KR20200067862A - 종양-관련된 항원 에피토프의 미생물 서열 변이체 - Google Patents

종양-관련된 항원 에피토프의 미생물 서열 변이체 Download PDF

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프란체스코 스트로지
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알레산드라 체르비노
셀리아 멘데즈
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엔터롬 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 암 면역 요법, 특히 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 서열 변이체에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체를 식별하는 방법을 제공한다. 이러한 미생물 서열 변이체는 자기 항원과 상이하여 강한 면역 반응을 유도할 수 있기 때문에 항암 약제의 제조에서 유용하다. 따라서, 미생물 서열 변이체를 포함하는 약제, 상기 약제의 제조 방법 및 상기 약제의 용도가 제공된다.

Description

종양-관련된 항원 에피토프의 미생물 서열 변이체
본 발명은 암 면역 요법 분야, 특히 인간 미생물 유전체(microbiome)에서 인간 종양-관련된 항원의 에피토프의 박테리아 서열 변이체를 식별하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인간 미생물 유전체의 박테리아 서열 변이체를 포함하는 백신을 제공하는 방법, 및 상기 백신에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 백신에 의해 인간 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
암은 전세계에서 사망의 주된 원인 중 하나이다. 세계 보건 기구에 따르면, 2012년에만, 1400만건의 신규 사례 및 820만건의 암-관련된 사망이 전세계에 보고되었고, 신규 암 사례의 수가 향후 20년 이내에 약 70%만큼 상승할 것으로 예상된다. 지금까지, 전세계 연간 총 신규 사례 중 60% 초과가 아프리카, 아시아, 중미 및 남미에서 발생한다. 이들 지역은 또한 전세계 암 사망의 70%를 차지한다. 남성에서, 5개의 가장 흔한 암의 발생 부위는 폐, 전립선, 대장, 위 및 간인 반면에, 여성에서는 유방, 대장, 폐, 자궁경부 및 위이다.
암은 오랫동안, 수술, 방사선 요법, 세포 독성 화학 요법 및 내분비 조작에 의해 관리되어 왔고, 이는 전형적으로 질병을 가장 잘 통제하기 위해 순차적으로 조합된다. 그러나, 이들 표준 요법의 정확한 효능에 대한 주요 제한은, 치료에 의해 발생한 정상 조직의 부수적 손상을 야기하는 부정확한 특이성, 낮은 치유율 및 내재 약물 내성이다.
지난 몇 년 동안, 특히 종양 및 정상 세포의 발현 프로파일링의 큰 발전으로 인해 암 요법의 발달에서 큰 증가가 있었고, 면역 요법 또는 분자 표적화된 요법의 최근 연구 및 제1 임상 결과는 상기 질병에 대한 인식을 바꾸기 시작했다.
유망한 항암 면역 요법은 이제 현실이 되었고, 숙주 면역계가 종양 항원을 인식할 수 있다는 증거는 항암 약물의 개발을 야기하였고, 이는 규제 기관, 예컨대 미국 식약처(FDA) 및 유럽 의약품청(EMA)에 의해 현재 승인되어 있다. 다양한 치료 접근법은 특히 생체외 확장된 종양 침윤성 림프구의 입양 전달, 암 세포 백신, 면역 자극성 시토카인 및 이의 변이체, 패턴 인식 수용체(PRR) 작용제, 및 종양 항원 또는 면역 체크포인트를 표적화하는 면역 중재 단클론 항체를 포함한다(문헌[Galuzzi L. et al., Classification of current anticancer immunotherapies. Oncotarget. 2014 Dec 30;5(24):12472-508]).
불행히도, 상당한 비율의 환자가 일부 이들 면역 요법에 대한 내재 내성을 나타낼 수 있거나 심지어 치료 과정 동안 내성을 획득할 수 있다. 예를 들어, 3-년 생존율이 절제 불가능하거나 전이성인 흑색종에서 항-CTLA-4 항체인 이필루무맙(Ipilumumab)의 사용시 약 20%인 것으로 보고된 반면에(문헌[Snyder et al., Genetic basis for clinical response to CTLA-4 blockade in melanoma. N Engl J Med. 2014 Dec 4;371(23):2189-2199]; [SSchadendorf D et al.. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data from Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 2015 Jun 10;33(17):1889-94]), PD1을 표적화하는 또 다른 체크포인트 억제제인 니볼루맙(Nivolumab)을 사용한 경우 3-년 생존율은 신장 세포 암종(RCC)에서 44%이고 NSCLC에서 18%인 것으로 보고되었다(문헌[McDermottet al., Survival, Durable Response, and Long-Term Safety in Patients With Previously Treated Advanced Renal Cell Carcinoma Receiving Nivolumab. J Clin Oncol. 2015 Jun 20;33(18):2013-20]; [Gettinger et al., Overall Survival and Long-Term Safety of Nivolumab (Anti-Programmed Death 1 Antibody, BMS-936558, ONO-4538) in Patients With Previously Treated Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer. J Clin Oncol. 2015 Jun 20;33(18):2004-12]).
따라서, 근본적인 약물 내성은 이들 면역 요법의 효능에 대한 고정된 장애물에 해당한다. 따라서, 암 치료에 대한 상이한 접근법이 이러한 장애물을 파괴하기 위해 필요하다.
이들 면역 요법으로 치료받는 다수의 개체에서 반응의 부재는 불충분한 항종양 면역 반응(APC에 의한 항원 제시 또는 T 세포에 의한 항원 인식의 부족)과 연관될 수 있다. 달리 말하면, 면역 요법에 대한 양성 반응은 인간 암 세포에 의해 발현되는 MHC 클래스 I-제한된 항원을 인식할 수 있는 특이적 림프구 서브세트를 발달시키는 면역계의 능력과 관련된다(문헌[Kvistborget al., Human cancer regression antigens. Curr Opin Immunol. 2013 Apr;25(2):284-90]).
이러한 가설은, 종양 침윤성 림프구의 입양 전달에 대한 반응이 환자에게 주입된 CD8+ T 세포와 직접 관련된다는 것을 입증하는 데이터에 의해 강하게 지지된다(문헌[Besser et al., Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in patients with metastatic melanoma: intent-to-treat analysis and efficacy after failure to prior immunotherapies. Clin Cancer Res. 2013 Sep 1;19(17):4792-800]).
