, situar-se-á geralmente entre os limites de cerca de 1 a cerca de 100 miligramas por quilograma de peso corporal e por dia.

Formulações

Embora seja possível que um anticorpo ou seu fragmen35

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Docket n⁹198/158

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 to seja administrado isoladamente, é preferível apresentá-lo sob a forma de uma formulação farmacêutica. 0 ingrediente activo pode constituir, para administração tópica, entre 0,001% e 10% p/p, por exemplo, entre 1% e 2% em peso da formulação, embora possa constituir até 10% p/p, mas preferível mente não mais do que 5% p/p e mais preferivelmente 0,1% a 1% p/p da formulação.

As formulações tópicas de acordo com a presente inven ção, compreendem um ingrediente activo, juntamente com um ou mais veículos aceitáveis para isso e, facultativamente, quais quer outros ingredientes terapêuticos. 0 veículo ou veículos devem ser aceitáveis, no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação e não serem nocivos pare o respectivo receptor.

As formulações adequadas para administração tópica incluem preparações líquidas e semi-líquidas adequadas para a penetração através da pele, para o ponto onde o tratamento é necessário, tais como linimentos, loções, cremes, unguentos ou pomadas e gotas adequadas para administração no olho, ouvido ou nariz.

Gotas de acordo com a presente invenção podem ser cons tituídas por soluções ou suspenções aquosas ou oleosas estéreis e podem ser preparadas por meio da dissolução do ingrediente activo numa solução aquosa adequada, de um agente bactericida e/ou fungicida e/ou conservante adequado e incluindo, de preferência, um agente tênsio-activo. A solução resultante pode então ser clarificada por filtração, transferida para um recipiente adequado, o qual é então fechado e esterilizado em autoclave ou mantendo-se a 90⁹-100²C durante meia hora Alternativamente, a solução pode ser esterilizada por filtra ção e transferida para o recipiente por meio de uma técnica asséptica. Exemplos de agentes bactericidas e fungicidas ade^ quados para inclusão nas gotas, são os nitrato ou acetato fe nilmercúrio (0,002%), cloreto de benzalcónio (0,01%) e aceta. to de cloro-hexidina (0,01%). Solventes adequados para a pr£

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Docket n⁵ 198/158

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 paração de uma solução oleosa incluem glicerol, álcool diluí do e propileno glicol.

Loções de acordo com a presente invenção incluem as que sao adequadas para aplicação na pele ou nos olhos. Uma solução ocular pode ser constituída por uma solução aquosa estéril, facultativamente contendo um bactericida e pode ser preparada por métodos semelhantes aos da preparação de gotas, As loções ou linimentos para aplicação cutânea podem também incluir um agente para pressar a secagem e para arrefecer a pele, tais como um álcool ou uma acetona e/ou um humidificador, tal como o glicerol, ou um óleo tal como o óleo de castor ou o óleo de raque.

Cremes, unguentos ou pomadas de acordo com a presente invenção são formulações semi-sólidas do ingrediente activo para aplicação externa. Podem ser feitas por meio da mistura do ingrediente activo, numa forma finamente dividida ou pulverizado, isolado ou em solução ou suspensão num líquido aquo so ou não-aquoso, com o auxílio de maquinaria adequada, com uma base gordurosa ou não gordurosa. A base pode ser constituída por hidrocarbonetos tais como parafina dura, macia ou líquida, glicerol, cera de abelha, um sabão metálico; uma mu cilagem; um óleo de origem natural como óleos de amêndoa, milho araque, castor ou azeite; gordura de lã ou seus derivados, ou um ácido gordo tal como o ácido esteárico ou oleíco, juntamente com um álcool tal como o propileno glicol ou macrogoles. A formulação pode incorporar qualquer agente tênsio-activo adequado tal como um tensio-activo aniónico, catjL ónico ou não-iónico, como sejam os esteres de sorbitano ou os seus derivados de polietoxietileno. Agentes suspensores tais como as gomas naturais, derivados de celulose ou materiais inorgânicos tais como sílicas silícosas e outros ingredientes tais como lanolina, podem também ser incluídos.

Será reconhecido pelos técnicos do ramo, que a quantidade e distanciamento óptimos das dosagens individuais de um anticorpo ou seu fragmento, de acordo com a invenção, serão

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Docket n²198/158

Mod. 71 -20.000 ex.-90/08 determinados pela natureza e extensão do estado a ser tratado, a forma, a via e o ponto de administração e do animal par ticular a ser tratado e que esse óptimo pode ser determinado por meio de técnicas convencionais. Será igualmente aprecia5 do pelos técnicos que o curso inicial, isto é, o número de doses de um anticorpo no seu fragmento, de acordo com a evolução, dadas por dia durante um número definido de dias, pode ser estabelecido pelos técnicos por meio da utilização de ensaios convencionais de determinação do curso do tratamen10 to.

