KR101509284B1 - 서바이빈으로부터 유래된 신규하고 강력한 ｍｈｃ-클래스 ｉｉ 펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역 요법 방식에 사용되는 펩티드, 핵산 및 세포들에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암의 면역 요법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단독으로 사용되거나 또는 항종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성물의 약학 성분으로서 사용되는 다른 종양 관련된 펩티드와 병용되는 서바이빈으로부터 유래된 종양 관련 세포독성 T 세포(CTL) 펩티드 에피토프에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항종양 면역 반응을 유도하는 백신 조성물에 사용될 수 있는 인간 종양 세포의 HLA 클래스 I 및 II 분자의 세 개의 새로운 펩티드 서열 및 이의 변이체에 관한 것이다.

Description

서바이빈으로부터 유래된 신규하고 강력한 ＭＨＣ-클래스 ＩＩ 펩티드{NOVEL AND POWERFUL MHC-CLASS II PEPTIDES DERIVED FROM SURVIVIN}
본 발명은 면역 요법에 사용되는 펩티드, 핵산 및 세포들에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암의 면역 요법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단독으로 사용되거나 또는 항종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성물의 활성 약학 성분으로서 작용하는 다른 종양 관련된 펩티드와 병용되는, 서바이빈(survivin)으로부터 유래된 종양 관련 세포독성 T 세포(CTL) 펩티드 에피토프에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 항종양 면역 반응을 유도하는 백신 조성물에 사용될 수 있는 인간 종양 세포의 HLA 클래스 I과 클래스 II 분자로부터 유래된 세 개의 신규한 펩티드 서열 및 이의 변이체에 관한 것이다.
신경 교종은 신경계의 신경 교세포에서 기원한 뇌 종양이다. 흔히 신경교 또는 단순히 아교라고 불리는 신경 교세포는 지지력 및 영양을 제공하고, 항상성을 유지하고, 미엘린을 형성하고, 신경계의 신호 전달에 참여하는 비신경 세포들이다. 신경 교종의 가장 중요한 두 가지 소그룹은 이들이 기원한 정상 신경 교세포 유형(각각 성상세포 또는 희소돌기아교세포)에 따라 지칭되는 성상세포종 및 희소돌기 신경 교종이 있다. 성상세포종의 소그룹에 속하는, 다형성아교모세포종(이하 아교모세포종)은 성인에서 가장 흔한 악성 뇌종양이며 모든 악성 뇌종양의 약 40% 및 신경 교종의 약 50%를 차지한다(CBTRUS, 2006). 이것은 중추신경계를 공격적으로 침략하고 모든 신경 교종 중 가장 높은 악성 레벨(IV 등급)로 선정되었다. 뉴로이미징, 미세수술, 다양한 치료 옵션, 예컨대 테모졸로마이드 또는 방사선의 향상에 기인한 치료의 안정적인 발전에도 불구하고, 아교모세포종은 불치로 남아있다(Macdonald, 2001; Burton and Prados, 2000; Prados and Levin, 2000). 뇌종양의 치사율은 매우 높다: 처음 진단 후 평균 기대 수명은 9 내지 12개월이다. 1986년부터 1990년까지의 관찰 기간 동안 5년 생존율은 8.0%이었다. 현재까지 총 종양 절제술을 포함한 적극적인 치료를 수행한 후에도 생존율은 여전히 10% 미만이다(Burton and Prados, 2000; Nieder et al., 2000; Napolitano et al., 1999; Dazzi et al., 2000). 따라서, 대체할만한 효과적인 치료 방법에 대한 강력한 의학적 요구가 있다.
아교모세포종의 종양 세포는 뇌종양 중 가장 미분화되었고, 따라서 종양 세포들은 이동 및 증식의 잠재력이 높으며 굉장히 침략적이고 이것은 매우 나쁜 예후로 이끈다. 아교모세포종은 뇌에서의 빠르고, 공격적이고, 침투하는 성장으로 인하여 죽음으로 이끈다. 이 종양들의 제거가 불가능한 성질에는 침투하는 성장 패턴에 책임이 있다. 아교모세포종은 방사선 및 화학요법에 비교적 저항하며, 따라서, 치료 후 재발률이 높다. 또한, 종양 세포에 대한 면역 반응은 절제 및 방사선 요법 이후의 모든 종양 세포의 완전한 근절에 오히려 효과적이지 않다(Roth and Weller, 1999; Dix et al., 1999; Sablotzki et al., 2000).
아교모세포종은 미분화된 성상세포 또는 신경 교 전구 세포의 악성 변형 중에 유전적 메커니즘의 차이에 따라 1차 아교모세포종(신생) 및 2차 아교모세포종으로 분류된다. 2차 아교모세포종은 45세 이하의 젊은 인구에서 나타난다. 4 내지 5년 동안, 평균적으로, 2차 아교모세포종은 낮은-등급의 성상세포종으로부터 미분화된 성상세포종으로 발현된다. 그에 비해, 1차 아교모세포종은 주로 평균 55세의 나이가 더 많은 인구에서 나타난다. 일반적으로, 1차 아교모세포종은 임상적 또는 병리학적 이상이 없는 상태로부터 3개월 내에 종양으로 발전되는 특징을 갖는 전격성 아교모세포종으로서 발생한다(Pathology and Genetics of the Nervous Systems. 29-39 (IARC Press, Lyon, France, 2000)).
아교모세포종은 유수 신경을 따라 이동하며 중추신경계에서 광범위하게 퍼진다. 대부분의 경우 수술 치료는 한정된 지속적인 치료 효과를 보인다(Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 34, 91-94, 1994; Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 33, 425-458, 1993; Neuropathology 17, 186-188, 1997) (Macdonald, 2001; Prados and Levin, 2000).
악성 신경 교종 세포는 T 세포 증식 및 면역 자극성의 사이토카인 IL-2의 생성을 손상하는 면역 억제제를 생산함으로써 숙주 면역계에 의한 탐지를 피한다(Dix et al, 1999).
두개내의 종양은 뇌, 뇌막, 뇌하수체, 골, 및 심지어는 잔여 배아 조직을 포함한 CNS에 존재하는 임의의 구조 또는 세포 유형으로부터 발생할 수 있다. 미국에서 연간 1차 뇌 종양의 전체 발병률은 100,000 중 14 사례이다. 가장 흔한 1차 뇌 종양은 수막종이며, 모든 1차 뇌종양의 27%를 차지하고, 아교모세포종은 모든 1차 뇌 종양의 23%를 차지한다(반면, 아교모세포종은 성인의 악성 뇌 종양의 40%를 차지한다). 이런 종양들 대부분은 공격적이고 높은 등급이다. 1차 뇌 종양은 소아의 가장 흔한 고체 종양이며 백혈병 다음으로 소아의 두 번째로 빈번한 암에 의한 죽음의 원인이다.
환자들을 위한 아교모세포종의 효과적인 치료에 대한 연구는 오늘도 진행 중이다. 종양 세포에 맞서기 위한 면역 요법, 또는 면역계의 모집을 통한 치료가 연구되고 있다. 우선, 항원-특이적 CTL 반응이 유도되어, 최소한의 독성을 겸비한 표준 치료를 적용하여 획득되는 것에 비해서 연장된 평균 생존 시간을 유도하는, 인간 면역 요법 연구에서 아교모세포종의 치료를 위한 "DCVax 뇌"를 사용하는 노스웨스트 테라피우틱스(Northwest Therapeutics)에 의해 고무적인 결과가 획득되었다(Heimberger et al., 2006).
대장 선암
미국 암 협회에 따르면, 대장 선암(CRC)은 미국에서 세 번째로 가장 흔한 암이며, 매년 175,000명 초과의 새로운 환자를 괴롭힌다. 미국, 일본, 프랑스, 독일, 이탈리아, 스페인 및 영국에서, 이는 480,000명 이 넘는 환자들에게 영향을 미친다. 이는 선진국에서 가장 일반적인 암 사망의 원인이다. 대장암 환자들의 1- 및 5-년 상대적 생존율은 각각 84% 및 64%이다. 생존율은 5년 후에도 계속 감소하며 진단 후 10년에는 57%가 된다. 대장암이 초기, 국소 단계에서 감지되었을 때는 5-년 생존율은 90%이다; 그러나, 주로 낮은 검진률 때문에 대장암의 39%만이 이 시기에 진단된다. 암이 주변 장기 또는 림프절로 지역적으로 퍼진 후, 5-년 생존율은 68%로 떨어진다. 원거리 전이가 있는 사람들에게는, 5-년 생존율은 10%이다.
연구에 따르면, 대장암의 발병은 선천적 요인과 후천적 요인의 상호 작용의 결과이다. 대부분의 경우, 선종성 용종이 대장 종양의 전조로 보인다; 그러나, 전이는 몇 년이 걸릴 수도 있다. 대장암의 주요 위험 요인은 나이이며, 진단된 사례의 90%가 50세 이상이었다. 미국 암 협회에 따르면 대장암의 다른 위험 요인은 알코올 소비, 지방 및/또는 붉은 고기가 많은 식단, 및 과일 및 채소의 섭취 부족이 있다. 발병률은 계속 상승되고 있으며, 일본과 같은, 지방 및 고기 섭취가 많고 섬유소의 섭취가 줄어든 서양화된 식단의 채택에 원인이 있을 수 있는 곳에서 특히 그러하다. 그러나, 발병률은 이전보다는 빨리 상승되지 않고 있고 이는 검진 및 용종 제거의 증가에 따라 용종이 암으로 진행되는 것이 방지되기 때문일 수 도 있다.
대부분의 고체 종양에서와 같이, 1차 치료는 수술이지만, 이의 이점은 초기-단계의 환자에게 국한되며, 상당한 비율의 환자는 질병이 진행된 단계에서 진단된다. 진행된 대장암에는 플루오로유라실에 기반을 둔 방식의 화학요법 방식이 표준 치료법이다. 이런 방식들의 대부분은 소위 FOLFOX(주입 5-FU/류코보린 + 옥살리플라틴) 및 FOLFIRI(이리노테칸, 류코보린, 볼러스 및 지속적-주입 5-FU) 프로토콜이라고 불린다.
이리노테칸 및 옥살리플라틴과 같은 3 세대 세포독성의 도입은 효능 개선의 희망을 상당히 높였지만, 예후는 여전히 상대적으로 나쁘고, 생존율은 일반적으로 전이 질병에서 20개월 정도로 남아있으며, 결과적으로, 질병의 미충족 수요가 높게 남아있다.
최근에 아바스틴(Avastin)(베바시주맙) 및 얼비툭스(Erbitux)(세툭시맙)와 같은 신규한 세대의 약물, 분자-표적화 제제들이 사용 가능해졌으며, 약 40개의 화합물이 대장암의 여러 단계를 위한 임상 개발의 후기 단계에 있다. 이 화합물들의 여러 조합이 미래에 기대되는 잠재 치료 옵션의 수를 증가시킨다. 대부분의 물질은 II 단계에 있고, EGFR은 대장암 환자의 약 80%에서 EGFR의 발현이 상향조절된다는 사실 때문에 임의의 다른 대장암 실험에서보다 더 자주 이들 화합물들에 의해 처리된다.
최근에 승인된 단일 클론 항체(mAb)(세툭시맙 + 이리노테칸 또는 FOLFOX4; 단일 제제로서 또는 FOLFOX4와 함께 베바시주맙)와 화학 요법을 결합한 II 단계 환자들의 임상 실험이 현재 진행 중이다. 이들 실험으로부터 통계적으로 유의한 결과를 얻기 위해서 3 내지 4년간의 관찰 기간이 예상된다.
일반적으로 현재 종양학에서 사용되는 단일 클론 항체(mAb)는 활성 면역 요법을 방해하지 않을 뛰어난 가능성을 갖는다. 사실, (베바시주맙에 의한) VEGF의 소모가 T 세포의 DC-매개된 활성화에 긍정적으로 기여한다는 것을 암시하는 임상 전(GABRILOVICH 1999) 및 임상적 증거가 있다(Osada T, Chong G, Tansik R, Hong T, Spector N, Kumar R, Hurwitz HI, Dev I, Nixon AB, Lyerly HK, Clay T, Morse MA. The effect of anti-VEGF therapy on immature myeloid cell and dendritic cells in cancer patinets. Cancer Immunol Immunother. 2008년 1월 10일).
전립선암 및 기타 종양
2007년에 추정된 27,050명의 죽음으로, 전립선암은 남성의 암의 주요 사망 원인이다. 1990년대 초반부터 백인과 아프리카계 미국인 남성 사이에서는 사망률이 감소되고 있지만, 아프리카계 미국인 남성의 사망률은 백인 남성보다 두 배 이상으로 유지된다. 전립선암은 남성에서 가장 자주 진단되는 암이다. 불분명하게 남아있는 이유로, 발병률은 백인보다 아프리카계 미국인에서 상당히 더 높다. 전립선암의 발병률은 지난 20년 동안 상당한 변화가 있었다: 1988년 내지 1992년에는급격히 증가되었고, 1992년 내지 1995년에는 급속히 감소되었고, 1995년 이후에는 완만하게 증가되었다. 이러한 경향은 대부분 전립선-특이적 항원(PSA) 혈액 검사와 함께 증가된 전립선암 검진을 반영한다. 지난 10년의 완화된 발병률 증가는 65세 보다 젊은 남성들 사이에서 널리 보급된 PSA 검진 때문일 가능성이 크다. 전립선암 발병률은 65세 이상의 남성에서는 변화가 없었다. 발병률은 백인 남성에서는 1992년 (10,000명의 남성 중 237.6명) 및 아프리카계 미국인에서는 1993년에 (10,000명의 남성 중 342.8명) 최고치를 보였다.
전립선암의 치료는 주의 깊은 기다림, 수술, 방사선 치료, 고강도 집중 초음파(HIFU), 화학요법, 저온 수술, 호르몬 요법, 또는 일부 조합을 포함할 수 있다. 어떤 옵션이 가장 최선인지는 질병의 단계, 글리슨(Gleason) 점수, 및 PSA 수준에 달려있다. 다른 중요한 요인에는 남성의 나이, 전반적인 건강, 및 잠재적인 치료 및 가능한 부작용에 대한 감정들이 있다. 모든 치료 방법은 발기 부전 및 요실금 등과 같은 상당한 부작용을 가질 수 있기 때문에, 치료 방법 논의는 종종 치료의 목표와 생활 방식 변경 위험의 균형에 초점을 맞춘다.
만약 암이 전립선 밖으로 퍼질 경우에는, 치료 옵션이 상당히 변경되기 때문에, 전립선암을 치료하는 대부분의 의사들은 확산의 가능성을 예측하는 다양한 노모그램을 사용한다. 주의 깊은 기다림, HIFU, 방사선 치료, 저온 수술 및 수술에 의한 치료는 암이 전립선 내에 남아있는 남성들에게 일반적으로 권해진다. 호르몬 요법과 화학요법은 종종 전립선 밖으로 확산된 질병의 경우를 위해 남겨진다. 그러나, 예외가 있다: 방사선 치료는 일부 진행된 종양에 사용될 수 있으며, 호르몬 요법은 일부 초기 단계의 종양에 사용된다. 또한, 저온 요법, 호르몬 요법 및 화학요법은 초기 치료가 실패하여 암이 진행될 때 권해질 수도 있다.
임상적으로 의심되는 장기-제한된 성장으로 인해 근치적 전립선 절제술을 받는 상당수의 전립선암 환자들에서, 수술 준비의 최종 조직학적 정밀검사는 장기의 경계를 넘어 확장된 국소적으로 확산된 종양을 보여준다. 이런 환자들은 초기의 국소 재발의 위험이 크며, 보통 생화학적 재발의 관점에서 PSA 수준의 증가로서 감지된다. 이런 상황에서 치료 옵션은 외부 방사선 치료 및 호르몬 제거(ablation)를 포함한다; 그러나, 이런 치료적 접근 방법의 가치는, 특히 환자의 장기적인 생존 연장에 대해서, 입증된 것으로 간주되서는 안 된다. 또한, 요도 협착의 발달(방사선 치료), 성욕의 손실, 및 발기 불능, 골다공증에 대한 골격 칼슘 염의 감소 위험, 및 병리학적 뼈 골절의 현저히 증가된 위험(호르몬 제거)과 같은 가능성 있는 치료-관련 합병증을 고려해야 한다.
모든 전립선암의 90% 이상은 국소적이며 지역적인 단계에서 발견된다; 이런 단계에서 진단된 종양의 환자들의 5년 상대적 생존율은 100%에 접근한다. 지난 25년 동안, 모든 단계에서의 5년 생존율은 69%로부터 거의 90%로 증가했다. 가장 최근의 데이터에 따르면, 상대적인 10년 생존율은 93%이고 15년 생존율은 77%이다. 특히 5년에서, 생존율의 극적인 개선은, 부분적으로 빠른 진단과 치료의 개선에 기인하고 있다. 그럼에도 불구하고, 생존율은 다른 조직 및 장기로 확산된 후에는 크게 떨어진다.
폐암
미국에서 2007년에 210,000건이 예상되고, 암 진단의 15%를 차지한다. 남성에서 발병률은 1984년에 100,000명 당 102건으로부터 2003년에 78.5건으로 크게 감소하고 있다. 여성에서, 발병률은 오랜 기간의 증가 후 안정기에 접근하고 있다. 폐암은 치료의 목적을 위해 소세포(13%) 또는 비소세포(87%)로서 임상적으로 분류된다.
폐암은 남성과 여성에서 가장 큰 암-관련 사망의 이유이다. 2007년에는 모든 암 사망의 약 29%를 차지하는 160,390건의 사망이 예상된다. 1987년부터, 매년 유방암보다 폐암으로 사망한 여성이 더 많았다. 남성 사망률은 1991년 내지 2003년에 매년 약 1.9%씩 상당히 감소하고 있다. 여성 폐암 사망률은 수 십년 동안의 지속적인 증가 후 안정기에 접근하고 있다. 폐암 사망률의 이런 경향은 지난 30년간의 흡연률 감소를 반영한다.
치료 옵션은 유형(소세포 또는 비소세포) 및 암의 단계에 따라 결정되고, 수술, 방사선 요법, 화학요법, 및 베바시주맙(아바스틴, 등록상표명) 또는 얼로티닙(타세바(Tarceva, 등록상표명)과 같은 표적화된 생물학적 요법을 포함한다. 국소 암에서는 수술이 일반적인 치료 선택이다. 최근의 연구는 초기 단계의, 비소세포 폐암에서의 생존율이 수술 후 화학요법으로 인해 개선된다는 것을 보여 주었다. 질병이 발견되는 시간에 이미 확산되었기 때문에, 방사선 요법 및 화학요법이, 때때로는 수술과 함께 종종 사용된다. 화학요법 단독 또는 방사선과 병용하는 요법은 소세포 폐암에서 사용되는 일반적인 치료 방법이며, 이 처방에서, 환자의 많은 비율의 환자가 완화를 경험하며, 이것은 일부 경우에서는 오래 지속될 수 있다.
폐암의 1년 상대적 생존율은 1975년 내지 1979년에 37%로부터 2002년에 42%로 약간 증가했고, 이것은 대부분 수술 기술 및 병용 요법의 개선 때문이다. 그러나, 모든 단계를 합한 5년 생존율은 겨우 16% 밖에 되지 않는다. 질병이 국소화되었을 때 발견된 경우 생존율은 49%이다; 그러나, 16%의 폐암만이 이러한 초기 단계에서 진단된다.
Figure 112010081795353-pct00001
그러므로, 화학요법제 또는 다른 심각한 부작용을 유도할 수 있는 제제들을 사용하지 않으면서 환자들의 건강과 행복을 향상시키는, 아교모세포종, 전립선 종양, 유방암, 식도암, 대장암, 투명 세포 신장 세포 선암, 폐암, CNS, 난소, 흑색종(Tamm et al. 1998) 췌장암, 편평 세포 선암, 백혈병 및 수모세포종 및 서바이빈의 과다발현을 보이는 다른 종양들에 대한 신규하고 효과적이며 안전한 치료 옵션에 대한 욕구가 존재한다.
제 1 양태에서, 본 발명은 서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드, 또는 서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3과 85% 이상 상동성인 변이체, 또는 상기 변이체 펩티드와 T 세포 교차-반응을 유도하는 변이체에 관한 것으로서, 이때 상기 펩티드는 인간 서바이빈의 전장 폴리펩티드가 아니다. 바람직하게는, 상기 펩티드는 HLA-A*02 또는 HLA-DR과 같은 특이적 HLA-아형을 갖는 펩티드로부터 선택된다.
제 2 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 상기 핵산을 발현할 수 있는 발현 벡터에 관한 것이다.
제 3 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것으로서, 이때 상기 숙주 세포는 바람직하게는 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포 또는 항원 제시 세포이다.
제 4 양태에서, 본 발명은 적당한 항원 제시 세포 또는 항원 특이적 방식으로 CTL을 활성화시키기에 충분한 시간 동안 항원 제시 세포를 모방하는 인공 구성체(construct)의 표면에 발현된 인간 클래스 I MHC 분자에 로딩된 항원과 CTL의 시험관내 접촉을 포함하는, 활성화된 세포독성 T 림프구(CTL)의 시험관내 제조 방법에 관한 것으로서, 이때 상기 항원은 본 발명에 따른 펩티드이다.
암의 치료 또는 암에 대한 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산 또는 발현 벡터, 본 발명에 따른 세포, 또는 본 발명에 따른 활성화된 세포독성 T 림프구의 용도가 제공되며, 이때 상기 약제는 바람직하게는 백신이다. 바람직하게는, 상기 암은 성상세포종, 모양세포성 성상세포종, 이형성 배아성 신경상피종, 희소돌기아교세포종, 뇌실막종, 다형성아교모세포종, 혼합 신경 교종, 희소돌기성상세포종, 수모세포종, 망막모세포종, 신경모세포종, 배아종, 기형종, 신경절신경아교종, 신경절세포종, 중추신경절세포종, 원시 신경외배엽 종양(PNET, 예를 들면, 수모세포종, 속질상피종, 신경모세포종, 망막모세포종, 뇌실막모세포종), 송과체 실질의 종양(예를 들면, 송과체종, 송과체모세포종), 뇌실막 세포 종양, 맥락막총 종양, 불특정 기원의 신경상피 종양(예를 들면, 대뇌신경아교종증, 성상모세포종), 아교모세포종 전립선 종양, 유방암, 식도암, 결장암, 대장암, 신장 세포 선암, 투명세포 신장세포 선암, 폐암, CNS, 난소, 흑색종 췌장암, 편평 세포 선암, 백혈병 및 수모세포종, 및 서바이빈의 과다발현을 보이는 기타 종양 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
(a) 용액 또는 동결건조된 형태로 본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산 또는 발현 벡터, 본 발명에 따른 세포, 또는 본 발명에 따른 활성화된 세포독성 T 림프구를 함유하는 약학 조성물을 갖는 용기; (b) 선택적으로, 동결건조된 제형을 위한 희석제 또는 재구성액을 갖는 제 2 용기; (c) 선택적으로, 서열 식별 번호: 4 내지 24에 따른 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드, 및 (d) 선택적으로, 용액의 사용 및/또는 동결건조된 제형의 재구성 및/또는 사용을 위한 지침을 포함하는 키트가 제공된다.
HLA-제한된 항원과 복합체를 형성하는 인간 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합하는 재조합성 항체의 제조 방법은 다음을 포함한다: 상기 HLA-제한된 항원과 복합체를 형성하는 가용성 형태의 MHC 클래스 I 또는 II 분자에 의해 상기 인간 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II를 발현하는 세포를 포함한 유전적으로 조작된 비인간 포유류를 면역시키는 단계; 상기 비인간 포유류의 항체 생성 세포로부터 mRNA 분자를 단리하는 단계; 상기 mRNA 분자에 의해 암호화된 단백질 분자를 디스플레이하는 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하는 단계; 및 상기 파지 디스플레이 라이브러리로부터 하나 이상의 파지를 단리하는 단계를 포함하며, 이때 하나 이상의 파지는 상기 HLA-제한된 항원과 복합체를 형성하는 상기 인간 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 디스플레이한다.
인간 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합하는 항체는 HLA-제한된 항원과 복합체를 형성하며, 이때 항체는 바람직하게는 다 클론 항체, 단일 클론 항체 및/또는 키메라 항체이다.
도 1은 아교모세포종 샘플 GB1006로부터 종양 관련 펩티드 NCAN-001을 식별하는 ESI-액체 크로마토그래피 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 2는 아교모세포종 관련 펩티드 NCAN-001을 암호화하는 NCAN 유전자의 mRNA 발현 프로필을 보여준다. 이 유전자의 발현은 정상 조직에서는 부재하거나 아주 낮으나, 아교모세포종 샘플에서는 강하게 증가된다(GB1006T 내지 GB1011T; NCH359T 및 NCH361T).
도 3은 유전자 BIRC.5의 상대적 mRNA 발현 프로필을 보여준다. 이 유전자의 발현은 정상 조직에서는 부재하거나 아주 낮고 종양 샘플에서는 강하게 증가된다.
도 4a 및 4b는 백신을 맞은 환자의 다른 시간 지점으로부터 말초 혈액 단핵세포(PBMC)에서 PSMA 및 서바이빈-특이적 IFNγ-분비 CD4+ T 세포의 존재를 보여주며, 이는 IFNγ-ELISPOT를 사용하여 측정되었다. 시간 지점: 백신 전 (a) 3번째 백신 후 (b), 6번째 백신 후 (c), 7번째 백신 후(d), 8번째 백신 후(e), 9번째 백신 후(f), 10번째 백신 후(g), 11번째 백신 후(h).
도 5는 백신을 맞은 환자의 세 개의 상이한 시간 지점으로부터 PBMC에서 서바이빈-특이적 IFNγ-, IL-5, IL-10, TNFα-분비 CD4+ T 세포의 존재를 보여주며, 이는 ICS-분석을 통하여 측정되었다. 시간 지점: 1번째 백신 후 (a), 3번째 백신 후(b), 7번째 백신 후(c).
도 6은 환자 8 및 10에서의 생화학적 반응을 보여주며, 이는 기준선 PSA로부터 10%이상 증가되지 않는 PSA 안정성을 보여준다.
도 7은 환자 11 및 16에서의 생화학적 반응을 보여주며, 이는 PSA 안정성 없이 PSA DT 증가를 보여준다.
도 8은 환자 5에서의 생화학적 반응을 보여주며, 이는 PSA 안정성 없이 PSA DT 증가를 보여준다.
도 9는 환자 1, 4, 10, 12 및 13에서의 생화학적 반응을 보여주며, 이는 백신 중 PSA DT의 변화가 없음을 보여준다.
도 10은 환자 2, 6, 9, 14 및 19에서의 생화학적 반응을 보여주며, 이는 백신 중 PSA DT 변화가 없음을 보여준다.
도 11은 환자 7, 15 및 17에서의 생화학적 반응을 보여주며, 이는 DT 감소를 수반하는 중간 PSA 감소 또는 DT 증가를 보여준다.
도 12는 전립선암 백신 연구로부터, BIR-009-펩티드-특이적 CD4+ T 세포 클론이 BIR-002에 반응하여 IFN-감마 생성에 대해 작용하는 여러 개의 백신을 맞은 암 환자들에서 확립될 수 있다는 것을 보여준다. 왕 등(2008)은 단지 몇번의 시험관내 프라이밍 및 자극 후에 건강한 공여자에게서 얻은 T 세포 클론을 기재하지만, 본 T 세포는 백신에 의해 환자에게서 유도될 수 있다. PMA/이오노마이신 = 항원-독립적 비특이적 활성화; 서바이빈 (II): BIR-002 자극; PSMA (II): 비관련 펩티드에 의해 자극. 모든 반응성 세포는 CD4 양성이다.
도 13은 BIR-002가 자연적으로 수지상 세포에 의해 제시된다는 것을 보여준다. 재조합 서바이빈 단백질과 함께 배양된 미성숙 수지상 세포는 백신을 맞은 환자로부터 BIR-002 특이적 T 세포에 의해 인식되며 이는 세포내 사이토카인 염색에 의해 보여진다. 이 결과는 BIR-002가 수지상 세포 내의 프로테이나아제에 의해 자연적으로 처리되며 BIR-002 에피토프는 처리에 의해 파괴되지 않음을 보여 준다. 또한, 이러한 CD4+ T 세포는 IFN-감마, TNF-알파와 IL-2와 같은 사이토카인을 분비하며 CD40 리간드(CD154)의 표면 발현을 가지고 있으며, CD107a의 표면 발현에 의해 표시되는 탈과립을 하는 등 다양한기능을 가지고 있다. T 세포가 비관련 단백질 RAP80, 또는 HIV-001펩티드와 함께 배양된 수지상 세포에 의해 활성화되지 않은 것으로 보아 표시된 T 세포 반응은 항원-특이적이다.
도 14는 BIR-002 백신을 맞은 전립선암 환자로부터 유래된 높은 분율의 BIR-002 특이적 CD4+ T 세포가 IFN-감마, TNF-알파, IL-2의 이로운 사이토카인을 발현시키지만, 면역조절 사이토카인 IL-10 및 IL-17은 그 정도로 발현시키지 않는다는 것을 보여준다. BIR-002에 대해 특이적인 T 세포 또는 클래스 II 제한된 펩티드인 두 개의 대조군의 세포내 사이토카인 염색으로부터의 초기 데이터 및 요약된 데이터가 보여진다.