따라서, 강한 항종양 반응은 면역 반응성 펩티드의 제시, 및 이들 항원을 인식하도록 "훈련된" 충분한 수의 반응성 세포의 존재에 좌우될 것이다.
종양 항원-기반 백신 접종은, 환자 자신의 면역계가 종양을 특이적이고 오래가는 방식으로 인식하고 공격하고 파괴하는 것을 요청할 수 있기 때문에, 상당한 관심을 얻고 있는 암 요법에 대한 독특한 접근법에 해당한다. 종양 세포는 면역계에 의해 인식되기 쉬운 다수의 펩티드 항원을 발현하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 이러한 항원을 기반으로 하는 백신은, 종양 항원의 낮은 독성 및 저분자량에 기인하여, 환자의 전체 생존율을 개선할 뿐만 아니라 면역 반응의 모니터링 및 GMP-등급 제품의 제조를 위한 좋은 기회를 제공한다. 종양 항원의 예는 특히 정상적 사일런트 유전자 또는 과발현된 유전자로부터 또는 종양 바이러스에 의해 발현된 단백질로부터 전사된 단백질의 부산물(문헌[Kvistborg et al., Curr Opin Immunol. 2013 Apr;25(2):284-90]), 및 세포 단백질의 점 돌연변이로부터 야기된 신생항원을 포함한다. 후자는, CTLA4 억제제로 치료받은 환자의 증가된 전체 생존율과 직접 연관된 것으로 나타났기 때문에 특히 관심의 대상이다(문헌[Snyder et al., Genetic basis for clinical response to CTLA-4 blockade in melanoma. N Engl J Med. 2014 Dec 4;371(23):2189-2199]; [Brown et al., Neo-antigens predicted by tumor genome meta-analysis correlate with increased patient survival. Genome Res. 2014 May; 24(5):743-50]).
그러나, 대부분의 종양-연관된 항원(TAA) 및 종양-특이적 항원(TSA)은 (기존) 인간 단백질이고, 따라서 자기 항원으로 간주된다. 흉선 선택 과정 동안, 충분한 친화도에 의해 펩티드/자기 MHC 복합체를 인식하는 T 세포는 클론성으로 고갈된다. 자가면역 질병에 대한 보호를 제공함으로써, T 세포 레퍼토리 선택의 이러한 메커니즘은 또한 종양-연관된 항원(TAA) 및 종양-특이적 항원(TSA)에 대한 면역력 발달의 가능성을 감소시킨다. 이는, 암-반응성 TCR이 일반적으로 약한 친화도의 것이라는 사실에 의해 예시된다. 또한, 현재까지, MHC에 대한 높은 결합 친화도에 의해 선택된 종양-연관된 항원(TAA) 및 종양-특이적 항원(TSA)을 사용하여 수행된 대부분의 백신 시험은 아마 흉선 선택의 결과를 반영하는 강한 면역력을 유도하는 것을 나타내지 않았다.
따라서, 암 백신이 개발될 수 있는 인간 종양 항원은 제한된다. 또한, 돌연변이되거나 변형된 자기 단백질로부터 유래된 항원은 면역 관용 및/또는 바람직하지 않은 자가면역 부작용을 유발할 수 있다.
따라서, 당분야에서 직면하는 한계, 특히 현재 이용가능한 면역 요법에 대한 내성을 극복할 수 있는 대안적인 암 치료법을 찾는 것이 당분야에서 필요하다.
상기의 관점에서, 본 발명의 목적은, 상기에 개괄된 현재의 암 면역 요법의 단점을 극복하고, 인간 종양-관련된 항원의 에피토프의 서열 변이체를 식별하는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 종양-관련된 항원 에피토프의 서열 변이체의 공급원인 인간 미생물 유전체에서 박테리아 단백질을 식별하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 특정 MHC 분자에 의해 제시될 수 있는 이들 박테리아 단백질로부터 펩티드를 식별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적은 하기 및 첨부된 특허청구범위에 제시된 내용에 의해 달성된다.
본 발명은 하기에 상세히 기재되나, 본 발명은, 변할 수 있는, 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 본 발명의 범위를 제한하지 않고, 이는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한될 것임이 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 과학 및 기술 용어는 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.
하기에서, 본 발명의 요소가 기재될 것이다. 이들 요소는 구체적 실시양태와 함께 열거되나, 임의의 방법으로 임의의 수로 조합되어 추가적 실시양태를 생성할 수 있음이 이해되어야 한다. 다양하게 기재된 예 및 바람직한 실시양태는 본 발명을 단지 명확히 기재된 실시양태에만 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이러한 설명은 기재는 명확히 기재된 실시양태를 임의의 수의 개시되고/되거나 바람직한 요소와 조합하는 실시양태를 지지하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원의 모든 기재된 요소의 임의의 치환 및 조합은 문맥상 달리 나타내지 않는 한 본원의 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.
본원 및 특허청구범위에 걸쳐, 문맥상 달리 필요하지 않는 한, 용어 "포함하다" 및 이의 변형, 예컨대 "포함함"은, 임의의 다른 언급되지 않은 구성원, 정수 또는 단계의 배제가 아닌 언급된 구성원, 정수 또는 단계의 포함을 시사하는 것으로 이해될 것이다. 용어 "~로 이루어지다"는 용어 "포함하다"의 특정 실시양태로서, 여기에 임의의 다른 언급되지 않은 구성원, 정수 또는 단계는 배제된다. 본 발명에 있어서, 용어 "포함하다"는 용어 "~로 이루어지다"를 포괄한다. 따라서, 용어 "포함함"은 "비롯함" 및 "이루어짐"을 포괄하고, 예를 들어 X를 "포함하는" 조성물은 배타적으로 X로 이루어질 수 있거나 추가적 무언가를 포함할 수 있다(예를 들어 X + Y).
본 발명(특히 특허청구범위)을 기재함에 있어서 사용된 단수형 용어는, 본원에 달리 지시되거나 본원에 의해 분명히 반박되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 모두를 포함하는 것으로 해석된다. 본원에서 값의 범위의 언급은 단지 상기 범위 내에 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 나타내는 약칭 방법으로서 제공된 것으로 의도된다. 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 각각의 별개의 값은 개별적으로 본원에 언급된 것과 같이 본원에 혼입된다. 본원의 어떤 표현도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
용어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않는다, 예를 들어, Y를 "실질적으로 미함유하는" 조성물은 Y를 완전히 미함유할 수 있다. 필요에 따라, 용어 "실질적으로"는 본 발병의 정의로부터 생략될 수 있다.