Sem mais nenhuma elaboração, crê-se que um técnico do ramo pode, usando a descrição anterior, utilizar a presente invenção na sua mais completa extensão. 0 que se segue é, por isso, para ser considerado como exemplos meramente ilustrati_ 15 vos e não uma limitação, seja de que espécie for, do âmbito da presente invenção.

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Docket n²198/158

Composição para Cápsulas

Uma composição farmacêutica da presente invenção em forma de cápsula é preparada por meio do enchimento de uma cápsula vulgar de gelatina dura, constituída por duas partes, com 50 mg de um anticorpo ou seu fragmento de acordo com a invenção, em forma de pó, 100 mg de lactose, 32 mg de talco e 8 mg de estearato de magnésio.

Composição de Parentérica injectável

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08

Uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, numa forma adequada para a administração por meio de injecção, é preparada por meio de agitação de 1,5% em peso de um anticorpo ou seu fragmento, da invenção, em 10% em volume de propileno glicol e água. A solução é esterilizada por filtração.

Composição para Unguento

Anticorpo ou seu fragmento, de acordo com a invenção, 1,0 g.

Parafina branca mole até 100.0 g.

anticorpo ou seu fragmento, de acordo com a inven25 ção, é disperso num pequeno volume do veículo, para produzir um produto macio, homogéneo. Tubos metálicos deformáveis são então cheios com a dispersão.

Composição para Creme Tópico

Anticorpo de acordo com a invenção ou um seu fragmento, 1,0 g.

Polawax GP 200, 20,0 g.

Lanolina anidra 2,5 g.

Cêra branca de abelha 2,5 g.

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Docket n° 198/158

Hidrobenzoato de metilo, 0,1 g.

Água destilada até 100,0 g.

A polawax, a cera de abelha e a lanolina são aqueci das em conjunto até 60²C. Uma solução de hidroxibenzoato de metilo é adicionada e a homogeneização é conseguida utilizan do-se agitação de alta velocidade. A temperatura é então de_i xada cair para 50-C. 0 anticorpo de acordo com a invenção ou um seu fragmento, é então adicionado e completamente disperso e a composição é deixada arrefecer com agitação a baixa velocidade.

Composição para Loção Tópica

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08

Anticorpo de acordo com a invenção ou seu fragmento, 1,0 g.

Monolaurato de sorbitano, 0,6 g.

Polisorbato 20, 0,6 g.

Álcool cetoestearílico 1,2 g.

Glicerina 6,0 g.

Hidroxibenzoato de metilo 0,2 g.

Água purificada B.P. para 100,0 ml. (B.P.= British Pharmacopeia) hidroxibenzoato de metilo e a glicerina são dissolvidos em 70 ml de água a 75²C. 0 monolaurato de sorbitano, o polisorbitano 20 e o álcool eeteosestearílico são fundidos juntamente a 75²C e adicionados à solução aquosa. A emulsão resultante é homogeneizada, deixada arrefecer com agitação contínua e o anticorpo de acordo com a invenção ou seu fragmento, é adicionado sob a forma de uma suspensão na água res tante. A suspensão total é agitada até à homogeneização.

Composição para Gotas Oculares

Anticorpo de acordo com a invenção ou um fragmento , 0,5 g.

Hidroxibenzoato de metilo, 0,01 g.

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Docket n- 198/158

Hidroxibsnzoato de propilo, 0,04 g.

Agua purificada B.P. até 100,0 ml.

Os hidrobenzoatos de metilo e propilo são dissolvidos em 70 ml. de água purificada a 75²C e deixa-se arrefecer a solução resultante. 0 anticorpo de acordo com a invenção ou seu fragmento é então adicionado e a soluçãoé esterilizada por filtração através de um filtro de membrana (0,022^ m de tamanho de poro) e embalada assépticamente em contentores estéreis adequados.

Composição para Administração por Inalação

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08

Para um contentor de aerossol com uma capacidade de

15-20 ml: misturar 10 mg de um anticorpo de acordo com a in15 venção ou um fragmento, com 0,2-0,5% de um agente lubrifican te , tal como um polisorbato 85 ou um ácido oleíco, e dispersar tal mistura num propulsor, tal como o freon, preferivelmente numa combinação de (1,2 diclorotetrafluoroetano) e difluoroclorometano e colocá-lo num contentor aerossol) apr£ 20 priado, adaptado para administração por inalação intranasal ou oral.

Composição para Administração por Inalação

Para um contentor de aerossol com uma capacidade de 15-20 ml: dissolver 10 mg de um anticorpo de acordo com a in venção ou um seu fragmento, em etanol (6-8 ml), adicionar 0,1-0,2% de um agente lubrificante tal como o polisorbato 85 ou um ácido oleíco; e dispersá-los num propulsor, tal como o freon, preferivelmente em combinação de (1,2 diclorotetrafluoroetano) e difluoroclorometano e colocá-los num contentor aerossol apropriado, adaptado para administração por ina laçãõ intranasal ou oral.

