JPH07278192A - 人尿腫瘍壊死因子インヒビターの精製法 - Google Patents
人尿腫瘍壊死因子インヒビターの精製法Info
- Publication number
- JPH07278192A JPH07278192A JP6087436A JP8743694A JPH07278192A JP H07278192 A JPH07278192 A JP H07278192A JP 6087436 A JP6087436 A JP 6087436A JP 8743694 A JP8743694 A JP 8743694A JP H07278192 A JPH07278192 A JP H07278192A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- column chromatography
- column
- human urine
- tumor necrosis
- necrosis factor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 人尿から腫瘍壊死因子インヒビターを抽出、
精製するための量産に適した方法を提供する。 【構成】 人尿に陽イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性カ
ラムクロマトグラフィーおよび逆相カラムクロマトグラ
フィーを結合して適用し、各クロマトグラフィーで得ら
れる腫瘍壊死因子インヒビターの活性画分を続くクロマ
トグラフィーに付することを特徴とする人尿中の腫瘍壊
死因子インヒビターの精製法。 【効果】 高純度の腫瘍壊死因子インヒビターを人尿か
ら大量に抽出、製造することができる。
精製するための量産に適した方法を提供する。 【構成】 人尿に陽イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性カ
ラムクロマトグラフィーおよび逆相カラムクロマトグラ
フィーを結合して適用し、各クロマトグラフィーで得ら
れる腫瘍壊死因子インヒビターの活性画分を続くクロマ
トグラフィーに付することを特徴とする人尿中の腫瘍壊
死因子インヒビターの精製法。 【効果】 高純度の腫瘍壊死因子インヒビターを人尿か
ら大量に抽出、製造することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は人尿中の腫瘍壊死因子
（ＴＮＦα）インヒビターを濃縮、精製する方法に関す
る。ＴＮＦαは炎症等の種々の症状を発生させるが、該
インヒビターはＴＮＦαと結合してその作用を抑制する
ことができる。
（ＴＮＦα）インヒビターを濃縮、精製する方法に関す
る。ＴＮＦαは炎症等の種々の症状を発生させるが、該
インヒビターはＴＮＦαと結合してその作用を抑制する
ことができる。
【０００２】
【従来の技術】ＴＮＦαインヒビターは最初人尿から発
見されたものですでに幾つかのグループにより単離精製
も行われている（Engelmann, H. et al. (1989) J. Bio
l. Chem. 264, 11974-11980; Olsson, I. et al. (198
9) Eur. J. Haematol. 42, 270-275; Schutze, S. et a
l. (1989) J. Biol. Chem. 264, 3562-3567; Seckinge
r,P. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264, 11966-1197
3; Engelmann, H. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265,
1531-1536)。またこの物質はＮ末端からのアミノ酸配
列よりＴＮＦαに対するレセプターの可溶化された物で
あり、ＴＮＦαに直接結合することによりその作用を抑
制するインヒビターであることが知られている。よって
本物質はＴＮＦαによって引き起こされる炎症、敗血症
性ショックを抑制する薬剤として期待されている。尿中
ＴＮＦαインヒビターには２種類ある（Engelmann. H.
et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 1531-1536)との報
告もあるが、Ｎ末端配列がＡｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｃ
ｙｓ−Ｐｒｏで始まる分子量約３万の分子種が主流であ
る。
見されたものですでに幾つかのグループにより単離精製
も行われている（Engelmann, H. et al. (1989) J. Bio
l. Chem. 264, 11974-11980; Olsson, I. et al. (198
9) Eur. J. Haematol. 42, 270-275; Schutze, S. et a
l. (1989) J. Biol. Chem. 264, 3562-3567; Seckinge
r,P. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264, 11966-1197
3; Engelmann, H. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265,
1531-1536)。またこの物質はＮ末端からのアミノ酸配
列よりＴＮＦαに対するレセプターの可溶化された物で
あり、ＴＮＦαに直接結合することによりその作用を抑
制するインヒビターであることが知られている。よって
本物質はＴＮＦαによって引き起こされる炎症、敗血症
性ショックを抑制する薬剤として期待されている。尿中
ＴＮＦαインヒビターには２種類ある（Engelmann. H.