도 15는 상이한 HLA-DR 대립유전자를 발현하는 몇몇의 종양 세포주가 환자-유래 PBMC에 의해서 인식되는 것을 보여준다(Pro26 및 Pro15의 환자에 대해서 보여짐). 따라서: 1. 환자는 BIR-002 백신 후 다 클론 T 세포 반응을 일으킨다; 2. BIR-002는 몇몇의 HLA 클래스 II 대립유전자로의 불규칙 결합을 보여준다: DR1(또 Wang et al 참고), DQ5(Wang et al에 의해 시험되지 않음), DR11(또한 Wang et al 참고) 또는 DRB3(Wang et al과 대조됨, 표 1); 3. BIR-002의 기능성 발현은 몇몇의 HLA 클래스 II 분자와 관련해서 가능하다(TNF-알파 생산). HLA 클래스 I(HLA-A, -B, C)에 대해, 원칙적으로 작용성 클래스 II 분자를 세포 표면에 발현하는, 세 개의 상이한 유전자좌, 즉 HLA-DQ, HLA-DP 및 HLA-DR이 HLA 클래스 II를 위해 발견될 수 있다. 클래스 I 분자는 중쇄(-A, -B, -C) 및 세 개의 모든 유전자에서 불변인 베타-2-미세글로불린으로 구성된다. 그럼에도 불구하고, 클래스 II 분자는 각각 두 개의 가변 쇄(알파 및 베타)로 이루어져 있다. 따라서, 클래스 II에 대한 유전자 형별 검사는 항상 더 복잡하다. 표에는, 혈청 유형이라 불리우는 것이 주어져 있고, 이는 항체 결합에 기반을 둔다. 따라서 예를 들어 "DQ3"는 상이한 HLA-DQ 알파 및 베타 쇄의 대립유전자를 포함하고, 이들은 대부분 함께 발견되고 특정 항체와 반응한다. 표에서의 세포는 다음과 같다:
Figure 112013110946559-pct00002

서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3은 서바이빈으로부터 유래된 본 발명의 종양 관련 펩티드의 서열을 보여 준다.
서열 식별 번호: 4 내지 서열 식별 번호: 13 및 서열 식별 번호: 24는 본 발명에서 사용된 다른 종양 관련 펩티드의 서열을 보여 준다.
서열 식별 번호: 14는 HBV의 펩티드 서열을 보여 준다.
서열 식별 번호: 15 내지 서열 식별 번호: 23은 본 발명에서 사용된 다른 종양 관련 펩티드의 서열을 보여 준다.
서열 식별 번호: 25 내지 서열 식별 번호: 27은 왕 등에 의해 사용된 관련된 펩티드의 서열을 보여 준다(WO 2007/036638).
서열 식별 번호: 28 내지 서열 식별 번호: 33은 피에쉬의 종양 관련 펩티드의 서열을 보여 준다.
서열 식별 번호: 34 내지 서열 식별 번호: 63은 실시예 3에 설계된 펩티드의 서열을 보여준다.
서열 식별 번호: 64 및 서열 식별 번호: 65는 실시예 4에서 사용된 펩티드의 서열을 보여 준다.
서열 식별 번호: 66 및 서열 식별 번호: 72는 실시예 5에서 사용된 펩티드의 서열을 보여준다.
본원에서 "펩티드"라는 용어는 전형적으로 인접 아미노산의 알파-아미노 및 카르보닐 기 사이에 펩티드 결합에 의해 서로 연결되는, 일련의 아미노산 잔기를 지정하는 데 사용된다. 펩티드는 일반적으로 길이가 9개의 아미노산이지만, 8개의 아미노산 길이 만큼 짧을 수도 있고, 16개의 아미노산 길이 만큼 길 수 도 있다.
본원에서 "올리고펩티드"라는 용어는 전형적으로 인접 아미노산의 알파-아미노 및 카르보닐 기 사이에 펩티드 결합에 의해 서로 연결되는, 일련의 아미노산 잔기를 지정하는 데 사용된다. 본 발명에서 올리고펩티드의 길이는 정확한 에피토프가 유지되는 이상 중요하지 않다. 올리고펩티드는 일반적으로 약 30개 미만의 아미노산 잔기 길이이고, 약 14개 초과의 아미노산 길이이다.
"폴리펩티드"라는 용어는 전형적으로 인접 아미노산의 알파-아미노 및 카르보닐 기 사이에 펩티드 결합으로 서로 연결되는, 일련의 아미노산 잔기를 지정하는 데 사용된다. 본 발명에서 폴리펩티드의 길이는 정확한 에피토프가 유지되는 이상 중요하지 않다. 펩티드 또는 올리고펩티드와 다르게, 폴리펩티드는 약 30개 초과의 아미노산 잔기를 함유하는 분자를 지칭하는 것으로 의미된다.
이런 분자를 암호화하는 펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 또는 폴리뉴클레오티드는 면역 반응을 유도할 수 있다면 "면역성" (따라서 본 발명에서는 "면역원") 이다. 본 발명의 경우, 면역성은 T 세포 반응을 유도하는 능력으로서 구체적으로 정의된다. 그러므로, "면역원"은 면역 반응을 유도할 수 있는 분자이고, 본 발명의 경우, T 세포 반응을 유도할 수 있는 분자이다.
T 세포 "에피토프"는 적당한 친화도로 MHC/펩티드 복합체에 결합하는 적합한 T 세포 수용체를 갖는 T 세포에 의해 인식될 수 있는 삼중 복합체(MHC 클래스 I 알파 쇄, 베타-2-미세글로불린 및 펩티드)를 형성하는, 클래스 I 또는 II MHC 수용체에 결합하는 짧은 펩티드를 필요로 한다. MHC 클래스 I 분자에 결합하는 펩티드는 일반적으로 8 내지 14개의 아미노산 길이이며, 가장 일반적으로 9개의 아미노산 길이이다. MHC 클래스 II 분자에 결합하는 T 세포 에피토프는 일반적으로 12 내지 30개의 아미노산 길이이다. MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드의 경우, 동일한 펩티드 및 상응하는 T 세포 에피토프는 공동의 코어 분절을 공유할 수 있지만, 각각 코어 서열의 아미노-말단의 상류와 카복시-말단의 하류의 상이한 길이의 인접 서열로 인하여 전체 길이는 다를 수 있다. MHC 클래스 II 수용체는 더 개방된 구조를 가지고 있으며, 그에 따라 MHC 클래스 II 수용체에 결합된 펩티드는 MHC 클래스 I 분자 펩티드-결합 홈(cleft)과는 달리 MHC 클래스 II 분자 펩티드-결합 홈에 완전히 묻히지 않는다. 놀랍게도, 이것은 서열 식별 번호: 1에 따른 펩티드에서는 해당되지 않는데, 이는 펩티드 길이의 작은 변화가 활성의 극단적인 감소를 이끌기 때문이다(아래 참조).
인간에는 MHC 클래스 I 분자를 암호화하는 세 개의 유전자 좌가 있다(인간의 MCH-분자는 또한 지정된 인간 백혈구 항원이다(HLA)): HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02, 및 HLA-A*11은 유전자 좌로부터 발현될 수 있는 상이한 MHC 클래스 I 대립유전자의 예이다.
상이한 모집단에서 발현된 대립유전자 상위 30
개인에서 대립유전자가 발현될 가능성(%)
발현된 대립유전자 상위 30
대립유전자 백인 대립유전자 아프리카계 미국인 대립유전자 라틴 아메리카계인 대립유전자 동양인
A*0201 45.6% C*0401 29.0% A*0201 37.1% A*1101 38.4%
C*0701 27.7% C*0701 25.4% C*0401 25.4% A*2402 33.7%
A*0101 27.4% C*0602 23.0% A*2402 24.9% C*0702 33.3%
A*0301 23.8% A*0201 22.3% C*0702 24.2% C*0102 27.7%
C*0702 21.5% A*2301 20.7% C*0701 20.8% A*3303 23.3%
C*0401 21.2% C*0202 19.0% C*0304 14.4% C*0801 21.6%
B*4402 20.2% A*0301 18.7% A*0301 14.3% C*0304 19.9%
B*0702 18.1% C*0702 18.1% B*0702 13.2% A*0201 18.1%
B*0801 18.1% B*5301 18.1% B*3501 12.8% B*4001 15.2%
C*0501 17.2% B*0702 15.8% C*0602 12.3% C*0401 14.0%
C*0304 16.8% C*1601 15.7% C*0501 11.9% B*5801 13.3%
C*0602 15.7% B*1503 13.9% A*0101 11.4% B*4601 12.7%
A*1101 15.3% B*5801 13.5% A*1101 11.0% B*5101 12.4%
B*4001 13.6% A*6802 12.7% B*5101 10.8% C*0302 12.0%
A*2402 12.1% C*1701 11.7% C*1601 10.6% B*3802 11.4%
B*3501 10.7% B*4501 10.8% B*4403 9.9% A*0207 11.0%
C*0303 10.6% B*4201 10.5% C*0102 9.7% B*1501 9.4%
B*5101 10.4% A*3001 10.4% A*2902 9.7% A*0206 9.3%
C*1203 9.9% B*3501 10.1% C*0802 9.3% C*0303 9.2%
B*1501 9.6% A*0101 10.0% B*1801 9.1% B*1502 9.1%
A*2902 8.9% C*0304 9.3% A*3101 8.9% A*0203 8.8%
A*2601 8.2% A*3002 9.2% B*5201 8.6% B*4403 8.6%
A*3201 8.2% B*0801 8.5% B*1402 8.6% C*1402 8.4%
C*0802 7.7% A*3402 8.4% C*0202 7.6% B*3501 7.2%
A*2501 7.5% A*7401 8.4% C*1203 7.6% C*0602 7.0%
B*5701 7.1% A*3303 8.0% A*2601 7.6% B*5401 6.9%
B*1402 6.7% C*1801 7.3% A*6801 7.1% B*1301 6.6%
C*0202 6.6% A*2902 7.2% B*0801 7.0% B*4002 6.3%
B*1801 6.4% B*4403 6.9% A*3002 6.8% B*5502 6.3%
B*4403 6.4% B*4901 6.9% B*4402 6.5% A*2601 6.0%
인간 게놈에는 MHC 클래스 II 유전자를 위한 세 가지 상이한 유전자 좌가 있다: HLA-DR, HLA-DQ, 및 HLA-DP. MHC 클래스 II 수용체는 알파 및 베타 쇄로 이루어진 이형이량체이고, 둘 다 막횡단 영역을 통해 세포 막에 고정된다. HLA-DRB1*04 및 HLA-DRB1*07은 이 유전자 좌에 암호화되는 것으로 알려진 상이한 MHC 클래스 II 베타 대립유전자의 두 가지 예이다. 클래스 II 대립유전자는 매우 다형적이고, 예를 들면 수백개의 상이한 HLA-DRB1 대립유전자가 알려졌다. 그러므로, 치료적이고 진단적인 목적을 위해서 적당한 친화도로 몇 개의 상이한 HLA 클래스 II 수용체에 결합하는 펩티드가 매우 바람직하다. 몇 개의 상이한 HLA 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드는 불규칙한 결합제로서 불리운다.
본원에서 사용되는 DNA 서열에 대한 참조는 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA를 포함한다. 그러므로, 특정한 서열은, 달리 나타내지 않는 한, 상기 서열의 단일 가닥 DNA, 그와 상보적인 서열을 갖는 이중쇄(이중 가닥 DNA) 및 상기 서열의 상보적 서열을 지칭한다. 용어 "암호화 영역"은 자연적인 게놈 환경에서 유전자의 발현 산물을 자연적으로 또는 정상적으로 암호화하는 유전자의 부분, 예를 들면, 유전자의 본래의 발현 산물을 위한 생체내 암호화 영역을 말한다.
암호화 영역은 정상, 돌연변이 또는 변형된 유전자, 또는 심지어 DNA 서열, 또는 DNA 합성의 기술자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 실험실에서 전체적으로 합성된 유전자로부터 기인할 수 있다.
"뉴클레오티드 서열"은 디옥시리보뉴클레오티드의 이종중합체를 말한다.
특정 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 자연적으로 발생하거나 합성적으로 구축될 수 도 있다. 일반적으로, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 암호화하는 DNA 분절은 cDNA 단편들 및 짧은 올리고 뉴클레오티드 링커, 또는 일련의 올리고뉴클레오티드로부터 조립되어 미생물 또는 바이러스 오페론으로부터 유래된 조절 요소를 포함하는 재조합 전사 단위에서 발현될 수 있는 합성 유전자를 제공한다.
용어 "발현 산물"은 유전자 및 유전적 암호 퇴화로 인해 생성된 등가물을 암호화하여 동일한 아미노산을 암호화하는 임의의 핵산 서열의 자연적 번역 산물인 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다.
암호화 서열을 지칭하는 경우, 용어 "단편(fragment)"은 완전한 암호화 영역보다 적은 부분의 DNA 부분을 의미하며, 이의 발현 산물은 완전한 암호화 영역의 발현 산물과 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 본질적으로 유지한다.
용어 "DNA 분절(segment)"은 별도의 단편 형태 또는 보다 큰 DNA 구성체의 성분으로서 DNA 중합체를 지칭하며, 이는 실질적으로 순수한 형태, 즉 내인성 물질의 오염이 없는 형태, 및 표준 생화학 방법에 의해, 예를 들면 클로닝 벡터를 사용함으로써 분절 및 이의 성분 뉴클레오티드 서열의 식별, 조작 및 회수를 가능하게 하는 양 및 농도로 1회 이상 단리된 DNA로부터 유래된다. 이러한 분절은 일반적으로 진핵 생물 유전자에 존재하는 인트론, 또는 내부 비번역된 서열에 의해 방해되지 않는 오픈리딩프레임의 형태로 제공되된다. 비번역된 DNA의 서열은 오픈리딩프레임의 하류에 존재할 수 있으며, 이는 암호화 영역의 조작 또는 발현을 방해하지 않는다.
용어 "프라이머"는 하나의 DNA 가닥과 짝을 이룰 수 있는 짧은 핵산 서열을 의미하고, DNA 폴리머라제가 디옥시리보뉴클레오티드 쇄의 합성을 시작하는 유리 3'-OH 말단을 제공한다.
용어 "프로모터"는 전사를 개시하기 위한 RNA 폴리머라제의 결합에 관련된 DNA의 영역을 의미한다.
용어 "오픈리딩프레임(ORF)"은 어떠한 종결 코돈 없이 아미노산을 암호화하는 일련의 삼중자 코드를 의미하며, 단백질로 (가능하게) 전사될 수 있는 서열이다.
용어 "단리"는 물질이 원래의 환경(예를 들면, 자연적으로 발생하는 경우에는 자연 환경)으로부터 제거됨을 의미한다. 예를 들면, 살아 있는 동물에서 존재하는 천연 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않지만, 자연계에서 공존하는 물질의 일부 또는 전체로부터 분리된 동일한 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나 그러한 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있으며, 여전히 벡터 또는 조성물이 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 단리될 수 있다.
본 발명에서 개시되는 폴리뉴클레오티드, 및 재조합 또는 면역성 폴리펩티드는 "정제" 형태일 수도 있다. 용어 "정제"는 절대적 순수를 필요로 하지 않는다; 오히려, 이는 상대적 정의로서 의도되고, 당해 분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이 상당히 정제된 제제 또는 단지 부분적으로만 정제된 제제를 포함할 수 있다. 예를 들면, cDNA 라이브러리로부터 단리된 개별 클론은 전기영동 동종성으로 통상적으로 정제된다. 개시 물질 또는 천연 물질의 적어도 한 차수, 바람직하게는 2 또는 3 차수, 보다 바람직하게는 4 또는 5 차수로의 정제가 특별히 고려된다. 또한, 바람직하게는 99.999중량%, 또는 적어도 99.99중량% 또는 99.9중량%; 및 보다 바람직하게는 99중량% 이상의 순도를 갖는 제시된 폴피펩티드가 특별히 고려된다.
본 발명에 개시된 핵산 및 폴리펩티드 발현 산물, 및 상기 핵산 및/또는 상기 폴리펩티드를 함유하는 발현 벡터는 "풍부한 형태"일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "풍부"는 물질의 농도가 물질의 천연 농도의 적어도 약 2, 5, 10, 100 또는 1000배 정도, 유리하게는 0.01중량%, 바람직하게는 적어도 약 0.1중량%인 것을 의미한다. 약 0.5중량%, 1중량%, 5중량%, 10중량% 및 20중량%의 풍부된 제제 또한 고려된다. 서열, 구성체, 벡터, 클론, 및 본 발명에 포함되는 다른 물질들은 유리하게는 풍부 또는 단리된 형태일 수 있다.
용어 "활성 단편"은 예를 들면 토끼, 또는 쥐 및 인간을 포함한 포유류 같은 동물에게 단독으로 또는 선택적으로 적당한 보조제와 함께 투여했을 때 면역 반응을 생성하는(예를 들면, 면역성 활동성을 갖는) 단편을 의미하며, 이러한 면역 반응은 인간과 같은 수용 동물 내에서 T 세포 반응을 자극하는 형태를 취한다. 다르게는, "활성 단편"은 또한 시험관내 T 세포 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는, "부분", "분절" 및 "단편"이라는 용어는, 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 서열이 보다 큰 서열의 하위 집합을 형성하는 아미노산 잔기와 같은 잔기의 연속적인 서열을 지칭한다. 예를 들면, 폴리펩티드가 트립신 또는 키모트립신 같은 임의의 일반적인 엔도펩티다제로 처리되는 경우, 상기 처리로 인해 생기는 올리고펩티드는 개시 폴리펩티드의 부분, 분절 또는 단편을 나타낸다. 이는 임의의 상기 단편이 이의 아미노산 서열의 일부로서 천연 서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3, 또는 이의 "모" 단백질, 즉 서바이빈에 상응하는 서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3의 서열과 정확히 동일하지 않더라도 실질적으로 동일한 분절, 단편 또는 부분을 필수적으로 함유할 것이라는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드와 관련해서 사용될 때, 상기 용어들은 임의의 일반적인 엔도뉴클레아제로 상기 폴리뉴클레오티드를 처리하여 생성된 생성물을 지칭한다.
본 발명에 따라, 서열을 지칭하는 경우 용어 "백분율 동일성" 또는 "백분율 동일"은 기재되거나 청구되는 서열("기준 서열")과 비교되는 서열("비교 서열")의 정렬 후 서열을 청구되거나 기재된 서열과 비교하는 것을 지칭한다. 백분율 동일성은 하기 수학식에 따라서 결정된다:
Figure 112010081795353-pct00003
상기 식에서, C는 기준 서열과 비교 서열 간의 정렬의 길이에 대한 기준 서열과 비교 서열 간의 차이 개수로서,
(i) 비교 서열에서 상응하는 정렬된 염기 또는 아미노산을 갖지 않은 기준 서열에서의 각각의 염기 또는 아미노산,
(ii) 기준 서열에서의 각각의 틈, 및
(iii) 비교 서열의 정렬된 염기 또는 아미노산과 상이한 기준 서열에서의 각각의 정렬된 염기 또는 아미노산이 차이를 구성하고,
R은 비교 서열과의 정렬의 길이에 대한 기준 서열에서의 염기 또는 아미노산의 개수이고, 기준 서열에 생긴 임의의 틈 또한 염기 또는 아미노산으로서 계산된다.
상기와 같이 계산된 백분율 동일성이 명시된 최소 백분율 동일성과 거의 같거나 더 큰 정렬이 비교 서열과 기준 서열 간에 존재하는 경우, 상기와 같이 계산된 백분율 동일성이 명시된 백분율 동일성보다 더 작은 정렬이 존재할 지라도, 비교 서열은 기준 서열에 대해 명시된 최소 백분율 동일성을 갖는다.
본원에서 개시된 본래의 펩티드는 달리 언급되지 않는 이상 다른, 아마도 선택적인, 펩티드 쇄 내의 부위에서 하나 이상의 잔기의 치환에 의해 변형될 수 있다. 상기 치환은 보존적 특징을 가질 수 있다(예를 들면, 소수성 아미노산이 다른 소수성 아미노산으로 대체되는 것과 같아 하나의 아미노산이 유사한 구조 및 특징을 갖는 아미노산으로 대체되는 경우). 보다 더 보존적인 것은 동일하거나 유사한 크기 및 화학적 특징을 갖는 아미노산의 대체이다(예를 들면, 류신이 이소류신으로 대체됨). 천연 동종 단백질의 종족에서의 서열 변화의 연구에서, 특정 아미노산 치환은 다른 것들보다 더 자주 용납되고 있으며, 이들은 본래의 아미노산과 이들의 대체물 사이에서 크기, 전하, 극성, 및 소수성이 비슷한 상관관계를 보이며, 이것은 "보존적 대체"를 정의하는데 기본이 된다.
본원에서 보존적 치환은 아래의 다섯 개 군 중 하나의 교환으로 정의된다: 제1군 - 작은 지방족, 무극성 또는 약한 극성의 잔기(Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); 제2군 - 극성의 음성 전하 잔기와 이들의 아미드(Asp, Asn, Glu, Gln); 제3군 - 극성의 양성 전하 잔기(His, Arg, Lys); 제4군 - 큰 지방족 무극성 잔기(Met, Leu, Ile, Val, Cys); 및 제5군 - 큰 방향족 잔기(Phe, Tyr, Trp).
덜 보존적인 치환은 알라닌을 이소류신 잔기로 대체하는 것처럼, 하나의 아미노산을 비슷한 성질을 갖지만 크기가 어느 정도 상이한 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함한다. 고도로 비보존적인 대체는 산성 아미노산을 극성의, 또는 심지어는 성질이 염기성인 아미노산으로 치환하는 것을 포함할 수도 있다. 그러나, 이러한 "라디칼" 치환은, 화학적 효과가 완전히 예측 불가능하고 라디칼 치환이 단순한 화학 원리로부터 예측 가능하지 않은 뜻밖의 효과가 있을 수 있기 때문에 잠재적으로 비효과적인 것으로서 배제할 수 없다.
물론, 상기 치환은 일반적인 L-아미노산 이외의 다른 구조를 포함할 수 있다. 그러므로, D-아미노산은 본 발명의 항원 펩티드에서 흔히 발견되고 여전히 본원의 개시물에 의해 포함되는 L-아미노산을 대신하여 치환될 수 있다. 또한, 비-표준 R 기(즉, 천연 단백질의 일반적인 20개의 아미노산에서 발견되는 것 이외의 R 기)를 갖는 아미노산은 또한 본 발명에 따른 면역원 및 면역성 폴리펩티드를 생성하기 위한 치환 목적에 사용될 수 있다.
하나 이상의 위치에서의 치환이 하기에 정의된 것과 실질적으로 동등하거나 더 큰 항원 활성을 갖는 펩티드를 생성하는 것으로 발견되는 경우, 이러한 치환들의 조합은 조합된 치환이 펩티드의 항원성에 추가 또는 상승 효과를 일으키는 지를 결정하기 위해 시험된다. 펩티드 내에 최대 4개 이하의 위치가 동시에 치환된다.
용어 "T 세포 반응"은 시험관내 또는 생체내에서 펩티드에 의해 유도되는 효과기 기능의 활성화 및 특이적 증식을 의미한다. MHC 클래스 I 제한된 CTL 에서, 효과기 기능은 펩티드-펄스, 펩티드-전구체 펄스 또는 천연 펩티드 제시 표적 세포의 용해, 사이토카인, 바람직하게는 인터페론-감마, TNF-알파, 또는 펩티드에 의해 유도된 IL-2의 분배, 효과기 분자, 바람직하게는 그랜자임 또는 펩티드에 의해 유도된 퍼로핀의 분비 또는 탈과립일 수 있다. MHC 클래스 II-제한된 보조 T 세포에서, 효과기 기능은 사이토카인, 바람직하게는 IFN-감마, TNF-알파, IL-4, IL5, IL-10 또는 IL-2의 펩티드 유도된 분비, 또는 펩티드-유도되는 탈과립일 수 있다. CTL과 보조 T 세포에 대해 가능한 효과기 기능은 이 목록에 국한되지 않는다.
바람직하게는, 임의의 서열 식별 번호: 1 내지 3으로부터 유래된 펩티드에 대해 특이적인 CTL이 치환된 펩티드에 대해 시험되는 경우, 치환된 펩티드가 배경에 비해 최대 용해 증가의 절반을 달성할 때의 펩티드 농도는 약 1 mM 이하, 바람직하게는 약 1 μM 이하, 더 바람직하게는 약 1 nM 이하, 여전히 더 바람직하게는 약 100 pM 이하, 및 가장 바람직하게는 약 10 pM 이하이다. 치환된 펩티드가 하나 이상, 둘 이상, 바람직하게는 셋 이상의 개체로부터의 CTL에 의해 인식되는 것이 바람직하다.
그러므로, 본 발명의 에피토프는 천연 종양-관련 또는 종양-특이적 에피토프와 동일할 수 있거나, 또는 실질적으로 동일한 항원 활성을 갖는 한 기준 펩티트와 4개 이하의 잔기 만큼 상이한 에피토프를 포함할 수 있다.
면역 반응의 자극은 숙주 면역계에 의해 외래종으로서 인식되는 항원의 존재에 따라 달라진다. 종양 관련 항원의 존재의 발견은 종양 세포의 표면에 나타나는 표적 항원에 특이적인 면역 반응을 촉진하는 숙주의 면역계를 사용할 가능성을 상승시키고, 이러한 작용의 매커니즘을 통해 종양 성장의 퇴화, 정체 또는 지연을 유도할 수 있다. 면역계의 체액성 및 세포의 부문 둘 다를 이용하는 다양한 매커니즘이 현재 암 면역 요법을 위해 조사되고 있다.
세포 면역 반응의 특이적 요소들은 종양 세포를 특이적으로 인식하고 파괴할 수 있다. 종양-침투 세포 모집단 또는 말초 혈액으로부터 세포독성 T 세포(CTL)를 단리하는 것은 상기 세포들이 암에 대한 자연적 면역 방어에서 중요한 역할을 한다는 것을 말해준다(Cheever et al., 1993; Zeh, III et al., 1999). 대장암을 앓고 있는 환자들의 415개의 표본의 분석에 의하면, 갈론(Galon) 등은 종양 조직의 면역 세포의 유형, 밀도 및 위치가 널리 사용되는 종양의 TNM-단계화 보다 환자들의 생존을 위해 실제로 더 나은 예언자라는 것을 보여줬다(Galon et al., 2006).
MHC 클래스 I은 주로 내인성 단백질, DRIP 및 더 큰 펩티드의 단백질 가수분해 분열(cleavage)로 생성되는 펩티드를 나타낸다. MHC 클래스 II 분자는 주로 항원 제시 세포(professional antigen presenting cell: APC)에서 발견되며, 주로 엔도사이토시스 과정에서 APC에 의해 섭취되고 가공된, 외인성 또는 막횡단 단백질의 펩티드를 나타낸다(Cresswell, 1994). 펩티드와 MHC 클래스 I 분자의 복합체는 적당한 TCR(T 세포 수용체)을 가진 CD8-양성 세포독성 T-림프구에 의해 인식되고, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 복합체는 적당한 TCR을 가진 CD4-양성-보조-T 세포에 의해 인식된다. TCR, 펩티드 및 MHC가 화학량적인 양 1:1:1로 존재하는 것으로 잘 알려져 있다.
삭제
CD4-양성 보조 T 세포는 CD8-양성 세포독성 T 세포에 의한 효과적인 반응을 유도하고 지속하는데 중요한 역할을 한다(Wang and Livingstone, 2003; Sun and Bevan, 2003; Shedlock and Shen, 2003). 처음에는, 림프절에서의 CTL의 프라이밍과 확장이 CD4+ T 세포에 의해서 지지된다(Schoenberger et al., 1998). 따라서, 하나의 매커니즘은 원시 CD8+ 세포의 기능성 CD4+ T 세포 - APC 상호작용의 위치로의 안내일 수 있다(Castellino et al., 2006). 마지막으로, 기능성 CD8+ 기억 세포의 생성은 CD4+ T 세포 보조에 대부분의 경우 의존한다(Sun and Bevan, 2003; Janssen et al., 2003). 이러한 이유로, 종양 관련 항원(TAA)으로부터 유래된 CD4 양성 T 세포 에피토프의 식별은 항-종양 면역 반응을 일으키기 위한 약학 제품의 개발에 아주 중요하다(Kobayashi et al., 2002; Qin et al., 2003; Gnjatic et al., 2003). 종양 부위에서, 보조 T 세포는, CTL 친화적 사이토카인 주위 환경을 지원하고(Qin and Blankenstein, 2000; Mortara et al., 2006), 효과기 세포, 예를 들면 CTLS, NK 세포, 대식 세포, 과립구를 유인한다(Marzo et al., 2000; Hwang et al., 2007).