Os anticorpos e as composições farmacêuticas de acordo com a invenção, são particularmente úteis para a adminis52

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Docket ri.- 19.8/158

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 tração parentérica, isto é, subcutânea., intramuscular ou intravenosa. As composições para, administração parentérica serão geralmente constituídas por uma solução de um anticorpo de acordo com a invenção ou um seu fragmento ou uma mistura do mesmo dissolvida num veículo aceitável, preferivelmente um veículo aquoso. Pode ser empregue uma variedade de veículos aquosos, por exemplo, água, água tamponada, salina a 0,4%, glicina a 0,3% e semelhantes. Essas soluções são estéres e geralmente sem matéria partículada. Essas soluções podem ser esterilizadas por meio de técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas.As'combinações podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, conforme seja necessário para aproximar condições fisiológicas tais como agentes ajustadores do pH e de tamponamento, etc. A con centração do anticorpo de acordo com a invenção ou um fragmento em tal formulação framacêutica, pode variar muito, isto é, entre menos de cerca de 0,5%, geralmente ou pelo menos 1% e 15 ou 20% em peso e será escolhida com base, principalmente no volume de líquido, viscosidades etc., de acordo com o modo particular de administração escolhido.

Deste modo, uma composição farmacêutica de acordo com a invenção, destinada a injecção intramuscular, poderá ser preparada para conter 1 ml de água tamponada estéril e 50 mg de um anticorpo de acordo com a invenção ou um seu fragmento , Similarmente, uma composição farmacêutica de acordo com a in venção, para infusão intravenosa, poderá ser feita para conter 250 ml de solução de Ringer estéril e 150 mg de um anticorpo de acordo com o invento ou de um seu fragmento. Métodos actuais para a preparação decomposições administráveis parentéricamente são bem conhecidos dos técnicos do ramo e estão descritos em maior detalhe em, por exemplo,Remington¹ s Pharmaceutical Science, 15^â edição, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, aqui incorporado como referência .

Os anticorpos de acordo com a invenção (ou seus fragmentos) podem ser liofilizados para armazenamento e reconsti

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Docket n²198/158 z?

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 tuídos num veículo apropriado antes da utilização. Esta técni^ ca revelou-se eficaz com as globulinas imunes convencionais e podem ser empregues as técnicas de liofilização e reconsti_ tuição conhecidas da técnica.

Dependendo dos resultados pretendidos, a composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser administrada para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Na aplicação terapêutica, as composições são administradas a um paciente que já está a sofrer de uma doença, numa quantidade suficiente para ou pelo menos deter parcialmente a doença e as suas complicações. Nas aplicações profiláticas, as composições que contêm os presentes anticorpos ou uma sua mistura, são administradas a um paciente que ainda não está num estado de doença, para melhorar a resistência do paciente.

Administrações simples ou múltiplas das composições farmacêuticas podem ser efectuadas, sendo os níveis e a admi. nistração escolhidos pelo médico assistente. Em qualquer dos casos, a composição farmacêutica de acordo com a invenção de_ verá fornecer uma quantidade dos anticorpos alterados da invenção (ou dos seus fragmentos), suficientes para tratar efjí cazmente do paciente.

Deverá também notar-se que os anticorpos da presente invenção podem ser usados para a orientação e sintese de com postos, péptidos ou não péptidos (miméticos), que seriam tão úteis na mesma terapia como os anticorpos. Ver, por exemplo Saragovi e al., Science, 253, 792-795 (1991).

Depósito

A estirpe___________ foi depositada no ATCC e foi-lhe atribuído o número__________. Este depósito foi efectuado em 9 de Julho de 1992.

Os requerentes e os representantes aceitam a sua responsabilidade de substituírem essas culturas, se elas morrerem antes do fim do prazo de uma patente aqui emitida, 5 anos

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Docket n² 198/158

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 depois do último pedido de uma cultura, ou 30 anos, dependen do de qual for maior e a sua responsabilidade de notificarem o depositário da emissão de tal patente, altura em que o depósito será tornado irrevogavelmente disponível para o públi co. Até essa altura o depósito será tornado disponível para o Comissário de Patentes, nos termos do C.F.R. 37, Secção 1-14 e U.S.C. 35, Secção 112.

Outras formas de realização são abrangidas pelas seguintes reivindicações.

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Docket n² 198/158

(i) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) REQUERENTE: ROLAND A.NEWMAN

NABIL HANHA

RONALD W. RAAB (ii) TITULO DA INVENÇÃO: ANTICORPOS QUIMÉRICOS PARA

TERAPIA HUMANA (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 16 (iv) CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO:	Lyon & Lyon
(B) RUA:	611 West Sixth Street
(C) CIDADE:	Los Angeles
(D) ESTADO	Califórnia
(E) PAÍS:	Estados Lhidos da América
(F) CODIGO POSTAL:	02111-2658

(v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR:

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08

(A) TIPO DE MEIO	Disquete de 3,5, 1,44 Mb capacidade
(B) COMPUTADOR:	Compatível IBM
(C) SISTEMA OPERATIVO:	C.P.IBM DOS (Versão 5,0)
(D) SOFTWARE:	WordPerfect (Versão 5,0)

