ES2549088T5

ES2549088T5 - Nuevos y potentes péptidos del MHC de clase II derivados de la survivina

Info

Publication number: ES2549088T5
Application number: ES09745570T
Authority: ES
Inventors: Stefan Stevanovic; Cécile Gouttefanges; Hans-Georg Rammensee; Toni Weinschenk; Peter Lewandrowski
Original assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Current assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date: 2008-05-14
Filing date: 2009-05-14
Publication date: 2019-04-29
Anticipated expiration: 2029-05-14
Also published as: CA2724198A1; PL2119726T3; US9498512B2; RS53872B2; US20130323272A1; PT2291395E; DK2291395T4; US10434136B2; CA2724198C; EA201071297A1; BR122019014468B8; ES2532896T5; EP2899206A1; NZ588605A; US8647629B2; EA019603B1; BRPI0912622A2; WO2009138236A1; CY1115999T1; KR20130041375A

Description

DESCRIPCION

Nuevos y potentes peptidos del MHC de clase II derivados de la survivina

La presente invencion se refiere a peptidos, acidos nucleicos y celulas destinados a la utilizacion en metodos inmunoterapeuticos. En particular, la presente invencion se refiere a la inmunoterapia contra el cancer. La presente invencion se refiere asimismo a epttopos peptidicos para linfocitos T citotoxicos (CTL) asociados a tumores y derivados de la survivina, solos o en combinacion con otros peptidos asociados a tumores que pueden servir como principios activos farmaceuticos en composiciones vacunales destinadas a estimular respuestas inmunitarias antitumorales. La presente invencion se refiere espedficamente a una nueva secuencia peptfdica derivada de moleculas HLA de clase II de celulas tumorales humanas que puede ser utilizada en composiciones vacunales para desencadenar respuestas inmunitarias antitumorales.

Antecedentes de la invencion

Los gliomas son tumores cerebrales originados en las celulas gliales del sistema nervioso. Las celulas gliales, llamadas por lo comun neuroglia o simplemente glfa, son celulas no neuronales que proporcionan soporte y nutricion, mantienen la homeostasia, forman la mielina e intervienen en la transmision de senales en el sistema nervioso. Los dos tipos mas importantes de glioma son el astrocitoma y el oligodendroglioma, llamados asf por el tipo de celula glial que los origina, esto es, astrocitos y oligodendrocitos. En el grupo de los astrocitomas se encuentra el glioblastoma multiforme (denominado en lo sucesivo glioblastoma) que es el tumor cerebral maligno mas frecuente en adultos pues supone alrededor del 40% de los tumores cerebrales malignos y alrededor del 50% de los gliomas (CBTRUS, 2006). El glioblastoma invade con agresividad el sistema nervioso central y entre todos los gliomas es el que ostenta el nivel mas alto de malignidad (grado IV). Pese a los avances en el tratamiento logrados merced a mejoras en las tecnicas de neuroimagen, la microcirugfa y las opciones terapeuticas como la temozolomida o la radiacion, el glioblastoma sigue siendo incurable (Macdonald, 2001; Burton and Prados, 2000; Prados and Levin, 2000). La mortalidad causada por este tumor cerebral es muy alta: la esperanza de vida media se situa entre 9 y 12 meses desde el diagnostico. La supervivencia a 5 anos durante el periodo de observacion comprendido entre 1986 y 1990 fue del 8,0%. Hasta la fecha, la supervivencia a cinco anos despues del tratamiento radical que incluye la reseccion macroscopica del tumor sigue siendo inferior al 10%(Burton and Prados, 2000; Nieder et al., 2000; Napolitano et al., 1999; Dazzi et al., 2000). A tenor de lo anterior queda patente la necesidad de nuevos metodos terapeuticos eficaces.

El grado de indiferenciacion de las celulas tumorales del glioblastoma es el mas elevado de todos los tumores cerebrales, lo que explica su alto potencial de migracion y proliferacion y su elevada invasividad y, por ende, su pronostico funesto. Los glioblastomas provocan la muerte por el crecimiento rapido, agresivo e infiltrante que demuestran en el cerebro. El crecimiento infiltrante es el responsable del caracter inoperable de estos tumores. Los glioblastomas tambien son relativamente resistentes a la radioterapia y la quimioterapia, por lo que la recurrencia postratamiento es elevada. Ademas, la respuesta inmunitaria contra las celulas neoplasicas resulta claramente ineficaz a la hora de lograr su erradicacion total despues de la reseccion y la radioterapia (Roth and Weller, 1999; Dix et al., 1999; Sablotzki et al., 2000).

El glioblastoma se clasifica en primario (de novo) y secundario dependiendo de las diferencias en el mecanismo genico de la transformacion maligna que experimentan los astrocitos indiferenciados o las celulas precursoras gliales. El glioblastoma secundario afecta a personas jovenes menores de 45 anos. A lo largo de 4 o 5 anos, en promedio, el glioblastoma secundario evoluciona de un astrocitoma de bajo grado a un astrocitoma indiferenciado. Por el contrario, el glioblastoma primario afecta sobre todo a personas mas mayores, con una media de edad de 55 anos. Por norma general, el glioblastoma primario aparece como un glioblastoma fulminante caracterizado por la progresion del tumor en 3 meses desde el estado sin anomalfas clmicas ni patologicas (Pathology and Genetics of the Nervous Systems. 29-39 (IARC Press, Lyon, Francia, 2000)).

El glioblastoma migra a lo largo de los nervios mielinizados y se disemina ampliamente por el sistema nervioso central. En la mayona de casos el tratamiento quirurgico solo consigue un efecto terapeutico limitado (Neurol. Med. Chir. (Tokio) 34, 91-94, 1994; Neurol. Med. Chir. (Tokio) 33, 425-458, 1993; Neuropathology 17, 186-188, 1997) (Macdonald, 2001; Prados and Levin, 2000).

Las celulas del glioma maligno eluden la deteccion del sistema inmunitario del anfitrion mediante la produccion de agentes inmunodepresores que alteran la proliferacion de los linfocitos T y la produccion por parte de estos de la citocina inmunoestimulante IL-2 (Dix et al., 1999).

Las neoplasias intracraneales pueden surgir en cualquiera de las estructuras o tipos celulares del SNC: encefalo, meninges, glandula pituitaria, craneo, e incluso tejido embrionario residual. La incidencia anual total de tumores cerebrales primarios en Estados Unidos es de 14 casos por 100. 000. Los tumores cerebrales primarios mas frecuentes son los meningiomas, que representan el 27% de los tumores cerebrales primarios, y los glioblastomas, que suponen otro 23% (los glioblastomas suponen el 40% de los tumores cerebrales malignos en los adultos). Muchos de esos tumores son agresivos y presentan un alto grado. En la poblacion pediatrica los tumores cerebrales primarios son los tumores solidos mas frecuentes y la segunda causa de muerte por cancer despues de la leucemia.

A dfa de hoy prosigue la busqueda de un tratamiento eficaz contra el glioblastoma. Para combatir tales celulas neoplasicas se esta estudiando la inmunoterapia, o el tratamiento basado en el reclutamiento del sistema inmunitario. Los primeros resultados alentadores en el tratamiento del glioblastoma los obtuvo Northwest Therapeutics con «DCVax Brain» en estudios inmunoterapeuticos en humanos, en el curso de los cuales se pudieron generar respuestas de CTL espedficas de antigeno que prolongaron la mediana del tiempo de supervivencia respecto al tratamiento estandar con una toxicidad minima (Heimberger et al., 2006).

Carcinoma colorrectal

Segun la Sociedad Americana contra el Cancer (American Cancer Society), el cancer colorrectal (CCR) es el tercer tipo de cancer mas habitual en Estados Unidos puesto que afecta a mas de 175. 000 nuevos pacientes cada ano. En Estados Unidos, Japon, Francia, Alemania, Italia, Espana y Reino Unido el numero de pacientes afectados supera los 480. 000. Ello lo convierte en una de las principales causas de muerte por cancer en los pafses industrializados. La supervivencia relativa a 1 y 5 anos de los enfermos de cancer colorrectal asciende al 84% y el 64%. Pasados los cinco anos, la supervivencia sigue descendiendo hasta el 57% al cabo de diez anos del diagnostico. Cuando el cancer colorrectal se detecta en un estadio inicial y localizado la supervivencia a 5 anos es del 90%, pero solo el 39% de los casos se detectan en ese estadio, principalmente por el escaso alcance de los programas de deteccion sistematica. Cuando el cancer alcanza dimensiones regionales y afecta ya a organos adyacentes o ganglios linfaticos la supervivencia a 5 anos disminuye hasta el 68%. Y en el caso de las personas con metastasis a distancia la supervivencia a 5 anos vista se reduce al 10%.

Las investigaciones sugieren que el cancer colorrectal tiene su origen en la interaccion entre factores hereditarios y ambientales. En la mayor parte de los casos los polipos adenomatosos parecen ser los precursores de los tumores colorrectales, aunque el proceso de transicion puede durar muchos anos. El principal factor de riesgo del cancer colorrectal es la edad, ya que el 90% de los casos se diagnostican a partir de los 50 anos. Otros factores de riesgo referidos por la American Cancer Society son el consumo de alcohol, la alimentacion rica en grasas o carnes rojas y una ingesta insuficiente de frutas y verduras. La incidencia sigue aumentando especialmente en zonas como Japon, donde como posibles causas se barajan la adopcion de la alimentacion de estilo occidental, con la ingesta excesiva de grasas y carne y la reduccion del consumo de fibra. Con todo, la incidencia no aumenta al mismo ritmo que en el pasado, lo cual se atribuye al aumento de las exploraciones preventivas y a la extirpacion de los polipos que de lo contrario se habnan convertido en tumores malignos.

A semejanza de la mayona de los tumores solidos el tratamiento de primera lmea consiste en cirugfa, aunque sus ventajas siguen estando limitadas a los pacientes en fase inicial y una parte importante de los casos se diagnostica cuando la enfermedad ya se encuentra en fases avanzadas. El tratamiento de referencia contra el cancer colorrectal avanzado consiste en regfmenes de quimioterapia basados en el fluorouracilo. Los protocolos denominados FOLFOX (leucovorina/5-FU mas oxaliplatino en infusion) y FOLFIRI (irinotecan y leucovorina en bolo y 5-FU en infusion continua) constituyen la mayor parte de tales regfmenes.

La introduccion de los citotoxicos de tercera generacion como el irinotecan y el oxaliplatino ha renovado las esperanzas de lograr mayor eficacia, pero el pronostico sigue siendo relativamente malo y el mdice de supervivencia suele rondar generalmente los 20 meses cuando la enfermedad es metastasica. Por tanto, sigue existiendo una importante necesidad de mejorar los resultados contra la enfermedad.

Recientemente ha aparecido una nueva generacion de medicamentos, agentes dirigidos contra moleculas, como por ejemplo Avastin (bevacizumab) y Erbitux (cetuximab), y cerca de 40 compuestos contra diferentes estadios del cancer colorrectal se hallan en las ultimas etapas de desarrollo clmico. Las combinaciones de varios de estos compuestos aumentan las posibles opciones de tratamiento que cabe esperar en el futuro. La gran mayona de las sustancias se encuentra en la fase II de desarrollo clmico, siendo el receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR) la diana de la mayor parte de ellos, puesto que alrededor del 80% de los pacientes afectados por el cancer colorrectal presentan regulada al alza la expresion de dicho receptor.

En la actualidad se estan efectuando ensayos clmicos con pacientes en estadio II que combinan la quimioterapia con los anticuerpos monoclonales (AcM) recientemente autorizados (cetuximab irinotecan o FOLFOX4; bevacizumab en monoterapia o con FOLFOX4). Se preven periodos de observacion de tres o cuatro anos para disponer de resultados estadfsticamente significativos de dichos ensayos.

Los anticuerpos monoclonales (AcM) que actualmente se utilizan en oncologfa ofrecen en general buenas garantfas de no interferir con la inmunoterapia activa. De hecho, existen datos preclmicos y clmicos (GABRILOVICH 1999) que apuntan a que la disminucion del VEGF (lograda por el bevacizumab) contribuye de forma positiva a la activacion de los linfocitos T por parte de las celulas dendnticas (Osada T, Chong G, Tansik R, Hong T, Spector N, Kumar R, Hurwitz HI, Dev I, Nixon AB, Lyerly HK, Clay T, Morse MA.The effect of anti-VEGF therapy on immature myeloid cell and dendritic cells in cancer patients. 2008 Jan 10.).

Carcinoma de prostata y otros tumores

Con una cifra estimada de 27.050 fallecimientos en 2007, el cancer de prostata es la principal causa de muerte por cancer en varones. Aunque los indices de deceso se han reducido entre la poblacion blanca y afroamericana desde principios de los 90, el nivel registrado entre los varones afroamericanos duplica con creces el de los hombres de raza blanca. El cancer de prostata es el mas diagnosticado en los varones. Por motivos que siguen sin estar claros, la incidencia es significativamente mayor entre los varones afroamericanos que entre los de raza blanca. La incidencia del cancer de prostata ha cambiado notablemente durante los ultimos 20 anos: experimento un rapido incremento entre 1988 y 1992 para reducirse drasticamente entre 1992 y 1995 y volvio a repuntar ligeramente desde 1995. Estas tendencias reflejan en gran parte el aumento de los programas de deteccion del cancer de prostata mediante el analisis sangumeo del antigeno espedfico de la prostata (PSA). El moderado incremento de la incidencia acaecido durante la ultima decada probablemente pueda atribuirse a la generalizacion del reconocimiento preventivo del PSA entre los varones menores de 65 anos. La incidencia del cancer de prostata se ha estabilizado entre los mayores de 65 anos. Los indices marcaron su maximo entre los hombres de raza blanca en 1992 (237,6 por cada 100.000 varones) y en 1993 entre los varones afroamericanos (342,8 por cada 100.000 varones).

El tratamiento del cancer de prostata puede implicar la espera en observacion, cirugfa, radioterapia, ultrasonidos focalizados de alta intensidad (HIFU), quimioterapia, hormonoterapia o cierta combinacion de los anteriores. La mejor opcion depende de la fase de la enfermedad, de la escala Gleason y del nivel de PSA. Otros factores importantes incluyen la edad del varon, el estado general de salud y su actitud frente a los posibles tratamientos y los posibles efectos secundarios. Puesto que todos los tratamientos pueden provocar importantes efectos secundarios, como por ejemplo disfuncion erectil e incontinencia urinaria, los debates sobre dichos tratamientos suelen centrarse en equilibrar los objetivos de la terapia y las posibles alteraciones en el estilo de vida.

Cuando el cancer se ha extendido fuera de la glandula prostatica, las opciones de tratamiento cambian significativamente, por lo que la mayor parte de los medicos que tratan el cancer de prostata utiliza una serie de nomogramas para pronosticar la probabilidad de la propagacion. Los tratamientos consistentes en la espera en observacion, HIFU, radioterapia, criocirugfa y cirugfa suelen ofrecerse a los varones cuyo cancer permanece confinado en la prostata. La terapia hormonal y la quimioterapia suelen reservarse para los casos en que la enfermedad se ha extendido fuera de la prostata, aunque hay excepciones: la radioterapia puede utilizarse para algunos tumores avanzados y la terapia hormonal se emplea para algunos tumores en fase inicial. La crioterapia, la terapia hormonal y la quimioterapia tambien pueden ofrecerse si el tratamiento inicial falla y el cancer avanza.

En un numero importante de pacientes con carcinoma de prostata que son sometidos a prostatectoirna radical por la sospecha clmica de que el crecimiento sigue limitado al organo, el analisis histologico confirmatorio de la preparacion quirurgica revela que el tumor esta extendido a nivel local y se propaga fuera de los lfmites del organo. Estos pacientes presentan un elevado riesgo de recidiva local precoz, normalmente detectable por un incremento de los niveles de ^pS^aque se traduce en una recafda bioqmmica. Las opciones terapeuticas en esta situacion incluyen la radioterapia externa y la ablacion hormonal. No obstante, el valor de estos enfoques terapeuticos, especialmente en lo que concierne a prolongar la supervivencia del paciente a largo plazo, no deben considerarse como probados. Ademas, deben tenerse en cuenta posibles complicaciones asociadas con el tratamiento, como, por ejemplo, el desarrollo de estenosis uretral (radioterapia), la perdida de libido y la impotencia, el riesgo de reduccion de las sales calcicas del esqueleto que puede acarrear o agravar la osteoporosis y el notable incremento del riesgo de fracturas oseas patologicas (ablacion hormonal).

Mas del 90% de los casos de cancer de prostata se descubren en los estadios local y regional. El mdice de supervivencia relativa a 5 anos de los pacientes diagnosticados en dichos estadios se aproxima al 100%. Durante los ultimos 25 anos, el mdice de supervivencia a 5 anos de todos los estadios combinados ha pasado del 69% a casi el 90%. Segun los datos mas recientes, la supervivencia relativa a 10 anos es del 93%, mientras que a los 15 anos es del 77%. Las espectaculares mejoras de la supervivencia, especialmente a 5 anos, son atribuibles en parte a la mayor precocidad de los diagnosticos y a las mejoras del tratamiento. Con todo, la supervivencia desciende notablemente cuando el cancer se ha extendido a otros tejidos y organos.

Cancer de pulmon

Se calcula que en 2007 se diagnosticaran 210. 000 nuevos casos en Estados Unidos, cifra que supone en torno al 15% de los diagnosticos de cancer. La incidencia esta cayendo notablemente entre los hombres, desde un maximo de 102 casos por cada 100. 000 varones en 1984 hasta 78,5 en 2003. En las mujeres esta estabilizandose tras un largo penodo de incremento. Clmicamente el cancer de pulmon se divide, a efectos de tratamiento, en dos grupos: el carcinoma microdtico de pulmon (13%) y el no microdtico (87%).

El cancer de pulmon auna la mayor parte de fallecimientos relacionados con el cancer, tanto en hombres como en mujeres. Se estima que en 2007 se produciran 160. 390 fallecimientos, que representan alrededor del 29% del total de muertes por cancer. Desde 1987, cada ano han fallecido mas mujeres a causa del cancer de pulmon que del cancer de mama. La tasa de mortalidad en la poblacion masculina ha seguido cayendo notablemente entre 1991 y 2003, a un ritmo aproximado del 1,9% por ano. La mortalidad por cancer de pulmon entre las mujeres esta estabilizandose, tras haber experimentado un aumento incesante durante varias decadas. Estas tendencias en la mortalidad por cancer de pulmon reflejan el descenso del tabaquismo durante los ultimos 30 anos.

Las opciones de tratamiento vienen determinadas por el tipo (microdtico o no) y la fase del cancer, e incluyen cirugfa, radioterapia, quimioterapia y terapias biologicas dirigidas, como bevacizumab (Avastin®) y erlotinib (Tarceva®). La cirugfa suele ser el tratamiento de eleccion para los canceres localizados. Algunos estudios recientes indican que la tasa de supervivencia del cancer de pulmon no microdtico en fase inicial mejora si se aplica quimioterapia tras la cirug^a. Como la enfermedad acostumbra a estar extendida cuando se descubre, suele recurrirse a la radioterapia y la quimioterapia, a veces en combinacion con la cirugfa. La quimioterapia sola o combinada con radiacion es el tratamiento elegido habitualmente para el carcinoma microcftico de pulmon. Con este regimen un alto porcentaje de pacientes experimentan remision, que en algunos casos es duradera.

El mdice de supervivencia relativa para el cancer de pulmon despues de 1 ano se ha incrementado ligeramente desde el 37% en 1975-1979 hasta el 42% en 2002, en gran medida gracias a las mejoras en las tecnicas quirurgicas y las terapias combinadas. No obstante, el mdice combinado de supervivencia a 5 anos para todos los estadios es tan solo del 16%. El mdice de supervivencia es del 49% en los casos que son detectados cuando la enfermedad aun esta localizada. Pero solo el 16% de los canceres de pulmon se diagnostica en este estadio inicial.

Tabla 1: Estimacion de los nuevos casos de cancer y fallecimientos segun el sexo en Estados Unidos en 2007 (American Cancer Society. Cancer Facts & Figures, 2007. Atlanta: American Cancer Society, 2007.) Cancer Facts & Figures 2007. Atlanta: American Cancer Society; 2007.)

Asf pues, sigue existiendo necesidad de nuevas opciones de tratamiento eficaz y seguro para el glioblastoma, tumor de prostata, cancer de mama, cancer de esofago, cancer colorrectal, carcinoma de celulas claras de celulas renales, cancer de pulmon, cancer del SNC, cancer de ovario, melanoma (Tamm et al. 1998), cancer de pancreas, carcinoma epidermoide, leucemia y meduloblastoma, asf como para otros tumores que muestran una sobreexpresion de survivina, de forma que se mejore el bienestar de los pacientes sin utilizar quimioterapia u otros farmacos que puedan provocar efectos secundarios graves.

Resumen de la invencion

En un primer aspecto de la misma, la presente invencion se refiere a un peptido que consta de la SEQ ID N.° 3. En un segundo aspecto de la misma, la presente invencion se refiere a un acido nucleico, que codifica un peptido conforme a la presente invencion o a un vector de expresion capaz de expresar dicho acido nucleico.

En un tercer aspecto de la misma, la presente invencion se refiere a una celula hospedadora que comprende el acido nucleico o el vector de expresion acorde con la presente invencion, en que dicha celula hospedadora es preferiblemente una celula presentadora de anftgeno, en particular una celula dendrftica o una celula presentadora de antfgeno.

En un cuarto aspecto de la misma, la presente invencion se refiere a un metodo in vitro para producir linfocitos T citotoxicos (CTL) activados, el cual comprende la puesta en contacto en condiciones in vitro de CTL con moleculas MHC de clase I o II humanas cargadas con anftgeno expresadas en la superficie de una celula presentadora de anftgeno o un constructo artificial que imite a una celula presentadora de anftgeno durante un periodo de tiempo suficiente para activar dichos CTL de una manera espedfica de anftgeno, siendo dicho anftgeno un peptido conforme a la presente invencion.

La presente invencion se refiere, ademas, a un peptido acorde con la presente invencion, a un acido nucleico o a un vector de expresion acorde con la presente invencion, la celula acorde con la presente invencion, o un linfocito T citotoxico activado producido conforme a la presente invencion como un medicamento destinado al tratamiento del cancer, en que dicho medicamento preferiblemente es una vacuna. Preferiblemente, dicho cancer es seleccionado del grupo consistente en astrocitoma, astrocitoma pilocftico, tumor neuroepitelial disembrioplastico, oligodendrogliomas, ependimoma, glioblastoma multiforme, gliomas mixtos, oligoastrocitomas, meduloblastoma, retinoblastoma, neuroblastoma, germinoma, teratoma, gangliogliomas, gangliocitoma, gangliocitoma central, tumores neuroectodermicos primitivos (PNET, p. ej., meduloblastoma, meduloepitelioma, neuroblastoma, retinoblastoma, ependimoblastoma), tumores del parenquima pineal (p. ej., pineocitoma, pineoblastoma), tumores de celulas ependimarias, tumores del plexo coroideo, tumores neuroepiteliales de origen incierto (p. ej., gliomatosis cerebral, astroblastoma), glioblastoma, tumor de prostata, cancer de mama, cancer de esofago, cancer de colon, cancer colorrectal, carcinoma de celulas renales, carcinoma renal de celulas claras, cancer de pulmon, cancer del SNC, cancer de ovario, melanoma, cancer de pancreas, carcinoma epidermoide, leucemia y meduloblastoma, asf como otros tumores o canceres que muestran una sobreexpresion de survivina.

La presente invencion se refiere, ademas, a un equipo, que comprende: (a) un envase que contiene una composicion farmaceutica que contiene un peptido acorde con la presente invencion, el acido nucleico o el vector de expresion acordes con la presente invencion, una celula acorde con la presente invencion, o un linfocito T citotoxico activado acorde con la presente invencion, en forma de solucion o liofilizado; (b) opcionalmente, un segundo envase que contiene un diluyente o solucion de reconstitucion para la formulacion liofilizada; (c) opcionalmente, al menos un peptido seleccionado del grupo consistente en los peptidos acordes con las SEQ ID N.° 4 a 24; y (d) opcionalmente, instrucciones de uso para la solucion y/o la reconstitucion y/o uso de la formulacion liofilizada.

La presente invencion se refiere, ademas, a un anticuerpo que se une espedficamente a un complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase II que forma un complejo con un antfgeno restringido a HLA conforme a la SEQ iD N.° 3, en el que el anticuerpo es preferentemente un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal y/o un anticuerpo quimerico.

WO 2007/039192, WO 2004/022709, WO 2004/067023, Piesche et al. (Identification of a promiscuous HLA DR-restricted T-cell epitope derived from the inhibitor of apoptosis protein survivin. Hum Immunol. 2007 Jul; 68(7):572-6), y Schmitz et al. (Generation of survivin-specific CD8+ T effector cells by dendritic cells pulsed with protein or selected peptides. Cancer Res. 2000 Sep 1;60 (17):4845-9) dan a conocer peptidos derivados de la survivina que se unen a moleculas MHC de clase I o clase II.

Asimismo, WO 2007/036638 da a conocer un peptido consistente en los aminoacidos 96-110 de la molecula de survivina entera.

Descripcion detallada de la invencion

El termino «peptido» designa aqrn una serie de residuos de aminoacidos conectados entre sf tfpicamente mediante enlaces peptfdicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoacidos adyacentes.

El termino «oligopeptido» designa aqrn una serie de residuos de aminoacidos conectados entre sf tfpicamente mediante enlaces peptfdicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoacidos adyacentes. La longitud del oligopeptido no es crucial en la invencion, siempre que se mantenga el epftopo o epftopos adecuados. Los oligopeptidos suelen tener una longitud inferior a unos 30 aminoacidos y mayor de 14, aproximadamente.

El termino «polipeptido» designa una serie de residuos de aminoacidos conectados entre sf tfpicamente por enlaces peptfdicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoacidos adyacentes. La longitud del polipeptido no es crucial en la invencion, siempre que se mantengan los epftopos adecuados. En contraste con los terminos «peptido» y «oligopeptido», el termino «polipeptido» se refiere a las moleculas de mas de unos 30 residuos de aminoacidos de longitud.

Un peptido, oligopeptido, protema o polinucleotido que codifica dicha molecula es «inmunogenico» (y, por lo tanto, un «inmunogeno» en la presente invencion), si es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. En el caso de la presente invencion, la inmunogenicidad se define mas espedficamente como la capacidad para desatar una respuesta por parte de los linfocitos T. Por lo tanto, un «inmunogeno» sena una molecula que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria y, en el caso de la presente invencion, una molecula capaz de inducir una respuesta de los linfocitos T.

Un «epftopo» de un linfocito T requiere un peptido corto que este unido a un receptor MHC de clase I o clase II, formando un complejo ternario (cadena alfa de MHC de clase I , beta-2-microglobulina y peptido) que puede ser reconocido por un linfocito T que lleve un receptor de linfocito T que coincida y que se una al complejo MHC/peptido con la afinidad adecuada. Los peptidos que se unen a moleculas MHC de clase I suelen tener una longitud de entre 8 y 14 aminoacidos, y mas habitualmente de 9 aminoacidos. Los epftopos de linfocitos T que se unen a moleculas MHC de clase II suelen tener una longitud de entre 12 y 30 aminoacidos. En el caso de los peptidos que se unen a moleculas MHC de clase II, el mismo peptido y el epftopo del linfocito T correspondiente pueden compartir un segmento central comun, pero en cambio diferir en la longitud total como consecuencia de secuencias de flanqueo de diferentes longitudes en direccion ascendente del extremo amino de la secuencia central y descendente con respecto a su terminal carboxflico, respectivamente. Los receptores MHC de clase II presentan una conformacion mas abierta; de la misma manera, los peptidos unidos a receptores MHC de clase II no se enclavan completamente en la estructura de la hendidura de union al peptido de la molecula MHC de clase II, como ocurre con la hendidura de union del peptido de la molecula MHC de clase I. Es de notar que este no es el caso del peptido acorde con la SEQ ID n. ° 1, puesto que pequenas variaciones en la longitud del peptido ocasionan un gran descenso de la actividad (vease mas abajo).

En el ser humano hay tres locus geneticos diferentes que codifican las moleculas MHC de clase I (las moleculas MHC del ser humano tambien se denominan antfgenos leucocitarios humanos [HLA]): HLA-A, HLA-B y HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 y HLA-A*11 son ejemplos de distintos alelos MHC de clase I que se pueden expresar a partir de estos locus.

Tabla 2: Los 30 alelos mas expresados en diversas poblaciones

Tres locus diferentes del genoma humano albergan los genes MHC de clase II: HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. Los receptores MHC de clase II son heterodfmeros que constan de una cadena alfa y una beta, las cuales se enclavan en la membrana celular a traves de una region transmembrana. HLA-DRB1*04 y HLA-DRB1*07 son dos ejemplos de diferentes alelos beta MHC de clase II que se sabe que estan codificados en estos locus. Los alelos de clase II son muy polimorfos: por ejemplo, se han descrito varios cientos de alelos HLA-DRB1 distintos. Por tanto, a efectos terapeuticos y de diagnostico sena muy deseable contar con un peptido que se uniese, con la afinidad adecuada, a varios receptores HLA de clase II distintos. Un peptido que se une a varias moleculas HLA de clase II distintas recibe el nombre de ligando promiscuo.

En la presente memoria, la referencia a una secuencia de ADN incluye tanto ADN monocatenario como bicatenario. Por lo tanto, la secuencia espedfica, a menos que el contexto indique otra cosa, se refiere al ADN monocatenario de dicha secuencia, a la doble cadena formada por dicha secuencia con su complementaria (ADN bicatenario) y a la cadena complementaria de dicha secuencia. El termino «region codificante» hace referencia a la porcion de un gen que, o bien de forma natural o normal, codifica el producto de expresion de dicho gen en su ambiente genomico natural, por ejemplo, la region que codifica in vivo el producto de expresion natural del gen.

La region codificante puede formar parte de un gen normal, mutado o alterado, o incluso puede provenir de una secuencia de ADN, o gen, sintetizada mtegramente en el laboratorio con metodos bien conocidos para los expertos en la smtesis de ADN.

El termino «secuencia nucleotfdica» hace referencia a un heteropolfmero de desoxirribonucleotidos.

La secuencia nucleotfdica que codifica un peptido, oligopeptido o polipeptido en particular puede ser natural o estar construida de forma sintetica. Generalmente, los segmentos de a Dn que codifican los peptidos, polipeptidos y protemas de la presente invencion se ensamblan a partir de fragmentos de ADNc y de oligonucleotidos cortos de enlace, o a partir de una serie de oligonucleotidos, con el fin de proporcionar un gen sintetico capaz de ser expresado en una unidad transcripcional recombinante que comprenda elementos reguladores derivados de un operon microbiano o vmco.

