PL221015B1

PL221015B1 - Sposób otrzymywania inhibitorów cysteinowych peptydaz o czystości elektroforetycznej z materiałów biologicznych

Info

Publication number: PL221015B1
Application number: PL394514A
Authority: PL
Inventors: Maciej Siewiński; Jan Czarnecki; Stanisław Jujeczka; Justyna Seliga; Aleksander Zuchowski
Original assignee: Akademia Medyczna Im Piastów Śląskich
Priority date: 2011-04-11
Filing date: 2011-04-11
Publication date: 2016-02-29
Also published as: EP2511288A1; PL394514A1; EP2511288B1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania inhibitorów cysteinowych peptydaz o czystości elektroforetycznej z materiałów biologicznych regulujących aktywność enzymów, które odgrywają strategiczną rolę w rozwoju wielu chorób, w tym głównie procesów nowotworowych, takich jak transformacja, inwazja, przerzuty lub angiogeneza oraz chorób związanych z infekcją wirusów, bakterii, grzybów lub pierwotniaków wywołujących takie choroby jak AIDS lub malaria, a także doprowadzają do nieodwracalnych zmian w rozwijającej się osteoporozie, chorobie Alzheimera, dystrofii, mi opatii lub paradontozie (Keppler D. 2006; Hugh T. E. 1996). Wynalazek znajduje zastosowanie w medycynie.

Poznano udział katepsyn, cysteinowych peptydaz, w wymienionych powyżej chorobach, a ponadto określono potencjalne możliwości wykorzystania ich specyficznych inhibitorów, w tym głównie syntetycznych, w kontroli aktywności tych enzymów. Możliwości wykorzystania inhibitorów tych enzymów jako składników potencjalnych leków są znane. Sugeruje się, że takie leki mogłyby znaleźć zastosowanie w kontroli rozwoju procesów chorobowych, w których znaczenie mają enzymy posiadające w swoim centrum aktywnym cysteinę. Takie inhibitory pozyskiwane syntetycznie w badaniach in vitro wykazały cechy substancji hamujących szereg chorób, w których kluczową rolę odgrywają głównie katepsyny B, K, L, ale, niestety, w badaniach in vivo okazały się one toksyczne, przez co nie mogą być wykorzystane w terapii. Wyniki otrzymane dla syntetycznych inhibitorów oraz uzyskiwanych w niewielkich ilościach, kosztownych analogów peptydowych pozwoliły uzyskać jednak niezwykle istotną informację, którą było określenie ich skuteczności terapeutycznej in vitro oraz in vivo na modelach zwierzęcych. Potwierdzono ponadto, że obrany kierunek poszukiwań nowych skutecznych leków w grupie inhibitorów cysteinowych peptydaz może dać obiecujące efekty w terapii, gdy rozwiąże się problem ich toksyczności w stosunku do organizmu pacjenta (Grub A. i inni 1991; Zimmerman M. P. i inni 1999; Obala R. i inni 2010).

Obecnie tematem intensywnych badań jest opracowanie sposobu izolacji peptydowych inhibitorów cysteinowych peptydaz z materiału biologicznego w ilościach wystarczających do wykorzystania przemysłowego. Sposób powinien być na tyle wydajny, aby uzyskane ze źródeł naturalnych peptydowe inhibitory stały się równie użyteczne jak syntetyczne, ale dzięki swoim właściwościom nie były ani toksyczne, ani immunogenne dla organizmu pacjenta. Z ich wykorzystaniem można opracować nowy rodzaj terapii, zwany „inhibitoroterapią”. Z dotychczasowego stanu techniki wiadomo, że jednym ze źródeł inhibitorów cysteinowych peptydaz jest białko jaj.

Otrzymuje się je do chwili obecnej w oparciu o patent amerykański nr US 4 902 509 (Turk V., Brzin J. 1990) z wykorzystaniem immobilizowanej karboksymetylopapainy, związanej ze znanym nośnikiem, metodą chromatografii powinowactwa. Wydajność tej metody jest jednak niewielka w przeliczeniu na ilość obecnych inhibitorów cysteinowych peptydaz w surowcu. Dodatkowo bardzo wysoki koszt wykorzystywanych odczynników i stosowanych metod oczyszczania, związany częściowo z koniecznością wykorzystania dwukrotnie krystalizowanej papainy przed jej modyfikacją przez karboksymetylację, sprawia, że cena 1 mg czystego inhibitora wynosi około 500 euro. Ogranicza to użycie tak oczyszczanych inhibitorów jako składników potencjalnych leków.

Z polskiego patentu nr PL 289 769 znany jest sposób otrzymywania inhibitorów tiolowych proteinaz z moczu osób chorych na nowotwory złośliwe, metodą chromatografii powinowactwa, z zastosowaniem jako biosorbentów papainy lub ficyny immobilizowanych na znanym nośniku. Wstępnie oczyszczony z cząsteczek mineralnych mocz nanosi się na kolumnę chromatograficzną co najmniej dwukrotnie, eluuje buforem o pH 6,5 z dodatkiem 0,2 M chlorku sodu. Biosorbent wypakowuje się następnie do wody, doprowadza do pH od 1 do 4 i ogrzewa od 60°C do 100°C, schładza do temperatury pokojowej, zobojętnia, osad odwirowuje, a supernatant zagęszcza i przechowuje w temperaturze -20°C (Siewiński 1991).