(vi) DADOS ACERCA DO PRESENTE PEDIDO:

(A) NÚMERO DO PEDIDO:

(B) DATA DA APRESENTAÇÃO:

(C) CLASSIFICAÇÃO:

(vii) DADOS ACERCA DE PEDIDOS ANTERIORES:

Total de pedidos anteriores.

incluindo o pedido descrito abaixo: 2 (A) NUMERO DA PEDIDO 07/856.281 (B) DATA DA'APRESENTAÇÃO:23-MAR-1992 (A) NUMERO DO PEDIDO: 07/735.064 (B) DATA DA APRESENTAÇÃO: 23-JULHO-1991 (viii) AGENTE DE INFORMAÇÃO/ADVOGADO:

(A) NOME: Warburg, Richard J.

(B) NÚMERO DE REGISTO: 32.327

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Docket n⁹ 198/158

(C) NÚMERO DE REFERENCIA/EXTRACTO 198/118 (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES:

(A) TELEFONE:	(213) 489-1600
(B) TELEFAX:	(213 955-9400
(C) TELEX:	67-3510

(2) INFORMAÇÃO PARA JD DA SEQUÊNCIA N⁹ 1.

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO. 17 (B) TIPO: ACIDO NUCLEICO (C) TIPO DE CORDÃO: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: ID DA SEQ N⁹ 1

CCATGGACTG GACCTGG

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 (3) INFORMAÇÃO PARA ID DA SEQ N⁹ 2 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQ :

(A) COMPRIMENTO. 20 (B) TIPO: ÁCIDO NUCLEÍCO (C) TIPO CORDÃO: Simples (D) TOPOLOglA: Linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: ID DA SEQ. N⁹ 2 ATGGACATAC TTTGTTCCAC 20 (4) INFORMAÇÃO PARA ID DA SEQ N⁹ 3 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 (B) TIPO: ÁCIDO NUCLRÍCO (C) TIPO DE CORDÃO: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: 10 DA SEQ N⁹ 3 CCATGGAGTT TGGGCTGAGC 20 (5) INFORMAÇÃO PARA ID DA SEQN⁹ 4 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 (B) TIPO: ACIDO NUCLEÍCO (C) TIPO DE CORDÃO: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear

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Docket n² 198/158

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: ID SEQ N² 4

ATGAAACACC TGTGGTTCTT (6) INFORMAÇÃO PARA ID DA SEQ N² 5 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO:

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLElCO (C) TOPOLOGIA: Linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA : ID DA SEQ N² 5 ATGGGGTCAA CCGCCATCCT 20 (7) INFORMAÇÃO PARA ID DA SEQ N² 6 (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO:

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 (B) TIPO: ACIDO NUCLElCO (0) TIPO CORDÃO: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: ID DA SEQ N² 6

ATGTCTGTCT CCTTCCTCAT (8) INFORMAÇÃO PARA ID DA SEQ N² 7 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 16 (B) TIPO: ACIDO NUCLElCO (C) TIPO GORDÃO: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA:ID DA SEQ N⁹ 7 TTGGGGCGGA TGCACT 16 (9) INFORMAÇÃO PARA ID DA SEQ N⁹ 8 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 17 (B) TIPO: ACIDO NUCLElCO (C) TIPO DE CORDÃO: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA : ID DA SEQ N² 8

GATGGGCCC TTGGTGGA 17 (10) INFORMAÇÃO PARA ID DA SEQ N² 9 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

*

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Docket n² 198/158

COMPRIMENTO: 21

TIPO: ACIDO NUCLEÍCO

TIPO DE CORDÃO: Simples

TOPOLOGIA: Linear <y _ . _ __________. ___ .

Mod. 71 -20.000 ex. - 90/08 (A) (B) (C) (D) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: ID DA SEQ

GATGACCAG TCTCCAGCCTC (ii) INFORMAÇÃO PARA ID DA SEQ N² 10 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

COMPRIMENTO: 21

TIPO: ACIDO NUCLElCO TIPO DE CORDÃO: Simples TOPOLOGIA: Linear . ry _ __ _ _ ___________ ____ ____ (A) (B) (C) (D) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: ID DA SEQ

CTCACTTGCT GCACAGGGTCC

Y VR M (12) INFORMAÇÃO PARA ID DA SEQ N² 11 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

COMPRIMENTO: 19

TIPO: ÁCIDO NUCLElCO TIPO DE CORDÃO: Simples TOPOLOGIA: Linear <y _ _ (A) (B) (C) (D) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: ID DA SEQ AAGACAGATG GTGCAGCCA (13) INFORMAÇÃO PARA ID DA SEQ N² 12 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

COMPRIMENTO: 20

TIPO: ACIDO NUCLElCO TIPO CORDÃO: Simples TOPOLOGIA: Linear ry ______ _ . .. .