El termino «producto de expresion» define al polipeptido o a la protema que es el producto natural de la traduccion del gen y cualquier secuencia de acidos nucleicos que codifiquen los equivalentes resultantes de la degeneracion del codigo genetico y, por tanto, que codifican el mismo aminoacido o aminoacidos.

El termino «fragmento», cuando se refiere a una secuencia de codificacion, define una porcion de ADN que no comprende la region codificante entera, cuyo producto de expresion conserva esencialmente la misma actividad o funcion biologica que el producto de expresion de la region codificante entera.

El termino «segmento de ADN» hace referencia a un polfmero de ADN, en forma de un fragmento separado o como componente de un constructo de ADN mayor, que deriva de ADN aislado por lo menos una vez en una forma sustancialmente pura, es decir, exento de materiales endogenos contaminantes y en una cantidad o concentracion que permite la identificacion, la manipulacion y la recuperacion del segmento y de sus secuencias nucleotfdicas constituyentes mediante metodos bioqmmicos estandar como, por ejemplo, mediante un vector de clonacion. Dichos segmentos se suministran en forma de un marco de lectura abierto sin interrupciones por secuencias internas no traducidas, o intrones, que suelen estar presentes en los genes eucariotas. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presentes corriente abajo (downstream) desde el marco de lectura abierto, donde no interfieren con la manipulacion o la expresion de las regiones codificantes.

El termino «cebador» define una secuencia corta de acidos nucleicos que puede aparearse con una cadena de ADN y que proporciona un extremo 3'-OH libre en el que una polimerasa de ADN puede comenzar la smtesis de una cadena de desoxirribonucleotidos.

El termino «promotor» define una region de ADN implicada en la union de la polimerasa de ARN para iniciar la transcripcion.

El termino «marco de lectura abierto (ORF)» designa una serie de tripletes que codifican aminoacidos sin ningun codon de terminacion y que forman una secuencia (potencialmente) traducible en protema.

El termino «aislado» define el material que se extrae de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si ocurre de forma natural). Por ejemplo, un polinucleotido o un polipeptido natural presente en un animal vivo no esta aislado, pero ese mismo polinucleotido o polipeptido lo estara si es separado de parte o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Tales polinucleotidos podran formar parte de un vector y/o tales polinucleotidos o polipeptidos podran formar parte de una composicion, y seguir estando aislados en dicho vector o composicion puesto que estos no forman parte de su entorno natural.

Los polinucleotidos, y los polipeptidos recombinantes o inmunogenos, descritos de acuerdo con la presente invencion tambien pueden presentarse en forma «purificada». El termino «purificado» no implica pureza absoluta; mas bien, se utiliza como definicion relativa y puede incluir preparaciones altamente purificadas o preparaciones tan solo parcialmente purificadas, tal y como los expertos en la materia entienden dichos terminos. Por ejemplo, los clones individuales aislados de una genoteca de ADNc se han purificado de manera convencional hasta obtener una homogeneidad electroforetica. Se contempla expresamente la purificacion del material de inicio o del material natural hasta, al menos, un orden de magnitud; preferiblemente, dos o tres ordenes de magnitud; y, con mayor preferencia, cuatro o cinco ordenes de magnitud. Ademas, se contempla expresamente el polipeptido reivindicado que tiene una pureza de, preferiblemente, el 99,999%, o, al menos, del 99,99% o el 99,9%; y, mas convenientemente, del 99% por peso o mayor.

Los productos de expresion de los polipeptidos y los acidos nucleicos descritos conforme a la presente invencion, as ^como los vectores de expresion que contienen dichos acidos nucleicos y/o dichos polipeptidos, pueden utilizarse en «forma enriquecida». Tal y como se usa aqm, el termino «enriquecido» significa que la concentracion del material es, al menos, unas 2, 5, 10, 100 o 1000 veces su concentracion natural (por ejemplo), mas ventajosamente 0,01% por peso, y, preferiblemente, aproximadamente de 0,1% al menos, por peso. Tambien se contemplan preparaciones enriquecidas de alrededor del 0,5%, 1%, 5%, 10% y 20% por peso. Las secuencias, constructos, vectores, clones y otros materiales que comprenden la presente invencion pueden utilizarse, segun convenga, en su forma enriquecida o aislada.

El termino «fragmento activo» define un fragmento que genera una respuesta inmunitaria(es decir, que posee actividad inmunogena) cuando se administra -solo u, opcionalmente, con un adyuvante adecuado- a un animal, que puede ser un mamffero como, por ejemplo, un conejo o un raton, sin excluir a un ser humano; dicha respuesta inmunitaria adopta la forma de estimulacion de una respuesta de linfocitos T en el animal receptor como, por ejemplo, el ser humano. De forma alternativa, el «fragmento activo» tambien se puede usar para inducir una respuesta de linfocitos T in vitro.

Tal y como se usan en la presente memoria, los terminos «porcion», «segmento» y «fragmento», cuando se utilizan en relacion a los polipeptidos, hacen referencia a una secuencia continua de residuos, como residuos de aminoacidos, secuencia que es un subconjunto de una secuencia mayor. Por ejemplo, si un polipeptido se somete a un tratamiento con cualquiera de las endopeptidasas habituales, como la tripsina o la quimotripsina, los oligopeptidos resultantes de dicho tratamiento representaran porciones, segmentos o fragmentos del polipeptido inicial. Esto significa que cualquiera de esos fragmentos, necesariamente y como parte de su secuencia de aminoacidos, contendra un segmento, fragmento o porcion que es sustancialmente identica, si no lo es exactamente, a una secuencia de las SEQ ID n. ° 1 a 3, que corresponde a la estructura natural, o a la protema «precursora» de las SEQ ID n. ° 1 a 3, esto es la survivina. Utilizados en relacion con los polinucleotidos, dichos terminos se refieren a los productos generados por el tratamiento de dichos polinucleotidos con cualquiera de las endonucleasas habituales.

Conforme a la presente invencion, el termino «identidad porcentual» o «porcentaje de identidad», al referirse a una secuencia, significa que una secuencia se compara con una secuencia reivindicada o descrita despues de alinear la secuencia que se va a comparar (la «secuencia comparada») con la secuencia descrita o reivindicada (la «secuencia de referencia»). La identidad porcentual se determina entonces con la siguiente formula:

Identidad porcentual = 100 [I -(C/R)]

donde C es el numero de diferencias entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada a lo largo de la alineacion entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada, donde

(I) cada base o aminoacido de la secuencia de referencia que no tiene una base o aminoacido alineados en la secuencia comparada y

(II) cada hueco (gap) de la secuencia de referencia y

(III) cada base o aminoacido alineado de la secuencia de referencia que difiere de una base o aminoacido alineado de la secuencia comparada, constituye una diferencia;

y R es el numero de bases o aminoacidos de la secuencia de referencia a lo largo de la alineacion con la secuencia comparada con cualquier hueco creado en la secuencia de referencia, tambien contabilizado como una base o un aminoacido.

Si existe una alineacion entre la secuencia comparada y la secuencia de referencia para la que la identidad porcentual, calculada como se ha especificado arriba, es aproximadamente igual o mayor que una identidad porcentual minima especificada, entonces la secuencia comparada guarda la identidad porcentual minima especificada con la secuencia de referencia, aunque puedan existir alineaciones en las que la identidad porcentual calculada arriba resulte menor que la identidad porcentual especificada.

Los peptidos originales descritos aqm se pueden modificar mediante la sustitucion de uno o mas residuos en sitios diferentes, posiblemente selectivos, dentro de la cadena peptfdica, si no se especifica de otra manera. Dichas sustituciones pueden ser de naturaleza conservadora como, por ejemplo, si un aminoacido es reemplazado por un aminoacido de estructura y caractensticas similares, como en el caso de un aminoacido hidrofobico que es sustituido por otro aminoacido hidrofobico. Aun mas conservador sena el reemplazo de aminoacidos de tamano y naturaleza qmmica igual o similar como, por ejemplo, si una leucina se reemplaza por isoleucina. En diversos estudios de variaciones de secuencias en familias de protemas homologas naturales, determinadas sustituciones de aminoacidos se toleran con mas frecuencia que otras, y estas muestran a menudo una correlacion con similitudes de tamano, carga, polaridad e hidrofobicidad entre el aminoacido original y su reemplazo, siendo esta la base para la definicion de las «sustituciones conservadoras».

Las sustituciones conservadoras se definen como intercambios dentro de uno de los cinco grupos siguientes: Grupo 1: residuos alifaticos pequenos, no polares o ligeramente polares (Ala, Ser, Thr, Pro y Gly); Grupo 2: residuos polares cargados negativamente y sus amidas (Asp, Asn, Glu y Gln); Grupo 3: residuos polares cargados positivamente (His, Arg y Lys); Grupo 4: residuos alifaticos grandes no polares (Met, Leu, Ile, Val y Cys); y Grupo 5: residuos grandes aromaticos (Phe, Tyr y Trp).

Las sustituciones menos conservadoras pueden implicar el reemplazo de un aminoacido por otro con caractensticas similares pero diferenciado de alguna manera en el tamano, como en el reemplazo de un residuo de isoleucina por alanina. Los reemplazos muy poco o nada conservadores pueden implicar la sustitucion de un aminoacido acido por otro polar, o incluso por uno de caracter basico. Estas sustituciones «radicales» no se pueden descartar, sin embargo, como potencialmente inefectivas, ya que los efectos qmmicos no son totalmente predecibles y las sustituciones radicales bien pueden provocar efectos inesperados imposibles de predecir de otra forma a partir de principios qmmicos simples.

Naturalmente, dichas sustituciones pueden implicar otras estructuras distintas de los aminoacidos L habituales. De esta forma, aminoacidos D podnan sustituir a los aminoacidos L que habitualmente se encuentran en los peptidos antigenicos de la invencion y, aun asf, quedar englobados en la descripcion del presente documento. Ademas, los aminoacidos que poseen grupos R no estandar (es decir, grupos R distintos de los presentes en los 20 aminoacidos comunes de las protemas naturales) tambien pueden ser utilizados como sustitutos para producir polipeptidos inmunogenos e inmunogenicos de acuerdo con la presente invencion.

Si se descubre que las sustituciones en mas de una posicion resultan en un peptido con actividad antigenica sustancialmente equivalente o mayor, como se define mas abajo, entonces las combinaciones de dichas sustituciones se probaran para determinar si las sustituciones combinadas provocan efectos aditivos o sinergicos en la antigenicidad del peptido. Como maximo, se sustituiran hasta cuatro posiciones simultaneamente dentro del peptido.

El termino «respuesta de linfocitos T» define la proliferacion y la activacion espedficas de las funciones efectoras inducidas por un peptido in vitro o in vivo. En el caso de los linfocitos T citotoxicos (CTL) restringidos a MHC de clase I, las funciones efectoras pueden consistir en la lisis de celulas diana presentadoras naturales de peptido o bien sensibilizadas de manera repetida con un peptido o con un precursor del mismo; la secrecion de citocinas, preferiblemente de interferon gamma, TNF-alfa o IL-2 inducida por peptido; la secrecion de moleculas efectoras, preferiblemente granzimas o perforinas inducidas por peptido; o la desgranulacion. En lo que respecta a los linfocitos T cooperadores restringidos a las MHC de clase II, las funciones efectoras pueden consistir en la secrecion inducida por el peptido de citocinas, preferiblemente de IFN-gamma, TNF-alfa, IL-4, IL-5, IL-10 o IL-2, o la desgranulacion inducida por el peptido. Las posibles funciones efectoras de los CTL y de los linfocitos T cooperadores no se limitan a esta lista.

Preferiblemente, cuando los CTL espedficos para un peptido derivado de la SEQ ID N.° 3 se prueben contra los peptidos sustituidos, la concentracion de peptido a la cual los peptidos sustituidos consiguen la mitad del aumento maximo de la lisis respecto al valor de fondo es como maximo de alrededor de 1 mM, preferiblemente como maximo de alrededor de 1 pM, mas preferiblemente como maximo de alrededor de 1 nM, y aun mas preferentemente como maximo de alrededor de 100 pM, y mas preferentemente como maximo de alrededor de 10 pM. Tambien se prefiere que el peptido sustituido sea reconocido por los CTL de mas de un individuo, de al menos dos, y mas preferiblemente de tres individuos.

La estimulacion de una respuesta inmunitaria depende de la presencia de antfgenos que sean reconocidos como extranos por el sistema inmunitario del hospedador. El descubrimiento de la existencia de antfgenos asociados a tumores ha abierto la posibilidad de utilizar el sistema inmunitario del hospedador para desencadenar una respuesta inmunitaria que sea espedfica contra los antfgenos expresados en la superficie de las celulas tumorales y que a traves de este mecanismo de accion sea capaz de inducir la regresion, paralice o frene el crecimiento del tumor. Actualmente se estan explorando diversos mecanismos para aprovechar las defensas humorales y celulares del sistema inmunitario en la inmunoterapia contra el cancer.

Ciertos elementos de la respuesta inmunitaria celular son capaces de reconocer espedficamente y destruir las celulas tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotoxicos (CTL) entre las celulas infiltradas en los tumores o en la sangre periferica hace pensar en que tales celulas desempenan un papel importante en las defensas inmunitarias naturales contra el cancer (Cheever et al., 1993; Zeh, III et al., 1999). A partir del analisis de 415 espedmenes de pacientes aquejados de cancer colorrectal, Galon et al. fueron capaces de demostrar que el tipo, la densidad y la localizacion de las celulas inmunitarias en el tejido tumoral son realmente mejores predictores de la supervivencia del paciente que la ampliamente utilizada estadificacion TNM de los tumores (Galon et al., 2006).

Las moleculas MHC de clase I presentan peptidos procedentes de la proteolisis de protemas endogenas, DRiP y peptidos grandes. Las moleculas MHC de clase II, presentes mayoritariamente en las celulas presentadoras de antigeno (APC) especializadas, presentan predominantemente peptidos de protemas exogenas o transmembrana que son captadas por las APC mediante endocitosis y despues son procesadas por las mismas (Cresswell, 1994). Los complejos constituidos por peptidos y moleculas MHC de clase I son reconocidos por los linfocitos T CD8 positivos portadores del receptor de linfocito T (TCR) adecuado, mientras que los complejos formados por peptidos y moleculas MHC de clase II son reconocidos por los linfocitos T cooperadores CD4-positivos portadores del TCR apropiado. Es bien sabido que el TCR, el peptido y el MHC estan presentes en una relacion estequiometrica de 1:1:1.

Los linfocitos T cooperadores CD4-positivos desempenan un papel importante en la induccion y en el mantenimiento de respuestas eficaces por parte de los linfocitos T citotoxicos CD8-positivos (Wang and Livingstone, 2003; Sun and Bevan, 2003; Shedlock and Shen, 2003). Inicialmente, la sensibilizacion y la expansion de los CTL en los ganglios linfaticos esta sustentada por los linfocitos T CD4+ (Schoenberger et al., 1998). Asf pues, un mecanismo podna ser el direccionamiento de los linfocitos CD8+ vftgenes hacia el lugar donde tiene lugar la interaccion funcional entre los linfocitos T CD4+ y las APC (Castellino et al., 2006). Por ultimo, la generacion de los linfocitos CD8+ de memoria funcionales depende casi siempre de la asistencia de los linfocitos T CD4+ (Sun and Bevan, 2003; Janssen et al., 2003). Por todas esas razones, la identificacion de epftopos derivados de antfgenos asociados a tumor (TAA) que sean reconocidos por los linfocitos T CD4-positivos reviste suma importancia para el desarrollo de medicamentos que estimulen una respuesta inmunitaria antitumoral (Kobayashi et al., 2002; Qin et al., 2003; Gnjatic et al., 2003). Los linfocitos T cooperadores generan en el seno del tumor un entorno de citocinas que es propicio para los CTL (Qin and Blankenstein, 2000; Mortara et al., 2006) y que atrae a las celulas efectoras, como por ejemplo los propios CTL, celulas NK, macrofagos, granulocitos (Marzo et al., 2000; Hwang et al., 2007).

En ausencia de inflamacion, la expresion de las moleculas MHC de clase II se circunscribe principalmente a las celulas del sistema inmunitario, en concreto a las celulas presentadoras de antfgeno (APC) especializadas, como por ejemplo monocitos, celulas derivadas de monocitos, macrofagos y celulas dendrfticas. En pacientes con cancer se ha descubierto con sorpresa que las celulas tumorales expresan moleculas MHC de clase II (Dengjel et al., 2006). En modelos de mamfero como el raton se ha demostrado que los linfocitos T CD4-positivos pueden inhibir la manifestacion de los tumores sin el concurso de las celulas efectoras CTL (los linfocitos T CD8-positivos) a traves de la inhibicion de la angiogenesis mediante la secrecion de interferon gamma (IFN-^y) (Qin and Blankenstein, 2000). Tambien ha sido propuesta la destruccion directa de las celulas tumorales por los linfocitos T CD4+ citotoxicos a traves de linfotoxinas y granzima B (Penna et al., 1992; Littaua et al., 1992).

Ademas se ha demostrado que los linfocitos T CD4-positivos pueden contrarrestar la progresion tumoral mediante la induccion de respuestas de anticuerpos al reconocer peptidos de antfgenos asociados a tumor presentados por moleculas HLA de clase II (Kennedy et al., 2003).

A diferencia de lo que sucede con los peptidos asociados a tumor reconocidos por moleculas HLA de clase I, hasta la fecha el numero descrito de ligandos de clase II derivados de antfgenos asociados a tumor (TAA) es pequeno. Dado que la expresion constitutiva de las moleculas HLA de clase II suele ser exclusiva de las celulas del sistema inmunitario (Mach et al., 1996), la posibilidad de aislar peptidos de clase II directamente de tumores primarios no se consideraba factible. Pero Dengjel et al. descubrieron varios epftopos de MHC de clase II en tumores (WO 2007/028574, EP 1760088 B1; (Dengjel et al., 2006).

Los antfgenos que son reconocidos por los linfocitos T citotoxicos espedficos del tumor, esto es, los epftopos, pueden ser moleculas derivadas de todo tipo de protemas, tales como enzimas, receptores, factores de transcripcion, etc. que son expresados y que, en comparacion con celulas inalteradas del mismo origen, estan regulados al alza en las celulas del tumor correspondiente.

La clasificacion actual de los antfgenos asociados a tumores (TAA) comprende los siguientes grupos principales (Novellino et al., 2005):

1. Antfgenos cancer-testmulo: Los primeros TAA descubiertos que pueden ser reconocidos por linfocitos T pertenecen a esta clase (van der Bruggen et al., 1991), que inicialmente se denomino antfgenos cancer-testmulo (CT) porque sus miembros se expresan en tumores humanos histologicamente diferentes y en los tejidos normales solo se encuentran en los espermatocitos/espermatogonias del testmulo y ocasionalmente en la placenta. Como las celulas del testmulo no expresan moleculas HLA de clase I y II, estos antfgenos no pueden ser reconocidos por los linfocitos T de los tejidos normales y, por tanto, se consideran como espedficos de tumor desde el punto de vista inmunologico. Ejemplos conocidos de antfgenos CT son los miembros de la familia MAGE y el NY-ESO-1.

2. Antfgenos de diferenciacion: Estos TAA estan presentes tanto en los tumores como en el tejido normal del que deriva el tumor; la mayona se encuentran en melanomas y en melanocitos normales. Muchas de esas protemas relacionadas con el linaje melanodtico participan en la biosmtesis de la melanina y no son espedficas de tumor, lo que no impide que sean muy utilizadas en la inmunoterapia contra el cancer. Algunos ejemplos son la tirosinasa y Melan-A/MART-1 en el melanoma y el PSA en el cancer de prostata.

3. TAA sobreexpresados: Se han detectado genes que codifican TAA de amplia expresion en tumores histologicamente distintos y en numerosos tejidos normales, en general con niveles de expresion mas bajos. Es posible que muchos de los epftopos procesados y posiblemente presentados por los tejidos normales lo sean por debajo del ftmite necesario para ser reconocidos por los linfocitos T, pero que la sobreexpresion por parte de las celulas tumorales rompa la tolerancia vigente hasta ese momento y desencadene la respuesta antitumoral. Ejemplos destacados de esta clase de TAA son Her-2/neu, survivina, telomerasa o WT1.

4. Antigenos espedficos de tumor: Estos TAA unicos son fruto de mutaciones de genes normales (como pcatenina, CDK4, etc.). Algunos de esos cambios moleculares estan relacionados con la transformacion neoplasica y/o su progresion. Los antfgenos espedficos de tumor generalmente son capaces de inducir potentes respuestas inmunitarias sin riesgo de reacciones autoinmunitarias contra los tejidos normales. Por otro lado, casi siempre estos TAA solo son relevantes para el mismo tumor exacto en el que fueron identificados y normalmente no se encuentran en muchos otros tumores de su tipo.

5. TAA resultantes de modificaciones postraduccionales anormales: Estos TAA pueden surgir a partir de protemas que no son espedficas ni se sobreexpresan en los tumores, pese a lo cual aparecen asociados a tumores por procesos postraduccionales que se activan principalmente en los tumores. Ejemplos de este tipo surgen a rafz de patrones de glucosilacion alterados que generan epftopos nuevos en tumores como MUC1 o fenomenos como el ayuste de protemas durante la degradacion que en algunos casos pueden ser espedficos de tumor (Hanada et al., 2004; Vigneron et al., 2004).

6. Protemas de oncovirus: Estos TAA son protemas virales que podnan desempenar un papel crftico en el proceso oncogenico y que, como extranas a causa de su origen no humano, pueden desencadenar una respuesta de los linfocitos T. Ejemplos de tales protemas son las protemas E6 y E7 del virus del papiloma humano de tipo 16, que se expresan en el carcinoma de cuello uterino.

Para que las protemas sean reconocidas por los linfocitos T citotoxicos como antfgenos espedficos o asociados a tumor y puedan ser empleadas como parte de un tratamiento, deben cumplir ciertos prerrequisitos. El antfgeno debe ser expresado principalmente por celulas tumorales y no por tejidos sanos normales o, de hacerlo, debe serlo en cantidades comparativamente pequenas. Y no solo es conveniente que el antfgeno de interes este presente unicamente en un tipo de tumor, sino que lo este tambien en altas concentraciones (numero de copias del peptido por celula). Los antfgenos espedficos de tumor y asociados a tumor proceden a menudo de protemas que intervienen directamente en la transformacion de una celula normal en una tumoral a causa de su funcion, por ejemplo, porque intervienen en el control del ciclo celular o en la supresion de la apoptosis. Ademas, tambien las dianas ulteriores de las protemas que son las causantes directas de la transformacion pueden estar reguladas al alza y, por tanto, estar asociadas indirectamente al tumor. Tales antfgenos asociados indirectamente a los tumores tambien pueden ser las dianas para una estrategia de vacunacion (Singh-Jasuja et al., 2004). En ambos casos es esencial que la secuencia de aminoacidos del antfgeno contenga epftopos, puesto que el peptido («peptido inmunogenico») derivado de un antfgeno asociado a tumor debe desencadenar una respuesta de los linfocitos T en condiciones in vitro o in vivo.

Basicamente, cualquier peptido capaz de unirse a una molecula de MHC puede actuar como un epftopo de linfocito T. Un prerrequisito para la induccion de una respuesta de linfocitos T in vitro o in vivo es la presencia de un linfocito T dotado del correspondiente TCR y la ausencia de tolerancia inmunitaria hacia ese epftopo en particular.

Por consiguiente, los TAA son el punto de partida para el desarrollo de una vacuna antitumoral. Los metodos para identificar y caracterizar los TAA estan basados, entre otros, en el uso de CTL que pueden aislarse de pacientes o de individuos sanos, o en la generacion de perfiles de transcripcion diferenciales o patrones de expresion peptfdica diferenciales entre los tumores y los tejidos normales (Lemmel et al., 2004; Weinschenk et al., 2002).

No obstante, la identificacion de genes sobreexpresados o expresados selectivamente en tejidos tumorales o en estirpes de celulas tumorales humanas no aporta informacion precisa acerca del uso de los antfgenos transcritos de esos genes en la inmunoterapia. Ello se explica porque solo una subpoblacion individual de epftopos de esos antfgenos resulta adecuada para aplicaciones de ese tipo, puesto que ha de haber un linfocito T con el TCR correspondiente y la inmunotolerancia hacia ese epftopo concreto ha de ser minima o nula. Por tanto, es importante seleccionar solo aquellos peptidos derivados de protemas sobreexpresadas o selectivamente expresadas que sean presentados ligados a moleculas de MHC y que sean diana de linfocitos T funcionales. Un linfocito T funcional se define como un linfocito T que tras la estimulacion con un antfgeno espedfico puede sufrir una expansion clonal y ser capaz de ejecutar funciones efectoras («linfocito T efector»).

Los linfocitos T cooperadores desempenan un papel importante en la coordinacion de la funcion efectora de los CTL en la inmunidad antitumoral. Los epftopos reconocidos por los linfocitos T cooperadores que desencadenan una respuesta de los linfocitos T cooperadores del tipo Thi apoyan las funciones efectoras de los linfocitos T citotoxicos CD8+, que incluyen funciones citotoxicas dirigidas contra las celulas tumorales que muestran en su superficie complejos de MHC/peptido asociado a tumor. De esta forma, los epftopos de los peptidos asociados a tumores que son reconocidos por los linfocitos T cooperadores, solos o en combinacion con otros peptidos asociados a tumores, pueden servir como principios activos farmaceuticos en composiciones vacunales destinadas a estimular respuestas inmunitarias antitumorales.

Dado que ambos tipos de respuesta, la dependiente de CD8 y la de CD4, contribuyen conjunta y sinergicamente al efecto antitumoral, la identificacion y caracterizacion de los antfgenos asociados a tumor reconocidos por los CTL CD8+ (ligando: moleculas MHC de clase I epftopo peptfdico) o por los linfocitos T cooperadores CD4 positivos (ligando: moleculas MHC de clase II epftopo peptfdico) es importante para el desarrollo de vacunas antitumorales.

A la luz de los efectos secundarios graves y los gastos que supone el tratamiento contra el cancer es evidente la urgente necesidad de mejora de los metodos pronosticos y diagnosticos. As ^pues, existe la necesidad de descubrir otros factores que puedan servir como biomarcadores para el cancer en general y el glioblastoma en particular. Existe igualmente la necesidad de identificar factores que puedan ser utilizados en el tratamiento contra el cancer en general y contra el glioblastoma en particular.

Y es mas, no existe ninguna pauta terapeutica pensada para los pacientes con cancer de prostata que presentan recidiva bioqdmica despues de la prostatectoirna radical, normalmente causada por tumor residual in situ que no ha sido extirpado en presencia de crecimiento localmente avanzado del tumor. Sena deseable contar con nuevas estrategias terapeuticas de menor morbilidad y similar eficacia terapeutica a las estrategias terapeuticas disponibles en estos momentos.

La presente invencion proporciona un peptido que es util para el tratamiento del glioblastoma, el cancer de prostata y otros tumores que sobreexpresan la survivina. De los peptidos descritos en la presente memoria se ha demostrado en parte directamente con tecnicas de espectrometna de masas que son presentados de forma natural por moleculas HLA en muestras de glioblastoma humano primario (veanse el ejemplo 1 y la figura 1), o en el caso de las SEQ ID N.° 1 y 2 predichas conforme al algoritmo de prediccion SYFPEITHI (Rammensee et al., 1995) son ligandos promiscuos de los alelos HLA-DR HLA-DRB1*01, DRB1*03, DRB1*04, D^rB1*11 y DRB1*15 (vease el anexo). A tenor de los datos anteriores y de las frecuencias de dichos alelos DRB1 frecuentes (Mori et al., 1995; Chanock et al., 2004), se puede suponer que el 92% de las personas de raza blanca A*02-positivas expresan como mmimo un alelo DRB1 que se une a esos peptidos (SEQ iD N.° 1 a 3). La SEQ ID N.° 2 contiene la misma secuencia central que la SEQ ID N.° 1, alargada por dos aminoacidos N-terminales procedentes de la secuencia natural de la survivina que contiene un epftopo de linfocito T de clase I descrito de la survivina (Schmitz et al., 2000). La SEQ ID N.° 3 contiene la misma secuencia que la SEQ ID N.° 1, salvo porque el ultimo aminoacido C-terminal es modificado: la asparragina (N) es sustituida por un acido aspartico (D).

Se ha demostrado que el gen originario del cual derivan las SEQ ID N.° 1 a 3 -survivina- esta altamente sobreexpresado en el glioblastoma, el tumor de prostata, cancer de mama, cancer de esofago, cancer colorrectal, carcinoma renal de celulas claras, cancer de pulmon, cancer del SNC, cancer de ovario, melanoma (Tamm et al.

1998), cancer de pancreas, carcinoma epidermoide, leucemia y meduloblastoma en comparacion con los tejidos normales (veanse el ejemplo 2 y la figura 2) demostrando un alto grado de asociacion del peptido con el tumor, es decir, que dichos peptidos aparecen claramente en el tejido tumoral pero no en los tejidos normales.

Los peptidos unidos a HLA pueden ser reconocidos por el sistema inmunitario, espedficamente por los linfocitos T. Los linfocitos T destruyen las celulas que presentan el complejo HLA/peptido reconocido, p. ej., celulas tumorales de glioblastoma que presentan el peptido derivado de survivina (SEQ ID N.° 1 a 3). Los linfocitos T cooperadores activados por los peptidos derivados de la survivina pueden inhibir la vascularizacion del tumor, pueden atraer a las celulas efectoras del sistema inmunitario y facilitar la sensibilizacion y la proliferacion de los CTL, asf como la respuesta sostenida de los linfocitos TCD8+.

El peptido de la presente invencion ha demostrado ser capaz de estimular las respuestas de los linfocitos T (veanse el ejemplo 3 y la figura 3). Asf pues, el peptido de la presente invencion es util para generar en un paciente una respuesta inmunitaria con la que destruir celulas tumorales. La respuesta inmunitaria se puede inducir en el paciente con la administracion directa de los peptidos descritos o de sustancias precursoras adecuadas (p. ej. peptidos alargados, protemas o acidos nucleicos que codifiquen dichos peptidos), idealmente en combinacion con un agente que potencie la inmunogenicidad (un adyuvante). Cabe esperar que la respuesta inmunitaria generada por esa vacunacion terapeutica sea muy espedfica contra las celulas tumorales porque los tejidos normales no contienen el peptido diana de la presente invencion en un numero comparable de copias, lo cual evita el riesgo de reacciones autoinmunitarias perjudiciales contra las celulas normales del paciente.