et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 1531-1536)との報
告もあるが、Ｎ末端配列がＡｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｃ
ｙｓ−Ｐｒｏで始まる分子量約３万の分子種が主流であ
る。
【０００３】これらのインヒビターを生産する手段とし
て遺伝子組換えで行う方法がすでに特許出願されている
が（特願平２−１９０３７２）、本物質は糖鎖を含むこ
とから動物細胞によって発現させる必要がある。よって
その生産性に問題があると共に天然のものと同様の糖鎖
が付加されるかという疑問がある。そこで天然のＴＮＦ
αインヒビターを人尿から大量に取得することが好まし
いが、これまで報告されている精製法はＴＮＦαをセフ
ァロース等の樹脂に結合させたアフィニティーカラムを
用いている例が多い。しかしながら大量精製するにはカ
ラムに結合させるＴＮＦαを多量に調製しなくてはなら
ず煩雑である。またアフィニティーカラムを使っていな
い例も１件見られるが、Ｍｏｎｏ Ｑ， Ｍｏｎｏ Ｓ
（商標、ファルマシア社）などのＨＰＬＣ用のカラムを
用いていることから大量精製には不向きであるという問
題点がある。
て遺伝子組換えで行う方法がすでに特許出願されている
が（特願平２−１９０３７２）、本物質は糖鎖を含むこ
とから動物細胞によって発現させる必要がある。よって
その生産性に問題があると共に天然のものと同様の糖鎖
が付加されるかという疑問がある。そこで天然のＴＮＦ
αインヒビターを人尿から大量に取得することが好まし
いが、これまで報告されている精製法はＴＮＦαをセフ
ァロース等の樹脂に結合させたアフィニティーカラムを
用いている例が多い。しかしながら大量精製するにはカ
ラムに結合させるＴＮＦαを多量に調製しなくてはなら
ず煩雑である。またアフィニティーカラムを使っていな
い例も１件見られるが、Ｍｏｎｏ Ｑ， Ｍｏｎｏ Ｓ
（商標、ファルマシア社）などのＨＰＬＣ用のカラムを
用いていることから大量精製には不向きであるという問
題点がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者らは
ＴＮＦαのアフィニティーカラムを用いずに大量の人尿
より多量のＴＮＦαインヒビターを精製する方法を探究
することにした。
ＴＮＦαのアフィニティーカラムを用いずに大量の人尿
より多量のＴＮＦαインヒビターを精製する方法を探究
することにした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこの課題を
解決するために研究を重ねた結果、各種クロマトグラフ
ィーを一定の順序で組み合わせることによりＴＮＦαの
大量精製が可能となることを見出し、本発明を確立する
に至った。
解決するために研究を重ねた結果、各種クロマトグラフ
ィーを一定の順序で組み合わせることによりＴＮＦαの
大量精製が可能となることを見出し、本発明を確立する
に至った。
【０００６】本発明は、人尿に陽イオン交換カラムクロ
マトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー、疎水性カラムクロマトグラフィーおよび逆相カラム
クロマトグラフィーを結合して適用し、各クロマトグラ
フィーで得られる腫瘍壊死因子インヒビターの活性画分
をそれに続くクロマトグラフィーに付することを特徴と
する人尿中の腫瘍壊死因子インヒビターの精製法であ
る。
マトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー、疎水性カラムクロマトグラフィーおよび逆相カラム
クロマトグラフィーを結合して適用し、各クロマトグラ
フィーで得られる腫瘍壊死因子インヒビターの活性画分
をそれに続くクロマトグラフィーに付することを特徴と
する人尿中の腫瘍壊死因子インヒビターの精製法であ
る。
【０００７】本発明の方法の原料である人尿としては原
尿またはそれを硫安分画などにより予備的に粗精製した
ものが用いられる。
尿またはそれを硫安分画などにより予備的に粗精製した
ものが用いられる。
【０００８】最初の工程では、原料を陽イオン交換樹脂
を充填剤とするクロマトグラフィーに付する。陽イオン
交換樹脂は弱酸性であるのが望ましく、その例としては
ＣＭ−セファロース、ＣＭ−セファデックス（商標、フ
ァルマシア社）、ＣＭ−トヨパール（商標、東ソー
（株））、ＣＭ−セルロファイン（商標、生化学工業
（株））などが挙げられる。あらかじめｐＨ４−７好ま
しくはｐＨ５−６に調製した酢酸系、クエン酸系、リン
酸系緩衝液などで平衡化した樹脂のカラムに、同緩衝液
で置換した原料をアプライする。樹脂を十分洗浄した
後、塩化ナトリウムの０−１Ｍ好ましくは０−０．４Ｍ
の直線濃度勾配を用いて溶出を行う。溶出される分画中
のＴＮＦαインヒビターの活性は後述するようにＴＮＦ
αの細胞障害作用を中和する活性を指標として行う。こ
こで得られた活性画分はさらに次工程の強塩基性イオン
交換樹脂を用いるクロマトグラフィーに付する。
を充填剤とするクロマトグラフィーに付する。陽イオン
交換樹脂は弱酸性であるのが望ましく、その例としては
ＣＭ−セファロース、ＣＭ−セファデックス（商標、フ
ァルマシア社）、ＣＭ−トヨパール（商標、東ソー
（株））、ＣＭ−セルロファイン（商標、生化学工業
（株））などが挙げられる。あらかじめｐＨ４−７好ま
しくはｐＨ５−６に調製した酢酸系、クエン酸系、リン
酸系緩衝液などで平衡化した樹脂のカラムに、同緩衝液
で置換した原料をアプライする。樹脂を十分洗浄した
後、塩化ナトリウムの０−１Ｍ好ましくは０−０．４Ｍ
の直線濃度勾配を用いて溶出を行う。溶出される分画中