염증이 없는 경우, MHC 클래스 II 분자의 발현은 주로 면역계의 세포, 특히 전문 항원 제시 세포(APC), 예를 들면 단핵 세포, 단핵 세포-유래된 세포, 대식 세포, 수지상 세포로 제한된다. 암 환자에서, 종양의 세포는 놀랍게도 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 것으로 알려졌다(Dengjel et al., 2006).
예를 들면, 마우스와 같은 포유류 동물 모델에서 CTL 효과기 세포(즉, CD8-양성 T 림프구) 없이도 CD4-양성 T 세포가 인터페론-감마(IFNγ)의 분비에 의한 혈관신생의 저해를 통해 종양 징후를 억제하는데 충분하다는 것이 보여졌다(Qin and Blankenstein, 2000). 또한, 림포톡신 및 그랜자임 B를 통한 세포독성 CD4+ T 세포에 의한 직접적인 종양 세포의 살상이 제안되었다(Penna et al., 1992; Littaua et al., 1992).
또한, HLA 클래스 II 분자에 의해 나타나는 종양-관련 항원으로부터 펩티드를 인식하는 CD4-양성 T 세포가 항체(Ab) 반응 유도를 통해 종양 진행을 방해할 수 있다는 것이 밝혀졌다(Kennedy et al., 2003).
HLA 클래스 I 분자에 결합하는 종양-관련 펩티드와 달리, 종양 관련 항원(TAA)의 클래스 II 리간드의 소수만이 이제까지 설명되었다.
HLA 클래스 II 분자의 구성적 발현이 일반적으로 면역계의 세포로 제한되기 때문에(Mach et al., 1996), 클래스 II 펩티드를 원시 종양으로부터 직접적으로 단리하는 것은 가능하지 않다고 간주되었다. 그러나, 덴젤(Dengjel) 등은 최근에 MHC 클래스 II 에피토프의 개수를 종양으로부터 직접적으로 식별하는데 성공하였다(WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1; (Dengjel et al., 2006)).
종양 특이적 세포독성 T 림프구에 의해 인식되는 항원, 즉 이들의 에피토프은, 발현되는 효소, 수용체, 전사 인자 등과 같은 모든 단백질 클래스로부터 유래된 분자일 수 있고, 동일한 기원의 변형없는 세포들에 비해서, 각각의 종양의 세포에서 상향조절된다.
종양 관련 항원(TAA)의 현재 분류는 다음과 같은 주요 군을 포함한다(Novellino et al., 2005):
1. 암-고환 항원: 처음으로 T 세포에 의해 인식될 수 있는 식별된 TAA(van der Bruggen et al., 1991)가 이 클래스에 속하며, 이는 조직학적으로 상이한 인간 종양, 및 정상 조직 중, 오직 고환의 정모 세포/정원 세포, 때로는 태반에서의 그 멤버들의 발현으로 인하여 암-고환(CT) 항원이라고 최초에 불려졌다. 고환의 세포들이 클래스 I 또는 II HLA 분자를 발현하지 않기 때문에, 이 항원들은 정상 조직에서 T 세포에 의해 인식될 수 없으며, 따라서 면역학적으로 종양-특이적이라고 간주될 수 있다. CT 항원의 잘 알려진 예로는 MAGE 족 멤버들 또는 NY-ESO-1이 있다.
2. 분화 항원: 이 TAA는 종양과 종양이 생긴 정상 조직 사이에 공유된다; 대부분은 흑색종 및 정상 멜라닌세포에서 발견된다. 대부분의 멜라닌세포 계통-관련 단백질은 멜라닌의 생합성에 관련되어 있으며 그러므로 종양 특이적이진 않지만 암 면역 요법에 널리 사용된다. 예로는, 티로시나아제 및 흑색종을 위한 멜란-A/MART-1 또는 전립선암을 위한 PSA가 있고 이로 국한되지 않는다.
3. 과다발현된 TAA: 일반적으로 낮은 발현 수준이 있는 많은 정상 조직 뿐만 아니라 조직학적으로 상이한 유형의 종양에서 폭넓게 발현된 TAA를 암호화하는 유전자가 감지되었다. 정상 조직에 의해서 처리되고 잠재적으로 제시되는 많은 에피토프가 T 세포 인식의 한계치 수준보다 낮을 수 있지만, 종양 세포에서의 이들의 과다발현은 이전에 생성된 내성을 중단함으로써 항암 반응을 일으킬 수 있다. 이러한 부류의 TAA에 대한 유망한 예로는 Her-2/neu, 서바이빈, 텔로머라제 또는 WT1이 있다.
4. 종양 특이적 항원: 이러한 독특한 TAA는 정상 유전자의 돌연변이로부터 발생한다(예컨대, β - 카테닌, CDK4, 등). 이러한 분자 변화의 일부는 종양 형질전환 및/또는 진행과 관련된다. 종양 특이적 항원은 일반적으로 강한 면역 반응을 정상 조직에 대한 자가면역 반응에 대한 위험성 없이 유도할 수 있다. 반면에, 대부분의 경우 TAA는 이들이 식별되는 정확한 종양에만 적절하고, 일반적으로 많은 개개의 종양들 간에 공유되지 않는다.
5. 비정상 번역 후 변형으로부터 발생하는 TAA: 이러한 TAA는 특이적이지도 않고 종양에서 과다발현되지도 않는 단백질로부터 발생할 수 있지만 종양에서 주로 활성인 번역 후 과정에 의해 종양과 관련된다. 이 클래스의 예는 종양 특이적일 수도 아닐 수도 있는 분해 동안의 단백질 스플라이싱과 같은 사건 또는 MUC1을 위한 종양의 새로운 에피토프를 이끄는 변경된 당화 패턴으로부터 발생한다(Hanada et al., 2004; Vigneron et al., 2004).
6. 종양 바이러스 단백질: 이러한 TAA는 원종양 과정에서 중요한 역할을 할 수 있는 바이러스 단백질이며, 이들이 외래종이기 때문에(인간 태생이 아닌), T 세포 반응을 일으킬 수 있다. 이런 단백질의 예로는 인간 유두종 유형 16 바이러스 단백질, E6 및 E7이며, 이들은 자궁경부암에서 발현한다.
종양-특이적 또는 -관련된 항원과 같은 세포독성 T-림프구에 의해 인식되는 백질에 있어서, 치료에 사용되기 위해서, 특정한 전제 조건이 충족되어야 한다. 항원은 정상 건강한 조직에 의해서가 아니거나 또는 비교적 작은 양으로, 주로 종양 세포에 의해 발현되어야 한다. 더 바람직하게는, 각각의 항원이 종양 유형에서 뿐만 아니라 높은 농도(즉, 세포 당 각 펩티드의 카피 수)로 존재하는 것이 더 바람직하다. 종양-특이적 및 종양-관련 항원은 기능에 기인하여 정상 세포를 종양 세포로 형질전환(예를 들면 세포 주기 조절 또는 세포자멸사의 억제)하는데 직접적으로 관련된 단백질로부터 종종 유래된다. 또한, 형질전환을 직접적으로 일으키는 단백질의 하류 표적이 상향조절될 수 있고, 따라서 간접적으로 종양-관련될 수 있다. 이러한 간접적 종양-관련 항원은 백신 접근법의 표적이 될 수도 있다(Singh-Jasuja et al., 2004). 두 경우 모두, 에피토프는 항원의 아미노산 서열에 존재하는 것이 필수적이며, 종양 관련 항원으로부터 유래된 상기 펩티드("면역성 펩티드")가 생체내 또는 시험관내 T 세포-반응을 유도해야 하기 때문이다.
기본적으로, MHC 분자에 결합할 수 있는 임의의 펩티드는 T 세포 에피토프로서 작용할 수 있다. 생체내 또는 시험관내 T 세포 반응의 유도의 전제 조건은 상응하는 TCR을 갖는 T 세포의 존재 및 이러한 특정 에피토프에 대한 면역학적 내성의 부재이다.
따라서, TAA는 종양 백신의 개발을 위한 출발점이다. TAA의 식별 및 특성화의 방법은 환자 또는 건강한 대상으로부터 단리될 수 있는 CTL의 사용을 기반으로 하거나, 또는 다른 특이한 전사 프로파일 또는 종양과 정상 조직 사이의 특이한 펩티드 발현 패턴의 생성을 기반으로 한다(Lemmel et al., 2004; Weinschenk et al., 2002).
그러나, 종양 조직 또는 인간 종양 세포주에서 과다발현되거나 또는 상기 조직 또는 세포주에서 선택적으로 발현된 유전자의 식별은 면역 요법에서 이러한 유전자로부터 전사된 항원의 용도에 대한 정확한 정보를 제공하지 않는다. 이것은 상응하는 TCR을 갖는 T 세포가 존재해야 하고 이 특정 에피토프에 대한 면역학적 내성이 없거나 최소화되야 하므로 이러한 항원의 에피토프의 개별 소집단 만이 상기 용도에 적당하기 때문이다. 따라서, 기능성 T 세포가 발견될 수 있는 MHC 분자와 gkaRpl 존재하는 과다발현된 또는 선택적으로 발현된 단백질로부터의 펩티드 만을 선택하는 것이 중요하다. 상기 기능성 T 세포는 특이적 항원에 의해 자극되었을 때 클론적으로 확대되고 효과기 기능을 실행할 수 있는 T 세포("효과기 T 세포")로 정의된다.
보조 T 세포는 항-종양 면역에서 CTL의 효과기 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다. TH1 유형의 보조 T 세포 반응을 일으키는 보조 T 세포 에피토프는 CD8-양성 킬러 T 세포의 효과기 기능을 지지하고, 이는 세포 표면에 종양-관련 펩티드/MHC 복합체를 디스플레이하는 종양 세포에 대한 세포독성 기능을 포함한다. 이런 식으로, 종양-관련 보조 T 세포 펩티드 에피토프은, 단독으로 또는 다른 종양-관련 펩티드와 함께, 항-종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성물의 활성 약학 성분으로서 작용할 수 있다.
CD8 및 CD4에 의존하는 두 유형의 반응이 항-종양 효과에 같이 및 상승적으로 기여하기 때문에, CD8+ CTL(리간드: MHC 클래스 I 분자 + 펩티드 에피토프) 또는 CD4-양성 보조 T 세포(리간드: MHC 클래스 II 분자 + 펩티드 에피토프)에 의해 인식되는 종양-관련 항원의 식별 및 특성화는 종양 백신의 개발에 중요하다.
암 치료와 관련된 심각한 부작용과 비용을 감안할 때 더 나은 예후 및 진단 방법이 간절히 필요하다. 그러므로, 일반적으로 암, 특히 아교모세포종의 바이오마커를 나타내는 다른 인자들의 식별이 필요하다. 또한, 일반적으로 암, 특히 아교모세포종의 치료에 사용될 수 있는 인자의 식별이 필요하다.
또한, 국소적으로 진행된 종양 성장의 존재하에 동일계에서 남아있는 잔류 종양에 의해 보통 초래되는, 근치적 전립선 절제 수술 이후 생화학적 재발을 갖는 전립선암 환자를 위해 설립된 치료 디자인이 존재하지 않는다. 현재 사용 가능한 치료 접근 방법에 비하여 유사한 치료 효능과 함께 더 낮은 사망률을 부여하는 새로운 치료 접근 방법이 바람직하다.
본 발명은 아교모세포종, 전립선암 및 서바이빈을 과다발현하는 다른 종양의 치료에 유용한 펩티드를 제공한다. 이러한 펩티드는 질량분석에 의해서 제 1 기의 인간 아교모세포종 샘플(실시예 1 및 도 1 참조) 상의 HLA 분자에 의해 자연적으로 존재하거나, 서열 식별 번호: 1 및 2의 경우 SYFPEITHI 예측 알고리즘(Rammensee et al., 1995)에 따라 HLA-DR 대립유전자 HLA-DRB1*01, DRB1*03, DRB1*04, DRB1*11, 및 DRB1*15(첨부 파일 참조)에 대한 불규칙한 결합제인 것으로 예측된다고 부분적으로 직접적으로 보여졌다. 이 데이터와 이러한 빈번한 DRB1 대립유전자의 빈도에 기반하여(Mori et al., 1995; Chanock et al., 2004), A*02-양성 백인의 92%는 상기 펩티드(서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3)를 결합하는 하나 이상의 DRB1 대립유전자를 발현한다고 가정할 수 있다. 서열 식별 번호: 2는 서바이빈으로부터 기재된 클래스 I T 세포 에피토프를 포함하기 위해서 천연 서바이빈 서열로부터 2개의 N-말단 아미노산에 만큼 연장된, 서열 식별 번호: 1과 동일한 코어 서열을 함유한다(Schmitz et al., 2000). 서열 식별 번호: 3은 서열 식별 번호: 1과 동일한 서열을 함유하고, 이때 마지막 C-말단 아미노산은 아스파라긴(N)으로부터 아스파르트산(D)으로 변형된다.
서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3(서바이빈)이 유래된 공급원 유전자는 정상 조직과 비교하여(실시예 2 및 도 2 참조) 아교모세포종, 전립선 종양, 유방암, 식도암, 대장암, 투명세포 신장세포 선암, 폐암, CNS, 난소, 흑색종(Tamm et al. 1998) 췌장암, 편평 세포 선암, 백혈병 및 수모세포종에서 높게 과다발현되는 것으로 보여졌으며, 이는 높은 정도의 펩티드의 종양 관련성을 입증한다(즉, 이러한 펩티드는 정상 조직이 아닌 종양 조직에서는 강하게 나타났다).
HLA-결합된 펩티드는 면역계, 특히 T 림프구/T 세포에 의해서 인식될 수 있다. T 세포들은 인식되는 HLA/펩티드 복합체를 제시하는 세포(예를 들면, 서바이빈-유래(서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3)를 제시하는 아교모세포종 종양 세포)를 파괴할 수 있다. 서바이빈-유래된 펩티드에 의해서 활성화된 보조 T 세포는 종양 혈관신생을 억제할 수 있으며, 면역계의 효과기 세포를 유인할 수 있고, CTL 프라이밍, 증식, 및 지속된 CD8+ T 세포 반응을 촉진한다.
본 발명의 모든 펩티드는 T 세포 반응을 자극할 수 있는 것으로 보여졌다(실시예 3 및 도 3 참조). 그러므로, 펩티드는 종양 세포가 파괴될 수 있는 환자의 면역 반응을 생성하는데 유용하다. 환자의 면역 반응은 이상적으로 면역성을 강화할 수 있는 제제(즉, 보조제)와 병용하여 기재된 펩티드 또는 적당한 전구 물질(예를 들면, 신장된 펩티드, 단백질, 또는 이러한 펩티드를 암호화하는 핵산)의 환자로의 직접 투여에 의해 유도될 수 있다. 이러한 치료적 백신으로부터 기원하는 면역 반응은 본 발명의 표적 펩티드가 유사한 카피 개수로 정상 조직에 나타나지 않기 때문에, 종양 세포에 대해 매우 특이적인 것으로 예상될 수 있는 바, 환자의 정상 세포에 대한 바람직하지 않은 자기면역 반응의 위험이 방지된다.
약학 조성물은 유리 형태 또는 약학적으로 허용가능한 염 형태의 펩티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용가능한 염"은 펩티드가 제제의 산 또는 염기 염을 만듦으로써 변형되는 개시된 펩티드의 유도체를 지칭한다. 예를 들면, 산 염은 적당한 산과의 반응을 포함하여 유리 염기(전형적으로, 약물의 중성 형태는 중성 -NH2 기를 갖는다)로부터 제조된다. 산 염을 제조하기에 적당한 산은 예를 들면, 염산, 브롬화 수소산, 황산, 질산, 인산과 같은 무기산 뿐만 아니라 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 석신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 맨델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 같은 유기산을 포함한다. 반대로, 펩티드에 존재할 수 있는 산 잔기의 염기성 염의 제조는 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼슘, 트리메틸아민 같은 약학적으로 허용가능한 염기를 사용하여 제조된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 약학 조성물은 아세트산(아세테이트) 또는 염산(클로라이드)의 염으로서 펩티드를 포함한다.
암 치료에 유용한 것 외에도, 본 발명의 펩티드는 또한 진단으로도 유용하다. 펩티드가 아교모세포종으로부터 생성되고 이런 펩티드가 정상 조직에서는 나타나지 않는다는 것이 결정되었기 때문에, 이런 펩티드는 암의 존재의 진단에 사용될 수 있다.
청구되는 펩티드의 조직 생체 검사에서의 존재는 암의 진단시에 병리학자를 도울 수 있다. 항체, 질량 분석, 또는 당해 분야에 알려진 다른 방법을 통한 특정 펩티드의 검출은 조직이 악성 또는 염증이 있는지 또는 일반적으로 병들어 있는지 병리학자에게 말해줄 수 있다. 펩티드의 기의 존재는 병든 조직의 분류 또는 하위 분류를 가능하게 한다.
병든 조직 표본 상의 펩티드의 검출은, 특히 T 림프구가 알려져 있거나 또는 작용 매커니즘에 관여하는 것으로 예상되는 경우, 면역계를 포함한 치료의 이점에 대한 결정을 내릴 수 있게 한다. MHC 발현의 손실은 감염된 악성 세포가 면역 감시를 탈출하는 잘 설명되는 메커니즘이다. 그러므로, 펩티드의 존재는 이 매커니즘이 분석된 세포에 의해 악용되지 않는 것을 보여준다.
펩티드는 펩티드 또는 MHC 분자와 복합체를 형성하는 펩티드에 대한 T 세포 반응 또는 항체 반응 같은 펩티드에 대한 림프구 반응을 분석하는데 사용될 수 있다. 이런 림프구 반응은 추가 치료 단계에서 결정을 내릴 때 예후 마커로서 사용될 수 있다. 이런 반응은 또한 여러 방법으로, 예를 들면, 단백질, 핵산, 자가 물질, 림프구의 양자 이입의 백신에 의해 림프구 반응을 유도하는 것을 목표로 하는 면역 요법 접근의 대리 마커로서 사용될 수 있다. 유전자 치료 설정에서, 펩티드에 대한 림프구 반응은 부작용의 평가에서 고려할 수 있다. 림프구 반응의 모니터링은 이식 요법의 후속 검사(예를 들면, 이식편 대 숙주 및 숙주대 이식편 질병)를 위한 중요한 도구가 될 수도 있다.
펩티드는 MHC/펩티드 복합체에 대한 특이적 항체를 생성하고 개발하는데 사용될 수 있다. 이들은 병든 조직에 대한 치료, 독성 물질 표적 또는 방사선 물질을 위해 사용될 수 있다. 이런 항체의 또 다른 용도는 PET 같은 이미징 목적을 위해 병든 조직에 대한 방사성 핵종을 목표로 할 수 있다. 이러한 용도는 작은 전이를 감지하거나 병든 조직의 크기와 정확한 위치를 결정하는데 도움이 될 수 있다.
또한, 이들은 생체 검사의 샘플에 기반을 둔 병리학자의 암 진단을 확인하는데 사용될 수 있다.
표 3은 본 발명에 의한 펩티드, 이들 각각의 서열 식별 번호, 각 펩티드가 결합하는 HLA 대립유전자, 및 이런 펩티드들이 발생할 수 있는 공급원 단백질을 보여준다. 서열 식별 번호: 2에 따른 펩티드는 HLA-A*02 뿐만 아니라 HLA-DR에 결합하며 따라서 2개의 상이한 반응을 유도한다는 점은 특별히 흥미롭다.
본 발명의 펩티드
서열 식별 번호 펩티드 코드 서열 HLA 대립유전자 공급원
단백질
1 BIR-002 TLGEFLKLDRERAKN HLA-DR 서바이빈
2 BIR-004 ELTLGEFLKLDRERAKN HLA-DR 및
HLA-A*02		 서바이빈
3 BIR-002a TLGEFLKLDRERAKD HLA-DR 서바이빈
세포자멸사 단백질(IAP) 억제제 종족의 일원인, BIRC5(서바이빈)의 발현은 성인 정상 분화된 조직에서 크게 감소된 발현으로, 특히 이들의 증식 지수가 낮을 때 태아 조직 및 다양한 인간 암에서 상승한다. 서바이빈은 세포 증식과 세포자멸 세포사 둘 다를 조절할 수 있는 것으로 보인다. 비록 서바이빈은 세포 세포질 영역에 일반적으로 위치하고 암의 나쁜 예후와 관련되지만, 유리한 예후의 지표인 핵 국소화 또한 보고되었다(O'Driscoll et al., 2003). 서바이빈의 조절 및 서바이빈을 통한 조절은 여러 메커니즘으로 설명되었다. 서바이빈은 분자 샤프론 Hsp60과 관련되는 것으로 보인다. 생체내, Hsp60은 일치하는 정상 조직에 비해서 제 1 기 인간 종양에서 풍부하게 발현된다. 작은 간섭 RNA에 의한 Hsp60의 급성 제거는 서바이빈의 미토콘드리아 집단을 불안정하게 하고, 미토콘드리아 기능 상실을 유도하며, 카스파제-의존 세포자멸사를 활성화시킨다(Ghosh et al., 2008). 또한, Ras 억제는 세포자멸사에 대한 서바이빈 "브레이크"의 방출 및 미토콘드리아 세포사멸 통로의 활성화를 일으킨다. 특히 아교모세포종에서, 세포자멸사에 대한 저항은 서바이빈을 표적으로 하는 Ras 억제제에 의해 없어질 수 있다(Blum et al., 2006). 또한, 신경 교종에서의 NF-kappaB 과다 활성과 NF-kappaB 목표 유전자의 하나인 서바이빈의 과다 발현 간에 상관 관계가 있는 것으로 보인다. 그러므로, NF-kappaB-활성화된 항-세포사멸 유전자는 종양 샘플에서 과다발현된다. 특히 아교모세포종에서, 아주 높은 수준의 서바이빈 발현이 감지될 수 있다(Angileri et al., 2008). 뇌 신경 교종에서 서바이빈 과다발현은 악성 증식, 항-세포자멸사 및 혈관신생에서 중요한 역할을 할 수도 있다고 암시된다(Zhen et al., 2005; Liu et al., 2006). 서바이빈 발현과 아교모세포종에서의 생존에 대한 그의 영향을 연구하는 여러 가지 분석이 수행되었다. 요약하면, 서바이빈 발현, 특히 성상 세포 종양에서 핵 및 세포질에서의 동시 발현은 서바이빈-음성 종양을 가진 환자들에 비해 악성 등급(아교모세포종에서 가장 높은 서바이빈 발현) 및 더 짧은 총 생존 시간과 상당히 관련되어 있었다(Kajiwara et al., 2003; Saito et al., 2007; Uematsu et al., 2005; Mellai et al., 2008; Grunda et al., 2006; Xie et al., 2006; Sasaki et al., 2002; Chakravarti et al., 2002).
또한, 서바이빈-과다발현은 다른 종양 실체에 대해서도 설명된다. 유방암에서, 서바이빈 발현은 더 높은 등급 및 더 짧은 질병없는 생존과 관련되어 있다(Yamashita et al., 2007; Al-Joudi et al., 2007; Span et al., 2004). 식도암 세포주에서, 서바이빈의 프로모터 활성은 정상 조직에서보다 28.5배 높은 것으로 보여졌다(Sato et al., 2006). 대장암에서, 서바이빈 발현은 또한 병리학적 등급 및 림프절 전이와 관련된다(Tan et al., 2005). 명백한 세포 신장 세포 선암의 공격성은 서바이빈 발현과 관련된 것으로 보여졌다. 또한, 서바이빈의 발현은 암-특이적 생존과 역으로 관련된다(Kosari et al., 2005). 서바이빈 발현은 정상 피부가 아닌 각질형성세포 종양 및 과다증식 피부 병변의 패널에서 감지될 수 있다(Bowen et al., 2004). 췌장암 세포주에서, 서바이빈은 시험된 세포주의 58%에서 증폭되었다(Mahlamaki et al., 2002). 편평 세포 선암에서, 서바이빈 발현은 더 공격적이고 침습적인 임상 표현형을 갖는 경우를 식별하는데 도움이 될 수 있다(Lo et al., 2001).
서바이빈이 암 치료에 촉망되는 표적이기 때문에, 서바이빈-유래된 펩티드를 사용함으로써 서바이빈이 CD8+ T 세포-매개 반응을 유도하여 종양 환자에서 면역성이라는 것을 보여주었다. 또한, 서바이빈은 동일한 환자로부터의 말초 혈액 림프구의 CD4+ T 세포 반응성을 특이적으로 자극한다(Casati et al., 2003; Piesche et al., 2007).
서바이빈(SVN, BIRC)은 암 실체의 다수에서 과다발현된다. 그러므로, 일반적으로, 서바이빈의 과다발현은 더 짧은 총 생존률 및 더 높은 악성 등급에 관련되는 것으로 생각된다.
피에쉬(Piesche)(2006)는 컴퓨터 프로그램 TEPITOPE를 사용하여 결정되는(Bian and Hammer, 2004) 서바이빈(SVN) 및 프로테이나아제-3(PR3)의 MHC 클래스 II 및 HLA 클래스 II-제한된 후보 에피토프를 그의 연구의 일부((Piesche et al., 2007) 또한 참조)로서 공개하였다. TEPITOPE 분석은 다양한 HLA-DR 대립유전자에 대한 높은 결합 가능성을 가진 SVN에 대한 6개의 후보 에피토프 및 PR3에 대한 11개의 후보 에피토프를 산출했다. 이러한 17개의 펩티드는 합성 및 크로마토그래피 정제 후 T 세포 면역학적 실험에 사용하였다. 다양한 길이의 펩티드가 하나의 펩티드와 함께 고려되는 중복 에피토프로부터 초래되었다(표 4).
피에쉬 2006에 의해 개시된 합성 SVN 펩티드의 이름, AA 위치 및 AA 서열
펩티드 위치 아미노산 서열 T 세포 빈번도
S10 10-24(서열 식별 번호: 28) WQPFLKDHRISTFKN 8.64*10-7
S22 22-36(서열 식별 번호: 29) FKNWPFLEGAAATPE 7.2*10-7
S40 40-54(서열 식별 번호: 30) EAGFIHAPTENEPDL 8.64*10-7
S58 58-72(서열 식별 번호: 31) FFCFKELEGWEPDDD 4.32*10-7
S88 88-103(서열 식별 번호: 32) LGEFLKLDRERAKNKI 1.73*10-7
S110 110-124(서열 식별 번호: 33) KNKIAKETNNKKKEF 8.64*10-7
(참고: S88은 실제로 S98이다, 따라서, 피에쉬 등은 이 에피토프의 위치를 결정하는데 오류를 만들었을 수도 있다)
상응하는 에피토프와의 적정 실험이 피에쉬에 의해 펩티드 HLA 친화도 또는 펩티드 HLA/TCR 결합력을 추정하기 위해서 수행되었다. 펩티드 농도가 낮을수록 MHC 분자에 대한 펩티드 에피토프의 결합 친화도는 높고, 이것은 단백질 항원의 세포내 처리로부터 "진성" T 세포 에피토프의 천연 제시를 위한 중요한 전제 조건이다. 펩티드-특이적 T 세포 클론의 측정된 절반-최대 증식 활성은 S10에서 < 50 nM이었고, S40에서 400 내지 700 nM이었고, S88에서 2000 내지 3000 nM이었고, P58에서 100 내지 300 nM이었다. 피에쉬는 재조합 SVN 단백질에 의한 노출 동안 SVN 펩티드 S10 만이 특이적 T 세포 증식을 유도한다고 추가로 개시하였다. 이것은 상이한 공여자의 세 개의 S10-특이적 T 세포 클론에서 보여졌다. 피에쉬 등은 천연 항원으로부터 SVN 펩티드 에피토프의 처리 및 제시를 펩티드-특이적 T 세포 클론과 SVN 단백질-펄스 DC를 공동 배양함으로써 조사하였다. SVN 펩티드 S10 만이 재조합 SVN 단백질에 의한 노출 동안 특이적 T 세포 증식을 일으킬 수 있었다. 이것은 상이한 공여자의 세 개의 S10-특이적 T 세포 클론에서 보여졌다. 자연 항원에 대한 특이적 증식은 PR3-특이적 T 세포 클론에서 감지되지 않았다.
또한, 세포사멸 또는 괴사 종양 세포로부터의 종양 항원은 생체내 APC에 의해 흡수되었고, MHC II와 독립적으로 처리되었으며 CD4+ T 세포에 제시된다. 진성 S10 에피토프의 T 세포 인식을 위하여, 다양한 SVN-양성 종양 세포주의 종양 세포 용해물을 갖는 DC는 펄스되었다. S10 에피토프를 위해, 종양 세포주 Karpas-422, Jurkat, 및 HL-60의 용해물-펄스된 DC의 직접적인 시험관내 인식이 감지되었다. 이 것은 상이한 공여자들로부터의 세 개 이상의 S10-특이적 T 세포 클론에서 보여졌다.
