ES2265005T3 - Anticuerpos recombinantes para terapia humana. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo quimérico que se une específicamente a un antígeno humano, es sustancialmente no inmunogénico en un ser humano, y no es igual que un anticuerpo humano o de chimpancé, donde el anticuerpo comprende polipéptidos de cadena ligera y pesada comprendiendo cada una: una región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de una región variable de un anticuerpo de un mono del viejo mundo seleccionado entre monos rhesus, monos cynomolgus, y mandriles, y una región constante que tiene la secuencia de aminoácidos de una región constante de un anticuerpo de un ser humano o chimpancé.

Description

Anticuerpos recombinantes para terapia humana.

Campo de la invención

Esta solicitud en una continuación en parte de Newman et al., solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de serie 07/856.281, presentada el 23 de marzo de 1992, que es una continuación en parte de la solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de serie 07/735.064, presentada en 25 de julio de 1991, la totalidad de ambas cuales, incluyendo los dibujos, se incluye por la presente como referencia. Esta invención se refiere a anticuerpos recombinantes útiles para terapia humana y a métodos para la producción de tales anticuerpos.

Antecedentes de la invención

Ciertos anticuerpos monoclonales murinos se usan en la diagnosis de enfermedades humanas y para solucionar problemas de investigación biológica básicos. Estos reactivos también se usan en ensayos clínicos como agentes terapéuticos para enfermedades humanas tanto agudas como crónicas, incluyendo leucemias, linfomas, tumores sólidos (por ejemplo, de colón, de mama, hepático), SIDA y enfermedades autoinmunes.

Se han creado anticuerpos quiméricos de ratón/humano y se ha demostrado que presentan las características principales del anticuerpo de ratón parental y las funciones efectoras asociadas con la región constante humana. Véase, por ejemplo, Cabilly et al., Patente de Estados Unidos 4.816.567; Shoemaker et al., Patente de Estados Unidos 4.978.745; Beavers et al., Patente de Estados Unidos 4.975.369; y Boss et al., Patente de Estados Unidos 4.816.397, todas las cuales se incorporan como referencia en este documento. Generalmente, estos anticuerpos quiméricos se construyen preparando una biblioteca de genes genómicos a partir de ADN extraído de hibridomas murinos pre-existentes. Nishimura et al., 47 Cancer Research 999, 1987. Después, la biblioteca se selecciona con respecto a genes de la región variable de cadenas tanto pesadas como ligeras que muestran los modelos de redistribución de fragmentos de anticuerpos correctos. Después, los genes de región variable clonados se unen a un vector de expresión que contiene cassettes clonados del gen de la región constante humana de cadena pesada o ligera apropiado. Después, los genes quiméricos se expresan en una línea celular de elección, normalmente una línea de mieloma murino.

Tales anticuerpos quiméricos se han usado en terapia humana. Sin embargo, en varios casos el receptor humano ha producido anticuerpos para estos anticuerpos quiméricos. Tales anticuerpos anti-anticuerpos quiméricos son perjudiciales para la terapia continuada con el anticuerpo quimérico.

Erlich et al., 34 Clinical Chemistry 1681, 1988, Erlich et al., 7 Hybridoma 385, 1988, Erlich et al., 6 Hybridoma 151, 1987, y Erlich et al., 1 Human Antibody Hybridomas 23, 1990 (no admitido como técnica anterior en la presente solicitud) indican que es de esperar que los anticuerpos monoclonales humanos sean una mejora con respecto a los anticuerpos monoclonales de ratón para la terapia humana in vivo. Además postulan que los anticuerpos de primates no humanos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales de chimpancé, se toleran en seres humanos porque estructuralmente son similares a los anticuerpos humanos. Como los anticuerpos humanos no son inmunogénicos en monos Rhesus (es decir, no inducen una respuesta de anticuerpos), predicen que los anticuerpos de primates no serán inmunogénicos en seres humanos. Indican que no es necesario el ensayo de anticuerpos en humanos si un anticuerpo de primate tiene una estructura de región constante idéntica a la de una inmunoglobulina humana o, al menos, una estructura que no sea más diferente de una inmunoglobulina humana que la diferencia que existe entre los anticuerpos humanos. De esta forma, sugieren que los anticuerpos de chimpancé pueden ser útiles en la terapia humana.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a la amplificación y clonación de genes que codifican las porciones de unión a antígeno de la región variable de inmunoglobulina de mono del viejo mundo (mencionado en este documento "mono", por ejemplo, mandril o macaco), la fusión de estos genes con genes que codifican la región constante de seres humanos o chimpancés (y genes que codifican las regiones flanqueantes de seres humanos o chimpancés si fuera necesario), y su expresión como anticuerpos recombinantes. Tales anticuerpos recombinantes (término que incluye anticuerpos producidos por fusión de ADN de dos genes de anticuerpos diferentes) pueden usarse como agentes inmunoterapéuticos para el tratamiento de enfermedad humana. La invención se basa en el descubrimiento de que monos distantes evolutivamente (por ejemplo, mandriles o macacos (incluyendo monos cynomolgus y Rhesus)), a diferencia de los chimpancés, no sólo son suficientemente diferentes de los seres humanos como para permitir la inducción de anticuerpos contra antígenos humanos en estos monos, incluso contra antígenos humanos relativamente conservados, por ejemplo, CD4 y CD54, sino que son suficientemente similares a los seres humanos como para tener anticuerpos similares a los anticuerpos humanos, de forma que no se produzca una respuesta inmune de anti-anticuerpos del hospedador cuando tales anticuerpos de mono, o anticuerpos recombinantes derivados de los mismos, se introducen en un ser humano.

Por consiguiente, la invención proporciona un anticuerpo quimérico que se une específicamente a un antígeno humano, es sustancialmente no inmunogénico en un ser humano, y no es igual a un anticuerpo humano o de chimpancé, donde el anticuerpo comprende polipéptidos de cadena ligera y pesada comprendiendo cada una: una región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de una región variable de un anticuerpo de un mono del viejo mundo seleccionado entre monos rhesus, monos cynomolgus, y mandriles, y una región constante que tiene la secuencia de aminoácidos de una región constante de una anticuerpo de un ser humano o chimpancé.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo quimérico de la invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se proporciona un ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de cadena ligera y pesada de un anticuerpo quimérico de la invención. Un anticuerpo quimérico que se une específicamente a un antígeno humano y es sustancialmente no inmunogénico en un ser humano puede producirse por un método que comprende expresar tal ácido nucleico recombinante.

Puede usarse un anticuerpo quimérico de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad, trastorno, o afección seleccionada entre el grupo compuesto por cáncer, enfermedad infecciosa, rechazo de un órgano o tejido trasplantado, y una enfermedad, trastorno, o afección autoinmune o inflamatoria.

A diferencia de algunos anticuerpos anteriores usados para terapia humana, los anticuerpos de la presente invención no sufren de varios inconvenientes, por ejemplo, 1) inmunogenicidad e inducción de respuesta humana anti-anticuerpo (HAA) después de la administración repetida necesaria para tratar afecciones crónicas, 2) vida media relativamente corta en comparación con anticuerpos humanos, y 3) ausencia de funciones efectoras con células humanas o complemento. La ausencia de estos inconvenientes es una ventaja significativa para terapia humana con anticuerpos producidos por la presente invención. Por ejemplo, en el caso de enfermedades humanas crónicas, incluyendo enfermedades autoinmunes, o cualquier enfermedad en la que sea necesaria una administración prolongada de un anticuerpo, uno de los obstáculos principales para la terapia repetitiva con anticuerpos es la respuesta del hospedador al anticuerpo terapéutico.

A menudo, las respuestas de HAA no pueden predecirse de un paciente a otro. Tales respuestas se dirigen predominantemente, pero no de forma exclusiva, contra la región constante de la molécula de anticuerpo, y una vez que aparecen, a menudo obstaculizan o reducen la eficacia de cualquier terapia adicional con ese anticuerpo o con otro anticuerpo del mismo isotipo.

Potencialmente, los problemas de HAA podrían evitarse por el uso de anticuerpos monoclonales humanos. Esta estrategia, sin embargo, se ve afectada por limitaciones éticas, clínicas e inmunológicas sobre la inmunización de seres humanos con muchos antígenos elegidos (por ejemplo, antígenos humanos, frase que incluye porciones antigénicas o inmunogénicas de cualquier proteína, polipéptido o su equivalente presente en un ser humano) para la generación de anticuerpos. La estrategia de los solicitantes para evitar este problema incluye la generación de anticuerpos de la especificidad apropiada y de la función efectora deseada y su uso en la producción de anticuerpos recombinantes. Estos anticuerpos recombinantes generalmente incluyen una porción apropiada de la región variable de un anticuerpo procedente de un mono inmunizado, y la región constante de un anticuerpo procedente de un ser humano o de un chimpancé. De esta forma, se conservan las especificidades y altas afinidades de anticuerpos monoclonales, y puede elegirse fácilmente la región constante humana o de chimpancé apropiada que presente las funciones efectoras deseadas.

La presente invención además se basa en un método para la amplificación de genes de inmunoglobulina de mono, por ejemplo, por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), a partir de ARN extraído de linfocitos de mono usando cebadores oligonucleotídicos sintéticos específicos para las familias de genes de región variable de cadena pesada y ligera. Los genes amplificados o las porciones apropiadas (por ejemplo, la región determinante de complementariedad (CDR)-regiones codificantes; véase Winter, Solicitud de Patente Británica Nº. GB2188638A) se clonan en un vector de expresión que contiene un gen de región constante de ser humano o de chimpancé para la producción de un anticuerpo recombinante de mono/humano del isotipo deseado. Estos anticuerpos representan agentes inmunoterapéuticos capaces de localizar y/o destruir células diana apropiadas (por ejemplo, células tumorales) después de la administración
in vivo.

Una porción reconocedora de antígeno de la región variable de un gen de anticuerpo de mono puede clonarse proporcionando un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN de mono, formando un ADNc para el ARN (usando la transcriptasa inversa), proporcionando un cebador complementario a la secuencia de ADNc que codifica una secuencia directora 5' del gen del anticuerpo, poniendo en contacto ese ADNc y el cebador para formar un complejo híbrido y amplificando el ADNc para producir un ácido nucleico que codifique para la región variable del gen de anticuerpo de mono.

Por "porción reconocedora de antígeno" se entiende una o más porciones de una región variable de un anticuerpo de mono que son responsables de la unión y/o reconocimiento del antígeno diana (o el epítopo o idiotipo) del anticuerpo. Por ejemplo, incluye las regiones CDR (véase a continuación) o la región variable completa, o cualquier combinación de estas dos regiones incluyendo cualquier cambio en regiones codificantes que pueden inducirse para hacer la región más de tipo humano que de tipo mono, sin alterar las propiedades específicas de unión del anticuerpo. Si se usa sólo una porción de la región variable completa, entonces, las porciones restantes, por ejemplo, las llamadas "flanqueantes", se proporcionan de otro anticuerpo, preferiblemente de un anticuerpo humano o de chimpancé (véase a continuación) y en la técnica citada anteriormente.

Las expresiones "región variable", "secuencia directora ", "región constante" y "estructura" se usan de la manera común reconocida en la técnica, cuyos ejemplos se proporcionan más adelante y en la técnica citada anteriormente.

En las realizaciones preferidas, la secuencia directora es una secuencia directora humana, de chimpancé o de mono de aproximadamente 60 bases, cuyos ejemplos se proporcionan en la Fig. 1.

El solicitante ha descubierto que las secuencias directoras de la región variable de mono, chimpancé y ser humano son suficientemente similares como para que los cebadores construidos para una de ellas sean adecuados para la amplificación de las otras. En el método, el ARN se amplifica suficientemente como para producir suficiente ácido nucleico como para poner ese ácido nucleico en un vector para la posterior clonación.

Puede producirse un anticuerpo para un antígeno humano, que no sea inmunogénico en seres humanos, induciendo en un mono un anticuerpo de mono contra el antígeno humano y aislando el ácido nucleico de mono que codifica una porción reconocedora de antígeno de una región variable del anticuerpo de mono. Se proporciona un ácido nucleico humano que codifica una región constante humana de un anticuerpo y se une al ácido nucleico de mono para formar un ácido nucleico recombinante. Después, este ácido nucleico recombinante se expresa para producir el anticuerpo deseado. Como alternativa, puede usarse un ácido nucleico que codifica la región constante de chimpancé o mono para formar el anticuerpo recombinante. Existen pocas, si hay alguna, diferencias en la secuencia de aminoácidos de las regiones constantes del ser humano y de chimpancé (es decir, son homólogas), y las diferencias presentes entre el ser humano y el mono pueden alterarse fácilmente por técnicas convencionales si el ácido nucleico que codifica la región constante de mono se usa para formar un anticuerpo recombinante. Lo único que es crítico en la invención es que se produzca un anticuerpo que tenga menos inmunogenicidad que la región constante de mono, de forma que no se produzca una respuesta inmune significativa cuando el anticuerpo recombinante se introduzca en un ser humano. (En este documento, tales regiones de anticuerpo se denominan regiones homólogas). De esta forma, el anticuerpo recombinante se modifica por ingeniería genética para ser funcionalmente igual que el anticuerpo humano en su secuencia de aminoácidos, es decir, tiene una región constante homóloga a una región constante de anticuerpo de ser humano de chimpancé. En resumen, el anticuerpo es un anticuerpo tan humano como sea necesario para reducir la probabilidad de una respuesta inmunológica indeseada contra el anticuerpo, y contiene una porción de unión a antígenos de un anticuerpo de mono.