のＴＮＦαインヒビターの活性は後述するようにＴＮＦ
αの細胞障害作用を中和する活性を指標として行う。こ
こで得られた活性画分はさらに次工程の強塩基性イオン
交換樹脂を用いるクロマトグラフィーに付する。
【０００９】強塩基性イオン交換樹脂としては、例えば
ＱＡＥ−セファロース、Ｑ−セファロース、ＱＡＥ−セ
ファデックス（商標、ファルマシア社）、ＱＡＥ−トヨ
パール（商標、東ソー（株））などが用いられる。樹脂
はあらかじめｐＨ７−９好ましくはｐＨ８−８．５に調
製したトリス系、ホウ酸系緩衝液などで平衡化し、その
カラムに同緩衝液で置換した試料をアプライする。樹脂
を十分洗浄した後、溶出は塩化ナトリウムの０−１Ｍ好
ましくは０−０．５Ｍの直線濃度勾配により行う。本工
程により活性成分はさらに効果的に濃縮、精製される。
得られた活性画分を次工程に移す。第３工程は上記と原
理の異なる疎水性クロマトグラフィーであって、さらに
精製度を上げることができる。充填剤として用いる疎水
性樹脂としてはブチル、オクチルセファロース（商標、
ファルマシア社）、ブチルトヨパール（商標、東ソー
（株））、ブチルもしくはオクチルセルロファイン（生
化学工業（株））などのアルキル基を結合させたもの、
フェニルセファロース（商標、ファルマシア社）、フェ
ニルトヨパール（商標、東ソー（株））、フェニルセル
ロファイン（商標、生化学工業（株））などのフェニル
基を結合させたものなどが使用できるが、フェニル基結
合樹脂の方が好ましい。
ＱＡＥ−セファロース、Ｑ−セファロース、ＱＡＥ−セ
ファデックス（商標、ファルマシア社）、ＱＡＥ−トヨ
パール（商標、東ソー（株））などが用いられる。樹脂
はあらかじめｐＨ７−９好ましくはｐＨ８−８．５に調
製したトリス系、ホウ酸系緩衝液などで平衡化し、その
カラムに同緩衝液で置換した試料をアプライする。樹脂
を十分洗浄した後、溶出は塩化ナトリウムの０−１Ｍ好
ましくは０−０．５Ｍの直線濃度勾配により行う。本工
程により活性成分はさらに効果的に濃縮、精製される。
得られた活性画分を次工程に移す。第３工程は上記と原
理の異なる疎水性クロマトグラフィーであって、さらに
精製度を上げることができる。充填剤として用いる疎水
性樹脂としてはブチル、オクチルセファロース（商標、
ファルマシア社）、ブチルトヨパール（商標、東ソー
（株））、ブチルもしくはオクチルセルロファイン（生
化学工業（株））などのアルキル基を結合させたもの、
フェニルセファロース（商標、ファルマシア社）、フェ
ニルトヨパール（商標、東ソー（株））、フェニルセル
ロファイン（商標、生化学工業（株））などのフェニル
基を結合させたものなどが使用できるが、フェニル基結
合樹脂の方が好ましい。
【００１０】樹脂はあらかじめ０．５−２Ｍ好ましくは
１−１．５Ｍの硫酸アンモニウムを含むｐＨ５−９好ま
しくはｐＨ６−８に調製したリン酸系、トリス系緩衝液
などで平衡化し、そのカラムに先の陰イオン交換樹脂工
程で精製された活性画分を同緩衝液で置換したものをア
プライする。樹脂を十分洗浄後、硫酸アンモニウムの濃
度を０Ｍまで下げる直線濃度勾配により溶出する。活性
画分をプール後、濃縮し、たとえば０．１％トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）溶液に透析する。かくして得られた透
析内液を次工程に移す。
１−１．５Ｍの硫酸アンモニウムを含むｐＨ５−９好ま
しくはｐＨ６−８に調製したリン酸系、トリス系緩衝液
などで平衡化し、そのカラムに先の陰イオン交換樹脂工
程で精製された活性画分を同緩衝液で置換したものをア
プライする。樹脂を十分洗浄後、硫酸アンモニウムの濃
度を０Ｍまで下げる直線濃度勾配により溶出する。活性
画分をプール後、濃縮し、たとえば０．１％トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）溶液に透析する。かくして得られた透
析内液を次工程に移す。
【００１１】第４工程は逆相クロマトグラフィーで、こ
の工程において単一なＴＮＦαインヒビターを単離する
ことができる。逆相クロマトグラフィーカラムとしてま
ず最初は炭素数１８のアルキル基で修飾されたＯＤＳシ
リカのカラム、例えばＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８カラ
ム（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）、ＶｙｄａｃＣ１
８カラム（Ｃｙｐｒｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｌｔｄ．）、マイクロボンダパックＣ１８カラム
（Ｗａｔｅｒｓ）、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳカラム（東ソ
ー（株））などの他、炭素数が８のＣｏｓｍｏｓｉｌ
５Ｃ８カラム（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）、マイ
クロボンダパックＣ８カラムなどを用いて行うのがよ
い。
の工程において単一なＴＮＦαインヒビターを単離する
ことができる。逆相クロマトグラフィーカラムとしてま
ず最初は炭素数１８のアルキル基で修飾されたＯＤＳシ
リカのカラム、例えばＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８カラ
ム（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）、ＶｙｄａｃＣ１
８カラム（Ｃｙｐｒｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｌｔｄ．）、マイクロボンダパックＣ１８カラム