수치 x와 관련된 용어 "약"은 x ± 10%를 의미한다.
종양-관련된 항원 에피토프의 박테리아 서열 변이체의 식별 방법
본 발명은, 인간 미생물 유전체에서 발견되는 박테리아 단백질이 펩티드를 함유하고, 이는 인간 종양-관련된 항원의 에피토프의 서열 변이체라는 놀라운 사실을 기반으로 한다. 따라서, 본 발명자는 인간 미생물 유전체에서 인간 종양-관련된 에피토프의 "에피토프 의태(mimicry)"를 발견하였다. 흥미롭게도, 이러한 에피토프 의태는 자기 항원을 인식하는 T 세포의 클론 고갈에 기인하여 인간 T 세포의 래퍼토리 제한을 우회하는 가능한 방법을 제공한다. 특히, 자기 항원과 다르나 자기 항원과 서열 유사성을 공유하는 항원/에피토프는, (i) T 세포 수용체의 교차반응성 때문에 인식될 수 있고(예를 들어 문헌[Degauque et al., Cross-Reactivity of TCR Repertoire: Current Concepts, Challenges, and Implication for Allotransplantation. Frontiers in Immunology. 2016;7:89. doi:10.3389/fimmu.2016.00089]; [Nelson et al., T cell receptor cross-reactivity between similar foreign and self peptides influences naive cell population size and autoimmunity. Immunity. 2015 Jan 20;42(1):95-107] 참조); (ii) 이러한 항원/에피토프가 T 세포 교육 과정 동안 고갈되지 않은 T 세포/TCR에 의해 인식된다는 것이 예상된다. 따라서, 이러한 항원/에피토프는 강한 면역 반응을 유도하여 자기 항원과의 잠재적 교차 반응성을 갖는 T 세포의 클론적 확산을 야기할 수 있다. 이러한 메커니즘이 자가면역 질병의 일부를 설명하기 위해 현재 제안되었다.
수천의 상이한 박테리아 종으로 구성된 인간 미생물 유전체는 유전적 다양성의 큰 공급원이고 잠재적 항원 성분이다. 소화관(gut)은 미생물(microbiota)과의 접촉 및 교환의 가장 큰 영역으로서 간주될 수 있다. 결과적으로, 소화관은 체내 가장 큰 면역 기관이다. 현재 인간 소화관 상피에서 분화 및 흉선외 T 세포 성숙은 10년 이상 동안 공지되어 있었다. 소화관은, 미생물을 인식할 수 있고 조절 메카니즘에 의해 엄격히 제어되는 면역 세포의 큰 패널을 함유한다.
본 발명에 따라, 소화관에 존재하는 박테리아 종의 큰 래퍼토리는 인간 종양 항원과의 잠재적 유사성을 갖는 항원의 엄청난 공급원을 제공한다. 이들 항원은 TLR 활성제로서 면역 세포에 전달되는 많은 양의 공동-신호와 함께 복잡한 상황으로 분화된 세포에 제공된다. 결과적으로, 미생물은 최대 기능적 반응을 유도할 수 있고 큰 T 기억 서브세트의 성숙을 추진하거나 때때로 최대 클론 고갈 또는 소진을 야기할 수 있다. 인간 종양 항원과의 유사성을 공유하는 박테리아 성분의 식별은 종양-관련된 항원의 에피토프의 선택을 위한 새로운 공급원을 제공할 것이며, 이는 (i) T 세포 고갈 문제를 극복하고, (ii) 소화관의 면역계를 "프라이밍"하여 다른 공급원의 항원 및 인공적으로 돌연변이된 항원/에피토프과 비교하여 보다 강한 면역 반응을 제공해야 한다.
제1 양태에서, 본 발명은 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체를 식별하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 관심 종양-관련된 항원을 선택하는 단계,
(ii) 상기 단계 (i)에서 선택된 종양-관련된 항원에 포함되는 하나 이상의 에피토프를 식별하고 이의 서열을 결정하는 단계, 및
(iii) 상기 단계 (ii)에서 식별된 에피토프 서열의 하나 이상의 미생물 서열 변이체를 식별하는 단계.
또한, 본 발명은 특히 종양-관련된 항원 에피토프의 미생물 서열 변이체를 식별하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(1) 미생물 서열을 종양-관련된 항원 에피토프의 서열과 비교하고, 종양-관련된 항원 에피토프의 미생물 서열 변이체를 식별하는 단계; 및
(2) 임의적으로, 단계 (1)에서 미생물 서열 변이체가 식별된 종양-관련된 항원 에피토프를 포함하는 종양-관련된 항원을 결정하는 단계.
본원에 사용된 용어 "미생물 서열 변이체" 및 "종양-관련된 항원 에피토프 서열"("에피토프 서열"로도 지칭됨)은 (i) (폴리)펩티드 서열 및 (ii) 핵산 서열을 지칭한다. 따라서, "미생물 서열 변이체"는 (i) (폴리)펩티드 또는 (ii) 핵산 분자일 수 있다. 따라서, "종양-관련된 항원 에피토프 서열"("에피토프 서열"로도 지칭됨)은 (i) (폴리)펩티드 또는 (ii) 핵산 분자일 수 있다. 바람직하게는, 미생물 서열 변이체는 (폴리)펩티드이다. 따라서, 종양-관련된 항원 에피토프 서열("에피토프 서열"로도 지칭됨)이 (폴리)펩티드인 것이 또한 바람직하다.