Z polskiego patentu nr PL 174 636 znany jest sposób otrzymywania inhibitorów cysteinowych peptydaz z białka jaj metodą chromatografii powinowactwa z zastosowaniem jako biosorbentów papainy lub ficyny immobilizowanych na znanym nośniku, w którym supernatant nanosi się na kolumnę chromatograficzną co najmniej dwukrotnie i eluuje buforem o pH około 6,0 z dodatkiem 0,2 M chlorku sodowego. Białka jaj dodaje się powoli, w małych dozach, do buforu fosforanowego zawierającego kwas etylenodiaminotetraoctowy i cysteinę, utrzymując pH 6, zaś uzyskany z kolumny biosorbent zawiesza się w wodzie i doprowadza do pH 1-4 lub do pH 9-12, po czym najpierw ogrzewa do temperatury powyżej 60°C, potem schładza, zobojętnia, wiruje przy 30000 rpm przez 20 minut, osad oddziela się, supernatant zagęszcza, oczyszcza od chlorku sodu na membranach oraz drobnoustrojów na filPL 221 015 B1 trach bakteryjnych i ampułkuje (Siewiński i inni, 1998). Postępuje się podobnie jak w przypadku inhibitorów uzyskiwanych z wód płodowych łożysk ludzi i zwierząt, które mają zastosowanie w hamowaniu chorób infekcyjnych i nowotworowych, co opisano w polskim patencie nr 334 758.

Sposoby otrzymywania inhibitorów przedstawione w polskich patentach nr PL 288 769, nr PL 174 636 oraz zgłoszeniu nr PL 334 758 pozwalają uzyskać preparaty w stanie surowym. Zanim zostaną zastosowane, wymagają dalszego oczyszczania, nawet w kilku etapach, przy użyciu kosztownych i mało wydajnych procedur izolacji białek.

Kolejną wadą opisanych procedur jest także brak możliwości wielokrotnego wykorzystania złoża, co dodatkowo podnosi koszty. Reasumując, wykorzystanie opracowanych i stosowanych dotychczas sposobów oczyszczania preparatów inhibitorów ze znanych źródeł jest kosztowne, skomplikowane i mało wydajne, ponieważ przy ich użyciu można uzyskać jedynie bardzo małe ilości preparatów o niskich aktywnościach inhibitorów cysteinowych peptydaz na otrzymany eluat, a stosowane metody wymagają kosztownych procedur i odczynników.

W pierwszym etapie oczyszczania inhibitorów cysteinowych peptydaz ani przy użyciu karboksymetylopapainy, jak w cytowanym patencie amerykańskim, ani papainy według sposobów opisanych w wymienionych polskich patentach, gdzie wykorzystano zmiany temperatury i kwasowości, nie otrzymywano preparatów czystych elektroforetycznie. Występowała więc konieczność wprowadzania dalszych etapów oczyszczania do takiego momentu, gdy preparaty były czyste, co powodowało pewne komplikacje oraz znacznie zmniejszało wydajność, przy tym wymagało to kolejnych nakładów finansowych, zwiększających koszty uzyskiwanego inhibitora, przez co jego zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym było mocno ograniczone. Pomimo trwających od ponad 20 lat prób pozyskiwania inhibitorów cysternowych peptydaz z różnych surowców, pozornej prostoty zagadnienia oraz wielu technik, jakie mogą być zastosowane, nie udało się do tej pory opracować metody pozyskiwania inhibitorów w skali technicznej. Koniecznym stało się opracowanie metody, która w sposób wydajny i efektywny pozwoli na uzyskanie dużych ilości inhibitorów cysteinowych peptydaz o czystości elektroforetycznej o wysokiej aktywności ze źródeł naturalnych oraz umożliwi wielokrotne wykorzystanie złoża, przy jego łatwym odzyskiwaniu metodami niskoenergochłonnymi. Nieoczekiwanie wspomniany problem rozwiązał prezentowany wynalazek.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania inhibitorów cysteinowych peptydaz o czystości elektroforetycznej z materiałów biologicznych obejmujący przygotowanie masy białkowej do pozyskiwania inhibitorów cysteinowych, po którym następuje pozyskiwanie inhibitorów cysteinowych i następnie odzyskiwanie złoża do pozyskiwania inhibitorów cysteinowych obejmujący:

a) przygotowanie masy białkowej do pozyskiwania inhibitorów cysteinowych poprzez działanie na masę białkową roztworem o pH kwaśnym, korzystnie zbliżonym do pH 2 oraz działanie wysokiej temperatury, korzystnie 90°C przez 10 do 20 minut,

b) pozyskiwanie inhibitorów cysteinowych poprzez co najmniej jednokrotną chromatografię powinowactwa, korzystnie kolumnową, wobec nośników ze związanymi peptydazami cysteinowymi, korzystnie papainą lub ficyną, lub inną pochodną roślinnych peptydaz cysteinowych z przygotowanej rozmrożonej masy białkowej z etapu a) do aktywności co najmniej 5 IU/mg eluentu po pierwszej elucji, charakteryzujący się tym, że w etapie a) po działaniu wysokiej temperatury roztwór masy zamraża się na kilka godzin, korzystnie 12 godzin, przy czym w etapie b) pozyskiwanie z zamrożonej masy białkowej z etapu a) inhibitorów cysteinowych peptydaz zachodzi poprzez co najmniej jednokrotną chromatografię powinowactwa na kolumnach wobec nośników związanych z papainą do aktywności co najmniej 5 IU/mg eluentu po pierwszej elucji, przy czym etap b) obejmuje:

i. co najmniej dwukrotne naniesienie supernatantu z 0,05% sorbinianem sodu, zawierającego aktywne inhibitory cysteinowych peptydaz na kolumnę wypełnioną złożem Sepharose B związanym z papainą;

ii. wypakowanie złoża, które przemywa się roztworem NaCl oraz wodą do zaniku białek w przesączu;

iii. ponowne naniesienie złoża na kolumnę i eluowanie związanych inhibitorów cysteinowych peptydaz buforem węglanowym o pH od 9,5 do 12 z dodatkiem 20% glicerolu w temperaturze od 8°C do 55°C przy wielokrotnym wykorzystywaniu złoża, albo w temperaturze od 60°C do 100°C przy jednorazowym użyciu złoża.

Korzystnie, co najmniej dwukrotna elucja następuje na tym samym złożu z etapu b).

Równie korzystnie, masa białkowa otrzymana jest z jaj rozcieńczonych wodą destylowaną, korzystnie 1:1 masy jajecznej do wody lub innego materiału biologicznego wybranego z grupy zawiera4

PL 221 015 B1 jącej homogenaty roślin takich jak ziemniaki, soja, ryż, jemioła lub tkanek ssaków, takich jak łożyska, tkanki rakowe usunięte śródoperacyjnie oraz wody płodowe, mocz i płyny puchlinowe.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku pozyskiwanie inhibitorów cysteinowych peptydaz w etapie b) obejmuje wirowanie rozmrożonej masy białkowej z etapu a), korzystnie przez 20 minut przy 30000 rpm. W następnej korzystnej realizacji wynalazku uzyskany eluat po końcowym wymywaniu w etapie b) zakwasza się, korzystnie do pH 2,0 i ogrzewa się, korzystnie w 90°C przez 10 do 20 minut, chłodzi i zobojętnia.

Korzystnie, elucje na etapie b) przeprowadza się tak długo, aż uzyska się czystość elektroforetyczną, korzystnie dwa, trzy lub cztery razy na kolejnych złożach kolumny z mobilizowanymi peptydazami cysteinowanymi i uzyska się co najmniej aktywność 5 IU/mg eluentu po pierwszej elucji z pierwszej chromatografii powinowactwa, przy czym korzystnie elucje prowadzi się w pH 11 w temperaturze pokojowej.

Równie korzystnie w etapie b) po końcowej elucji reaktywuje się złoże z immobilizowanym enzymem poprzez inkubowanie w buforze, korzystnie przez minimum 12 godzin w temperaturze 4°C w buforze fosforanowym o pH 6,5 i 2 mM ditiotreitolem, 2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i 0,05% merkaptoetanolem w celu reaktywacji enzymu.

Przedmiotem wynalazku jest technologia pozwalająca na pozyskiwanie inhibitorów cysteinowych peptydaz w ilościach przemysłowych przy kosztach zdecydowanie niższych niż w przypadku opisywanych powyżej metod laboratoryjnych. Ponadto uzyskiwany preparat nie wymaga dalszego doczyszczania innymi technikami, w przeciwieństwie do inhibitorów otrzymywanych w skali laboratoryjnej i może być stosowany bezpośrednio. Przykładowo, sposób polega na kilkukrotnym naniesieniu preparatu biologicznego zawierającego aktywne inhibitory cysteinowych peptydaz na kolumnę wypełnioną znanym złożem ze związaną papainą, ficyną lub inną cysteinową peptydazą, wypakowaniu złoża, które przemywa się na lejku Buchnera 0,2 M NaCl i wodą aż do zaniku białka w przesączu, po czym złoże ponownie nanosi się na tą samą kolumnę. Odzyskanie inhibitorów związanych z enzymem połączonym z wymienionymi enzymami polega na ich elucji ze złoża roztworem zawierającym 20% glicerol o pH od 9,5 do 12 w zakresie temperatur od 8 do 55°C. Zebrany eluat zostaje najpierw zobojętniony, a po odsoleniu i zagęszczeniu na membranie przepuszczającej cząsteczki do 5 kDa przy zachowaniu 20% stężenia glicerolu zostaje oznaczona jego aktywność oraz czystość elektroforetyc zna. W razie potrzeby, gdy aktywność inhibitora jest zbyt niska, roztwór zakwasza się, ogrzewa do 90°C przez 5 minut, schładza do temperatury pokojowej, zobojętnia i dodaje się do niego bufor fosforanowy o pH 6,5, przy zachowaniu 20% stężenia glicerolu, zagęszcza się i odsala na membranie przepuszczającej cząsteczki do 5 kDa. Gdy preparat nie spełnia wymogów odnośnie czystości zostaje on ponownie naniesiony na nową kolumnę wypełnioną tym samym złożem związanym z tymi samymi enzymami, membranie której inhibitor zostanie kolejno wymyty w opisany powyżej sposób. Oczyszczanie takie przeprowadza się 2-4 razy na kolejnych kolumnach wypełnionych znanym złożem z immobilizowaną papainą, ficyną lub inną peptydazą cysteinową do momentu, gdy preparat będzie czysty elektroforetycznie i będzie wykazywał pożądaną aktywność w przeliczeniu na mg białka. Za każdym razem po naniesieniu inhibitora na kolumny złoże wypakowuje się, odmywa od niezwiązanych substancji, po czym wypełnia się nim kolumnę ponownie. Inhibitor eluuje się z kolumn roztworami o pH od 9,5 do 12 w zakresie temperatur od 8°C do 55°C.