Las composiciones farmaceuticas pueden comprender los peptidos en forma libre o en forma de una sal farmaceuticamente aceptable.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «sal farmaceuticamente aceptable» se refiere a un derivado de los peptidos descritos en el que el peptido es modificado para obtener sales acidas o basicas del agente. Por ejemplo, las sales acidas se preparan a partir de la base libre (normalmente la forma neutra del farmaco posee un grupo -NH²neutro) haciendola reaccionar con un acido adecuado. Acidos adecuados para la preparacion de sales acidas incluyen tanto acidos organicos, p. ej. acido acetico, acido propionico, acido glicolico, acido piruvico, acido oxalico, acido malico, acido malonico, acido sucdnico, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido dtrico, acido benzoico, acido cinnamico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido p-toluensulfonico, acido salidlico y similares, como acidos inorganicos, como por ejemplo acido clorddrico, acido bromddrico, acido sulfurico, acido dtrico, acido fosforico y similares. A la inversa, la preparacion de sales basicas a partir de grupos acidos que pueden estar presentes en un peptido se preparan empleando una base farmaceuticamente aceptable como hidroxido de sodio, hidroxido de potasio, hidroxido de amonio, hidroxido de calcio, trimetilamina o similares.

En una forma de realización especialmente preferida, las composiciones farmaceuticas comprenden los peptidos en forma de sales de acido acetico (acetatos) o acido clorddrico (cloruros).

Ademas de ser utiles para el tratamiento del cancer, los peptidos de la presente invencion tambien son utiles para el diagnostico. Dado que muchos de los peptidos son generados por el glioblastoma y se ha determinado que dichos peptidos no estan presentes en tejidos normales, dichos peptidos pueden ser utilizados para diagnosticar la presencia de un cancer.

La presencia de los peptidos reivindicados en biopsias de tejido puede ayudar al histopatologo a diagnosticar un cancer. La deteccion de ciertos peptidos mediante anticuerpos, espectrometna de masas u otros metodos conocidos en la tecnica puede advertir al histopatologo de que el tejido es maligno o esta inflamado o enfermo. La presencia de grupos de peptidos puede permitir la clasificacion o subclasificacion de los tejidos enfermos.

La deteccion de los peptidos en una muestra de tejido enfermo puede ayudar a decidir si los tratamientos que implican al sistema inmunitario pueden ser beneficiosos, sobre todo si se sabe o se preve que los linfocitos T esten implicados en el mecanismo de accion. La perdida de expresion de MHC es un mecanismo conocido con el que las celulas infectadas o cancerosas logran eludir la vigilancia del sistema inmunitario. Asf pues, la presencia de los peptidos indica que dicho mecanismo no es utilizado por las celulas analizadas.

Los peptidos descritos pueden ser utilizados para analizar las respuestas de los linfocitos contra ellos, como son las respuestas de los linfocitos T o las respuestas de anticuerpos contra el peptido o el peptido unido a moleculas de MHC. Estas respuestas de los linfocitos pueden ser utilizadas como marcadores pronosticos para decidir los pasos posteriores del tratamiento. Dichas respuestas tambien pueden ser utilizadas como marcadores indirectos en las estrategias de inmunoterapia destinadas a estimular respuestas linfocitarias a traves de diferentes medios, como por ejemplo la vacunacion con protemas, acidos nucleicos, materiales autologos, o la transferencia de linfocitos de donantes. En el ambito de la terapia genica, las respuestas de los linfocitos contra los peptidos pueden tenerse en cuenta para la evaluacion de efectos secundarios. El control regular de las respuestas de los linfocitos tambien puede ser una herramienta valiosa para el seguimiento en trasplantes, por ejemplo, con el fin de detectar enfermedades del injerto contra el hospedador y del hospedador contra el injerto.

Los peptidos pueden usarse para generar y desarrollar anticuerpos espedficos contra complejos MHC/peptido. Estos pueden ser utilizados como terapia, dirigiendo toxinas o sustancias radiactivas contra el tejido enfermo. Otra aplicacion de estos anticuerpos consistina en dirigir radionuclidos contra el tejido enfermo en aplicaciones de diagnostico por la imagen como la TEP. Este uso puede ayudar a detectar metastasis pequenas o determinar el tamano y la ubicacion precisa de los tejidos enfermos.

Ademas se pueden utilizar para verificar el diagnostico histopatologico de cancer basado en una muestra de biopsia. La Tabla 3 muestra el peptido acorde con la presente invencion correspondiente a la SEQ ID N.° 3, los alelos HLA a los que se unen los peptidos respectivos y las protemas originarias de las que pueden surgir dichos peptidos. Reviste especial interes que el peptido acorde con la SEQ ID N.° 2 se una tanto a HLA-DR como a HLA-A*02, con lo que puede desencadenar dos respuestas distintas.

Tabla 3: Peptidos descritos

La expresion de BIRC5 (survivina), miembro de la familia de protemas inhibidoras de la apoptosis (IAP), es elevada en tejidos fetales y en diversos canceres humanos mientras que su expresion esta enormemente reducida en los tejidos diferenciados normales del adulto, sobre todo en aquellos cuyo mdice de proliferacion es bajo. La survivina parece ser capaz de regular tanto la proliferacion celular como la muerte celular apoptosica. Aunque la survivina se localiza normalmente en la region citoplasmatica de la celula, donde esta asociada con un mal pronostico en el cancer, tambien se ha descrito en el nucleo, localizacion donde indica un pronostico favorable (O'Driscoll et al., 2003). Se han descrito varios mecanismos de regulacion a traves de la survivina y de ella misma. La survivina parece estar relacionada con la chaperona molecular Hsp60. En condiciones in vivo, la Hsp60 aparece abundantemente expresada en los tumores humanos primarios en comparacion con los correspondientes tejidos normales. El silenciamiento agudo de la Hsp60 con ARN pequenos de interferencia desestabiliza la reserva mitocondrial de survivina, induce la disfuncion mitocondrial y activa la apoptosis dependiente de caspasas (Ghosh et al., 2008). Ademas, la inhibicion de Ras libera el «freno» que ejerce la survivina sobre la apoptosis y provoca la activacion de la via apoptosica mitocondrial. Especialmente en el glioblastoma, la resistencia a la apoptosis se puede neutralizar con un inhibidor de Ras dirigido contra la survivina (Blum et al., 2006). Asimismo, parece haber una correlacion entre la hiperactividad del NF-kappaB en los gliomas y la hiperexpresion de la survivina, uno de los genes diana del factor NF-kappaB. En consecuencia, los genes antiapoptosicos activados por el NF-kappaB estan hiperexpresados en muestras tumorales. Y especialmente en el glioblastoma se detectan niveles sumamente elevados de expresion de la survivina (Angileri et al., 2008). Se ha planteado que la sobreexpresion de la survivina en los gliomas cerebrales podna desempenar un papel importante en la proliferacion maligna, los mecanismos antiapoptosicos y la angiogenesis (Zhen et al., 2005; Liu et al., 2006). Se han realizado diversos analisis para estudiar la expresion de la survivina y su repercusion en la supervivencia en el marco del glioblastoma. En resumen, la expresion de la survivina, sobre todo la expresion simultanea en el nucleo y el citoplasma en los tumores astrodticos aparecio relacionada significativamente con el grado de malignidad (con la mayor expresion de survivina en el glioblastoma) y con tiempos de supervivencia global mas cortos que los pacientes con tumores negativos para la survivina (Kajiwara et al., 2003; Saito et al., 2007; Uematsu et al., 2005; Mellai et al., 2008; Grunda et al., 2006; Xie et al., 2006; Sasaki et al., 2002; Chakravarti et al., 2002).

La sobreexpresion de la survivina tambien se ha descrito en otros tipos de tumores. En el cancer de mama, la expresion de la survivina aparece asociada con un grado mayor y menor supervivencia sin progresion (Yamashita et al., 2007; Al-Joudi et al., 2007; Span et al., 2004). En estirpes celulares de cancer de esofago, la actividad promotora de la survivina ha resultado ser 28,5 veces mas elevada que en los tejidos normales (Sato et al., 2006). La expresion de la survivina en el cancer colorrectal tambien esta relacionada con el grado patologico y la metastasis ganglionar (Tan et al., 2005). Tambien se ha demostrado que la agresividad del carcinoma renal de celulas claras esta relacionada con la expresion de la survivina. Asimismo, su expresion esta inversamente relacionada con la supervivencia dependiente espedficamente del cancer (Kosari et al., 2005). La expresion de la survivina se puede detectar en un conjunto de neoplasias queratinodticas y lesiones cutaneas hiperproliferativas pero no en la piel normal (Bowen et al., 2004). En estirpes celulares de cancer de pancreas, la survivina apareda amplificada en el 58% de las estirpes celulares estudiadas (Mahlamaki et al., 2002). En el carcinoma epidermoide, la expresion de la survivina puede ayudar a identificar los casos con un fenotipo clrnico mas agresivo e invasivo (Lo et al., 2001).

Las posibilidades que ofrece la survivina como diana en el tratamiento contra el cancer ha propiciado la realización de estudios con peptidos derivados de la misma en los cuales ha demostrado su inmunogenicidad en pacientes oncologicos al desencadenar respuestas mediadas por los linfocitos T CD8+. Asimismo, la survivina estimulo de forma espedfica la reactividad de los linfocitos T CD4+ en linfocitos de sangre periferica de los mismos pacientes (Casati et al., 2003; Piesche et al., 2007).

La survivina (SVN, BIRC) se sobreexpresa en multitud de tipos de cancer distintos. Por lo que en general su sobreexpresion se considera vinculada con una menor supervivencia global y mayor grado de malignidad.

Piesche (2006) revelo como parte de su estudio (vease tambien (Piesche et al., 2007)), epftopos candidatos restringidos a HLA de clase II y MHC de clase II en la survivina (SVN) y en la proteinasa-3 (PR3), que fueron determinados utilizando el programa informatico TEPITOPE (Bian and Hammer, 2004). El analisis con TEPITOPE dio como resultado 6 epftopos candidatos de la SVN y 11 de la PR3 con una alta probabilidad de union a varios alelos HLA-DR. Los 17 peptidos se estudiaron en experimentos inmunologicos con linfocitos T una vez sintetizados y purificados por cromatograffa. Los peptidos manifestaron longitudes variables a consecuencia del solapamiento de epftopos que se consideraron juntos en un peptido (Tabla 4).

Tabla 4: Nombre, posicion de los AA y secuencias de AA de los peptidos sinteticos de la SVN revelados por Piesche 2006.

Piesche llevo a cabo experimentos de titulacion con los peptidos correspondientes para estimar la afinidad entre el HLA y los peptidos o la avidez del TCR por el complejo peptido-HLA. Cuanto menor es la concentracion de peptido mayor es la afinidad de union de los epftopos peptfdicos a las moleculas de MHC, un prerrequisito importante para la presentacion natural de los «autenticos» epftopos de linfocito T procedentes del procesamiento intracelular del antfgeno proteico. La actividad proliferativa semimaxima medida de los clones de linfocitos T espedficos de cada peptido fue: <50 nM en el caso del S¹⁰, 400-700 nM en el del S⁴⁰, 2000-3000 nM en el del Sas y 100-300 nM en el del P⁵⁸. Piesche indico ademas que solo el peptido S¹⁰de la SVN desencadeno la proliferacion de linfocitos T espedficos tras la exposicion a la protema SVN recombinante. Esto se demostro en tres clones de linfocitos T espedficos del S¹⁰procedentes de donantes diferentes. Piesche et al. investigaron el procesamiento y la presentacion de los epftopos peptidicos de la SVN a partir del antigeno natural mediante el cocultivo de clones de linfocitos T espedficos del peptido con celulas dendrfticas expuestas a la protema SVN. Solo el peptido Siode la SVN fue capaz de causar la proliferacion de los linfocitos T espedficos durante la exposicion a la protema SVN recombinante. Esto se demostro en tres clones de linfocitos T espedficos del Sio procedentes de donantes diferentes. No se detecto ninguna proliferacion espedfica como respuesta al antigeno natural en los clones de linfocitos T espedficos de la PR³.

Ademas, antigenos tumorales procedentes de celulas tumorales apoptosicas o necroticasfueron internalizados por APC in vivo, procesados independientemente de las MHC II y presentados a linfocitos T CD4+. Para el reconocimiento por parte de los linfocitos T del autentico epftopo S10, se expusieron celulas dendrfticas a lisados de celulas tumorales procedentes de varias estirpes de celulas tumorales positivas para la SVN. En el caso del epftopo S10, se detecto el reconocimiento directo in vitro de las CD expuestas al lisado de estirpes de celulas tumorales Karpas-422, Jurkat y HL-60. Esto se demostro al menos en tres clones de linfocitos T espedficos del Sio procedentes de donantes diferentes. A fin de demostrar que el epftopo Sio puede provocar una respuesta inmunitaria en pacientes oncologicos es preciso confirmar la presencia de los correspondientes linfocitos T CD4+ en la sangre de dichos pacientes. Se aislaron PBMC de varios pacientes y se estimularon con el peptido Sio. Con ese fin se extrajeron muestras de PBMC de los pacientes antes de iniciar el tratamiento y del inicio del tratamiento citotoxico-citostatico, y como celulas presentadoras de antfgeno/peptido se emplearon los monocitos y los linfocitos B contenidos en la fraccion de PBMC. Tras una semana de cultivo, las celulas se analizaron para determinar la proliferacion espedfica del peptido con un ensayo de incorporacion de [³H]-timidina. En tres de los i3 pacientes analizados se detecto la respuesta proliferativa in vitro.

La aplicacion potencial de los epftopos peptfdicos en la inmunoterapia depende basicamente de si los linfocitos T CD4+ espedficos de peptido responden al antigeno correspondiente. El reconocimiento del antigeno proteico procesado naturalmente en forma de epftopos «autenticos» o «reales» depende en principio de varios factores. Piesche mostro que el reconocimiento de la protema solo resulto detectable con el epftopo Sio de la SVN. Con los demas peptidos identificados no se detecto el reconocimiento de la protema (SVN: S⁴o y S8&PR3: P⁵⁸, P²i⁶, P²³⁵y P²³⁹). Piesche et al. afirmaron que durante la proteolisis endosomica es importante que los motivos de secuencia presentes no sean degradados, como en el caso de los epftopos «cnpticos». En contraste con los epftopos restringidos a MHC de clase I, las moleculas MHC de clase II pueden captar peptidos de longitud variable (i2-28) y, por tanto, no es necesaria la escision de los epftopos peptfdicos en longitudes concretas.

Los inventores revelan sorprendentemente en la presente invencion que otro epftopo, la SEQ ID N.° i, derivado de la survivina que es mas corto que el S88, pero tambien se solapa, genero una potente respuesta inmunitaria en i6 de i9 pacientes in vivo (vease el ejemplo 4). Debido al elevado polimorfismo del locus HLA-DR, esto tambien demuestra la union altamente promiscua del peptido de la SEQ ID N.° i como se hada predicho, puesto que la respuesta inmunitaria solo se puede desencadenar con la union de un peptido a una molecula HLA.

La importancia de los diversos tipos de cancer en los que se ha descrito la sobreexpresion de la survivina se indica en la Tabla 2. Los tipos de cancer en los que se describe con frecuencia la sobreexpresion de la survivina fueron responsables de mas de 4i5. ooo muertes en 2oo7 (vease la tabla i).

Piesche et al. (2oo6) demostraron en condiciones in vitro la presencia de precursores adecuados del peptido S88 en tres de cuatro donantes con alelos HLA-DR solapados. En este caso el peso de las pruebas es demasiado pequeno para deducir la union promiscua del S88 al HLA-D^r, puesto que los resultados se pueden explicar por la union a dos alelos HLA-DR distintos (p. ej. DR3 y D R ii, o DRi y DR3, o D R ii y DR4). Asimismo, los indices de estimulacion obtenidos en un ensayo de proliferacion bastante inespedfico (incorporacion de [3H]-timidina) en cultivos de PBMC enteras son bastante bajos y no se realizaron con un control positivo (p. ej. una mezcla conocida de peptidos virales fuertemente inmunogenicos) ni controles negativos adecuados (estimulacion durante el ensayo de proliferacion con un peptido control irrelevante). Los datos sobre las frecuencias de los precursores no fueron confirmados con un segundo ensayo de otro tipo.

WO 2oo7/o36638 (Wang et al.), entre otras, da a conocer peptidos de la survivina con las siguientes secuencias de aminoacidos

96 -iio (LTLGEFLKLDRERAK; SEQ ID N.° 25);

99 -ii3 (GEFLKLDRERAKNKI; SEQ ID N.° 26); y

io 2 - ii6 (LKLDRERAKNKIAKE; SEQ ID N.° 27).

Como region que se une a moleculas HLA de MHC II con una afinidad «buena» (CI⁵o<iooo nM), se describe la region 84 a i i3. No obstante, los peptidos como los examinados por Wang et al. presentan un espectro muy amplio de union con las diferentes moleculas de HLA, y dicha union incluso difiere drasticamente dentro de dicha region tal y como se describe, cuando la secuencia de los peptidos vana en uno o dos aminoacidos.

El peptido de la presente invencion de la SEQ ID N.° 3 (TLGEFLKLDRERAKD; peptido «BIR-oo2a») comprende una secuencia del peptido BIR-oo2 de la SEQ ID N.° i, excepto que en el extremo C-terminal, dicho peptido acaba con el aminoacido acido aspartico (D) en lugar de asparragina (N). El peptido se solapa con el peptido S88 de Piesche, que i6

contiene los tres ultimos aminoacidos NKI. Tal y como se ha dicho, el peptido S88 se mostro inactivo en un ensayo de proliferacion de linfocitos T espedficos en el curso de la exposicion a la protema SVN recombinante. En cambio, el peptido BIR-002a presento una potente respuesta inmunitaria relacionada con moleculas MHC II. Sin pretension de limitarse a la teona, se supone que la conversion enzimatica de la asparragina en acido aspartico mediante una asparraginasa tiene lugar in vivo, y de ese modo el aminoacido C-terminal queda modificado (y el peptido queda activado y/o activado en mayor grado). Como la asparragina C-terminal del peptido de Piesche S88 queda bloqueada por dos aminoacidos, dicho peptido permanece inactivo (hecho que pone de manifiesto la importancia de un solo cambio de aminoacido en la actividad de dicho peptido).

Asimismo, se comprobo que las respuestas inmunitarias y las actividades de otros peptidos que conteman la asparragina C-terminal (como, por ejemplo, la SEQ ID N.° 1) tal vez dependan tambien de la modificacion del extremo C-terminal en otro aminoacido acido, en concreto en acido aspartico. Por tanto, en un aspecto de la presente invencion, el peptido acorde con la SEQ ID N.° 1 puede ser considerado como un «profarmaco» de la SEQ ID N.° 3, que proporciona el peptido activo acorde con la SEQ ID N.° 3 tras la conversion enzimatica. Debe entenderse que la presente invencion tambien abarca la conversion qmmica del aminoacido, en concreto de la asparragina, y la desamidacion espontanea por la perdida de una molecula de agua.

Asimismo, los ejemplos que demuestran la actividad del peptido acorde con la SEQ ID N.° 1 sustentan tambien la actividad del peptido modificado acorde con la SEQ ID N.° 3.

Ademas, en el contexto de la presente invencion puede llegar a constatarse que las solubilidades de los peptidos en la zona del peptido BIR-002 (region 84 a 113) difieren drasticamente de la de otros peptidos muy similares. Cabe subrayar que en Wang et al. los peptidos de la region cercana al peptido BIR-002 eran en realidad insolubles por lo que los estudios de union no se pudieron llevar a cabo.

Se comprobo que las solubilidades eran las siguientes:

BIR-002 (SEQ ID N.° 1): < 32,9 mg/ml (acetato)

BIR-002a (SEQ ID N.° 3) (D en lugar de N en el extremo C-terminal): < 23,5 mg/ml

BIR-014 (peptido comparativo de Wang, SEQ ID N.° 25): < 99,5 mg/ml

Existe otro aspecto mas que se refiere a un anticuerpo que se une espedficamente a un complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase II que forma un complejo con un antfgeno restringido a HLA (en lo sucesivo tambien denominado «anticuerpo espedfico de complejo»). Aun existe otro aspecto mas que se refiere a un metodo para producir dicho anticuerpo que se une espedficamente a un complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase II que forma un complejo con un antfgeno restringido a HLA, comprendiendo dicho metodo: inmunizar un mairnfero no humano geneticamente modificado que comprenda celulas que expresen dicho complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase II con una forma soluble de una molecula MHC de clase II unida a dicho antfgeno restringido a HLA; aislamiento de moleculas de ARNm a partir de celulas productoras de anticuerpos de dicho mamffero no humano; produccion de una fagoteca que contenga moleculas proteicas codificadas por dichas moleculas de ARNm; y aislamiento de al menos un fago de dicha fagoteca, en que al menos ese fago contenga dicho anticuerpo capaz de unirse espedficamente al citado complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase II unido con dicho antfgeno restringido a HLA. Metodos pertinentes para la produccion de tales anticuerpos y de complejos mayores de histocompatibilidad de clase I monocatenarios, asf como de otras herramientas para la produccion de tales anticuerpos se revelan en WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, y en Cohen CJ, Denkberg G, Lev A, Epel M, Reiter Y. Recombinant antibodies with MHC-restricted, peptide-specific, T-cell receptor-like specificity: new tools to study antigen presentation and TCR-peptide-MHC interactions. J Mol Recognit. 2003 Sep-Oct;16(5):324-32.; Denkberg G, Lev A, Eisenbach L, Benhar I, Reiter Y. Selective targeting of melanoma and APCs using a recombinant antibody with TCR-like specificity directed toward a melanoma differentiation antigen. J Immunol. 2003 Sep 1;171(5):2197-207; y en Cohen CJ, Sarig O, Yamano Y, Tomaru U, Jacobson S, Reiter Y. Direct phenotypic analysis of human MHC class I antigen presentation: visualization, quantitation, and in situ detection of human viral epitopes using peptide-specific, MHC-restricted human recombinant antibodies. J Immunol. 2003 Apr 15; 170(8):4349-61.

Preferiblemente el anticuerpo se une al complejo con una afinidad de union inferior a 20 nanomolar, preferentemente a 10 nanomolar, lo cual se considera «espedfico» en el contexto de la presente invencion.

El termino «anticuerpo» se utiliza en la presente memoria en sentido amplio e incluye tanto anticuerpos policlonales como monoclonales. Ademas de las moleculas de inmunoglobulina intactas, el termino «anticuerpos» tambien incluye fragmentos o polfmeros de esas moleculas de inmunoglobulina y versiones humanizadas de moleculas de inmunoglobulina, siempre que posean alguna de las propiedades deseadas (p. ej., ser un anticuerpo espedfico de complejo como se ha definido arriba, administracion de una toxina contra una celula cancerosa que exprese un gen marcador de cancer con un nivel elevado, y/o inhibicion de la actividad de un polipeptido marcador del cancer, como la survivina) descritas en la presente memoria.

Los anticuerpos de la invencion tambien se pueden fabricar con metodos consabidos. La persona versada en la tecnica entiende que para fabricar los anticuerpos de la invencion se pueden emplear tanto polipeptidos marcadores de cancer enteros como fragmentos de los mismos. El polipeptido necesario para generar un anticuerpo de la invencion se puede purificar parcial o completamente de una fuente natural o se puede producir con tecnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, un ADNc que codifica un polipeptido de la survivina, o un fragmento de los mismos, se puede expresar en celulas procariotas (p. ej., bacterias) o celulas eucariotas (p. ej., de levadura, insecto o mairnfero), a partir de las cuales se puede purificar una protema recombinante con la que generar una preparacion de anticuerpo monoclonal o policlonal que se una espedficamente al polipeptido marcador de cancer usado para generar el anticuerpo. Los anticuerpos espedficos de complejo se generaran habitualmente tal y como se ha indicado antes.

Una persona versada en la tecnica sabra que la generacion de dos o mas conjuntos diferentes de anticuerpos monoclonales o policlonales maximiza la probabilidad de obtener un anticuerpo dotado de la especificidad y la afinidad necesarias para el uso previsto (p. ej., ELISA, inmunohistoqmmica, tecnicas de imagen in vivo, tratamiento con inmunotoxinas). Los anticuerpos son analizados para buscar la actividad deseada con metodos conocidos, de acuerdo con el fin previsto para los anticuerpos (p. ej., ELISA, inmunohistoqmmica, inmunoterapia, etc.; para mas detalles sobre la generacion y el analisis de anticuerpos, vease, por ejemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1988). Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser analizados con pruebas ELISA, inmunoelectrotransferencia (Western blot), tincion inmunohistoqmmica de cortes de tejido canceroso congelados o fijados en formol. Despues de la caracterizacion in vitro inicial, los anticuerpos destinados a uso terapeutico o diagnostico in vivo se analizan con metodos de ensayo clmico conocidos.

El termino «anticuerpo monoclonal» tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion notablemente homogenea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por mutaciones posiblemente naturales que pueden estar presentes en pequeno numero. Los anticuerpos monoclonales de la presente memoria incluyen espedficamente anticuerpos «quimericos» en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie concreta o pertenecientes a una clase o subclase concreta de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o cadenas es identica u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, asf como a fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad antagonista deseada (N.° pat. de EE. UU. 4.816.567).

Los anticuerpos monoclonales de la invencion se pueden preparar con metodos basados en hibridomas. En el metodo del hibridoma, un raton u otro animal hospedador adecuado es vacunado con un agente inmunizante que estimula a los linfocitos para que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan espedficamente al agente inmunizante. Otra alternativa consiste en inmunizar los linfocitos in vitro.

Los anticuerpos monoclonales tambien se pueden fabricar con metodos de ADN recombinante, como los descritos en la Pat. de EE.UU. N.° 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invencion puede ser facilmente aislado y secuenciado con procedimientos convencionales (p. ej. con sondas oligonucleotidicas capaces de unirse espedficamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de raton).

Los metodos in vitro tambien son adecuados para la preparacion de anticuerpos monovalentes. La digestion de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, en particular fragmentos Fab, se puede llevar a cabo con tecnicas ordinarias conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, la digestion se puede realizar con papama. Ejemplos de la digestion con papama aparecen descritos en WO 94/29348, publicada el 22 de diciembre de 1994 y en la Pat. de EE. UU. N.° 4.342.566. La digestion de anticuerpos con papama normalmente produce dos fragmentos de union a antfgeno identicos llamados fragmentos Fab, cada uno dotado de un sitio de union al antfgeno, asf como un fragmento residual Fc. El tratamiento con pepsina da como resultado un fragmento que tiene dos sitios de combinacion con antfgenos y todavfa es capaz de reconocer antfgenos de reactividad cruzada.

Los fragmentos de anticuerpo, esten unidos a otras secuencias o no, tambien pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones y otras modificaciones seleccionadas de regiones particulares o de residuos de aminoacidos espedficos, siempre que la actividad de los fragmentos no se vea significativamente alterada o afectada respecto al anticuerpo o el fragmento de anticuerpo intactos. Estas modificaciones pueden ofrecer alguna propiedad adicional, como eliminar o anadir aminoacidos capaces de establecer puentes de sulfuro para aumentar la biolongevidad, alterar las caractensticas de secrecion, etc. En cualquier caso, el fragmento de anticuerpo debe poseer una propiedad bioactiva, como actividad de union, regulacion de union al dominio de union, etc. Las regiones activas o funcionales del anticuerpo pueden ser identificadas por mutagenesis de una region espedfica de la protema, seguida por la expresion y el analisis del polipeptido expresado. Tales metodos son obvios para toda persona versada en la tecnica y pueden incluir la mutagenesis dirigida del acido nucleico que codifica el fragmento de anticuerpo.

Los anticuerpos de la invencion tambien pueden comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (p. ej. de raton) son inmunoglobulinas quimericas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos quimericos de las mismas (como Fv, Fab, Fab' u otras secuencias de union a antfgeno de los anticuerpos) que contienen una pequena secuencia derivada de inmunoglobulinas no humanas. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en que los residuos de una region determinante de complementariedad (CDR) del receptor son sustituidos por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como raton, rata o conejo que esta dotada de la especificidad, la afinidad y la capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos estructurales (FR) del fragmento Fv de la inmunoglobulina humana son sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados tambien pueden comprender residuos que no estan presentes ni en el anticuerpo receptor ni en el CDR importado o en las secuencias estructurales. En general, el anticuerpo humanizado comprendera casi todas de al menos uno, y normalmente de dos dominios variables, en los que todas o casi todas las regiones CDR corresponderan a las de la inmunoglobulina no humana y todas o casi todas las regiones FR seran las de una secuencia consenso de la inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado idealmente tambien comprendera al menos una porcion de una region constante de la inmunoglobulina (Fc), normalmente de una inmunoglobulina humana.

Los metodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la tecnica. En general, a un anticuerpo humanizado se le introducen uno o varios residuos de aminoacidos de origen no humano. Estos residuos de aminoacidos no humanos con frecuencia son denominados residuos «importados», que normalmente se extraen del dominio variable «importado». La humanizacion se puede llevar a cabo basicamente sustituyendo la o las secuencias CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por tanto, tales anticuerpos «humanizados» son anticuerpos quimericos (Pat. EE. UU. N.° 4.816.567), en los que una parte notablemente mas pequena que un dominio variable humano intacto ha sido sustituida por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados normalmente son anticuerpos humanos en los que se han sustituido algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR por residuos de sitios analogos de anticuerpos de roedor.

Se pueden emplear animales transgenicos (p. ej. ratones) que tras la inmunizacion sean capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos sin producir inmunoglobulinas endogenas. Por ejemplo, se ha descrito que la delecion homocigota del gen de la region de union de la cadena pesada del anticuerpo en ratones quimericos y mutantes germinales provoca la inhibicion completa de la produccion endogena de anticuerpos. La transferencia de la matriz genica de la inmunoglobulina de la lmea germinal humana a dichos ratones mutantes de la lmea germinal dara como resultado la produccion de anticuerpos humanos tras la exposicion al antfgeno. Los anticuerpos humanos tambien se pueden producir en fagotecas, por ejemplo como se ha descrito antes en el caso de los anticuerpos espedficos de complejo.

Los anticuerpos de la invencion se administran preferiblemente a un sujeto incorporandolos en un vehteulo farmaceuticamente aceptable. Normalmente a la formulacion se le anade una cantidad apropiada de una sal farmaceuticamente aceptable para que sea isotonica. Ejemplos de vehteulos farmaceuticamente aceptables son solucion salina, solucion Ringer y solucion de dextrosa. Es preferible que el pH de la solucion este comprendido aproximadamente entre 5 y 8, y mas preferiblemente entre 7 y 7,5 aproximadamente. Otros vehteulos incluyen preparaciones de liberacion prolongada como matrices semipermeables de polfmeros hidrofobicos solidos que contengan el anticuerpo, en matrices con forma modelada, p. ej. pelteulas, liposomas o micropartteulas. Para las personas versadas en la tecnica sera evidente que son preferibles ciertos vehteulos dependiendo de la via de administracion y de la concentracion del anticuerpo que se va a administrar, por ejemplo.

Los anticuerpos se pueden administrar al sujeto, al paciente o a las celulas mediante inyeccion (intravenosa, intraperitoneal, subcutanea, intramuscular, etc.), o con otros metodos como la infusion que aseguren su liberacion efectiva en el torrente sangumeo. Los anticuerpos tambien se pueden administrar por via intratumoral o peritumoral para ejercer un efecto terapeutico a la par sistemico y local. Se prefiere la inyeccion local o intravenosa.