본원에서 펩티드 또는 핵산 수준을 지칭할 수 있는 용어 "에피토프 서열"과 대조적으로, 본원에 사용된 용어 "에피토프"는 특히 펩티드를 지칭한다. 본원에 사용된 "에피토프"("항원 결정기"로도 공지됨)는 면역계, 특히 항체, T 세포 수용체 및/또는 B 세포 수용체에 의해 인식되는 항원의 부분(또는 단편)이다. 따라서, 하나의 항원은 하나 이상의 에피토프를 갖는다, 즉, 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 갖는다. "항원"은 전형적으로 적응 면역 반응의 수용체에 대한 표적, 특히 항체, T 세포 수용체 및/또는 B 세포 수용체에 대한 표적으로서 작용한다. 항원은 (i) 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, (ii) 폴리사카라이드, (iii) 지질, (iv) 지질 단백질 또는 지질 펩티드, (v) 당 지질, (vi) 핵산, 또는 (vii) 소분자 약물 또는 독소일 수 있다. 따라서, 항원은 펩티드, 단백질, 폴리사카라이드, 지질, 지질 단백질 및 당 지질을 포함하는 이들의 조합, 핵산(예를 들어 DNA, siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, decoy DNA, 플라스미드), 또는 소분자 약물(예를 들어 사이클로스포린 A, 파클리탁셀, 독소루비신, 메토트렉세이트, 5-아미노레불린산), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 본 발명에 있어서, 항원은 전형적으로 (i) 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, (ii) 지질 단백질 또는 지질 펩티드, 및 (iii) 당 단백질 또는 당 펩티드로부터 선택되고; 보다 바람직하게는, 항원은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이다.
용어 "종양-관련된 항원"("종양 항원"으로도 지칭됨)은 종양 세포에서 생산된 항원을 지칭하고 종양-연관된 항원(TAA) 및 종양-특이적 항원(TSA)을 포함한다. 고전적 정의에 따라, 종양-특이적 항원(TSA)은 임의의 다른 세포 내에/상에 존재하지 않고 종양 세포 내에/상에만 존재하는 항원인 반면에, 종양-연관된 항원(TAA)은 종양 세포 및 비-종양 세포("정상" 세포) 내에/상에 존재하는 항원이다. 종양-관련된 항원은 흔히 특정 종류의 암/종양에 대해 특이적이다(연관된다).
본 발명에 있어서, 즉, 본원에 걸쳐서, 용어 "펩티드", "폴리펩티드", "단백질" 및 이들 용어의 변형은 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 또는 바람직하게는 일반적 펩티드 결합 또는 대안적으로 변형된 펩티드 결합(예컨대 등전자 펩티드의 경우)에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 단백질을 지칭한다. 특히, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 또한 "펩티도미메틱(peptidomimetic)"을 포함하고, 이는 비-펩티드 구조적 요소를 함유하는 펩티드 유사체로서 정의되고, 상기 펩티드는 천연 모 펩티드의 생물학적 작용을 모방하거나 길항작용할 수 있다. 펩티도미메틱은 통상적 펩티드 특징, 예컨대 효소에 의해 절단가능한 펩티드 결합이 없다. 특히, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 유전자 코드에 의해 정의된 20개의 아미노산에 더하여 이들 아미노산 이외의 아미노산을 포함할 수 있거나, 이는 유전자 코드에 의해 정의된 20개의 아미노산 이외의 아미노산으로 구성될 수 있다. 특히, 본 발명에 있어서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 당업자에게 주지된 천연 과정, 예컨대 번역-후 성숙 과정 또는 화학적 과정에 의해 변형된 아미노산으로 동등하게 구성될 수 있다. 변형은 문헌에 상세히 기재되어 있다. 이들 변형은 폴리펩티드의 임의의 부분, 펩티드 골격, 아미노산 쇄 또는 심지어 카복시- 또는 아미노-말단 단부에서에서 출현할 수 있다. 특히, 펩티드 또는 폴리펩티드는 유비퀴틴화 후에 분지될 수 있거나, 분지 형성과 함께 또는 분지 형성 없이 환형일 수 있다. 이러한 유형의 변형은 당업자에게 주지된 천연 또는 합성 번역-후 과정의 결과일 수 있다. 본 발명에 있어서 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 특히 또한 변형된 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합 고정, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합 고정, 포스파티딜이노시톨의 공유 결합 고정, 공유 또는 비-공유 교차 결합, 환화, 다이설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 페길화를 포함하는 글리코실화, 하이드록시화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 분해 공정, 포스포릴화, 프레닐화, 라세미화, 세넬로일화(seneloylation), 황산화, 아미노산 첨가, 예컨대 아르기닐화, 또는 유비퀴틴화를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 문헌에 상세히 기재되어 있다(문헌[Proteins Structure and Molecular Properties (1993) 2nd Ed., T. E. Creighton, New York]; [Post-translational Covalent Modifications of Proteins (1983) B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York]; [Seifter et al. (1990) Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182: 626-646] 및 [Rattan et al., (1992) Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci, 663: 48-62]). 따라서, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 바람직하게는 예를 들어 지질 펩티드, 지질 단백질, 당 펩티드, 당 단백질 등을 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체는 "통상적" (폴리)펩티드이고, "통상적" (폴리)펩티드는 전형적으로 일반적 펩티드 결합에 의해 서로 연결된, 유전자 코드에 의해 정의된 20개의 아미노산으로부터 선택된 아미노산으로 구성된다.
핵산은 바람직하게는 게놈 DNA, cDNA, RNA, siRNA, 안티센스 DNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 발현 요소를 갖거나 갖지 않는 상보적 RNA/DNA 서열, 미니 유전자, 유전자 단편, 조절 요소, 프로모터 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 단일가닥, 이중가닥 또는 부분적 이중가닥 핵산을 포함한다. 핵산(분자) 및/또는 폴리뉴클레오티드의 추가로 바람직한 예는 예를 들어 재조합 폴리뉴클레오티드, 벡터, 올리고뉴클레오티드, RNA 분자, 예컨대 rRNA, mRNA 또는 tRNA, 또는 상기에 기재된 DNA 분자를 포함한다. 따라서, 핵산(분자)이 바람직하게는 게놈 DNA; cDNA; rRNA; mRNA; 안티센스 DNA; 안티센스 RNA; 상보적 RNA 및/또는 DNA 서열; 발현 요소를 갖거나 갖지 않는 RNA 및/또는 DNA 서열, 조절 요소, 및/또는 프로모터; 벡터; 및 이들의 조합으로부터 선택된 DNA 분자 또는 RNA 분자인 것이 바람직하다.