Por "no inmunogénico" se entiende que el anticuerpo no induce una respuesta de anticuerpo de suficiente magnitud como para reducir la eficacia de la administración continuada del anticuerpo en la mayoría de los seres humanos durante un período de tiempo suficiente como para conseguir eficacia terapéutica, por ejemplo, en comparación con un anticuerpo quimérico murino o murino-humano. Preferiblemente, no se observa ninguna respuesta de anticuerpo.

En las realizaciones preferidas, el método incluye inmortalizar una célula del mono que es responsable de producir el anticuerpo de mono, por ejemplo, por fusión de hibridoma, transformación viral con Herpes papio, clonación de una sola célula B (también denominada "inmortalización transitoria"), y producción de una biblioteca de inmunoglobulinas recombinantes. En otras realizaciones preferidas, el método incluye seleccionar una célula B de mono a partir de leucocitos de sangre periférica, el bazo, la médula ósea o un ganglio linfático; seleccionar un clon que produzca el anticuerpo apropiado; rescatar los genes de inmunoglobulina que codifican para ese anticuerpo a partir de la línea celular inmortalizada; y re-expresar los genes en una línea celular productora (es decir, una línea celular que ocasione una producción suficiente del anticuerpo útil para la terapia humana).

La invención se refiere a un anticuerpo recombinante formado a partir de una región constante humana o de chimpancé y una porción reconocedora de antígeno de una región variable de mono.

También se describe en este documento un anticuerpo monoclonal, o un Fab, (Fab)_{2}, un dímero de cadena ligera o cadena pesada, o cualquier fragmento recombinante mínimo, tal como un Fv o un SCA (anticuerpo de cadena única) u otro fragmento inmunológicamente eficaz (por ejemplo, una región CDR), contra un antígeno humano formado por una célula B de mono inmortalizada. Tales fragmentos son útiles como agentes inmunosupresores. Como alternativa, el anticuerpo de la invención puede tener unida una molécula efectora o indicadora. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede tener un macrociclo, para quelar un átomo de metal pesado, o una toxina, tal como ricina, unida al mismo por una estructura de puente covalente. Además, el fragmento Fc o el dominio CH3 de una molécula de anticuerpo completa puede reemplazarse por una enzima o molécula de toxina, y una parte de la cadena de inmunoglobulina puede unirse con un efector polipeptídico o molécula indicadora. También pueden construirse anticuerpos biespecíficos por un procedimiento convencional.

En otro aspecto, la invención hace referencia a composiciones farmacéuticas en las que se proporcionan anticuerpos de la presente invención para usos terapéuticos o profilácticos. Tales anticuerpos también pueden proporcionarse como inmunotoxinas, es decir, moléculas que se caracterizan por dos componentes y que son particularmente útiles para destruir células seleccionadas in vitro o in vivo. Un componente es un agente citotóxico que normalmente es fatal para una célula cuando se une o se absorbe. El segundo componente, conocido como "vehículo de suministro" proporciona un medio para suministrar el agente tóxico a un tipo celular particular, tal como células de carcinoma. Los dos componentes comúnmente se unen químicamente por cualquiera de una diversidad de procedimientos genéticos o químicos bien conocidos. Por ejemplo, cuando el agente citotóxico es una proteína y el segundo componente es una inmunoglobulina intacta, la unión puede realizarse mediante entrecruzamientos heterobifuncionales, por ejemplo, carbodiimida, glutaraldehído y similares. En la técnica se conoce bien la producción de diversas inmunotoxinas.

En otro aspecto relacionado, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo recombinante de humano/mono. En realizaciones preferidas, el ácido nucleico codifica una región constante humana o de chimpancé y una porción reconocedora de antígenos de la región variable de mono; y el ácido nucleico se purifica, es decir, se separa de los componentes biológicos con los que existe de manera natural, o más preferiblemente se proporciona como una solución homogénea.

También se describe en este documento un anticuerpo con CDR injertada formado a partir de al menos una de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), es decir, los restos de aminoácidos (usando el sistema de marcaje de aminoácidos convencional de Rabat) 31-35 (CDR 1), 50-65 (CDR 2) y 95-102 (CDR 3) de la cadena pesada especificada, y los restos de aminoácidos 24-34 (CDR 1), 50-56 (CDR 2) y 89-97 (CDR 3) de la cadena ligera especificada de una región variable de mono del viejo mundo, y una región flanqueante variable de inmunoglobulina de una segunda especie. El anticuerpo con CDR injertada es capaz de unirse al mismo antígeno que el anticuerpo de mono original. La región constante del anticuerpo se obtiene de una inmunoglobulina humana o de chimpancé. La metodología para realizar este aspecto se describe en líneas generales por Jones et al., 321 Nature 522, 1986. Tales injertos de CDR pueden alterarse si se desea para asegurar que parezcan más de tipo humano de modo que se reduzca la probabilidad de inducción de reacciones adversas contra el anticuerpo.

Esto puede conseguirse por inmortalización o selección de una célula de un macaco, que es responsable de producir un anticuerpo de macaco, y rescatar los genes de inmunoglobulinas de la célula; clonando y secuenciando los genes de anticuerpos responsables de la producción de anticuerpo; seleccionando una secuencia flanqueante de una región variable humana (preferiblemente con la homología más cercana a la región flanqueante variable de macaco); y sustituyendo las secuencias de CDR de macaco por secuencias de CDR humanas y pueden incluirse modificaciones minoritarias en la región flanqueante humana para mantener la afinidad del anticuerpo por este antígeno.

Por "modificaciones minoritarias" se entiende que puede sustituirse menos de un total de 6 aminoácidos en la región flanqueante por otros aminoácidos. Habitualmente, tales sustituciones o modificaciones se hacen sólo cuando esos aminoácidos están implicados en interacciones conformacionales que mantienen la región flanqueante en una forma apropiada de modo que se reconozca el antígeno deseado por el anticuerpo. Tales modificaciones generalmente reflejarán los aminoácidos que difieren presentes en un anticuerpo de mono, en comparación con un anticuerpo humano. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano justo antes de la CDR 3 de la cadena pesada, 92-94 generalmente es cisteína-alanina-arginina (se sabe que la arginina está remplazada en una minoría de anticuerpos por serina o treonina); en algunos anticuerpos en el mono la secuencia es cisteína-alanina-serina; por tanto, en este ejemplo, puede preferirse usar serina en el aminoácido 94 (véase Fig. 9D).

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para tratar a un ser humano que tiene un antígeno particular, por ejemplo, uno asociado a una enfermedad. El método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo recombinante específico para el antígeno particular, donde el anticuerpo recombinante es uno que tiene una región constante humana o de chimpancé y una porción reconocedora de antígenos de una región variable de mono, o una primera región constante de mono y una porción reconocedora de antígenos de una segunda región variable de mono diferente.

En realizaciones preferidas de los aspectos anteriores, el antígeno es un antígeno tumoral, un antígeno implicado en un trastorno inmune, un antígeno implicado en una respuesta autoinmune, un receptor expresado en una célula hospedadora, o un antígeno seleccionado entre los antígenos humanos CD58, VLA4, (integrina \alpha4B1), CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, receptor de células T humanas, CD3, CD8, CD23, CD41, CD44, CD45, CD71, TNF\alpha, TNF\beta, antígeno Tn, IL-1, IL-8, C5a, moléculas de adhesión, por ejemplo, VCAM, CD54, CD28, CD11a, CD11c, CD18 y CD11b, el producto del oncogen neu, MDR-1 (glicoproteína P), TGF\alpha y su receptor, y PDGF; y el anticuerpo recombinante es activo para reducir (destruir o eliminar) las células indeseadas (por ejemplo, anti-CD4) por medio de la actuación con el complemento, o de células destructoras, o es activo como un agente citotóxico o para causar la unión al receptor Fc por un fagocito. Como alternativa, el anticuerpo bloquea o estimula funciones del receptor o neutraliza productos solubles activos, tales como una o más de las interleuquinas, TNF y C5a.

En otros aspectos, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas de los anticuerpos anteriores o fragmentos de los mismos. Las composiciones o productos de acuerdo con la invención pueden proporcionarse convenientemente en forma de soluciones adecuadas para la administración parenteral, nasal u oral. Pueden mezclarse preparaciones apropiadas de anticuerpos con preparaciones apropiadas de otros agentes, obteniéndose una mayor utilidad clínica.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes tras la siguiente descripción de sus realizaciones preferidas, y por las reivindicaciones.

Descripción de las realizaciones preferidas

Primero se describirán brevemente los dibujos.

Dibujos

La Fig.1 es una representación en una tabla de 20 codones en nueve secuencias directoras de cadena pesada de Ig diferentes y 10 secuencias directoras de cadena pesada de Ig de mono;

la Fig. 2 es una representación esquemática de la estructura de diversas cadenas de Ig que muestran la posición relativa de las regiones directora, variable y constante, con las posiciones de los sitios de restricción y los cebadores usados para la amplificación;

la Fig. 3 es una representación esquemática de un vector de cassette de cadena pesada para la expresión de anticuerpos humanos o quiméricos;

la Fig. 4 es una representación esquemática de un vector de cassette de cadena ligera diseñado para la expresión de anticuerpos humanos o quiméricos;

las Fig. 5 y 6 son representaciones esquemáticas de vectores diseñados para la expresión de inmunoglobulinas a partir de ADNc de cadena ligera kappa o lambda, respectivamente. En estos vectores, los genes de inmunoglobulina se disponen en una configuración en tándem usando la neomicina fosfotransferasa como marcador selectivo;

las Fig. 7-1, 7-2, y 8 muestran la secuencia de ácido nucleico de diversos cebadores de secuencia directora útiles en la invención (estos cebadores de la Fig. 8 corresponden a los enumerados en la SEC ID NO. 1-12 infra;

las Fig. 9A a 9H son comparaciones de regiones humanas y de mono en las secuencias de VH1, VH2, VH3, VH4 y VH5, y en las secuencias VKI y VKII, y VlambdaIII, respectivamente;

la Fig. 10 es una comparación de secuencias de VH3 humanas y de mono, con una comparación con la secuencia de VH2 humana;

la Fig. 11 es una representación gráfica de la unión de un anticuerpo de la invención a un antígeno CD4 humano;

la Fig. 12 es una representación gráfica de la inhibición de la unión de 1F3 por el anticuerpo mostrado en la Fig. 10;

las Fig. 13 y 14 son porciones de las secuencias de nucleótidos de las regiones VH y VL anti-CD4, respectivamente;

la Fig. 15 es un gráfico que muestra actividad anti-CD54; y

la Fig. 16 es un histograma que compara las características de expresión de plásmidos.

Anticuerpos de Mono

Los monos del viejo mundo incluyen los denominados mandriles y macacos (incluyendo el mono Rhesus y el mono cynomolgus). Esta invención proporciona detalles del uso de la invención reivindicada con diversos genes de mono. Estos ejemplos no son limitantes de la invención y pueden aplicarse fácilmente a otros monos del viejo mundo.

Haciendo referencia a la Fig. 2, se muestra en forma esquemática la estructura general de genes que codifican cadenas pesadas de inmunoglobulina, ligeras kappa y ligeras lambda. Cada una de estas cadenas se forma con un codón de iniciación ATG seguido de una secuencia directora de aproximadamente 60 bases, una región que codifica una región variable de la inmunoglobulina, y una región constante de esa inmunoglobulina. En la Fig. 1 se muestran ejemplos de diferentes secuencias directoras, o péptidos señal, de cadenas pesadas. Estas secuencias, y su equivalente en mono, pueden determinarse por técnicas convencionales bien conocidas para el especialista habitual en la técnica, y como se describe más adelante.

Las secuencias mostradas en la porción inferior de la Fig. 1 son secuencias directoras humanas. Los solicitantes han descubierto que la construcción de cebadores complementarios a estas regiones directoras permite la amplificación de genes de Ig a partir de monos. Asimismo, pueden usarse cebadores homólogos a secuencias directoras de mono (véase, por ejemplo, la parte superior de la Fig. 1) en la amplificación de genes de inmunoglobulina de mono, y también para la amplificación de genes de inmunoglobulina humana.