Las dosis y pautas de administracion mas adecuadas se pueden determinar empmcamente; la toma de decisiones a este respecto forma parte de los conocimientos de la materia. Las personas versadas en la materia saben que la dosis de anticuerpos a administrar depende, por ejemplo, del sujeto que va a recibir al anticuerpo, la via de administracion, el tipo concreto de anticuerpo y de otros medicamentos que se le esten administrando. Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al, eds. Raven Press, New York (1977) pp. 365-389. La dosis diaria tfpica de anticuerpo cuando se utiliza solo puede oscilar entre 1 pg/kg y 100 mg/kg de peso corporal o mas por dfa, dependiendo de los susodichos factores. Tras la administracion del anticuerpo como tratamiento contra el cancer, su eficacia se puede evaluar de varios modos bien conocidos por el medico especialista. Por ejemplo, se puede controlar el tamano, el numero y/o la distribucion del cancer en el sujeto receptor del tratamiento utilizando tecnicas de imagen oncologicas estandar. Todo anticuerpo administrado con fines terapeuticos que detenga el crecimiento del tumor, reduzca su extension y/o impida la aparicion de nuevos tumores en contraste con la evolucion de la enfermedad si no se produjera la administracion del anticuerpo, es un anticuerpo eficaz para el tratamiento del cancer.

Los anticuerpos tambien se pueden utilizar para ensayos diagnosticos in vivo. En general, el anticuerpo se marca con un radionuclido (como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P o 35S) de modo que el tumor puede ser localizado con inmunogammagraffa. En una forma de realización, anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen a los dominios extracelulares de dos o mas dianas de cancer y el valor de afinidad (Kd) es inferior a 1 x 10 pM.

Los anticuerpos para uso diagnostico pueden ser marcados con sondas adecuadas para posibilitar la deteccion con diferentes metodos opticos. Los metodos para la deteccion de sondas incluyen, entre otros, microscopfa de fluorescencia, optica, confocal y electronica; resonancia magnetica y espectroscop^a; radioscopia, tomograffa computadorizada y tomograffa por emision de positrones. Las sondas adecuadas incluyen, entre otras, fluorescema, rodamina, eosina y otros fluoroforos, radioisotopos, oro, gadolinio y otros lantanidos, hierro paramagnetico, fluor-18 y otros radionuclidos emisores de positrones. Ademas, las sondas pueden ser bi o multifuncionales y ser detectables por mas de uno de los metodos enumerados. Los anticuerpos pueden marcarse directa o indirectamente con dichas sondas. La fijacion de sondas a los anticuerpos incluye la union covalente de la sonda, la incorporacion de la sonda en el anticuerpo, y la union covalente de un compuesto quelante para unir la sonda, entre otros metodos consabidos en la tecnica. Para las tecnicas de inmunohistoqmmica, la muestra de tejido patologico puede ser fresca o congelada o puede estar incluida en parafina y fijada con un conservante como formol. El corte fijado o incluido que contiene la muestra se pone en contacto con un anticuerpo primario marcado y un anticuerpo secundario, de modo que el anticuerpo se emplea para detectar la expresion in situ de la protema NCAN.

La presente invencion proporciona asf un peptido consistente en la secuencia acorde con la SEQ ID N.° 3.

En una forma de realización preferida para el tratamiento del carcinoma de celulas renales el peptido de la SEQ ID N.° 3 se usa en combinacion con al menos dos de los peptidos de las SEQ ID N.° 4 a 13 y la SEQ ID N.° 24. El peptido de la SEQ ID N.° 3 puede ser administrado por separado o junto con otros peptidos en una formulacion.

En WO 2007/028573 se da a conocer una descripcion detallada de los peptidos y los anffgenos indicados arriba. En una forma de realización preferida para el tratamiento del cancer de colon el peptido de la SEQ ID N.° 3 se usa en combinacion con al menos dos de los peptidos de las SEQ ID N.° 15 a 24, 4, 8, 1l o 12. El peptido de la SEQ ID N.° 3 puede ser administrado por separado o junto con otros peptidos en una formulacion.

En EP07014796.2 y US 60/953.161 se da a conocer una descripcion detallada de los peptidos y los antigenos indicados arriba.

El peptido de la invencion tiene la capacidad de unirse a una molecula del complejo mayor de histocompatibilidad humana (MHC) de clase II.

En la presente invencion el termino «hom6logo» se refiere al grado de identidad (vease antes Identidad porcentual) entre las secuencias de dos secuencias de aminoacidos, es decir secuencias peptfdicas o polipeptidicas. La susodicha «homologfa» se determina comparando las dos secuencias alineadas en condiciones optimas con las secuencias a comparar. Las secuencias que se comparan en la presente memoria pueden tener una adicion o delecion (por ejemplo, un hueco o similar) en la alineacion optima de las dos secuencias. La homologfa de secuencia se puede calcular creando una alineacion con el algoritmo ClustalW, por ejemplo (Nucleic Acid Res., 22(22): 4673 4680 (1994). Bases de datos publicas proporcionan software para el analisis de secuencias, en concreto, Vector NTI, GENETYX y otras herramientas de analisis.

Una persona versada en la materia sera capaz de valorar si los linfocitos T inducidos por una variante del peptido espedfico seran capaces de reaccionar con el propio peptido (Fong et al., 2001) (Zaremba et al., 1997; Colombetti et al., 2006; Appay et al., 2006).

Es sabido que los peptidos que son presentados por MHC de clase II estan compuestos por una «secuencia central» dotada de un secuencia de aminoacidos que se ajusta a cierto motivo espedfico del alelo de HLA y, opcionalmente, de extensiones N- y/o C-terminales que no interfieren con la funcion de la secuencia central (es decir, que se consideran irrelevantes para la interaccion del peptido y todos o una parte de los clones de linfocitos T que reconocen la contrapartida natural). Las extensiones N- y/o C-terminales pueden, por ejemplo, tener entre 1 y 10 aminoacidos de longitud, respectivamente. Estos peptidos se pueden utilizar directamente para cargar las moleculas MHC de clase II o bien la secuencia se puede clonar en vectores de acuerdo con la descripcion ofrecida abajo en la presente memoria. Dado que estos peptidos constituyen el producto final del procesamiento de peptidos mas grandes en el interior de la celula, tambien pueden utilizarse peptidos mas largos.

En el caso de los peptidos restringidos a MHC de clase II, la molecula MHC puede presentar varios peptidos distintos dotados de la misma secuencia central. Como la interaccion con el linfocito T reconocedor (cooperador) depende de la secuencia central de 9 a 11 aminoacidos, el mismo clon de linfocito T (cooperador) puede reconocer varias variantes de longitud. Asf pues, para la carga directa de moleculas MHC de clase II se pueden usar diversas variantes de longitud de una secuencia de union central sin necesidad de ningun procesamiento adicional ni recortes en los extremos N y C-terminal. En consecuencia, las variantes naturales o artificiales que estimulan la reaccion cruzada de los linfocitos T con un peptido de la invencion son a menudo variantes de longitud.

Si un peptido mas largo de aproximadamente 12 residuos de aminoacidos se utiliza directamente para unirse a una molecula MHC de clase II, es preferible que los residuos que flanquean la region de union a HLA central sean residuos que no afecten sustancialmente a la capacidad del peptido para unirse espedficamente a la hendidura de union de la molecula MHC de clase II o presentar el peptido al linfocito T (cooperador). No obstante, como se ha indicado arriba, se apreciara que es posible usar peptidos mas grandes, p. ej. los codificados por un polipeptido, ya que estos peptidos mas grandes pueden ser fragmentados por celulas presentadoras de antfgeno adecuadas. No obstante, en algunos casos se ha demostrado que las regiones que flanquean la secuencia central pueden influir en la union del peptido a la molecula MHC de clase II o en la interaccion del complejo dimerico MHC:peptido con el TCR en ambas direcciones en comparacion con un peptido de referencia dotado de la misma secuencia central. Las estructuras terciarias intramoleculares del peptido (p. ej. bucles) normalmente reduce la afinidad hacia el MHC o el TCR. Las interacciones intermoleculares de las regiones flanqueantes con otras partes del MHC o del TCR aparte de la misma hendidura de union al peptido pueden estabilizar la interaccion. Esos cambios de afinidad pueden ser determinantes para que el peptido de MHC de clase II estimule de forma efectiva la respuesta de los linfocitos T (cooperadores).

Tambien es posible que los epftopos de MHC de clase I, aunque suelen tener entre 8 y 10 aminoacidos de longitud, sean generados por el procesamiento de peptidos mas largos o protemas que incluyen el epftopo real. Se prefiere que los residuos que flanquean el epftopo de interes sean residuos que no afecten sustancialmente a la digestion proteolftica necesaria para exponer el epftopo durante el procesamiento.

El peptido acorde con la presente invencion tiene la capacidad de unirse a una molecula del complejo mayor de histocompatibilidad humana (MHC) de clase II. La union de un peptido o una variante a un complejo MHC puede ser analizada mediante metodos conocidos en la tecnica, como por ejemplo los descritos en la bibliograffa para diferentes alelos de MHC de clase II(p. ej. Vogt et al., 1994; Malcherek et al., 1994; Manici et al., 1999; Hammer et al., 1995; Tompkins et al., 1993; Boyton et al., 1998).

Un peptido como el descrito, ademas de la secuencia acorde con cualquiera de las SEQ ID N.° 1 a N.° 3 o con una variante de las mismas puede contener segmentos adicionales de aminoacidos en los extremos N- y/o C-terminal que no forman parte necesariamente del peptido que funciona como un epftopo para el epftopo de moleculas MHC. No obstante, dichos segmentos pueden ser importantes para facilitar la introduccion eficaz del peptido acorde con la presente invencion en las celulas. En una forma de realización de la presente invencion, el peptido es parte de una protema de fusion que comprende, por ejemplo, los 80 aminoacidos N-terminales de la cadena invariable asociada al antigeno HLA-DR (p33, en lo sucesivo «Ii») tal y como aparece en el NCBI, numero de acceso de GenBank X00497 (Strubin, M. et al. 1984).

Ejemplos de otros peptidos preferidos incluyen peptidos dotados de un subtipo de HLA espedfico y que son capaces de estimular linfocitos CD8, y en los que dicho peptido comprende el motivo de aminoacidos de anclaje espedfico mostrado a continuacion en la Tabla 6.

Tabla 6: Subtipos de HLA y motivos de anclaje del peptido preferido acorde con la SEQ ID N.° 24

Ademas, el peptido o variante pueden ser modificados aun mas para mejorar la estabilidad y/o la union a las moleculas de MHC con el fin de desencadenar una respuesta inmunitaria mas potente. Los metodos para conseguir esa optimizacion de una secuencia peptfdica son bien conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, la introduccion de enlaces peptfdicos inversos o enlaces no peptfdicos.

En un enlace peptfdico inverso los residuos de aminoacido no estan unidos por enlaces peptfdicos (-CO-NH-) sino que el enlace peptfdico esta invertido. Estos peptidomimeticos retro-inversos pueden sintetizarse con metodos conocidos en la tecnica, como por ejemplo los descritos por Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237. Esta estrategia implica la smtesis de seudopeptidos que contengan cambios en la estructura principal, pero no en la orientacion de las cadenas laterales.

Meziere y cols. (1997) demuestran que estos seudopeptidos resultan utiles para la union al MHC y las respuestas de los linfocitos T cooperadores. Los peptidos retro-inversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptfdicos CO-NH, son mucho mas resistentes a la proteolisis.

Enlaces no peptfdicos son, por ejemplo: -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- y -CH2SO-. La patente de Estados Unidos 4.897.445 proporciona un metodo para la smtesis en fase solida de enlaces no peptfdicos (-CH²-NH) en cadenas polipeptfdicas que implica la obtencion de polipeptidos con procedimientos estandar y la smtesis del enlace no peptfdico mediante la reaccion de un aminoaldeddo y un aminoacido en presencia de NaCNBH³.

Peptidos que comprenden las secuencias descritas arriba pueden ser sintetizados con otros grupos qmmicos anadidos en los extremos amino y/o carboxi, con el fin de mejorar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la afinidad de los peptidos. Por ejemplo, grupos hidrofobicos como los grupos carbobenzoxilo, dansilo, o t-butiloxicarbonilo pueden anadirse a los extremos amino de los peptidos. De manera similar, se puede colocar un grupo acetilo o un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo en los extremos amino de los peptidos. Asimismo, p. ej. el grupo hidrofobico tbutiloxicarbonilo, o un grupo amido pueden ser anadidos en los extremos carboxflicos de los peptidos.

Adicionalmente, todos los peptidos descritos pueden ser sintetizados para alterar su configuracion esterica. Por ejemplo, puede utilizarse el D-isomero de uno o mas de los residuos de aminoacidos del peptido en lugar del L-isomero habitual. Y aun mas, al menos uno de los residuos de aminoacidos de los peptidos de la invencion puede ser sustituido por uno de los consabidos residuos de aminoacidos no naturales. Alteraciones como estas pueden servir para aumentar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la capacidad de union de los peptidos de la invencion. De manera similar, un peptido o variante descritos pueden ser modificados qmmicamente mediante la reaccion con aminoacidos espedficos antes o despues de la smtesis del peptido. Ejemplos de tales modificaciones son bien conocidos en la tecnica y aparecen resumidos por ejemplo en R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005, que se incorpora en la presente memoria como referencia. La modificacion qmmica de aminoacidos incluye, sin ammo limitativo, la modificacion por acilacion, amidinacion, piridoxilacion de lisina, alquilacion reductora, trinitrobencilacion de grupos amino con acido 2,4,6-trinitrobencenosulfonico (TNBS), transformacion de grupos carboxilo en grupos amida y oxidacion del grupo sulfhidrilo con acido performico para convertir la cistema en acido cisteico, formacion de derivados mercuriales, formacion de disulfuros mixtos con otros compuestos tiol, reaccion con maleimida, carboximetilacion con acido yodoacetico o yodoacetamida y carbamoilacion con cianato a pH alcalino, aunque sin limitacion a ello. A este respecto, se remite a las personas versadas en la tecnica al Capftulo 15 de Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000), donde hallaran una metodologfa mas extensa relacionada con la modificacion qmmica de protemas. En resumen, la modificacion de p. ej. los residuos arginilos de las protemas se basa a menudo en la reaccion de compuestos dicarbonilo adyacentes como fenilglioxal, 2,3-butanodiona y 1,2-ciclohexanodiona para formar un aducto. Otro ejemplo es la reaccion del metilglioxal con residuos de arginina. La cistema se puede modificar sin la modificacion simultanea de otros sitios nucleofflicos como sucede con la lisina y la histidina. Asf pues, para la modificacion de la cistema hay disponible un gran numero de reactivos. Las paginas web de empresas como Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) ofrecen informacion sobre reactivos concretos.

La reduccion selectiva de los puentes disulfuro de las protemas tambien es habitual. El tratamiento termico al cual se someten los productos biofarmaceuticos a veces genera y oxida puentes disulfuro.

El reactivo K de Woodward se puede utilizar para modificar residuos de acido glutamico concretos. Se puede emplear N-(3-(dimetilamino)propil)-N'-etilcarbodiimida para formar enlaces cruzados intramoleculares entre un residuo de lisina y un residuo de acido glutamico.

Por ejemplo, el dietilpirocarbonato es un reactivo empleado para la modificacion de residuos histidilo en protemas. La histidina tambien puede ser modificada con 4-hidroxi-2-nonenal.

La reaccion de los residuos de lisina y otros grupos a-amino es util, por ejemplo, para la union de peptidos a superficies o para la formacion de enlaces cruzados entre protemas/peptidos. La lisina es el sitio de fijacion del poli(etilen)glicol y el principal sitio de modificacion en la glucosilacion de protemas. Los residuos de metionina de las protemas se pueden modificar por ejemplo con yodoacetamida, bromoetilamina y cloramina T. Los residuos tirosilo se pueden modificar con tetranitrometano y N-acetilimidazol. La formacion de enlaces cruzados por medio de la formacion de ditirosina se puede consumar con peroxido de hidrogeno/iones de cobre.

En estudios recientes sobre la modificacion del triptofano se han empleado N-bromosuccinimida, 2-hidroxi-5-nitrobenzilbromuro o 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmercapto)-3H-indol (BPNS-escatol).

La modificacion de protemas terapeuticas y peptidos con PEG se asocia a menudo con una prolongacion de la semivida en circulacion, mientras que la union por entrecruzamiento de protemas con glutaraldehfdo, diacrilato de polietilenglicol y formaldelmdo se emplea en la preparacion de hidrogeles. La modificacion qmmica de alergenos con fines de inmunoterapia se consigue a menudo mediante la carbamilacion con cianato potasico.

En general, peptidos y variantes (al menos aquellas que contienen enlaces peptfdicos entre los residuos de aminoacidos) pueden ser sintetizados con la smtesis de peptidos en fase solida por el metodo de Fmoc-poliamida, como muestra Lu et al. (1981) y las referencias que aparecen en el mismo. La proteccion provisional del grupo N-amino se consigue con el grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La escision repetida de este grupo protector muy sensible al pH basico se lleva a cabo con piperidina al 20% en N,N-dimetilformamida. Los grupos funcionales de las cadenas laterales se podnan proteger si se transformaran en eteres de butilo (en el caso de la serina, treonina y tirosina), esteres de butilo (en el caso del acido glutamico y aspartico), derivados butiloxicarbomlicos (en la lisina y la histidina), derivados tritilados (en la cistema) y derivados 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzenosulfomlicos (en la arginina). Cuando los residuos C-terminales son glutamina o asparragina se utiliza el grupo 4,4'-dimetoxibenzhidrilo para proteger los grupos funcionales amido de la cadena lateral. El soporte en fase solida se basa en un polfmero de polidimetil-acrilamida constituido por los tres monomeros dimetilacrilamida (monomero estructural), bisacriloiletilendiamina (entrelazante) y acriloilsarcosina metilester (funcionalizador). El agente escindible que mantiene unido el peptido a la resina es un derivado del acido 4-hidroximetilfenoxiacetico, sensible a pH acido. Todos los derivados de aminoacidos se anaden en forma de derivados anhfdridos simetricos preformados salvo la asparragina y la glutamina, que se anaden utilizando un procedimiento de acoplamiento inverso con N,N-diciclohexilcarbodiimida/1-hidroxibenzotriazol. Todas las reacciones de acoplamiento y desproteccion se controlan con procedimientos de ensayo con ninhidrina, acido trinitrobencenosulfonico o isotina. Una vez completada la smtesis, los peptidos se separan del soporte de resina y al mismo tiempo se eliminan los grupos protectores de las cadenas laterales mediante el tratamiento con acido trifluoroacetico al 95% con una mezcla de capturadores (scavengers) al 50%. Los capturadores utilizados normalmente son etanditiol, fenol, anisol y agua, dependiendo de la eleccion exacta de los aminoacidos constituyentes del peptido que se esta sintetizando. La smtesis de peptidos tambien es posible combinando metodologfas de fase solida y de fase en solucion (vease por ejemplo Bruckdorfer et al., 2004, y las referencias citadas en la misma).

El acido trifluoroacetico se elimina por evaporacion en vado y se procede a la trituracion con dietileter para obtener el peptido bruto. Todos los capturadores (scavengers) se eliminan con un procedimiento de extraccion simple que con la liofilizacion de la fase acuosa proporciona el peptido bruto exento de ellos. Los reactivos para la smtesis de peptidos se pueden conseguir en general por ejemplo de Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG72QJ, Reino Unido.

La purificacion puede llevarse a cabo mediante una sola o una combinacion de tecnicas como la recristalizacion, cromatograffa por exclusion de tamano, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa por interaccion hidrofobica, y (normalmente) cromatograffa de lfquidos de alto rendimiento con fase inversa utilizando p. ej. la separacion con gradiente de acetonitrilo/agua.

El analisis de los peptidos puede efectuarse utilizando cromatograffa de capa fina, electroforesis, en particular electroforesis capilar, extraccion en fase solida (CSPE), cromatograffa de lfquidos de alto rendimiento con fase inversa, analisis de aminoacidos tras hidrolisis acida y analisis con espectrometna de masas por bombardeo con atomos rapidos (FAB), asf como analisis con espectrometna de masas MALDI y ESI-Q-TOF.

Otro aspecto de la invencion proporciona un acido nucleico (por ejemplo, un polinucleotido) que codifica un peptido de la invencion. El polinucleotido puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc, APN, ACN, ARN o combinaciones de los mismos, monocatenarios y/o bicatenarios, o formas nativas o estabilizadas de polinucleotidos, como, por ejemplo, polinucleotidos con un esqueleto de fosforotioato y que pueden contener intrones siempre que codifique el peptido. Por supuesto, solo los peptidos que contengan residuos de aminoacidos naturales unidos por enlaces peptfdicos naturales pueden ser codificados por un polinucleotido. Otro aspecto mas de la invencion proporciona un vector de expresion capaz de expresar un polipeptido conforme a la invencion.

Se han desarrollado diversos metodos para unir polinucleotidos, especialmente ADN, a vectores, por ejemplo, a traves de extremos cohesivos complementarios. Por ejemplo, al segmento de ADN se le pueden anadir prolongaciones de homopolfmeros complementarios para insertarlo en el vector de ADN. El vector y el segmento de ADN se unen a continuacion por medio de puentes de hidrogeno entre las colas homopolimericas complementarias para formar moleculas de ADN recombinante.

Otro metodo alternativo para unir el segmento de ADN a los vectores son los ligadores sinteticos que contienen uno o mas sitios de restriccion. Existen ligadores sinteticos comerciales que contienen diversas dianas para las endonucleasas de restriccion que facilitan varios proveedores como International Biotechnologies Inc. New Haven, CN, EE. UU.

Un metodo deseable para modificar el ADN que codifica el polipeptido de la invencion emplea la reaccion en cadena de la polimerasa tal y como exponen). Este metodo puede ser utilizado para introducir el ADN en un vector adecuado, por ejemplo, disenando las dianas de restriccion adecuadas, o puede ser empleado para modificar el ADN de otros modos utiles conocidos en la tecnica. Si se opta por vectores virales, son preferibles los vectores poxvmcos o adenovmcos.

El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovmcos) se puede expresar en un hospedador adecuado para producir un polipeptido que comprenda el peptido o variante de la invencion. Asf pues, el ADN que codifica el peptido o variante de la invencion puede ser utilizado conforme a tecnicas conocidas, modificado adecuadamente siguiendo las ensenanzas contenidas en la presente memoria para construir un vector de expresion que se emplee para transformar una celula hospedadora a fin de que exprese y produzca el polipeptido de la invencion. Tales tecnicas incluyen las reveladas en las patentes de EE. UU. N.° 4.440.859, 4.530.901, 4.582.800, 4.677.063, 4.678.751, 4.704.362, 4.710.463, 4.757.006, 4.766.075 y 4.810.648.

El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovmcos) que codifica el polipeptido que constituye el compuesto de la invencion se puede unir con una amplia variedad de secuencias de ADN distintas para introducirlo en un hospedador adecuado. El ADN acompanante dependera de la naturaleza del hospedador, el modo de introducir el ADN en su interior y de si se pretende que se integre o que se mantenga como un episoma.

En general, el ADN se inserta en un vector de expresion, como un plasmido, con la orientacion apropiada y el marco de lectura correcto para asegurar la expresion. Si es necesario, el ADN se puede enlazar con secuencias nucleotidicas de control que regulan la transcripcion o la traduccion y que son reconocidas por el hospedador deseado, aunque en general tales controles ya suelen estar incluidos en el propio vector de expresion. A continuacion, el vector se introduce en el hospedador mediante tecnicas estandar. En general, el vector no consigue transformar todos los hospedadores, lo que hara necesario seleccionar las celulas hospedadoras que hayan quedado transformadas. Una tecnica de seleccion consiste en incorporar en el vector de expresion una secuencia de ADN con los elementos de control necesarios que codifique un rasgo seleccionable en la celula transformada, como por ejemplo de resistencia a antibioticos.

Otra alternativa consiste en incorporar el gen de ese rasgo seleccionable en otro vector con el que se cotransforma la celula hospedadora. Las celulas hospedadoras que hayan sido transformadas con el ADN recombinante de la invencion se cultivaran durante el tiempo suficiente y en las condiciones apropiadas que las personas versadas en la tecnica conocen a la vista de las ensenanzas reveladas en la presente memoria para que el polipeptido pueda expresarse y, finalmente, ser recuperado.

Son muchos los sistemas de expresion conocidos, como bacterias (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), levaduras (Saccharomyces cerevisiae, etc.), hongos filamentosos (genero Aspergillus, etc.), celulas vegetales, animales o de insectos. Preferiblemente el sistema consistira en celulas de mairnfero, como las celulas CHO disponibles de la ATCC Cell Biology Collection.

Un tfpico vector plasmfdico de expresion constitutiva para celulas de mamffero comprende el promotor del CMV o del SV40 con una cola poli-A adecuada y un marcador de resistencia como la neomicina. Un ejemplo es el pSVL que ofrece Pharmacia, Piscataway, NJ, EE. U^u. Un ejemplo de vector de expresion inducible para mamnfero es el pMSG, tambien suministrado por Pharmacia. Otros vectores plasmfdicos de levadura son pRS403-406 y pRS413-416, en general provefdos por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU. Los plasmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plasmidos integrativos de levadura (YIp) que incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plasmidos pRS413-4l6 son plasmidos centromericos de levadura (Ycp). Los vectores dotados del promotor del CMV (por ejemplo, de Sigma-Aldrich) proporcionan una expresion transitoria o estable, expresion en el citoplasma o secrecion, y marcaje de los extremos N-terminal o C-terminal en varias combinaciones de FLAG, 3^xFLA^g, c-myc o MAT. Estas protemas de fusion permiten la deteccion, la purificacion y el analisis de la protema recombinante. Las fusiones con doble etiqueta aportan flexibilidad a la deteccion.

La potente region reguladora promotora del citomegalovirus (CMV) humano ofrece niveles de expresion constitutiva de la protema muy elevados, de hasta 1 mg/l en celulas COS. En estirpes celulares menos potentes los niveles de protemas suelen rondar ~0,1 mg/l. La presencia del origen de replicacion del SV40 genera niveles elevados de replicacion del ADN en celulas COS que toleran la replicacion del SV40. Los vectores de CMV, por ejemplo, pueden contener el origen pMB1 (derivado del pBR322) para la replicacion en celulas bacterianas, el gen de la b-lactamasa para la seleccion por resistencia a la ampicilina, hGH poliA, y el origen f1. Los vectores que contienen la secuencia ifder de la preprotripsina (PPT) pueden canalizar la secrecion de las protemas de fusion FLAG hacia el medio de cultivo, donde se pueden purificar por medio de anticuerpos ANTI-FLAG, resinas y placas. En la tecnica se conocen otros vectores y sistemas de expresion aptos para el uso con una variedad de celulas hospedadoras.

La presente invencion tambien se refiere a una celula hospedadora transformada con un vector polinucleotidico de la presente invencion. La celula hospedadora puede ser procariota o eucariota. Las celulas bacterianas pueden ser las celulas hospedadoras procariotas mas adecuadas en determinadas circunstancias; normalmente son cepas de E. coli, como por ejemplo las cepas DH5 disponibles de Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EE. UU., y las RR1 disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, EE. UU. (N.° ATCC 31343). Las celulas hospedadoras eucariotas preferidas son celulas de levadura, de insecto y de marnffero, preferiblemente celulas de vertebrado como estirpes celulares de colon y de fibroblastos de raton, rata, mono o ser humano. Las celulas hospedadoras de levadura incluyen YPH499, YPH500 y YPH501, que en general estan disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU. Las celulas hospedadoras de mamffero preferidas incluyen las celulas de ovario de hamster chino (CHO) disponibles de la ATCC como CCL61, las celulas embrionarias de raton suizo NIH/3T3 disponibles de la ATCC como CRL 1658, las celulas COS-1 de rinon de mono disponibles de la ATCC como CRL 1650 y las celulas 293 que son celulas renales embrionarias humanas. Las celulas de insecto preferidas son las celulas Sf9 que se pueden transfectar con vectores de expresion baculovmcos. Se puede encontrar una revision general referente a la eleccion de las celulas hospedadoras mas adecuadas por ejemplo en el manual de Paulina Balbas y Argelia Lorence “Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols,” Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9, y otra bibliograffa conocida por las personas versadas en la materia.

La transformacion de las celulas hospedadoras adecuadas con el constructo de ADN de la presente invencion se consuma con metodos consabidos que normalmente dependen del tipo de vector utilizado. En lo referente a la transformacion de celulas hospedadoras procariotas, veanse por ejemplo Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110, y Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU. La transformacion de celulas de levadura aparece descrita en Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU. El metodo de Beggs (1978) Nature 275,104-109 tambien resulta util. En lo que concierne a los reactivos adecuados para transfectar las celulas de vertebrados, por ejemplo, el fosfato de calcio y el DEAE-dextrano o las formulaciones con liposomas, se pueden adquirir de Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EE. UU. La electroporacion tambien es util para la transformacion y/o la transfeccion de las celulas y es perfectamente conocida su aplicacion en la transformacion de celulas de levadura, bacteria, insecto y vertebrado.

Las celulas transformadas con exito, es decir, las que contengan un constructo de ADN de la presente invencion, se pueden identificar con tecnicas bien conocidas como la PCR. Otra alternativa consiste en detectar la presencia de la protema en el sobrenadante por medio de anticuerpos.

Se apreciara que ciertas celulas hospedadoras de la invencion son utiles para la preparacion de peptidos de la invencion, por ejemplo, las celulas bacterianas, de levadura o insecto. Con todo, para ciertos metodos terapeuticos pueden ser utiles otras celulas hospedadoras. Por ejemplo, se pueden utilizar celulas presentadoras de antfgeno como las celulas dendnticas para expresar los peptidos de la invencion de tal forma que puedan ser cargados en las moleculas MHC oportunas. Asf pues, la presente invencion proporciona una celula hospedadora que comprende un acido nucleico o un vector de expresion conforme a la invencion.

En una forma de realización preferida la celula hospedadora es una celula presentadora de antfgeno, en particular una celula dendntica o celula presentadora de antigeno. Las APC cargadas con una protema de fusion recombinante que contiene fosfatasa acida prostatica (PAP) son en la actualidad objeto de investigacion como tratamiento contra el cancer de prostata (Sipuleucel-T) (Small EJ et al. 2006; Rini et al. 2006).