Opisany przykładowy sposób według wynalazku pozwala na wykorzystanie złoża wielokrotnie. Istotnym jest to, że przed każdym naniesieniem roztworu zawierającym izolowany inhibitor złoże z immobilizowanym enzymem jest inkubowane przez minimum 12 godzin w temperaturze 4°C w buforze fosforanowym o pH 6,5 i 2 mM ditiotreitolem, 2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i 0,05% merkaptoetanolem w celu reaktywacji enzymu.

Istnieje też inny przykładowy sposób uzyskania inhibitorów z wykorzystaniem złoża jednokrotnie. Polega on na izolowaniu inhibitora ze złoża w temperaturze 60°C do 100°C w pH 1 do 6 lub 8 do 12, ochłodzeniu całości, zobojętnieniu, zamrożeniu na 24 godziny, rozmrożeniu, dodaniu glicerolu do stężenia 20%, odsoleniu na membranie przepuszczającej do 5 kDa, przesączeniu przez filtry bakteryjne i przechowywaniu w ampułkach lub innej sterylnej formie w temperaturze 4°C lub po zamrożeniu.

Prezentowany wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania inhibitorów cysteinowych peptydaz z białka jaj oraz łożyska i wód płodowych zarówno zwierząt, jak i ludzi, homogenatów tkanek rakowych usuniętych śródoperacyjnie, z roślin, takich jak ziemniaki, soja, ryż, jemioła, metodą chromatografii powinowactwa na kolumnach wypełnionych znanymi nośnikami, do których związana jest papaina, ficyną lub inna peptydaza cysteinowa, przez kilkukrotne nanoszenie supernatantu na kolumnę chroPL 221 015 B1 matograficzną, następnie odpłukanie niezwiązanych ze złożem cząsteczek, wyeluuowanie z kolumny inhibitorów cysteinowych peptydaz roztworem o pH od 9,5 do 12 w zakresie temperatur od 8°C do 55°C przy wielokrotnym wykorzystywaniu złoża lub od 60°C do 100°C przy jednorazowym użyciu złoża, schładzanie do temperatury pokojowej i zobojętnianie, a następnie wirowanie i, po przesączeniu przez filtry bakteryjne, wykorzystywanie supernatantów do dalszych celów. Inhibitory cysteinowych peptydaz zabezpiecza się przed dimeryzacją 20% glicerolem.

Przykładowa realizacja wynalazku polega na tym, że eluat sporządza się z homogenatów substancji źródłowych poprzez wirowanie, dobór pH od 9,5 do 12, ogrzewanie od 8°C do 55°C albo od 60°C do 100°C, następnie schładzanie do temperatury pokojowej, zobojętnianie, wiruje się i zamraża w temperaturze -20°C na czas najkorzystniej 24 godzin, po czym rozmraża się i odwirowuje. Wykorzystuje się supernatant, który nanosi się kilkakrotnie na kolumnę wypełnioną znanym złożem ze związaną papainą, ficyną lub inną peptydazą cysteinową. Po uzyskaniu kompleksu inhibitor-związany enzym złoże wypakowuje się, przemywa 0,2 M NaCl i wodą do zaniku białka w przesączu, złoże umieszcza się ponownie w kolumnie. Inhibitor wymywa się z kolumny w pH od 9,5 do 12 w zakresie temperatur od 8°C do 55°C, gdy złoże wykorzystywane jest wielokrotnie lub ogrzewa złoże wypakowane z kolumny w takich samych zakresach pH przy temperaturze od 60°C do 100°C, gdy złoże wykorzystuje się jednorazowo.

Uzyskane inhibitory przechowywane są w 20% glicerolu, aby zabezpieczyć inhibitory przed dimeryzacją. Gdy inhibitory nie posiadają wymaganej czystości oczyszczanie zostaje powtórzone na kolejnej kolumnie wypełnionej tym samym złożem. Uzyskane roztwory odsala się na membranach przepuszczających cząsteczki do 5 kDa. W ten sam sposób roztwory wodne peptydowych inhibitorów cysteinowych peptydaz mogą zostać zagęszczone do ich pożądanego stężenia i objętości. Aktywność oznacza się kolorymetrycznie lub spektrofluorymetrycznie względem papainy lub katepsyny B. Ostatecznie inhibitory w formie sterylnej po oczyszczeniu na filtrze mikrobiologicznym przechowuje się w ampułkach w 4°C lub zamrożone w sterylnych pojemnikach z tworzywa plastycznego. Roztwory zawierające elektroforetycznie czyste inhibitory cysteinowych peptydaz oczyszcza się z chlorku sodu przy użyciu aparatu filtracyjnego z wykorzystaniem dobranych membran, a sposób ten służy też do zagęszczania roztworu inhibitorów.

Przykładowy sposób otrzymywania inhibitorów cysteinowych peptydaz według wynalazku polega na wielokrotnym powtarzaniu w preparacji opisanej metody chromatografii powinowactwa, aż do momentu uzyskania frakcji czystych elektroforetycznie. Sposób ten pozwala na otrzymywanie inhibitorów cysteinowych peptydaz z różnych źródeł z wydajnością przekraczającą 50% ich początkowej aktywności, za pomocą tańszej i wydajniejszej metody niż w opracowanych wcześniej sposobach ich pozyskiwania. Obecny w preparacie glicerol nie stanowi przeszkody przy podawaniu inhibitorów zarówno w zastrzykach, wlewach dożylnych, a także przy użyciu zewnętrznym np. w leczeniu paradontozy lub grzybic.