Por medio del uso de tales cebadores en procedimientos de amplificación convencionales, pueden aislarse fácilmente genes que codifican diversos genes de inmunoglobulina de mono, y pueden determinarse las secuencias que codifican las regiones variables de los anticuerpos. Más adelante se proporcionan ejemplos de tales procedimientos. Los resultados de los análisis proporcionados más adelante se presentan en las Fig. 9A a 9H, y la en Fig.10. Sorprendentemente, el solicitante descubrió que, a pesar de la capacidad de producir anticuerpos contra antígenos humanos relativamente conservados en los monos, las secuencias estructurales de la región variable de los anticuerpos producidos de esta forma no se podían distinguir de las de anticuerpos humanos. Es decir, la cantidad de variabilidad en la secuencia de inmunoglobulina observada para los monos fue similar a la observada para los seres humanos, y fue imposible determinar qué anticuerpo procedían de un ser humano o mono sin analizar la propia fuente.

De esta forma, por ejemplo, con relación a la Fig. 10, la secuencia de aminoácidos de la región VH3 de ser humano se comparó con el mono. Los anticuerpos humanos mostraron un intervalo de homología entre ellos mismos del 83-98%, mientras que los de mono fueron homólogos en un 90-95% con la región VH3 humana. Por el contrario, la región VH2 humana fue homóloga a la VH3 humana en un 60%. [En este dibujo, al igual que en los otros dibujos, la presencia del mismo aminoácido en cualquier localización se muestra por un trazo, mientras que la presencia de un aminoácido diferente se muestra por el código de una letra convencional. Las posiciones a las que no pueden asignarse aminoácidos consenso se muestran como una X]. Asimismo, la homología para VH1, VH2, VH3, VH4 y VH5, y para VKI y VKII y Vlambda III se muestra en las Figs. 9A-9H, respectivamente. Una vez más, se observó una homología significativa entre la región de inmunoglobulina de mono y la de los seres humanos en cada región variable, incluyendo las secuencias de las regiones J de inmunoglobulina. Tal alta homología es similar a la observada entre anticuerpos humanos.

Más adelante, en los ejemplos, se presenta la metodología por la que se determinaron las secuencias. Los especialistas habituales en la técnica reconocerán que estos ejemplos no son limitantes en esta invención y que pueden obtenerse resultados equivalentes y anticuerpos monoclonales y quiméricos por procedimientos similares bien conocidos para los especialistas habituales en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 4.816.567; 4.978.745; 4.975.369; y 4.816.397, supra. Por ejemplo, después de la clonación de un gen que codifica una región variable de mono, tal gen se une fácilmente a uno que codifica una región constante de mono o humana, y los genes fusionados se expresan en una línea celular productora para producir el anticuerpo deseado. Más adelante se proporcionan ejemplos de tales procedimientos.

En los siguientes ejemplos, la primera etapa del método implica el aislamiento del ARN total de las células de sangre periférica o de bazo de mono. Pueden obtenerse células B de monos inmunizados a partir de sangre periférica o de ganglios linfáticos y pueden usarse directamente o pueden expandirse preferentemente. La expansión puede incluir la transformación del virus Herpes papio, fusión con una célula de mieloma heteróloga con la selección posterior, o la clonación de células B individuales en condiciones de dilución limitante en presencia de células T humanas estimuladas.

Después, el ARN total se convierte en ADNc monocatenario (ss) por la transcriptasa inversa usando cebadores oligonucleotídicos no específicos (oligo-dT o hexámeros aleatorios) o específicos (inmunoglobulina CH1 o CK o región constante Clambda). El ADNc monocatenario producido por esta reacción se amplifica usando la reacción en cadena de la polimerasa en la que se usan el ADNc ss, junto con desoxinucleótido trifosfatos, una ADN polimerasa (por ejemplo, una polimerasa termoestable) y cebadores específicos, para amplificar genes de inmunoglobulina de región variable de la cadena pesada o ligera. Los cebadores usados son oligonucleótidos sintéticos monocatenarios que varían de 20 a 40 bases, que contienen algunas bases degeneradas que se unen a la secuencia directora 5' de inmunoglobulinas. Se han diseñado seis cebadores de secuencia directora 5' diferentes (véase, la Fig. 7-1 que incorporan un sitio de enzimas de restricción (por ejemplo, SalI) para la amplificación de familias de región variable de cadena pesada de mono basándose en su similitud con las familias génicas de región variable de cadena pesada humana. Con cada uno de los seis cebadores de secuencia directora 5', se usa un cebador 3' específico para el dominio de región constante del isotipo relevante (por ejemplo, IgG, IgM, IgA o IgE) que también incorpora un sitio de enzimas de restricción (por ejemplo, NheI). Asimismo, para las cadenas ligeras kappa y lambda de mono, se usan otros pares de cebadores para la amplificación de la región variable de cadena ligera apropiada (Fig. 7-2).

Puede usarse otra serie de cebadores para incorporar diferentes sitios de restricción únicos para permitir la clonación direccional del ADN amplificado por PCR en un vector de expresión apropiado que posea el mismo sitio de restricción. También puede usarse una serie de cebadores que se unen al extremo 3' de la secuencia directora de cadena pesada de anticuerpo que incorpora un sitio Mlu1, o una serie de cebadores que se unen a las 23 primeras bases de la estructura, incorporando uno de ellos un sitio XhoI, y se describen en la Fig. 7-1. Los genes de región variable de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina de mono pueden clonarse en un vector lanzadera directamente después de la amplificación por PCR para permitir manipulaciones moleculares adicionales si es necesario, o clonarse directamente en un vector de expresión que contenga genes de región constante de cadena pesada o ligera humana. La configuración molecular de los genes de inmunoglobulina en el vector de expresión puede ser genómica, en la que están presentes regiones promotoras/potenciadoras de inmunoglobulina y otras regiones reguladoras así como secuencias donadoras/aceptoras en las uniones intrón/exón. Como alternativa, pueden insertarse genes de inmunoglobulina quiméricos en una configuración de ADNc usando secuencias promotoras/potenciadoras heterólogas virales.

Ejemplo 1 Secuencia de Anticuerpos de Mono

Las Figs. 7 y 8 muestran los cebadores con o sin sitios de restricción, respectivamente, usados en la amplificación por PCR de genes de inmunoglobulina procedentes de ADNc de mono y/o humano. Más adelante se proporcionan detalles de los procedimientos usados. El ARN se aisló a partir de células de bazo, de sangre periférica y de ganglios linfáticos de monos usando el método de isotiocianato de guanidinio convencional. Después, se usó la fracción de ARN total aislada por este método como plantilla para las reacciones de amplificación posteriores. Se incubó una alícuota del ARN en presencia de 200 unidades de transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney y cebadores oligonucleotídicos no específicos (oligo-dT o hexámeros aleatorios) o específicos (región CH1 de inmunoglobulina IgG o región CK constante de cadena kappa) (50-100 picomoles) para generar una sola cadena de ADNc con sentido no codificante. Después, el ADNc monocatenario producido por esta reacción se amplificó usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se incubó una alícuota del ADNc monocatenario junto con desoxinucleótido trifosfatos (20 \muM), una ADN polimerasa termoestable (2-5 unidades) y cebadores oligonucleotídicos sintéticos procedentes de ser humano (50 picomoles), para amplificar genes de inmunoglobulina de región variable de cadena pesada o ligera.

Usando los pares de cebadores mostrados en la Fig. 8, se amplificaron varias secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de cynomolgus representativas a partir de varias familias de genes. Estas secuencias amplificadas se clonaron en el sitio EcoRV del vector plasmídico p-Bluescript (pBS, disponible en Stratagene, CA) y se usaron para secuenciar el ADN. La secuenciación de ADN se realizó usando el ADN plasmídico que contenía el inserto clonado como una plantilla de ADN bicatenario y el método de secuenciación de terminación de cadena convencional.

En las Figs 9A - 9H se muestran secuencias representativas de inmunoglobulina de mono cynomolgus. En las Fig. 9A - 9H se incluyen las secuencias de aminoácidos consenso para genes de región variable humanos que representan cada una de las familias génicas de región variable principales. Se muestra la homología en porcentaje de cada una de las secuencias de mono con la secuencia consenso humana, excluyendo las regiones de dominio constante y las regiones CDR. El nivel de homología entre secuencias de ser humano y de mono para una familia dada es tan alto como entre dos secuencias humanas dentro de esa familia. Por lo tanto, es imposible distinguir entre secuencias de inmunoglobulina de región variable procedentes de monos del viejo mundo, y las procedentes de humanos basándose sólo en comparaciones de secuencia.

Aislamiento de ARN

Se obtuvieron células B específicas de antígeno de mono de varias formas: por fusión de células de ganglio linfático de mono inmunizado con la línea celular de moléculas de fusión de heteromieloma humano/de ratón K5H6/B5, y seleccionando posteriormente las líneas de hibridoma, por células B transformadas viralmente, o por técnicas de clonación de una sola célula B in vitro. En este último caso, el crecimiento de una sola célula B de mono se soportó in vitro por co-cultivo con células T humanas que se estimularon mediante anticuerpos. Se puso una sola célula B en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos con aproximadamente 150.000 células T humanas tratadas con mitomicina C estimuladas anti-CD3. Después de un período de incubación de 2 semanas, la célula B individual se expandió hasta al menos 200 células plasmáticas diferenciadas. El sobrenadante de cultivo de estos pocillos se ensayó con respecto a la presencia de inmunoglobulina mediante una técnica ELISA usando un anticuerpo de captura de inmunoglobulina de cabra anti-mono.

Las células procedentes de células transformadas viralmente específicas de antígeno o de hibridomas se desarrollaron hasta llegar a un número suficiente para la extracción de ARN. Se retiraron los pocillos de la técnica de clonación de una sola célula B in vitro que fueron positivos para la inmunoglobulina, se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato fría, pH 7,5 y se centrifugaron (1000 x g 10 minutos). Las células lavadas se suspendieron en 100 \mul de solución de lisis (isotiocianato de guanidinio 4 M, citrato sódico 25 mM, pH 7,0, sarcosina sódica al 0,5%, 2-mercapto-etanol 0,1 M). Se añadieron 100 \mul de acetato sódico 2 M, pH 4,0 y se mezclaron. La proteína se retiró añadiendo 100 \mul de fenol saturado con agua, mezclando y añadiendo 20 \mul de cloroformo/alcohol isoamílico (49:1). Después de la agitación vorticial y de la incubación en hielo durante 15 minutos, las muestras se centrifugaron a 10.000 x g durante 20 minutos. La fase acuosa se transfirió a un nuevo tubo, se mezcló con un volumen igual de isopropanol y se incubó durante 1 hora a -20ºC. El precipitado se recogió por centrifugación a 10.000 x g durante 15 minutos, se lavó con etanol al 70%, se volvió a centrifugar y el sedimento se secó en un Speedivac (Savant). El ARN seco se redisolvió una segunda vez en 100 \mul de tampón de lisis. Se añadió un volumen igual de isopropanol y se incubó a -20ºC durante una hora. El precipitado se recogió por centrifugación a 10.000 x g durante 15 minutos y se lavó con etanol al 70%. El sedimento se secó en un Speedivac (Savant) y se almacenó a -20ºC en etanol al 70% hasta su uso.

Síntesis de ADNc monocatenario

El ARN total extraído de las células procedentes de un solo pocillo se disolvió en 32 \mul de agua doblemente destilada a la que se añadieron 1 \mul (50-100 picomoles) de cebador (hexámeros aleatorios, oligo dT o cebadores específicos de 3' inmunoglobulina) y 10 \mul de tampón de transcriptasa inversa 5X (0,25 Tris-HCl pH 8,3, KCl 0,375 M, MgCl_{2} 15 mM, ditiotreitol 50 mM). La mezcla se calentó a 65ºC durante 5 minutos, después de lo cual se puso en hielo durante 2 minutos. Después del calentamiento, se añadieron 1 \mul de RNAsin (Promega), 5 \mul de desoxinucleótido trifosfatos 5 mM y 1 \mul (200 unidades) de transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (BRL), y la mezcla se incubó a 37ºC durante 1,5 horas. Después de terminar la reacción de la transcriptasa inversa, la mezcla de ADNc monocatenario/ARN se extrajo con fenol/cloroformo y se pasó a través de una columna rotatoria G-25 SEPHADEX de 1 ml. El material que pasó a través de esta columna se usó como ADNc ss de plantilla para la amplificación por PCR.

Amplificación de ADNc ss

Se mezclaron 3-10 \mul de ADNc ss con 10 \mul de tampón 10X PCR (KCl 500 mM, Tris-HCl 100 mM pH 8,3, MgCl_{2} 15 mM), 1,6 \mul de desoxinucleótido trifosfatos 1,25 mM, 50 picomoles de cebador 5' de inmunoglobulina específico, 50 picomoles de cebador 3' de inmunoglobulina específico y 2-5 unidades de ADN polimerasa termoestable (Synthetic Genetics). El volumen de reacción se llevó hasta 100 \mul con agua y se cubrió con 100 \mul de aceite mineral. La mezcla de reacción se incubó a las siguientes temperaturas durante los períodos de tiempo especificados.

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94ºC durante 1 minuto

48ºC durante 2 minutos

72ºC durante 2 minutos.