따라서, 용어 "미생물 서열 변이체"는 미생물에서 발견되는, 즉, 미생물 기원의 핵산 서열 또는 (폴리)펩티드 서열을 지칭한다(서열이 미생물에서 식별되는 경우, 이는 통상적으로 또한 당분야에 주지된 재조합 조치에 의해 수득될 수 있다). "미생물 서열 변이체"는 적어도 5개의 아미노산(15개의 뉴클레오티드), 바람직하게는 적어도 6개의 아미노산(18개의 뉴클레오티드), 보다 바람직하게는 적어도 7개의 아미노산(21개의 뉴클레오티드), 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 8개의 아미노산(24개의 뉴클레오티드)의 길이를 갖는, 미생물에서 발견되는 완전한 (폴리)펩티드 또는 핵산, 또는 바람직하게는 (완전한) 미생물 (폴리)펩티드/단백질 또는 핵산 분자의 단편을 지칭한다. 또한, 미생물 서열 변이체가 50개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 40개 이하의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 30개 이하의 아미노산, 가장 바람직하게는 25개 이하의 아미노산의 길이를 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 미생물 서열 변이체는 바람직하게는 5 내지 50개의 아미노산, 보다 바람직하게는 6 내지 40개의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 7 내지 30개의 아미노산, 가장 바람직하게는 8 내지 25개의 아미노산, 예를 들어 8 내지 24개의 아미노산의 길이를 갖는다. 예를 들어, "미생물 서열 변이체"는 미생물 단백질/핵산 분자의 단편일 수 있고, 상기 단편은 9 또는 10개의 아미노산(27 또는 30개의 뉴클레오티드)의 길이를 갖는다. 바람직하게는, 미생물 서열 변이체는 상기에 기재된 미생물 단백질의 단편이다. 특히 바람직하게는, 미생물 서열 변이체는 8 내지 12개의 아미노산(펩티드의 경우; 핵산 분자의 경우 24 내지 36개의 뉴클레오티드에 해당함)의 길이를 갖고, 보다 바람직하게는 미생물 서열 변이체는 8 내지 10개의 아미노산(펩티드의 경우; 핵산 분자의 경우 24 내지 30개의 뉴클레오티드에 해당함)의 길이를 갖고, 가장 바람직하게는 미생물 서열 변이체는 9 또는 10개의 아미노산(펩티드의 경우; 핵산 분자의 경우 27 또는 30개의 뉴클레오티드에 해당함)의 길이를 갖는다. 이러한 길이를 갖는 펩티드는, 세포 독성 T 림프구(CTL) 반응에 중요한 MHC(주요 조직적합성 복합체) 클래스 I(MHC I)에 결합할 수 있다. 또한, 미생물 서열 변이체가 13 내지 24개의 아미노산(펩티드의 경우; 핵산 분자의 경우 39 내지 72개의 뉴클레오티드에 해당함)의 길이를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 길이를 갖는 펩티드는 CD4+ T 세포(T 헬퍼 세포) 반응에 중요한 MHC(주요 조직적합성 복합체) 클래스 II(MHC II)에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "미생물"은, 오늘날까지 연구된 식물에서 동물에 이르는 모든 다세포 유기체 내에 및 상에 발견되는, 편리공생 미생물, 공생 미생물 및 병원성 미생물을 지칭한다. 특히, 미생물은 이의 숙주의 면역, 호르몬 및 대사 항상성에 중요한 것으로 밝혀졌다. 미생물은 박테리아, 고세균, 원생생물, 진균 및 바이러스를 포함한다. 따라서, 미생물 서열 변이체는 바람직하게는 박테리아 서열 변이체, 고세균 서열 변이체, 원생생물 서열 변이체, 진균 서열 변이체 및 바이러스 서열 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 미생물 서열 변이체는 박테리아 서열 변이체 또는 고세균 서열 변이체이다. 가장 바람직하게는, 미생물 서열 변이체는 박테리아 서열 변이체이다.
해부학적으로, 미생물은 피부, 결막, 유선, 질, 태반, 정액, 자궁, 난포, 폐, 타액, 구강(특히 구강 점막) 및 위장관(gastrointestinal tract), 특히 소화관을 포함하는 임의의 많은 조직 및 생체액 상에 또는 내에 산다. 본 발명에 있어서, 미생물 서열 변이체는 바람직하게는 위장관 미생물(위장관에 사는 미생물) 서열 변이체, 보다 바람직하게는 소화관 미생물(소화관에 사는 미생물) 서열 변이체이다. 따라서, 미생물 서열 변이체가 소화관 박테리아 서열 변이체(즉, 소화관에 사는 박테리아 서열 변이체)인 것이 가장 바람직하다.
미생물이 많은 다세포 유기체(오늘날까지 연구된 식물에서 동물에 이르는 모든 다세포 유기체) 내에 및 상에 발견될 수 있지만, 포유동물에 내에 및 상에 발견된 미생물이 바람직하다. 본 발명에서 고려되는 포유동물은 예를 들어 인간, 영장류, 가축, 예컨대 소, 양, 돼지, 말, 실험실 설치류 등을 포함한다. 인간 내에 및 상에 발견되는 미생물이 가장 바람직하다. 이러한 미생물은 본원에서 "포유동물 미생물" 또는 "인간 미생물"을 지칭한다(용어 포유동물/인간은 구체적으로 미생물의 국소화/거주를 나타낸다). 바람직하게는, 종양-관련된 항원 에피토프는, 그 안에/상에 (미생물 서열 변이체의) 미생물이 사는 동일 종의 것이다. 바람직하게는, 미생물 서열 변이체는 인간 미생물 서열 변이체이다. 따라서, 종양-관련된 항원이 인간 종양-관련된 항원인 것이 바람직하다.