Na załączonym rysunku przedstawiono przykładowe realizacje wynalazku, na którym fig. 1 przedstawia chromatogram uzyskany podczas oczyszczania inhi bitorów cysteinowych peptydaz z białka jaja z elucją buforem o pH 11 w temperaturze pokojowej, absorbancja na kolektorze frakcji przy 280 nm długości fali, a fig. 2 - wynik elektroforezy na żelu 12% poliakrylamidowym, uzyskany dla preparatu inhibitorów cysteinowych peptydaz z białka jaja oczyszczonego z elucją buforem o pH 11 w temperaturze pokojowej, przy czym na żel nałożono 3 μg białka.

P r z y k ł a d 1. Elucja w temperaturze pokojowej buforem o pH 9,5 kg masy białkowej rozcieńcza się 3 litrami wody destylowanej, następnie zakwasza do pH 2,0, ogrzewa w 90°C przez 10-20 minut, po czym ochładza do temperatury pokojowej, zobojętnia i zamraża na co najmniej 12 godzin. Następnie, rozmraża się, wiruje 20 minut przy 30000 rpm i supernatant ₃ z 0,05% sorbinianem sodu nanosi 3-5 razy na 5000 cm kolumnę wypełnioną Sepharose 4B związaną z papainą. Po ostatnim naniesieniu kolumnę wypakowuje się i przemywa na lejku Buchnera najpierw 0,2 M NaCl oraz wodą destylowaną do zaniku białka w przesączu. Kolumnę wypełnia się przemytym złożem i związany inhibitor eluuje się 0,01 M NaHCO₃ z 20% glicerolem o pH 11,0 z dodatkiem 0,05% sorbinianu sodu, zbierając frakcje zawierające białko, które po połączeniu mają objętość około 2 litrów. Preparat następnie zakwasza się do pH 2,0, ogrzewa w 90°C przez 10-20 minut, po czym ochładza do temperatury pokojowej i zobojętnia, po czym oznacza się białko. Średnio uzyskuje się 1 mg białka/ml o aktywności 2,0 do 3,5 IU/ml (2- 3,5 IU/mg białka).

₃

Uzyskany po oczyszczaniu na pierwszej kolumnie roztwór nanosi się na kolumnę 400 cm³ wypełnioną Sepharose 4B - papaina 3-5 krotnie, złoże wypakowuje się i przemywa 0,2 M NaCl oraz wo6

PL 221 015 B1 dą destylowaną do zaniku białka w przesączu. Następnie, kolumnę upakowuje się tym przemytym złożem i wymywa związany inhibitor w temperaturze pokojowej buforem węglanowym o pH 9,5 z dodatkiem 20% glicerolu zbierając frakcje zawierające białko. Uzyskuje się 400 ml eluatu (z 20% glicerolem), który zakwasza się do pH 2,0 ogrzewa się w 90°C przez 10-20 minut, chłodzi, zobojętnia i oznacza się aktywność inhibitorową. Tym sposobem uzyskuje się preparat o aktywności 6,5 IU/ml, zawierający około 30 mg białka o aktywności 86,6 IU/mg.

P r z y k ł a d 2. Elucja w temperaturze pokojowej buforem o pH 11 kg masy białkowej rozcieńcza się 3 litrami wody destylowanej, następnie zakwasza do pH 2,0, ogrzewa w 90°C przez 10-20 minut, po czym ochładza do temperatury pokojowej, zobojętnia i zamraża na co najmniej 12 godzin. Następnie, rozmraża się, wiruje 20 minut przy 30000 rpm i supernatant ₃ z 0,05% sorbinianem sodu nanosi 3-5 razy na 5000 cm³ kolumnę wypełnioną Sepharose 4B związaną z papainą. Po ostatnim naniesieniu kolumnę wypakowuje się i przemywa na lejku Buchnera najpierw 0,2 M NaCl oraz wodą destylowaną do zaniku białka w przesączu. Kolumnę wypełnia się przemytym złożem i związany inhibitor eluuje się 0,01 M NaHCO3 z 20% glicerolem o pH 11,0 z dodatkiem 0,05% sorbinianu sodu, zbierając frakcje zawierające białko, które po połączeniu mają objętość około 2 litrów. Preparat następnie zakwasza się do pH 2,0, ogrzewa w 90°C przez 10-20 minut, po czym ochładza do temperatury pokojowej i zobojętnia, po czym oznacza się białko. Średnio uzyskuje się 1 mg białka/ml o aktywności 2,0 do 3,5 IU/ ml (2- 3,5 IU/mg białka).

₃

Uzyskany po oczyszczaniu na pierwszej kolumnie roztwór nanosi się na kolumnę 400 cm³ wypełnioną Sepharose 4B - papaina 3-5 krotnie, złoże wypakowuje się i przemywa 0,2 M NaCl oraz wodą destylowaną do zaniku białka w przesączu. Następnie, kolumnę upakowuje się tym przemytym złożem i wymywa związany inhibitor w temperaturze pokojowej buforem węglanowym o pH 11 z dodatkiem 20% glicerolu zbierając frakcje zawierające białko. Uzyskuje się 400 ml eluatu (z 20% glicerolem), który zakwasza się do pH 2,0 ogrzewa się w 90°C przez 10-20 minut, chłodzi, zobojętnia i oznacza się aktywność inhibitorową. Tym sposobem uzyskuje się preparat o aktywności 15-18 IU/ml, zawierający około 60 mg białka o aktywności 100-120 IU/mg.