Este ciclo se repitió 30-35 veces. Los productos amplificados se examinaron por electroforesis en gel de agarosa usando un gel de agarosa al 1,2% y patrones de peso molecular. Los genes de región variable de inmunoglobulina amplificados salieron entre marcadores de aproximadamente 350-500 pb. Después, los productos amplificados por PCR se usaron para clonarse en el vector plasmídico apropiado.

Ejemplo 2 Clonación de Genes de Anticuerpo de Mono

Como las secuencias génicas de región variable de mono, a nivel del ADNc, no pueden distinguirse de los miembros humanos de la familia génica equivalente, es improbable que las respuestas inmunes a anticuerpos quiméricos de mono/humano, si existen, sean diferentes de las creadas contra moléculas de anticuerpo humano.

La tecnología de PCR puede usarse para introducir sitios de enzimas de restricción específicos, incluyendo (pero sin limitación) SalI, BglII, KpnI y NheI, en las secuencias de región variable del viejo mundo durante la reacción de amplificación por PCR usando cebadores basados en los de la Fig. 6. Los genes clonados pre-existentes se amplificaron a partir de su vector específico usando estos cebadores para introducir el sitio de restricción específico que posteriormente se usó para clonar el gen en un vector de expresión. Como alternativa, estos cebadores se usaron para la amplificación directa a partir del ARN celular.

Los vectores de expresión que se han construido son de dos tipos. El primero (véanse las Figs. 3 y 4) permiten insertar ADNc clonado de regiones variables de inmunoglobulina de monos en un vector de cassette, usando sitios de restricción únicos, en el que los elementos génicos de inmunoglobulina se disponen en una configuración genómica. Este tipo de vector incorpora un promotor de inmunoglobulina, los dos exones que constituyen la secuencia directora de inmunoglobulina, dos sitios de clonación SpeI y NheI, secuencias donadoras de empalme cadena abajo, una región potenciadora de inmunoglobulina, un gen de región constante humana (cadena pesada o ligera) y señales de poliadenilación cadena abajo. Además, incluyen un origen bacteriano de replicación, un gen beta-lactamasa para la selección bacteriana, y un gen de neomicina fosfotransferasa para la selección de G418, o un gen de xantina-guanina fosforribosil transferasa (gpt) para la selección con ácido micofenólico en células de mamífero. Los vectores de expresión de cadena pesada y ligera usan genes de neomicina fosfotransferasa (Neo) y xantina-guanina fosforribosil transferasa (Gpt) respectivamente como marcador selectivo.

El segundo tipo de sistema de expresión (véanse las Figs. 5 y 6) usa genes de inmunoglobulina en una configuración de ADNc. No están presentes intrones o sitios de empalme entre la secuencia 5' directora y la secuencias 3' de región constante. Este tipo de vector utiliza secuencias promotoras virales/potenciadoras heterólogas, que dirigen a los genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina dispuestos de una forma en tándem, secuencias de poliadenilación y un marcador de células de mamífero selectivo (Neo). El gen Neo puede modificarse para debilitar su traducción, por ejemplo, cambiando el codón cadena arriba y adyacente al sitio de iniciación del gen desde ACC a TCT. Además, está presente un gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr) para la posterior amplificación génica con metotrexato. Los genes de región variable de inmunoglobulina de mono que van a clonarse en vectores de expresión configurados con ADNc se amplificaron a partir de secuencias clonadas pre-existentes en el vector lanzadera (PBS), o directamente a partir de ARN con cebadores que contenían los sitios de restricción SalI o MluI y NheI, para la cadena pesada, o BglII y KpnI o BsiWI para cadenas ligeras kappa o lambda. Sin embargo, no se excluyen otros sitios de restricción únicos potenciales.

Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera quiméricos se introdujeron por separado o secuencialmente (para construcciones configuradas genómicamente), o en el mismo vector (para construcciones configuradas de ADNc), por electroporación en una línea celular productora. Se usó electroporación para introducir construcciones de ADN linealizadas en células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma de ratón, seguido de clonación de una sola célula de los transfectantes en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Las condiciones de electroporación que usaron un dispositivo de electroporación BTX-100 (BTX, San Diego) y una cubeta de plástico desechable de 1 ml proporcionaron números óptimos de transfectantes a partir de una cantidad dada de ADN del vector. En construcciones que contenían elementos reguladores virales se usaron células CHO que se adaptaron para crecer en suspensión en medio sin suero (CHO-S SFM II menos hipoxantina y timidina, Gibco).

Subclonación de genes de región variable de Ig

Los productos de la reacción de PCR se extrajeron con fenol/cloroformo y se pasaron a través de una columna rotatoria SEPHADEX G-25 de 1 ml. Si el fragmento de ADN se iba a clonar con extremos romos en un plásmido, se añadieron 1 \mul de MgCl_{2} 1 M, 0,5 ml de desoxinucleótido trifosfatos 1,25 mM y 1 \mul de ADN polimerasa de Klenow (5 unidades) a la mezcla de reacción de PCR total (100 \mul) y la mezcla se incubó a 37ºC durante 15 minutos para rellenar cualquier saliente 5'. Antes de la clonación con extremos romos en un plásmido, los extremos 5' se fosforilaron como sigue; se añadieron 5 \mul de ATP 10 mM y 1 \mul de polinucleótido quinasa de T4 (10 unidades) a la mezcla de reacción total y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Los fragmentos amplificados que contenían sitios de restricción internos primero se cortaron con la enzima de restricción apropiada y se usaron directamente para la unión sin fosforilación. En ambos casos, el fragmento a clonar se extrajo con fenol/cloroformo antes de unirse al vector apropiado.

Para la reacción de unión, el 10% del fragmento amplificado por PCR cortado con enzima de restricción o fosforilado se mezcló con aproximadamente 2 ng del vector apropiado (volumen total 8 \mul), previamente digerido con la enzima o las enzimas de restricción. Para la clonación de extremos romos, se usó pBluescript digerido con EcoRV. Para la clonación de extremos adherentes, se usó el vector TCAE 5.2 o 6.2 o pGenex-H o pGenexL, cortado con enzimas de restricción apropiadas. Se añadió 1 \mul de tampón de unión 10X (Tri-HCl 500 mM pH 7,6, MgCl_{2} 100 mM, ATP 10 mM, ditiotreitol 10 mM), 1 \mul de ADN ligasa de T4 (1 unidad), y se dejó que la reacción procediera a 14ºC durante una noche. El material unido se usó para transformar células E. coli HB101 competentes usando el método de transformación de cloruro de calcio convencional. Las bacterias transformadas se seleccionaron por crecimiento en placas de agar que contenían ampicilina LB. Se seleccionaron colonias individuales y se desarrollaron durante una noche en medio LB que contenía ampicilina y el ADN plasmídico se extrajo usando el método de lisis alcalina convencional. Después del análisis de restricción para determinar los clones que contenían insertos de inmunoglobulina, se preparó el ADN para la secuenciación.

Secuenciación de genes clonados

Se secuenciaron genes de región variable de inmunoglobulina clonados usando un método de terminación de cadena convencional. Como plantilla de secuenciación se usó ADN plasmídico de doble cadena que contenía el inserto clonado. Antes de la secuenciación, el ADN de doble cadena se desnaturalizó químicamente. El ADN se secuenció usando ADN polimerasa de T7 SEQUENASE (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH), alfa desoxiATP radiomarcado y los siguientes cebadores de secuenciación: (5' CAGAGCTGGGTACGTCCTCA 3') y (5' GCCCCCAGAGGTGCTCTTGG 3') para la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina G en las direcciones 5' a 3' y 3' a 5' respectivamente. (5' CAGAGCTGGGTACGTGAACC 3') y (5' GGCTTGAAGCTCCTCAGAGG 3') para la región variable de cadena ligera lambda de inmunoglobulina en las direcciones 5' a 3' y 3' a 5', respectivamente. Los productos de reacción se separaron en geles de poliacrilamida al 6% y se leyeron.

Los resultados de la secuenciación de varios genes de región variable ligera y pesada de inmunoglobulina de mono del viejo mundo se resumen en las Figs. 9A - 9H. La clonación y secuenciación de genes de inmunoglobulina de monos cynomolgus no se han descrito previamente en la bibliografía. Por lo tanto, tampoco ha sido posible definir el grado de homología entre los genes de región V de seres humanos y de monos cynomolgus. Se ha descrito la homología entre un solo gen lambda variable de chimpancé y su homólogo genómico humano, mostrando una diferencia de sólo un 2% en las regiones estructurales.

Transfección y selección

Después de secuenciar genes de región variable de cadena ligera y pesada clonados, se subclonaron en vectores apropiados para la expresión. Éstos pueden ser vectores construidos con elementos reguladores de inmunoglobulina en una configuración genómica (como se muestra en las Figs. 3 y 4), o con elementos reguladores virales usando una configuración de ADNc (Figs. 5 y 6). Pueden diseñarse sitios de restricción apropiados (SpeI y NheI) en los cebadores de amplificación por PCR durante la etapa de amplificación inicial o, por el contrario, pueden usarse cebadores de amplificación que contienen sitios de restricción para amplificar genes de inmunoglobulina a partir de los vectores lanzadera en los que se han clonado. Como alternativa, los genes de región variable de inmunoglobulina pueden clonarse directamente en vectores de expresión después de la amplificación por PCR a partir de ARN, de forma que no sea necesaria la subclonación.

Electroporación

Se usó electroporación para cotransfectar construcciones genómicas de cadena pesada y ligera o transfectar secuencialmente construcciones genómicas de cadena ligera y pesada en células Sp2/0. En las transfecciones secuenciales, la electroporación de la construcción de cadena ligera quimérica se continuó por la selección en ácido micofenólico. La selección de sobrenadantes de cultivo de clones, cultivados en placas de 96 pocillos, con respecto a la producción de cadena ligera con antisuero contra región constante de cadena ligera humana usando una técnica ELISA, permitió la selección de los clones con la mayor expresión de cadena ligera. La electroporación posterior de los transfectantes de cadena ligera con un vector que contenía la construcción de inmunoglobulina de cadena pesada quimérica de mono/humano permitió la selección de transfectomas que expresaban anticuerpo quimérico de la especificidad y del isotipo deseados.

La construcción de cadena ligera pGENX-L (Figs. 3 y 4) se utilizó para transfectar la línea celular de mieloma murino Sp2/0 por electroporación como se indica a continuación. Se mezclaron células SP2/0 a una concentración de 1 x 10^{7}/ml en tampón de transfección (sacarosa 272 mM, fosfato sódico 7 mM pH 7,4, MgCl_{2} 1 mM) con 50 \mug de pGENEX-L que contenía el gen de cadena ligera clonado apropiado, que previamente se había linealizado por digestión con la enzima de restricción PvuII. Las células se pusieron en una cubeta de espectrofotometría de plástico desechable de 1 ml y se insertaron electrodos de placa a una distancia de 3,5 mm en la cubeta. Usando un aparato de transfección BTX-100 (BTX, Inc), las células recibieron pulsos de corriente durante 500 microsegundos de tal forma que se produjo la muerte de aproximadamente un 50% de las células. Este valor se determinó antes de la transfección sometiendo las células a pulsos, en ausencia de ADN, de aumento del voltaje y midiendo el número de células supervivientes 24 horas después. Se representó gráficamente el voltaje frente a la viabilidad celular y el voltaje correspondiente al 50% de la muerte celular se usó para todos los experimentos de electroporación posteriores. Usando el aparato BTX-100 se descubrió que el valor óptimo era un pulso a una amplitud de 200 durante 500 microsegundos. Después de someter las células a pulsos, se dejó que se recuperaran en hielo durante 15 minutos antes de ser transferidas a placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía suero de ternero fetal al 5% y medio acondicionado de Sp2/0 al 10%. Las células se cultivaron en placas a una concentración a la que se observaba el crecimiento celular en aproximadamente 1 de cada 3 de los pocillos después de la selección con el fármaco adecuado. Este parámetro se determinó para cada experimento de electroporación cultivando números variables de células sometidas a electroporación por pocillo (1000 - 10000) y seleccionando las células que habían incorporado el plásmido. Después de 2-3 semanas de la selección, se contó el número de pocillos en cada placa que mostró crecimiento celular. De esta forma, se determinó el número apropiado de células que proporcionó de 1 de cada 3 pocillos positivos con una concentración dada de un plásmido particular, para uso en experimentos futuros.

Directamente después de la electroporación, las células se pusieron en medio sin fármaco. Se añadió medio nuevo dos días después de la electroporación que contenía G418 o ácido micofenólico para las células que mostraban actividad neomicina fosfotransferasa o actividad guanosin fosfotransferasa, respectivamente. Las células se alimentaron cada dos días durante la primera semana y en lo sucesivo dos veces por semana. La concentración de fármaco a usar se determinó incubando las células en presencia de concentraciones crecientes de fármaco y controlando la viabilidad celular. La concentración de fármaco usada fue dos veces la que proporcionó una destrucción del 100%. Para Sp2/0, se requirió aproximadamente un microgramo de ácido microfenólico/ml y para G418 se requirieron aproximadamente 800 \mug/ml.