일반적으로, 본원에 사용된, 즉, 본원에 걸쳐, 용어 "서열 변이체"는 기준 서열과 유사하나(이는 특히 50% 이상의 서열 동일성을 의미함, 하기 참조), (100%) 동일한 것은 아닌 서열을 지칭한다. 따라서, 서열 변이체는 기준 서열과 비교하여 하나 이상의 변경을 함유한다. 즉, "미생물 서열 변이체"는, "종양-관련된 항원 에피토프 서열"인 이의 기준 서열과 비교하여 유사하나 하나 이상의 변경을 함유한다. 따라서, 미생물 서열 변이체는 "종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체"로 지칭된다. 달리 말하면, "미생물 서열 변이체"는 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 서열 변이체인 미생물 서열(미생물 기원의 서열)이다. 즉, "미생물 서열 변이체"는 종양-관련된 항원 에피토프 서열과 비교하여 유사하나 하나 이상의 변경을 함유하는 미생물 서열(미생물 기원의 서열)이다. 따라서, "미생물 서열 변이체"는 미생물 서열이다(미생물 서열이 아닌 미생물 서열의 서열 변이체가 아니다). 일반적으로, 서열 변이체(즉, 미생물 서열)는 특히 서열의 전체 길이에 걸쳐, 기준 서열(종양-관련된 항원 에피토프 서열)과 50% 이상의 서열 동일성을 공유하고, 서열 동일성은 하기에 기재되는 바와 같이 계산될 수 있다. 바람직하게는, 서열 변이체는 특히 서열의 전체 길이에 걸쳐, 기준 서열과 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 85% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 공유한다. 따라서, 미생물 서열 변이체가 종양-관련된 항원 에피토프 서열과 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 85% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 것이 바람직하다. 특히 바람직하게는, 미생물 서열 변이체는 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 아미노산에서만 종양-관련된 항원 에피토프 서열과 상이하다. 달리 말하면, 종양-관련된 항원 에피토프 서열과 비교하여, 미생물 서열 변이체가 3개 이하의 아미노산 변경(즉, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변경), 보다 바람직하게는 2개 이하의 아미노산 변경(즉, 1 또는 2개의 아미노산 변경)을 포함하는 것이 특히 바람직하다. 가장 바람직하게는, 미생물 서열 변이체는 종양-관련된 항원 에피토프 서열과 비교하여 1개 또는 정확히 2개의(즉, 2개보다 적지도 많지도 않은) 아미노산 변경을 포함한다.
바람직하게는, 서열 변이체는 기준 서열의 특이적 기능을 보존한다. 본 발명에 있어서, 상기 기능은 "에피토프"로서의 기능이다, 즉, 이는 면역계, 특히 항체, T 세포 수용체 및/또는 B 세포 수용체에 의해 인식될 수 있고, 바람직하게는, 이는 면역 반응을 유도할 수 있다.
용어 "서열 변이체"는 뉴클레오티드 서열 변이체 및 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산 서열 변이체는, 기준 서열과 비교하여 아미노산 중 하나 이상이 결실되거나 치환되거나 기준 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산이 삽입된 변경된 서열을 갖는다. 변경의 결과로서, 아미노산 서열 변이체는 기준 서열에 대해 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 더 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 85% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어, 90% 이상 동일한 변이체 서열은 기준 서열의 100개의 아미노산 당 10개 이하의 변경(즉, 결실, 삽입 또는 치환의 임의의 조합)을 갖는다. 특히 바람직하게는, 미생물 서열 변이체는 1, 2 또는 3개의 아미노산에서만, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 아미노산에서만 종양-관련된 항원 에피토프 서열과 상이하다. 달리 말하면, 미생물 서열 변이체가, 종양-관련된 항원 에피토프 서열과 비교하여, 3개 이하의 아미노산 변경(즉, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변경), 보다 바람직하게는 2개 이하의 아미노산 변경(즉, 1 또는 2개의 아미노산 변경)을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 쿼리 아미노산 서열에 대해 적어도 예를 들어 95%의 "서열 동일성을 공유하는" 아미노산 서열은, 대상 아미노산 서열이 쿼리 아미노산 서열의 각각의 100개의 아미노산 당 5개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 것을 제외하고 대상 아미노산 서열의 서열이 쿼리 서열과 동일한 것을 의미하는 것으로 의도된다. 달리 말하면, 쿼리 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 동일성의 서열을 갖는 아미노산 서열을 수득하기 위해, 대상 서열의 아미노산 잔기의 5%(100개 중 5개) 이하가, 바람직하게는 변이체 또는 단편의 상기 정의 내에서, 또 다른 아미노산에 의해 삽입되거나 치환되거나 삭제될 수 있다. 이는 또한 핵산 서열에 대해 유사하게 적용된다.
정확한 연관성이 없는 (아미노산 또는 핵산) 서열의 경우, 제1 서열(예를 들어 서열 변이체)의 "% 동일성"은 제2 서열(예를 들어 기준 서열)과 관련하여 결정될 수 있다. 일반적으로, 비교할 2개의 서열은 이들 서열 사이의 최대 상관성을 제공하도록 정렬될 수 있다. 이는 정렬도를 증진시키기 위해 하나 또는 둘 모두의 서열에 "갭"의 삽입을 포함할 수 있다. % 동일성은 비교되는 서열 각각의 전체 길이에 걸쳐 결정될 수 있거나(이는 특히 동일하거나 유사한 길이의 서열에 적합함)(소위 "전반적 정렬"), 보다 짧은 한정된 길이에 걸쳐 결정될 수 있다(이는 동일하지 않은 길이의 서열에 보다 적합하다)(소위 "국소 정렬").
2개 이상의 서열의 동일성(때때로 "유사성" 또는 "상동성"으로 지칭됨)의 비교 방법은 당분야에 주지되어 있다. 2개(이상)의 서열이 동일한지에 대한 백분율은 예를 들어 수학적 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 사용될 수 있는 수학적 알고리즘의 바람직하고 비제한적인 예는 문헌[Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 BLAST 프로그램 패밀리, 예를 들어 BLAST 또는 NBLAST 프로그램(또한, 월드 와이드 웹 사이트[ncbi.nlm.nih.gov] NCBI의 홈페이지를 통해 접근 가능한 문헌[Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410] 또는 [Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402]을 참조한다) 및 FASTA(문헌[Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98]; [Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448])에 통합된다. 다른 서열에 소정의 정도로 동일한 서열은 이들 프로그램에 의해 식별될 수 있다. 또한, 위스콘신 서열 분석 패키지 버전 9.1로 입수가능한 프로그램(문헌[Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res., 387-395]), 예를 들어 프로그램 BESTFIT 및 GAP는 2개의 폴리뉴클레오티드 사이의 % 동일성 및 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 % 동일성 및 % 상동성 또는 동일성을 결정하는 데 사용될 수 있다. BESTFIT는 "국소 상동성" 알고리즘(문헌[Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197])을 사용하고 2개의 서열 사이의 유사성의 최고의 단일 영역을 찾는다.