P r z y k ł a d 3. Elucja w temperaturze pokojowej buforem o pH 12 kg masy białkowej rozcieńcza się 3 litrami wody destylowanej, następnie zakwasza do pH 2,0, ogrzewa w 90°C przez 10-20 minut, po czym ochładza do temperatury pokojowej, zobojętnia i zamraża na co najmniej 12 godzin. Następnie, rozmraża się, wiruje 20 minut przy 30000 rpm i supernatant ₃ z 0,05% sorbinianem sodu nanosi 3-5 razy na 5000 cm³ kolumnę wypełnioną Sepharose 4B związaną z papainą. Po ostatnim naniesieniu kolumnę wypakowuje się i przemywa na lejku Buchnera najpierw 0,2 M NaCl oraz wodą destylowaną do zaniku białka w przesączu. Kolumnę wypełnia się przemytym złożem i związany inhibitor eluuje się 0,01 M NaHCO3 z 20% glicerolem o pH 11,0 z dodatkiem 0,05% sorbinianu sodu, zbierając frakcje zawierające białko, które po połączeniu mają objętość około 2 litrów. Preparat następnie zakwasza się do pH 2,0, ogrzewa w 90°C przez 10-20 minut, po czym ochładza do temperatury pokojowej i zobojętnia, po czym oznacza się białko. Średnio uzyskuje się 1 mg białka/ml o aktywności 2,0 do 3,5 IU/ml (2- 3,5 IU/mg białka).

₃

Uzyskany po oczyszczaniu na pierwszej kolumnie roztwór nanosi się na kolumnę 500 cm³ wypełnioną Sepharose 4B - papaina 3-5 krotnie, złoże wypakowuje się i przemywa 0,2 M NaCl oraz wodą destylowaną do zaniku białka w przesączu. Następnie, kolumnę upakowuje się tym przemytym złożem i wymywa związany inhibitor w temperaturze pokojowej buforem węglanowym o pH 12 z dodatkiem 15% glicerolu zbierając frakcje zawierające białko. Uzyskuje się 160 ml eluatu (z 15% glicerolem), który zakwasza się do pH 2,0 ogrzewa się w 90°C przez 10-20 minut, chłodzi, zobojętnia i oznacza się aktywność inhibitorową. Tym sposobem uzyskuje się preparat o aktywności 17,9 IU/ml, zawierający około 20,8 mg białka o aktywności 137,7 IU/mg.

P r z y k ł a d 4. Doczyszczanie na trzeciej kolumnie ₃

100 ml preparatu uzyskanego według sposobu opisanego w przykładzie 1 naniesiono na 100 cm³3 kolumnę z Sepharose 4B - papaina trzykrotnie, kolumnę przemyto 2000 cm³ wody destylowanej, a następnie eluowano inhibitor 0,01 M NaHCO3 z 20% glicerolem zbierając frakcje z białkiem. Uzyskano 80 ml roztworu, który doprowadzono do pH 2,0, ogrzewano w 90°C przez 10-20 minut, po czym ochłodzono do temperatury pokojowej i zobojętniono, uzyskując preparat o aktywności 15,6 IU/ml, stężeniu białka 0,036 mg/ml i o aktywności 433,3 IU/mg.

P r z y k ł a d 5. Elucja w temperaturze 8°C buforem o pH 11 kg masy białkowej rozcieńcza się 3 litrami wody destylowanej, następnie zakwasza do pH 2,0, ogrzewa w 90°C przez 10-20 minut, po czym ochładza do temperatury pokojowej, zobojętnia i zamraPL 221 015 B1 ża na co najmniej 12 godzin. Następnie, rozmraża się, wiruje 20 minut przy 30000 rpm i supernatant ₃ z 0,05% sorbinianem sodu nanosi 3-5 razy na 5000 cm³ kolumnę wypełnioną Sepharose 4B związaną z papainą. Po ostatnim naniesieniu kolumnę wypakowuje się i przemywa na lejku Buchnera najpierw 0,2 M NaCl oraz wodą destylowaną do zaniku białka w przesączu. Kolumnę wypełnia się przemytym złożem i związany inhibitor eluuje się 0,01 M NaHCO3 z 20% glicerolem o pH 11,0 z dodatkiem 0,05% sorbinianu sodu, zbierając frakcje zawierające białko, które po połączeniu mają objętość około 2 litrów. Preparat następnie zakwasza się do pH 2,0, ogrzewa w 90°C przez 10-20 minut, po czym ochładza do temperatury pokojowej i zobojętnia, po czym oznacza się białko. Średnio uzyskuje się 1 mg białka/ml o aktywności 2,0 do 3,5 IU/ml (2-3,5 IU/mg białka).