Otro aspecto de la invencion proporciona un metodo para la produccion de un peptido, comprendiendo dicho metodo el cultivo de una celula hospedadora y el aislamiento del peptido a partir de dicha celula o de su medio de cultivo. En otra forma de realización el peptido, el acido nucleico o el vector de expresion de la invencion se emplean en medicina. Por ejemplo, el peptido o su variante pueden ser preparados para la inyeccion por via intravenosa (i. v.), subcutanea (s. c.), intradermica (i. d.), intraperitoneal (i. p.) o intramuscular (i. m.). Los metodos preferidos para la inyeccion del peptido incluyen s.c., i.d., i. p., i.m. e i.v. Los metodos preferidos para la inyeccion del ADN incluyen i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. Segun el peptido o ADN de que se trate se pueden administrar dosis de, por ejemplo, entre 50 |jg y 1,5 mg, preferiblemente de 125 |jg a 500 |jg de peptido o ADN. Dosis en esos intervalos se han empleado en ensayos anteriores (Brunsvig et al. 2006; Staehler et al. 2007).

Otro aspecto incluye un metodo in vitro para producir linfocitos T activados, comprendiendo dicho metodo la puesta en contacto en condiciones in vitro de linfocitos T con moleculas MHC humanas de clase I o II cargadas con antigeno expresadas en la superficie de una celula presentadora de antigeno adecuada por tiempo suficiente para activar los linfocitos T de una manera espedfica de antfgeno, siendo el antigeno un peptido acorde con la invencion. Preferentemente se emplea una cantidad suficiente del antfgeno con una celula presentadora de antigeno.

Cuando se este utilizando como antigeno un epftopo de MHC de clase II, los linfocitos T seran linfocitos cooperadores CD4-positivos, preferiblemente del tipo Thi. Las moleculas MHC de clase II se pueden expresar en la superficie de cualquier celula adecuada. Preferiblemente la celula no debe expresar de forma natural moleculas MHC de clase II (de ser asf, la celula tendra que ser transfectada para que exprese dicha molecula). Si, en cambio, la celula expresa de forma natural moleculas MHC de clase II es preferible que sea defectuosa en los mecanismos de procesamiento o presentacion de antigenos. De ese modo sera posible que la celula que expresa la molecula MHC de clase II quede completamente cargada con el antigeno peptfdico escogido antes de activar el linfocito T. La celula presentadora de antfgeno (o celula estimuladora) normalmente presenta moleculas de MHC de clase II en su superficie y preferiblemente es basicamente incapaz de cargar dicha molecula de MHC de clase II con el antfgeno seleccionado. La molecula de MHC de clase II puede cargarse facilmente in vitro con el antfgeno seleccionado.

Preferiblemente, la celula de mairnfero carece del transportador de peptidos TAP o bien este se presenta en un nivel reducido o funciona defectuosamente. Las celulas adecuadas que carecen del transportador de peptidos TAP incluyen las celulas T2, RMA-S y de Drosophila. TAP es el transportador relacionado con el procesamiento de los antfgenos.

La estirpe celular humana deficiente en carga de peptidos T2 esta disponible en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE. UU. con el N.° de catalogo CRL 1992; la estirpe de celulas de Drosophila Schneider line 2 esta disponible en la ATCC con el N.° de catalogo CRL 19863; la estirpe de celulas de raton RMA-S esta descrita en Karre et al. 1985.

Preferentemente, la celula hospedadora no expresa sustancialmente moleculas MHC de clase I antes de la transfeccion. Tambien es preferible que la celula estimuladora exprese una molecula importante que proporcione una senal coestimuladora para los linfocitos T, como B7. 1, B7. 2, ICAM-1 y LFA3. Las secuencias de acidos nucleicos de numerosas moleculas MHC de clase II y de las moleculas co-estimuladoras estan disponibles publicamente en las bases de datos GenBank y EMBL.

De forma similar, si se utiliza como antfgeno un epftopo de MHC de clase I, los linfocitos T seran CTL CD8-positivos.

51 una celula presentadora de antfgeno es transfectada para expresar un epftopo de ese tipo, la celula comprendera preferentemente un vector de expresion capaz de expresar un peptido que contenga la SEQ ID N.° 3.

Existen otros metodos para generar CTL in vitro. Por ejemplo, los metodos descritos en Peoples et al. (1995) y Kawakami et al. (1992) emplean linfocitos autologos infiltrados en el tumor para generar los CTL. Plebanski et al. (1995) recurren a linfocitos autologos de sangre periferica (PLB) para la preparacion de los CTL. Jochmus et al. (1997) describen la produccion de CTL autologos estimulando celulas dendnticas con el peptido o el polipeptido, o a traves de la infeccion con virus recombinantes. Hill et al. (1995) y Jerome et al (1993) emplean linfocitos B para la produccion de CTL autologos. Asimismo, para la preparacion de CTL autologos se pueden usar macrofagos estimulados con peptido o polipeptido o infectados con virus recombinantes. S. Walter et al. 2003 describen la sensibilizacion in vitro de linfocitos T mediante celulas presentadoras de antfgeno artificiales (aAPC), que es otro modo adecuado para generar linfocitos T contra el peptido de eleccion. En este estudio, las aAPC se generaron adhiriendo complejos MHC:peptido preformados a la superficie de partmulas de poliestireno (microperlas) con biotina:estreptavidina. Este sistema permite controlar con exactitud la densidad de MHC en las aAPC, lo que permite desencadenar respuestas de linfocitos T espedficas de antigeno con una avidez alta o baja a partir de muestras de sangre, de una forma selectiva y altamente eficaz. Ademas de los complejos MHC:peptido, las aAPC deben incorporar acopladas en su superficie otras protemas con actividad co-estimuladora como anticuerpos anti-CD28. Tales sistemas de aAPC tambien precisan a menudo el concurso de factores solubles adecuados, por ejemplo, citocinas como la interleucina-12.

Para la preparacion de linfocitos T tambien se pueden utilizar celulas alogenicas; en WO 97/26328 se describe detalladamente un metodo que se incorpora a la presente memoria como referencia. Por ejemplo, ademas de celulas de Drosophila y celulas T2, para presentar antfgenos se pueden usar otras celulas tales como celulas CHO, celulas de insecto infectadas con baculovirus, bacterias, levaduras, celulas diana infectadas con virus vacunal. Asimismo, se pueden utilizar virus vegetales (vease por ejemplo Porta et al. (1994), que describen el desarrollo del virus del mosaico del ctucharo como sistema de alto rendimiento para la presentacion de peptidos extranos).

Los linfocitos T activados que estan dirigidos contra el peptido de la invencion son utiles como tratamiento. Asf pues, otro aspecto de la invencion proporciona linfocitos T activados obtenibles por los susodichos metodos de la invencion. Los linfocitos T activados producidos con el susodicho metodo reconoceran selectivamente una celula que expresa de forma aberrante un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID N.° 1. Preferiblemente el linfocito T reconoce la celula interaccionando a traves de su TCR con el complejo HLA/peptido, por ejemplo, uniendosele. Los linfocitos T son utiles en un metodo para destruir celulas diana en un paciente cuyas celulas diana expresen de forma aberrante un polipeptido que comprenda una secuencia de aminoacidos de la invencion y al cual se le administre un numero eficaz de linfocitos T activados. Los linfocitos T que se le administren pueden proceder del mismo paciente y ser activados del modo antes descrito, es decir, ser linfocitos T autologos. Otra alternativa consiste en que los linfocitos T no sean del paciente y procedan de otro individuo. Por supuesto, es preferible que dicho individuo este sano. Por «individuo sano» los inventores entienden un individuo que goce de buen estado de salud general, preferentemente con un sistema inmunitario competente y, mas preferentemente, no sufra ninguna enfermedad que analizada se le detecte.

En condiciones in vivo, las celulas diana de los linfocitos T CD4-positivos pueden ser celulas del tumor (que a veces expresan MHC de clase II) y/o celulas estromales circundantes al tumor (celulas tumorales) (que en ocasiones tambien expresan MHC de clase II; (Dengjel et al., 2006)).

Los linfocitos T pueden ser utilizados como principios activos de una composicion terapeutica. Por tanto, la invencion tambien proporciona un metodo para destruir celulas diana de un paciente que expresan de forma aberrante un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de la invencion, comprendiendo dicho metodo la administracion al paciente de un numero eficaz de linfocitos T como los definidos arriba.

Por «expresado de forma aberrante» los inventores tambien quieren decir que el polipeptido esta sobreexpresado en comparacion con los niveles normales de expresion o que el gen esta reprimido en el tejido del que deriva el tumor, pero en cambio se expresa en este. Por «sobreexpresado» los inventores quieren decir que el nivel del polipeptido es como mmimo 1,2 veces mayor que el nivel en el tejido normal; preferiblemente como mmimo 2 veces mayor, y mas preferiblemente como mmimo 5 o 10 veces mayor que el del tejido normal.

Los linfocitos T se pueden obtener por metodos conocidos en la materia, como, por ejemplo, los antes descritos. Los protocolos para la llamada transferencia de linfocitos T a un receptor son perfectamente conocidos y se pueden encontrar por ejemplo en (Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1988; Dudley et al., 2002; Yee et al., 2002; Dudley et al., 2005); revisado en (Gattinoni et al., 2006) y (Morgan et al., 2006).

Cualquier molecula de la invencion, ya sea peptido, acido nucleico, vector de expresion, celula o el acido nucleico que lo codifique es util para el tratamiento de trastornos caracterizados por celulas que eluden la respuesta inmunitaria. Por consiguiente, cualquier molecula de la presente invencion puede ser utilizada como medicamento o en la fabricacion de un medicamento. La molecula puede ser utilizada sola o combinada con otra molecula o moleculas de la invencion o con cualquier o cualesquier moleculas conocidas.

Preferiblemente, el medicamento de la presente invencion es una vacuna. La vacuna puede administrarse directamente al paciente, en el organo afectado o por via sistemica de forma i.d., i.m, s.c., i.p. e i.v., o aplicarse ex vivo a celulas derivadas del paciente o a una lmea celular humana que despues se administra al paciente, o utilizarse in vitro para seleccionar una subpoblacion de celulas inmunitarias derivadas del paciente que despues se le vuelven a administrar. Si el acido nucleico se administra a celulas in vitro, puede ser util que estas celulas sean transfectadas para que expresen simultaneamente citocinas inmunoestimuladoras, como la interleucina-2. El peptido puede ser sustancialmente puro, o combinarse con un adyuvante inmunoestimulador (vease abajo) o utilizarse en combinacion con citocinas inmunoestimuladoras, o bien administrarse mediante otro sistema de liberacion adecuado, como por ejemplo liposomas. El peptido tambien se puede conjugar con un transportador adecuado como la hemocianina de lapa californiana (KLH) o el manano (vease WO95/18145 y Longenecker et al. 1993). El peptido tambien puede estar marcado, o ser una protema de fusion, o ser una molecula tubrida. Se espera que los peptidos cuya secuencia se ofrece en la presente invencion estimulen a los linfocitos T CD4 o CD8. No obstante, la estimulacion de los CTL CD8 es mas eficiente si cuentan con la ayuda de los linfocitos T cooperadores CD4. Asf pues, los epftopos de MHC de clase I que estimulan a los CTL CD8, el companero de fusion o las secciones de una molecula fftbrida adecuada proporcionan epftopos que estimulan a los linfocitos T CD4-positivos. Los epftopos estimuladores de los CD4 y CD8 son bien conocidos en la tecnica e incluyen los identificados en la presente invencion.

En un aspecto, la vacuna comprende al menos un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos expuesta en las SEQ ID N.° 3 y al menos otro peptido adicional, preferiblemente dos a 50, mas preferiblemente dos a 25, incluso mas preferiblemente dos a 15 y mas preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o trece peptidos. Los peptidos pueden derivar de uno o mas TAA espedficos y se pueden unir a moleculas MHC de clase I y/o II. Preferiblemente al menos un peptido adicional tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en las SEQ ID N.° 4 a 24.

El polinucleotido puede ser sustancialmente puro, o estar contenido en un vector o un sistema de liberacion adecuado. El acido nucleico puede ser ADN, ADNc, APN, ARN o una combinacion de los mismos. Los metodos para disenar e introducir ese acido nucleico son bien conocidos por los expertos en la materia. Se puede consultar una revision general por ejemplo en Pascolo S. 2006; Stan R. 2006, o A. Mahdavi 2006. Las vacunas polinucleotfdicas son faciles de preparar, pero el mecanismo por el cual tales vectores inducen la respuesta inmunitaria no se conoce con exactitud. Los vectores y sistemas de liberacion adecuados incluyen los de ADN y/o ARN viral, como los sistemas basados en adenovirus, virus vacunal, retrovirus, herpesvirus, virus adeno-asociados o fftbridos que contienen elementos de varios virus. Los sistemas de liberacion no virales incluyen ftpidos cationicos y poftmeros cationicos que son bien conocidos como tecnicas para la introduccion de ADN. Los metodos de introduccion ffsicos, como la «pistola genica», tambien pueden utilizarse. El peptido o peptidos codificados por el acido nucleico pueden ser una protema de fusion, por ejemplo, con un epftopo que estimule los linfocitos T para el respectivo CDR opuesto tal y como se ha indicado antes.

El medicamento de la invencion tambien puede incluir uno o varios adyuvantes. Los adyuvantes son sustancias que potencian o estimulan de forma inespedfica la respuesta inmunitaria (p. ej. respuestas inmunitarias mediadas por CTL y linfocitos T cooperadores (T^h) contra un antfgeno, y podnan ser considerados utiles en el medicamento de la presente invencion. Entre los adyuvantes adecuados se incluyen, entre otros: 1018 ISS, sales de aluminio, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, ligandos de flagelina o TLR5 derivados de flagelina, ligando de FLT3, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod (A^lDARA^®), resiquimod, ImuFact IMP321, interleucinas como IL-2, IL-13, IL-21, interferon alfa o beta o derivados pegilados de los mismos, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune®, LipoVac, MALP2, MF59, ftpido monofosforilo A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsiones de agua en aceite y de aceite en agua, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistema de vectores PepTel®, micropartfculas de dextrano y PLG, resiquimod, SRL172, virosomas y otras partfculas similares a virus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam 3 Cys, estimulon QS21 de Aquila, que deriva de la saponina, extractos de micobacterias y mimeticos sinteticos de la pared bacteriana, y otros adyuvantes patentados como Detox de Ribi, Quil o Superfos. Se prefieren los adyuvantes como el adyuvante de Freund o el GM-CSF. Con anterioridad se han descrito varios adyuvantes inmunologicos (p. ej. MF59) espedficos para las celulas dendrfticas, asf como la preparacion de los mismos (Dupuis M et al. 1998; Allison 1998). Tambien se pueden usar citocinas. A varias citocinas se las ha atribuido una influencia directa en la migracion de las celulas dendrfticas hacia los tejidos linfoides (p. ej. el TNF-a), como parte de un proceso que acelera su maduracion hasta convertirlas en celulas presentadoras antfgeno de los linfocitos T (p. ej. GM-CSF, IL-1 e IL-4) (Patente de EE. UU. N.° 5.849.589) y en el que actuan como inmunoadyuvantes (p. ej. la IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich et al 1996).

Tambien se ha descrito que los oligonucleotidos de CpG inmunoestimuladores potencian los efectos de los adyuvantes en vacunas. Sin limitarse a la teona, los oligonucleotidos de CpG actuan activando el sistema inmunitario innato (no adaptativo) a traves de los receptores de tipo Toll (TLR), principalmente el TLR9. La activacion del TLR9 desencadenada por los CpG potencia las respuestas humorales y celulares espedficas de antfgeno contra una amplia gama de antfgenos, incluidos antfgenos peptfdicos o proteicos, virus vivos o muertos, vacunas de celulas dendrfticas, vacunas de celulas autologas y conjugados de polisacaridos, tanto en vacunas profilacticas como terapeuticas. Mas importante aun, potencian la maduracion y la diferenciacion de las celulas dendrfticas, lo cual resulta en una mayor activacion de los linfocitos Tm y una generacion mas potente de linfocitos T citotoxicos (CTL), incluso sin la ayuda de los linfocitos T CD4. La tendencia hacia la respuesta T^h1provocada por la estimulacion del TLR9 se mantiene incluso en presencia de adyuvantes vacunales como el aluminio o el adyuvante de Freund incompleto (IFA) que normalmente promueven un sesgo hacia la respuesta T^h2.Los oligonucleotidos de CpG muestran incluso una mayor actividad adyuvante cuando se formulan o administran conjuntamente con otros adyuvantes o en formulaciones como micropartfculas, nanopartfculas, emulsiones de ftpidos o formulaciones similares, que son especialmente necesarias para inducir una respuesta potente cuando el antfgeno es relativamente debil. Tambien aceleran la respuesta inmunitaria y permiten reducir las dosis de antfgeno aproximadamente en dos ordenes de magnitud, habiendo obtenido en algunos experimentos respuestas de anticuerpos comparables a las conseguidas con la dosis plena de vacuna sin CpG (Krieg, 2006). La patente de EE. UU. N.° 6.406.705 B1 describe el uso combinado de oligonucleotidos de CpG, adyuvantes sin acidos nucleicos y un antfgeno para inducir una respuesta inmunitaria espedfica de antfgeno. Un componente preferido de la composicion farmaceutica de la presente invencion es un antagonista CpG del TLR9 conocido como dSLIM (inmunomodulador en horquilla doble), fabricado por Mologen (Berlin, Alemania). Tambien se pueden utilizar otras moleculas que se unen a los TLR como ARN que se unen a TLR 7, TLR 8 y/o TlR 9.

Entre los ejemplos de adyuvantes utiles tambien incluyen sin animo de limitacion a CpG modificados qmmicamente (p. ej., CpR, Idera), analogos ARNdc como poli(I:C) y AmpliGen, ARN o ADN bacteriano sin CpG asf como anticuerpos y moleculas pequenas inmunoactivas como ciclofosfamida, sunitinib, Bevacizumab, celebrex, NCX-4016, sildenafilo, tadalafilo, vardenafilo, sorafenib, temozolomida, temsirolimus, XL-999, CP-547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4 y SC58175, que pueden actuar de forma terapeutica y/o como adyuvantes. Las cantidades y concentraciones de adyuvantes y de aditivos utiles en el contexto de la presente invencion pueden ser determinadas facilmente por las personas versadas en la tecnica sin demasiada experimentacion. Los adyuvantes preferidos son dSLIM, interferones alfa o beta, CpG7909, IC31, ALDARA (Imiquimod), PeviTer, ARN, tadalafilo, temozolomida y JuvImmune.

La presente invencion proporciona un medicamento que es util para el tratamiento del cancer, en particular del glioma y del cancer cerebral, cancer de mama, cancer de prostata, cancer de esofago, cancer colorrectal, cancer renal, cancer de pancreas, carcinomas epidermoides y neoplasias queratinocfticas de la piel, leucemia, cancer de pulmon, cancer de ovario y melanoma.

La presente invencion tambien contempla un equipo que comprende: (a) un envase que contiene una composicion farmaceutica como la descrita arriba, en forma de solucion o liofilizada; (b) opcionalmente, un segundo envase que contiene un diluyente o una solucion de reconstitucion para la formulacion liofilizada; y (c) opcionalmente, instrucciones para (I) el uso de la solucion o (II) reconstitucion y/o uso de la formulacion liofilizada.

El equipo puede comprender ademas uno o mas de los siguientes componentes: (III) un tampon, (IV) un diluyente, (V) un filtro, (VI) una aguja, o (V) una jeringa. El envase es preferiblemente un frasco, un vial, una jeringa o un tubo de ensayo; puede ser un envase multiusos. Se prefiere que la composicion farmaceutica este liofilizada.

Los equipos de la presente invencion comprenden, preferiblemente, una formulacion liofilizada de la presente invencion en un contenedor adecuado e instrucciones para su reconstitucion y/o uso. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales (p. ej. viales con doble camara), jeringas (como jeringas con doble camara) y tubos de ensayo. El envase puede estar formado por materiales diversos como vidrio o plastico. Preferiblemente el equipo y/o envase contienen o van acompanados de instrucciones de reconstitucion y/o uso. Por ejemplo, el prospecto puede indicar que la formulacion liofilizada debe reconstituirse para obtener concentraciones de peptidos como las descritas en paginas precedentes. El prospecto puede indicar, ademas, que la formulacion puede administrarse o esta destinada a la administracion subcutanea.

El envase que contiene la formulacion puede ser un vial multiuso que permita varias administraciones (p. ej. de 2 a 6 administraciones) de la formulacion reconstituida. El equipo puede comprender, ademas, un segundo envase que contenga un diluyente adecuado (p. ej., una solucion de bicarbonato sodico).

Despues de mezclar el diluyente y la formulacion liofilizada, la concentracion final del peptido en la formulacion reconstituida es preferiblemente como mmimo de 0,15 mg/ml/peptido (=75 |jg) y preferiblemente como maximo de 3 mg/ml/peptido (=1500 jg). El equipo puede incluir ademas otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, tales como otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso.

Los equipos de la presente invencion pueden tener un solo envase que contenga la formulacion de las composiciones farmaceuticas acordes con la presente invencion, acompanado o no de otros componentes (p. ej., otros compuestos o composiciones farmaceuticas de estos otros compuestos) o pueden contar con un envase distinto para cada componente.

Preferiblemente, los equipos de la invencion incluyen una formulacion de la invencion acondicionada para ser utilizada y administrada conjuntamente con un segundo compuesto (como adyuvantes (p. ej. GM-CSF), un agente de quimioterapia, un producto natural, una hormona o un antagonista, un inhibidor o agente anti-angiogenesis, un inductor de la apoptosis o un quelante) o una composicion farmaceutica de los mismos. Los componentes del equipo pueden estar preagrupados o cada componente puede estar en un envase separado antes de la administracion al paciente. Los componentes del equipo pueden proporcionarse en una o varias soluciones lfquidas, preferiblemente en una solucion acuosa y, con mayor preferencia, en una solucion acuosa esteril. Los componentes del equipo tambien pueden facilitarse en forma de solidos, y pueden convertirse en lfquidos anadiendo los disolventes adecuados, que preferiblemente se proporcionan en otro envase distinto.

El envase de un equipo terapeutico puede ser un vial, tubo de ensayo, matraz, frasco, jeringa, o cualquier otro medio para contener un solido o lfquido. Si hay mas de un componente, normalmente el equipo contendra un segundo vial u otro envase para permitir la dosificacion por separado. El equipo tambien puede contener otro envase para un lfquido farmaceuticamente aceptable. Preferiblemente el equipo terapeutico contendra un aparato (p. ej., una o varias agujas, jeringas, cuentagotas, pipeta, etc.) para permitir la administracion de los agentes de la invencion que son componentes del presente equipo.

La presente formulacion puede ser toda aquella que sea adecuada para la administracion de los peptidos a traves de cualquier via aceptable como la oral (enteral), nasal, oftalmica, subcutanea, intradermica, intramuscular, intravenosa o transdermica. Se prefiere la administracion subcutanea y, con mayor preferencia, la intradermica. Se puede utilizar una bomba de infusion para la administracion.

A continuacion, se describira la presente invencion con los ejemplos siguientes que muestran las formas de realización preferidas de la misma a tftulo ilustrativo, sin que con ello se pretenda limitar la invencion.

Breve descripcion de las figuras

La Fig. 1 muestra el resultado de la espectrometna de masas con ESI acoplada cromatograffa de ftquidos que identifica el peptido asociado a tumor NCAN-001 en la muestra de glioblastoma GB1006.

La Fig. 2 expone el perfil de expresion del ARNm del gen NCAN que codifica el peptido asociado a glioblastoma NCAN-001. La expresion de este gen es nula o muy baja en los tejidos normales, pero es muy elevada en las muestras de glioblastoma (GB1006T a GB1011T; NCH359T y NCH361T).

La Fig. 3 muestra el perfil de expresion relativo del ARNm del gen BIRC. 5. La expresion de este gen es nula o muy baja en los tejidos normales, pero es muy elevada en muestras tumorales.

Las Figs. 4a y 4b muestran la presencia de linfocitos T CD4+ que segregan IFND espedfico contra PSMA y survivina en celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) en varios intervalos de tiempo tras la vacunacion del paciente, analisis realizado con EliSpot de IFNH. Intervalos de tiempo: antes de la vacunacion (a) y despues de 3 (b), 6 (c), 7 (d), 8. (e), 9 (f), 10 (g) y 1l (h) vacunaciones.

La Fig. 5 muestra la presencia de linfocitos T CD4+ que segregan IFNH, IL-5, IL-10 y TNFa espedficamente contra la survivina en PBMC en tres intervalos de tiempo distintos tras la vacunacion del paciente analizados con un ensayo de ICS. Intervalos de tiempo: despues de 1 (a), 3 (b) y 7 (c) vacunaciones.

La Fig. 6 expone la respuesta bioqmmica de los pacientes 8 y 10 que revela la estabilidad del PSA, con un aumento no superior al 10% respecto al valor inicial del mismo.

La Fig. 7 expone la respuesta bioqmmica de los pacientes 11 y 16, que muestra el aumento del tiempo de duplicacion del PSA sin que se llegue a estabilizar.

La Fig. 8 expone la respuesta bioqmmica del paciente 5, que muestra el aumento del tiempo de duplicacion del PSA sin que se llegue a estabilizar.

La Fig. 9 expone la respuesta bioqmmica de los pacientes 1, 4, 10, 12 y 13 que no revela ningun cambio en el tiempo de duplicacion del PSA durante la vacunacion.

La Fig. 10 expone la respuesta bioqmmica de los pacientes 2, 6, 9, 14, 18 y 19 que no revela ningun cambio en el tiempo de duplicacion del PSA durante la vacunacion.

La Fig. 11 expone la respuesta bioqmmica de los pacientes 7, 15 y 17 que revela un descenso transitorio del PSA o bien un aumento del tiempo de duplicacion seguido por un descenso de este ultimo.

La Fig. 12 expone que del estudio de vacunacion contra el cancer de prostata, se pueden establecer clones de linfocitos T CD4+ espedficos del peptido BIR-002 a partir de varios pacientes con cancer vacunados que son funcionales en lo referente a la produccion de IFN-gamma como respuesta contra el BIR-002. Wang et al., 2008 describen clones de linfocitos T obtenidos de donantes sanos solo tras varias rondas de sensibilizacion y estimulacion in vitro, mientras que los presentes linfocitos T pueden ser inducidos en los pacientes mediante vacunaciones. PMA/ionomicina = activacion inespedfica independiente de antfgeno; Survivina (II): estimulacion con BIR-002; PSMA (II): estimulacion con peptido irrelevante. Todas las celulas reactivas son CD4 positivas. La Fig. 13 ilustra que el BIR-002 es presentado de forma natural por las celulas dendnticas. Celulas dendnticas inmaduras incubadas con survivina recombinante o con el epftopo BIR-002 de la misma son reconocidas por linfocitos T espedficos de BIR-002 procedentes de pacientes vacunados, tal y como demuestra la tincion intracelular de citocinas. Estos resultados apuntan a que BIR-002 es procesado de forma natural por proteinasas dentro de las celulas dendnticas y que el epftopo BIR-002 no es destruido durante el procesamiento. Ademas, dichos linfocitos T CD4+ son multifuncionales puesto que segregan las citocinas IFN-gamma, TNF-alfa e IL-2, expresan en su superficie el ligando de CD40 (CD154) y se desgranulan, tal y como indica la expresion en su superficie del CD107a. Esta respuesta de los linfocitos T es espedfica de antfgeno, ya que no resultan activados por celulas dendnticas incubadas con la protema irrelevante RAP80 ni con el peptido HIV-001.

La Fig. 14 expone que una elevada fraccion de los linfocitos T CD4+ espedficos de BIR-002 derivados de pacientes con cancer de prostata vacunados con BIR-002 expresan citocinas beneficiosas como IFN-gamma, TNF-alfa e IL-2 mientras que las citocinas inmunorreguladoras IL-10 e IL-7 no se expresan con esa magnitud. Se muestran los datos primarios y los datos resumidos aportados por la tincion intracelular de citocinas de los linfocitos T espedficos de BIR-002 o de dos peptidos restringidos a clase II usados como control.

La Fig. 15 muestra que varias estirpes de celulas tumorales que expresan diferentes alelos HLA-DR son reconocidas por PBMC extrafdas de pacientes (mostrados de los pacientes Pro26 y Pro15). Asf pues: 1. Los pacientes desarrollan respuestas multiclonales de linfocitos T tras la vacunacion con BIR-002; 2. BIR-002 se une de forma promiscua a varios alelos HLA de clase II: DR1 (vease tambien Wang et al.); DQ5 (no analizado por Wang et al.); DR11 (vease tambien Wang et al.); y DRB3 (en contraste con Wang et al., 2008, Tabla 1): 3. La presentacion funcional de BIR-002 es posible en el contexto de varias moleculas de HLA de clase II (produccion de TNF-alfa). Tal y como sucede con las HLA de clase I (HLA-A, -B, C), en principio, en las HLA de clase II tambien se pueden encontrar tres locus geneticos diferentes que expresan moleculas funcionales de clase II en la superficie celular, concretamente HLA-DQ, HLA-DP y HLA-DR. Las moleculas de clase I estan compuestas por una cadena pesada (A, B o C) y una microglobulina beta-2 que es constante en los tres genes. Por su parte, las moleculas de clase II estan compuestas por dos cadenas variables (alfa y beta). De ah que el genotipado avanzado resulte siempre complicado en la clase II. En la tabla se ofrecen los llamados tipos serologicos, que estan basados en la union de anticuerpos. Asf pues, por ejemplo «DQ3» comprende diferentes alelos de las cadenas alfa y beta del HLA-DQ que suelen hallarse juntos y reaccionan con un anticuerpo particular. Las celulas de la tabla son:

Las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 3 muestran las secuencias del peptido asociado a tumor derivado de la survivina. La SEQ ID N.° 3 es conforme a la presente invencion.

Las SEQ ID N.° 4 a SEQ ID N.° 13 y la SEQ ID N.° 24 presentan las secuencias de otros peptidos asociados a tumor usados en la presente invencion.

La SEQ ID N.° 14 expone las secuencias del peptido del HBV.

Las SEQ ID N.° 15 a SEQ ID N.° 23 presentan las secuencias de otros peptidos asociados a tumor usados en la presente invencion.

Las SEQ ID N.° 25 a SEQ ID N.° 27 presentan las secuencias de otros peptidos asociados a tumor de Wang et al. (WO 2007/036638).

Las SEQ ID N.° 28 a SEQ ID N.° 33 muestran las secuencias de los peptidos asociados a tumor de Piesche. Las SEQ ID N.° 34 a SEQ ID N.° 63 presentan las secuencias de los peptidos tal y como aparecen designados en el Ejemplo 3.

Las SEQ ID N.° 64 y SEQ ID N.° 65 presentan las secuencias de los peptidos tal y como se usan en el Ejemplo 4.

Las SEQ ID N.° 66 y SEQ ID N.° 72 presentan las secuencias de los peptidos tal y como se usan en el Ejemplo 5.