에피토프 S10이 암 환자에게서 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 보여주기 위해서, 암 환자의 혈액 중 상응하는 CD4+ T 림프구의 존재를 확인해야 한다. 다양한 환자의 PBMC는 단리되고 S10 펩티드에 의해서 자극되었다. 이 목적으로, PBMC 샘플은 환자들에게서 치료 시작 전 및 세포독성 상태 치료 시작 후에 채취하였고, PBMC 단편에 함유된 단핵 세포 및 B 세포들은 항원-/펩티드-제시 세포들로서 사용되었다. 배양 1주일 후, 세포들은 [3H]-티미딘 혼입 분석을 사용해서 이들의 펩티드-특이적 증식에 대해서 분석되었다.
13명의 시험된 환자들 중에서, 3명이 감지가능한 시험관내 증식 반응을 나타냈다.
면역 요법에서 펩티드 에피토프의 잠재적인 용도는 본질적으로 펩티드-특이적 CD4+ T 림프구가 상응하는 항원에 대해 반응하는 여부에 따라 달라진다. "진성" 또는 "진짜" 에피토프의 형태로 자연적으로 처리되는 단백질 항원의 인식은 원칙적으로 여러 요인에 따라 영향을 받는다.
피에쉬는 단백질 인식이 SVN 에피토프 S10에서만 감지된다고 보여주었다. 다른 식별된 펩티드(SVN: S40, S88; PR3: P58, P216, P235, 및 P239)에서는, 감지되는 단백질 인식이 없었다. 피에쉬 등은, 엔도솜 단백질 분해 동안, 분해되지 않는 제시된 서열 모티프가 "잠적" 에피토프의 경우에서처럼 중요하다고 제시하였다. MHC 클래스 I-제한 에피토프와 반대로, MHC 클래스 II 분자는 다양한 길이(12 내지 28)의 펩티드를 취할할 수 있다; 그러므로, 펩티드 에피토프의 제한된 길이로의 단백질 분해 분열은 필요하지 않다.
놀랍게도, 본 발명에서 발명자들은 S88보다 짧지만 또한 중복되는 서바이빈으로부터 유래된 또 다른 에피토프, 서열 식별 번호: 1이 19명의 환자중 16명에서 생체 내 강한 면역 반응을 유도하는 것을 보여주었다(실시예 4 참조). HLA-DR 유전자 좌의 높은 다형성으로 인하여, 이것은 또한 면역 반응이 HLA 분자에 결합한 펩티드에 의해서만 재현되기 때문에 예상한 바와 같은 펩티드 서열 식별 번호: 1의 높은 불규칙한 결합의 증거이다.
서바이빈의 과다발현이 문헌에 기재된 암 실체의 중요성은 표 2에 의해 설명된다. 서바이빈의 과다발현이 통상 기재된 특징인 암 징후는 2007년에 415,000명 이상의 사망에 대한 원인이다(표 1 참조).
피에쉬 등(2006)은 중복되는 HLA-DR 대립유전자를 가진 4명의 공여자 중 3명에서 펩티드 S88에 대한 적당한 전구 물질의 시험관내 존재를 보여준다. 본원에서, 획득된 결과는 두 개의 상이한 HLA-DR 대립유전자(예를 들면, DR3 및 DR11, 또는 DR1 및 DR3, 또는 DR11 및 DR4)에 결합함으로써 설명될 수 있기 때문에, 주요 증거는 S88의 HLA-DR로의 불규칙한 결합을 추론하기에는 너무 작다. 또한, 전체 PBMC 배양물로부터 상당히 비특이적인 증식 어세이([3H]-티미딘 혼입)에 의해 얻어진 자극 지표는 상당히 낮으며 양성 대조군이 없고(예를 들면, 잘-특성화된, 강한 면역성 바이러스 펩티드의 혼합), 적당한 음성 대조군(관계없는 대조군 펩티드에 의한 증식 어세이 동안의 자극)이 없다. 전조 횟수에 대한 데이터는 두 번째 유형의 어세이에 의해서 확인되지 않았다.
특히, WO 2007/036638(Wang et al)은 아미노산 서열의 서바이빈 펩티드를 공개한다.
96-110(LTLGEFLKLDRERAK; 서열 식별 번호: 25);
99-113(GEFLKLDRERAKNKI; 서열 식별 번호: 26); 및
102-116(LKLDRERAKNKIAKE; 서열 식별 번호: 27).
"우수한" 친화도(IC50 < 1000 nM)를 갖는 MHC 클래스 II의 HLA-분자 결합 영역으로서, 영역 84 내지 113이 기재되었다. 그럼에도 불구하고, 왕(Wang) 등에서 시험된 펩티드는 상이한 HLA-분자에 대한 광범위한 결합 범위를 보이며, 그러한 결합은 펩티드가 이들의 서열에서 1 또는 2 개의 아미노산 만큼 이동되는 경우 대폭 달라진다.
서열 식별 번호: 3(TLGEFLKLDRERAKD; "BIR-002a" 펩티드)을 갖는 본 발명의 펩티드는 C-말단으로 상기 펩티드가 아스파라긴(N) 대신에 아미노산 아스파르트산(D)으로 종결되는 것을 제외하고, 서열 식별 번호: 1을 갖는 본 발명의 BIR-002 펩티드의 서열을 포함한다. 펩티드는 마지막 3개의 아미노산 NKI을 함유하는 피에쉬의 펩티드 S88와 중복된다. 위에서 언급되었듯이, S88 펩티드는 재조합 SVN 단백질과의 노출 동안 특이적 T 세포 증식 어세이에서는 비활성이었다. 반면, BIR-002a 펩티드는 강한 MHC-II-관련된 면역 반응을 보였다. 이론에 구속되지 않으면서, 아스파라기나제를 통한 아스파라긴의 아스파르트산으로의 효소적 전환은 생체내에서 일어나므로, C-말단 아미노산은 변형되는 것으로 가정된다(펩티드는 활성화되고/되거나 더욱 활성화된다). 피에쉬-펩티드 S88의 C-말단 아스파라긴이 두 개의 아미노산에 의해 차단되기 때문에, 상기 펩티드는 비활성이다(이 펩티드의 활성에서 단일 아미노산 변화의 중요성을 추가로 보여준다).
또한, C-말단 아스파라긴(예를 들면, 서열 식별 번호: 1)을 포함하는 다른 펩티드의 활성 및 면역 반응이 산 아미노산 특히 아스파르트산으로의 C-말단 전환으로부터 의존할 수 있음을 주목한다. 그러므로, 본 발명의 하나의 양태에서, 서열 식별 번호: 1에 따른 펩티드는 효소적 전환 후 서열 식별 번호: 3에 따른 활성 펩티드를 제공하는 서열 식별 번호: 3의 "전구약물"로서 간주될 수 있다. 본 발명이 또한 아미노 산, 특히 아스파라긴의 화학 전환, 및 물 한 분자의 손실에 의한 자발적 탈아미드화를 포함한다는 것을 이해해야 한다.
또한, 서열 식별 번호: 1에 따른 펩티드에 대한 활성을 보여주는 실시예는 서열 식별 번호: 3에 따른 변형된 펩티드에 대한 활성 또한 지지한다.
BIR-002 펩티드의 영역(영역 84 내지 113)에서 펩티드의 용해도는 매우 유사한 펩티드에 대해서 매우 상이할 수 있다는 것을 본 발명에서 추가로 발견하였다. 왕 등의 문헌에서, BIR-002 펩티드에 밀접한 영역 내의 펩티드는 실제적으로 불용성이었으며 결합 연구가 수행될 수 없다는 것을 주지해야 한다.
다음과 같이 용해도가 결정된다:
BIR-002(서열 식별 번호: 1): < 32.9 mg/mL(아세테이트)
BIR-002a(서열 식별 번호: 3)(C-말단에서 N 대신 D): < 23.5 mg/mL
BIR-014(왕(Wang)의 비교 펩티드, 서열 식별 번호: 25): < 99.5 mg/mL
본 발명의 또 다른 양태는 HLA-제한 항원과 복합체를 형성하는 인간 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합하는 항체(아래에서 "복합-특이적 항체"로 지정됨)와 관련된다. 본 발명의 또 다른 양태는 HLA-제한 항원과 복합체를 형성하는 인간 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 인간 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II를 발현하는 세포를 포함하는 유전적으로 조작된 비인간 포유류를, 상기 HLA-제한 항원과 복합체를 형성하는 가용성 형태의 MHC 클래스 I 또는 II 분자에 의해 면역화하는 단계, 상기 비인간 포유류의 항체 생성 세포로부터 mRNA 분자를 단리하는 단계; 상기 mRNA 분자에 의해 암호화 된 단백질 분자를 디스플레이하는 파지 디스플레이 라이브러리의 생산하는 단계; 및 상기 파지 디스플레이 라이브러리로부터 하나 이상의 파지를 단리하는 단계를 포함하며, 이때 상기 하나 이상의 파지는 상기 HLA-제한 항원과 복합체를 형성하는 인간 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 디스플레이한다. 상기 항체 및 단일 쇄 클래스 I 주요 조직적합성 복합체를 제조하는 각각의 방법 및 상기 항체의 다른 제조 도구는 WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, 및 문헌[Cohen CJ, Denkberg G, Lev A, Epel M, Reiter Y. Recombinant antibodies with MHC-restricted, peptide-specific, T-cell receptor-like specificity; new tools to study antigen presentation and TRC-peptide-MHC interactions. J Mol Recognit. 2003 Sep-Oct; 16(5):324-32.; Denkberg G, Lev A, Eisenbach L, Benhar I, Reiter Y. Selective targeting of melanoma and APCs using a recombinant antibody with TCR-like specificity directed toward a melanoma differentiation antigen. J Immunol. 2003년 9월 1일; 171(5):2197-207; 및 Cohen CJ, Sarig O, Yamano Y, Tomaru U, Jacobson S, Reiter Y. Direct phenotype analysis of human MHC class I antigen presentation: visualization, quantitation, and in situ detection of human viral epitopes using peptide-specific, MHC-restricted human recombinant antibodies. J Immunol. 2003 Apr 15;170(8):4349-61]에 개시되어 있으며, 이들은 본 발명의 목적을 위해 본원에서 그 전체가 참고로서 명확하게 인용된다.
바람직하게는, 20 나노몰 미만, 더 바람직하게는 10 나노몰 미만의 결합 친화도로 항체가 복합체에 결합하며, 이를 본 발명에서 "특이적"이라고 간주한다.
용어 "항체"는 본원에서 광범위한 의미로 사용되며, 다 클론 및 단일 클론 항체를 둘 다 포함한다. 손상되지 않은 면역글로불린 분자 외에도, 또한 용어 "항체"에 포함되어 있는 것은 본원에 기재된 목적하는 특성(예컨대, 상기 복합체-특이적 항체, 높아진 수준으로 암 마커 유전자를 발현하는 암 세포로의 독성 전달, 및/또는 서바이빈 같은 암 마커 폴리펩티드의 활성 억제) 중 어떠한 것을 나타내는 한, 면역글로불린 분자의 단편 또는 중합체 및 면역글로불린 분자의 인간화된 버젼이다.
가능할 때마다, 본 발명의 항체는 상업적 공급처로부터 구입할 수 있다. 본 발명의 항체는 잘 알려진 방법을 사용해서 생성될 수도 있다. 숙련가는 전장 암 마커 폴리펩티드 또는 그의 단편을 사용하여 본 발명의 항체를 생성할 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 항체를 생성하는데 사용되는 폴리펩티드는 천연 공급원으로부터 부분적 또는 완전히 정제될 수 있거나, 또는 재조합성 DNA 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 서바이빈 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA, 또는 이의 단편은, 원핵 세포(예를 들면, 박테리아) 또는 진핵 세포(예를 들면, 효모, 곤충, 또는 포유동물 세포)에서 발현될 수 있으며, 그 후 재조합성 단백질은 정제되고, 항체를 생성하는데 사용되는 암 마커 폴리펩티드를 특이적으로 결합하는 단일 클론 또는 다 클론 항체 제조를 위해 사용된다. 복합체-특이적 항체는 일반적으로 상기와 같이 생성될 것이다.
당해 분야의 숙련자는 단일 클론 또는 다 클론 항체의 둘 이상의 상이한 세트의 생성이 목적하는 용도(예를 들면, ELISA, 면역 조직 화학, 생체내 이미징, 면역 독성 치료)에 필요한 특이성 및 친화도를 갖는 항체를 획득할 가능성을 최대화한다는 것을 알고 있다. 항체는 이들의 원하는 활성에 대해 알려진 방법으로 항체가 사용될 목적에 따라 시험된다(예, ELISA, 면역 조직 화학, 면역 치료 등; 항체 생성 및 시험에 대한 더 자세한 사항은 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988]을 참고한다). 예를 들면, 항체는 ELISA 어세이, 웨스턴 블롯, 포말린-고정 암 샘플 또는 냉동 조직 절편의 면역 조직 화학 염색으로 시험될 수 있다. 이러한 시험관내 최초 특성화 후, 치료의 목적 또는 생체내 진단의 목적을 가진 항체는 알려진 임상 시험 방법에 따라 시험된다.
"단일 클론 항체"라는 용어는 본원에서 실질적으로 균질한 항체 모집단으로부터 수득된 항체를 말한다, 즉, 개별 항체를 포함하는 모집단은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일 클론 항체는 본원에서 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체에 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 나머지 쇄가 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체에 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체를 포함한다(미국 특허 4,816,567).
본 발명의 단일 클론 항체는 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 다른 적당한 숙주 동물은 전형적으로 면역제에 의해 면역화되어 면역제에 특이적으로 결합하는 항체를 생성할 수 있거나 생성하는 림프구를 유도한다. 다르게는, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.
단일 클론 항체는 미국 특허 4,816,567에서 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수도 있다. 본 발명의 단일 클론 항체를 암호화하는 DNA는 용이하게 단리될 수 있고 통상적인 방법(예, 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 사용하여 서열화된다.
시험관내 방법은 또한 일가 항체를 제조하는 데 적당하다. 당해 분야에서 잘 알려진 일상적인 기법을 사용하여 항체를 이의 단편, 특히 Fab 단편을 생산하도록 절편화시킬 수 있다. 예를 들면, 파파인을 사용하여 절편화가 이루어질 수 있다. 파파인 절편화의 예는 1994년 12월 22일에 공개된 WO 94/29348 및 미국 특허 4,342,566에 기재되어 있다. 항체의 파파인 절편화는 각각 하나의 항원 결합 부위 및 잔여 Fe 단편을 갖는, Fab 단편으로 불리는 두 개의 동일한 항원 결합 단편을 생산한다. 펩신 처리는 두 개의 항원 조합 부위를 갖고 여전히 항원을 교차 결합할 수 있는 단편을 만든다.
항체 단편이 다른 서열에 부착되거나 아니든 간에, 항체 단편은, 단편의 활성이 비변형된 항체 또는 항체 단편과 비교하여 상당히 변형되거나 손상되지 않는 한, 삽입, 삭제, 치환, 또는 특정한 영역 또는 특이적 아미노산 잔기의 다른 선택된 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 이황화 결합될 수 있는 아미노산의 제거/첨가, 생물 수명의 증가, 분비 특징의 변화 등의 추가적인 특성을 제공할 수 있다. 어떤 경우에도, 항체 단편은 결합성, 결합 도메인에서의 결합 조정 등의 생물활성 성질을 소유하고 있어야 한다. 항체의 기능적 또는 활성 영역은 단백질의 특이적 영역의 돌연변이 생성 후 발현 및 이 발현된 폴리펩티드의 시험에 의해 식별될 수 있다. 이러한 방법은 당해 분야의 숙련자에게 자명하며, 이는 항체 단편을 암호화하는 핵산의 부위-특이적 돌연변이 생성을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수도 있다. 인간화된 형태의 비-인간(예, 마우스) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이들의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab' 또는 다른 항체의 항원 결합 하위서열)이다. 인간화된 항체는 수용자의 상보성 결정 영역(complementary determining region(CDR))으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 수용력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 CDR의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 몇몇의 예에서는, 인간 면역글로불린의 Fv 골격(FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 인간화된 항체는 또한 수용자 항체 또는 수입된 CDR 또는 골격 서열의 어디에서도 발견될 수 없는 잔기를 포함하기도 한다. 보통, 인간화된 항체는 1개 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함하며, CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 인간화된 항체는 최적으로 또한 전형적으로 인간 면역글로불린의 것인 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 것이다.
당해 분야에서 비-인간 항체를 인간화하는 방법은 잘 알려져 있다. 보통, 인간화된 항체는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비-인간 공급원으로부터 이에 도입된다. 이 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기라고 지칭되며, 이는 대게 "수입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 본질적으로 설치류의 CDR 또는 CDR 서열을 상응하는 인간 항체 서열로 치환함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화된" 항체는 키메라 항체(미국 특허 4,816,567)이고, 이때 실질적으로 무손상이 적은 인간 가변 도메인은 비인간 종으로부터 상응하는 서열에 의해 치환된다. 실제로, 인간화된 항체는 보통 몇몇의 CDR 잔기 및 가능하게는 몇몇의 FR 잔기가 설치류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
면역화되었을 때, 내인성 면역글로불린 생성이 없는 전체 인간 항체의 레퍼토리를 생산할 수 있는 형질전환 동물(예, 마우스)이 사용될 수 있다. 예를 들면, 키메라 및 생식 계통(germ-line) 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역 유전자의 동형접합 삭제는 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 일으키는 것으로 기재되었다. 이러한 배선 돌연변이 마우스에서 인간 배선 면역글로불린 유전자 정렬의 전이는 항원이 존재할 때 인간 항체를 생성시킬 것이다. 인간 항체는 또한 복합체-특이적 항체에 대해 기재된 바와 같이, 파지 디스플레이 라이브러리에서 생산될 수 있다.
본 발명의 항체는 약학적으로 허용가능한 담체에서 바람직하게는 대상에게 투여된다. 보통, 적당한 양의 약학적으로 허용가능한 염이 제형에 사용되어 제형을 등장성으로 만든다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예로는, 염수, 링거액(Ringer's solution) 및 포도당액이 있다. 이 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8이며, 더 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 추가의 담체는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스와 같은 지속된 방출 제제를 포함하며, 이 매트릭스는 성형된 제품의 형태, 예컨대 필름, 리포좀 또는 미세입자와 같은 형태이다. 예를 들어, 투여 경로 및 투여되는 항체의 농도에 따라 어떤 담체가 더 바람직한지는 이 분야의 기술자에게는 명백할 것이다.
항체는 주사(예, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내), 또는 효과적인 형태로 혈액으로의 전달을 보장하는 주입과 같은 다른 방법에 의해 대상, 환자 또는 세포에 투여될 수 있다. 항체는 국소 뿐만이 아니라 전신의 치료 효과를 얻기 위해 종양 내 또는 종양주변 경로로도 투여될 수도 있다. 국소 또는 정맥내 주사가 바람직하다.
항체 투여에 효과적인 투여량 및 스케쥴은 경험적으로 결정될 수 있으며, 이러한 결정을 내리는 것은 이 분야의 기술 중의 하나다. 이 분야의 기술자는 투여되는 항체의 투여량이 예를 들어 이 항체를 받는 대상, 투여 방법, 사용되는 특정한 항체의 유형 및 투여되는 다른 약물에 따라 달라진다는 것을 이해할 것이다(Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al, eds. Raven Press, New York (1977) pp. 365-389). 단독으로 사용되는 전형적인 항체의 일일 투여량은 매일 1μg/kg 내지 100 mg/kg 이하까지 다를 수 있으며, 위에 언급된 요인을 고려할 때 이 보다 더 높을 수도 있다. 암의 치료를 위한 항체의 투여 후, 이 분야의 기술자들에게 알려진 방법으로 항체의 치료적 효능을 평가할 수 있다. 예를 들면, 치료를 받고 있는 대상의 암의 크기, 개수, 및/또는 분포가 표준 종양 이미징 기법을 이용하여 모니터될 수 있다. 항체의 투여가 없을 경우 일어날 수 있는 질병 과정과 비교하여 종양의 성장을 정지시키고, 종양을 수축시키고/시키거나 새로운 종양의 발생을 예방하는 치료의 목적으로 투여된 항체는 암 치료에 효과적인 항체이다.
항체는 생체내 진단 어세이에 사용될 수도 있다. 보통, 항체는 방사성핵종(예, 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32 P 또는 35 S)으로 표지되어 면역 섬광 조형술을 사용하여 종양의 위치가 결정될 수 있다. 하나의 실시양태에서는, 항체 또는 이들의 단편은 두 개 이상의 암 표적의 세포외 도메인에 결합하고 친화도 값(Kd)이 1x10μM 미만이다.
진단 용도로 사용되는 항체는 여러 가지 이미징 방법으로 감지되기에 적당한 프로브에 의해 표지될 수 있다. 프로브의 감지 방법은 형광, 광학, 공초점 및 전자 현미경, 자기 공명 단층 촬영 영상 및 분광기; 형광 투시법, 전산화 단층 촬영 및 양전자 방사 단층 촬영기를 포함하지만 이에 국한되지 않는 방법을 들 수 있다. 적당한 프로브는 플루오레세인, 로다민, 에오신 및 다른 형광체, 방사성 동위 원소, 금, 가돌리늄 및 다른 란탄계열 원소, 상자성 철, 플루오르-18 및 다른 양전자 방출 방사성핵종 등을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 또한, 프로브는 이중 또는 다기능적일 수 있고, 본원에서 나열된 하나 이상의 방법으로 감지될 수 있다. 이러한 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 상기 프로브에 의해 표지될 수 있다. 항체와 프로브의 부착은 이 분야에서 잘 알려진 것들 중 특히 프로브의 공유 결합, 프로브의 항체로의 혼입, 및 프로브의 결합을 위한 킬레이트 화합물의 공유 결합 등을 들 수 있다. 면역조직화학을 위해서, 질병 조직 샘플은 신선하거나 냉동되었거나 또는 파라핀에 파묻여 포르말린과 같은 방부제로 고정되어 있을 수 있다. 고정되었거나 파묻여 있는 절편은 표지된 1차 항체 및 2차 항체와 접촉되며 여기서 항체는 동일계에서 NCAN 단백질 발현을 감지하기 위해 사용된다.
따라서, 본 발명은 서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드, 또는 서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3과 85% 이상, 바람직하게는 95% 이상 상동성인 변이체, 또는 상기 펩티드와 교차-반응하는 T 세포를 유도하는 변이체를 제공한다.
신장 세포 선암의 치료에 바람직한 실시양태에서, 서열 식별 번호: 1 및/또는 서열 식별 번호: 2 및/또는 서열 식별 번호: 3의 펩티드는 서열 식별 번호: 4 내지 서열 식별 번호: 13 및 서열 식별 번호: 24를 갖는 펩티드 중 두 개 이상과 병용된다. 서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3의 펩티드는 별도로 또는 하나의 제형에서 다른 펩티드와 함께 투여될 수 있다.
Figure 112010081795353-pct00004
상기 제공된 펩티드 및 항원에 대한 자세한 설명은 WO 2007/028573에 개시되어 있다.
결장암의 치료에 바람직한 실시양태에서, 서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3의 펩티드는 서열 식별 번호: 15 내지 24, 4, 8, 11 또는 12를 갖는 펩티드 중 두 개 이상과 병용된다. 서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3의 펩티드는 별도로 또는 하나의 제형에서 다른 펩티드와 함께 투여될 수 있다.
Figure 112010081795353-pct00005
상기 제공된 펩티드 및 항원에 대한 자세한 기재는 EP07014796.2 및 US 60/953,161에 제공되어 있다.
본 발명의 펩티드는 인간 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다.
본 발명에서, "상동"이라는 용어는 두 개의 아미노산 서열, 즉, 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 동일성 정도를 일컫는다. 전술한 "상동"은 비교될 두 개의 서열에 대한 최적 상태에서 정렬된 두 개의 서열을 비교함으로써 결정된다. 본원에서 비교될 서열은 두 개의 서열의 최적 정렬에서 추가 또는 삭제(예를 들면, 틈 등)를 가질 수 있다. 이러한 서열 상동성은 예를 들면 ClustalW 알고리즘을 이용하여 정렬을 만들어 계산할 수 있다(Nucleic Acid Res., 22(22): 4673 4680 (1994). 일반적으로 사용이 가능한 서열 분석 소프트웨어, 더 구체적으로 벡터 NTI, GENETYX 또는 분석 기구 등은 공용 데이터베이스에 의해 제공된다.
당 분야의 전문가는 특이적 펩티드의 변이체에 의해 유도된 T 세포가 그 자체의 펩티드와 교차 반응할 수 있을지를 평가할 수 있을 것이다(Fong et al., 2001); (Zaremba et al., 1997; Colombetti et al., 2006; Appay et al., 2006).
주어진 아미노산의 "변이체"라는 것은 본 발명자들은 예를 들면, 하나 또는 두 개의 아미노산 잔기의 측쇄가 변형(예를 들면 이들을 또다른 천연 아미노산 잔기의 측쇄 또는 다른 측쇄로 대체)되어 그 펩티드가 여전히 서열 식별 번호: 1 내지 24의 주어진 아미노산의 서열로 이루어진 펩티드와 실질적으로 동일한 방식으로 HLA 분자에 결합할 수 있음을 의미한다. 예를 들면, 이것은 HLA-A*02 또는 -DR과 같은 적당한 MHC 분자의 결합 홈과 상호작용하고 그것에 결합하는 능력을 개선시키지 않더라도 적어도 유지하고, 이러한 방식으로 활성화된 CTL의 TCR에 결합할 수 있는 능력을 개선시키지 않더라도 적어도 유지하도록 펩티드를 변형할 수 있다. 이 CTL은 후속적으로 본 발명의 한 양태에서 정의된 바와 같은 동종 펩티드의 천연 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 상호 반응하고 그 세포들을 죽인다. 과학 문헌(Rammensee et al. 1997) 및 데이터베이스(Rammensee et al., 1999)으로부터 유추할 수 있듯이, HLA 결합 펩티드의 특정한 위치는 전형적으로 HLA 수용기의 결합 모티프에 맞는 코어 서열을 형성하는 고정 잔기이며, 이는 결합 홈을 이루고 있는 폴리펩티드 쇄의 극성, 전기 물리성, 소수성 및 공간적 특성에 의해 한정된다. 따라서, 당해 분야의 전문가는 알려진 고정 잔기를 유지함으로써 서열 식별 번호: 1 내지 24에 기재된 아미노산을 변형할 수 있고, 이러한 변이체들이 MHC 클래스 I 또는 II 분자와 결합할 수 있는 능력을 유지할 수 있는지를 결정할 수 있다. 본 발명의 변이체는 활성화된 CTL의 TCR에 결합할 수 있는 능력을 유지하고, 이는 후속적으로 본 발명의 양태에서 정의된 바와 같은 동종 펩티드의 천연 아미노 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 상호 반응하고 이들을 죽일 수 있다.
T 세포 수용체와 상호작용하는 데에 실질적으로 기여하지 않는 아미노산 잔기들은 혼입에 의해 T 세포의 반응성에 실질적으로 영향을 주지 않고 관련된 MHC와의 결합을 제거하지 않는 다른 아미노산과의 대체에 의해 변형될 수 있다. 따라서, 주어진 조건 외에도, 본 발명의 펩티드는 아미노산 서열 또는 이의 한 부분 또는 주어진 변이체를 포함하는 (본 발명자들에 의해 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한고 지칭됨) 임의의 펩티드가 될 수도 있다.
서열 식별 번호: 24에 따른 펩티드의 변이체 및 모티프
NCAN 위치 1 2 3 4 5 6 7 8 9
펩티드 코드 V L C G P P P A V
변이체 M L
I L
E K
I A G I I A E
L Y P K L Y
F F T Y T H
K P N
M M F
Y S V
V R
M L
MHC 클래스 II-제시 펩티드에 대해 더 알려진 사항은 이 펩티드들은 특정한 HLA-대립유전자 특이적 모티프에 맞는 아미노산 서열로 이루어진 "코어 서열" 및, 선택적으로, 코어 서열의 기능에 영향을 미치지 않는(즉, 펩티드와 천연 대응물을 인식하는 T 세포 클론 모두 또는 한 부분의 상호작용과 관련이 없는 것으로 간주됨) N-말단 및/또는 C-말단 연장부로 구성된다는 것이다. N-말단 및/또는 C-말단 연장부는 예를 들면, 각각 1개 내지 10개의 아미노산 길이일 수 있다. 이 펩티드는 MHC 클래스 II 분자를 로딩하기 위해 직접적으로 사용될 수 있거나, 이 서열은 하기 주어진 설명에 따라 벡터로 클로닝될 수 있다. 펩티드가 세포 내의 더 큰 펩티드의 처리 후의 최종 생성물을 구성하기 때문에 더 긴 펩티드가 사용될 수도 있다. 본 발명의 펩티드는 임의의 크기일 수도 있으나, 전형적으로 분자량이 100,000 미만이고, 바람직하게는 50,000 미만이며, 더 바람직하게는 10,000 미만이며, 전형적으로 약 5,000이다. 아미노산 잔기의 개수와 관련하여, 본 발명의 펩티드는 1,000개의 잔기보다 적은, 바람직하게는 500개의 잔기보다 적은, 더 바람직하게는 100개보다 더 적은, 더 바람직하게는 100개보다 적은 및 가장 바람직하게는 30개 내지 8개의 잔기를 가지고 있다. 따라서, 본 발명은 상기 펩티드 또는 변이체가 전체 8 내지 100의 길이, 바람직하게는 8 내지 30, 및 가장 바람직하게는 8 내지 16, 즉 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개의 아미노산을 가지고 있는 펩티드 및 변이체를 제공한다.