Las células se sometieron a electroporación de varias formas, se sometieron a co-electroporación los vectores genómicos de cadena ligera o pesada (pGenex-H y pGenex-L), o se sometió a electroporación sólo la cadena ligera. En este último caso, los clones se seleccionaron para la expresión de alto nivel de la cadena ligera de inmunoglobulina quimérica usando una técnica ELISA. Después, estos clones se desarrollaron y se sometieron a electroporación con el vector que contenía cadena ligera. Cuando se usaron construcciones génicas en tándem de ADNc, el vector de expresión (TCAE5.2 o TCAE6) primero se linealizó por digestión con la enzima de restricción NotI. Una sola electroporación fue suficiente para conseguir la integración tanto de genes de cadena pesada como de genes de cadena ligera. Después de 2-3 semanas, los sobrenadantes de los pocillos que continúan creciendo en presencia del fármaco apropiado se ensayaron con respecto a la secreción de la cadena ligera de inmunoglobulina quimérica o de inmunoglobulina entera usando una técnica ELISA. Los genes de inmunoglobulina en una configuración de ADNc se sometieron a electroporación en células Sp2/0, como se ha descrito anteriormente, o en células de ovario de hámster chino (CHO) adaptadas para crecer en suspensión en medio sin suero. Las células CHO se sometieron a electroporación usando un aparato de electroporación BTX 600, establecido a las condiciones para conseguir el mayor número de colonias resistentes a G418. Estas condiciones fueron 210 voltios, 400 \muF y 13 ohmios. Después de la electroporación, las células se contaron, se lavaron en tampón de transfección, se resuspendieron en el mismo tampón y se colocaron en hielo durante 15 minutos. Las células se ajustaron a 1 x 10^{7} células vivas/ml y se pusieron 400 \mul de suspensión celular en una cubeta desechable estéril de 0,4 ml (BTX Inc.). Se resuspendieron 25 \mug de ADN del vector TCAE 5.2 o TCAE 6 linealizado con Not 1, que contenía genes de región variable de inmunoglobulina de macaco clonados, en tampón de TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) a 1 \mug/ml y se añadieron a la suspensión celular. La electroporación se realizó descargando el aparato, usando la carga automática y el botón de pulsos. La cubeta se puso en hielo durante 15 minutos, las células se diluyeron en 120 ml de medio sin suero y se pusieron en seis placas de 96 pocillos (200 \mul por pocillo que contenía aproximadamente 6.667 células sometidas a electroporación o 3.333 células vivas por pocillo). Para esta línea celular se establecieron parámetros de electroporación independientes y la selección por G418 se realizó a 400 \mug/ml.

Selección para la producción de anticuerpos

La presencia de anticuerpos humanos, de mono o quiméricos secretados por transfectantes se ensayó mediante una técnica ELISA como se indica a continuación: se recubrieron plaquetas de fondo plano de 96 pocillos (Dynatech) con IgG de cabra anti-humana o kappa a 200 ng/pocillo en tampón de recubrimiento (0,8 mg/ml de carbonato sódico, 1,55 mg/ml de bicarbonato sódico, pH 9,6) y se incubaron durante al menos 16 horas a 4ºC. El tampón de recubrimiento se retiró y los pocillos se bloquearon con 120 \mul de tampón de bloqueo (albúmina de suero bovino al 1% en solución salina tamponada con fosfato que contenía azida sódica al 0,2%) y se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Se añadieron hasta 125 \mul de sobrenadante de cultivo celular a los pocillos que contenían tampón de bloqueo y se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Después, las placas se lavaron cinco veces con PBS. Se añadieron 100 \mul de IgG de cabra anti-humana marcada con peroxidasa de rábano picante (o kappa) diluida a 1:1000-1:5000 en tampón de dilución (albúmina de suero bovino al 1%, Tween-20 al 0,05%, azida sódica al 0,02% en PBS). Las placas se incubaron a 37ºC durante 1 hora y después se lavaron cinco veces con PBS. El anticuerpo quimérico se detectó con 100 \mul de peróxido de hidrógeno y el substrato, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (1:1 v/v) por pocillo. La reacción de color se terminó después de 2 a 5 minutos con 100 \mul de ácido sulfúrico 2M por pocillo.

Los especialistas habituales en la técnica pueden realizar fácilmente metodologías equivalentes a las descritas anteriormente. Los ejemplos de tal tecnología incluyen inmortalización de células B seleccionadas por fusión de hibridoma, como se ha descrito anteriormente, con la línea celular K5H6/B5 descrita por Carroll et al., 164 J. Experimental Medicine 1566, 1986, o una línea celular equivalente, tal como SPAZ4 (disponible en Sandoz, véase, Ehrlich et al., 34 Clin. Chem. 1681, 1988). Pueden construirse fácilmente líneas celulares similares por técnicas convencionales usando la metodología disponible públicamente. Como alternativa, pueden seleccionarse genes de inmunoglobulina a partir de: (a) células inmortalizadas por transformación viral con Herpes papio, como se describe por Markova et al., 30 Vopr Virusol 549, 1985, o con un virus equivalente, (b) por clonación de una sola célula B para proporcionar una inmortalización transitoria, como se describe por Amaroso y Lipske 145 J. Immunology 3155, 1990, o (c) mediante el uso de bibliotecas de bacteriófago de inmunoglobulinas recombinantes, como se describe por Huse et al., 246 Science 1275, 1989 y McCafferty et al., 348 Nature 552, 1990. La selección de los clones que contienen los anticuerpos apropiados puede realizarse por las técnicas descritas anteriormente, o por técnicas equivalentes bien conocidas para los especialistas habituales en la técnica, y el gen de inmunoglobulina deseado puede rescatarse de la línea celular inmortalizada. Además, el anticuerpo producido por células B de mono aisladas puede usarse en terapia humana, sin manipulación para formar un anticuerpo quimérico.

La región constante humana puede obtenerse por técnicas convencionales, con cualquier isotipo deseado bien conocido para los especialistas habituales en la técnica, y la región variable de un anticuerpo de mono puede unirse con la región constante humana. Los anticuerpos quiméricos particularmente útiles contra receptores de la superficie celular específicos que pueden usarse en inmunoterapia de seres humanos incluyen CD4, ICAM, CD19, CD20, CD8, CD11a, CD11b, CD28, CD18, CD45, CD71 y TCR.

Ejemplo 3 Clonación y Expresión de un Anticuerpo Quimérico de Mono/Humano con Especificidad para CD4

A continuación se proporciona un ejemplo específico de los métodos y anticuerpos de esta invención.

Generación de Líneas de Células B Inmortalizadas de Mono

Se inmunizó por vía intramuscular un mono cynomolgus adulto (White Sands New Mexico Primate Center), en múltiples sitios, con 150-300 \mug de CD4 soluble (sCD4) o membranas celulares (1 x 10^{8} células) procedentes de la línea celular CD4 positiva supT1 usando un adyuvante convencional. La inmunización se repitió cada 2-3 semanas durante un total de seis veces. El mono se sometió a una dosis de refuerzo por medio de la inyección de 100 \mug de sCD4 en la región inguinal de un muslo, y una semana después se extrajo quirúrgicamente el ganglio linfático drenante del mismo muslo. Se extrajeron linfocitos del ganglio linfático cortando el tejido y aclarando con medio DMEM estéril. La suspensión celular se pasó a través de una gasa de nylon y se recogió por centrifugación a 1000 x g durante 10 minutos.

Se suspendieron aproximadamente 1 x 10^{8} linfocitos en tampón de cloruro de Tris-amonio (16 mM, pH 7,5) y se calentaron a 37ºC durante 5 minutos para lisar los eritrocitos. Los linfocitos se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en L-leucina metil éster (LME) y se incubaron a 37ºC durante 45 minutos. Las células tratadas con LME se filtraron a través de un tamiz de nylon y se centrifugaron. Se añadió 1 ml de suero de ternero fetal, las células se suspendieron y se lavaron dos veces en RPMI sin suero. Las células se contaron y se mezclaron en un solo tubo de centrífuga cónico de 50 ml junto con un número igual de células de heteromieloma K6H6/B5, prelavadas dos veces en medio sin suero. Las células se suspendieron suavemente en 1 ml de PEG al 50% (polietilenglicol) añadido lentamente con agitación suave durante un período de tiempo de 1 minuto. Después, las células se resuspendieron por la adición de 20 ml de medio sin suero durante un período de 5 minutos, con mezcla suave para diluir el PEG. Después de lavar dos veces con medio sin suero, las células se resuspendieron a una concentración de 5 x 10^{5}/0,1 ml en medio RPMI, que contenía suero de ternero fetal al 20% y gentamicina, y se pusieron en microplacas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a 0,1 ml por pocillo. Se añadió un volumen igual de medio HAT (0,1 ml) a cada pocillo y los híbridos permitieron el crecimiento durante 14-17 días después la selección.

Selección de Híbridos de Células Fusionadas para la Producción de Anti-CD4

El ensayo para determinar la especificidad anti-CD4 fue el siguiente: se recubrieron placas ELISA con sCD4 recombinante a una concentración de 100 ng por pocillo y se bloquearon con albúmina de suero bovino al 1% en PBS. Se retiraron alícuotas de 50 \mul de sobrenadante de hibridoma de cada uno de los pocillos y se dejaron incubar con las placas recubiertas de sCD4 durante 60 minutos. La unión se detectó por incubación con Ig de cabra anti-mono o de cabra anti-humano marcada con ^{125}I durante 60 minutos. Después de lavar cuatro veces con agua destilada, los pocillos se contaron en un contador gamma. Los pocillos positivos se volvieron a ensayar por duplicado y las células de hibridoma de esos pocillos se subclonaron tres veces, primero a 5 células por pocillo, y después dos veces a una célula por pocillo. En esta etapa, los positivos anti-sCD4 se seleccionaron en cuanto a la capacidad de unirse al CD4 de la superficie celular. Esto se realizó por inhibición de la unión de un monoclonal murino anti-CD4, denominado 1F3, con la línea celular CD4 positiva supT1. En resumen, esto se realizó coincubando diferentes cantidades de anti-CD4 de mono y 10 ng de 1F3 marcado con ^{125}I con 3 x 10^{5} células supT1/pocillo en una placa de 96 pocillos. Después de incubar durante 1 hora a temperatura ambiente (aproximadamente 20-25ºC), las células se retiraron al vacío en filtros de fibra de vidrio. Después de un lavado extensivo con PBS, los filtros se contaron en un contador gamma para determinar la inhibición de la unión de 1F3 a células supT1 por los sobrenadantes de hibridoma de mono.

Se eligió un clon candidato que producía un anticuerpo que mostraba una fuerte inhibición contra 1F3. El clon que elegimos se isotipificó usando reactivos de isotipificación humanos y se descubrió que era una IgG2 que poseía una cadena ligera lambda. Esta línea celular se desarrolló hasta números superiores para la clonación de sus genes de inmunoglobulina.

Clonación de Genes de Región Variable de Cadena Ligera y Pesada a partir de Células B Inmortalizadas de Mono

Se aisló el ARN total a partir de 1 x 10^{7} células B inmortalizadas de mono usando el método de isotiocianato de guanidinio descrito anteriormente. Se usó una décima parte del ARN total para obtener ADNc monocatenario usando un cebador oligonucleotídico oligo-DT y transcriptasa inversa, también como se ha descrito anteriormente. Se usó una décima parte de la cantidad de ss ADNc para establecer las reacciones de PCR. Cada una de las seis reacciones de PCR incluía uno de seis cebadores oligonucleotídicos específicos de la familia V_{H} 5' que contenía un sitio de restricción Sal I junto con un oligonucleótido de región constante 3' de IgG que contenía un sitio Nhe I, ambos mostrados en la figura 7-1. Asimismo, se realizaron cinco reacciones de PCR, utilizando uno de cinco cebadores oligonucleotídicos de secuencia directora 5' lambda que contenía un sitio Bgl II y un cebador de región constante 3' lambda que contenía un sitio Avr II. Las condiciones de reacción fueron como se ha descrito anteriormente. Cada reacción de PCR se realizó por triplicado. Los productos de cada una de las reacciones de amplificación de cadena ligera y pesada se procesaron sobre geles de agarosa al 1,2%. El cebador de cadena pesada VH4 (SEC. ID, Nº: 13: 5' ACTAAGTCGACATGAAACACCTGTGGTTCTT 3') y el cebador lambda (SEC. ID, Nº: 14: (5' ATCACA
GATCTCTCACCATGACCTGCTCCCCTCTCCTCC 3') proporcionaron fuertes bandas sobre electroforesis en gel de agarosa. Los productos de estas reacciones se usaron para clonarse en el vector TCAE 6, que contiene secuencias de región constante lambda humana e IgG1 humana.