(A) (B) (C) (D) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: ID DA SEQ

GGAACAGAGT GACCGAGGGG (14) INFORMAÇÃO PARA ID DA SEQ N² 13 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 31 (B) TIPO: ACIDO NUCLElCO

N²

N²

N²

N²

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Docket n² 198/158

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 (C) TIPO CORDÃO: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: ID DA SEQ N² 13 ACTAAGTCGA CATGAAACAC CTGTGGTTCT T 31 (15) INFORMANÃO PARA ID DA SEQ N² 14 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 39 (B) TIPO: ÁCIDO NUCLEÍCO (C) TIPO CORDÃO: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: ID DA SEQ N² 41 ATCACAGATC TCTCACCATG ACCTGCTCCC CTCTCCTCC 39 (16) INFORMAÇÃO PARA ID DA SEQ N² 15 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 432 (B) TIPO: ÁCIDO NUCLEÍCO (C) TIPO DE CORDÃO: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: ID DA SEQ N² 15

GAC

ATG

AAA

CAC

CTG

TGG

TTC

TTC

CTC

CTC

CTG

GTG

GCA

GCC

CCC

AGA

48

TGG

GTC

TTG

TCC

CAG

GTG

CAG

CTG

CAG

GAG

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GGC

CCA

GGA

CTG

GTG

96

AAG

CCT

TCG

GAG

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CTG

TCC

CTC

ACC

TGC

AGT

GTC

TCT

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GGC

TCC

144

ATC

AGC

GGT

GAC

TAT

TAT

TGG

TTC

TGG

ATC

CGC

CAG

TCC

CCA

GGG

AAG

192

GGA

CTG

GAG

TGG

ATC

GGC

TAC

ATC

TAT

GGC

AGT

GGT

GGG

GGC

ACC

AAT

240

TAC

AAT

CCC

TCC

CTC

AAC

AAT

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GTC

TCC

ATT

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ATA

GAC

ACG

TCC

288

AAG

AAC

CTC

TTC

TCC

CTG

AAA

CTG

AGG

TCT

GTG

ACC

GCC

GCG

GAC

ACG

336

GCC

GTC

TAT

TAC

TGT

GCG

AGT

AAT

ATA

TTC-

AAA

TAT

CTT

CAC

TGG

TTA

384

TTA

TAC

TGG

GGC

CAG

GGA

GTC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

TAC-

423

(17

) INFOR

,MAÇ

ÃO PARA

. ID

DA

SEQ

! NQ

16

(i)

CA

RACTERI

STI'

CAS

DA

SEQ'

UENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 387

65194

Docket n²198/158 (B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO (C) TIPO DE CORDÃO: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (ix) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: ID SA SEQ N² 16

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08

ACC ATG GCC TGG

GCT CTG CTG

CTC CTC GGC CTC CTT GCT CAC TTT ACA

48

GAC

TCT

GCG

GCC

TCC

TAT GAG

TTG AGT

CAG

CCT

CGC TCA GTG

TCC

GTG

96

TCC

CCA

GGA

CAG

ACG

GCC GGG

TTC

ACC

TGT

GGG

GGA GAC AAC

GTT

GGA

144

AGG

AAA

AGT

GTA

CAG

TGG TAC

CAG

CAG

AAG

CCA

CCG CAG GCC

CCT

GTG

192

CTG

GTC

ATC

TAT

GCT

GAC AGC

GAA

CGG

CCC

TCA

GGG ATC CCT

GCG

CGA

240

TTC

TCT

GGC

TCC

AAC

TCA GGG

AAC

ACC

GCC

ACC

CTG ACC ATC

AGC

GGG

288

GTC

GAG

GCC

GGG

GAT

GAG GCT

GAC

TAT

TAC

TGT

CAG GTG TGG

GAC

AGT

336

ACT GGT

GCT

GAT

CAT

TGG

GTC TTC

GGC

GGA

GGG ACC

CGG CTG ACC

GTC

CTA

384 387

Lisboa, 23.0UTJ992

Claims (3)

1. I^a- Anticorpo recombinante compreendendo uma região constante de imunoglobulina humana, de chimpanzé ou de um primeiro macaco do Velho Mundo e uma porção de ligação antigénio de uma segunda região variável de imunoglobulina de macaco do Velho Mundo em que os referidos primeiro e segundo macacos do Velho Mundo podem ser o mesmo ou diferentes

   2-- Anticorpo recombinante compreendendo uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina que tem especificidade para um antigénio específico tendo uma região constante homóloga a uma região constante correspondente de um humano, chimpanzé ou primeiro anticorpo de macaco do Velho Mundo,uma região de estrutura homóloga a uma região correspondente huma na, de chimpanzé ou a uma segunda região de estrutura de macaco do Velho Mundo, e uma porção de ligação antigénio hom£ Ioga à terceira ligação antigénia de macaco do do Velho Mundo, caracterizado por os referidos primeiro, segundo e terceiro macacos do Velho Mundo poderem ser o mesmo ou diferentes .