MHC 클래스 II 제한 펩티드에 대해서는, MHC 분자에서 동일한 코어 서열을 갖는 몇몇의 상이한 펩티드가 제시될 수 있다. 인식하는 T (보조) 세포와의 상호 작용이 9 내지 11개의 아미노산의 코어 서열에 의해 정의되기 때문에, 몇몇의 길이의 변이체는 동일한 T (보조) 세포 클론에 의해 인식될 수 있다. 따라서, 코어 결합 서열의 몇몇의 상이한 길이 변이체는 N- 또는 C-말단의 추가의 처리와 트리밍이 필요없이 MHC 클래스 II 분자의 직접 로딩에 사용될 수 있다. 대응적으로, 본 발명의 펩티드와 상응 반응하는 T 세포를 유도하는 천연 또는 인공 변이체는 종종 길이 변이체이다.
대략 12개 아미노산 잔기보다 더 긴 펩티드가 MHC 클래스 II 분자에 직접적으로 결합하는 데에 사용될 경우, 코어 HLA 결합 영역에 인접한 잔기들이 MHC 클래스 II 분자의 결합 홈에 특이적으로 결합하거나 펩티드를 T (-보조) 세포에 제시하는 능력에 실질적으로 영향을 주지 않는 잔기가 바람직하다. 그러나, 앞에서 지적된 바처럼, 더 큰 펩티드가 적당한 항원-제시 세포에 의해 단편화될 수 있기 때문에 예를 들어 플리뉴클레오티드에 의해 암호화 될 때 더 긴 펩티드가 사용될 수도 있다. 그러나, 동일한 경우에 코어 서열 인접 영역은 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드, 또는 동일한 코어 서열을 갖는 참조 펩티드와 비교시 두 가지 방향의 이량체성 MHC:펩티드 복합체와 TCR과의 상호 작용에 영향을 끼치는 것으로 보여진 바 있다. 펩티드 내의 분자내 3차 구조(예, 루프 형성)는 대부분 MHC 또는 TCR에 대한 친화도를 감소시킨다. 펩티드 결합 홈 외에도 MHC 또는 TCR의 부분과 인접 영역간의 분자간 상호작용은 상호작용을 안정화시킬 수 있다. 이러한 친화도의 변화는 MHC 클래스 II 펩티드가 T (보조) 세포 반응을 유도하는 잠재력에 극적인 영향을 끼칠 수 있다.
또한, 약 8 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 MHC 클래스 I 에피토프는 실제 에피토프를 포함한 더 긴 펩티드 또는 단백질로부터 처리되는 펩티드에 의해서 생성될 수도 있다. 실제 에피토프에 인접한 잔기는 처리 과정 중 실제 에피트프를 드러내는 데에 필요한 단백질 분해 절단에 실질적으로 영향을 끼치지 않는 잔기가 바람직하다.
따라서, 본 발명은 MHC 클래스 I 에피토프의 펩티드 및 변이체를 제공하며 여기서 펩티드 또는 변이체는 총 길이가 8 내지 100 사이이며, 바람직하게는 8 내지 30 사이이며, 가장 바람직하게는 8 내지 16 사이이며, 이는 즉 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개의 아미노산이다.
물론, 본 발명에 따른 펩티드 또는 변이체는 인간 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II의 분자에 결합하는 능력을 가지고 있다. 펩티드 또는 변이체와 MHC 복합체의 결합은 당해 분야에서 알려진 방법, 예를 들어 상이한 MHC 클래스 II 대립유전자에 대한 문헌에 기재되어 있는 방법에 의해서 시험될 수 있다(e.g. Vogt et al., 1994; Malcherek et al., 1994; Manici et al., 1999; Hammer et al., 1995; Tompkins et al., 1993; Boyton et al., 1998).
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 펩티드는 서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3에 따른 아미노산을 포함하거나 이를 본질적으로 포함하는 것이다.
본 발명에 따른 펩티드는 서열 식별 번호: 1 내지 3에 기재된 아미노산의 연속적인 신장으로 이루어지며, 이 때 신장은 코어 서열이 펩티드에 존재하는 한 8개 이상(예, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개)의 아미노산의 길이를 갖는 서열의 일부이며, 이는 본원에 기재된 면역 반응을 일으키는 기능을 준다.
"본질적으로 포함하는"이란 임의의 서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3에 따른 서열 외에도 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 변이체가 MHC 분자 에피토프에 대한 에피토프로서 기능하는 펩티드의 일부를 필수적으로 형성하지 않는 아미노산의 N- 및 또는 C-말단 스트레치(stretch)를 추가로 함유함을 의미한다.
그럼에도 불구하고, 이들 신장은 본 발명에 따른 펩티드의 세포 내로의 효율적인 도입을 제공하는데 중요할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 펩티드는 예를 들면 NCBI, GenBank Accession-number X00497(Strubin, M. et al 1984)로부터 유래된 HLA-DR 항원-결합 불변 쇄(p33, 하기에서는 "Ii")의 80개의 N-말단 아미노산을 포함하고 있는 융합 단백질이다.
더 바람직한 펩티드의 예는 특이적 HLA-서브유형을 갖는 펩티드를 포함하고, CD8 세포를 자극할 수 있으며, 이때 펩티드는 하기 표 6에 기재된 바와 같은 특이적 고정 아미노산-모티프를 포함한다.
서열 식별 번호: 24에 따른 바람직한 펩티드의 HLA-서브유형 및 고정 모티프
펩티드 HLA-서브유형 위치 1 2 3 4 5 6 7 8 9
24 A*02 펩티드 코드 V L C G P P P A V
고정 모티프 x L x x x x x x V
추가적으로, 펩티드 또는 변이체는 안정성 및/또는 MHC 분자에의 결합성을 더욱 개선시키도록 변형되어 더 강한 면역 반응을 일으킬 수 있다. 펩티드 서열의 최적화를 위한 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 역 펩티드 결합 또는 비-펩티드 결합을 도입하는 것이 있다.
역 펩티드 결합에서 아미노산 잔기는 펩티드(-CO-NH-) 연결로 결합되어 있지 않으나 펩티드 결합은 역으로 되어 있다. 이러한 역-인버스 펩티드모방형물질은 당해 분야에서 잘 알려진 방법으로 생성될 수 있으며, 이 방법의 예는 본원의 참조 문헌으로 들어 있는 문헌[Meziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237]에 기재되어 있는 방법을 들 수 있다. 이 방법은 측쇄의 배향이 아닌 백본을 포함하는 변형을 함유하는 유사펩티드를 제조하는 것을 포함한다. 메지에르(Meziere) 등(1997)은 MHC 결합 및 T 보조 세포 반응에서 이 유사펩티드가 유용하다는 것을 보여준다. CO-NH 대신에 NH-CO 결합을 포함하고 있는 역-인버스 펩티드는 단백질 분해에 대한 저항력이 훨씬 높다.
비-펩티드 결합의 예는 -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-, 및 -CH2SO- 등 이다. 미국 특허 4,897,445는 표준 과정을 거쳐 합성된 폴리펩티드 및 아미노 알데히드와 아미노산을 NaCNBH3 존재하에 반응시켜 합성된 비-펩티드 결합을 포함한 폴리펩티드 쇄 내의 비-펩티드 결합(-CH2-NH)의 고체상 합성 방법을 제공한다.
상기 기재된 서열을 포함하는 펩티드는 안정성, 생물학적 이용 가능성, 및/또는 펩티드의 친화도를 증가시키기 위해 아미노 및/또는 카르복시 말단에 존재하는 추가의 화학 기와 합성될 수도 있다. 예를 들면, 카르보벤족실, 단실, 또는 t- 부톡실카르보닐 기 등의 소수성 기가 펩티드의 아미노 말단에 추가될 수 있다. 비슷하게, 아세틸 기 또는 9-플루오렌일메톡시-카르보닐- 기가 펩티드의 아미노 말단에 위치할 수도 있다. 또한, 소수성 기, t-부톡실카르보닐, 또는 아미도 기 또한 펩티드의 카르복시 말단에 추가될 수 있다.
또한, 본 발명의 펩티드는 이들의 입체 배치를 변화시키도록 합성될 수도 있다. 예를 들면, 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 D-이성질체는 보통의 L-이성질체 대신에 사용될 수도 있다. 더 나아가서, 본 발명의 펩티드의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 공지된 비천연 아미노산 잔기 중 하나에 의해 대체될 수도 있다. 이와 같은 변화는 안정성, 생물학적 이용 가능성, 및/또는 본 발명의 펩티드의 결합 작용을 증가시킬 수 있다.
유사하게, 본 발명의 펩티드 또는 변이체는 특이적 아미노산을 펩티드 합성 전 또는 후에 반응시킴으로써 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예는 당해 분야에 잘 알려져 있으며 예를 들어 본원의 참조 문헌에 포함되어 있는 문헌[R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005]에 잘 기재되어 있다. 아미노산의 화학 변형은 아실화, 아미딘화, 리신의 피리독실화, 환원성 알킬화 반응, 아미노 기의 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산(TNBS)에 의한 트리니트로벤질화, 카르복실 기의 아미드 변형 및 퍼폼산 산화에 의한 시스테인의 시스트산으로의 설피드릴 변형, 수은 유도체 생성, 다른 티올 화합물과의 혼합된 디설피드 생성, 말레이미드와의 반응, 요드아세트산 또는 요드아세트아미드에 의한 카르복시메틸화 및 사이안산 염의 알칼리성 pH에서의 카바모일화를 포함하지만 이에 국한되지 않은 변형을 말한다. 이에 관해서, 더 광대한 단백질의 화학 변형에 대한 방법론에 대해서는 전문가는 문헌[Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000)의 15장]을 참조하길 바란다.
간단하게, 예를 들어 단백질 내의 알지닐 잔기의 변형은 종종 부가 생성물의 생성을 위해 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온 및 1,2-사이클로헥산디온과 같은 인접 디카르보닐 화합물의 반응을 기반으로 한다. 시스테인은 리신 및 히스티딘과 같은 다른 친핵성 부위의 수반되는 변형없이 변형될 수 있다. 결과적으로, 많은 시약이 시스테인의 변형에 사용될 수 있다. 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)와 같은 회사의 웹사이트(http://www.sigma-aldrich.com)가 특정한 시약에 대한 정보를 제공한다.
단백질 내의 디설피드 결합의 선택적 환원 또한 일반적이다. 디설피드 결합은 생물 의약품의 열처리 중에 형성되고 산화될 수 있다.
특정 글루탐산 잔기의 변형을 위해 우드와드(Woodward)의 시약 K가 사용될 수 있다. N-(3-(디메틸아미노)프로필)-N'-에틸카보디이미드는 또한 리신 잔기와 글루탐산 잔기 사이의 분자내 결합을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들면, 디에틸피로카르보네이트는 단백질 내의 히스티딜 잔기의 변형을 위한 시약이다. 히스티딘은 4-하이드록시-2-노네날을 사용함으로서 또한 변형될 수 있다.
예를 들면 리신 잔기 및 다른 α-아미노 기의 반응은, 예를 들면 펩티드의 표면으로의 결합 또는 단백질/펩티드의 교차 결합에 유용하다. 리신은 폴리(에틸린)글리콜 결합의 부착 부위 및 단백질 당화 변형의 주요 부위이다. 단백질 내의 메티오닌 잔기는 예를 들어 요드아세트아미드, 브로모에틸아민 및 클로라민 T에 의해 변형될 수 있다. 테트라아니트로메탄 및 N-아세틸이미다졸은 티로실 잔기의 변형에 사용될 수 있다. 디티로신 형성을 거친 교차 결합은 과산화수소/구리 이온에 의해 이루어질 수 있다.
트립토판의 변형에 대한 최근 연구에서는 N-브로모석신이미드, 2-하이드록시-5-니트로벤질 브로마이드 또는 3-브로모-3-메틸-2-(2-니트로페닐메르캅토)-3H-인돌(BPNS-스카톨)이 사용되었다.
PEG를 이용한 치료 단백질 및 펩티드의 성공적인 변형은 순환 반감기의 연장부와 종종 관련되지만 글루타르알데히드, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트 및 포름알데히드는 히드로겔 제조에 사용된다. 면역 요법을 위한 알레르겐의 화학 변형은 종종 칼륨 시안산염에 의한 카바밀화에 의해 달성된다.
펩티드 또는 변이체(이때 펩티드는 변형되었거나 또는 비-펩티드 결합을 포함한다)는 본 발명의 바람직한 실시양태이다. 보통, 펩티드 및 변이체(적어도 아미노산 잔기 사이에 펩티드 연결을 포함하는 것들)는 루(Lu) 등(1981)에 의해 개시된 문헌 및 그 문헌의 참조 자료에서 기재된 바와 같이 고체상 펩티드 합성의 Fmoc-폴리아미드 모드에 의해 합성될 수 있다. 일시적인 N-아미노 기 보호는 9-플루오렌일메틸옥시카르보닐(Fmoc) 기에 의해 제공된다. 이렇게 염기 불안정한 보호 기의 반복적인 절단은 N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘을 이용하여 이루어진다. 측쇄 작용기는 부틸 에테르(세린 트레오닌 및 티로신의 경우), 부틸 에스터(글루탐산 및 아스파르트산의 경우), 부틸옥시카르보닐 유도체(리신 및 히스티딘의 경우), 트리틸 유도체(시스테인의 경우) 및 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐 유도체(아르기닌의 경우)에 의해 보호될 수 있다. 글루타민 또는 아스파라긴이 C-말단의 잔기인 경우, 4,4'-다이메톡시벤즈히드릴 기가 사용되어 측쇄 아미도 작용기를 보호한다. 고체상 지지는 다이메틸아크릴아미드(백본-단량체), 비스아크릴로일에틸렌 디아민(교차 연결) 및 아크릴로일사르코신 메틸 에스테르(작용제)의 3개의 단량체로 만들어진 폴리디메틸-아크릴아미드 중합체에 기반을 둔다. 사용되는 펩티드 대 수지 절단가능 연결제는 산-불안정 4-하이드록시메틸-페녹시아세트산 유도체이다. 모든 아미노산 유도체는 역 N,N-디사이클로헥실-카르보디이미드/1-하이드록시벤조트리아졸 매개된 커플링 절차를 사용하여 첨가되는, 아스파라긴 및 글루타민을 제외하고 이들의 미리 생성된 대칭 무수물 유도체로서 추가된다. 모든 커플링및 탈보호 반응은 닌히드린, 트리니트로벤젠 설폰산 또는 이소틴 시험 과정에 의해 모니터된다. 합성 완성 시에, 펩티드는 50% 스캐빈져 혼합을 포함한 95% 트리플루오로아세트산에 의한 처리에 의해 측쇄 보호기 제거와 동시에 수지 지지체로부터 절단된다. 일반적으로 사용되는 스캐빈저는 에탄디티올, 페놀, 아니솔 및 물을 포함하고, 정확한 선택은 합성되는 펩티드의 구성 아미노산에 따라 결정된다. 펩티드의 합성에 있어서 고체상 및 용액상 방법의 조합 또한 가능하다(예를 들면, Bruckdorfer et al. 2004 와 그에 들어 있는 참조 문헌을 참고).
트리플루오로아세트산은 진공 상태에서 증발에 의해 제거되고, 연이어 디에틸 에테르에 의한 저작에 의해 조질 펩티드가 생성된다. 존재하는 임의의 스캐빈저는 수성상의 동결건조에 의해 스캐빈저가 없는 조질 펩티드를 제공하는 단순한 추출 절차에 의해 제거된다. 펩티드 합성의 시약은 예를 들면 칼바이오켐-노바바이켐 리미티드(Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, 영국 노팅엄 NG7 2QJ소재)로부터 입수된다.
정제는 재결정화, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 (보통) 예를 들면 아세토니트릴/물 구배 분리를 사용하는 역상 고 성능 액체 크로마토그래피 등과 같은 임의의 한 기법 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다.
펩티드의 분석은 박막 크로마토그래피, 전기영동, 특히 모세관 전기영동, 고체상 추출(CSPE), 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 산 가수 분해 후 아미노산 분석 및 고속원자충격(FAB) 질량 분광분석, 및 MALDI와 ESI-Q-TOF 질량 분광분석등에 의해 이루어진다.
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 변이체를 암호화하는 핵산(예를 들면 폴리뉴클레오티드)을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있으며, 단일 가닥 및/또는 이중 가닥일 수 있고, 또는 네이티브 또는 안정화된 형태의 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 포스포로티오에이트 백본을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드일 수도 있으며, 펩티드를 암호화하는 한 인트론을 포함할 수도 또는 그렇지 않을 수도 있다. 물론, 단지 천연 펩티드 결합에 의해 연결된 천연 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드 만이 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화될 수 있다. 본 발명의 추가의 양태는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 제공한다.
특히 폴리뉴클레오티드, DNA, 예를 들면 상보성 응집 말단을 통한 벡터에 연결하는 여러 가지의 방법이 개발되었다. 예를 들면, 상보성 단독중합체 트랙이 DNA 단편에 첨가되어 벡터 DNA로 삽입을 가능하게 한다. 벡터 및 DNA 단편은 그 후 상보성 단독중합체 꼬리들 사이의 수소 결합에 의하여 결합되어 재조합 DNA 분자를 형성한다.
하나 이상의 제한 부위를 포함하는 합성 연결기는 DNA 단편을 벡터에 연결하는 다른 방법을 제공한다. 여러 가지의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 합성 연결기는 인터네셔널 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA)를 비롯한 다수의 공급처로부터 시판된다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 변형하는 바람직한 방법은 (Saiki et al (1988))에 의해 발표된 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한다. 이 방법은 예를 들면 적당한 제한 부위를 만들어 적당한 벡터로 DNA를 도입하는데 사용할 수 있거나, 또는 당해 분야에서 알려져 있는 여러가지 유용한 방식으로 DNA를 변형하는 데 사용될 수도 있다. 만약 바이러스 벡터가 사용된다면, 수두 바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터가 바람직하다.
DNA(또는 레트로바이러스 벡터일 경우, RNA)는 그 후 적당한 숙주에서 발현되어 본 발명의 펩티드 또는 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 생성한다. 따라서, 본 발명의 펩티드 또는 변이체를 암호화하는 DNA는 본원에 함유된 교시에 대하여 적절하게 변형된 공지된 기법에 따라 사용되어 발현 벡터를 구축할 수 있고, 이는 적당한 숙주 세포를 형질전환하여 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 생성하기 위해 사용된다. 이러한 기법은 미국 특허 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075, 및4,810,648에 개시된 것들을 포함한다.
본 발명의 화합물을 구성하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA(또는 레트로바이러스 벡터일 경우, RNA)는 많은 종류의 다른 DNA 서열과 결합되어, 적당한 숙주로의 도입될 수 있다. 동반 DNA는 숙주의 특성, DNA를 숙주로 도입하는 방법, 및 에피소말 유지 또는 통합이 필요한 지에 따라 결정될 것이다.
보통, DNA는 발현을 위한 적절한 배향 및 올바른 오픈리딩프레임으로 플라스미드와 같은 발현 벡터로에 삽입된다. 필요할 경우, DNA는 바람직한 숙주에 의해 인식되는 적당한 전사 및 번역 조절 제어 뉴클레오티드 서열(하지만, 이 제어는 대부분의 경우 발현 벡터에 허용될 수 있다)에 연결될 수 있다. 벡터는 그 후 표준 기법을 통해 숙주에 도입된다. 일반적으로, 모든 숙주가 벡터에 의해 형질전환되지 않는다. 따라서, 형질전환된 세포를 선택하는 것이 필요할 것이다. 하나의 선택 기법은 발현 벡터에 임의의 필요한 조절 요소에 의해 형질전환된 세포에서 선택가능한 형질, 예컨대 항생제 내성을 암호화하는 발현 벡터를 혼입하는 것을 포함한다.
다르게는, 이러한 선택가능한 형질에 대한 유전자는 다른 벡터에 있을 수 있으며, 이는 바람직한 숙주 세포를 동시-형질전환하는 데 사용된다. 본 발명의 재조합 DNA에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본원에 개시된 교시와 관련하여 당해 분야의 숙련자에게 공지된 충분한 시간 동안 적당한 상태에서 배양되어 폴리펩티드의 발현을 허용하고, 이는 회수될 수 있다.
박테리아(예를 들면, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 효모(예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애( Saccharomyces cerevisiae)), 사상균류(예를 들면, 아스퍼질러스 종(Aspergillus spec.)), 식물 세포, 동물 세포 및 곤충 세포 등을 포함한 많은 발현 체계가 알려져 있다. 바람직하게는, 체계는 ATCC Cell Biology Collection으로부터 입수할 수 있는 CHO 세포 등의 포유류 세포일 수 있다.
구성적 발현(constitutive expression)을 위한 전형적인 포유류 세포 벡터 플라스미드는 적당한 폴리 A 꼬리 및 네오마이신과 같은 내성 마커를 갖는 CMV 또는 SV40 프로모터를 포함한다. 하나의 예는, 파마시아(Pharmacia, 미국 뉴욕주 피스카타웨이 소재)에서 입수할 수 있는 pSVL이다. 유도성 포유류 발현 벡터의 예는 pMSG이며 이 또한 파마시아로부터 입수할 수 있다. 유용한 효모 플라스미드 벡터는 pRS403-406 및 pRS413-416 이며 이는 대부분 스트라타진 클로닝 시스템(Stratagene Cloning Systems, 미국 캘리포니아주 92037 라 졸라 소재)에서 입수할 수 있다. 플라스미드 pRS403, pRS404, pRS405 및 pRS406는 효모 통합 플라스미드(YIp)이며 이는 효모 선택 마커 HIS3, TRP1, LEU2와 URA3를 통합한다. 플라스미드 pRS413-416은 효모 동원체 플라스미드(Ycp)이다. 예를 들면 시그마-알드리치로부터의 CMV 프로모터 기반 벡터는 일시적인 또한 안정된 발현, 세포질 발현 또는 분비, 및 FLAG, 3xFLAG, c-myc 또는 MAT의 다양한 조합에서 N-말단 또는 C-말단 태깅을 제공한다. 이러한 융합 단백질은 재조합 단백질의 검출, 정제 및 분석을 가능하게 한다. 이중-태깅된 융합은 검출 유연성을 제공한다.
강한 인간 거대세포바이러스(CMV) 프로모터 조절 영역은 구성 단백질 발현 수준을 높게는 COS 세포에서 1mg/L까지 구동시킨다. 효능이 덜한 세포주에 있어서, 단백질 수준은 전형적으로 약 0.1mg/L 정도이다. SV40 복제 기원의 존재는 SV40 복제 허용 COS 세포에서 높은 DNA 복제의 수준을 초래한다. CMV 벡터는 예를 들면 박테리아 세포에서의 복제를 위한 pMB1(pBR322) 기원, 박테리아에서 암피실린 내성 선택을 위한 b-락타마아제 유전자, hGH 폴리 A, 및 f1 기원을 함유할 수 있다. 프리프로트립신 리더(PPT)를 함유하는 벡터는 FLAG 융합 단백질의 분비를 ANTI-FLAG 항체, 수지, 및 플레이트를 사용하여 정제하기 위한 배향 배지로 유도시킬 수 있다. 다른 벡터 및 발현 체계는 여러 가지의 숙주 세포 사용 분야에서 널리 알려져 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 벡터 구성체에 의해 형질전환된 숙주 세포와 관련된다. 숙주 세포는 원핵 세포이거나 진핵세포일 수 있다. 박테리아 세포는 몇몇의 상황에서 바람직한 원핵 숙주 세포일 수 있으며, 보통 베테스다 리서치 래보래토리즈 인코포레이티드(Bethesda Research Laboratories Inc., 미국 메릴랜드주 베테스다 소재)로부터 입수할 수 있는 이. 콜라이 균주 DH5 및 어메리칸 타입 컬쳐 컬랙션(American Type Culture Collection(ATCC), 미국 메릴랜드주 락빌 소재)로부터 입수할 수 있는 RR1(No ATCC 31343)과 같은 이. 콜라이 균주이다. 바람직한 진핵 숙주 세포는 효모, 곤충, 포유류 세포를 포함하고, 바람직하게는 마우스, 래트, 원숭이 또는 인간 섬유아세포 및 대장 세포주 등과 같은 척추동물 세포이다. 효모 숙주 세포는 YPH499, YPH500 및 YPH501을 포함하며, 이는 대부분 스트라타진 클로닝 시스템으로부터 구입이 가능하다. 바람직한 포유류 숙주 세포는 ATCC에서 구입이 가능한 CCL61로 알려져 있는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, ATCC에서 CRL 1658로 알려져 있는 스위스 마우스 배아 세포 NIH/3T3, ATCC에서 CRL 1650 세포로 알려져 있는 원숭이 신장-유래 COS-1 세포, 및 293 세포로 알려져 있느 인간 배아 신장 세포를 들 수 있다. 바람직한 곤충 세포는 Sf9 세포이며 이는 바큘로바이러스 발현 벡터에 의해 형질감염될 수 있다. 발현을 위한 적당한 숙주 세포의 선택에 대한 개관은 예를 들면 문헌[Paulina Balbㅱs and Argelia Lorence "Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols," Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9] 및 이 분야에 종사하는 사람들이 잘 아는 문헌에서 찾을 수 있다.
적당한 세포 숙주를 본 발명의 DNA 구성체로 형질전환하는 것은 보통 사용되는 벡터의 유형에 따라 결정되는 잘 알려진 방법으로 완성된다. 원핵 숙주 세포의 형질전환에 대해서는 예를 들면 문헌[Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110, 및 Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY를]을 참조하기 바란다. 효모 세포의 형질전환은 문헌[Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY]에 기재되어 있다. 문헌[Beggs (1978) Nature 275,104-109]에 나와 있는 방법도 유용하다. 척추동물 세포에 대해서는, 이러한 세포를 형질감염시키는 시약, 예를 들면 칼슘 인산염 및 DEAE-덱스트란 또는 리포좀 제형은 스트라타진 클로닝 시스템스 또는 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드(Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA)로부터 입수할 수 있다. 전기 천공법 역시 형질전환 또는/및 세포를 형질감염시키는 데에 유용하며 이는 효모 세포, 박테리아 세포, 곤충세포 및 척추동물 세포 형질전환 분야에 잘 알려져 있다.
성공적으로 형질전환된 세포, 즉 본 발명의 DNA 구성체를 함유하는 세포는, 잘 알려진 PCR과 같은 기법으로 식별될 수 있다. 다르게는, 상청액 중 단백질의 존재는 항체를 사용함으로서 검출될 수 있다.
본 발명의 특정한 숙주 세포, 예를 들면 박테리아, 효소 및 곤충 세포는 본 발명의 펩티드의 제조에 유용하다는 것을 알 수 있을 것이다. 하지만, 다른 숙주 세포 또한 특정한 치료 방법에 유용할 수도 있다. 예를 들면, 수지상 세포와 같은 항원-제시 세포는 적당한 MHC 분자에 로딩될 수 있는 본 발명의 펩티드를 발현하는 데 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 항원 제시 세포이며, 특히 수지상 세포 또는 항원 제시 세포이다. 전립선 산성 포스파타제(PAP)를 함유하는 재조합된 융합 단백질이 로딩된 APC는 현재 전립선암의 치료 방법에 대해 조사 중이다(Sipuleucel-T)(Small EJ et al 2006; Rini et al 2006).
본 발명의 다른 양태는 숙주 세포를 배양하고, 숙주 세포 또는 이의 배양 배지로부터 펩티드를 단리함을 포함하는 펩티드 또는 이의 변이체의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 펩티드, 핵산 또는 발현 벡터는 의학에서 사용된다. 예를 들면, 펩티드 또는 이의 변이체는 정맥내(i.v.) 투여, 피하(s.c.) 투여, 피부 내(intradermal; i.d.) 투여, 복강내(i.p.) 투여, 근육내(i.m.) 주사를 위해 제조될 수 있다. 펩티드 주사의 바람직한 방법은 피하, 피부 내, 근육내 및 정맥내 주사를 포함한다. DNA 주사의 바람직한 방법은 피부 내, 근육내, 피하, 복강내 및 정맥내 주사를 포함한다. 펩티드 또는 DNA의 50 μg 내지 1.5 mg, 바람직하게는 125 μg 내지 500 μg의 투여량이 각각의 펩티드 또는 DNA에 따라서 주어질 수 있다. 이러한 범위의 투여량은 이전 시도에서 성공적으로 사용된 바 있다(Brunsvig et al 2006; Staehler et al 2007).
본 발명의 또 다른 양태는 항원 특이적 방식으로 T 세포를 활성화시키는데 충분한 시간 동안 적당한 항원-제시 세포의 표면에서 발현된 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자와 T 세포에 로딩된 항원을 시험관내 접촉시킴을 포함하는, 활성화된 T 세포의 시험관내 제조 방법을 포함하며, 이때 항원은 본 발명에 따른 펩티드이다. 바람직하게는, 충분한 양의 항원이 항원-제시 세포와 함께 사용된다.