（Ｗａｔｅｒｓ）、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳカラム（東ソ
ー（株））などの他、炭素数が８のＣｏｓｍｏｓｉｌ
５Ｃ８カラム（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）、マイ
クロボンダパックＣ８カラムなどを用いて行うのがよ
い。
【００１２】カラムはあらかじめ０．１％ＴＦＡなどで
平衡化した後、前工程で得た活性画分の透析液をアプラ
イし、一般的なアセトニトリルの直線濃度勾配により溶
出する。ＴＮＦαインヒビターは比較的疎水性度が低い
ことから他の不純タンパクとの分離が良く、本ステップ
で飛躍的に精製度が上昇する。ここで得られた活性画分
をプールし、凍結乾燥を行った後さらに次の逆相クロマ
トグラフィーに供する。次の充填剤カラムとしては炭素
数が４のアルキル基で修飾されたシリカのカラムたとえ
ばＶｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４カラム（Ｃｙｐｒ
ｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ．）、Ｃ
ｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ４−３００カラム（Ｎａｃａｌａ
ｉ Ｔｅｓｑｕｅ）などを用いるのが好ましい。カラム
はあらかじめ０．１％ＴＦＡなどで平衡化した後、同溶
液に溶かした上記の活性画分をアプライし、たとえばア
セトニトリルの直線濃度勾配により溶出する。ＴＮＦα
インヒビターは第一ピークとして検出され、その後不純
タンパクが溶出されてくることからここでもさらに精製
度が上昇する。このステップでＴＮＦαインヒビターは
単一に近くなるが、まだ若干の不純物が残っていること
が多い。その場合は最後のステップとして同様の炭素数
４のカラムを用い、移動相の溶媒を変更して精製を行う
のが有効である。カラムはたとえば５ｍＭ酢酸−トリメ
チルアミン（ＴＭＡ）（ｐＨ５）で平衡化し、同溶液に
溶かした試料をアプライし、アセトニトリルの直線濃度
勾配により溶出する。本ステップによってＴＮＦαイン
ヒビターは単一なタンパクとして得ることができる。な
おここで用いられる逆相カラムとしては分析用あるいは
分取用のものが使用可能である。
平衡化した後、前工程で得た活性画分の透析液をアプラ
イし、一般的なアセトニトリルの直線濃度勾配により溶
出する。ＴＮＦαインヒビターは比較的疎水性度が低い
ことから他の不純タンパクとの分離が良く、本ステップ
で飛躍的に精製度が上昇する。ここで得られた活性画分
をプールし、凍結乾燥を行った後さらに次の逆相クロマ
トグラフィーに供する。次の充填剤カラムとしては炭素
数が４のアルキル基で修飾されたシリカのカラムたとえ
ばＶｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４カラム（Ｃｙｐｒ
ｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ．）、Ｃ
ｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ４−３００カラム（Ｎａｃａｌａ
ｉ Ｔｅｓｑｕｅ）などを用いるのが好ましい。カラム
はあらかじめ０．１％ＴＦＡなどで平衡化した後、同溶
液に溶かした上記の活性画分をアプライし、たとえばア
セトニトリルの直線濃度勾配により溶出する。ＴＮＦα
インヒビターは第一ピークとして検出され、その後不純
タンパクが溶出されてくることからここでもさらに精製
度が上昇する。このステップでＴＮＦαインヒビターは
単一に近くなるが、まだ若干の不純物が残っていること
が多い。その場合は最後のステップとして同様の炭素数
４のカラムを用い、移動相の溶媒を変更して精製を行う
のが有効である。カラムはたとえば５ｍＭ酢酸−トリメ
チルアミン（ＴＭＡ）（ｐＨ５）で平衡化し、同溶液に
溶かした試料をアプライし、アセトニトリルの直線濃度
勾配により溶出する。本ステップによってＴＮＦαイン
ヒビターは単一なタンパクとして得ることができる。な
おここで用いられる逆相カラムとしては分析用あるいは
分取用のものが使用可能である。
【００１３】各工程における精製画分のＴＮＦαインヒ
ビターの活性測定は以下の方法で行うことができる。マ
ウスＬ９２９細胞を９６穴プレートに３００００ｃｅｌ
ｌｓ／ｗｅｌｌではん種し、１０％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏ
ｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ−ＥＡＧ
ＬＥ培地中で３７℃、５％ＣＯ2 気流下、２４時間培養
する。その後、培地を除き、アクチノマイシンＤとＴＮ
Ｆαをそれぞれ１μｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌとなるよ
うに添加した上記培地１００μｌを加え、さらにアクチ
ノマイシンＤ １μｇ／ｍｌを加えた上記培地で希釈し
た試料を加える。さらに１８時間培養した後、培地を除
き、
ビターの活性測定は以下の方法で行うことができる。マ
ウスＬ９２９細胞を９６穴プレートに３００００ｃｅｌ
ｌｓ／ｗｅｌｌではん種し、１０％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏ
ｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ−ＥＡＧ
ＬＥ培地中で３７℃、５％ＣＯ2 気流下、２４時間培養
する。その後、培地を除き、アクチノマイシンＤとＴＮ