바람직하게는, 미생물 서열 변이체는 MHC 분자에 대한 일차 및/또는 이차 앵커 잔기에 있어서(만) 종양-관련된 항원 에피토프 서열과 상이하다. 보다 바람직하게는, 미생물 서열 변이체는, 이것이 MHC 분자에 대한 일차 및/또는 이차 앵커 잔기에 있어서(만) 아미노산 치환을 포함한다는 점에서(만) 종양-관련된 항원 에피토프 서열과 상이하다. HLA 하위 유형에 대한 앵커 잔기는 당분야에 공지되어 있고, 단백질 데이터 은행의 기존의 p-HLA 복합체의 구조적 데이터의 대량 분석에 의해 정의되었다. 또한, MHC 하위 유형에 대한 앵커 모티프는 IEDB(URL: www.iedb.org; browse by allele) 또는 SYFPEITHI(URL: http://www.syfpeithi.de/)에서 찾아볼 수 있다. 예를 들어, 9개의 아미노산의 크기의 HLA.A2.01 펩티드의 경우, 주요 접촉 점을 제공하는, 펩티드 일차 앵커 잔기는 잔기 위치 P1, P2 및 P9에 위치된다.
따라서, 미생물 서열 변이체의 코어 서열이 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 코어 서열과 동일한 것이 바람직하되, 상기 코어 서열은 N-말단에 가까운 3개의 아미노산(the three most N-terminal amino acids) 및 C-말단에 가까운 3개의 아미노산(the three most C-terminal amino acids)을 제외한 모든 아미노산으로 이루어진다. 달리 말하면, 종양-관련된 항원 에피토프 서열와 비교하여 미생물 서열 변이체의 임의의 변경은 바람직하게는 "코어 서열"(서열 중간의 아미노산)이 아닌 3개의 N-말단 내에 및/또는 3개의 C-말단 아미노산 내에 위치하는 것이 바람직하다. 달리 말하면, 미생물 서열 변이체에서, 종양-관련된 항원 에피토프 서열과 비교한 변경(미스매치)은 바람직하게는 (적어도) 3개의 N-말단 아미노산 및/또는 (적어도) 3개의 C-말단 아미노산에서만 허용되고, 보다 바람직하게는 변경(미스매치)은 2개의 N-말단 아미노산 및/또는 2개의 C-말단 아미노산에서만 허용된다. 이는 셋 모두의 (바람직하게는 둘 모두의) N-말단 및/또는 C-말단 아미노산이 변경되어야 하나, 이는 아미노산이 변경될 수 있는 아미노산 위치에서만 존재함을 의미한다. 예를 들어, 9개의 아미노산의 펩티드에서, 3개의 중간 아미노산이 코어 서열을 나타낼 수 있고, 변경은 바람직하게는 임의의 3개의 N-말단 및 3개의 C-말단 아미노산 위치에서만 발생할 수 있고, 보다 바람직하게는 변경/치환은 임의의 2개의 N-말단 및/또는 2개의 C-말단 아미노산 위치에서만 발생할 수 있다.
보다 바람직하게는, (종양-관련된 항원 에피토프 서열의) 코어 서열은 N-말단에 가까운 2개의 아미노산 및 C-말단에 가까운 2개의 아미노산을 제외한 모든 아미노산으로 이루어진다. 예를 들어, 9개의 아미노산의 펩티드(종양-관련된 항원 에피토프 서열)에서, 5개의 중간 아미노산이 코어 서열을 나타내고, 변경은 바람직하게는 (종양-관련된 항원 에피토프 서열의) 임의의 2개의 N-말단 및 2개의 C-말단 아미노산 위치에서만 발생할 수 있다.
또한, (종양-관련된 항원 에피토프 서열의) 코어 서열은 N-말단에 가장 가까운 아미노산 및 C-말단에 가장 가까운 아미노산을 제외한 모든 아미노산으로 이루어지는 것이 바람직하다. 예를 들어, 9개의 아미노산의 펩티드(종양-관련된 항원 에피토프 서열)에서, 7개의 가운데 아미노산은 코어 서열을 나타낼 수 있고, 변경은 바람직하게는 N-말단 위치(P1) 및 C-말단 아미노산 위치(P9)에서만 발생할 수 있다.
가장 바람직하게는, (종양-관련된 항원 에피토프 서열의) 코어 서열은 N-말단에 가까운 2개의 아미노산 및 C-말단에 가까운 2개의 아미노산을 제외한 모든 아미노산으로 이루어진다. 예를 들어, 9개의 아미노산의 펩티드(종양-관련된 항원 에피토프 서열)에서, 가운데 6개의 아미노산은 코어 서열을 나타낼 수 있고, 변경은 바람직하게는 임의의 2개의 N-말단 위치(P1 및 P2) 및 C-말단 아미노산 위치(P9)에서만 발생할 수 있다.
예를 들어, 9개의 아미노산의 길이를 갖는 미생물 서열 변이체가 위치 1(P1; N-말단에 가장 가까운 아미노산 위치)에서 페닐알라닌(F) 또는 리신(K)을 포함하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 예를 들어 9개의 아미노산의 길이를 갖는 미생물 서열 변이체가 위치 2(P2)에서 류신(L) 또는 메티오닌(M)을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 예를 들어 9개의 아미노산의 길이를 갖는 미생물 서열 변이체가 위치 9(P9)에서 발린(V) 또는 류신(L)을 포함하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 예를 들어 9개의 아미노산의 길이를 갖는 미생물 서열 변이체는 위치 1(P1; N-말단에 가장 가까운 아미노산 위치)에서 페닐알라닌(F) 또는 리신(K), 위치 2(P2)에서 류신(L) 또는 메티오닌(M) 및/또는 위치 9(P9)에서 발린(V) 또는 류신(L)을 포함한다.
미생물 서열 변이체의 코어 서열은 또한 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 코어 서열과 상이할 수 있다. 이러한 경우, (종양-관련된 항원 에피토프 서열의 코어 서열과 비교되는 미생물 서열 변이체의 코어 서열에서) 임의의 아미노산 치환이 하기에 기재되는 보존적 아미노산 치환인 것이 바람직하다.