La clonación de los dos genes de región variable en el vector de expresión TCAE 6 se realizó secuencialmente. Primero, el producto de PCR de cadena pesada y el vector TCAE 6 se digirieron con las enzimas de restricción Sal I y Nhe I, los productos se extrajeron con fenol/cloroformo y se pasaron a través de una columna rotatoria SEPHADEX G-25. El producto de PCR se unió al vector cortado durante una noche a 14ºC en presencia de ADN ligasa de T4. Se unieron aproximadamente 500 mg de ADN total en un volumen de 10 \mul con una relación molar de inserto/vector de 10:1. El material unido se usó para transformar células XL-1 Blue competentes (Stratagene) y las células transformadas se cultivaron en placas de agar LB que contenían 500 \mug/ml de ampicilina. Las colonias de bacterias resistentes a ampicilina se seleccionaron y se desarrollaron como minicultivos de 5 ml. Se extrajo el ADN plasmídico de cada uno de estos cultivos mediante un método de lisis alcalina convencional cortando con las enzimas de restricción Sal I y Nhe I, y los productos se procesaron sobre un gel de agarosa al 1,2%. Como plantillas para la posterior clonación de regiones variables de cadena ligera se usaron plásmidos con insertos de aproximadamente 450 pb. Los productos de la reacción de PCR de cadena ligera así como el plásmido que contenía el inserto de cadena pesada se cortaron con las enzimas de restricción Bgl II y Avr II y se unieron entre sí. Los minicultivos de plásmido se seleccionaron cortando con Bgl II y Avr II. Las digestiones que proporcionaron un inserto de aproximadamente 400-450 pb se consideraron positivas. Los plásmidos que contenían tanto insertos Sal I/Nhe I como insertos Bgl II/Avr II se cultivaron en mayores cantidades para la secuenciación de ADN.

Los vectores de expresión de anticuerpo quimérico en tándem TCAE 5.2 y TCAE 6 procedían del vector CLDN, que es un derivado del vector RLDN10b (253 Science 77-79, 1991). A su vez, RLDN10b es un derivado del vector de expresión TND (7 ADN 651-661, 1988).

RLDN10b difiere del vector TND de las siguientes formas. El cassette transcripcional de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (promotor, ADNc y región de poliadenilación) se puso entre el cassette activador de plasminógeno tisular (cassette de expresión t-Pa) y el cassette de neomicina fosfotransferasa (NEO), de forma que los tres cassettes estén en tándem y en la misma orientación transcripcional. Además, el promotor del gen DHFR en CLDN se ha reemplazado por el promotor principal de la beta globina de ratón (3 Mol. Cell Biol. 1246-54, 1983) y el ADNc de t-PA se ha reemplazado por un poliengarce. Los tres cassettes transcripcionales eucariotas (Expression, DHFR, NEO) pueden separarse del ADN del plásmido bacteriano (derivado de pUC9) por digestión con la endonucleasa de restricción
Not I.

CLDN difiere de RLDN10b porque el LTR de Rous delante del poliengarce se ha reemplazado por el potenciador del promotor del gen temprano inmediato del citomegalovirus humano (41 Cell, 521, 1985).

Los vectores de expresión TCAE 5.2 y TCA 6 difieren de CLDN en que:

1) contienen cuatro cassettes transcripcionales (en lugar de tres), en orden en tándem:

(a)

Una región constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana obtenida por amplificación de ADNc por una reacción en cadena de la polimerasa. En TCAE 5.2, ésta es la región constante kappa de cadena ligera de inmunoglobulina humana (numeración de aminoácidos de Kabat 108-214, alotipo Km3), y en TCAE 6 la región constante lambda de cadena ligera de inmunoglobulina humana (numeración de aminoácidos de Kabat 108-215, genotipo Oz menos, Mcg menos, alotipo Ke menos)

(b)

Una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana; en las dos construcciones, la cadena pesada de inmunoglobulina humana era una región constante gamma 1 (numeración de aminoácidos de Kabat 114-478, alotipo Gm1a, Gm1z), que se obtuvo por amplificación de ADNc por una reacción en cadena de la polimerasa.

(c)

DHFR; que contiene su propio promotor eucariota y región de poliadenilación.

(d)

NEO; que también contienen su propio promotor eucariota y región de poliadenilación.

3) Los cassettes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina humana contienen secuencias señal sintéticas para la secreción de las cadenas de inmunoglobulina.

4) Los cassettes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina humana contienen engarces de ADN específicos que permiten la inserción de regiones variables de inmunoglobulina ligera y pesada que mantienen la fase de lectura traduccional y no alteran los aminoácidos encontrados normalmente en las cadenas de inmunoglobulina. La incorporación de los cambios descritos, condujo a la construcción de los vectores TCA 5.2 y TCA 6. La clonación de los genes de región variable de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina, a partir de la línea celular de heterohibridoma anti-CD4 E9.1, en TCAE 6 condujo a la construcción que se deposita en el ATCC. La construcción, que se ha depositado, contiene la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de mono cynomolgus y la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de mono cynomolgus, cuyas secuencias se muestran en las Figuras 13 y 14 respectivamente, clonadas a partir de la líneas de células de hibridoma anti-CD4 E9.1. La región constante de cadena pesada es de origen humano del isotipo gamma 1 y de alotipo Gmla, Gmlz. La región constante de cadena ligera lambda también es de origen humano, de genotipo Oz menos, mcg menos y de alotipo Ke menos. Los genes de inmunoglobulina se clonan en el vector de expresión de mamífero TCAE 6, mostrado en la Figura 6, que, cuando se introdujo por electroporación en la línea de células de mamífero CHO produjo un anticuerpo quimérico anti-CD4 de mono/humano. La construcción de ADN descrita en este documento se ha usado para transformar la cepa bacteriana XL-1 Blue, seleccionada en el antibiótico ampicilina y depositada como una suspensión de células bacterianas en medio LB estéril que contiene glicerol al 15%.

Otro sistema de expresión útil es uno en el que el gen que codifica un marcador selectivo se modifica para potenciar el rendimiento de sistemas recombinantes que codifican una secuencia deseada. Por ejemplo, la alteración del inicio de la traducción de un marcador selectivo dominante produce menos colonias resistentes a fármaco en comparación con el vector no alterado, pero cada colonia individual expresa niveles significativamente superiores de producto génico unido que en el vector no alterado. Por ejemplo, el inicio de la traducción es la primera etapa en la síntesis de proteínas. El sitio de inicio de la traducción del gen de neomicina fosfotransferasa (gen de resistencia a G418) se cambió desde una secuencia Kozak consenso (secuencia-ccAccATGG) a una secuencia Kozak deficiente (secuencia-ccTccATGC). La alteración del inicio de la traducción del gen de resistencia a G418 dio como resultado: 1) una reducción significativa (5 veces) del número de colonias resistentes a G418 obtenidas a partir de una misma cantidad de ADN plasmídico transfectado por célula, y 2) un aumento significativo en la cantidad de gen de producto unido expresado en cada clon. En los clones que contienen la secuencia consenso Kozak, el 73% de las colonias seleccionadas produjeron menos de 25 ng/ml, produciendo sólo un 3% más de 100 ng/ml. Para los clones con la secuencia Kozak más deficiente alterada, el 8% de las colonias seleccionadas produjeron menos de 25 ng/ml, en comparación con el 63% de las colonias que producían más de 100 ng/ml. Específicamente, haciendo referencia a la Fig. 16 (donde TCAE 5.2 tiene una secuencia Kozak consenso y TCAE 12 tiene una secuencia Kozak más deficiente), se obtuvieron 258 colonias a partir de dos electroporaciones de 25 mg de ADN que contiene un gen de neomicina fosfotransferasa con un sitio de inicio de la traducción consenso (invariable). 201 de estas colonias (78%) no expresaban ningún producto génico detectable (es decir, <25 ng/ml de inmunoglobulina quimérica), y sólo 8 colonias (3%) expresaron más de 100 ng/ml. Se obtuvieron 98 colonias a partir de 6 electroporaciones de 25 \mug de ADN que contiene el gen de neomicina fosfotransferasa con un sitio de inicio de la traducción alterado. El 63% de estas colonias estaban expresando más de 100 ng/ml, y sólo un 8% de estas colonias expresaron menos de 25
ng/ml.

Secuenciación del ADN

Se preparó ADN plasmídico a partir de cultivos de 100 ml. Se purificó adicionalmente por precipitación (1 volumen) con una mezcla de cloruro sódico 2,5 M y polietilenglicol al 20% (6 volúmenes) en hielo durante 15 minutos. Después de la centrifugación a 10.000 x g durante 20 minutos, el sedimento se lavó con etanol al 70%, se recentrifugó y se secó en un Speedivac (Savant). El sedimento de ADN se resuspendió en agua desionizada a una concentración de 150-250 \mug/ml. La secuenciación se realizó en 5 \mug de ADN de doble cadena usando la técnica de Sanger. Se usaron cebadores de secuenciación que fueron homólogos a secuencias dentro del vector de expresión cadena arriba y cadena abajo de los insertos de cadena ligera o cadena pesada. Los insertos se secuenciaron tanto en la dirección 5' a 3' como en la dirección 3' a 5'. Se secuenciaron dos clones de cadena ligera anti-CD4 y dos clones de cadena pesada anti-CD4, generados cada uno a partir de reacciones de PCR separadas, en paralelo, para determinar si durante la reacción de PCR se había introducido algún cambio de nucleótidos. Se descubrió que los dos clones de cadena pesada y los dos clones de cadena ligera elegidos eran idénticos en toda su longitud, lo que confirma que no se habían introducido errores durante el proceso de amplificación. La secuencia de las cadenas pesada y ligera anti-CD4 se muestran en las Figuras 13 y 14 y en la Lista de Secuencia números: 15 y 16.

\newpage

Expresión de Anti-CD4 quimérico de Mono/Humano

Los vectores de expresión TCAE 5.2 y TCAE 6 no sólo pueden usarse para la expresión integrada estable en las líneas celulares Sp2/0 y CHO sino que, como incluyen el origen de SV40 también pueden expresarse de forma transitoria en la línea celular COS. La expresión de las células COS se realizó como se indica a continuación: se sembraron células COS un día antes de la transfección de forma que tuvieran una confluencia del 50-70% al día siguiente. Se retiró el medio de cultivo y las células se lavaron dos veces con tampón de transfección (TB - NaCl 140 mM, Tris 25 mM, KCl 5 mM, Na_{2}HPO_{4} 0,5 mM, MgCl_{2} 1 mM, CaCl_{2} 1 mM). Se mezclaron 30 \mug de plásmido TCAE 6 purificado con cloruro de cesio que contenía las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera quiméricas de mono/humano anti-CD4 con 3 ml de DEAE dextrano por placa (1 mg/ml en TB). El ADN se dejó incubar con las células durante 1 hora a 37ºC. La solución de ADN se retiró y se reemplazó con 3 ml de glicerol al 20% durante 1,5-2,5 minutos, después de lo cual las células se lavaron dos veces con TB. Las células se incubaron en 5 ml de medio nuevo que contenía cloroquina 100 \muM durante 3-5 horas a 37ºC, después de lo cual se lavaron dos veces con medio y se incubaron con DMEM normal durante 72 horas. El sobrenadante (100 \mul) de las células COS transfectadas se ensayó a diversas diluciones con respecto a la presencia de anticuerpo por una técnica basada en ELISA. Se usó lambda de cabra anti-humano para recubrir placas de ensayo de 96 pocillos y una IgG de cabra anti-humana marcada con peroxidasa como anticuerpo de detección, en condiciones ELISA convencionales. Se descubrió que las células COS producían entre 10 y 40 ng/ml de anticuerpo quimérico de mono/humano. Se concentraron 10 veces mayores volúmenes de sobrenadante y se usaron en un RIA de unión directa a células supT1 CD4 positivas. Como controles positivo y negativo, respectivamente (Fig. 11), se usaron el anticuerpo de mono entero parental y una inmunoglobulina humana irrelevante. Además se usaron el anti-CD4 de mono y el anti-CD4 quimérico de mono/humano para inhibir la unión de un anticuerpo anti-CD4 (1F3) de ratón de alta afinidad (Fig. 12). Puede verse que el anticuerpo recombinante de mono/humano no sólo se une a células CD4 positivas, sino que es capaz de inhibir la unión de 1F3 a células CD4 positivas en aproximadamente las mismas concentraciones de anticuerpo totalmente de mono o del propio 1F3.

A continuación se presenta un ejemplo de los métodos y anticuerpos de esta invención.