Ｆαをそれぞれ１μｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌとなるよ
うに添加した上記培地１００μｌを加え、さらにアクチ
ノマイシンＤ １μｇ／ｍｌを加えた上記培地で希釈し
た試料を加える。さらに１８時間培養した後、培地を除
き、
【００１４】ＭＥＭ−ＥＡＧＬＥ培地、０．２％ニュー
トラルレッド、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）を６：
３：１の割合で混ぜたものを１００μｌ／ｗｅｌｌで分
注する。さらに１時間培養した後、培地を除去洗浄す
る。５０％エタノールを含む０．１Ｍリン酸溶液を１０
０μｌ／ｗｅｌｌで分注し、室温で３０分抽出後、５４
６ｎｍの吸収を測定する。
トラルレッド、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）を６：
３：１の割合で混ぜたものを１００μｌ／ｗｅｌｌで分
注する。さらに１時間培養した後、培地を除去洗浄す
る。５０％エタノールを含む０．１Ｍリン酸溶液を１０
０μｌ／ｗｅｌｌで分注し、室温で３０分抽出後、５４
６ｎｍの吸収を測定する。
【００１５】次に本発明を実施例により更に詳細に説明
するが、本発明の範囲はこれらの例に限定されるもので
はない。
するが、本発明の範囲はこれらの例に限定されるもので
はない。
【００１６】
【実施例】 実施例１ 新鮮な人尿２．８ｔに硫安を濃度５０％になるように加
え、生成する沈澱を濾取して１０ｍＭクエン酸緩衝液
（ｐＨ５．０）に溶解し、溶液を同緩衝液に透析し、透
析内液をあらかじめ同緩衝液で平衡化したＣＭ−セファ
ロースカラム（樹脂量５００ｍｌ）にアプライした。カ
ラムを同緩衝液で洗浄後、０−０．４Ｍの塩化ナトリウ
ムによる直線濃度勾配により溶出した（図１）。得られ
た活性画分を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
に透析し、透析内液をあらかじめ同緩衝液で平衡化した
ＱＡＥ−トヨパールカラム（樹脂量５０ｍｌ）にアプラ
イした。カラムを同緩衝液で洗浄後、０−０．５Ｍの塩
化ナトリウムによる直線濃度勾配により溶出した（図
２）。次に活性画分を１Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、透析内液を
あらかじめ同緩衝液で平衡化したフェニルセファロース
カラム（樹脂量２０ｍｌ）にアプライした。カラムを洗
浄後、１−０Ｍの硫酸アンモニウムによる直線濃度勾配
により溶出した（図３）。得られた活性画分は限外ろ過
にて約１０倍濃縮し、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）に透析した。透析内液をあらかじめ８％アセトニト
リル（ＡＮ）を含む０．１％ＴＦＡで平衡化した逆相カ
ラムＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ８にアプライし、洗浄後、
最初の２０分間でＡＮ濃度を直線的に４０％上昇させ、
次の１０分間でＡＮ濃度を３２％に上昇させるプログラ
ムで溶出した。流速はすべて１ｍｌ／ｍｉｎで行った。
図４に示したように活性は早い時期に溶出され、大部分
の不純タンパクがこのステップで除かれることがわかっ
た。
え、生成する沈澱を濾取して１０ｍＭクエン酸緩衝液
（ｐＨ５．０）に溶解し、溶液を同緩衝液に透析し、透
析内液をあらかじめ同緩衝液で平衡化したＣＭ−セファ
ロースカラム（樹脂量５００ｍｌ）にアプライした。カ
ラムを同緩衝液で洗浄後、０−０．４Ｍの塩化ナトリウ
ムによる直線濃度勾配により溶出した（図１）。得られ
た活性画分を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
に透析し、透析内液をあらかじめ同緩衝液で平衡化した
ＱＡＥ−トヨパールカラム（樹脂量５０ｍｌ）にアプラ
イした。カラムを同緩衝液で洗浄後、０−０．５Ｍの塩
化ナトリウムによる直線濃度勾配により溶出した（図
２）。次に活性画分を１Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析し、透析内液を
あらかじめ同緩衝液で平衡化したフェニルセファロース
カラム（樹脂量２０ｍｌ）にアプライした。カラムを洗
浄後、１−０Ｍの硫酸アンモニウムによる直線濃度勾配
により溶出した（図３）。得られた活性画分は限外ろ過
にて約１０倍濃縮し、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）に透析した。透析内液をあらかじめ８％アセトニト
リル（ＡＮ）を含む０．１％ＴＦＡで平衡化した逆相カ
ラムＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ８にアプライし、洗浄後、
最初の２０分間でＡＮ濃度を直線的に４０％上昇させ、
次の１０分間でＡＮ濃度を３２％に上昇させるプログラ
ムで溶出した。流速はすべて１ｍｌ／ｍｉｎで行った。
図４に示したように活性は早い時期に溶出され、大部分
の不純タンパクがこのステップで除かれることがわかっ
た。
【００１７】得られた精製活性画分を凍結乾燥後、０．
１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解し、さらに８％
アセトニトリル（ＡＮ）を含む０．１％ＴＦＡで平衡化
した逆相カラムＶｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４にア
プライした。カラムを洗浄後、４０分間でＡＮ濃度を４
０％上昇させるプログラムで溶出した。流速はすべて１