Ejemplos

Ejemplo 1:

Identificacion de los peptidos asociados a tumor presentados en la superficie celular

Muestras de tejido

Las muestras de tejido sano y tumoral fueron facilitadas por el Hopital Cantonal Universitaire de Geneve (Oncologfa medica, Laboratorio de inmunologfa tumoral) y la Neurochirurgische Universitats-Klinik Heidelberg (Laboratorio de biologfa molecular). Los pacientes otorgaron su consentimiento informado por escrito antes de la intervencion quirurgica. Los tejidos se criogenizaron en nitrogeno lfquido inmediatamente despues de la operacion y permanecieron a -80°C hasta el aislamiento de los peptidos.

Aislamiento de los peptidos HLA de las muestras de tejido

Las mezclas de peptidos HLA de las muestras de tejido criogenizadas se obtuvieron por inmunoprecipitacion de los tejidos solidos siguiendo un protocolo ligeramente modificado (Falk, K., 1991; Seeger, F. H. et al. T1999) con el anticuerpo espedfico de HLA-A*02 BB7. 2, el anticuerpo espedfico de HLA-A, B y C W6/32, sefarosa activada con CNBr, tratamiento con acido y ultrafiltracion.

Metodo dos:

Las mezclas de peptidos HLA se separaron en funcion de su hidrofobicidad con cromatograffa en fase invertida (sistema Acquity UPLC, Waters) y los peptidos eluidos se analizaron con un espectrometro de masas Idbrido LTQ-Orbitrap (ThermoElectron) equipado con una fuente ESI. Las mezclas de peptidos se cargaron directamente en una columna microcapilar de sflice fundido (75 pm d. i. x 250 mm) rellena con material de fase invertida C18 de 1,7 pm (Waters) aplicando un caudal de 400 nl por minuto. Posteriormente los peptidos se separaron con un gradiente binario de 180 minutos en dos fases con 10% al 33% de B con un caudal de 300 nl por minuto. El gradiente estaba compuesto por solvente A (acido formico al 0,1% en agua) y solvente B (acido formico al 0,1% en acetonitrilo). Para la introduccion en la fuente micro-ESI se empleo un capilar de vidrio recubierto de oro (PicoTip, New Objective). El espectrometro de masas LTQ-Orbitrap se hizo operar en el modo dependiente de datos con el metodo TOP5. En resumen, se inicio un ciclo de barrido con un barrido completo de alta precision de masa en el orbitrap (R = 30000), al que siguieron barridos EM/EM tambien en el orbitrap (R = 7500) con los 5 iones precursores mas abundantes y exclusion dinamica de los iones preseleccionados. Los espectros de masas en tandem se interpretaron con SEQUEST y control manual adicional. La secuencia peptfdica identificada se confirmo comparando el patron de fragmentacion generado por el peptido natural con el patron de fragmentacion de un peptido de referencia sintetico de identica secuencia. La Fig. 1 muestra un ejemplo de espectro obtenido de tejido tumoral correspondiente al peptido asociado a MHC de clase I NCAN-001.

Ejemplo 2

Perfiles de expresion de genes que codifican peptidos

No todos los peptidos identificados como presentes en la superficie de las celulas tumorales a traves de las moleculas MHC son adecuados para la inmunoterapia, porque la mayona de ellos proceden de protemas celulares normales que se expresan en multitud de tipos de celulas. Muy pocos de esos peptidos estan asociados a tumores y probablemente sean capaces de estimular los linfocitos T con una alta especificidad de reconocimiento contra el tumor del cual derivan. A fin de descubrirlos y de minimizar el riesgo de que la vacuna genere autoinmunidad los inventores se centraron en los peptidos derivados de protemas que aparecen sobreexpresadas en las celulas tumorales en comparacion con la mayona de los tejidos normales.

El peptido ideal sena el derivado de una protema que sea exclusiva del tumor y no este presente en ningun otro tejido. Para identificar los peptidos que derivaban de genes dotados con un perfil de expresion similar al ideal los peptidos identificados se asignaron a las protemas y despues a los genes originarios y se generaron los perfiles de expresion de dichos genes.

Fuentes de ARN y preparacion

Las muestras de tejido extirpado fueron facilitadas por dos centros clmicos (vease Ejemplo 1); todos los pacientes otorgaron su consentimiento informado por escrito. Las muestras de tejido tumoral se criogenizaron en nitrogeno lfquido inmediatamente despues de la operacion y se homogeneizaron a mano en un mortero con nitrogeno lfquido. El ARN total se preparo a partir de estas muestras con TRIzol (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y despues se purificaron con RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania); ambos metodos se efectuaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

El ARN total procedente de tejidos humanos sanos se obtuvo por canales comerciales (Ambion, Huntingdon, Reino Unido; Clontech, Heidelberg, Alemania; Stratagene, Amsterdam, Holanda; BioChain, Hayward, CA, EE. UU.). El ARN de varios individuos (de 2 a 123 individuos) se mezclo de tal modo que el ARN de cada uno de ellos estuviera representado en la misma proporcion. Cuatro voluntarios sanos donaron sangre de la que se extrajeron los leucocitos.

La calidad y la cantidad de las muestras de ARN se valoro con Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Alemania) y el RNA 6000 Pico LabChip Kit (Agilent)

Experimentos con micromatrices

El analisis de la expresion genica de todas las muestras de ARN de tejido tumoral y normal se efectuo con micromatrices oligonucleotfdicas Affymetrix Human Genome (HG) U133A o HG-U133 Plus 2. 0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE. UU.). Todos los pasos se llevaron a cabo siguiendo el manual de Affymetrix. En resumen, a partir de 5-8 pg de ARN total se sintetizo ADNc bicatenario con SuperScript RTII (Invitrogen) y el cebador oligo-dT-T7 (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) siguiendo las indicaciones del manual. La transcripcion in vitro se llevo a cabo con el BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, EE. UU.) en el caso de las matrices U133A y con el GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) en el de las matrices U133 Plus 2. 0, y despues se procedio a la fragmentacion del ARNc, a su hibridacion y tincion con estreptavidina-ficoeritrina y un anticuerpo anti-estreptavidina biotinilado (Molecular Probes, Leiden, Holanda). Las imagenes se analizaron con el Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) o con el Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2. 0), y los datos se analizaron con el software GCOS (Affymetrix), aplicando los ajustes por defecto en todos los parametros. Para la normalizacion se utilizaron 100 genes constitutivos (housekeeping) suministrados por Affymetrix. Los valores de expresion relativa se calcularon a partir de los ratios logantmicos de senal dados por el software y la muestra normal se ajusto de forma arbitraria en 1,0.

El perfil de expresion del gen originario NCAN del peptido NCAN-001 muestra una elevada expresion en el tejido tumoral del glioblastoma mientras que el gen no se expresa o lo hace muy poco en los tejidos normales (Fig. 2). Ejemplo 3

Motivos pepddicos HLA-DR derivados de la survivina (swissprot: O15392)

Prediccion de epftopos: La prediccion de los posibles ligandos de HLA-DR se llevo a cabo con la base de datos virtual SYFPEITHI. En resumen, la secuencia de la survivina se cribo con un patron de matriz que evalua cada aminoacido de la secuencia nonamera central de los peptidos 15ameros que encajan en el motivo HLA-DR correspondiente. A los residuos de anclaje se les dan valores de hasta 10; a otros residuos se les puntua hasta 3, reflejando las preferencias de aminoacidos para ciertas posiciones dentro del peptido. La puntuacion maxima teorica de un peptido candidato oscila entre 28 y 43; las puntuaciones de los abundantes ligandos naturales superan normalmente los 20 puntos.

TLGEFLKLDRERAKN (SED ID N.° 1) (o versiones truncadas) ocupa los primeros puestos de los peptidos en 5 de las 6 predicciones.

DRB1*01 (puntuacion teorica maxima 43)

58 FFCFKELEGWEPDDD (SEQ ID N.° 34) 36

98 LGEFLKLDRERAKNK (SEQ ID N.° 35) 28

22 FKNWPFLEGCACTPE (SEQ ID N.° 36) 28

DRB1*03 (puntuacion teorica maxima 40)

99 GEFLKLDRERAKNKI (SEQ ID N.° 37) 29

10 WQPFLKDHRISTFKN (SEQ ID N.° 38) 26

3 APTLPPAWQPFLKDH (SEQ ID N.° 39) 25

DRB1*04 (puntuacion teorica maxima 28)

98 LGEFLKLDRERAKNK (SEQ ID N.° 40) 28

10 WQPFLKDHRISTFKN (SEQ ID N.° 41) 28

3 APTLPPAWQPFLKDH (SEQ ID N.° 42) 26

DRB1*07 (puntuacion teorica maxima 34)

121 KKEFEETAEKVRRAI (SEQ ID N.° 43) 24

128 AEKVRRAIEQLAAMD (SEQ ID N.° 44) 24

3 APTLPPAWQPFLKDH (SEQ ID N.° 45) 22

16 DHRISTFKNWPFLEG (SEQ ID N.° 46) 20

28 LEGCACTPERMAEAG (SEQ ID N.° 47) 18

40 EAGFIHCPTENEPDL (SEQ ID N.° 48) 18

93 FEELTLGEFLKLDRE (SEQ ID N.° 49) 16

103 KLDRERAKNKIAKET (SEQ ID N.° 50) 16

DRB1*11 (puntuacion teorica maxima 38)

98 LGEFLKLDRERAKNK (SEQ ID N.° 51) 32

83 GCAFLSVKKQFEELT (SEQ ID N.° 52) 24

58 FFCFKELEGWEPDDD (SEQ ID N.° 53) 22

DRB1*15 (puntuacion teorica maxima 34)

95 ELTLGEFLKLDRERA (SEQ ID N.° 54) 30

19 ISTFKNWPFLEGCAC (SEQ ID N.° 55) 28

55 AQCFFCFKELEGWEP (SEQ ID N.° 56) 28

Pasos para tomar la decision sobre la secuencia

1. Para cada peptido se precisa una secuencia nonamera central para la union al HLA-DR. Secuencias centrales predichas:

DRB1*01FLKLDRERA (SEQ ID N.° 57)

DRB1*03LKLDRERAK (SEQ ID N.° 58)

DRB1*04FLKLDRERA (SEQ ID N.° 59)

DRB1*11FLKLDRERA (SEQ ID N.° 60)

DRB1*15LGEFLKLDR (SEQ ID N.° 61)

2. Combinar las secuencias centrales para obtener una secuencia central promiscua:

Combinada: LGEFLKLDRERAK (SEQ ID N.° 62)

3. Anadir secuencias flanqueantes hasta obtener la longitud final de 15 aminoacidos:

Final: TLGEFLKLDRERAK (SEQ ID N.° 63)

Ejemplo 4

Se llevo a cabo un estudio clmico para confirmar la inmunogenicidad del peptido con la SEQ ID N.° 1. El objetivo principal del estudio era investigar la respuesta del PSA (antigeno espedfico de prostata) (PSA-R) a la administracion subcutanea de un panel de peptidos espedficos de la prostata (vacunacion) en pacientes con recidiva bioqmmica tras prostatectoirna radical sin deteccion de lesiones metastasicas evidentes.

El objetivo secundario del estudio consistio en investigar la tolerabilidad y la viabilidad del tratamiento vacunal en pacientes con carcinoma de prostata, con especial hincapie en los fenomenos inmunitarios en terminos de respuesta de los linfocitos T.

El estudio se diseno como un ensayo prospectivo y aleatorizado de fase I/II para la indicacion de «recidiva bioqmmica tras prostatectom^a radical sin deteccion de lesiones metastasicas evidentes».

Poblacion del estudio

Como parte de este estudio de fase I/II se intento inducir la regresion del PSA como indicador del cese del crecimiento tumoral mediante la vacunacion con un panel de peptidos espedficos de la prostata en pacientes HLA-A*02+ que presentaban recidiva bioqmmica tras la prostatectom^a radical. La combinacion de peptidos espedficos de la prostata se administro por via subcutanea y se evaluo la magnitud de la respuesta inmunitaria en el contexto de varias formas de administracion de las estructuras antigenicas.

A diferencia de los estudios de vacunacion anteriores, el estudio priorizo el tratamiento de pacientes que presentaban una pequena carga tumoral todavfa indetectable con las tecnicas de imagen. Todos los pacientes fueron vacunados del mismo modo utilizando conocidas estructuras antigenicas espedficas de la prostata para estimular la respuesta inmunitaria contra las celulas malignas. Se trato a 19 pacientes.

Tabla 7. Poblacion del estudio

Esquema de tratamiento

Una vez descartadas las lesiones metastasicas manifiestas con la tomograffa computadorizada y la gammagraffa osea, la vacuna de peptidos espedficos contra la prostata se administro por v^ a subcutanea conforme a las diferentes formas de administracion a pacientes con recidiva del PSA que hadan sido sometidos a prostatectom^a radical (aumento del PSA: elevacion del 50% en dos analisis realizados como mmimo con 14 dfas de diferencia). La vacuna se administro ocho veces los dfas 0, 7, 14, 28, 42 y 56 (aproximadamente 100 microgramos de cada peptido en cada inyeccion). Despues de cada vacunacion y de nuevo el dfa 70, se midio la concentracion de PSA para evaluar la respuesta al tratamiento.

Si se detectaba respuesta del tumor (remision completa [PSA-CR] o remision parcial [PSA-PR] o estabilizacion clmica [sin cambio, PSA-NC]), el paciente recida la vacuna una vez al mes como tratamiento de mantenimiento con la forma de administracion seleccionada en cada caso. La respuesta del paciente al tratamiento de vacunacion se evaluo detalladamente del modo indicado a continuacion:

Remision completa (PSA-CR): Normalizacion de la concentracion de PSA inicialmente elevada, confirmada por la medicion despues de un intervalo mmimo de 4 semanas. La normalizacion se definio como un valor mmimo del PSA < 0,2 ng/ml, que cabna esperar despues de la prostatectoirna radical con extirpacion completa del tumor o de la prostata.

Remision parcial: a) PSA-PR < 80% (Reduccion de un 80% de la concentracion de PSA inicialmente elevada, confirmada por la medicion despues de un intervalo mmimo de 4 semanas); y b) PSA-PR < 50% (Reduccion de un 50% de la concentracion de PSA inicialmente elevada, confirmada por la medicion despues de un intervalo mmimo de 4 semanas);

Enfermedad estable (PSA-SD): Ningun cambio significativo durante un penodo mmimo de cuatro semanas. Esto incluye la estabilizacion y una reduccion inferior al 50% y un aumento inferior al 10%, confirmada por la medicion despues de un intervalo de al menos 4 semanas.

Progresion (PSA-PD): Aumento de la concentracion de PSA superior al 10%. El estudio se daba por concluido para el paciente si apareda progresion del PSA.

Una vez admitidos los pacientes en el estudio se les administraba la vacuna de epftopos espedficos; se tuvieron en cuenta las protemas que se expresan espedficamente en las celulas epiteliales de la prostata (p. ej. PSMA / PSCA). Ademas de investigar la eficacia general de la vacuna controlando el crecimiento de las fracciones residuales del tumor mediante la cuantificacion regular de las concentraciones de PSA, el estudio investigo los efectos de los diversos metodos de vacunacion sobre la modulacion del sistema inmunitario. Ademas de la simple administracion subcutanea de los peptidos acordes con la invencion solos tambien se probaron diversas combinaciones con adyuvantes. La vacuna incluyo una combinacion de al menos 6 peptidos derivados de PSA, PSCA, PSMA, survivina, TRP-P8 y prostema, respectivamente. Como control positivo se utilizo un peptido derivado de la MP gripal. Como epftopos para los linfocitos T cooperadores se emplearon peptidos derivados del PSMA y de la survivina. En concreto se empleo Montanide por la liberacion lenta y el efecto adyuvante que consigue en las vacunas peptfdicas (Montanide consiste en el clasico adyuvante incompleto de Freund adaptado para la administracion en humanos), que recientemente ha sido descrito muy favorablemente. Con este fin, antes de la administracion se mezclaron 500 |jl de la solucion de peptidos con 500 j l de Montanide. Asf se obtiene una emulsion de agua en aceite que libera lentamente el antfgeno contenido en la fase acuosa durante varias semanas. La estabilidad ffsica de la emulsion es muy alta, y a 4 °C se puede conservar durante mas de tres meses sin una separacion apreciable de las fases. La liberacion lenta de Montanide se ha aprovechado en varios ensayos de vacunacion con buenos resultados (Oka et al., 2004).

En una rama del estudio se investigo la eficacia de la vacunacion con la estimulacion simultanea del sistema inmunitario con factores de crecimiento, GM-CSF y solucion inyectable Leukine®. El GM-CSF es un adyuvante muy habitual en los ensayos de vacunacion con peptidos y en varios se ha descrito la potenciacion de la respuesta clmica y de los linfocitos T. Inicialmente, el GM-CSF actua como un factor de reclutamiento y de diferenciacion de las celulas dendrfticas que se cree que potencia el numero de estas en el punto de inyeccion de la vacuna. Aunque el GM-CSF no activa por sf solo las celulas presentadoras de antfgeno como las celulas dendrfticas y los macrofagos sf se ha descrito la activacion indirecta en condiciones in vivo (Molenkamp et al., 2005).

Otra rama del estudio investigo la eficacia de la vacunacion con la activacion simultanea de las celulas dendnticas mediante el uso epicutaneo del imiquimod. El imiquimod se administro en forma de pomada al 5% (Aldara). Ejerce una potente accion inmunoestimuladora a traves de su efecto sobre las celulas TLR7-positivas (p. ej. celulas dendnticas plasmocitoides, celulas de Langerhans, celulas dendnticas dermicas), que activa la via dependiente de MyD88. Las APC activadas liberan citocinas inflamatorias y estimuladoras de los linfocitos T, regulan al alza la coestimulacion y migran a los ganglios linfaticos invadidos por el tumor. En modelos con animales se ha demostrado el potencial de imiquimod para estimular la respuesta de los CTL inducida por los peptidos con la mezcla de los antfgenos en la pomada o con la aplicacion de Aldara sobre el punto de administracion por via s.c. o inyeccion i.d. de los antigenos.

Otra rama del estudio investigo la eficacia de la vacunacion con la activacion concomitante de las celulas dendnticas mediante su mezcla con ARNm de la mucina-1 estabilizado con protaminas para activar los TLR 7/8. El ARNm genera una amplia activacion de las poblaciones de celulas inmunitarias de raton y humanas. La incorporacion a la formulacion de la protema polibasica protamina aumenta la semivida del ARNm y propicia la formacion de partmulas que probablemente prolongan la liberacion. Asf pues, este adyuvante combina propiedades de liberacion lenta con la activacion de las APC.

En resumen, las formas de administracion de la vacuna incluyeron las siguientes estrategias:

a) Administracion subcutanea de la vacuna peptfdica emulsificada con Montanide

b) Administracion subcutanea de la vacuna peptfdica emulsificada en 500 pl de Montanide en combinacion con la administracion topica de 225 pl de GM-CSf con el objetivo de lograr una respuesta inmunitaria mas potente gracias a la administracion simultanea de factores de crecimiento;

c) Administracion subcutanea de la vacuna peptfdica emulsificada en 500 pl de Montanide en combinacion con hipertermia local, esta ultima con el objetivo de lograr una respuesta inmunitaria mas potente por el efecto termico;

d) Administracion subcutanea de la vacuna peptfdica emulsificada en 500 pl de Montanide en combinacion con imiquimod epicutaneo a fin de activar las celulas dendnticas a traves del TLR 7;

e) Administracion subcutanea de la vacuna peptfdica emulsificada en 500 pl de Montanide en combinacion con 55 pl de ARNm de mucina-1/protamina a fin de activar las celulas dendnticas a traves de los TLR 7/8.

Calendario

La duracion total del estudio fue de tres anos. Las vacunas con los peptidos espedficos de prostata se administraron a los pacientes los dfas 0, 7, 14, 28, 42 y 56. En los pacientes con enfermedad estable o con respuesta objetiva del tumor (PSA-CR o PSA-PR) las vacunas se administraron una vez al mes por via i.d. hasta detectar progresion. A tenor de la experiencia hasta la fecha, las inyecciones de peptidos se toleran sin reacciones adversas significativas. Como la respuesta al tratamiento vacunal se evaluo exclusivamente con la serologfa a traves de las concentraciones de PSA, al inicio del estudio se efectuo un analisis para determinar si la vacuna administrada interfena con la medicion de las concentraciones de PSA in vitro, de modo que pudiera semejar una respuesta clmica. Los dfas 0, 7, 14, 28, 42, 56 y 70 se extrajeron muestras de sangre para las analfticas clmicas, la concentracion de PSA, el hemograma diferencial, el analisis de FACS y citocinas. Si el tratamiento duraba mas de 70 dfas se practicaba un control regular del PSA cada 6 semanas para detectar oportunamente el fracaso terapeutico.

El tratamiento conclrna si se verificaba la progresion de la enfermedad con la elevacion continua del PSA.

A partir del dfa 84 el tratamiento de vacunacion se administro cada 4 semanas hasta verificar la progresion o hasta el dfa 420 (15 meses). Las decisiones referentes a la continuacion del tratamiento fuera del estudio en los casos de exito se tomaron de forma individualizada. Durante el estudio no hubo reacciones adversas imprevistas.

Las analfticas incluyeron pruebas de coagulacion, electrolitos, LDH, 132-M, CK, enzimas hepaticas, bilirrubina, creatinina, acido urico, protema total, coagulacion, CRP, hemograma diferencial con extension, concentracion de PSA, citocinas, FACS y Elispot.

El analisis de la reaccion cutanea a antfgenos bacterianos y fungicos conocidos (48-72 horas despues de la administracion, hipersensibilidad retardada (DTH), mediada por linfocitos T, se empleo para analizar el sistema inmunitario celular del paciente antes de iniciar el estudio)

Los peptidos necesarios para el estudio (nonapeptidos) se fabricaron en el laboratorio del Dr. Stefan Stevanovic del departamento del catedratico H. G. Rammensee. Los peptidos se purificaron con HPLC y se analizaron con espectrometna de masas. La pureza de los peptidos tambien se puede verificar con HPLC, espectrometna de masas y secuenciacion de Edman. Con estos metodos se puede obtener una pureza de hasta el 98% (que se puede considerar el maximo por el estado actual de los metodos). Los peptidos sintetizados se disolvieron en DMSO (CryoSure, WAK Chemie Medical GmbH; 10 mg/ml), se diluyeron 1:10 con Ampuwa (Fresenius Kabi), y se fraccionaron en almuotas en condiciones esteriles.

Respuesta clmica

En dos pacientes el estudio de TEP-TAC revelo recurrencia local despues de detectar el tumor local mediante tacto rectal continuo. En los 17 pacientes restantes la localizacion de la actividad de la enfermedad no se pudo verificar al acabar el estudio.

Los hemogramas diferenciales y los analisis bioqmmicos completes reiterados no revelaron anomaKas ni cambios durante el estudio.

Dieciseis de los 19 pacientes reaccionaron al peptido de la survivina II (IFN-g ELISPOT, /- ICS) acorde con la SEQ ID N.° 1. Entre ellos hubo 12 que manifestaron una respuesta de linfocitos T contra la survivina despues de la vacunacion, dos que ya presentaban linfocitos T anti-survivina antes de ello y otros dos en los que no se pudo determinar si los linfocitos T anti-survivina eran abundantes antes de la vacunacion.

Respuesta bioqû mica

La respuesta completa se definio como todo valor de PSA indetectable segun el lfmite de deteccion del laboratorio colaborador despues de haber presentado inicialmente un valor elevado de PSA. Para confirmar la medicion esta tema que verificarse tras un intervalo mmimo de cuatro semanas. La PR > 80% y > 50%teman que volver a analizarse al cabo de cuatro semanas. La enfermedad estable se definio como cualquier valor del PSA comprendido entre una reduccion inferior al 50% y un aumento inferior al 10% que se volvfa a confirmar al cabo de como mmimo cuatro semanas. La enfermedad progresiva se definio como todo aumento del PSA superior al 10% respecto al inicio del tratamiento.

La respuesta bioqmmica de los pacientes que concluyeron el estudio se siguio controlando hasta que comenzaron a recibir otro tratamiento con radioterapia local o privacion de androgenos. Diecinueve pacientes accedieron a participar y sus datos se analizaron; el pertedo de seguimiento mas largo duro alrededor de 3,75 anos.

Estabilidad del PSA y aumento del TD

Dos pacientes (10,2%) manifestaron estabilizacion de los valores de PSA segun los susodichos criterios de recidiva bioqmmica, por los cuales no se produjo ningun aumento del valor del PSA superior al 10% desde el inicio del tratamiento hasta el final del estudio (Fig. 6, Tablas 8, 9 y 10). El seguimiento de los dos casos se prolongo hasta 14 y 16 meses despues de la ultima aplicacion de la vacuna. La duracion media de la estabilidad fue de 24 meses (28 y 31) en el momento de la fecha lfmite de datos con una media de 18 vacunaciones (14 y 20) aplicadas.

Uno de los dos pacientes presento respuesta parcial >50% durante un pertedo de 9 meses, seguida por un pertedo de lento incremento del PSA con un tiempo de duplicacion de 20,5 en comparacion con los 9,8 meses observados antes del tratamiento. La recidiva inicial del PSA habfa comenzado 18 meses despues de la extirpacion de un tumor apT2pN0 Gleason 5.

En el analisis de los datos el paciente 8 mostro enfermedad estable desde el inicio del programa de vacunacion hacfa 28 meses. Pero tuvo que abandonarlo al cabo de 10 meses debido a una reaccion alergica despues de recibir la 14° vacunacion. Presentaba una situacion desfavorable con tumor pT3b Gleason 3+4 con un valor mmimo del PSA no inferior a 0,6 ng/ml tras la prostatectoirna radical y progresion del PSA tras un declive postquirurgico inicial. El tiempo de duplicacion se freno pasando de 6,6 a 148 meses.

Ambos pacientes recibieron imiquimod dermico en el punto de aplicacion con cada vacunacion peptfdica (Figuras 9, 10 y 11, Tabla 13).

Aumento del TD del PSA sin estabilidad del mismo

El TD del PSA del paciente 11 aumento de 1,5 a 10,1 meses en los primeros seis meses del estudio. Como habfa comenzado con un PSA de 10,8 ng/ml y progreso hasta 17,8 ng/ml se le retiro de los procedimientos del estudio para recibir supresion androgenica en monoterapia sin que se visualizara ninguna lesion maligna en el TEP-TAC. Recibio Aldara como adyuvante.

El paciente 16 comenzo con el tratamiento a base de vacuna acompanada de ARNm de la mucina-1/protamina con un tiempo de duplicacion de 6,1 meses. La velocidad del PSA se redujo hasta un tiempo de semivida de 2,7 meses durante cinco meses, seguidos por un repunte calculado estadfsticamente del TD del PSA de 14,4 meses que continuaba 16 meses despues de comenzar el tratamiento. Su PSA inicial de 0,29 ng/ml se redujo a 0,19 ng/ml durante los 5 primeros meses de tratamiento del estudio, volvio a aumentar a 0,4 ng/ml en los 8 meses siguientes y 19 meses despues de iniciar el tratamiento concluyo el estudio conforme al protocolo con 0,41 ng/ml (Fig. 7, Tablas 8 y 10).

Progresion del PSA

El paciente 5 manifesto progresion durante el estudio segun el tiempo de duplicacion del PSA calculado antes de recibir las vacunas. No obstante, experimento un declive del PSA con un tiempo de semivida de 20,2 meses despues del final del tratamiento durante un periodo continuo de 10 meses hasta la fecha Ifmite de recogida de datos. Despues de concluir las vacunaciones segma sin recibir ningun tratamiento secundario. Las vacunas se le administraron con Montanide como unico adyuvante (Figura 8, Tabla 13).

Tabla 8: Tiempo de duplicacion del PSA en meses

Tabla 9: Estabilidad del PSA con un aumento no superior al 10% respecto al valor inicial del PSA

Tabla 10: Incremento permanente del TD del PSA durante la vacunacion, en meses

Tabla 11: Sin cambio del TD del PSA durante la vacunacion (meses) pero con declive posterior

Tabla 12: Descenso/estabilidad transitoria del TD del PSA (meses) seguido por aumento acelerado

Sntesis

Los peptidos se sintetizaron de forma totalmente automatica con el sintetizador de peptidos EPS 221 fabricado por Abimed. El programa de smtesis se ajusta a los protocolos indicados por el fabricante. Siempre que es posible se anotan los numeros de lote de los reactivos empleados en la fabricacion de cada lote de peptido.

Procesamiento del peptido bruto

El procesamiento del peptido bruto consistio en la separacion del mismo de la resina de smtesis y la eliminacion de los grupos protectores de las cadenas laterales con TFA / fenol / etanoditiol / tioanisol / agua (90/3,75/1,25/2,5/2,5, porcentajes en volumen) durante 1 h o 3 h (peptidos con arginina). El peptido bruto se precipito con metil-tertbutileter, se lavo tambien con metil-tert-butileter y dos veces con dietileter, se seco y el sedimento formado por el peptido se diluyo con acido acetico. De nuevo se volvio a precipitar con dietileter, se seco, se resuspendio en agua y se liofilizo.

HPLC preparativa

Sistema de HPLC Varian "Star", columna cromatografica de 250 x 10 mm con C18 y 5 pm (Ziemer). Solvente movil A: agua con TFA al 0,1%, solvente movil B:acetonitrilo con TFA al 0,08%. El gradiente utilizado para la separacion esta orientado a la hidrofobicidad del peptido. Las fracciones de peptido separadas se liofilizan.

Analisis

Se registro un cromatograma HPLC y un espectro de masas MALDI de cada peptido para demostrar la identidad (mediante la masa molar reflejada en el espectro de masas) y la pureza (con las areas de los picos del cromatograma HPLC).

Peptidos sinteticos y esdmulos

Los peptidos sinteticos empleados para la estimulacion y las pruebas funcionales fueron el epftopo derivado del VIH (HIV gag 164-181: YVDRFYKTLRAEQASQEV (SEQ ID N.° 65), control negativo); el PSMA 459-473: NYTLRVDCTPLMYSL (SEQ ID N.° 64) y el survivina 97-111: TLGEFLKLDRERAKN (SEQ ID N.° 1). La enterotoxina estafilococica B (SEB, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania) se utilizo como control positivo de la estimulacion de los linfocitos T CD4+ en el ELISPOT con interferon-Y.

Amplificacion in vitro de los linfocitos T espedficos

Se obtuvieron celulas mononucleares de sangre periferica de pacientes con carcinoma de prostata en diferentes intervalos de tiempo durante la vacunacion que se conservaron congeladas en nitrogeno lfquido con suero fetal bovino al 90% y DMSO al 10%. Una vez descongeladas, se cultivaron aproximadamente 5 x 106 celulas (placas de cultivo celular de 24 pocillos, Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania) con medio IMDM complementado con penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 pg/ml (todos de Biowhittaker, Verviers, Belgica), suero humano termoinactivado al 10% (c.c.pro, Neustadt, Alemania) y beta-mercaptoetanol 50 pM a 37°C y CO²al 7,5%. El dfa 1 se anadieron mezclas de peptidos sinteticos de union a HLA de clase II, cada uno en una concentracion de 5 pg/ml y el cultivo se complemento con IL-2 recombinante humana (r-hIL2, R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Alemania) en los dfas 2, 5, 7 y 9 de la estimulacion de los linfocitos T.