Ejemplo 4 Generación de Anticuerpos de Mono Contra Antígenos de Linfocitos Humanos

Un mono cynomolgus adulto (White Sands New Mexico Primate Center) se inmunizó por vía intramuscular, en múltiples sitios, con 5 x 10^{8} linfocitos CD54 positivos humanos enteros. Como alternativa, las células usadas fueron células SB (línea linfoide B humana) y linfocitos humanos periféricos activados, activados por preincubación con una mezcla de mitógeno de Phytolacca americana (2,5 mg/ml), monoacetato de forbol (40 nM) y fitohemaglutinina (4 mg/pocillo) con la inclusión de un adyuvante convencional. La inmunización se repitió cada 2-3 semanas durante un período de 8 meses. Los sueros de los animales inmunizados se seleccionaron a diversos tiempos por la inhibición de la unión de un anticuerpo murino, 84H10, que se sabe que se une a ICAM-1. Se unió una cantidad de saturación de 84H10 a células de ovario de hámster chino (CHO), previamente transfectadas con un vector de expresión que contenía c-ADN de CD54 humano y seleccionadas para la alta expresión de CD54 de la superficie celular, junto con diluciones crecientes de suero de mono. En la Fig. 15 se muestra la inhibición de la unión de 84H10.

Otros anticuerpos monoclonales murinos que reconocen otros antígenos de linfocitos humanos se ensayaron por inhibición usando suero de mono obtenido por los mismos métodos de inmunización.

Uso

Los anticuerpos producidos de la manera descrita anteriormente, o por técnicas equivalentes, pueden purificarse por una combinación de cromatografía de afinidad y de exclusión molecular para la caracterización en ensayos biológicos funcionales. Estos ensayos incluyen la determinación de la especificidad y la afinidad de unión, así como la función efectora asociada con el isotipo expresado, por ejemplo, ADCC, o la fijación del complemento. Tales anticuerpos pueden usarse como agentes terapéuticos pasivos o activos contra varias enfermedades humanas, incluyendo el linfoma de células B, enfermedades infecciosas incluyendo SIDA, enfermedades autoinmunes e inflamatorias, y trasplante. Los anticuerpos pueden usarse en su forma nativa, o como parte de un complejo de anticuerpo/quelato, anticuerpo/fármaco o anticuerpo/toxina. Además, pueden usarse anticuerpos enteros o fragmentos de anticuerpos (Fab_{2}, Fab, Fv) como reactivos de formación de imágenes o como vacunas potenciales o inmunógenos en una inmunoterapia activa para la generación de respuestas anti-idiotípicas.

La cantidad de anticuerpo útil para producir un efecto terapéutico puede determinarse por técnicas convencionales bien conocidas para los especialistas habituales en la técnica. Los anticuerpos generalmente se proporcionarán por técnicas convencionales dentro de un tampón farmacéuticamente aceptable, y pueden administrarse por cualquier vía deseada. Debido a la eficacia de los anticuerpos reivindicados en el presente documento y su tolerancia por los seres humanos, es posible administrar estos anticuerpos repetidamente para combatir diversas enfermedades o estados de enfermedad dentro de un ser humano.

Los anticuerpos recombinantes anti-CD4 (o fragmentos de los mismos) de esta invención también son útiles para inducir inmunosupresión, es decir, inducir una supresión del sistema inmune de un ser humano o un animal. Por lo tanto, esta invención se refiere a un método para inducir profiláctica o terapéuticamente la inmunosupresión en un ser humano o en otro animal que lo necesite, por medio de la administración de una cantidad eficaz y no tóxica de tal anticuerpo de esta invención a dicho ser humano o animal.

La capacidad de los compuestos de esta invención para inducir la inmunosupresión puede demostrarse en ensayos convencionales usados para este fin, por ejemplo, un ensayo de reacción de linfocitos mixtos o un ensayo que mide la inhibición de la proliferación de células T medida por la captación de timidina.

El hecho de que los anticuerpos de esta invención tengan utilidad en la inducción de la inmunosupresión significa que son útiles en el tratamiento o prevención de la resistencia o rechazo de órganos o tejidos trasplantados (por ejemplo, riñón, corazón, pulmón, médula ósea, piel, córnea etc); el tratamiento o prevención de enfermedades autoinmunes, inflamatorias, proliferativas e hiperproliferativas, y de manifestaciones cutáneas de enfermedades tratadas con medicamentos que afectan al sistema inmunológico (por ejemplo, artritis reumatoide, lupus eritematoso, lupus sistémico eritematoso, tiroiditis de Hashimoto, esclerosis múltiple, miastenia grave, diabetes de tipo 1, uveítis, síndrome nefrótico, psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis de contacto y además dermatitis eccematosa, dermatitis seborreica, liquen plano, pénfigo, pénfigo buloso, epidermolisis bulosa, urticaria, angioedemas, vasculitis, eritema, eosinofilias cutáneas, alopecia areata, etc); el tratamiento de enfermedades obstructivas reversibles de las vías respiratorias, inflamaciones intestinales y alergias (por ejemplo, enfermedad celíaca, proctitis, eosinofilia, gastroenteritis, mastocitosis, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa) y alergias relacionadas con los alimentos (por ejemplo, migraña, rinitis y eccema).

Un especialista en la técnica podría, por medio de una experimentación rutinaria, determinar la cantidad eficaz y no tóxica de anticuerpo para el fin de inducir la inmunosupresión. Sin embargo, en general, una dosificación eficaz estará en el intervalo de aproximadamente 0,05 a 100 mg por kg de peso corporal por día.

Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) de esta invención también serían útiles para el tratamiento de tumores en un mamífero. Más específicamente, serían útiles para reducir el tamaño del tumor, inhibir el crecimiento tumoral y/o prolongar el tiempo de supervivencia de animales que tienen tumores. Por consiguiente, esta invención también se refiere a un método para tratar tumores en un ser humano u otro animal por medio de la administración a dicho ser humano o animal de una cantidad eficaz y no tóxica de un anticuerpo. Un especialista en la técnica podría, por medio de una experimentación rutinaria, determinar la cantidad eficaz y no tóxica de anticuerpo necesaria para el fin de tratar tumores carcinogénicos. Sin embargo, en general, es de esperar que una dosificación eficaz esté en el intervalo de aproximadamente 0,05 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal al día.

Los anticuerpos de la invención pueden administrarse a un ser humano o a otro animal de acuerdo con los métodos de tratamiento mencionados anteriormente en una cantidad suficiente para producir tal efecto en un grado terapéutico o profiláctico. Tales anticuerpos de la invención pueden administrarse a dicho ser humano u otro animal en una forma de dosificación convencional preparada combinando el anticuerpo de la invención con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable convencional o de acuerdo con técnicas conocidas. Un especialista en la técnica reconocerá que la forma y carácter del vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable viene dictada por la cantidad de ingrediente activo con la que se combina, la vía de administración y otras variables bien conocidas.

La vía de administración del anticuerpo (o fragmento del mismo) de la invención puede ser oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral, como se usa en este documento, incluye la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vagina o intraperitoneal. Generalmente se prefieren las formas subcutánea e intramuscular de administración parenteral.

Los regímenes de dosificación parenteral y oral diarios para emplear los compuestos de la invención para inducir profiláctica o terapéuticamente inmunosupresión, o para tratar terapéuticamente tumores carcinogénicos, generalmente estará en el intervalo de aproximadamente 0,05 a 100, pero preferiblemente de aproximadamente 0,5 a 10 miligramos por kilogramo de peso corporal al día.

El anticuerpo de la invención también puede administrarse por inhalación. Por "inhalación" se entiende la administración por inhalación intranasal y oral. Las formas de dosificación apropiadas para tal administración, tales como una formulación de aerosol o un inhalador dosificador, pueden prepararse por técnicas convencionales. La cantidad de dosificación preferida de un compuesto de la invención a emplear generalmente está dentro del intervalo de aproximadamente 10 a 100 miligramos.

El anticuerpo de la invención también puede administrarse tópicamente. Por administración tópica se entiende la administración no sistémica e incluye la aplicación de un compuesto de anticuerpo (o fragmento del mismo) de la invención externamente en la epidermis o en la cavidad bucal y la instilación de tal anticuerpo en el oído, ojo y nariz, y donde no entra significativamente en la corriente sanguínea. Por administración sistémica se entiende la administración oral, intravenosa, intraperitoneal e intramuscular. La cantidad de un anticuerpo necesaria para conseguir un efecto terapéutico o profiláctico, por supuesto, variará con el anticuerpo elegido, la naturaleza y gravedad del estado que se está tratando y el animal sometido al tratamiento, y finalmente estará a la discreción del médico. Una dosis típica adecuada de un anticuerpo de la invención generalmente estará dentro del intervalo de aproximadamente 1 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal al día.

Formulaciones

Aunque es posible que un anticuerpo o fragmento del mismo se administre solo, es preferible presentarlo como una formulación farmacéutica. El ingrediente activo puede constituir, para la administración tópica, de un 0,001% a un 10% p/p, por ejemplo, de un 1% a un 2% en peso de la formulación, aunque puede comprender hasta un 10% p/p, pero preferiblemente no más de un 5% p/p y más preferiblemente de un 0,1% a un 1% p/p de la formulación.

Las formulaciones tópicas de la presente invención comprenden un ingrediente activo junto con uno o más vehículos aceptables para el mismo y opcionalmente cualquier otro ingrediente terapéutico. El vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación y no perjudicial para el receptor del mismo.

Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen preparaciones líquidas o semi-líquidas adecuadas para la penetración a través de la piel hasta el sitio donde se requiere el tratamiento, tales como linimentos, lociones, cremas, pomadas o pastas, y gotas adecuadas para administración en el ojo, oído o nariz.

Las gotas de acuerdo con la presente invención pueden comprender soluciones o suspensiones acuosas u oleosas estériles y pueden prepararse disolviendo el ingrediente activo en una solución acuosa adecuada de un agente bactericida y/o fungicida y/o cualquier otro conservante adecuado, y preferiblemente incluyendo un agente tensioactivo. La solución resultante después puede clarificarse por filtración, transferirse a un recipiente adecuado que después se cierra herméticamente y se esteriliza por tratamiento en autoclave o mantenimiento a 90-100ºC durante media hora. Como alternativa, la solución puede esterilizarse por filtración y transferirse al recipiente por una técnica aséptica. Son ejemplos de agentes bactericidas y fungicidas adecuados para inclusión en las gotas, nitrato o acetato fenilmercúrico (0,002%), cloruro de benzalconio (0,01%) y acetato de clorhexidina (0,01%). Los disolventes adecuados para la preparación de una solución oleosa incluyen glicerol, alcohol diluido y propilenglicol.

Las lociones de acuerdo con la presente invención incluyen las adecuadas para aplicarse en la piel o en los ojos. Una loción oftálmica puede comprender una solución acuosa estéril que contiene opcionalmente un bactericida y puede prepararse por métodos similares a los de la preparación de gotas. Las lociones o linimentos para la aplicación en la piel también pueden incluir un agente para acelerar el secado y enfriar la piel, tal como un alcohol o acetona, y/o un hidratante tal como glicerol o un aceite tal como aceite de ricino o aceite de arachis.

Las cremas, pomadas o pastas de acuerdo con la presente invención son formulaciones semi-sólidas del ingrediente activo para aplicación externa. Pueden obtenerse mezclando el ingrediente activo en forma finamente dividida o de polvo, solo o en solución o suspensión en un fluido acuoso o no acuoso, con la ayuda de la maquinaria adecuada, con una base grasa o no grasa. La base puede comprender hidrocarburos tales como parafina dura, blanda o líquida, glicerol, cera de abejas, un jabón metálico; un mucílago; un aceite de origen natural tal como aceite de almendras, de maíz, de arachis, de ricino o de oliva; grasa de lana o sus derivados, o un ácido graso tal como ácido esteárico u oleico junto con un alcohol tal como propilenglicol o macrogoles. La formulación puede incorporar cualquier agente tensioactivo adecuado tal como un tensioactivo aniónico, catiónico o no iónico, tal como ésteres de sorbitán o derivados de polioxietileno de los mismos. También pueden incluirse agentes de suspensión tales como gomas naturales, derivados de celulosa o materiales inorgánicos tales como sílices silíceas y otros ingredientes tales como lanolina.

Un especialista en la técnica reconocerá que la cantidad óptima y la separación de las dosificaciones individuales de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención se determinarán por la naturaleza y grado de la afección a tratar, la forma, la vía y el sitio de administración, y el animal particular que se esté tratando, y que tales cantidades óptimas pueden determinarse por técnicas convencionales. También se apreciará por un especialista en la técnica que el curso óptimo de tratamiento, es decir, el número de dosis de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención administradas al día durante un número definido de días, puede averiguarse por los especialistas en la técnica usando ensayos de determinación del curso de tratamiento convencionales.

Se cree que un especialista en la técnica puede, sin elaboración adicional, usando la descripción anterior, utilizar la presente invención en su mayor grado. Por lo tanto, los siguientes ejemplos deben considerarse simplemente ejemplos ilustrativos y no limitantes del alcance de la presente invención de forma alguna.

Composición de Cápsulas

Se prepara una composición farmacéutica de esta invención en forma de una cápsula rellenando una cápsula de gelatina dura de dos piezas convencional con 50 mg de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención, en forma de polvo, 100 mg de lactosa, 32 mg de talco y 8 mg de estearato de magnesio.

Composición Parenteral Inyectable

Se prepara una composición farmacéutica de esta invención en una forma adecuada para administración por inyección agitando un 1,5% en peso de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención en un 10% en volumen de propilenglicol y agua. La solución se esteriliza por filtración.