ｍｌ／ｍｉｎで行った。図５に示したようにＴＮＦαイ
ンヒビターは第一ピークとして検出され、その後に不純
タンパクが溶出された。しかしこの分画にはまだ不純タ
ンパクが混入していたことより移動相を０．１％ＴＦＡ
から５ｍＭ酢酸−トリメチルアミン（ＴＭＡ）（ｐＨ
５．０）に変えて再クロマトを行った。即ち、８％ＡＮ
を含む５ｍＭ酢酸−ＴＭＡ（ｐＨ５．０）で平衡化した
逆相カラムＶｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４に先の精
製画分をアプライし、洗浄後、４０分間でＡＮ濃度を４
０％上昇させるプログラムで溶出した。流速はすべて１
ｍｌ／ｍｉｎで行った。図６で見られる第一ピークを分
取することにより単一なＴＮＦαインヒビター（約３０
０μｇ）を得ることができた。
１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解し、さらに８％
アセトニトリル（ＡＮ）を含む０．１％ＴＦＡで平衡化
した逆相カラムＶｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４にア
プライした。カラムを洗浄後、４０分間でＡＮ濃度を４
０％上昇させるプログラムで溶出した。流速はすべて１
ｍｌ／ｍｉｎで行った。図５に示したようにＴＮＦαイ
ンヒビターは第一ピークとして検出され、その後に不純
タンパクが溶出された。しかしこの分画にはまだ不純タ
ンパクが混入していたことより移動相を０．１％ＴＦＡ
から５ｍＭ酢酸−トリメチルアミン（ＴＭＡ）（ｐＨ
５．０）に変えて再クロマトを行った。即ち、８％ＡＮ
を含む５ｍＭ酢酸−ＴＭＡ（ｐＨ５．０）で平衡化した
逆相カラムＶｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４に先の精
製画分をアプライし、洗浄後、４０分間でＡＮ濃度を４
０％上昇させるプログラムで溶出した。流速はすべて１
ｍｌ／ｍｉｎで行った。図６で見られる第一ピークを分
取することにより単一なＴＮＦαインヒビター（約３０
０μｇ）を得ることができた。
【００１８】かくして得られた精製ＴＮＦαインヒビタ
ーについて還元条件下でＳＤＳ電気泳動（１０−２０％
ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ）を行い、ＣＢＢ Ｒ−２
５０で染色した結果を図７に示すが、分子量約３万の位
置に単一バンドとして検出された（ｌａｎｅ ２）。ま
たこの試料をＮ−グリカナーゼ処理すると分子量約２万
の位置に移動した（ｌａｎｅ ３）ことから本タンパク
は約３０％の糖鎖を含むことがわかった。（ｌａｎｅ
１：分子量マーカー；９４，６７，４３，３０，２０．
１，１４．４ ｋＤａ）
ーについて還元条件下でＳＤＳ電気泳動（１０−２０％
ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ）を行い、ＣＢＢ Ｒ−２
５０で染色した結果を図７に示すが、分子量約３万の位
置に単一バンドとして検出された（ｌａｎｅ ２）。ま
たこの試料をＮ−グリカナーゼ処理すると分子量約２万
の位置に移動した（ｌａｎｅ ３）ことから本タンパク
は約３０％の糖鎖を含むことがわかった。（ｌａｎｅ
１：分子量マーカー；９４，６７，４３，３０，２０．
１，１４．４ ｋＤａ）
【００１９】実施例２ 次に実施例１で得られたＴＮＦαインヒビターの１次構
造を以下のように調べた。まず一定量のＴＮＦαインヒ
ビターを８Ｍグアニジン塩酸、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む
０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、含
有システインの１００倍モル量のジチオスレイトール
（ＤＴＴ）を加えて５０℃、４時間処理した。その後、
溶液を室温に戻し、ＤＴＴの２．５倍モル量のヨード酢
酸ナトリウムを加えて室温１時間処理することによりカ
ルボキシメチル化した。過剰の試薬を脱塩除去、濃縮乾
固後、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解
し、リシルエンドペプチダーゼを基質の１／５０（ｗ／
ｗ）になるように加えて３７℃、８時間消化した。８時
間後、さらに同量の酵素を加えて３７℃、１５時間消化
し、逆相カラムＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ８に供して溶出
した各ピークを分取した。カラムは０．１％ＴＦＡで平
衡化し、試料を添加後、洗浄し、４０分間でアセトニト
リル濃度が４８％上昇するプログラムにて溶出した。流
速は１ｍｌ／ｍｉｎで行った。得られた各ペプチドのア
ミノ酸配列はＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ４７
３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により
分析した。またペプチドが長い場合はさらにトリプシン
で消化を行い、同様に分析した。
造を以下のように調べた。まず一定量のＴＮＦαインヒ
ビターを８Ｍグアニジン塩酸、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む
０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、含
有システインの１００倍モル量のジチオスレイトール
（ＤＴＴ）を加えて５０℃、４時間処理した。その後、
溶液を室温に戻し、ＤＴＴの２．５倍モル量のヨード酢
酸ナトリウムを加えて室温１時間処理することによりカ
ルボキシメチル化した。過剰の試薬を脱塩除去、濃縮乾