MHC 클래스 II 에피토프가 항원으로 사용되는 경우, T 세포는 CD4-양성 보조 세포이고, 바람직하게는 TH1-유형이다. MHC 클래스 II 분자는 임의의 적당한 세포의 표면에서 발현될 수 있다. 바람직하게는 세포는 자연적으로 MHC 클래스 II 분자를 발현하지 않는다(이런 경우, 세포는 이러한 분자를 발현하도록 형질감염되어 있다). 다르게는, 세포가 MHC 클래스 II 분자를 자연적으로 발현하는 경우, 항원-처리 또는 항원-제시 경로에서 불완전한 것이 바람직하다. 이렇게 함으로서, MHC 클래스 II 분자를 발현하는 세포가 T 세포를 활성시키기 전에 주어진 펩티드 항원으로 완전히 로딩될 수 있다.
항원-제시 세포(또는 자극 세포)는 전형적으로 MHC 클래스 II 분자를 이의 표면에 가지고 있고, 바람직하게는 MHC 클래스 II 분자를 선택된 항원으로 실질적으로 로딩하는 것이 불가능하다. MHC 클래스 II 분자는 시험관내에서는 선택된 항원으로 쉽게 로딩될 수 있다.
바람직하게는, 포유류 세포는 TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있거나, 감소된 수준 또는 기능을 가지고 있다. TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있는 적당한 세포로는 T2, RMA-S 및 드로소필라(Drosophila)세포를 들 수 있다. TAP는 항원 처리에 관련된 트랜스포터이다.
인간 펩티드 로딩 결함 세포주 T2는 어메리칸 타입 컬쳐 컬랙션으로부터 카타로그 번호 CRL 1992하에 입수 가능하고, 드로소필라 세포주 쉬나이더(Schneider) 주 2는 ATCC의 카타로그 번호 CRL 19863으로 입수 가능하며, 마우스 RMA-S 세포주는 문헌[Karre et al 1985]에 기재되어 있다.
바람직하게는, 숙주 세포는 형질감염전에 실질적으로 MHC 클래스 I 분자를 발현하지 않는다. 또한, 자극 세포가 B7.1, B7.2, ICAM-1 및 LFA 3과 같은 T 세포에 대한 동시-자극 신호를 제공하는 중요한 분자를 발현하는 것이 바람직하다. 다수의 MHC 클래스 II 분자의 핵산 서열 및 동시자극 분자의 서열은 GenBank 및 EMBL 데이터베이스에서 공개적으로 제공된다.
유사하게, MHC 클래스 I 에피토프가 항원으로 사용되는 경우, T 세포는 CD8-양성 CTL이다.
항원 제시 세포가 상기 에피토프를 발현하도록 형질감염되는 경우, 바람직하게는 세포는 서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3 또는 이의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다.
CTL을 시험관내에서 생성시키는 몇몇의 다른 방법도 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Peoples et al (1995)와 Kawakami et al (1992)]에서 기재된 방법은 CTL 생성 시, 자가조직 종양-침투 림프구를 사용한다. 플레반스키(Plebanski) 등(1995)은 자가조직 말초 혈액 림프구(PLB)를 CTL 제조에 사용한다. 조크무스(Jochmus) 등(1997)은 수지상 세포를 펩티드 또는 폴리펩티드로 펄스시키거나, 또는 재조합 바이러스에 의한 감염에 의해 자가조직 CTL을 제조하는 방법을 기재한다. 힐(Hill) 등(1995) 및 제로미(Jerome) 등(1993)은 자가조직 CTL 생성 시 B 세포를 사용 한다. 또한, 펩티드 또는 폴리펩티드로 펄스된 또는 재조합된 바이러스에 의해 감염된 대식 세포가 자가조직 CTL의 제조에 사용될 수 있다. 왈터(S. Walter) 등(2003)은 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 사용하는 시험관내 T 세포의 프라이밍을 기재하며, 이는 역시 선택된 펩티드에 대한 T 세포의 생성에 적합한 방식이다. 이 연구에서, aAPC는 바이오틴-스트렙트아비딘에 의해 미리 생성된 MHC:펩티드 복합체를 폴리스티렌 입자(마이크로 비드)의 표면에 커플링시킴으로써 생성된다. 이 체계는 aAPC에 대해 정확한 MHC 밀도를 제어할 수 있도록 허용하며, 이는 혈액 샘플로부터 높은 효율로 높은- 또는 낮은-결합 항원-특이적 T 세포 반응을 선택적으로 유도하게 한다. MHC:펩티드 복합체 외에도, aAPC는 이들의 표면에 커플링된 항-CD28 항체와 같은 동시-자극 활성을 갖는 다른 단백질을 운반해야 한다. 또한 이러한 aAPC-기반 체계는 종종 예를 들면, 인터루킨-12와 같은 사이토카인 같은 적당한 가용성 인자의 첨가를 필요로 한다.
동종이계 세포는 T 세포의 제조에 또한 사용될 수 있으며, 방법은 WO 97/26328에 더 자세하게 기재되어 있으며, 본원에 참조 문헌으로 포함되어 있다. 예를 들어, 드로소필라 세포 및 T2 세포 외에도, CHO 세포, 바큘로바이러스-감염 곤충 세포, 박테리아, 효모, 백시니아-감염된 표적 세포와 같은 다른 세포들도 항원을 제시하는 데에 사용될 수 있다. 추가적으로 식물 바이러스가 사용될 수도 있다(예를 들어 Porta et al (1994)를 참조). 이는 외래 펩티드의 제시를 위한 동부모자이크바이러스의 높은 수확 체계로서 발전에 대해 기재한다.
본 발명의 펩티드에 대해 지향되는 활성화된 T 세포는 치료에서 유용하다. 따라서, 본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 상기 방법으로 획득될 수 있는 활성화된 T 세포를 제공한다. 상기 방법으로 생성된 활성화된 T 세포는 서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.
바람직하게는, T 세포는 이의 TCR을 통해 HLA/펩티드-복합체와 상호작용(예, 결합)함으로써 세포를 인식한다. T 세포는 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 표적 세포를 갖는 환자에서 표적 세포를 죽이는 방법에 유용하며, 이때 환자는 유효 개수의 활성화된 T 세포가 투여된다. 환자에게 투여된 T 세포는 환자로부터 유래될 수 있고 상기 기재된 바와 같이 활성화된다(즉, 이는 자가조직 T 세포이다). 다르게는, T 세포는 환자로부터가 아닌, 다른 개체로부터 유래된다. 물론, 개체가 건강한 개체인 것이 바람직하다. 본 발명자들은 "건강한 개체"를 개체가 일반적으로 좋은 건강을 가지고 있으며, 바람직하게는 허용되는 면역계를 갖고, 보다 바람직하게는, 손쉽게 시험되고 감지될 수 있는 임의의 질병도 겪고 있지 않다는 것이다.
생체내에서, 본 발명에 따른 CD4-양성 T 세포에 대한 표적 세포는 종양 세포(이는 종종 MHC 클래스 II를 발현함) 및/또는 종양을 감싸고 있는 간질성 세포(종양 세포)(이는 종종 MHC 클래스 II를 또한 발현한다)이다(Dengjel et al., 2006)).
본 발명의 T 세포는 치료 조성물의 활성 성분으로서 사용될 수도 있다. 따라서, 상기 정의된 유효 개수의 T 세포를 환자에게 투여함을 포함하는, 본 발명은 환자의 표적 세포가 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는, 환자의 표적 세포를 죽이는 방법을 제공한다.
본원에서 "비정상적으로 발현되는"이라는 것은 폴리펩티드가 발현의 정상 수준에 비교했을 때 과다발현되거나 유전자가 종양이 유래된 조직에서는 침묵적이지만(silent) 종양에서는 발현되는 것을 말한다. "과다발현"이라는 것은 폴리펩티드가 정상 조직에서 존재하는 수준의 적어도 1.2배로 존재하는 것을 말하고, 더 바람직하게는 적어도 2배, 더 바람직하게는 적어도 5배 또는 10배 이상으로 존재하는 것을 말한다.
T 세포는 예를 들면 상기 기재된 바와 같은 방법으로 얻어질 수 있다. 소위 T 세포의 입양 전송에 대한 프로토콜은 당해 분야에서 잘 알려져 있으며, 이는 문헌[Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1988; Dudley et al., 2002; Yee et al., 2002; Dudley et al., 2005]에서 찾아볼 수 있으며, 문헌[Gattinoni et al., 2006 and Morgan et al., 2006에 리뷰되어 있다.
본 발명의 임의의 분자(즉, 펩티드, 핵산, 발현 벡터, 세포, 활성화된 CTL, T 세포 수용체 또는 이를 암호화하는 핵산)는 면역 반응을 피할 수 있는 세포를 특징으로 하는 장애의 치료에 유용하다. 따라서, 본 발명의 임의의 분자는 약제로서 사용되거나 약제의 제조에 사용될 수 있다. 상기 분자는 단독으로 사용될 수 있고, 임의의 알려진 분자와 함께 결합하여 사용될 수도 있다.
바람직하게는, 본 발명의 약제는 백신이다. 이는 환자의 침범된 기관에 직접적으로 투여될 수 있거나 또는 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v.로서 전체적으로 투여되거나 또는 환자에게서 또는 나중에 환자에게 투여될 인간 세포주에 생체외 적용될 수도 있거나 또는 환자로부터 유래된 면역 세포의 부분 집단을 선택하도록 시험관내에 사용되며 이는 이어서 환자에게 재투여된다. 핵산이 시험관내에서 세포에 투여되면, 인터루킨-2와 같은 면역 자극 사이토카인과 함께 발현되기 위해 세포가 형질감염되는 것이 유용할 수도 있다. 펩티드는 실질적으로 순수하거나, 면역-자극 보조제(하기 참고)와 병용되거나, 면역-자극 사이토카인과 병용하여 사용되고, 적합한 전달 체계, 예를 들면 리포좀과 함께 투여될 수 있다. 펩티드는 또한 키홀 림펫 헤모사이아닌(keyhole limpet haemocyanin, KLH) 또는 만난(mannan)(WO 95/18145 및 Longenecker et al (1993) 참조)과 같은 적당한 담체에 결합될 수 있다. 펩티드는 또한 태그될 수도 있고, 융합 단백질일 수도 있으며, 또는 하이브리드 분자(hybrid molecule)일 수도 있다. 펩티드(이의 서열은 본 발명에 제시되어 있다)는 의 서열은 CD4 또는 CD8을 자극하는 것으로 기대된다. 그러나, CD8 CTL의 자극은 CD4 T-보조 세포에 의해 제공된 도움하에 더 효율적이다. 따라서, CD8 CTL을 자극하는 MHC 클래스 I 에피토프에 있어서는 융합 파트너 또는 하이브리드 분자의 부분이 적당하게 CD4-양성 T 세포를 자극하는 에피토프를 제공한다. CD4- 및 CD8-자극 에피토프는 당해 분야에서 잘 알려졌고 본 발명에서 식별된 것들을 포함한다.
한 양태에서, 백신은 서열 식별 번호: 1, 2 또는 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 펩티드 및 하나 이상, 바람직하게는 2 내지 50개, 더 바람직하게는 2 내지 25개, 더 바람직하게는 2 내지 15개, 가장 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 추가의 펩티드를 포함한다. 펩티드는 하나 이상의 특이적 TAA로부터 유래될 수 있고, MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 추가의 펩티드는 서열 식별 번호: 4 내지 24에 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수할 수 있거나, 또는 적당한 벡터 또는 전달 체계에 포함될 수 있다. 핵산은 DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 이런 핵산을 디자인하고 도입하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 개요는 문헌[Pascolo S. 2006; Stan R. 2006, 또는 A Mahdavi 2006]에 의해 제공된다. 폴리뉴클레오티드 백신은 제조하기 쉽지만, 면역 반응 유도에서 이들 벡터의 작용 모드는 완전히 이해되지 않았다. 적당한 벡터 및 전달 체계는 아데노바이러스, 우두바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노-결합 바이러스 또는 하나 이상의 바이러스를 포함하는 하이브리드와 같은 바이러스 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 비-바이러스 전달 체계는 양이온 지질 및 양이온 중합체를 포함하고 이는 이 DNA 전달 분야에서 잘 알려져 있다. "유전자-총"과 같은 물리적 전달 또한 사용될 수 있다. 펩티드 또는 핵산에 의해 암호화된 펩티드는, 예를 들면 상기 언급한 각각의 반대 CDR을 위한 T 세포를 자극하는 에피토프와의 융합 단백질일 수 있다.
본 발명의 약제는 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 보조제는 면역 반응을 비-특이적으로 향상시키거나 강력하게 하는 물질이고(예: 항원에 대한 CTL 및 보조 T 세포(TH)에 의해서 매개된 면역 반응), 따라서 본 발명의 약제에서 유용한 것으로 간주된다. 적당한 보조제는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스(Amplivax), AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, 플라젤린 또는 플라제린으로부터 유래된 TLR5 리간드, FLT3 리간드, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드(Imiquimod)(알다라(ALDARA)), ImuFact IMP321, IL-2, IL-13, IL-21, 인터페론-알파 또는 -베타, 또는 이들의 PEG화된 유도체로서 인터류킨, IS 패치, ISS, ISCOMATRIX, ISCOM, JuvImmune, LipoVac, MALP2, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드(Montanide) IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, 유중수및 수중유 에멀전, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel(등록상표명) 벡터 시스템, PLG 및 덱스트란 미세입자, 레시퀴모드(resiquimod), SRL172, 비로좀(Virosomes) 및 다른 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타-글루칸, Pam3Cys, 아퀼라(Aquila) QS21 스티뮬론(이는 사포닌으로부터 유래됨), 미코박테리아 추출물 및 합성 박테리아 세포벽 모방체, 및 다른 독점 보조제, 예컨대 리비 데톡스(Ribi's Detox), 퀼(Quil) 또는 수퍼포스(Superfos) 등이 있다. 프레운드(Freund's) 또는 GM-CSF와 같은 보조제가 바람직하다. 몇몇의 면역학적 보조제(예: MF59)는 수지상 세포에 대해 특이적이고, 이들의 제조 방법은 이전에 기재된 바 있다(Dupuis M et al 1998; Allison 1998). 또한, 사이토카인도 사용될 수 있다. 몇몇의 사이토카인은 수지상 세포의 림포이드 조직으로의 이동의 영향에 직접적으로 연관된 바 있으며(예: TNF-α), 이는 수지상 세포의 T-림프구(예: GM-CSF, IL-1 및 IL-4)에 대한 효율적인 항원 제시 세포로의 성장을 가속시키며,(미국 특허 5,849,589, 본 발명의 참조 문헌으로 들어가 있음) 면역보조제로서 작용한다(예: IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alpha. IFN-beta)(Gabrilovich et al 1996).
CpG 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 백신 세팅에서 보조제의 효과를 높이는 것으로 나타났다. 이론에 얽매이지 않고, CpG 올리고뉴클레오티드는 톨(Toll)-유사 수용체(TLR), 주로 TLR9를 통해 선천적 (비-적응) 면역계를 활성화시킴으로써 작용한다. CpG에 의해 유도된 TLR9의 활성화는 예방적 및 치료적 백신에서 펩티드 또는 단백질 항원, 살아 있거나 죽은 바이러스, 수지상 세포 백신, 자가조직 세포 백신 및 다당류 접합체를 포함한 넓은 종류의 항원에 대한 항원-특이적 체액성 및 세포성 반응을 향상시킨다. 더 중요하게 이는 수지상 세포의 성장 및 분화를 향상시키고 이는 TH1 세포의 활성화를 향상시키며 강한 세포독성 T-림프구(CTL) 생성을 CD4 T 세포의 도움이 없을 때에도 향상시킨다. TLR9의 자극에 의해 유도된 TH1 바이어스는 보통 TH2 바이어스를 촉진하는 알룸(alum) 또는 비완성된 프레운도 보조제(IFA)와 같은 백신 보조제가 존재할 때도 유지된다. CpG 올리고뉴클리오티드는 다른 보조제와 함께 제조되거나 함께 투여될 시 또는 미세입자, 나노입자, 지질 에멀전 또는 유사한 제형과 같은 제형에서 더 큰 보조제 활성을 나타내며, 이는 특히 항원이 상대적으로 약할 때 강한 반응을 유도하기 위해 필수적이다. 이들은 또한 면역 반응을 가속화시키고, 몇몇의 실험에서 CpG가 없을 때 전체 투여량 백신에 대한 유사한 항체 반응을 가지면서 대략 두 배 정도 만큼 항원 투여량을 감소시킨다(Krieg et al 2006). 미국 특허 6,406,705 B1는 CpG 올리고뉴클레오티드, 비-핵산 보조제 및 항원-특이적 면역 반응을 유도하는 항원의 조합 사용에 대해 기재한다. CpG TLR9 길항제는 몰로겐(Mologen)(Berlin, Germany)에 의한 dSLIM(double Stem Loop Immunomodulator)이며 이는 본 발명의 약학 조성물의 바람직한 성분이다. RNA 결합 TLR 7, TLR 8 및/또는 TLR 9와 같은 다른 TLR 결합 분자 또한 사용될 수 있다.
다른 유용한 보조제의 예는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 화학적으로 변형된 CpG예: CpR, 이데라(Idera)), dsRNA 유사체, 예컨대 Poly(I:C) 및 AmpliGen, 비-CpG 박테리아 DNA 또는 RNA, 및 면역활성 소 분자 및 항체, 예컨대 사이클로포스파미드, 수니티닙, 베자시주맙(Bevacizumab), 세레브렉스, NCX-4016, 실데나필, 타달라필, 바르데나필, 소라페닙, 테모졸로미드, 템시로리무스, XL-999, CP-547632, 파조파닙, VEGF 트랩, ZD2171, AZD2171, 항-CTLA4 및 SC58175(이들은 치료학적으로 및/또는 보조제로서 작용할 수 있다). 본 발명에서 유용한 보조제 및 첨가제의 양 및 농도는 특별히 다른 실험을 할 필요 없이 기술이 뛰어난 개인에 의해서 쉽게 결정될 수 있다. 바람직한 보조제는 dSLIM, 인터페론-알파, -베타, CpG7909, IC31, 알다라(이미퀴모드), PeviTer, RNA, 타달라필, 테모졸로미드 및 JuvImmune가 있다.
본 발명은 암, 특히 신경 교종, 뇌암, 유방암, 전립선암, 식도암, 대장암, 신장암, 췌장암, 편평 세포 선암 및 피부의 각질형성세포 종양, 백혈병, 폐암, 난소암, 및 흑생종에 유용한 약제를 제공한다.
본 발명은 다음을 포함한 키트(kit)를 포함한다: (a) 상기 기재된 바와 같은 약학 조성물을 용액 또는 동결건조 형태로 함유하는 용기; (b) 선택적으로, 동결건조된 제형을 위한 희석제 또는 재구성 용액을 함유하는 제 2 용기; 및 (c) 선택적으로, (i) 용액의 사용 또는 (ii) 동결건조된 제형의 재구성 및/또는 사용에 대한 지침서.
키트는 또한 (iii) 완충제, (iv) 희석제, (v) 필터, (vi) 바늘 또는 (v) 주사기 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 용기는 바람직하게는 병, 물약병, 주사기 또는 시험관이고; 다용도 용기일 수도 있다. 약학 조성물은 바람직하게는 동결건조되어 있다.
본 발명의 키트는 바람직하게는 적합한 용기에서 본 발명의 동결건조된 제형 및 이의 재구성 및/또는 사용에 관한 지침서를 포함한다. 적당한 용기는 예를 들면, 병, 물약병(예: 듀얼 챔버 물약병), 주사기(듀얼 챔버 주사기 등) 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱 등의 여러 가지의 물질로 만들어 질 수 있다. 바람직하게는 키트 및/또는 용기는 재구성 및/또는 사용에 대한 사용법을 함유하거나, 용기에 결합되어 있다. 예를 들면, 라벨은 동결건조된 제형이 상기 기재된 바와 같은 펩티드의 농도로 재구성하는 것을 가리킬 수 있다. 라벨은 또한 제형이 피하 투여가 가능한지 아니면 유용한지를 보여줄 수도 있다.
제형을 포함한 용기는 재구성된 제형의 반복된 투여(예: 약 2 내지 6회의 투여)를 가능하게 하는 다용도 물약병일 수 있다 . 키트는 또한 적당한 희석제(예: 중탄산나트륨 용액)를 포함하는 제 2 용기를 포함할 수도 있다.
희석제 및 동결건조된 제형을 혼합할 때, 재구성된 제형의 최종 펩티드 농도는 바람직하게는 적어도 0.15 mg/mL/펩티드(=75μg)이고, 바람직하게는 3 mg/mL/펩티드(=1500μg)를 넘지 않아야 한다. 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 패키지 삽입물 및 사용 설명서 등의 사용자의 입장 및 상업적 입장으로부터 유리한 다른 물질을 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 키트는 본 발명에 따른 약학 조성물의 제형을 함유하는 하나의 용기를 다른 성분과 함께 또는 없이(예: 다른 화합물 또는 다른 화합물의 약학 조성물)갖거나, 각각의 조성물을 별도의 용기에 가질 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 키트는 제 2 화합물(예컨대, 보조제(예: GM-CSF), 화학요법제, 천연 생성물, 호르몬 또는 길항제, 항-혈관신생제 또는 억제제, 세포자멸 유도제 또는 킬레이터) 또는 이들의 약학 조성물의 공동 투여에 의해 함께 사용되도록 포장된 본 발명의 제형을 포함한다. 환자에게 투여되기 전에 키트의 성분은 미리 형성될 수도 있고 또는 각각의 성분은 각각 별도의 용기에 담겨 있을 수도 있다. 키트의 성분은 하나 이상의 액체 용액, 바람직하게는 수용액, 더욱 바람직하게는 무균 수용액에 제공될 수 있다. 키트의 성분은 바람직하게는 다른 용기에 담겨진 적당한 용매의 첨가에 의해 액체로 전환될 수 있는 고체로서 제공될 수 있다.
치료 키트의 용기는 물약병, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 고체 또는 액체를 담을 수 있는 임의의 다른 수단일 수도 있다. 보통, 하나 이상의 성분이 있을 경우, 키트는 제 2 물약병 또는 다른 용기를 포함하고, 이는 별도의 투여를 가능하게 한다. 키트는 약학적으로 허용가능한 액체용 용기를 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 치료 키트는 본 키트의 성분인 본 발명의 제제의 투여를 허용하는 장치(예: 하나 이상의 바늘, 주사기, 안약 투입제, 피펫 등)를 함유할 것이다.
본 제형은 구강(경구), 비강, 안약 형태의, 피하의, 피부 내, 근육내, 정맥내 또는 경피 등 어떠한 투여 형태로든 펩티드 투여에 적합하다. 바람직한 투여 경로는 피하 경로이고 가장 바람직한 투여 경로는 피부 내 경로이다. 주입 펌프에 의해서도 투여가 가능하다.
본 발명은 이제 이의 바람직한 실시양태가 기재된 다음의 실시예를 통해 기재되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명을 위해, 본원에서 인용된 모든 참조 문헌은 그 전체가 참고로서 인용되어 있다.
실시예
실시예 1:
세포 표면에 제시된 종양 관련 펩티드의 식별
조직 샘플
환자의 종양 및 건강한 조직은 두 기관[Hopital Cantonal Universitaire de Geneve(Medical Oncology Laboratory of Tumor Immunology) 및 Neurochirurgische Universitats-Klinik Heidelberg(Molekularbiologisches Labor)]에 의해 제공되었다. 모든 환자의 서면 동의서는 수술 전에 얻어졌다. 조직은 수술 직후 액체 질소에 의해 냉동되고 이는 영하 80℃에서 TUMAP가 단리 될 때까지 저장되었다.
HLA 펩티드의 조직 샘플에서부터의 단리
충격 냉동 조직 샘플로부터의 HLA 펩티드 풀(pool)이 고체 조직에서 면역 침전법을 통해 약간 변형된 프로토콜에 따라 HLA-A*02-특이적 항체 BB7.2 또는 HLA-A, -B, -C-특이적 항체 W6/32, CNBr-활성화된 세파로스, 산 치료 및 한외 여과기 사용을 통해 얻어졌다(Falk, K. et al 1991; Seeger, F. H. et al T 1999).
방법 2:
얻어진 HLA 펩티드 풀은 이들의 소수성에 의해 역상 크로마토그래피를 이용하여 분리되었고(Acquity UPLC system, Waters) 용리된 펩티드는 ESI 소스를 갖춘 LTQ-Orbitrap 하이브리드 질량 스펙트로미터(ThermoElectron)에 의해 분석되었다. 펩티드 풀은 1.7 μm C18 역상 물질(물)로 패킹되어 있는 융합-실리카 미세 모세혈관 컬럼(75 μm i.d. x 250 mm)에 바로 로딩된다. 이어서, 펩티드는 두-단계 180분-10%에서 33%까지의 이진 구배를 이용하여 분리되고, 여기서 유량은 분당 300nL이다. 구배는 용매 A(물의 0.1% 포름산)와 용매 B(아세토니트릴의 0.1% 포름산)로 이루어져 있다. 금이 입혀진 유리 모세관(PicoTip, New Objective)이 미세-ESI 소스로의 도입에 사용되었다. LTQ-Orbitrap 질량 스펙트로미터가 TOP5 전략을 이용한 데이터-의존 모드에서 작동되었다. 간략하게, 스캔 싸이클은 오비트랩(orbitrap)의 높은 질량 정확도(R = 30 000)의 전스캔으로 시작되고, 이후 5개의 가장 많은 이전에 선택한 이온의 동적 배제에 의한 전조 이온에 대한 오비트랩(R = 7500)의 MS/MS 스캔이 이어진다. 탄덤 질량 스펙트럼은 SEQUEST과 추가적인 수동 컨트롤에 의해 해석된다. 식별된 펩티드 서열은 천연 펩티드 단편 패턴을 합성 서열-동일 기준 펩티드의 단편 패턴과 비교함으로써 보증되었다. 도 1은 MHC 클래스 1과 관련된 펩티드 NCAN-001에 대한 종양 조직으로부터 얻어진 스펙트럼의 예를 보여준다.
실시예 2
본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자의 발현 프로필
종양 세포의 표면에 MHC 분자에 의해 제시되는 모든 펩티드가 면역 치료에 적당한 것은 아니다. 이는 이 펩티드의 거의 대 부분이 많은 세포 유형에 의해 발현되는 정상 세포 단백질로부터 유래된 것이기 때문이다. 아주 적은 몇 개의 펩티드가 종양-관련되어 있고, 유래된 종양을 인식하는 높은 특이성을 갖는 T 세포를 유도할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이런 펩티드를 식별하고 백신에 의해서 발생하는 자가면역의 위험을 최소화하기 위해 본 발명자들은 정상 조직과 비교했을 때 종양 세포에서 과다발현되는 단백질로부터 유래된 펩티드에 초점을 맞추었다.
가장 이상적인 펩티드는 종양에 대해 독특하고 다른 임의의 조직에는 존재하지 않은 단백질로부터 유래될 것이다. 이러한 이상과 유사한 발현 프로필을 갖는 유전자로부터 유래된 펩티드를 식별하기 위해, 식별된 펩티드는 단백질 및 유전자에 할당되었고, 이 유전자들의 발현 프로필이 생성되었다.
RNA 공급원 및 제조
수술로 제거된 조직 표본은 각각의 환자로부터 서면 동의서가 주어진 후 두 개의 임상 실험 센터에서 제공되었다(실시예 1 참조). 종양 조직 표본은 액체 질소에 의해 수술 직후 스냅-냉동되었고 절구와 유봉을 이용하여 액체 질소 환경 아래에서 균질화되었다. 전체 RNA는 TRIzol(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)을 이용하여 샘플로부터 제조되었고 이는 RNeasy(QIAGEN, Hilden, Germany)에 의해 정제되었다; 이 두 개의 모든 방법은 제조 업체의 설명서에 따라 실행되었다.
건강한 인간 조직의 전체 RNA는 상업적으로 얻어졌다(Ambion, Huntingdon, UK; Clontech, Heidelberg, Germany; Stratagene, Amsterdam, Netherlands; BioChain, Hayward, CA, USA). 여러 개인(2 내지 123명의 개인)에서 얻어진 RNA는 각각의 개인에게 균등 가중치를 두어 혼합하였다. 백혈구는 4명의 자원 봉사자의 혈액 샘플에서 단리되었다.
RNA 샘플의 양과 질은 아질런트 2100 생체분석기(Agilent, Waldbronn, Germany)에 의해 RNA 6000 Pico LabChip Kit(아질런트)를 사용하여 분석되었다.