Composición de Pomada

Anticuerpo o fragmento del mismo de la invención 1,0 g.

Parafina blanda blanca hasta 100,0 g.

El anticuerpo o fragmento del mismo de la invención se dispersa en un pequeño volumen del vehículo para producir un producto homogéneo uniforme. Después se rellenan tubos metálicos presionables con la dispersión.

Composición de Crema Tópica

Anticuerpo o fragmento del mismo de la invención 1,0 g.

Polawax GP 200 20,0 g.

Lanolina anhidra 2,0 g.

Cera de abejas blanca 2,5 g.

Hidroxibenzoato de metilo 0,1 g.

Agua destilada hasta 100,0 g.

El polawax, la cera de abejas y la lanolina se calientan conjuntamente a 60ºC. Se añade una solución de hidroxibenzoato de metilo y se consigue la homogeneización usando agitación de alta velocidad. Después se deja que la temperatura se reduzca a 50ºC. Después se añade el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención y se dispersa minuciosamente, y la composición se deja enfriar con agitación de baja velocidad.

Composición de Loción Tópica

Anticuerpo o fragmento del mismo de la invención 1,0 g.

Monolaurato de sorbitán 0,6 g.

Polisorbato 20 0,6 g.

Alcohol cetoestearílico 1,2 g.

Glicerina 6,0 g.

Hidroxibenzoato de metilo 0,2 g.

Agua purificada B.P. hasta 100,00 ml (B.P. = farmacopeia británica)

El hidroxibenzoato de metilo y la glicerina se disuelven en 70 ml del agua a 75ºC. El monolaurato de sorbitán, el polisorbato 20 y el alcohol cetoestearílico se funden conjuntamente a 75ºC y se añaden a la solución acuosa. La emulsión resultante se homogeneiza, se deja enfriar con agitación continua y el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención se añade como una suspensión en el agua restante. La suspensión entera se agita hasta que se homogeneiza.

Composición de Gotas Oftálmicas

Anticuerpo o fragmento del mismo de la invención 0,5 g.

Hidroxibenzoato de metilo 0,01 g.

Hidroxibenzoato de propilo 0,04 g.

Agua purificada B.P. hasta 100,00 ml.

Los hidroxibenzoatos de metilo y propilo se disuelven en 70 ml de agua purificada a 75ºC y la solución resultante se deja enfriar. Después se añade el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención y la solución se esteriliza por filtración a través de un filtro de membrana (tamaño de poros de 0,022 \mum) y se envasa asépticamente en recipientes estériles adecuados.

Composición para Administración por Inhalación

Para un recipiente de aerosol con una capacidad de 15-20 ml: mezclar 10 mg de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención con 0,2-0,5% de un agente lubricante, tal como polisorbato 85 o ácido oleico, y dispersar tal mezcla en un propelente tal como freón, preferiblemente en una combinación de (1,2 diclorotetrafluoroetano) y difluoroclorometano y ponerla en una recipiente de aerosol apropiado adaptado para la administración por inhalación intranasal u oral.

Composición para la Administración por Inhalación

Para un recipiente de aerosol con una capacidad de 15-20 ml: disolver 10 mg de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención en etanol (6-8 ml), añadir de un 0,1 a un 0,2% de un agente lubricante tal como polisorbato 85 o ácido oleico; y dispersar la mezcla en un propelente, tal como freón, preferiblemente en combinación de (1,2 diclorotetrafluoroetano) y difluoroclorometano, y ponerlo en una recipiente de aerosol apropiado adaptado para la administración intranasal u oral.

Los anticuerpos y las composiciones farmacéuticas de la invención son particularmente útiles para la administración parenteral, es decir, por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa. Las composiciones para administración parenteral comúnmente comprenden una solución de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención o un cóctel del mismo disuelto en un vehículo aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso. Puede emplearse una diversidad de vehículos acuosos, por ejemplo agua, agua tamponada, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente carecen de materia particulada. Estas soluciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables cuando sea necesario para aproximar las condiciones fisiológicas, tales como agentes para ajustar el pH y tamponantes, etc. La concentración del anticuerpo o del fragmento del mismo de la invención en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente un 0,5%, normalmente de un 1%, o al menos este valor, hasta un 15 o un 20% en peso, y se seleccionará principalmente basándose en volúmenes de fluido, viscosidades etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado.

De esta manera, una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular podría prepararse para contener 1 ml de agua tamponada estéril y 50 mg de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención. De forma similar, una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa podría prepararse para contener 250 ml de solución de Ringer estéril y 150 mg de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención. Los métodos reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral son bien conocidos o serán evidentes para los especialistas en la técnica, y se describen con más detalle, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, incorporado por la presente como referencia en este documento.

Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) de la invención pueden liofilizarse para el almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes del uso. Se ha demostrado que esta técnica es eficaz con inmunoglobulinas convencionales, y pueden emplearse técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica.

Dependiendo del resultado deseado, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En la aplicación terapéutica, las composiciones se administran a un paciente que ya padece una enfermedad, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. En aplicaciones profilácticas, se administran composiciones que contienen los presentes anticuerpos o un cóctel de los mismos a un paciente que no sufre un estado de enfermedad para mejorar la resistencia del paciente.

Las administraciones individuales o múltiples de las composiciones farmacéuticas pueden realizarse con niveles de dosificación seleccionándose el patrón por el médico a cargo del caso. En cualquier caso, la composición farmacéutica de la invención debe proporcionar una cantidad de los anticuerpos alterados (o fragmentos de los mismos) de la invención suficiente para tratar eficazmente al paciente.

Debe indicarse que los anticuerpos de esta invención pueden usarse para el diseño y síntesis de compuestos peptídicos o no peptídicos (miméticos) que serían útiles en la misma terapia que el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Saragovi et al., Science, 253, 792-795 (1991).

Claims (27)

1. Un anticuerpo quimérico que se une específicamente a un antígeno humano, es sustancialmente no inmunogénico en un ser humano, y no es igual que un anticuerpo humano o de chimpancé, donde el anticuerpo comprende polipéptidos de cadena ligera y pesada comprendiendo cada una:

una región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de una región variable de un anticuerpo de un mono del viejo mundo seleccionado entre monos rhesus, monos cynomolgus, y mandriles, y

una región constante que tiene la secuencia de aminoácidos de una región constante de un anticuerpo de un ser humano o chimpancé.

2. Un anticuerpo quimérico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende polipéptidos de cadena ligera y pesada comprendiendo cada una una región constante que tiene la secuencia de aminoácidos de una región constante de un anticuerpo humano.

3. Un anticuerpo quimérico de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende polipéptidos de cadena ligera y pesada comprendiendo cada una una región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de una región variable de un anticuerpo de un mono cynomolgus.

4. Un anticuerpo quimérico de acuerdo con la reivindicación 3, que se une específicamente a CD4 y comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable mostrada en la Figura 13 y una región constante de cadena ligera lambda y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable mostrada en la Figura 14 y una región constante gamma 1 humana.

5. Un anticuerpo quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende:

un polipéptido de cadena ligera que comprende una región constante que tiene la secuencia de aminoácidos de una región constante de una cadena ligera kappa o lambda de un anticuerpo humano; y

un polipéptido de cadena pesada que comprende una región constante que tiene la secuencia de aminoácidos de una región constante de una cadena pesada gamma-1 de un anticuerpo humano

donde dicho anticuerpo se produce por expresión del vector de expresión TCAE 5.2 como se muestra en la Figura 5 o TCAE 6 como se muestra en la Figura 6.

6. Un anticuerpo quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que se une específicamente a un antígeno humano implicado en una enfermedad, trastorno o afección autoinmune o un antígeno tumoral humano.

7. Un anticuerpo quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que se une específicamente a un antígeno humano elegido entre CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNF-\alpha, TNF-\beta, antígeno Tn, IL-1, IL-8, receptor de células T humanas, CD3, CD28, CD8, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD5a, CD45, producto del oncogén neu, MDR-1, TGF-\alpha, receptor TGF-\alpha, PDGF y CD71.

8. Un anticuerpo quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es terapéuticamente eficaz cuando se administra a una dosificación de 0,05 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal.

9. Un anticuerpo quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para su uso como agente terapéutico.

10. Un anticuerpo quimérico de acuerdo con la reivindicación 9, que se une específicamente a un antígeno humano implicado en cáncer, enfermedad infecciosa, una enfermedad, trastorno, o afección autoinmune o inflamatoria, y rechazo de un órgano o tejido trasplantado, para su uso en el tratamiento o prevención de dicha enfermedad, trastorno, o afección.

11. Un anticuerpo quimérico de acuerdo con la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno, o afección induciendo inmunosupresión.

12. Un anticuerpo quimérico de acuerdo con la reivindicación 11, donde la enfermedad, trastorno, o afección se selecciona entre el grupo compuesto por artritis reumatoide, lupus eritematoso, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis de Hashimoto, esclerosis múltiple, miastenia grave, diabetes de tipo 1, uveítis, síndrome nefrótico, psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis por contacto, dermatitis seborreica, dermatitis eczematosa, Liquen plano, Pénfigo, pénfigo ampollar, Epidermolisis ampollar, urticaria, angioedemas, vasculitis, eritema, eosinofilia cutánea, Alopecia areata, enfermedad de las vías respiratorias obstructiva reversible, migraña, eczema, rinitis, otras afecciones alérgicas, y enfermedades asociadas con inflamación intestinal, incluyendo enfermedad Celiaca, proctitis, gastroenteritis eosinofílica, mastocitosis, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.

13. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Ácido nucleico recombinante que comprende secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de cadena ligera y pesada de un anticuerpo quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

15. Ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 14, que es un vector de expresión como se muestra en la Figura 5 o Figura 6.

16. Un método para producir un anticuerpo quimérico que se une específicamente a un antígeno humano y es sustancialmente no inmunogénico en un ser humano, que comprende expresar ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15.

17. Un fragmento de un anticuerpo quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde dicho fragmento se une específicamente a un antígeno humano, es sustancialmente no inmunogénico en un ser humano, y comprende las regiones variables de los polipéptidos de cadena ligera y pesada de un anticuerpo de un mono del viejo mundo seleccionado entre monos rhesus, monos cynomolgus, y mandriles, y un fragmento de una región constante que tiene una secuencia de aminoácidos de una región constante de un anticuerpo de un ser humano o chimpancé que presenta una función efectora de anticuerpos en un ser humano.

18. Un fragmento Fab o (Fab)_{2} de un anticuerpo quimérico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde dicho fragmento se une específicamente a un antígeno humano, es sustancialmente no inmunogénico en un ser humano, y comprende las regiones variables de los polipéptidos de cadena ligera y pesada de un anticuerpo de un mono del viejo mundo seleccionado entre monos rhesus, monos cynomolgus, y mandriles, y donde los polipéptidos de región constante de cadena ligera y pesada tienen las secuencias de aminoácidos de las porciones de región constante de un fragmento Fab o (Fab)_{2} de un anticuerpo de un ser humano o chimpancé.

19. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 17 o reivindicación 18, que comprende las regiones variables de los polipéptidos de cadena ligera y pesada de un anticuerpo de un mono cynomolgus.

20. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 19, que comprende las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena ligera y pesada mostradas en las Figuras 13 y 14.

21. Ácido nucleico recombinante que comprende secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos que contienen regiones variables de un fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-20.

22. Un método para producir un fragmento de un anticuerpo quimérico que se une específicamente a un antígeno humano y es sustancialmente no inmunogénico en un ser humano, que comprende expresar ácido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 21.

23. Uso de un anticuerpo quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad, trastorno o afección seleccionada entre el grupo compuesto por cáncer, enfermedad infecciosa, rechazo de un órgano o tejido trasplantado, y una enfermedad, trastorno o afección autoinmune o inflamatoria.

24. Uso de un anticuerpo quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno autoinmune.

25. Uso de un anticuerpo quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.

26. Uso de un anticuerpo quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección seleccionada entre el grupo compuesto por artritis reumatoide, psoriasis, trasplante, dermatitis atópica, dermatitis por contacto, o dermatitis seborreica.

27. Uso de un anticuerpo quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección seleccionada entre el grupo compuesto por artritis reumatoide, lupus eritematoso, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis de Hashimoto, esclerosis múltiple, miastenia grave, diabetes de tipo 1, uveítis, síndrome nefrótico, psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis por contacto, dermatitis seborreica, dermatitis eczematosa, Liquen plano, Pénfigo, pénfigo ampollar, Epidermolisis ampollar, urticaria, angioedemas, vasculitis, eritema, eosinofilia cutánea, Alopecia areata, enfermedad de las vías respiratorias obstructiva reversible, migraña, eczema, rinitis, otras afecciones alérgicas, y enfermedades asociadas con inflamación intestinal, incluyendo enfermedad Celiaca, proctitis, gastroenteritis eosinofílica, mastocitosis, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.