固後、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解
し、リシルエンドペプチダーゼを基質の１／５０（ｗ／
ｗ）になるように加えて３７℃、８時間消化した。８時
間後、さらに同量の酵素を加えて３７℃、１５時間消化
し、逆相カラムＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ８に供して溶出
した各ピークを分取した。カラムは０．１％ＴＦＡで平
衡化し、試料を添加後、洗浄し、４０分間でアセトニト
リル濃度が４８％上昇するプログラムにて溶出した。流
速は１ｍｌ／ｍｉｎで行った。得られた各ペプチドのア
ミノ酸配列はＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ４７
３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により
分析した。またペプチドが長い場合はさらにトリプシン
で消化を行い、同様に分析した。
【００２０】ペプチドの溶出パターンを図８に、各ピー
クのアミノ酸配列を表１に示す。またＴＮＦαインヒビ
ターの全一次構造を図９に示すが、この構造は遺伝子の
構造より推測されるＴＮＦαリセプターの細胞外ドメイ
ン部分の構造と良く一致した。よって本タンパクは１６
１残基のアミノ酸から成るＴＮＦαリセプターの可溶化
物であることが証明された。
クのアミノ酸配列を表１に示す。またＴＮＦαインヒビ
ターの全一次構造を図９に示すが、この構造は遺伝子の
構造より推測されるＴＮＦαリセプターの細胞外ドメイ
ン部分の構造と良く一致した。よって本タンパクは１６
１残基のアミノ酸から成るＴＮＦαリセプターの可溶化
物であることが証明された。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【発明の効果】本発明によれば、人尿から単一成分にま
で精製された腫瘍壊死因子インヒビターを大量に抽出、
製造することができる。
で精製された腫瘍壊死因子インヒビターを大量に抽出、
製造することができる。
図１〜図７は実施例１における実験結果を示すもので、
図１、図２および図３はそれぞれ弱酸性陽イオン交換、
強塩基性イオン交換および疎水性交換カラムクロマトグ
ラフィーにおける溶出パターンを示し、図４、図５およ
び図６は３段階で行われた逆相カラムクロマトグラフィ
ーの溶出パターンを示し、図７は図６の第１ピーク分画
を電気泳動し、染色した写真で、１は分子量マーカー、
２は上記の分画、３はその分画をＮ−グリカナーゼで処
理したものである。図８は実施例１で得られたＴＮＦα
インヒビターを酵素で分解して逆相クロマトグラフィー
にかけた溶出パターンを、図９は解析されたＴＮＦαイ
ンヒビターの全一次構造を示す。
図１、図２および図３はそれぞれ弱酸性陽イオン交換、
強塩基性イオン交換および疎水性交換カラムクロマトグ
ラフィーにおける溶出パターンを示し、図４、図５およ
び図６は３段階で行われた逆相カラムクロマトグラフィ
ーの溶出パターンを示し、図７は図６の第１ピーク分画
を電気泳動し、染色した写真で、１は分子量マーカー、
２は上記の分画、３はその分画をＮ−グリカナーゼで処
理したものである。図８は実施例１で得られたＴＮＦα
インヒビターを酵素で分解して逆相クロマトグラフィー
にかけた溶出パターンを、図９は解析されたＴＮＦαイ
ンヒビターの全一次構造を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＥ ＡＤＵ
Claims (5)
- 【請求項１】 人尿に陽イオン交換カラムクロマトグラ
フィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水
性カラムクロマトグラフィーおよび逆相カラムクロマト
グラフィーを結合して適用し、各クロマトグラフィーで
得られる腫瘍壊死因子インヒビターの活性画分を続くク
ロマトグラフィーに付することを特徴とする人尿中の腫
瘍壊死因子インヒビターの精製法。 - 【請求項２】 陽イオン交換カラムクロマトグラフィー
が弱酸性イオン交換樹脂を充填剤として行われる請求項
１記載の精製法。 - 【請求項３】 陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
が強塩基性イオン交換樹脂を充填剤として行われる請求
項１記載の精製法。 - 【請求項４】 疎水性カラムクロマトグラフィーがアル
キル基またはフェニル基の結合された疎水性樹脂を充填
剤として行われる請求項１記載の精製法。 - 【請求項５】 逆相カラムクロマトグラフィーが先ず炭
素数１８もしくは８のアルキル基で修飾されたシリカ、
次いで炭素数４のアルキル基で修飾されたシリカを充填
剤として行われる請求項１記載の精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6087436A JPH07278192A (ja) | 1994-04-01 | 1994-04-01 | 人尿腫瘍壊死因子インヒビターの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6087436A JPH07278192A (ja) | 1994-04-01 | 1994-04-01 | 人尿腫瘍壊死因子インヒビターの精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07278192A true JPH07278192A (ja) | 1995-10-24 |
Family