   3^a- Anticorpo recombinante compreendendo uma região constante de imunoglobulina que não é imunogénico a um humano, uma região de estrutura que não é essencialmente imunogénica a um humano, e uma porção de ligação antigénio de uma primeira região variável de imonuglobulina de macaco do Velho Mundo.

   4^a Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por o referido enticorpo se ligar espe cialmente a um antigénio humano.

   5a- Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a referida região constante ser homóloga à

   65194

   Docket n² 194/158 t

   Mod, 71 - 20.000 ex. - 90/08 região constante de um humano, um chimpanzé ou uma segunda região constante de imunoglobulina de macaco do Velho Mundo, em que os referidos primeiro e segundo macacos do Velho Mun do podem ser o mesmo ou diferentes.

   6^S- Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a referida região de estrutura ser homóloga a uma região de estrutura de macaco do Velho Mundo, chimpanzé ou humano.

   7^§- Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por um referido macaco do Velho Mundo ser um macaco Rhesus.

   8^â- Anticorpo de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado por o referido macaco do Velho Mundo ser um macaco do tipo cinocéfalo.

   9^ã_ Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por o referido macaco do Velho Mundo ser um babuíno.

   10^â- Anticorpo recombinante compreendendo uma primeira região constante de imunoglobulina de macaco do Velho Mundo e uma segunda porção de ligação antigénica de uma segunda região diferente variável de imunoglobulina de macaco do Velho Mundo.

   11^-Anticorpo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o referido anticorpo se ligar especificamente a um antigénio humano.

   12²- Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, 2, 3, 5, 6, 10, ou 11, caracterizado por o referido anticorpo se ligar especificamente a antigénios humanos escolhidos

   65194

   Docket n² 198/158 de CD5B, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CE44, CD54, TNPtf, TNP/?, antigénio Tn, IL-1,

   IL-8, receptor de célula-T humana, CD3, CD28, CD8, CDlla,

   CDllb, CD18, CD5a, CDllb, CD45, produto oncogénio neu, TGHq^, receptor TGF/^, FDGF e CD71.

   MDR-1

   13^§- Anticorpo de acordo com a reivindicação

   4, caracterizado por o referido anticorpo se ligar especialmente a antigénios humanos escolhidos de CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD41, CD44, CD54,TNFtf TNF^, antigénio Tn, IL-1. IL-8, receptor de célula-T humana, CD3, Cd28, CD8, CDlla, CDllb, CDllc, CD18, CD5a, CD45, produto oncogénio neu, MDR-1, TGF , receptor TGF^, PDGF e CD71£|

   Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08

   14^â- anticorpo de acordo com a reivindicação

   7, caracterizado por o referido anticorpo se ligar especificamente aos antigénios humanos - escolhidos de DC58, VCAM, VLA4 CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD23, CD.25, CD4, CB19, CE.20, CD41, CD44, CD54, TNFq( , TNF^, antigénio Tn, IL^l, IL-B, receptor de célula-T humana, CD3, GD28, CD8, CDllb, CDllc, CD18, CD5a CD45, produto oncigénio neu, MDR-1, TGF^, receptor TGF^;

   PDGF e CD71.

   15^ã- Anticorpo de acordo coma reivindicação § caracterizado por o referido anticorpo se ligar especificamente a antigénios humanos escolhidos de CD58, VCAM, VLA4, DC2, LFA3, ELAM; LAM, CD23, CD25, CD4, CD19, CD20, CD41,CDxx CD54 TNljb(, TNF^, antigénio Tn, IL-1, IL-8, recepto.r de célula-T humana, CD3, CD28, CD8, CDlla, CDllb, CDllc, CD18, CD5a CD45, produto onogénio, neu, MDR-1, TGF^, receptor TGF/y, PDGF e CD71.

   16-- Anticorpo de acordo com.a reivindicação

   9, caracterizado por 0 referido anticorpo se ligar especificamente aos antigénios humanos escolhidos de CD58, VCAM,

   65194

   Docket n² 198/158

   VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNFg^, TNF/?, antigénio Tn, IL-1, IL-8, receptor de célula-T humana, CD3, Cd28, CD8, CDlla, CDllb, CDllc, CD18, CD5a, CD45, produto oncogénio neu, MDR-1, TGF/γ, receptor TGF^, PDGF E CD71.

   17-- Anticorpo de acordo com a reivindicação

   10, caracterizado por cada referido macaco do Antigo Mundo ser seleccionado do grupo que consiste em macacos babuínos, 10 Rhesus e macacos do tipo cinocéfalo.

   18-- Anticorpo de acordo com a reivindicação

   1, 2 ou 3 caracterizado por a referida porção de ligação antigénico compreender uma ou mais regiões CDR de uma região 15 variável de macaco do Velho Mundo.

   Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08

   18-- Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por a referida porção de ligação antigénia compreender toda a região variável de um macaco do Velho Mundo.

   20^§- Acido nucleico codificando um anticorpo recombinante compreendendo uma primeira porção de ligação an tigénia de imunoglobulina de macaco do Velho Mundo.