Ensayo de puntos por inmunoabsorcion ligada a enzima (ELISPOT)

La funcionalidad de los linfocitos T expandidos se analizo con un ensayo ELISPOT con interferon-Y siguiendo las recomendaciones del comite de seguimiento de CIMT (CIMT Monitoring Panel; www.c-imt.org). En suma, las celulas se recolectaron a los 12 dfas de cultivo, se lavaron, contaron y sembraron con medio de cultivo en una placa ELISPOT (Millipore, Schwalbach, Alemania). Se analizaron por duplicado o triplicado entre 0,15 y 0,25 x 106 celulas en presencia de los peptidos sinteticos con una concentracion de 2,5 pg/ml o bien con SEB en una concentracion 1 pg/ml. La produccion de IFN-^yse detecto con una pareja de anticuerpos monoclonales espedficos (1D1-k y 7-B6-1, ambos de Mabtech, Nacka Strand, Suecia) tras 26 horas de incubacion a 37°C y CO2 al 5%. Se anadieron ExtraAvidina-fosfatasa alcalina y sustrato BCIP/NBT (ambos de Sigma-Aldrich) durante 1 hora y durante 10 min, respectivamente. El analisis ELISPOT se llevo a cabo con lectores ImmunoSpot (Series 3A y 5, Cellular Technology Ltd, Aalen, Alemania).

Tincion intracelular de citocinas

Las celulas recuperadas del ensayo ELISPOT se siguieron cultivando en presencia de r-hIL22 ng/ml durante nueve dfas mas. Despues de ese penodo de reestimulacion, las celulas efectoras se recolectaron, se lavaron y se estimularon en un ensayo estandar con los peptidos a 5 pg/ml o con PMA e ionomicina (50 ng/ml y 1 pM, respectivamente) en presencia de Golgi-STOP (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Despues de un penodo de incubacion de 6 horas, las celulas se lavaron con PBS, FCS al 1% y NaN³al 0,02% y se tineron con los anticuerpos monoclonales (AcM) CD4-APC-Cy7 (BD Biosciences) y CD8-PE-Cy7 (Beckman Coulter) durante 20 min a 4°C y a oscuras. Despues de una fase de lavado, las celulas se permeabilizaron durante 20 min con el reactivo Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) y despues se tineron durante 30 minutes para visualizar las citocinas intracelulares. Los AcM utilizados fueron: IFN-^y-FITC, IL-10-PE (ambos de BD Biosciences), IL-5-APC (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) y TNF-D-Pacific Blue (Biolegend, San Diego, California, EE. UU.). La adquisicion de las celulas se llevo a cabo con un citometro Canto II, con software Diva y analisis con FlowJo (BD Biosciences).

Ejemplo 5

Union de BIR-11, BIR-12 y BIR-13 a HLA-A*0211

El objetivo de este analisis consistfa en evaluar la afinidad de los peptidos C-terminales de BIR-004 (ELTLGEFLKLDRERAKN (SEQ ID N.° 2)) hacia la molecula de MHC codificada por el alelo HLA-A*0211 ya que de este alelo se ha descrito su capacidad para unirse a peptidos portadores de residuos de asparragina en el extremo C-terminal. Los ligandos MHC con la N c-terminal no son muy frecuentes y solo hemos analizado 66 peptidos que la tengan en dicho extremo C-terminal. La gran mayona no reconocen ligandos MHC, salvo contadas excepciones: RLYNFSFLN (SEQ ID N.° 66) se une con fuerza a A*0211 y tambien YADGGQWYN (SEQ ID N.° 67) se une a A*0211...”).

Las pruebas indican con claridad que la union al HLA-A*0211 se da en el caso del BIR-11 (nonamero C-terminal: KLDRERAKN (SEQ ID N.° 68)) y, en concentraciones elevadas, con el BIR-13 (decamero C-terminal: LKLDRERAKN (SEQ ID N.° 69)), pero no con el BIR-12 (octamero C-terminal: LDRERAKN (S^eQ ID N.° 70)). El peptido que sirvio como control positivo (Secuencia: FLPSDYFPSV (SEQ ID N.° 71)) mostro claras propiedades de union.

Fundamento de la prueba

El ensayo se preparo del modo siguiente: Los complejos estables de HLA/peptido constan de tres moleculas: cadena pesada de HLA, beta-2 microglobulina (b2m) y el ligando peptfdico. La actividad de las moleculas de cadena pesada recombinantes y desnaturalizadas del HLA-A*0211 solas se puede conservar convirtiendolas en equivalentes funcionales de «moleculas HLA-A*0211 vadas». Cuando se diluyen en un tampon acuoso que contiene b2m y un peptido adecuado, estas moleculas se pliegan con rapidez y con eficacia de un modo que depende totalmente del peptido. La disponibilidad de estas moleculas se utiliza en un ensayo ELISA para medir la afinidad de la interaccion entre el peptido y la molecula HLA de clase I (Sylvester-Hvid et al., 2002 SYLVESTERHVID2002 /id).

Moleculas recombinantes y purificadas de HLA-A*0211 se incubaron con b2m y dosis escalonadas del peptido de interes. La cantidad de complejos de HLA/peptido plegados de novo se determino con un ELISA cuantitativo. Las constantes de disociacion (valores K^d) se calcularon con una curva patron trazada con disoluciones de un complejo de HLA/peptido de calibracion. La desviacion en las mediciones resulto demasiado grande para obtener valores K^dfiables, aunque se puede decir que el valor K^ddel BIR13 se haya comprendido en el intervalo del control positivo, mientras que el valor Kd del BIR-11 es mayor. Cuanto mas bajo es el valor de Kd mayor es la afinidad hacia el HLA-A*0211.

Puntuaciones de union del nonamero BIR-11 y del nonamero BIR-11a frente a varios alelos con SYFPEITHI KLDRERAKD (SEQ ID Puntuacion

N.° 72). ID del alelo Nombre del alelo relativa Puntuacion KLDRERAKD 74 A*0301 0,45 20

KLDRERAKD 65 A*0201 0,42 15

KLDRERAKD 99 B*1501 (B62) 0,36 10

KLDRERAKD 334 A*0101 0,28 14

KLDRERAKD (SEQ ID Puntuacion

N.° 68). ID del alelo Nombre del alelo relativa Puntuacion KLDRERAKN 74 A*0301 0,45 20

KLDRERAKN 65 A*0201 0,42 15

KLDRERAKN 99 B*1501 (B62) 0,36 10

KLDRERAKN 334 A*0101 0,28 14

Lista de referencias bibliograficas

Al-Joudi FS, Iskandar ZA, Imran AK (2007). Survivin expression correlates with unfavourable prognoses in invasive ductal carcinoma of the breast. Med J Malaysia 62, 6-8.

al-Sheneber IF, Shibata HR, Sampalis J, Jothy S (1993). Prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen expression in colorectal cancer. Cancer 71, 1954-1959.

Angileri FF, Aguennouz M, Conti A, La TD, Cardali S, Crupi R, Tomasello C, Germano A, Vita G, Tomasello F (2008). Nuclear factor-kappaB activation and differential expression of survivin and Bcl-2 in human grade 2-4 astrocytomas. Cancer.

Apostolopoulos V, McKenzie IF (1994). Cellular mucins: targets for immunotherapy. Crit Rev. Immunol. 14, 293 309.

Appay V, Speiser DE, Rufer N, Reynard S, Barbey C, Cerottini JC, Leyvraz S, Pinilla C, Romero P (2006). Decreased specific CD8+ T cell cross-reactivity of antigen recognition following vaccination with Melan-A peptide. Eur. J Immunol. 36, 1805-1814.

Asher RA, Morgenstern DA, Fidler PS, Adcock KH, Oohira A, Braistead JE, Levine JM, Margolis RU, Rogers JH, Fawcett JW (2000). Neurocan is upregulated in injured brain and in cytokine-treated astrocytes. J Neurosci. 20, 2427-2438.

Bamias A, Chorti M, Deliveliotis C, Trakas N, Skolarikos A, Protogerou B, Legaki S, Tsakalou G, Tamvakis N, Dimopoulos MA (2003). Prognostic significance of CA 125, CD44, and epithelial membrane antigen in renal cell carcinoma. Urology 62, 368-373.

Barnd DL, Lan Ms , Metzgar RS, Finn OJ (1989). Specific, Major Histocompatibility Complex-Unrestricted Recognition of Tumor-Associated Mucins by Human Cytotoxic T Cells. PNAS 86, 7159-7163.

Bates S, Bonetta L, MacAllan D, Parry D, Holder A, Dickson C, Peters G (1994). CDK6 (PLSTIRE) and CDK4 (PSK-J3) are a distinct subset of the cyclin-dependent kinases that associate with cyclin D1. Oncogene 9, 71-79. Beilmann M, Vande Woude GF, Dienes HP, Schirmacher P (2000). Hepatocyte growth factor-stimulated invasiveness of monocytes. Blood 95, 3964-3969.

Berger M, Bergers G, Arnold B, Hammerling GJ, Ganss R (2005). Regulator of G-protein signaling-5 induction in pericytes coincides with active vessel remodeling during neovascularization. Blood 105, 1094-1101.

Bertoletti A, Chisari FV, Penna A, Guilhot S, Galati L, Missale G, Fowler P, Schlicht HJ, Vitiello A, Chesnut RC, . (1993). Definition of a minimal optimal cytotoxic T-cell epitope within the hepatitis B virus nucleocapsid protein. J. Virol. 67, 2376-2380.

Bladt F, Riethmacher D, Isenmann S, Aguzzi A, Birchmeier C (1995). Essential role for the c-met receptor in the migration of myogenic precursor cells into the limb bud. Nature 376, 768-771.

Blum R, Jacob-Hirsch J, Rechavi G, Kloog Y (2006). Suppression of survivin expression in glioblastoma cells by the Ras inhibitor farnesylthiosalicylic acid promotes caspase-dependent apoptosis. Mol. Cancer Ther. 5, 2337 2347.

Borset M, Seidel C, Hjorth-Hansen H, Waage A, Sundan A (1999). The role of hepatocyte growth factor and its receptor c-Met in multiple myeloma and other blood malignancies. Leuk. Lymphoma 32, 249-256.

Bottaro DP, Rubin JS, Faletto DL, Chan AM, Kmiecik TE, Vande Woude GF, Aaronson SA (1991). Identification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product. Science 251, 802-804.

Bowen Ar , Hanks AN, Murphy KJ, Florell SR, Grossman D (2004). Proliferation, apoptosis, and survivin expression in keratinocytic neoplasms and hyperplasias. Am J Dermatopathol. 26, 177-181.

Boyton RJ, Lohmann T, Londei M, Kalbacher H, Halder T, Frater AJ, Douek DC, Leslie DG, Flavell RA, Altmann DM (1998). Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes: analysis in disease discordant human twins, non-obese diabetic mice and ^hLA-DQ transgenic mice. Int. Immunol. 10, 1765-1776.

Bramhall SR, Neoptolemos JP, Stamp GW, Lemoine NR (1997). Imbalance of expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of the matrix metalloproteinases (TIMPs) in human pancreatic carcinoma. J Pathol. 182, 347-355.

Brossart P, Heinrich KS, Stuhler G, Behnke L, Reichardt VL, Stevanovic S, Muhm A, Rammensee HG, Kanz L, Brugger W (1999a). Identification of HLA-A2-restricted T-cell epitopes derived from the MUC1 tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies. Blood 93, 4309-4317.

Brossart P, Heinrich KS, Stuhler G, Behnke L, Reichardt VL, Stevanovic S, Muhm A, Rammensee HG, Kanz L, Brugger W (1999b). Identification of HLA-A2-restricted T-cell epitopes derived from the MUC1 tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies. Blood 93, 4309-4317.

Brossart P, Wirths S, Stuhler G, Reichardt VL, Kanz L, Brugger W (2000). Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses in vivo after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells. Blood 96, 3102-3108.

Browner MF, Smith WW, Castelhano AL (1995). Matrilysin-inhibitor complexes: common themes among metalloproteases. Biochemistry 34, 6602-6610.

Burton EC, Prados MD (2000). Malignant gliomas. Curr. Treat. Options. Oncol 1, 459-468.

Cao Y, Karsten U, Zerban H, Bannasch P (2000). Expression of MUC1, Thomsen-Friedenreich-related antigens, and cytokeratin 19 in human renal cell carcinomas and tubular clear cell lesions. Virchows Arch. 436, 119-126. Casati C, Dalerba P, Rivoltini L, Gallino G, Deho P, Rini F, Belli F, Mezzanzanica D, Costa A, Andreola S, Leo E, Parmiani G, Castelli C (2003). The apoptosis inhibitor protein survivin induces tumor-specific CD8+ and CD4+ T cells in colorectal cancer patients. Cancer Res. 63, 4507-4515.

Castellino F, Huang AY, tan-Bonnet G, Stoll S, Scheinecker C, Germain RN (2006). Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature 440, 890-895. CBTRUS. Primary Brain Tumors in the United States, Statistical Report. 2006. Ref Type: Internet Communication

Chakravarti A, Noll E, Black PM, Finkelstein DF, Finkelstein DM, Dyson NJ, Loeffler JS (2002). Quantitatively determined survivin expression levels are of prognostic value in human gliomas. J Clin Oncol 20, 1063-1068.

Chanock SJ, Foster CB, Miller FW, O'Hanlon TP (2004). HLA-A, -B, -Cw, -DQA1 and -DRB1 Alleles in a Caucasian Population from Bethesda, USA. Hum. Immunol. 65, 1211-1223.

Cheever MA, Chen W, Disis ML, Takahashi M, Peace DJ (1993). T-cell immunity to oncogenic proteins including mutated ras and chimeric bcr-abl. Ann N. Y. Acad. Sci. 690, 101-112.

Chen X, Higgins J, Cheung ST, Li R, Mason V, Montgomery K, Fan ST, van de RM, So S (2004). Novel endothelial cell markers in hepatocellular carcinoma. Mod. Pathol. 17, 1198-1210.

Colombetti S, Basso V, Mueller DL, Mondino A (2006). Prolonged TCR/CD28 engagement drives IL-2-independent T cell clonal expansion through signaling mediated by the mammalian target of rapamycin. J Immunol. 176, 2730-2738.

Cresswell P (1994). Assembly, transport, and function of MHC class II molecules. Annu. Rev. Immunol. 12, 259 293.

Dazzi C, Cariello A, Giannini M, Del DM, Giovanis P, Fiorentini G, Leoni M, Rosti G, Turci D, Tienghi A, Vertogen B, Zumaglini F, De GU, Marangolo M (2000). A sequential chemo-radiotherapeutic treatment for patients with malignant gliomas: a phase II pilot study. Anticancer Res. 20, 515-518.

De VL, Zheng B, Fischer T, Elenko E, Farquhar MG (2000). The regulator of G protein signaling family. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40, 235-271.

Delsol G, Al ST, Gatter KC, Gerdes J, Schwarting R, Caveriviere P, Rigal-Huguet F, Robert A, Stein H, Mason DY (1988) . Coexpression of epithelial membrane antigen (EMA), Ki-1, and interleukin-2 receptor by anaplastic large cell lymphomas. Diagnostic value in so-called malignant histiocytosis. Am. J. Pathol. 130, 59-70.

Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Muller M, Kramer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanovic S (2006). Unexpected Abundance of HLA Class II Presented Peptides in Primary Renal Cell Carcinomas. Clin Cancer Res. 12, 4163 4170.

Denys H, De WO, Nusgens B, Kong Y, Sciot R, Le AT, Van DK, Jadidizadeh A, Tejpar S, Mareel M, Alman B, Cassiman JJ (2004). Invasion and MMP expression profile in desmoid tumours. Br. J Cancer 90, 1443-1449. Deshpande A, Sicinski P, Hinds PW (2005). Cyclins and cdks in development and cancer: a perspective. Oncogene 24, 2909-2915.

Di Renzo MF, Olivero M, Giacomini A, Porte H, Chastre E, Mirossay L, Nordlinger B, Bretti S, Bottardi S, Giordano S, . (1995). Overexpression and amplification of the met/HGF receptor gene during the progression of colorectal cancer. Clin. Cancer Res. 1, 147-154.

Dix AR, Brooks WH, Roszman TL, Morford LA (1999). Immune defects observed in patients with primary malignant brain tumors. J Neuroimmunol. 100, 216-232.

Dong G, Chen Z, Li ZY, Yeh NT, Bancroft CC, Van WC (2001). Hepatocyte growth factor/scatter factor-induced activation of MEK and PI3K signal pathways contributes to expression of proangiogenic cytokines interleukin-8 and vascular endothelial growth factor in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res. 61, 5911-5918. Duchateau PN, Pullinger CR, Cho MH, Eng C, Kane ^jP (2001). Apolipoprotein L gene family: tissue-specific expression, splicing, promoter regions; discovery of a new gene. J. Lipid Res. 42, 620-630.

Duchateau PN, Pullinger CR, Orellana RE, Kunitake ST, Naya-Vigne J, O'Connor PM, Malloy MJ, Kane JP (1997). Apolipoprotein L, a new human high density lipoprotein apolipoprotein expressed by the pancreas. Identification, cloning, characterization, and plasma distribution of apolipoprotein L. J. Biol. Chem. 272, 25576 25582.

Dudley ME, Wunderlich JR, Robbins PF, Yang JC, Hwu P, Schwartzentruber DJ, Topalian SL, Sherry R, Restifo NP, Hubicki AM, Robinson MR, Raffeld M, Duray P, Seipp CA, Rogers-Freezer L, Morton KE, Mavroukakis SA, White DE, Rosenberg SA (2002). Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes. Science 298, 850-854.

Dudley ME, Wunderlich JR, Yang JC, Sherry RM, Topalian SL, Restifo NP, Royal RE, Kammula U, White DE, Mavroukakis SA, Rogers LJ, Gracia GJ, Jones SA, Mangiameli DP, Pelletier m M, Gea-Banacloche J, Robinson MR, Berman DM, Filie AC, Abati A, Rosenberg SA (2005). Adoptive cell transfer therapy following nonmyeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 23, 2346-2357.

Duperray C, Klein B, Durie BG, Zhang X, Jourdan M, Poncelet P, Favier F, Vincent C, Brochier J, Lenoir G, . (1989) . Phenotypic analysis of human myeloma cell lines. Blood 73, 566-572.

Engel M, Maurel P, Margolis RU, Margolis RK (1996). Chondroitin sulfate proteoglycans in the developing central nervous system. I. cellular sites of synthesis of neurocan and phosphacan. J Comp Neurol. 366, 34-43.

Ferracini R, Di Renzo MF, Scotlandi K, Baldini N, Olivero M, Lollini P, Cremona O, Campanacci M, Comoglio PM (1995). The Met/HGF receptor is over-expressed in human osteosarcomas and is activated by either a paracrine or an autocrine circuit. Oncogene 10, 739-749.

Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian-Blander J, Barratt-Boyes SM (1995). MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and cancer vaccines. Immunol. Rev. 145, 61-89.

Fischer J, Palmedo G, von KR, Bugert P, Prayer-Galetti T, Pagano F, Kovacs G (1998). Duplication and overexpression of the mutant allele of the MET proto-oncogene in multiple hereditary papillary renal cell tumours. Oncogene 17, 733-739.

Fong L, Hou Y, Rivas A, Benike C, Yuen A, Fisher GA, Davis MM, Engleman EG (2001). Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumor immunotherapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98, 8809-8814.

Friedlander DR, Milev P, Karthikeyan L, Margolis RK, Margolis RU, Grumet M (1994). The neuronal chondroitin sulfate proteoglycan neurocan binds to the neural cell adhesion molecules Ng-CAM/L1/NILE and N-CAM, and inhibits neuronal adhesion and neurite outgrowth. J Cell Biol. 125, 669-680.

Fujita K, Denda K, Yamamoto M, Matsumoto T, Fujime M, Irimura T (1999). Expression of MUC1 mucins inversely correlated with post-surgical survival of renal cell carcinoma patients. Br. J. Cancer 80, 301-308.

Furge KA, Kiewlich D, Le P, Vo MN, Faure M, Howlett AR, Lipson KE, Woude GF, Webb CP (2001). Suppression of Ras-mediated tumorigenicity and metastasis through inhibition of the Met receptor tyrosine kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98, 10722-10727.

Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF (2000). Met receptor tyrosine kinase: enhanced signaling through adapter proteins. Oncogene 19, 5582-5589.

Furuya M, Nishiyama M, Kimura S, Suyama T, Naya Y, Ito H, Nikaido T, Ishikura H (2004). Expression of regulator of G protein signalling protein 5 (RGS5) in the tumour vasculature of human renal cell carcinoma. J. Pathol. 203, 551-558.

Gaire M, Magbanua Z, McDonnell S, McNeil L, Lovett DH, Matrisian LM (1994). Structure and expression of the human gene for the matrix metalloproteinase matrilysin. J Biol Chem. 269, 2032-2040.

Galon J, Costes A, Sanchez-Cabo F, Kirilovsky A, Mlecnik B, Lagorce-Pages C, Tosolini M, Camus M, Berger A, Wind P, Zinzindohoue F, Bruneval P, Cugnenc PH, Trajanoski Z, Fridman WH, Pages F (2006). Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science 313, 1960-1964. Gattinoni L, Powell DJ, Jr., Rosenberg SA, Restifo NP (2006). Adoptive immunotherapy for cancer: building on success. Nat. Rev. Immunol. 6, 383-393.

Gendler S, Taylor-Papadimitriou J, Duhig T, Rothbard J, Burchell J (1988). A highly immunogenic region of a human polymorphic epithelial mucin expressed by carcinomas is made up of tandem repeats. J. Biol. Chem. 263, 12820-12823.

Gerner EW, Meyskens FL, Jr. (2004). Polyamines and cancer: old molecules, new understanding. Nat. Rev. Cancer 4, 781-792.

Gherardi E, Stoker M (1991). Hepatocyte growth factor--scatter factor: mitogen, motogen, and met. Cancer Cells 3, 227-232.

Ghosh JC, Dohi T, Kang BH, Altieri DC (2008). Hsp60 regulation of tumor cell apoptosis. J Biol. Chem. 283, 5188-5194.

Girling A, Bartkova J, Burchell J, Gendler S, Gillett C, Taylor-Papadimitriou J (1989). A core protein epitope of the polymorphic epithelial mucin detected by the monoclonal antibody SM-3 is selectively exposed in a range of primary carcinomas. Int. J. Cancer 43, 1072-1076.

Gnjatic S, Atanackovic D, Jager E, Matsuo M, Selvakumar A, Altorki NK, Maki RG, Dupont B, Ritter G, Chen YT, Knuth A, Old LJ (2003). Survey of naturally occurring CD4+ T cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: correlation with antibody responses. Proc Natl. Acad. Sci. U. S. A 100, 8862-8867.

Gong L, Jiang C, Zhang B, Hu H, Wang W, Liu X (2006). Adenovirus-mediated Expression of Both Antisense Ornithine Decarboxylase and S-adenosylmethionine Decarboxylase Induces G(1) Arrest in HT-29 Cells. J Biochem. Mol. Biol 39, 730-736.

Grumet M, Friedlander DR, Sakurai T (1996). Functions of brain chondroitin sulfate proteoglycans during developments: interactions with adhesion molecules. Perspect. Dev. Neurobiol. 3, 319-330.

Grumet M, Milev P, Sakurai T, Karthikeyan L, Bourdon M, Margolis RK, Margolis RU (1994). Interactions with tenascin and differential effects on cell adhesion of neurocan and phosphacan, two major chondroitin sulfate proteoglycans of nervous tissue. J Biol. Chem. 269, 12142-12146.

Grunda JM, Nabors LB, Palmer CA, Chhieng DC, Steg A, Mikkelsen T, Diasio RB, Zhang K, Allison D, Grizzle WE, Wang W, Gillespie GY, Johnson MR (2006). Increased expression of thymidylate synthetase (TS), ubiquitin specific protease 10 (USP10) and survivin is associated with poor survival in glioblastoma multiforme (GBM). J Neurooncol. 80, 261-274.

Gursky S, Olopade OI, Rowley JD (2001). Identification of a 1.2 Kb cDNA fragment from a region on 9p21 commonly deleted in multiple tumor types. Cancer Genet. Cytogenet. 129, 93-101.

Halaban R (1999). Melanoma cell autonomous growth: the Rb/E2F pathway. Cancer Metastasis Rev. 18, 333 343.

Hammer J, Gallazzi F, Bono E, Karr RW, Guenot J, Valsasnini P, Nagy ZA, Sinigaglia F (1995). Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules: correlation with rheumatoid arthritis association. J Exp. Med 181, 1847-1855. Hanada K, Yewdell JW, Yang JC (2004). Immune recognition of a human renal cancer antigen through post translational protein splicing. Nature 427, 252-256.

Hedberg Y, Davoodi E, Roos G, Ljungberg B, Landberg G (1999). Cyclin-D1 expression in human renal-cell carcinoma. Int. J. Cancer 84, 268-272.

Heid HW, Moll R, Schwetlick I, Rackwitz HR, Keenan TW (1998). Adipophilin is a specific marker of lipid accumulation in diverse cell types and diseases. Cell Tissue Res. 294, 309-321.

Heimberger AB, Hussain SF, Aldape K, Sawaya R, Archer GA, Friedman H, Reardon D, Friedman A, Bigner DD, Sampson JH. Tumor-specific peptide vaccination in newly-diagnosed patients with GBM. Journal of Clinical Oncology, 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement), 2006: 2529.

20-6-2006.

Herz C, Aumailley M, Schulte C, Schlotzer-Schrehardt U, Bruckner-Tuderman L, Has C (2006). Kindlin-1 is a phosphoprotein involved in regulation of polarity, proliferation, and motility of epidermal keratinocytes. J Biol Chem. 281, 36082-36090.

Hwang ML, Lukens JR, Bullock TN (2007). Cognate memory CD4+ T cells generated with dendritic cell priming influence the expansion, trafficking, and differentiation of secondary CD8+ T cells and enhance tumor control. J Immunol. 179, 5829-5838.

Jadeski LC, Chakraborty C, Lala PK (2003). Nitric oxide-mediated promotion of mammary tumour cell migration requires sequential activation of nitric oxide synthase, guanylate cyclase and mitogen-activated protein kinase. Int. J. Cancer 106, 496-504.

Janssen EM, Lemmens EE, Wolfe T, Christen U, von Herrath MG, Schoenberger SP (2003). CD4+ T cells are required for secondary expansion and memory in CD8+ T lymphocytes. Nature 421, 852-856.

Jarvinen TA, Liu ET (2006). Simultaneous amplification of ^hE^r-2 (ERBB2) and topoisomerase IIalpha (TOP2A) genes--molecular basis for combination chemotherapy in cancer. Curr. Cancer Drug Targets. 6, 579-602.

Jones LL, Margolis RU, Tuszynski MH (2003). The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan, brevican, phosphacan, and versican are differentially regulated following spinal cord injury. Exp. Neurol. 182, 399-411. Jucker M, Gunther A, Gradl G, Fonatsch C, Krueger G, Diehl V, Tesch H (1994). The Met/hepatocyte growth factor receptor (HGFR) gene is overexpressed in some cases of human leukemia and lymphoma. Leuk. Res. 18, 7-16.

Kajiwara Y, Yamasaki F, Hama S, Yahara K, Yoshioka H, Sugiyama K, Arita K, Kurisu K (2003). Expression of survivin in astrocytic tumors: correlation with malignant grade and prognosis. Cancer 97, 1077-1083.

Kellner U, Sehested M, Jensen PB, Gieseler F, Rudolph P (2002). Culprit and victim -- DNA topoisomerase II. Lancet Oncol. 3, 235-243.

Kennedy RC, Shearer MH, Watts AM, Bright RK (2003). CD4+ T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumor immunity against simian virus 40 large tumor antigen. Cancer Res. 63, 1040-1045.

Kloeker S, Major MB, Calderwood DA, Ginsberg MH, Jones DA, Beckerle MC (2004). The Kindler syndrome protein is regulated by transforming growth factor-beta and involved in integrin-mediated adhesion. J. Biol. Chem.

279, 6824-6833.

Kobayashi H, Omiya R, Ruiz M, Huarte E, Sarobe P, Lasarte JJ, Herraiz M, Sangro B, Prieto J, Borras-Cuesta F, Celis E (2002). Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoembryonic antigen. Clin Cancer Res. 8, 3219-3225.

Koochekpour S, Jeffers M, Rulong S, Taylor G, Klineberg E, Hudson EA, Resau JH, Vande Woude GF (1997). Met and hepatocyte growth factor/scatter factor expression in human gliomas. Cancer Res. 57, 5391-5398.

Kosari F, Parker AS, Kube DM, Lohse CM, Leibovich BC, Blute ML, Cheville JC, Vasmatzis G (2005). Clear cell renal cell carcinoma: gene expression analyses identify a potential signature for tumor aggressiveness. Clin Cancer Res. 11, 5128-5139.

Kraus S, Abel PD, Nachtmann C, Linsenmann HJ, Weidner W, Stamp GW, Chaudhary KS, Mitchell SE, Franke FE, Lalani e (2002). MUC1 mucin and trefoil factor 1 protein expression in renal cell carcinoma: correlation with prognosis. Hum. Pathol. 33, 60-67.

Kurokawa Y, Matoba R, Nakamori S, Takemasa I, Nagano H, Dono K, Umeshita K, Sakon M, Monden M, Kato K (2004). PCR-array gene expression profiling of hepatocellular carcinoma. J. Exp. Clin. Cancer Res. 23, 135-141. Lemmel C, Weik S, Eberle U, Dengjel J, Kratt T, Becker HD, Rammensee ^hG, Stevanovic S (2004). Differential quantitative analysis of MHC ligands by mass spectrometry using stable isotope labeling. Nat. Biotechnol. 22, 450-454.

Leontiou C, Lightowlers R, Lakey JH, Austin CA (2003). Kinetic analysis of human topoisomerase IIalpha and beta DNA binding by surface plasmon resonance. FEBS Lett. 554, 206-210.

Leroy X, Copin MC, Devisme L, Buisine MP, Aubert JP, Gosselin B, Porchet N (2002). Expression of human mucin genes in normal kidney and renal cell carcinoma. Histopathology 40, 450-457.

Lew DJ, Dulic V, Reed SI (1991). Isolation of three novel human cyclins by rescue of G1 cyclin (Cln) function in yeast. Cell 66, 1197-1206.

Li G, Schaider H, Satyamoorthy K, Hanakawa Y, Hashimoto K, Herlyn M (2001). Downregulation of E-cadherin and Desmoglein 1 by autocrine hepatocyte growth factor during melanoma development. Oncogene 20, 8125 8135.