Połowę preparatu uzyskanego po oczyszczaniu na pierwszej kolumnie nanosi się na kolumnę ₃

200 cm³ z płaszczem grzejnym wypełnioną Sepharose 4B - papaina 3-5 krotnie, złoże wypakowuje się i przemywa 0,2 M NaCl oraz wodą destylowaną do zaniku białka w przesączu. Następnie, kolumnę upakowuje się tym przemytym złożem, schładza do 8°C i wymywa związany inhibitor buforem węglanowym o pH 11 o temperaturze 8°C z dodatkiem 20% glicerolu zbierając frakcje zawierające białko. Uzyskuje się 200 ml eluatu (z 20% glicerolem), w który zakwasza się do pH 2,0 ogrzewa się w 90°C przez 10-20 minut, chłodzi, zobojętnia i oznacza się aktywność inhibitorową. Tym sposobem uzyskuje się preparat o aktywności 2,09 IU/ml, zawierający około 4,8 mg białka o aktywności 87,08 IU/mg.

P r z y k ł a d 6. Elucja w temperaturze 55°C buforem o pH 11 3 kg masy białkowej rozcieńcza się 3 litrami wody destylowanej, następnie zakwasza do pH 2,0, ogrzewa w 90°C przez 10-20 minut, po czym ochładza do temperatury pokojowej, zobojętnia i zamraża na co najmniej 12 godzin. Następnie, rozmraża się, wiruje 20 minut przy 30000 rpm i supernatant ₃ z 0,05% sorbinianem sodu nanosi 3-5 razy na 5000 cm³ kolumnę wypełnioną Sepharose 4B związaną z papainą. Po ostatnim naniesieniu kolumnę wypakowuje się i przemywa na lejku Buchnera najpierw 0,2 M NaCl oraz wodą destylowaną do zaniku białka w przesączu. Kolumnę wypełnia się przemytym złożem i związany inhibitor eluuje się 0,01 M NaHCO3 z 20% glicerolem o pH 11,0 z dodatkiem 0,05% sorbinianu sodu, zbierając frakcje zawierające białko, które po połączeniu mają objętość około 2 litrów. Preparat następnie zakwasza się do pH 2,0, ogrzewa w 90°C przez 10-20 minut, po czym ochładza do temperatury pokojowej i zobojętnia, po czym oznacza się białko. Średnio uzyskuje się 1 mg białka/ml o aktywności 2,0 do 3,5 IU/ml (2-3,5 IU/mg białka).

200 cm³ z płaszczem grzejnym wypełnioną Sepharose 4B - papaina 3-5 krotnie, złoże wypakowuje się i przemywa 0,2 M NaCl oraz wodą destylowaną do zaniku białka w przesączu. Następnie, kolumnę upakowuje się tym przemytym złożem, ogrzewa do 55°C i wymywa związany inhibitor buforem węglanowym o pH 11 o temperaturze 55°C z dodatkiem 20% glicerolu zbierając frakcje zawierające białko. Uzyskuje się 200 ml eluatu (z 20% glicerolem), który zakwasza się do pH 2,0 ogrzewa się w 90°C przez 1020 minut, chłodzi, zobojętnia i oznacza się aktywność inhibitorową. Tym sposobem uzyskuje się preparat o aktywności 1,15 IU/ml, zawierający około 38 mg białka o aktywności 6,06 IU/mg.

P r z y k ł a d 7. Oczyszczanie z gotowaniem złoża kg masy białka jaj kurzych poddano wstępnemu oczyszczeniu przez zakwaszenie do pH 2,0 i ogrzaniu do 90°C, ochłodzeniu i zobojętnieniu. Następnie, całość zamrożono na 12 godzin, odwirowa₃ no przy 4000 rpm przez 20 minut zbierając supernatant. Supernatant nanoszono na kolumnę 500 cm³z Sepharose 4B - papaina z szybkością 2 ml/min. Złoże odpłukano od białka, przeniesiono do kolby, zakwaszono do pH 2,0 i ogrzano do 90°C. Następnie, ochłodzono, zobojętniono, zamrożono i odwirowano. Uzyskano 640 ml roztworu zawierającego 1 mg białka/ml o aktywności 4,5 IU/mg białka.

P r z y k ł a d 8. Pozyskiwanie inhibitorów cysteinowych peptydaz z ziemniaków

3,20 kg czystych ziemniaków pokrojono, a następnie zmiksowano z 3,2 litra wody destylowanej, zakwaszono do pH 2,0, ogrzewano w 90°C przez 20 minut. Następnie, ochłodzono, zobojętniono i odwirowano przez 20 minut przy 30000 rpm zbierając supernatant, który zamrożono na 24 godziny, po czym rozmrożono i ponownie odwirowano przez 20 minut przy 30000 rpm oraz przesączono na bibule. Lekko opalizujący roztwór o objętości 1,8 litra nanoszono dwukrotnie na 150 ml kolumnę wypełnioną Sepharose 4B-papaina. Złoże wypakowano i przemyto wodą na lejku Buchnera. Złoże ponownie umieszczono na kolumnie i białka wymywano w temperaturze pokojowej buforem węglanowym 0,01 M NaHCO3 o pH 11 z dodatkiem 20% glicerolu zbierając frakcje zawierające białko. Zebrano 100 ml eluatu. Całość zobojętniono i oznaczano poziom białka oraz aktywność cysteinowej peptydazy w stosunku do papainy testem BANA. Uzyskuje się preparat o aktywności 3,08 IU/ml, zawierający około 10 mg białka o aktywności 30,8 IU/mg.