   21^â- Acido nucleico de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o referido anticorpo recombinante compreender uma região constante humana, de chimpanzé, ou de segundo macaco do Velho Mundo, em que os referidos primei, ro e segundo macacos do Velho Mundo podem ser o mesmo ou diferentes.

   22^ã- Ácido nicleíco de acordo com a reivindjí cação 21, caracterizado por o referido anticorpo compreender uma região de estrutura do Velho Mundo, um anticorpo de um

   65194

   Docket n² 198/158

   Mod. 71 -20.000 ex.-90(08 humano ou um chimpanzé, em que os referidos primeiro e segun do macacos do Velho Mundo podem ser o mesmo ou diferentes.

   23^a- Ácido nucleíco de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por a referida porção de reconhecimento de antigénio compreender toda a região variável do referido anticorpo do macaco do Velho Mundo.

   24^a- Ácido nucleíco de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por a referida porção de reconhecimento de antigénio compreender uma ou mais regiões CDR da primeira região variável do macaco do Velho Mundo.

   25^a- Ácido nucleíco de acordo com a reivind_i cação 20, 21 ou 22, caracterizado por os referidos primeiro e segundo macacos serem separadamente seleccionados do grupo que consiste em babuínos, Rhesus e macacos do tipo cinocéfalo .

   26-- Anticorpo monoclonal ou um Fab ou Fv do mesmo fragmento (Fab)₂, formado por uma célula -B imortaliza da do macaco do Velho Mundo.

   27^a- Anticorpo monoclonal de acordo com a rei vindicação 26, caracterizada por a referida célula -B ser uma célula -B do tipo cinocéfalo.

   28^a- Anticorpo monoclonal de acordo com a rei vindicação 26, caracterizado por a referida célula -B ser uma célula ~B de Rhesus.

   29^a- Anticorpo monoclonal de acordo com a rei vindicação 26, caracterizado por a referida célula -B ser uma célula -B da babuíno.

   65194

   Docket n^s 198/158

   Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08

   30^s- Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 26, 27, 28 ou 29, caracterizado por o referido anticorpo ser produzido para um antigénio humano.

   31§- Anticorpo monoclonal de acordo com a re_ vindicação 26, 27, 28 ou 29, caracterizado por o referido-anticorpo se ligar especificamente aos antigénios humanos escolhidos de CD58, VC AM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, GD41, CD44, TNF#, TNF^ ; antigénio Tn IL-1, IL-8, receptor de célula-T humana, CD3, CD28, CD8,CDllé CD8 CDllb, CDllc, C5a, produto oncogénico neu, MDR-1 TGF^, receptor TGR^, PDGF e CD71.

   32^s- Método para isolar a região variável de um gene do anticorpo de macaco do Velho Mundo, compreendendo os passos de.

   pôr em contacto o ácido nucleico do macaco do Ve lho Mundo e um arrancador complementar à sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência 5' principal do referido gene do anticorpo,para formar um complexo híbridoje ampliar o referido ácido nucleico no referido complexo híbrido para produzir ácido nucleico ampliado

   33^ã- Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o referido ácido nucleico ser ADN ou ADNc.

   34^â- Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o referido arrancador ser complementar ao cordão não codificador de uma sequência 5' principal de um génio de anticorpo humano ou de macaco do Velho Mundo.

   35⁵- Método de acordo coma reivindicação 32, caracterizado por o referido passo de ampliação produzir áci do nucleico suficiente para ser colocado dentro do vector.

   65194

   Docket n² 198/158 i

   Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08

   36^§- Método para isolar a região variável de um gene do anticorpo do macaco do Velho Mundo, compreendendo os passos de:

   pôr em contacto ARN de um macaco do Velho Mundo com transcriptase inversa para formar ADNc, pôr em contacto o referido ADNc com um arrancador complementar ao ADNc numa localização que codifica uma sequência 5' principal do referido gene do anticorpo, para formar um complexo híbrido, e ampliar o referido ácido nucleíco no referido complexo híbrido para produzir ácido nucleíco ampliado.

   37^§- Método para produzir um anticorpo recom binante para um antigénio humano, não sendo o referido anti.corpo imunogénio num humano, o qual compreende os passos de; cultivar um anticorpo de macaco do Velho Mundo para o referido antigénio num macaco do Velho Mundo, isolar o ácido nucleíco de um macaco do Velho Mundo que codifica uma porção de ligação do antigénio de ume região variável do referido anticorpo de macaco, do Velho Mundo, providenciar um ácido nucleíco humano que codifi ca num anticorpo humano, ligar o referido ácido nucleíco do macaco do Velho Mundo e o referido ácido nucleíco humano para formar um ácido nucleíco recombinante, e expressar o referido ácido nucleíco recombinante para produzir o referido anticorpo.

   38-- Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por a referida porção de ligação do anticorpo compreender uma ou mais regiões CDR de uma região variável de um macaco do velho Mundo.