마이크로어레이 실험
모든 종양 및 정상 조직 RNA 샘플의 유전자 발현 분석은 어피매트릭스(Affymetrix) 인간 게놈(HG) U133A 또는 HG-U133 Plus 2.0 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)에 의해 실행되었다. 모든 단계는 어피매트릭스의 사용 설명서에 따라 실행되었다. 요약하면, 이중 가닥 cDNA는 SuperScript RTII(Invitrogen) 및 올리고-dT-T7 프라이머(MWG Biotech, Ebersberg, Germany)를 사용하여 사용 설명서에 따라 전체 RNA의 5 내지 8 μg로부터 합성되었다. 시험관내 전사는 U133A 어레이를 위한 BioArray High Yield RNA 전사물 라벨링 키트(ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, USA) 또는 U133 Plus 2.0 어레이를 위한 GeneChip IVT 라벨링 키트(어피매트릭스)를 사용하여 실행되었다. 이는 cRNA 단편화, 하이브리드화 및 스트렙트아비딘-피코에리틴 및 비오티닐화된 항-스트렙트아비딘 항체로의 염색으로 이어졌다. 이미지는 아질런트 2500A 진어레이 스캐너(U133A) 또는 어피매트릭스 진-칩 스캐너 3000(U133 Plus 2.0)를 이용하여 스캔되었고, 데이터는 기본 세팅을 이용하여 GCOS 소프트웨어(어피매트릭스)를 통해 분석되었다. 표준화를 위해, 100 어피매트릭스에 의해 제공된 항존 유전자(housekeeping gene)가 사용되었다. 상대적인 발현 값은 시그널 로그 비율을 통해 계산되었고 정상 샘플의 값은 임의로 1.0으로 정해졌다.
본 발명의 펩티드 NCAN-001의 유전자 NCAN의 발현 프로필은 아교모세포종 종양 조직에서 높은 발현을 나타내고 정상적인 조직에서는 발현되지 않거나 아주 낮은 수준로 발현된다(도 2).
실시예 3
서바이빈으로부터 HLA-DR 모티프 펩티드(swissprot: O15392)
에피토프 예측: 잠재적인 HLA-DR 리간드의 예측은 www 데이터베이스 SYFPEITHI를 이용하여 이루어졌다. 간단하게 말하면, 서바이빈의 서열은 메트릭스 패턴에 비교되었고 이는 각각의 HLA-DR 모티프에 맞는 15합체 펩티드의 9합체 코어 서열의 하나 하나의 아미노산을 평가한다. 고정 잔기는 10 이하의 값이 주어졌다; 다른 잔기는 3 이하의 값이 주어졌으며, 이는 펩티드 내의 특정 자리의 아미노산 선호도를 나타내는 것이다. 이론적으로 각 후보 펩티드의 최고 점수는 28 내지 43이다; 풍부한 천연 리간드의 점수는 보통 20 이상이다.
TLGEFLKLDRERAKN(서열 식별 번호: 1)(또는 끝이 잘린 버젼)이 5 또는 6개의 예측에서 가장 점수가 높은 펩티드로 나타난다.
DRB1*01(최고 이론 점수 43)
58 FFCFKELEGWEPDDD(서열 식별 번호: 34) 36
98 LGEFLKLDRERAKN K(서열 식별 번호: 35) 28
22 FKNWPFLEGCACTPE(서열 식별 번호: 36) 28
DRB1*03(최고 이론 점수 40)
99 GEFLKLDRERAKN KI(서열 식별 번호: 37) 29
10 WQPFLKDHRISTFKN(서열 식별 번호: 38) 26
3 APTLPPAWQPFLKDH(서열 식별 번호: 39) 25
DRB1*04(최고 이론 점수28)
98 LGEFLKLDRERAKN K(서열 식별 번호: 40) 28
10 WQPFLKDHRISTFKN(서열 식별 번호: 41) 28
3 APTLPPAWQPFLKDH(서열 식별 번호: 42) 26
DRB1*07(최고 이론 점수 34)
121 KKEFEETAEKVRRAI(서열 식별 번호: 43) 24
128 AEKVRRAIEQLAAMD(서열 식별 번호: 44) 24
3 APTLPPAWQPFLKDH(서열 식별 번호: 45) 22
16 DHRISTFKNWPFLEG(서열 식별 번호: 46) 20
28 LEGCACTPERMAEAG(서열 식별 번호: 47) 18
40 EAGFIHCPTENEPDL(서열 식별 번호: 48) 18
93 FEEL TLGEFLKLDRE( 서열 식별 번호: 49) 16
103 KLDRERAKNKIAKET(서열 식별 번호: 50) 16
DRB1*11(최고 이론 점수 38)
98 LGEFLKLDRERAKN K(서열 식별 번호: 51) 32
83 GCAFLSVKKQFEELT(서열 식별 번호: 52) 24
58 FFCFKELEGWEPDDD(서열 식별 번호: 53) 22
DRB1*15(최고 이론 점수 34)
95 EL TLGEFLKLDRERA( 서열 식별 번호: 54) 30
19 ISTFKNWPFLEGCAC(서열 식별 번호: 55) 28
55 AQCFFCFKELEGWEP(서열 식별 번호: 56) 28
서열에 대한 결정을 내릴 때까지의 단계
1. 각각의 펩티드에 대해, HLA-DR 결합을 위해서는 9합체 코어 서열이 필요하다. 예측된 코어 서열은:
DRB1*01 FLKLDRERA(서열 식별 번호: 57)
DRB1*03 LKLDRERAK(서열 식별 번호: 58)
DRB1*04 FLKLDRERA(서열 식별 번호: 59)
DRB1*11 FLKLDRERA(서열 식별 번호: 60)
DRB1*15 LGEFLKLDR(서열 식별 번호: 61)
2. 코어 서열을 결합하여 불규칙한 하나의 코어 서열을 획득한다.
결합된 서열: LGEFLKLDRERAK(서열 식별 번호: 62)
3. 인접 서열을 추가하여 총 길이가 15개의 아미노산이 되게 한다.
최종: TLGEFLKLDRERAK(서열 식별 번호: 63)
실시예 4
서열 식별 번호: 1을 사용하여 펩티드의 면역원성을 확인하기 위해 임상 실험이 실시되었다. 최초 연구의 목적은 근치적 전립선 절제술 후 재발되었지만 전이성 병변이 탐지되지 않은 환자에서 전립선-특이적 펩티드 패널(백신 치료)의 피하의 투여에 대한 PSA(전립선 특이적 항원)-기반 반응(PSA-R)을 연구하는 것이었다.
이차적 연구 목적은 T 세포 반응에 대한 면역 현상에 대해 특별히 고려하여 전립선암을 가지고 있는 환자들에게 백신 치료를 투여하는 것의 내약성과 실행 가능성을 알아보기 위한 것이었다.
연구는 전향적 연구, 무작위 연구 단계 I/II 연구로 설계되었고, 적응증은 "전이성 병변이 탐지되지 않은 근치적 전립선 절제술 후 생화학적 재발"이었다.
연구 모집단
I/II 단계 연구의 일부로, 전립선-특이적 펩티드 패널의 백신을 사용하여, 근치적 전립선 절제술 후 생화학적으로 재발된 HLA-A*02+ 환자에게 종양 성장의 중단의 지표로서 PSA 퇴행를 유도하는 것이 시도되었다. 전립선-특이적 펩티드의 결합이 피하내로 투여 되어 면역 반응의 정도가 각각의 다양한 항원 구조에 대해 평가되었다.
이전 백신 연구에 반해, 이 계획된 연구는 아직 영상 수단으로 감지되지 않는 작은 종양을 가지고 있는 환자를 목표로 했다. 환자는 모두 알려진 전립선-특이적 항원 구조로 같은 방법으로 면역되었으며 이는 악성으로 변형된 세포에 대한 면역 반응을 높이기 위한 것이었다. 19명의 환자가 치료되었다.
연구 모집단
총 % 중앙값 범위
나이 19 63 55 - 77
이전 신-/ 보조 치료
없음 11 58
방사선 3 16
간헐성 호르몬 치료 2 11
방사선 + 간헐성 호르몬 치료 2 11
방사선 + 화학 요법 1 5
근치적 전립선 절제술 시 TNM
T2a-c R0 6 32
T3a-c R0 6 32
T2a-c R1 3 16
T3a-c R1 3 16
T3aN2 R0 1 5
글리슨 점수
5 - 7 10 53
8 - 10 3 16
모름 6 32
백신 전 근치적 전립선 절제술 기간 (달) 41 9 - 124
수술 후 첫번째 재발 (달) 14 1 - 90
백신 시작 시 PSA 0.76 0.14 - 10.8
치료 스케쥴
전이성 병변을 전산화 단층 촬영과 골격 신티그램 촬영으로 배제시킨 후, 전립선-특이적 펩티드 백신을 근치적 전립선 절제술 후 PSA 재발이 감지(14일 이상 떨어진 2 번의 측정에서 50% 이상 PSA 증가)된 환자에게 다른 투여 행태에 따라 피하 투여하였다. 백신은 0, 7, 14, 28, 42 및 56 일째 걸쳐 8회 투여되었다(펩티드 당 약 100 마이크로그램, 매번 주사 투여). 백신 치료 후 70일째, PSA를 다시 측정하여 치료 반응을 평가하였다.
종양 반응이 감지될 시(완전 완화 [PSA-CR], 부분 완화 [PSA-PR], 또는 안전 임상 진행 [변화 없음, PSA-NC]), 환자에게 백신을 선택된 투여 형태로 유지 치료 방법으로서 한 달에 한번씩 투여하였다. 환자의 백신에 대한 반응의 평가는 다음에 자세히 나와있다:
완전 완화(PSA-CR): 처음에 증가되었던 PSA 수준이 정상화되고, 이는 4주 이상의 간격 후에 측정함으로써 확인되었다. 정상화란 PSA 최하점이 0.2ng/ml 이하인 것으로 정의되며, 이는 완전한 종양 또는 전립선 적출술이 이루어진 근치적 전립선 절제술 후에 기대된다.
부분 완화: a) PSA-PR ≤ 80%(처음에 증가되었던 PSA 수준이 80% 감소되고, 4주 이상의 간격 후에 측정으로써 확인됨); 및 b) PSA-PR ≤ 50%(처음에 증가되었던 PSA 수준이 50% 감소되고, 4주 이상의 간격 후에 측정함으로써 확인됨).
안정적 상태(PSA-SD): 4주 동안 현저한 변화가 없음. 이는 4주 이상의 간격을 둔 측정에 의해 확인된 안정된 상태 및 50% 이하의 감소 및 10% 이하의 증가를 포함한다.
진행(PSA-PD): PSA 수준의 10% 이상 증가. PSA가 진행되는 경우, 연구가 종료되었다.
환자가 연구에 등록한 후, 에피토프-특이적 백신이 사용되었다; 전립상 상피 세포에서 특이적으로 발현되는 단백질(예, PSMA/PSCA)이 고려되었다. 잔여 종양의 성장 모니터링에 의한 투여된 백신의 일반적인 효율을 PSA 모니터링으로 평가하는 것 외에도, 이 연구는 다양한 백신 방법에 대한 효율적인 면역계 조절에 대해 조사하였다. 발명에 따른 펩티드의 간단한 피하 투여 외에도 보조제의 다양한 조합도 함께 사용되었다. 백신은 PSA, PSCA, PSMA, 서바이빈, TRP-P8 및 프로스테인으로부터 각각 유래된 적어도 6개의 펩티드의 조합을 포함하였다. 인플루엔자 MP에서 유래된 펩티드가 양성 대조군으로 사용되었다. PSMA와 서바이빈에서 유래된 펩티드는 T 보조 에피토프로 사용되었다. 특히, 예전에 호의적으로 기재된 바 있는 몬타나이드(인간에의 사용에 적합한 전형적인 불완전 프로인드 보조제의 제형)가 펩티드 백신을 위한 저장(depot)과 보조 활성을 위해 사용되었다. 이 목적을 위하여 500μl 펩티드 용액이 500μl의 몬타나이드와 혼합되었고, 투여되었다. 그렇게 함으로써, 수중유 에멀전이 제조되었고, 이는 수성상에 포함되어 있는 항원을 몇주에 걸쳐 천천히 방출한다. 에멀전의 물리적 안정성은 상온 4℃에서 3개월 이상 현저한 분리가 없이 저장될 수 있는 만큼 아주 높다. 몬타나이드의 저장 기능은 몇몇의 백신 임상 실험에서 좋은 결과를 얻은 바가 있다(Oka et al., 2004).
하나의 연구 군은 면역계의 성장 인자, GM-CSF, 투여를 위한 Leukine(등록상표명) 액체의 동시 자극에 의한 백신의 효율성을 조사했다. GM-CSF는 펩티드 백신 임상 실험에서 임상적인 및 T 세포 반응을 증가시키는 것으로 알려져 널리 사용되는 보조제이다. 초기에, GM-CSF는 수지상 세포 모집, 분화의 인자로서 이는 백신 주사 부위의 수지상 세포의 숫자를 높인다고 생각된다. GM-CSF는 항원 제시 세포를 직접 활성화시키지는 않지만, 수지상 세포와 대식 세포의 간접적인 생체내 활성화 활동이 보고 된 바 있다(Molenkamp et al., 2005).
또 다른 연구 군은 피부 내(epicutaneous) 이미퀴모드의 사용에 의한 수지상 세포의 수반 활성화 중의 백신의 효율성을 조사하였다. 이미퀴모드는 5%의 연고(알다라)로서 투여되었다. TLR7 양성 세포의 효과를 통해 이는 강한 면역 자극을 일으키고, MyD88-의지 경로를 활성화시킨다. 활성화된 APC는 T 세포 자극과 염증 사이트카인을 분출하고, 동시 자극을 상향 조절하며 배출되는 림프절로 이동한다. 이미퀴모드를 항원과 혼합하거나, 알다라를 피하 또는 피부 내 주사 부위에 바르는 것에 의한 펩티드-유도 CTL 반응의 향상은 동물 모델에서 증명된 바가 있다.
다른 연구 군은 백신을 프로타민-안정 mRNA 암호화 뮤신-1을 혼합함으로서 TLF 7/8을 활성화 시켜 수지상 세포를 동시 활성화시키는 백신의 효율성을 조사하였다. mRNA는 마우스 및 인간 면역 세포 모집단의 넓은 활성화를 보인다. 다염기성 단백질 프로타민이 제형에 존재함으로서 mRNA의 반감기가 증가하고 이는 데포-형성 입자의 형성을 유도한다. 이 보조제는 데포-형성과 APC-활성화 성질을 결합시킬 수 있다.
요약한다면, 백신의 투여 형태는 다음을 포함하였다:
a) 몬타나이드를 이용하여 유상으로 만든 펩티드 백신의 피하 투여;
b) 성장 인자의 동시 투여에 의한 더 강한 면역 반응을 일으키기 위한 500 μl 몬타나이드를 이용하여 유상으로 만든 펩티드 백신과 225 μl GM-CSF의 국소 투여의 결합;
c) 500 μl 몬타나이드를 이용하여 유상으로 만든 펩티드 백신과 열로 인하여 더 강한 면역 반응을 유도하기 위한 국소 발열 요법을 사용한 피하 투여;
d) 500 μl 몬타나이드를 이용하여 유상으로 만든 펩티드 백신의 피하 투여및 TLR 7을 통한 수지상 세포의 활성화를 위한 피부 내 이미퀴모드의 사용의 결합;
e) TLR 7/8을 통한 수지상 세포의 활성화를 위한 500 μl 몬타나이드를 이용하여 유상으로 만든 펩티드 백신과 55 μl의 뮤신-1 mRNA/프로타민을 같이 피하 투여.
스케쥴
연구의 총 기간은 3년이었다. 전립선-특이적 펩티드 백신은 환자에게 0, 7, 14, 28, 42 및 56일 째에 투여되었다. 안정적 상태 또는 객관적인 종양 반응(PSA-CR 또는 PSA-PR)이 있는 환자에게는, 감지 가능한 진행이 있을 때까지 백신이 한달에 한번씩 피부 내 투여되었다. 지금까지의 경험에 기반하여, 펩티드 주사는 현저한 이상 반응이 없이 내약성을 보였다. 백신 치료의 반응이 완전히 PSA 측정에 의한 혈청적인 방법으로만 평가되었기 때문에, 연구 시작 시 백신의 투여가 PSA 측정 결과에 시험관내 상에서 영향을 미쳐 임상적 반응을 자극할 수 있는 지를 알아내기 위해 실험이 진행되었다. 0, 7, 14, 28, 42, 56 및 70일 째, 실험실 분석, PSA 수준, 감별혈구계산, 유세포 분석, 및 사이토카인 측정을 위해 혈액 샘플이 채취되었다. 만약에 치료가 70일 이상 지속되었다면, 치료 실패를 빠르게 감지하기 위해, 6주마다 PSA 모니터링이 실행되었다.
지속된 PSA 증가가 계속되는 질병의 진행이 기록되었다면 치료는 중단되었다.
84일 째 시작 시, 면역 치료는 4주 간격으로 기록된 진행이 있을 때까지 또는 420일(15달)까지 계속되었다. (성공적인 경우) 치료의 지속은 개별적으로 결정되었다. 이 연구에서 예상치 못한 이상 반응은 일어나지 않았다.
실험실 검사는 응고, 전해질, LDH, β2-M, CK, 간장 효소, 빌리루빈, 크레아티닌, 요산, 총단백질, 응고, CRP, 도말 표본 포함 감별혈구계산, PSA 수준, 사이토카인, FACS, Elispot을 포함한다.
정의된 박테리아와 균주 항원에 대한 피부 반응(투여 후 48-72 시간 후, 지연형 과민 반응(DTH), T 세포 조정) 분석은 연구 시작 전 환자의 세포 면역계 분석으로 사용될 것이다.
이 연구에 필요한 펩티드(9개 펩티드)는 에이치-지 람멘시 교수(Prof. H.-G. Rammensee)의 연구실의 스테판 스테바노빅 박사(PD Dr. Stefan Stevanovic)에 의해 제조되었다. 이 펩티드는 HPLC에 의해 정제되고, 질량 스펙트로미터에 의해 분석되었다. 펩티드의 순도는 HPLC, 질량 스펙트로미터, 및 Edman 서열에 의해서 확인되었다. 이 방법을 사용하여, 98%의 순도가 기록되었다(이 현재 방법에 의해서는 이 순도가 최고의 순도라고 간주되어야 한다). 합성된 펩티드는 DMSO(CryoSure, WAK Chemie Medical GmbH; 10 mg/ml)에 용해되고, Ampuwa와 1:10으로 희석되며(Fresenius Kabi), 무균 상태에서 나누어 담아졌다.
임상 반응
두 명의 환자의 직장 수지 검사에서 국소 종양이 감지된 후, PET-CT 스캔했을 때 국소 재발이 드러났다. 남아 있는 17명의 환자에서는 질병의 활동의 위치가 연구 종료때까지 확인되지 않았다.
반복된 실험 평가와 감별혈구계산 또는 광범위한 임상 화학 실험은 연구 내 어떠한 이상도 변화도 보여주지 않았다.
19명의 환자 중, 16명의 환자는 서바이빈 II(서열 식별 번호: 1에 따른 IFN-g ELISPOT, +/- ICS) 펩티드에 반응하였다. 이 중 12명의 환자는 백신 시 항-서바이빈 T 세포 반응 유도를 보였고, 2명의 환자에서는 이전에 존재하는 항-서바이빈 T 세포를 보였으며, 2명의 환자에서는 항-서바이빈 T 세포가 충분히 존재했는지가 결정되지 않았다.
생화학적 반응
초기 증가된 PSA 값 후 실험실에서 감지할 수 있는 가장 낮은, 감지 불가능한 PSA 값이 완전한 반응이라고 여겨졌다. 이 측정 값은 적어도 4주 후에 다시 확인되었다. PR > 80% 및 > 50% 는 4주 후에 다시 평가되어야 했다. PSA 50% 이하의 감소 또는 10% 이하의 증가는 4주 후에 다시 확인되었을 시 안정적인 상태라고 반영되었다. 10% 이상의 PSA 수준의 증가시 진행 상태로 간주되었다.
연구를 종료했던 환자의 생화학적 반응은 환자가 다음 국소 방사선 또는 항호르몬 치료를 받을 때까지 계속되었다. 19명의 환자들이 연구에 참여하기로 동의하였고, 데이터가 가장 길게는 3.75년까의 팔로우-업 기간 동안에 분석되었다.
PSA 안정 및 DT 증가
상기 언급된 생화학 반응 조건에 따를 때, 두 명의 환자의 PSA 값(10.2%)은 안정성을 나타내었고, 이는 연구 종료시 PSA 값이 연구 시작시의 값보다 10% 초과의 증가가 없는 것임을 나타낸다(도 6, 표 8, 9 및 10). 이 두 명의 환자의 추적 조사는 백신 투여 후 14개월 내지 16개월까지 진행되었다. 데이터 중단 시, 평균 안정적 상태 기간은 24개월(28 및 31)이었고, 평균 백신 수는 18이었다(14 및 20).
이 두 명의 환자 중 한 명의 환자는 9개월 동안 50% 이상의 부분 반응을 처음 보였고, 이 후 배가 시간이 백신 투여 전 9 개월에 비해 높은 20.5개월로 더딘 PSA 증가의 추세를 보였다. pT2pN0 글리슨 5 종양인 경우 최초 PSA 재발은 수술 후 18개월 후에 시작되었다.
환자 8의 데이터 분석은 28개월 전인 백신 시작 때부터 안정적인 상태를 보였다. 이 환자는 치료를 14번째 백신, 연구 시작 후 10개월 때 알러지 반응 때문에 중단하였다. 이 환자는 근치적 전립선 절제술 후 가장 낮은 PSA 수치가 0.6 ng/ml 보다 낮지 않은, 호의적이지 않은 pT3b 글리슨 3+4 상황이었고, PSA 진행이 수술 후 최초 감소 후, 적절히 지연되지 않았다. 배가 시간(doubling time)은 6.6 개월에서 148개월로 늦어졌다.
이 두 명의 환자는 각 펩티드 백신 영역에 피부 이미퀴모드를 적용하였다(도 9, 10, 및 11, 표 13).
PSA 안정성 없이 PSA DT 증가
환자 11의 PSA DT는 1.5개월부터 10.1개월로 연구 중 6개월 동안 증가되었다. PSA가 처음 10.8 ng/ml에서 17.8 ng/ml로 증가함에 따라 환자는 연구를 중단하고 PET-CT 스캔에서 악성의 종양이 시각화되지 않은 상태에서 항안드로젠 단독 요법을 받았다. 그는 알다라를 보조제로 받았다.
환자 16은 백신 치료와 뮤신-1-mRNA/프로타민을 배가 시간이 6.1 개월일 때 시작하였다. 반감기가 통계학적으로 계산된 PSA DT의 14.4개월로의 증가에 이어 2.7개월로 감소하였고, 이는 치료 시작 후 16개월 동안 계속되고 있다. 처음 PSA는 0.29 ng/ml였고, 이는 연구 시작 후 5개월 동안 0.19 ng/ml로 감소하였으며, 그 후 8개월 동안 0.4 ng/ml로 증가하였고, 치료 시작 후 19개월에 0.41 ng/ml로서 연구가 중단되었다(도 7, 표 8 및 10).
PSA 진행
환자 5는 연구 기간 동안에 백신 전 추정된 PSA 배가 시간에 따라 진행되었다. 그러나, 그는 치료 중단 후 10개월 동안(데이터 중단 시간) 반감기가 20.2개월로 PSA 감소를 경험하였다. 그는 백신 중단 후 다른 어떤 치료도 받고 있지 않다. 그는 몬타나이드를 단 하나의 보조제로서 백신을 맞았다(도 8, 표 13).
PSA 배가 시간(개월)
총 % 기하 평균 DT 범위
백신 전 PSA DT (개월) 19 8.3 1.5 - 44.8
연구 중단 시 또는 추적조사 종료 시 PSA DT 18* 11.2 2.2 -148
백신 중 PSA DT의 무변화 11 58 2.2 - 44.8
연구 종료 시 계속되는 PSA DT 증가 4 21
백신 중 PSA DT 무변화 및 백신 후 감소 1 5
중간 PSA 감소 또는 DT 감소 후 DT 증가 3 16
*연구 종료 또는 추적 조사 종료 시 환자 5에 대한 PSA DT는 PSA 감소에 의해 이 데이터에 포함되지 않았다.
기준선 PSA로부터 10%를 초과하여 증가하지 않은 PSA 안정성
PSA 기준선
ng/ml 		PSA 연구 종료시
ng/ml 		PSA 추적조사 종료 시
ng/ml 		개월 기준선 후
환자 3 0.7 0.51 0.73 31
환자 8 1.76 1.84 1.85 28
백신 도중 PSA DT(개월)의 영구 증가
1 th DT 백신 전 (개월) 2 th DT 백신 중 (개월) 3 th DT 백신 중 (개월)
환자 3 9.8 - 2.3 20.5
환자 8 6.6 148
환자 11 1.5 10.1
환자 16 6.1 -2.7 14.4
기하 평균 DT 4.9 25.8
백신 중 PSA DT(개월) 변화는 없지만 백신 후 감소
1 th DT 백신 전 (개월) 2 th DT 백신 중 (개월)
환자 5 3.2 - 20.2
중간 PSA DT 감소/안정성(개월) 후 가속 증가
1 th DT 백신 전 (개월) 2 th DT 백신 중 (개월) 3 th DT 백신 중 (개월) 4 th DT 백신 중 (개월)
환자 7 3.7 21.5 2.8
환자 15 1.3 25.8 -9.9 7.4
환자 17 10.2 -1.9 4.8
보조제 및 환자 반응. PSA 무반응(-), 중간 PSA 감소 및 (+/-) 후 가속 증가, PSA DT 증가(+)
보조제 없음
반응		 알다라
반응		 이상고열
반응		 GmCSF
반응		 RNA
반응
환자 1 - 환자 3 + 환자 13 - 환자 4 - 환자 16 +
환자 2 - 환자 7 +/- 환자 10 - 환자 6 - 환자 17 +/-
환자 5 - 환자 8 + 환자 12 - 환자 18 -
환자 9 - 환자 11 + 환자 14 - 환자 19 -
환자 15 +/-
합성
Abimed에서 생산된 EPS221 펩티드 합성기에서 완전히 자동으로 펩티드가 합성되었다. 합성 프로그램은 생산자의 기본 프로토콜을 따른다. 가능한 한, 각 펩티드에 대한 시약 벳치의 시약 뱃치 넘버는 등록된다.
미가공 펩티드의 처리
미가공된 펩티드의 처리는 합성 수지를 분리시키고 측쇄의 보호기를 TFA/페놀/에탄 디티올/티오아니솔/물(90/3.75/1.25/2.5/2.5, 각각 부피 퍼센트)에 의해 1시간 또는 3시간 동안 방출시키는 것에 의해 수행된다(아르기닌을 갖는 펩티드). 미가공 펩티드의 메틸-3급-부틸에테르에의 침전, 메틸-3급-부틸에테르로 세정 및 디에틸에테르로 2회 세척, 건조, 펩티드 펠렛을 아세트산에 용해시키는 단계. 디에틸에테르에서 다시 침전, 건조, 물에서 현탁, 및 동결건조.
HPLC 준비
HPLC 시스템 Varian "Star," 크로마토그래피 컬럼 250 x 10 mm C18 5 μm(Manufacturer Ziemer). 이동 용매 A: 0.1% TFA를 포함한 물, 이동 용매 B: 0.08% TFA를 포함한 아세토니트릴. 펩티드의 소수성에 의해 분리를 위해 사용되는 구배의 방향이 정해졌다. 분리된 펩티드 단편은 동결건조되었다.
분석
각 펩티드에 대해, HPLC 크로마토그램 및 MALDI 질량 스펙트럼이 동일성(질량 스펙트럼의 몰 질량을 통해) 및 순도(HPLC 크로마토그램의 최고점 부분을 통해)를 증명하기 위해 기록되었다.
합성된 펩티드 및 자극
합성 펩티드는 자극을 위해 사용되었고, 기능적인 실험을 위해 사용된 것은 HIV-유래 에피토프이다(HIV gag 164-181: YVDRFYKTLRAEQASQEV(서열 식별 번호: 65), 음성 대조군), PSMA 459-473: NYTLRVDCTPLMYSL(서열 식별 번호: 64) 및 서바이빈 97-111: TLGEFLKLDRERAKN(서열 식별 번호: 1). 스타필로코커스(Staphylococcus) 엔테로톡시 B(SEB, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany)가 인터페론-γ ELISPOT에서 CD4+ T 세포에 대한 양성 대조군 자극으로서 사용되었다.
시험관내 상의 특이적 T 세포 증폭
전립선암 환자로부터 말초 혈액 단핵 세포가 각각 백신 중 다른 시간 지점에서 획득되고, 액체 질소 중 90% 태아 우혈청 및 10% DMSO에서 동결 보존되었다. 해동시킨 후, 약 5 x 106의 세포가 50U/ml 페니실린, 50 μg/ml 스트렙토마이신(all Biowhittaker, Verviers, Belgium), 10% 열비동화 인간 혈청(c.c. pro, Neustadt, Germany) 및 50μM 베타- 머캅토에탄올을 포함한 IMDM 배지에서 37℃와 7.5% 이산화탄소에서 배양되었다(24-well cell culture plate, Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany). 풀링된 합성 HLA-클래스 II 결합 펩티드는 1일째에 각각 5 μg/ml로 추가되었고, 배양은 재조합형 인간 IL-2(r-hIL2, R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Germany)로 T 세포 자극 2, 5, 7 및 9일 째에 보충되었다.