Li H, Leung TC, Hoffman S, Balsamo J, Lilien J (2000). Coordinate regulation of cadherin and integrin function by the chondroitin sulfate proteoglycan neurocan. J Cell Biol. 149, 1275-1288.

Lin TS, Chiou SH, Wang LS, Huang HH, Chiang SF, Shih AY, Chen YL, Chen CY, Hsu CP, Hsu NY, Chou MC, Kuo SJ, Chow KC (2004). Expression spectra of matrix metalloproteinases in metastatic non-small cell lung cancer. Oncol. Rep. 12, 717-723.

Littaua RA, Takeda A, Cruz J, Ennis FA (1992). Vaccinia virus-specific human CD4+ cytotoxic T-lymphocyte clones. J Virol. 66, 2274-2280.

Liu X, Chen N, Wang X, He Y, Chen X, Huang Y, Yin W, Zhou Q (2006). Apoptosis and proliferation markers in diffusely infiltrating astrocytomas: profiling of 17 molecules. J Neuropathol. Exp. Neurol. 65, 905-913.

Livingston BD, Crimi C, Grey H, Ishioka G, Chisari FV, Fikes J, Grey H, Chesnut RW, Sette A (1997). The hepatitis B virus-specific CTL responses induced in humans by lipopeptide vaccination are comparable to those elicited by acute viral infection. J. Immunol. 159, 1383-1392.

Lo ML, Staibano S, Pannone G, Mignogna MD, Mariggio A, Salvatore G, Chieffi P, Tramontano D, De RG, Altieri DC (2001). Expression of the apoptosis inhibitor survivin in aggressive squamous cell carcinoma. Exp. Mol. Pathol. 70, 249-254.

Loden M, Stighall M, Nielsen NH, Roos G, Emdin SO, Ostlund H, Landberg G (2002). The cyclin D1 high and cyclin E high subgroups of breast cancer: separate pathways in tumorogenesis based on pattern of genetic aberrations and inactivation of the pRb node. Oncogene 21, 4680-4690.

Louhelainen J, Wijkstrom H, Hemminki K (2000). Initiation-development modelling of allelic losses on chromosome 9 in multifocal bladder cancer. Eur. J. Cancer 36, 1441-1451.

Macdonald DR (2001). Temozolomide for recurrent high-grade glioma. Semin. Oncol 28, 3-12.

Mach B, Steimle V, Martinez-Soria E, Reith W (1996). Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 14, 301-331.

Mahlamaki EH, Barlund M, Tanner M, Gorunova L, Hoglund M, Karhu R, Kallioniemi A (2002). Frequent amplification of 8q24, 11q, 17q, and 20q-specific genes in pancreatic cancer. Genes Chromosomes. Cancer 35, 353-358.

Malcherek G, Gnau V, Stevanovic S, Rammensee HG, Jung G, Melms A (1994). Analysis of allele-specific contact sites of natural HLA-DR17 ligands. J Immunol. 153, 1141-1149.

Manici S, Sturniolo T, Imro MA, Hammer J, Sinigaglia F, Noppen C, Spagnoli G, Mazzi B, Bellone M, Dellabona P, Protti MP (1999). Melanoma cells present a MAGE-3 epitope to CD4(+) cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen ^dR11. J Exp. Med 189, 871-876.

Margolis RK, Rauch U, Maurel P, Margolis r U (1996). Neurocan and phosphacan: two major nervous tissuespecific chondroitin sulfate proteoglycans. Perspect. Dev. Neurobiol. 3, 273-290.

Mark AS, Mangkornkanok M (1989). B-cell lymphoma marking only with anti-epithelial membrane antigen. Cancer 63, 2152-2155.

Marzo AL, Kinnear BF, Lake RA, Frelinger JJ, Collins EJ, Robinson BW, Scott B (2000). Tumor-specific CD4+ T cells have a major "post-licensing" role in CTL mediated anti-tumor immunity. J Immunol. 165, 6047-6055.

Maulik G, Kijima T, Ma PC, Ghosh SK, Lin J, Shapiro GI, Schaefer E, Tibaldi E, Johnson BE, Salgia R (2002). Modulation of the c-Met/hepatocyte growth factor pathway in small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 8, 620-627. Mayer A, Takimoto M, Fritz E, Schellander G, Kofler K, Ludwig H (1993). The prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen, epidermal growth factor receptor, and mdr gene expression in colorectal cancer. Cancer 71, 2454-2460.

McKeon RJ, Jurynec MJ, Buck CR (1999). The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci. 19, 10778-10788.

Mellai M, Caldera V, Patrucco A, Annovazzi L, Schiffer D (2008). Survivin expression in glioblastomas correlates with proliferation, but not with apoptosis. Anticancer Res. 28, 109-118.

Meyer-Puttlitz B, Junker E, Margolis RU, Margolis RK (1996). Chondroitin sulfate proteoglycans in the developing central nervous system. II. Immunocytochemical localization of neurocan and phosphacan. J Comp Neurol. 366, 44-54.

Miyazaki K, Hattori Y, Umenishi F, Yasumitsu H, Umeda M (1990). Purification and characterization of extracellular matrix-degrading metalloproteinase, matrin (pump-1), secreted from human rectal carcinoma cell line. Cancer Res. 50, 7758-7764.

Mizuno K, Higuchi O, Ihle JN, Nakamura T (1993). Hepatocyte growth factor stimulates growth of hematopoietic progenitor cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 194, 178-186.

Molenkamp BG, Vuylsteke RJ, van Leeuwen PA, Meijer S, Vos W, Wijnands PG, Scheper RJ, de Gruijl TD (2005) . Matched skin and sentinel lymph node samples of melanoma patients reveal exclusive migration of mature dendritic cells. Am. J Pathol. 167, 1301-1307.

Monajemi H, Fontijn RD, Pannekoek H, Horrevoets AJ (2002). The apolipoprotein L gene cluster has emerged recently in evolution and is expressed in human vascular tissue. Genomics 79, 539-546.

Montesano R, Soriano JV, Malinda KM, Ponce ML, Bafico A, Kleinman HK, Bottaro DP, Aaronson SA (1998). Differential effects of hepatocyte growth factor isoforms on epithelial and endothelial tubulogenesis. Cell Growth Differ. 9, 355-365.

Morgan RA, Dudley ME, Wunderlich JR, Hughes MS, Yang JC, Sherry RM, Royal RE, Topalian SL, Kammula US, Restifo NP, zheng Z, Nahvi A, de Vries CR, Rogers-Freezer LJ, Mavroukakis SA, Rosenberg SA (2006). Cancer Regression in Patients After Transfer of Genetically Engineered Lymphocytes. Science.

Morgenstern DA, Asher RA, Fawcett JW (2002). Chondroitin sulphate proteoglycans in the CNS injury response. Prog. Brain Res. 137, 313-332.

Mori M, Barnard GF, Mimori K, Ueo H, Akiyoshi T, Sugimachi K (1995). Overexpression of matrix metalloproteinase-7 mRNA in human colon carcinomas. Cancer 75, 1516-1519.

Mortara L, Castellani P, Meazza R, Tosi G, De Lerma BA, Procopio FA, Comes A, Zardi L, Ferrini S, Accolla RS (2006) . CIITA-induced MHC class II expression in mammary adenocarcinoma leads to a Th1 polarization of the tumor microenvironment, tumor rejection, and specific antitumor memory. Clin Cancer Res. 12, 3435-3443.

Mott JD, Werb Z (2004). Regulation of matrix biology by matrix metalloproteinases. Curr. Opin. Cell Biol 16, 558 564.

Nakamura T, Tabuchi Y, Nakae S, Ohno M, Saitoh Y (1996). Serum carcinoembryonic antigen levels and proliferating cell nuclear antigen labeling index for patients with colorectal carcinoma. Correlation with tumor progression and survival. Cancer 77, 1741-1746.

Naldini L, Vigna E, Narsimhan RP, Gaudino G, Zarnegar R, Michalopoulos GK, Comoglio PM (1991). Hepatocyte growth factor (HGF) stimulates the tyrosine kinase activity of the receptor encoded by the proto-oncogene c-MEt . Oncogene 6, 501-504.

Napolitano M, Keime-Guibert F, Monjour A, Lafitte C, Ameri A, Cornu P, Broet P, Delattre JY (1999). Treatment of supratentorial glioblastoma multiforme with radiotherapy and a combination of BCNU and tamoxifen: a phase II study. J Neurooncol. 45, 229-235.

Nieder C, Grosu AL, Molls M (2000). A comparison of treatment results for recurrent malignant gliomas. Cancer Treat. Rev. 26, 397-409.

Noto H, Takahashi T, Makiguchi Y, Hayashi T, Hinoda Y, Imai K (1997). Cytotoxic T lymphocytes derived from bone marrow mononuclear cells of multiple myeloma patients recognize an underglycosylated form of MUC1 mucin. Int. Immunol. 9, 791-798.

Novellino L, Castelli C, Parmiani G (2005). A listing of human tumor antigens recognized by T cells: March 2004 update. Cancer Immunol. Immunother. 54, 187-207.

O'Driscoll L, Linehan R, Clynes M (2003). Survivin: role in normal cells and in pathological conditions. Curr. Cancer Drug Targets. 3, 131-152.

Ohara O, Nagase T, Ishikawa K, Nakajima D, Ohira M, Seki N, Nomura N (1997). Construction and characterization of human brain cDNA libraries suitable for analysis of cDNA clones encoding relatively large proteins. DNA Res. 4, 53-59.

Oka Y, Tsuboi A, Taguchi T, Osaki T, Kyo T, Nakajima H, Elisseeva OA, Oji Y, Kawakami M, Ikegame K, Hosen N, Yoshihara S, Wu F, Fujiki F, Murakami M, Masuda T, Nishida S, Shirakata T, Nakatsuka S, Sasaki A, Udaka K, Dohy H, Aozasa K, Noguchi S, Kawase I, Sugiyama H (2004). Induction of WT1 (Wilms' tumor gene)-specific cytotoxic T lymphocytes by WT1 peptide vaccine and the resultant cancer regression. Proc Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 13885-13890.

Penna A, Fowler P, Bertoletti A, Guilhot S, Moss B, Margolskee RF, Cavalli A, Valli A, Fiaccadori F, Chisari FV, . (1992). Hepatitis B virus (HBV)-specific cytotoxic T-cell (CTL) response in humans: characterization of HLA class II-restricted CTLs that recognize endogenously synthesized HBV envelope antigens. J Virol. 66, 1193-1198. Piesche M, Hildebrandt Y, Zettl F, Chapuy B, Schmitz M, Wulf G, Trumper L, Schroers R (2007). Identification of a promiscuous HLA DR-restricted T-cell epitope derived from the inhibitor of apoptosis protein survivin. Hum. Immunol. 68, 572-576.

Pons E, Uphoff CC, Drexler HG (1998). Expression of hepatocyte growth factor and its receptor c-met in human leukemia-lymphoma cell lines. Leuk. Res. 22, 797-804.

Ponzetto C, Bardelli A, Maina F, Longati P, Panayotou G, Dhand R, Waterfield MD, Comoglio PM (1993). A novel recognition motif for phosphatidylinositol 3-kinase binding mediates its association with the hepatocyte growth factor/scatter factor receptor. Mol. Cell Biol. 13, 4600-4608.

Prados MD, Levin V (2000). Biology and treatment of malignant glioma. Semin. Oncol 27, 1-10.

Previsani N, Lavanchy D (2002). Hepatitis B. World Health Organization Department of Communicable Diseases Surveillance and Response. 2002 WHO/CDS/CSR/LYO/2002. 2:Hepatitis B.

Qian CN, Guo X, Cao B, Kort EJ, Lee CC, Chen J, Wang LM, Mai WY, Min HQ, Hong MH, Vande Woude GF, Resau JH, Teh BT (2002). Met protein expression level correlates with survival in patients with late-stage nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res. 62, 589-596.

Qin Z, Blankenstein T (2000). CD4+ T cell-mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 12, 677-686.

Qin Z, Schwartzkopff J, Pradera F, Kammertoens T, Seliger B, Pircher H, Blankenstein T (2003). A critical requirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumor rejection by CD8+ T cells. Cancer Res. 63, 4095-4100.

Quantin B, Murphy G, Breathnach R (1989). Pump-1 cDNA codes for a protein with characteristics similar to those of classical collagenase family members. Biochemistry 28, 5327-5334.

Rae FK, Stephenson SA, Nicol DL, Clements JA (2000). Novel association of a diverse range of genes with renal cell carcinoma as identified by differential display. Int. J. Cancer 88, 726-732.

Ramirez R, Hsu D, Patel A, Fenton C, Dinauer C, Tuttle RM, Francis GL (2000). Over-expression of hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) and the HGF/SF receptor (cMET) are associated with a high risk of metastasis and recurrence for children and young adults with papillary thyroid carcinoma. Clin Endocrinol. (Oxf) 53, 635-644.

Rammensee HG, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S (1999). SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics 50, 213-219.

Rammensee,H.G., Bachmann,J., and Stevanovic,S. (1997). MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany).

Rammensee HG, Friede T, Stevanoviic S (1995). MHC ligands and peptide motifs: first listing. Immunogenetics 41, 178-228.

Rauch U, Feng K, Zhou XH (2001). Neurocan: a brain chondroitin sulfate proteoglycan. Cell Mol. Life Sci. 58, 1842-1856.

Rehermann B, Nascimbeni M (2005). Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection. Nat. Rev. Immunol. 5, 215-229.

Retzler C, Gohring W, Rauch U (1996). Analysis of neurocan structures interacting with the neural cell adhesion molecule N-CAM. J Biol. Chem. 271, 27304-27310.

Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM, Chang AE, Avis FP, Leitman S, Linehan WM, Robertson CN, Lee RE, Rubin JT, . (1987). A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interleukin-2 or high-dose interleukin-2 alone. N. Engl. J. Med. 316, 889-897.

Rosenberg SA, Packard BS, Aebersold PM, Solomon D, Topalian SL, Toy ST, Simon P, Lotze MT, Yang JC, Seipp CA, . (1988). Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma. A preliminary report. N. Engl. J Med 319, 1676-1680.

Roth W, Weller M (1999). Chemotherapy and immunotherapy of malignant glioma: molecular mechanisms and clinical perspectives. Cell Mol. Life Sci. 56, 481-506.

Rubin JS, Bottaro DP, Aaronson SA (1993). Hepatocyte growth factor/scatter factor and its receptor, the c-met proto-oncogene product. Biochim. Biophys. Acta 1155, 357-371.

Ruiz M, Kobayashi H, Lasarte JJ, Prieto J, Borras-Cuesta F, Celis E, Sarobe P (2004). Identification and characterization of a T-helper peptide from carcinoembryonic antigen. Clin Cancer Res. 10, 2860-2867.

Sablotzki A, Ebel H, Muhling J, Dehne MG, Nopens H, Giesselmann H, Hempelmann G (2000). Dysregulation of immune response following neurosurgical operations. Acta Anaesthesiol. Scand. 44, 82-87.

Sadler E, Klausegger A, Muss W, Deinsberger U, Pohla-Gubo G, Laimer M, Lanschuetzer C, Bauer JW, Hintner H (2006). Novel KIND1 gene mutation in Kindler syndrome with severe gastrointestinal tract involvement. Arch. Dermatol. 142, 1619-1624.

Saha S, Bardelli A, Buckhaults P, Velculescu VE, Rago C, St CB, Romans KE, Choti MA, Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B (2001). A phosphatase associated with metastasis of colorectal cancer. Science 294, 1343 1346.

Saino M, Maruyama T, Sekiya T, Kayama T, Murakami Y (2004). Inhibition of angiogenesis in human glioma cell lines by antisense RNA from the soluble guanylate cyclase genes, GUCY1A3 and GUCY1B3. Oncol. Rep. 12, 47 52.

Saito T, Arifin MT, Hama S, Kajiwara Y, Sugiyama K, Yamasaki F, Hidaka T, Arita K, Kurisu K (2007). Survivin subcellular localization in high-grade astrocytomas: simultaneous expression in both nucleus and cytoplasm is negative prognostic marker. J Neurooncol. 82, 193-198.

Sakaguchi A, Kikuchi A (2004). Functional compatibility between isoform alpha and beta of type II DNA topoisomerase. J Cell Sci. 117, 1047-1054.

Sasaki T, Lopes MB, Hankins GR, Helm GA (2002). Expression of survivin, an inhibitor of apoptosis protein, in tumors of the nervous system. Acta Neuropathol. 104, 105-109.

Sato F, Abraham JM, Yin J, Kan T, Ito T, Mori Y, Hamilton JP, Jin Z, Cheng Y, Paun B, Berki AT, Wang S, Shimada Y, Meltzer SJ (2006). Polo-like kinase and survivin are esophageal tumor-specific promoters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 465-471.

Schmidt C, Bladt F, Goedecke S, Brinkmann V, Zschiesche W, Sharpe M, Gherardi E, Birchmeier C (1995). Scatter factor/hepatocyte growth factor is essential for liver development. Nature 373, 699-702.

Schmitz M, Diestelkoetter P, Weigle B, Schmachtenberg F, Stevanovic S, Ockert D, Rammensee HG, Rieber EP (2000). Generation of survivin-specific CD8+ T effector cells by dendritic cells pulsed with protein or selected peptides. Cancer Res. 60, 4845-4849.

Schoenberger SP, Toes RE, van d, V, Offringa R, Melief CJ (1998). T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by CD40-CD40L interactions. Nature 393, 480-483.

Schubert U, Anton LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, Bennink JR (2000). Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes. Nature 404, 770-774.

Shedlock DJ, Shen H (2003). Requirement for CD4 T cell help in generating functional CD8 T cell memory. Science 300, 337-339.

Siddiqui J, Abe M, Hayes D, Shani E, Yunis E, Kufe D (1988). Isolation and Sequencing of a cDNA Coding for the Human DF3 Breast Carcinoma-Associated Antigen. PNAS 85, 2320-2323.

Singh-Jasuja H, Emmerich NP, Rammensee HG (2004). The Tubingen approach: identification, selection, and validation of tumor-associated HLA peptides for cancer therapy. Cancer Immunol. Immunother. 53, 187-195. Smith GM, Strunz C (2005). Growth factor and cytokine regulation of chondroitin sulfate proteoglycans by astrocytes. Glia 52, 209-218.

Span PN, Sweep FC, Wiegerinck ET, Tjan-Heijnen VC, Manders P, Beex LV, de Kok JB (2004). Survivin is an independent prognostic marker for risk stratification of breast cancer patients. Clin Chem. 50, 1986-1993.

Sun JC, Bevan MJ (2003). Defective CD8 T cell memory following acute infection without CD4 T cell help. Science 300, 339-342.

Takahashi T, Makiguchi Y, Hinoda Y, Kakiuchi H, Nakagawa N, Imai K, Yachi A (1994). Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153, 2102-2109.

Takayama H, Larochelle WJ, Sharp R, Otsuka T, Kriebel P, Anver M, Aaronson SA, Merlino G (1997). Diverse tumorigenesis associated with aberrant development in mice overexpressing hepatocyte growth factor/scatter factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94, 701-706.

Takayama H, LaRochelle WJ, Anver M, Bockman DE, Merlino G (1996). Scatter factor/hepatocyte growth factor as a regulator of skeletal muscle and neural crest development. PNAS 93, 5866-5871.

Tan HY, Liu J, Wu SM, Luo HS (2005). Expression of a novel apoptosis inhibitor-survivin in colorectal carcinoma. World J Gastroenterol. 11, 4689-4692.

Ten KM, van der Wal JB, Sluiter W, Hofland LJ, Jeekel J, Sonneveld P, van Eijck CH (2006). The role of superoxide anions in the development of distant tumour recurrence. Br. J Cancer.

Teofili L, Di Febo AL, Pierconti F, Maggiano N, Bendandi M, Rutella S, Cingolani A, Di RN, Musto P, Pileri S, Leone G, Larocca LM (2001). Expression of the c-met proto-oncogene and its ligand, hepatocyte growth factor, in Hodgkin disease. Blood 97, 1063-1069.

Tompkins SM, Rota PA, Moore JC, Jensen PE (1993). A europium fluoroimmunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins. J Immunol. Methods 163, 209-216.

Tripathi A, Dasgupta S, Roy A, Sengupta A, Roy B, Roychowdhury S, Panda CK (2003). Sequential deletions in both arms of chromosome 9 are associated with the development of head and neck squamous cell carcinoma in Indian patients. J. Exp. Clin. Cancer Res. 22, 289-297.

Troussard X, vet-Loiseau H, Macro M, Mellerin MP, Malet M, Roussel M, Sola B (2000). Cyclin D1 expression in patients with multiple myeloma. Hematol. J. 1, 181-185.

Tuck AB, Park M, Sterns EE, Boag A, Elliott BE (1996). Coexpression of hepatocyte growth factor and receptor (Met) in human breast carcinoma. Am. J. Pathol. 148, 225-232.

Uehara Y, Minowa O, Mori C, Shiota K, Kuno J, Noda T, Kitamura N (1995). Placental defect and embryonic lethality in mice lacking hepatocyte growth factor/scatter factor. Nature 373, 702-705.

Uematsu M, Ohsawa I, Aokage T, Nishimaki K, Matsumoto K, Takahashi H, Asoh S, Teramoto A, Ohta S (2005). Prognostic significance of the immunohistochemical index of survivin in glioma: a comparative study with the MIB-1 index. J Neurooncol. 72, 231-238.

van der Bruggen P, Traversari C, Chomez P, Lurquin C, De PE, Van den EB, Knuth A, Boon T (1991). A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 254, 1643-1647. van d, V, Taher TE, Keehnen RM, Smit L, Groenink M, Pals ST (1997). Paracrine regulation of germinal center B cell adhesion through the c-met-hepatocyte growth factor/scatter factor pathway. J. Exp. Med. 185, 2121-2131. Vasef MA, Brynes RK, Sturm M, Bromley C, Robinson RA (1999). Expression of cyclin D1 in parathyroid carcinomas, adenomas, and hyperplasias: a paraffin immunohistochemical study. Mod. Pathol. 12, 412-416. Vigneron N, Stroobant V, Chapiro J, Ooms A, Degiovanni G, Morel S, van der BP, Boon T, Van Den Eynde BJ (2004). An antigenic peptide produced by peptide splicing in the proteasome. Science 304, 587-590.

Vogt A^b, Kropshofer H, Kalbacher H, Kalbus M, Rammensee HG, Coligan JE, Martin R (1994). Ligand motifs of HLA-DRB5*0101 and DRB1*1501 molecules delineated from self-peptides. J Immunol. 153, 1665-1673.

Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S (2003). Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J. Immunol. 171, 4974-4978.

Wang FQ, So J, Reierstad S, Fishman DA (2005). Matrilysin (MMP-7) promotes invasion of ovarian cancer cells by activation of progelatinase. Int. J Cancer 114, 19-31.

Wang JC, Livingstone AM (2003). Cutting edge: CD4+ T cell help can be essential for primary CD8+ T cell responses in vivo. J Immunol. 171, 6339-6343.

Wang R, Ferrell LD, Faouzi S, Maher JJ, Bishop JM (2001). Activation of the Met receptor by cell attachment induces and sustains hepatocellular carcinomas in transgenic mice. J. Cell Biol. 153, 1023-1034.

Weber RG, Rieger J, Naumann U, Lichter P, Weller M (2001). Chromosomal imbalances associated with response to chemotherapy and cytotoxic cytokines in human malignant glioma cell lines. Int. J. Cancer 91, 213 218.

Weinschenk T, Gouttefangeas C, Schirle M, Obermayr F, Walter S, Schoor O, Kurek R, Loeser W, Bichler KH, Wernet D, Stevanovic S, Rammensee HG (2002). Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62, 5818-5827.

Weinstein EJ, Bourner M, Head R, Zakeri H, Bauer C, Mazzarella R (2003). URP1: a member of a novel family of PH and FERM domain-containing membrane-associated proteins is significantly over-expressed in lung and colon carcinomas. Biochim. Biophys. Acta 1637, 207-216.

Wierecky J, Muller MR, Horger MS, Brugger W, Kanz L, Brossart P (2005). Induction of clinical and immunological responses in patients with metastatic renal cell carcinoma after vaccinations with peptide pulsed dendritic cells. J Clin Oncol (Meeting Abstracts) 23, 2507.

Xie D, Zeng YX, Wang HJ, Wen JM, Tao Y, Sham JS, Guan XY (2006). Expression of cytoplasmic and nuclear Survivin in primary and secondary human glioblastoma. Br. J Cancer 94, 108-114.

Xiong Y, Connolly T, Futcher B, Beach D (1991). Human D-type cyclin. Cell 65, 691-699.

Yamashita S, Masuda Y, Kurizaki T, Haga Y, Murayama T, Ikei S, Kamei M, Takeno S, Kawahara K (2007). Survivin expression predicts early recurrence in early-stage breast cancer. Anticancer Res. 27, 2803-2808.

Yee C, Thompson JA, Byrd D, Riddell SR, Roche P, Celis E, Greenberg PD (2002). Adoptive T cell therapy using antigen-specific CD8+ T cell clones for the treatment of patients with metastatic melanoma: in vivo persistence, migration, and antitumor effect of transferred T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 16168-16173.

Young AN, Amin MB, Moreno CS, Lim SD, Cohen C, Petros JA, Marshall FF, Neish AS (2001). Expression profiling of renal epithelial neoplasms: a method for tumor classification and discovery of diagnostic molecular markers. Am. J. Pathol. 158, 1639-1651.

Zacharias U, Rauch U (2006). Competition and cooperation between tenascin-R, lecticans and contactin 1 regulate neurite growth and morphology. J Cell Sci. 119, 3456-3466.

Zaremba S, Barzaga E, Zhu M, Soares N, Tsang KY, Schlom J (1997). Identification of an enhancer agonist cytotoxic T lymphocyte peptide from human carcinoembryonic antigen. Cancer Res. 57, 4570-4577.

Zarnegar R, Michalopoulos GK (1995). The many faces of hepatocyte growth factor: from hepatopoiesis to hematopoiesis. J. Cell Biol. 129, 1177-1180.

Zeh HJ, III, Perry-Lalley D, Dudley ME, Rosenberg SA, Yang JC (1999). High avidity CTLs for two self-antigens demonstrate superior in vitro and in vivo antitumor efficacy. J Immunol. 162, 989-994.

Zhang B, Liu XX, Zhang Y, Jiang CY, Hu HY, Gong L, Liu M, Teng QS (2006). Polyamine depletion by ODC-AdoMetDC antisense adenovirus impairs human colorectal cancer growth and invasion in vitro and in vivo. J Gene Med 8, 980-989.

Zhen HN, Zhang X, Hu PZ, Yang TT, Fei Z, Zhang JN, Fu LA, He XS, Ma FC, Wang XL (2005). Survivin expression and its relation with proliferation, apoptosis, and angiogenesis in brain gliomas. Cancer 104, 2775 2783.

Zhou YT, Guy GR, Low BC (2005). BNIP-2 induces cell elongation and membrane protrusions by interacting with Cdc42 via a unique Cdc42-binding motif within its BNIP-2 and Cdc42GAP homology domain. Exp. Cell Res. 303, 263-274.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Peptido consistente en la SEQ ID N.° 3.

2. Peptido acorde con la reivindicación 1, en que dicho peptido es capaz de estimular linfocitos T CD4.

3. Peptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 que esta fusionado con los aminoacidos N-terminales de la cadena invariable (li) asociada al antigeno HLA-DR.

4. Acido nucleico, que codifica un peptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un vector de expresion que expresa dicho acido nucleico.

5. Peptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el acido nucleico o el vector de expresion acorde con la reivindicación 4 para el uso en medicina.

6. Celula hospedadora que comprende el acido nucleico o el vector de expresion acordes con la reivindicación 4, siendo dicha celula hospedadora preferiblemente una celula presentadora de antigeno, en particular una celula dendntica.

7. Método para producir un peptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo el metodo el cultivo de la celula hospedadora acorde con la reivindicación 6 que expresa el acido nucleico o el vector de expresion acordes con la reivindicación 4, y el aislamiento del peptido a partir de la celula hospedadora o de su medio de cultivo.

8. El peptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el acido nucleico o el vector de expresion acorde con la reivindicación 4, o la celula acorde con la reivindicación 6 para el uso como medicamento en el tratamiento del cancer, en que dicho medicamento es preferiblemente una vacuna.

9. Peptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el acido nucleico o el vector de expresion acorde con la reivindicación 4, o la celula acorde con la reivindicación 6 para el uso de acuerdo con la reivindicación 8 , en que dicho cancer se selecciona entre: astrocitoma, astrocitoma pilodtico, tumor neuroepitelial disembrioplasico, oligodendrogliomas, ependimoma, glioblastoma multiforme, gliomas mixtos, oligoastrocitomas, meduloblastoma, retinoblastoma, neuroblastoma, germinoma, teratoma, gangliogliomas, gangliocitoma, gangliocitoma central, tumores neuroectodermicos primitivos (PNET, p. ej. meduloblastoma, meduloepitelioma, neuroblastoma, retinoblastoma, ependimoblastoma), tumores del parenquima pineal (p. ej. pineocitoma, pineoblastoma), tumores de celulas ependimales, tumores de los plexos coroideos, tumores neuroepiteliales de origen incierto (p. ej. gliomatosis cerebral, astroblastoma), glioblastoma, tumor de prostata, cancer de mama, cancer de esofago, cancer de colon, cancer colorrectal, carcinoma de celulas renales, carcinoma renal de celulas claras, cancer de pulmon, SNC, cancer de ovario, melanoma, cancer de pancreas, carcinoma epidermoide, leucemia y meduloblastoma, y otros tumores o canceres que presenten una sobreexpresion de survivina.

10. Peptido para el uso acorde con la reivindicación 8 o 9, en combinacion con al menos un peptido seleccionado del grupo consistente en los peptidos acordes con las SEQ ID N.° 4 a 13 y 24 en el tratamiento del cancer renal, o para el uso en combinacion con al menos un peptido seleccionado del grupo consistente en los peptidos acordes con las SEQ ID N.° 4, 8, 11, 12 y 15 a 24 en el tratamiento del cancer de colon.

11. Un equipo que comprende:

(a) un envase que contiene una composicion farmaceutica que contiene un peptido acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el acido nucleico o el vector de expresion acorde con la reivindicación 4, o una celula acorde con la reivindicación 6, en solucion o en forma liofilizada;

(b) opcionalmente, un segundo envase que contiene un diluyente o solucion de reconstitucion para la formulacion liofilizada;

(c) opcionalmente, al menos un peptido seleccionado del grupo consistente en los peptidos conformes a las SEQ ID N.° 4 a 24; y

(d) opcionalmente, instrucciones de uso de la solucion y/o la reconstitucion y/o uso de la formulacion liofilizada.

12. Anticuerpo que es espedfico contra un peptido acorde con la SEQ ID N.° 3 cuando forma un complejo con una molecula de ^hL^apertinente, siendo dicho anticuerpo preferiblemente un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal y/o un anticuerpo quimerico.