   39§- Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por a referida porção de ligação de antigénio compreender toda a região variável de um macaco do velho Mun

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   Docket n² 198/158

   40-- Método de acordo com a reivindicação 37, caracte rizado por o referido método compreender ainda o passo de imortalização de uma célula capaz de produzir o referido anticorpo de macaco do Velho Mundo.

   Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08

   41-- Método de acordo com a reivindicação 37, que compreende o passo de indentificação de ácido nucleico de macaco do Velho Mundo que codifica uma região variável do referido anticorpo de macaco do Velho Mundo.

   42-- Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por a referida imortalização ser por fusão de hibidroma.

   43^ã- Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por a referida imortalização ser por transformação virai.

   44²- Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por a referida imortalização ser por clonagem simples de célula-B.

   45^ã- Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por a referida imortalização ser por construção de biblioteca.

   46-- Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por a referida região constante humana ser seleccionada para ter um isotipo desejado.

   47^ã- Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por o referido método compreender ainda a se30

   65194

   Docket n⁹ 198/158

   Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 leção de uma célula-B do referido macaco do Velho Mundo.

   48^â- Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado por a referida célula-B ser obtida de linfócitos de sangue periférico, nódulos linfáticos, meduma óssea ou baço.

   49^ã- Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por o referido método compreender ainda o rastreio de células do referido macaco do velho Mundo para a prc dução do referido anticorpo.

   50^â- Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por a referida expressão ser no interior de uma linha de células produtora.

   51-- Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por o referido isolamento compreender a retirada do gene da imunoglobulina da referida região variável.

   52^â- Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-44, caracterizado por o referido antigénio ser seleccionado de CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNF^, TNF^, antigénio Tn, IL-B, receptor de cálula-T humana, CD3, CD28, CD8, CD18, CDlla, CDllb, CDllc, C5a, CD45, produto oncogénio neu, MDR-1, TGR^, receptor de TGRc(, PDGF e CD71.

   53-- Método para o tratamento de humanos que tenham um antigénio, em que esse humano necessita do tratamento, compreendendo o passo de administar uma quantidade t£ rapêuticamente eficaz de um recombinante específico_;para © re ferido antigénio, caracterizado por o referido anticorpo com preender uma região constante de humano, chimpanzé ou de um primeiro macaco do Velho Mundo e uma porção de ligação do an

   65194 docket n² 198/158

   Mod. 71 -20.000 ex.-90/08 tigénio da região variável de um segundo macaco do Velho Mundo.

   54^ã- Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por 0 referido humano sofrer de cancro e 0 referido antigénio ser um antigénio de um tumor.

   55²- Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por o referido humano sofrer de uma resposta auto-imune e 0 referido antigénio ser um antigénio envolvido numa resposta auto-imune no humano.

   56^â- Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por o referido antigénio ser um receptor expre^ so numa célula parasita.

   57-- Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por o referido anticorpo compreender porções homólogas aos anticorpos humanos e de macacos do velho Mundo.

   58^ã- Método de acordo com a reivindicação 53 ou 57, caracterizado por 0 referido antigénio ser seleccionado de CD58, VCAM, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19,CD2-0, CD23, CD41, CD44, CD54, TNE^ ; antigénio Tn, IL-1, IL-B, receptor da célula-T humana, CD3, Cd28, CD8, CD18, CDlla, CDllb, CDllc, C5a, produto oncogénico neu, MDR-1, TGF/γ, receptor de TGFO(, PDGF, e CD71.

   59²- Método de acordo com a reivindicação 53, 30 caracterizado por a referida porção de ligação de antigénio compreender uma ou mais regiões CDR de uma região variável de um macaco do Velho Mundo.

   60-- Método de acordo com a reivindicação 53, 35 caracterizado por a referida porção de ligação do antigénio compreender toda a região variável de um macaco do velho Mun71

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   Docket n² 198/158

   1 do.

   Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08

   61Anticorpo recombinante compreendendo (1) uma região constante de cadeia pesada de um anticorpo humano;
2. (2) uma região constante de uma cadeia le ve do referido anticorpo humano;
3. (3) uma região variável de uma cadeia pesada de um anticorpo de um macaco do Velho Mundo contra um antigénio humano; e (4) uma região variável de uma cadeia le ve do referido anticorpo de macaco do Velho Mundo.

   62^ã- Acido nucleíco recombinante compreendendo pelo menos uma região CDR da região variável nas SEQ. ID NOS. 15 ou 16.

   63⁹- Composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2,3, 10 ou 26, num veículo farmaceuticamente aceitável.

   64^ê- Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 63 em que o referido anticorpo se liga especificamente a CD58, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, C19 CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNF^, TNE0 , antigénio Tn, IL-1, IL-B, receptor da célula-T humana, CD3, CD28, CD8, CD18,CDlla CDllb, CDllc, C5a, CD45, produto oncogénico neu, MDR-1, TGF^z receptor de TGR/y, PDGF ou CD71.

   65^s- Método para o tratamento de uma doença escolhida de entre atrite reimatóide, eczema e uma doença imunomodulatória que compreende o passo de se fornecer uma

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   Docket n⁹ 198/158 composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 63 a um humano que sofra da referida doença.