ID=13914823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6087436A Pending JPH07278192A (ja) | 1994-04-01 | 1994-04-01 | 人尿腫瘍壊死因子インヒビターの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07278192A (ja) |
-
1994
- 1994-04-01 JP JP6087436A patent/JPH07278192A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Miyazono et al. | Purification and properties of an endothelial cell growth factor from human platelets. | |
| Wheelock et al. | Soluble 80‐kd fragment of cell‐CAM 120/80 disrupts cell‐cell adhesion | |
| EP0460426B1 (en) | Protein purification method | |
| Thomas et al. | Brain fibroblast growth factor: nonidentity with myelin basic protein fragments. | |
| US4785079A (en) | Isolation of fibroblast growth factor | |
| DE68915675T3 (de) | Verfahren zur Reinigung von Vitamin K-abhängigen Proteinen. | |
| KR100234497B1 (ko) | Tgf-베타 2 및 tgf-베타3의 대형 잠복 복합체 | |
| JPH04505014A (ja) | 新規の蛋白質及びその製法 | |
| AU2011234532A1 (en) | Process for the purification of a Growth Factor Protein | |
| HUE027724T2 (hu) | Eljárás G-CSF tisztítására | |
| RU2358980C2 (ru) | Способ очистки и/или выделения биологически активного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора | |
| JP3438735B2 (ja) | 上清ｉｖ、特にｉｖ−４またはコーンフラクションｖまたはそれと類似の上清または画分からヒトアルブミンを単離する方法 | |
| JPS63503352A (ja) | タンパク質の精製 | |
| DE68915226T2 (de) | Thrombin bindende Substanz und Verfahren zu ihrer Herstellung. | |
| EP0685490A1 (en) | Process for the purification of homogeneous platelet-derived endothelial cell growth factor from a platelet lysate | |
| US4902782A (en) | Isolation of fibroblast growth factor | |
| CA2128215C (en) | Autotaxin: motility stimulating protein useful in cancer diagnosis and therapy | |
| JPH07278192A (ja) | 人尿腫瘍壊死因子インヒビターの精製法 | |
| DE3783693T2 (de) | Verfahren zur reinigung des gewebeplasminogenaktivators. | |
| JPS59155324A (ja) | ヒト尿中チオ−ルプロテア−ゼインヒビタ−を有効成分とする抗炎症剤及びその製造法 | |
| US4495096A (en) | Process for producing and obtaining anaphylatoxin-and cocytotaxin-containing leucotaxine preparations and of anaphylatoxin and cocytotaxin proteins in molecularly homogeneous, biologically active form | |
| DE69005618T2 (de) | Verfahren zur wiedergewinnung eines gereinigten epi-proteins aus einer lösung, insbesondere einer gärungslösung. | |
| EP0434836B1 (en) | Method for purifying tenascin | |
| US5071956A (en) | Protein with vascular activity derived from monocytes and its analogues, a process for its extraction and their uses for therapeutic purposes and for the preparation of antibodies | |
| CA1334390C (en) | Glycoprotein growth modulation materials |