PL 221 015 B1

P r z y k ł a d 9. Test aktywności

Aktywność inhibitorów cysteinowych peptydaz oznaczano względem BANA według metody opisanej w Siewiński M. (1991): Method of purification of thiol proteinase inhibitors from human urine. Cancer Biochem. Biophys. 12, 33-43. W tabeli zestawiono właściwości preparatów uzyskanych z 3 kg masy białkowej (* w przeliczeniu na 3 kg masy białkowej) przy elucji buforami temperaturach różnych temperaturach i o różnych wartościach pH. W ostatniej kolumnie podano liczbę uzyskanych jednostek inhibitorowych. Objętość można modyfikować przez zagęszczenie na odpowiednich membranach. Dla temperatury pokojowej i pH 11 podano średni zakres uzyskiwanych parametrów - dla tego wariantu preparację powtórzono kilkukrotnie. Szczegóły opisano we wcześniejszych przykładach wykonania.

Preparat uzyskany przez użycie buforu o wskazanej temperaturze/pH	Stężenie białka	Aktywność preparatu	Liczba uzyskanych jednostek
Temperatura pokojowa/pH 9,5	75 μg/ml	86,6 IU/mg	2600 IU
Temperatura pokojowa/pH 11	150 pg/ml	100-120 IU/mg	6000-7200 IU
Temperatura pokojowa/pH 12	130 pg/ml	137,7 IU/mg	2864 IU
Temperatura 8°C/pH 11	24 pg/ml	87,1 IU/mg	836 IU *
Temperatura 55°C/pH 11	190 pg/ml	6,05 IU/mg	460 IU *
Oczyszczanie z gotowaniem złoża	1 mg/ml	4,5 IU/mg	2880 IU

Zastrzeżenia patentowe

Claims

1. Sposób otrzymywania inhibitorów cysteinowych peptydaz o czystości elektroforetycznej z materiałów biologicznych obejmujący przygotowanie masy białkowej do pozyskiwania inhibitorów cysteinowych, po którym następuje pozyskiwanie inhibitorów cysteinowych i następnie odzyskiwanie złoża do pozyskiwania inhibitorów cysteinowych obejmujący:

b) pozyskiwanie inhibitorów cysteinowych poprzez co najmniej jednokrotną chromatografię powinowactwa, korzystnie kolumnową, wobec nośników ze związanymi peptydazami cysternowymi, korzystnie papainą lub ficyną, lub inną pochodną roślinnych peptydaz cysteinowych z przygotowanej rozmrożonej masy białkowej z etapu a) do aktywności co najmniej 5 IU/mg eluentu po pierwszej elucji, znamienny tym, że w etapie a) po działaniu wysokiej temperatury roztwór masy zamraża się na kilka godzin, korzystnie 12 godzin, przy czym w etapie b) pozyskiwanie z zamrożonej masy białkowej z etapu a) inhibitorów cysteinowych peptydaz zachodzi poprzez co najmniej jednokrotną chromatografię powinowactwa na kolumnach wobec nośników związanych z papainą do aktywności co najmniej 5 IU/mg eluentu po pierwszej elucji, przy czym etap b) obejmuje:

1. co najmniej dwukrotne naniesienie supematantu z 0,05% sorbinianem sodu, zawierającego aktywne inhibitory cysteinowych peptydaz na kolumnę wypełnioną złożem Sepharose B związanym z papainą;

iii. ponowne naniesienie złoża na kolumnę i eluowanie związanych inhibitorów cysteinowych peptydaz buforem węglanowym o pH od 9,5 do 12 z dodatkiem 20% glicerolu w temperaturze od 8°C do 55°C przy wielokrotnym wykorzystywaniu złoża albo w temperaturze od 60°C do 100°C przy jednorazowym użyciu złoża.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej dwukrotna elucja następuje na tym samym złożu z etapu b).

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że masa białkowa otrzymana jest z jaj rozcieńczonych wodą destylowaną, korzystnie 1:1 masy jajecznej do wody lub innego materiału biologicznego wybranego z grapy zawierającej homogenaty roślin, takich jak ziemniaki, soja, ryż, jemioła

PL 221 015 B1 lub tkanek ssaków, takich jak łożyska, tkanki rakowe usunięte śródoperacyjnie oraz wody płodowe, mocz i płyny puchlinowe.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pozyskiwanie inhibitorów cysteinowych peptydaz w etapie b) obejmuje wirowanie rozmrożonej masy białkowej z etapu a), korzystnie przez 20 minut przy 30000 rpm.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskany eluat po końcowym wymywaniu w etapie b) zakwasza się, korzystnie do pH 2,0 i ogrzewa się, korzystnie w 90°C przez 10 do 20 minut, chłodzi i zobojętnia.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że elucje na etapie b) przeprowadza się tak długo, aż uzyska się czystość elektroforetyczną, korzystnie dwa, trzy lub cztery razy na kolejnych złożach kolumny z imobilizowanymi peptydazami cysteinowanymi i uzyska się co najmniej aktywność 5 IU/mg eluentu po pierwszej elucji z pierwszej chromatografii powinowactwa, przy czym korzystnie elucje prowadzi się w pH 11 w temperaturze pokojowej.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie b) po końcowej elucji reaktywuje się złoże z immobilizowanym enzymem poprzez inkubowanie w buforze, korzystnie przez minimum 12 godzin w temperaturze 4°C w buforze fosforanowym o pH 6,5 i 2 mM ditiotreitolem, 2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i 0,05% merkaptoetanolem, w celu reaktywacji enzymu.