효소 연결된 면역흡수제 스팟 분석(ELISPOT)
확장된 T 세포의 기능은 표준 인터페론-γ ELISPOT 분석으로 CIMT 모니터링 판넬(www.c-imt.org)의 추천 방법에 따라 시험되었다. 간단하게, 세포는 배양 후 12일째에 수확되고, 세정되고, 계수되고, ELISPOT 접시 위의 배양기에 뿌려지게 된다(Millipore, Schwalbach, Germany). 0.15 내지 0.25 x 106 사이의 세포가 2.5 μg/ml의 합성 펩티드 또는 1 μg/ml의 SEB 존재 하에, 두차례, 세차례 실험되었다. IFN-γ의 제조는 특이적 단일 클론 항체 한 쌍에 의해 37℃ 및 5%의 이산화탄소에서 26시간 배양후 감지되었다(1D1-k and 7-B6-1, 모두 Mabtech, Nacka Strand, Sweden). 엑스트라아비딘-알칼리성 포스파타제 및 BCIP/NBT 기질(모두 시그마-알드리치)이 각 한시간 및 10분에 추가되었다. ELISPOT 분석이 이뮤노스팟 판독기(Series 3A and 5, Cellular Technology Ltd, Aalen, Germany)를 사용하여 실행되었다.
세포내 사이토카인 염색
ELISPOT로부터 회수된 세포는 2 ng/ml r-hIL2의 존재하에 9일 동안 더 배양되었다. 이러한 재자극 기간 후, 작동체는 수확되고, 세정되고, 제조자의 프로토콜에 따라 Golgi-STOP(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)이 존재하는 가운데, 5 μg/ml의 펩티드 또는 PMA 및 이오노마이신(각각, 50ng/ml 및 1μM)으로 표준 분석으로 자극되었다. 6시간의 배양 기간 후에, 세포는 PBS 1%FCS 0.02% NaN3로 세정되고, 단일 클론 항체(MoAb) CD4-APC-Cy7(BD Biosciences) 및 CD8-PE-Cy7(Beckman Coulter) 에 의해 20분 동안 4℃ 어두운 곳에서 염색되었다. 세정 단계 후, 세포는 투과할 수 있도록 20분 동안 Cytofix/Cytoperm 시약(BD Biosciences)을 사용하여 만들어진 후 세포내 사이토카인 염색이 30분 동안 이루어졌다. 사용된 단일 클론 항체는 IFN-γ-FITC, IL-10-PE(모두 BD Biosciences), IL-5-APC(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) 및 TNF-α-Pacific Blue(Biolegend, San Diego, CA)였다. 세포 획득은 소프트웨어 디바(Diva) 및 플로우조(FlowJo)(BD Biosciences)를 사용한 분석을 통해 세포측정기 칸토(Cytometer Canto) II에서 실행되었다.
실시예 5
BIR-11, BIR-12 및 BIR-13의 HLA-A*0211와의 결합
이 분석의 목적은 C-말단 아스파라긴 잔기와 펩티드의 결합 능력이 있다고 보고된 HLA-A*0211 대립유전자로 암호화된 MHC 분자에 대한 BIR-004(ELTLGEFLKLDRERAKN(서열 식별 번호: 2)) C-말단 펩티드의 친화도를 평가하기 위한 것이었다. C-말단 N을 가지고 있는 MHC 리간드는 빈번하게 발견되지 않았고 우리는 단지 66개의 C-말단에 N을 가지고 있는 펩티드만 실험했다. 이 중의 대부분이 비결합체였으나, 몇몇의 제외가 있었다: RLYNFSFLN(서열 식별 번호: 66)은 A*0211에 강하게 결합했고, YADGGQWYN(서열 식별 번호: 67)은 또한 A*0211..."에 결합하였다).
이 실험은 명백하게 BIR-11(C-말단 구량체: KLDRERAKN(서열 식별 번호: 68)) 및 BIR-13(C-말단 십량체: LKLDRERAKN(서열 식별 번호: 69))이 높은 농도에서 HLA-A*0211과 결합을 한다는 것을 보여주었으나, BIR-12(C-말단 팔량체: LDRERAKN(서열 식별 번호: 70))는 그렇지 않다는 것을 보여주었다. 양성 대조군 펩티드(서열: FLPSDYFPSV(서열 식별 번호: 71))는 명백한 결합 성질을 보였다.
시험의 원리
분석이 다음과 같이 설정되었다: 3개의 분자로 이루어진 안정한 HLA/펩티드 복합체: HLA 중쇄, 베타-2 마이크로글로불린(b2m) 및 펩티드 리간드. 변성된 재조합 HLA-A*0211 중쇄 분자 단독의 활성은 이들의 기능적으로 동등한 "빈 HLA-A*0211 분자"를 제조함으로써 보존될 수 있다. b2m 및 적당한 펩티드를 가지고 있는 수성 완충제에 희석하였을 때, 이 분자는 빠르고 효율적으로 완전히 펩티드 의존 방식으로 접히게 된다. 이러한 분자의 이용성은 ELISA-기반 분석에서 펩티드와 HLA 클래스 I 분자 간의 상호작용의 친화도를 측정하는 데 사용된다{Sylvester-Hvid, 2002 SYLVESTERHVID2002 /id}.
정제된 재조합 HLA-A*0211 분자는 b2m과 등급이 정해진 관심이 있는 펩티드의 양과 함께 배양된다. 새로운 상태에서 접혀진 HLA/펩티드 복합체의 양은 정량적 ELISA에 의해 결정된다. 해리 상수(KD 값)는 검량선용 HLA/펩티드 복합체의 희석으로부터 기록된 기본 곡선을 사용하여 계산된다. 측정에서 편차값이 너무 커 믿을 수 있는 KD 값을 찾을 수 없었지만, BIR13에 대한 KD 값은 양성 대조군의 범위 안에 있고, BIR-11에 대한 KD 값은 더 높았다고 할 수 있다. 더 낮은 KD는 HLA-A*0211에 대한 더 높은 친화도를 나타낸다.
SYFPEITHI를 사용한 구량체 BIR-11 및 구량체 BIR-11a와 몇몇의 대립유전자의 결합 점수
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참조 문헌
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SEQUENCE LISTING <110> Immatics biotechnologies GmbH <120> Novel and powerful MHC-Class II peptides derived from survivin <130> I31383PCT <140> PCT/EP2009/003447 <141> 2009-05-14 <150> EP08008944.4 <151> 2008-05-14 <150> US61/053,182 <151> 2008-05-14 <160> 72 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn 1 5 10 15 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys 1 5 10 15 Asn <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asp 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Lys Leu Tyr Gly Lys Arg Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Val Met Ala Gly Asp Ile Tyr Ser Val 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Val Ala Ser Thr Ile Thr Gly Val 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Leu Ala Asp Gly Val Gln Lys Val 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Leu Leu Gly Ala Thr Cys Met Phe Val 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ser Val Phe Ala Gly Val Val Gly Val 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ala Leu Phe Asp Gly Asp Pro His Leu 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Leu Ala Ala Leu Pro His Ser Cys Leu 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ala Leu Ser Asn Leu Glu Val Thr Leu 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ile Leu Ala Pro Val Ile Leu Tyr Ile 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ile Leu Asp Gln Lys Ile Asn Glu Val 1 5 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Lys Leu Met Asp Leu Asp Val Glu Gln Leu 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ala Leu Phe Val Arg Leu Leu Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Lys Ile Phe Asp Glu Ile Leu Val Asn Ala 1 5 10 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Thr Pro Pro Ile Asp Ala His Thr Arg Asn Leu Leu Arg Asn His 1 5 10 15 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr 1 5 10 15 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Val Leu Cys Gly Pro Pro Pro Ala Val 1 5 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys 1 5 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile 1 5 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn 1 5 10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Ala Ala Ala Thr Pro Glu 1 5 10 15 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Glu Ala Gly Phe Ile His Ala Pro Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp 1 5 10 15 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe 1 5 10 15 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp 1 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys 1 5 10 15 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala Cys Thr Pro Glu 1 5 10 15 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile 1 5 10 15 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn 1 5 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His 1 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys 1 5 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Glu Lys Val Arg Arg Ala Ile 1 5 10 15 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Ala Glu Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp 1 5 10 15 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His 1 5 10 15 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly 1 5 10 15 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Leu Glu Gly Cys Ala Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu 1 5 10 15 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu 1 5 10 15 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr 1 5 10 15 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys 1 5 10 15 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr 1 5 10 15 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp 1 5 10 15 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala 1 5 10 15 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala Cys 1 5 10 15 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro 1 5 10 15 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg 1 5 <210> 62 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys 1 5 10 <210> 63 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys 1 5 10 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Asn Tyr Thr Leu Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu 1 5 10 15 <210> 65 <211> 18 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 65 Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln 1 5 10 15 Glu Val <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Phe Leu Asn 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Tyr Ala Asp Gly Gly Gln Trp Tyr Asn 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn 1 5 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn 1 5 10 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn 1 5 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Phe Leu Pro Ser Asp Tyr Phe Pro Ser Val 1 5 10 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asp 1 5

Claims (17)

  1. 서열 식별 번호: 1 내지 서열 식별 번호: 3 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열로 구성된 펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩티드가 CD4 T 세포를 자극시킬 수 있는, 펩티드.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩티드가, HLA-DR 항원-관련 불변 쇄(Ii)의 N-말단 아미노산을 포함하는 융합 단백질의 일부인, 펩티드.
  6. 제 1 항에 따른 펩티드를 암호화하는 핵산.
  7. 제 6 항에 따른 핵산을 발현시킬 수 있는 발현 벡터.
  8. 제 7 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  9. 제 8 항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포 또는 이의 배양 배지로부터 펩티드를 단리하는 단계를 포함하는, 제 1 항에 따른 펩티드의 제조 방법.
  10. 시험관 내에서 세포독성 T 림프구(CTL)를, 항원 특이적 방식으로 CTL을 활성화시키기에 충분한 시간 동안 적합한 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포를 모방(mimicking)하는 인공 구성체(construct)의 표면에 발현된 항원 로딩된 인간 클래스 I MHC 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 활성화된 CTL의 시험관내 제조 방법으로서, 상기 항원이 제 1 항에 따른 펩티드인, 제조 방법.
  11. 제 1 항에 따른 펩티드, 제 6 항에 따른 핵산, 제 7 항에 따른 발현 벡터, 제 8 항에 따른 숙주 세포 또는 제 10 항에 따른 제조 방법에 따라 제조된 활성화된 CTL을 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 암이 성상세포종, 모양세포성 성상세포종, 이형성 배아성 신경상피종, 희소돌기아교세포종, 뇌실막종, 다형성 아교모세포종, 혼합 신경 교종, 희소돌기성상세포종, 수모세포종, 망막모세포종, 신경모세포종, 배아종, 기형종, 신경절신경아교종, 신경절세포종, 중추신경절세포종, 원시 신경외배엽 종양(PNET), 송과체 실질의 종양, 뇌실막 세포 종양, 맥락막총 종양, 불특정 기원의 신경상피 종양, 아교모세포종 전립선 종양, 유방암, 식도암, 결장암, 대장암, 신장 세포 선암, 투명세포 신장세포 선암, 폐암, 중추신경계(CNS)암, 난소암, 흑색종 췌장암, 편평 세포 선암, 백혈병 및 수모세포종, 및 서바이빈 또는 뉴로칸(Neurocan)의 과다발현을 보이는 기타 종양 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
  13. 제 11 항에 있어서,
    신장 암의 치료를 위해 서열 식별 번호: 4 내지 13 및 24에 따른 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드와 병용되거나, 또는 결장암의 치료를 위해 서열 식별 번호: 4, 8, 11, 12 및 15 내지 24에 따른 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드와 병용되는, 약학 조성물.
  14. (a) 제 11 항에 따른 약학 조성물을 용액 또는 동결건조된 형태로 함유하는 용기;
    (b) 선택적으로, 동결건조된 제형을 위한 희석제 또는 재구성액을 함유하는 제 2 용기;
    (c) 선택적으로, 서열 식별 번호: 4 내지 24에 따른 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드, 및
    (d) 선택적으로, 용액의 사용; 동결건조된 제형의 재구성 또는 사용; 또는 이들 모두를 위한 지침
    을 포함하는 키트.
  15. 서열 식별 번호: 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 펩티드에 대해 특이적인 항체로서, 다클론 항체, 단클론 항체, 키메라 항체, 및 항원 결합 부위를 포함하는 이들의 단편으로부터 선택되는 것인, 항체.
  16. 제 8 항에 있어서,
    상기 숙주 세포가 수지상 세포 또는 항원 제시 세포인, 숙주 세포.
  17. 제 11 항에 있어서,
    상기 약학 조성물이 백신인, 약학 조성물.
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Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012079878A2 (en) * 2010-12-14 2012-06-21 Immatics Biotechnologies Gmbh Hla-binding peptides derived from prostate-associated antigenic molecules and methods of use thereof
WO2006023598A2 (en) 2004-08-19 2006-03-02 University Of Maryland, Baltimore Prostate-specific antigen-derived mhc class ii-restricted peptides and their use in vaccines to treat or prevent prostate cancer
PT2567707T (pt) * 2007-07-27 2016-12-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Composição de péptidos associados a tumores e vacina anticancro relacionada
EP2113253B1 (en) * 2008-04-30 2010-03-31 Immatics Biotechnologies GmbH Novel formulations of tumour-associated peptides binding to human leukocyte antigen (HLA) class I or II molecules for vaccines
SI2119726T2 (en) † 2008-05-14 2018-03-30 Immatics Biotechnologies Gmbh New and powerful Class II MHC peptides derived from survivin and neurocane
MX337432B (es) 2009-12-15 2016-03-04 Ascendis Pharma As Composicion de la hormona del crecimiento seca enlazada transitoriamente a un portador del polimero.
FR2955112B1 (fr) 2010-01-14 2012-01-20 Isp Investments Inc Nouveaux peptides anti-age modulateurs de la survivine et compositions les comprenant
GB201004575D0 (en) 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh Composition of tumor associated peptides and related anti cancer vaccine for the treatment of gastric cancer and other cancers
GB201009222D0 (en) * 2010-06-02 2010-07-21 Immatics Biotechnologies Gmbh Improved cancer therapy based on tumour associated antigens derived from cyclin D1
US9109007B2 (en) 2010-08-18 2015-08-18 Purdue Pharma L.P. MHC-I restricted epitopes containing non-natural amino acid residues
CN102181401B (zh) * 2011-02-01 2013-04-24 北京市肿瘤防治研究所 存活素酶联免疫试剂盒及其应用
KR20140100419A (ko) * 2013-02-05 2014-08-14 닛토덴코 가부시키가이샤 경피 투여용 ｗｔ1 펩티드 암 백신 조성물
DE102013012432A1 (de) * 2013-07-29 2015-01-29 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Immuntherapie von Prostatakrebs
WO2015066057A2 (en) * 2013-10-28 2015-05-07 Baylor College Of Medicine Expansion of cmv-specific t cells from cmv-seronegative donors
GB201319446D0 (en) 2013-11-04 2013-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors
GB201321242D0 (en) * 2013-12-02 2014-01-15 Immune Targeting Systems Its Ltd Immunogenic compound
GB201504502D0 (en) * 2015-03-17 2015-04-29 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against pancreatic cancer and other cancers
ES2952959T3 (es) * 2015-03-27 2023-11-07 Immatics Biotechnologies Gmbh Nuevos péptidos y nuevas combinaciones de péptidos para el uso en la inmunoterapia contra diversos tumores (SEQ ID N.º 25 - MXRA5-003)
GB201505305D0 (en) 2015-03-27 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors
NL2014935B1 (en) 2015-06-08 2017-02-03 Applied Immune Tech Ltd T cell receptor like antibodies having fine specificity.
EP3919507A3 (en) * 2015-07-01 2022-01-12 Immatics Biotechnologies GmbH Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
MY189596A (en) * 2015-07-15 2022-02-18 Immatics Biotechnologies Gmbh A novel peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers
GB201513921D0 (en) * 2015-08-05 2015-09-23 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against prostate cancer and other cancers
MY198087A (en) * 2015-10-05 2023-07-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against small cell lung cancer and other cancers
GB201521746D0 (en) * 2015-12-10 2016-01-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against CLL and other cancers
MY196837A (en) * 2015-12-11 2023-05-03 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various cancers
KR20180107102A (ko) 2015-12-16 2018-10-01 그릿스톤 온콜로지, 인코포레이티드 신생항원 동정, 제조, 및 용도
GB201522667D0 (en) 2015-12-22 2016-02-03 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against breast cancer and other cancers
SG10202111399YA (en) 2015-12-22 2021-11-29 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against breast cancer and other cancers
GB201604458D0 (en) * 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against cancers
GB201604755D0 (en) * 2016-03-21 2016-05-04 Vaxeal Res Sas Immunogenic compositions
GB201609193D0 (en) * 2016-05-25 2016-07-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides, combination of peptides as targets for use in immunotherapy against gallbladder cancer and cholangiocarcinoma and other cancers
MA45491A (fr) * 2016-06-27 2019-05-01 Juno Therapeutics Inc Épitopes à restriction cmh-e, molécules de liaison et procédés et utilisations associés
AU2017290119A1 (en) * 2016-06-28 2019-01-24 Geneius Biotechnology, Inc. T cell compositions for immunotherapy
IL265479B (en) 2016-09-21 2022-09-01 Amal Therapeutics Sa A fusion containing a cell-penetrating peptide, a multiple epitope, and a peptide tlr agonist for cancer therapy
EP4317432A3 (en) 2016-12-08 2024-04-17 Immatics Biotechnologies GmbH T cell receptors with improved pairing
DE102016123893A1 (de) 2016-12-08 2018-06-14 Immatics Biotechnologies Gmbh T-Zellrezeptoren mit verbesserter Bindung
US10738100B2 (en) 2017-01-27 2020-08-11 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
CR20210128A (es) 2017-01-27 2021-04-26 Immatics Biotechnologies Gmbh Nuevos péptidos y nuevas combinaciones de péptidos para el uso en la inmunoterapia contra el cáncer de ovario y otros tipos de cancer (divisional exp. 2019-388)
CA3054861A1 (en) 2017-03-03 2018-09-07 Treos Bio Zrt Peptide vaccines
WO2019007974A1 (en) * 2017-07-07 2019-01-10 Immatics Biotechnologies Gmbh NOVEL PEPTIDES AND COMBINATION OF PEPTIDES FOR USE IN IMMUNOTHERAPY OF LUNG CANCER, INCLUDING NSCLC, CPPC AND OTHER CANCERS
US20200256877A1 (en) 2017-10-09 2020-08-13 Enterome S.A. Microbiota Sequence Variants Of Tumor-Related Antigenic Epitopes
KR20200087143A (ko) 2017-10-10 2020-07-20 그릿스톤 온콜로지, 인코포레이티드 핫스팟을 이용한 신생항원 동정
AU2018373154A1 (en) 2017-11-22 2020-07-02 Gritstone Bio, Inc. Reducing junction epitope presentation for neoantigens
DE102018107224A1 (de) * 2018-02-21 2019-08-22 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptide und Kombinationen von Peptiden nicht-kanonischen Ursprungs zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten
SI3773689T1 (sl) 2018-04-11 2023-02-28 Enterome S.A. Antigenski peptidi za preprečevanje in zdravljenje raka
US20210106652A1 (en) 2018-04-11 2021-04-15 Enterome S.A. Immunogenic Compounds For Treatment Of Fibrosis, Autoimmune Diseases And Inflammation
JP2021523945A (ja) * 2018-05-15 2021-09-09 インテルク ペプチド セラピューティクス リミテッド 活性化剤
US11912789B2 (en) * 2018-05-15 2024-02-27 Interk Peptide Therapeutics Limited Peptide activating agent
CN113329761A (zh) 2018-09-04 2021-08-31 特雷斯生物有限公司 肽疫苗
US20230105457A1 (en) 2019-10-16 2023-04-06 Enterome S.A. Immunogenic Compounds For Treatment Of Adrenal Cancer
LT4021487T (lt) 2019-11-15 2024-02-12 Enterome S.A. Antigeniniai peptidai, skirti b-ląstelių piktybinių navikų prevencijai ir gydymui
IL296881A (en) * 2020-04-14 2022-12-01 Universit? De Montr?Al New antigens specific for acute myeloid leukemia (aml) and their uses
KR20240004764A (ko) 2021-04-30 2024-01-11 칼리버 임뮤노쎄라퓨틱스, 인크. 변형된 mhc 발현을 위한 종양용해성 바이러스
WO2023021056A1 (en) * 2021-08-17 2023-02-23 Intomics A/S Vaccine design pipeline
WO2023187127A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Enterome S.A. Antigenic peptides for prevention and treatment of cancer

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007039192A2 (en) 2005-09-27 2007-04-12 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4440859A (en) 1977-05-27 1984-04-03 The Regents Of The University Of California Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
NZ192465A (en) 1978-12-22 1983-09-30 Biogen Nv Recombinant dna molecule comprising gene coding for polypeptide displaying hbv (hepatitis b virus) antigenicity usesthereof
US4530901A (en) 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US4342566A (en) 1980-02-22 1982-08-03 Scripps Clinic & Research Foundation Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes
US4678751A (en) 1981-09-25 1987-07-07 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
US4766075A (en) 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US4582800A (en) 1982-07-12 1986-04-15 Hoffmann-La Roche Inc. Novel vectors and method for controlling interferon expression
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4677063A (en) 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
US4772547A (en) * 1986-02-03 1988-09-20 Hoffmann-La Roche Inc. HTLV-III envelope peptides
US4897445A (en) 1986-06-27 1990-01-30 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Method for synthesizing a peptide containing a non-peptide bond
US5057540A (en) * 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
ES2108460T3 (es) 1993-06-03 1997-12-16 Therapeutic Antibodies Inc Fragmentos de anticuerpos en terapeutica.
AUPM322393A0 (en) 1993-12-24 1994-01-27 Austin Research Institute, The Mucin carbohydrate compounds and their use in immunotherapy
AU1394497A (en) 1996-01-17 1997-08-11 Imperial College Innovations Limited Immunotherapy using cytotoxic t lymphocytes (ctl)
US5849589A (en) 1996-03-11 1998-12-15 Duke University Culturing monocytes with IL-4, TNF-α and GM-CSF TO induce differentiation to dendric cells
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6420518B1 (en) * 1997-04-04 2002-07-16 Genetech, Inc. Insulin-like growth factor agonist molecules
US6255055B1 (en) * 1998-03-09 2001-07-03 Wisconsin Alumni Research Foundation c-myc coding region determinant-binding protein (CRD-BP) and its nucleic acid sequence
US6274362B1 (en) * 1999-02-04 2001-08-14 Millennium Pharmaceuticals, Inc. RGS-containing molecules and uses thereof
US20040191260A1 (en) 2003-03-26 2004-09-30 Technion Research & Development Foundation Ltd. Compositions capable of specifically binding particular human antigen presenting molecule/pathogen-derived antigen complexes and uses thereof
EP1294748B1 (en) 2000-03-27 2010-06-30 Technion Research and Development of Foundation, Ltd. Single chain class i major histo-compatibility complexes, constructs encoding same and methods of generating same
EP1300418A1 (en) * 2001-10-04 2003-04-09 Erasmus Universiteit Rotterdam Gene regulation by oligopeptides
WO2003042661A2 (en) * 2001-11-13 2003-05-22 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
EP1459537A1 (en) 2001-12-13 2004-09-22 Koninklijke Philips Electronics N.V. Recommending media content on a media system
US7892559B2 (en) * 2002-01-30 2011-02-22 Survac Aps Survivin-derived peptides and use thereof
US6992176B2 (en) 2002-02-13 2006-01-31 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibody having a T-cell receptor-like specificity, yet higher affinity, and the use of same in the detection and treatment of cancer, viral infection and autoimmune disease
AU2003216341A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Dyax Corporation Mhc-peptide complex binding ligands
DE10225144A1 (de) 2002-05-29 2003-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh An MHC-Moleküle bindende Tumor-assoziierte Peptide
US20040180354A1 (en) * 2002-09-06 2004-09-16 Simard John J.L. Epitope sequences
US7468254B2 (en) * 2003-01-21 2008-12-23 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of MCSP
JP2007519910A (ja) * 2004-01-28 2007-07-19 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 腫瘍関連ペプチドの同定および定量方法
DE102004026135A1 (de) * 2004-05-25 2006-01-05 Immatics Biotechnologies Gmbh An MHC-Moleküle bindende Tumor-assoziierte Peptide
WO2006023598A2 (en) * 2004-08-19 2006-03-02 University Of Maryland, Baltimore Prostate-specific antigen-derived mhc class ii-restricted peptides and their use in vaccines to treat or prevent prostate cancer
PL1806358T3 (pl) 2005-09-05 2010-08-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptydy towarzyszące nowotworom, wiążące się swobodnie z cząsteczkami ludzkich antygenów leukocytarnych (HLA) klasy II
EP1760089B1 (en) 2005-09-05 2009-08-19 Immatics Biotechnologies GmbH Tumor-associated peptides binding to human leukocyte antigen (HLA) class I or II molecules and related anti-cancer vaccine
FR2891462B1 (fr) * 2005-09-30 2009-10-16 Commissariat Energie Atomique Epitopes t cd4+ de la survivine et leurs applications
EP1945263A4 (en) † 2005-11-09 2012-09-26 Ontherix Inc THERAPEUTIC PEPTIDES BINDING TO METALS
PT2567707T (pt) * 2007-07-27 2016-12-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Composição de péptidos associados a tumores e vacina anticancro relacionada
EP2113253B1 (en) * 2008-04-30 2010-03-31 Immatics Biotechnologies GmbH Novel formulations of tumour-associated peptides binding to human leukocyte antigen (HLA) class I or II molecules for vaccines
SI2119726T2 (en) * 2008-05-14 2018-03-30 Immatics Biotechnologies Gmbh New and powerful Class II MHC peptides derived from survivin and neurocane
PL2172211T3 (pl) * 2008-10-01 2015-05-29 Immatics Biotechnologies Gmbh Kompozycja związanych z guzem peptydów i związana z tym szczepionka przeciwrakowa do leczenia glejaka (GBM) i innych rodzajów raka

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007039192A2 (en) 2005-09-27 2007-04-12 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens

Also Published As

Publication number Publication date
HUE028102T2 (en) 2016-11-28
PT2119726E (pt) 2015-03-30
CY1115999T1 (el) 2017-01-25
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US20130323272A1 (en) 2013-12-05
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EP2291395A1 (en) 2011-03-09
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US10434136B2 (en) 2019-10-08
US9498512B2 (en) 2016-11-22
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UA103481C2 (ru) 2013-10-25
ES2549088T3 (es) 2015-10-22
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US20100029571A1 (en) 2010-02-04
PL2291395T3 (pl) 2016-01-29
HRP20150300T4 (hr) 2018-03-09
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AU2009248413A1 (en) 2009-11-19
BRPI0912622A2 (pt) 2016-05-03
EP2291395B2 (en) 2018-11-14
NZ588605A (en) 2012-06-29
US11957729B2 (en) 2024-04-16
PL2119726T5 (pl) 2018-04-30
US20140086943A1 (en) 2014-03-27
HRP20151135T1 (hr) 2015-11-20
US8647629B2 (en) 2014-02-11
PL2119726T3 (pl) 2015-05-29
EP2899206A1 (en) 2015-07-29
SI2291395T1 (sl) 2015-10-30
CA2724198A1 (en) 2009-11-19
DK2119726T3 (en) 2015-02-16
DK2291395T3 (da) 2015-09-21
CA2724198C (en) 2016-03-22
ES2532896T3 (es) 2015-04-01
HUE024541T2 (hu) 2016-01-28
ES2532896T5 (es) 2018-03-20
US20200078439A1 (en) 2020-03-12
KR20110021881A (ko) 2011-03-04
EP2119726B1 (en) 2014-12-24
CN102027006A (zh) 2011-04-20
JP5663473B2 (ja) 2015-02-04
SI2119726T1 (sl) 2015-05-29
KR20130041375A (ko) 2013-04-24
DK2119726T5 (en) 2018-03-26
WO2009138236A1 (en) 2009-11-19
MX2010012443A (es) 2010-12-20
EP2291395B1 (en) 2015-08-12

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Class et al. Patent application title: NOVEL AND POWERFUL MHC-CLASS II PEPTIDES DERIVED FROM SURVIVIN Inventors: Hans Georg Rammensee (Tuebingen, DE) Hans Georg Rammensee (Tuebingen, DE) Stefan Stevanovic (Tuebingen, DE) Stefan Stevanovic (Tuebingen, DE) Cecile Gouttefanges (Tuebingen, DE) Toni Weinschenk (Aichwald, DE) Peter Lewandrowski (Tubingen-Unterjesingen, DE) Assignees: IMMATICS BIOTECHNOLOGIES GMBH

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