일반적으로, 특히 MHC 분자에 대한 앵커 위치(예를 들어 MHC-I 하위 유형 HLA.A2.01의 경우 P1, P2 및 P9) 이외의 위치에서의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다. 보존적 치환의 예는 하나의 지방족 잔기를 또 다른 것으로 치환함, 예컨대 Ile, VaI, Leu 또는 Ala를 또 다른 하나로 치환함; 또는 극성 잔기를 또 다른 것으로 치환함, 예컨대 Lys와 Arg 사이의 치환, Glu와 Asp 사이의 치환, 또는 Gln과 Asn 사이의 치환을 포함한다. 기타 상기 보존적 치환, 예를 들어 유사한 소수성 특성을 갖는 전체 영역의 치환은 주지되어 있다(문헌[Kyte and Doolittle, 1982, J. Mol. Biol. 157(1):105- 132]). 보존적 아미노산 치환의 예는 하기 표 1에 제시되어 있다:
원래 잔기 치환의 예
Ala (A) Val, Leu, Ile, Gly
Arg (R) His, Lys
Asn (N) Gln
Asp (D) Glu
Cys (C) Ser
Gln (Q) Asn
Glu (E) Asp
Gly (G) Pro, Ala
His (H) Lys, Arg
Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe
Leu (L) Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys (K) Arg, His
Met (M) Leu, Ile, Phe
Phe (F) Leu, Val, Ile, Tyr, Trp, Met
Pro (P) Ala, Gly
Ser (S) Thr
Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr, Phe
Tyr (Y) Trp, Phe
Val (V) Ile, Met, Leu, Phe, Ala
특히, (미생물) 서열 변이체 및 이의 바람직한 실시양태의 상기 설명은, 선택된 종양-관련된 항원 에피토프의 미생물 서열 변이체가 식별되는 본 발명에 따른 방법의 단계 (iii)에 적용된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법의 단계 (iii)의 식별은 미생물 서열 변이체에 대해 상기에 개괄된 원리를 기초로 한다.
본 발명에 따른 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체의 식별 방법의 단계 (i)에서, 관심 종양-관련된 항원이 선택된다. 이는 예를 들어 예방하고/하거나 치료할 암을 기초로 수행될 수 있다. 별개의 유형의 암에 관련된 항원이 당분야에 주지되어 있다. 적합한 암/종양 에피토프는 예를 들어 암/종양 에피토프 데이터베이스로부터, 예를 들어 데이터베이스 "탄티젠(Tantigen)"(탄티젠 버전 1.0, Dec 1, 2009; 다나-파버 캔서 인스티튜트(Dana-Farber Cancer Institute)의 암 백신 센터의 바이오인포메틱스 코어(Bioinformatics Core)에서 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/)으로부터 검색해볼 수 있다. 선택을 위한 단계 (i)에서 사용될 수 있는 종양-관련된 항원의 데이터베이스에 대한 추가적 예는 "펩티드 데이터베이스"(https://www.cancerresearch.org/scientists/events-and-resources/peptide-database) 및 "CT데이터베이스"(http://www.cta.lncc.br/)를 포함한다. 또한, 종양-관련된 항원은 당분야에 공지된 문헌, 예컨대 과학 기사를 기초로 선택될 수 있다.
항원의 데이터베이스를 제공하는 인터넷 자원(상기에 예시됨)을 문헌 조사와 병행하는 것이 특히 바람직하다. 예를 들어, 단계 (i)의 하위 단계 (i-a)에서, 하나 이상의 종양-관련된 항원은 데이터베이스, 예컨대 탄티젠, 펩티드 데이터베이스 및/또는 CT데이터베이스로부터 식별될 수 있고, 하위 단계 (i-b)에서, 데이터베이스로부터 하위 단계 (i-a)에서 선택된 하나 이상의 항원에 대한 구체적인 문헌이 확인되고 연구될 수 있다. 이러한 문헌은 구체적으로 항원의 특이적 종양 발현의 조사에 관한 것이며, 예컨대 문헌[Xu et al., An integrated genome-wide approach to discover tumor-specific antigens as potential immunologic and clinical targets in cancer. Cancer Res. 2012 Dec 15;72(24):6351-61]; [Cheevers et al., The prioritization of cancer antigens: a national cancer institute pilot project for the acceleration of translational research. Clin Cancer Res. 2009 Sep 1;15(17):5323-37]이다.
이후, 선택의 추가적 회차는 하위 단계 (i-c)에서 수행될 수 있되, 여기서 데이터베이스로부터 하위 단계 (i-a)에서 선택된 하나 이상의 항원이 하위 단계 (i-b)의 문헌 연구의 결과를 기초로 선택(즉, 유지)될 수 있거나 "폐기"될 수 있다.
임의적으로, 선택 후에(예를 들어 이들 하위 단계가 수행되는 경우 하위 단계 (i-a) 또는 (i-c) 후에) 선택된 항원에 발현 프로필에 관하여 애노테이션(annotation)을 수행할 수 있다. 이를 위하여, 툴, 예컨대 Gent(http://medicalgenome.kribb.re.kr/GENT/), metabolic gene visualizer(http://merav.wi.mit.edu/), 또는 protein Atlas(https://www.proteinatlas.org/)가 사용될 수 있다. 이로써, 하나 이상의 선택된 항원은 예를 들어 잠재적 지표, 가능한 부작용에 대한 이의 관련성 및/또는 "드라이버(driver)" 항원(암의 원인이되는 변경) 또는 "패신저(passenger)" 항원(부수적인 변화 또는 암의 결과로서 발생하는 변화)인지 여부에 관하여 추가로 정의될 수 있다(예를 들어 문헌[Tang J, Li Y, Lyon K, et al. Cancer driver-passenger distinction via sporadic human and dog cancer comparison: a proof of principle study with colorectal cancer. Oncogene. 2014;33(7):814-822] 참조).
바람직하게는, 단계 (ii)에서 식별된 종양-관련된 항원 에피토프는 MHC 클래스 I에 의해 제시될 수 있다. 달리 말하면, 단계 (ii)에서 식별된 종양-관련된 항원 에피토프가 MHC 클래스 I에 결합할 수 있는 것이 바람직하다. MHC 클래스 I(주요 조직적합성 복합체 클래스 I, MHC-I)은 에피토프를 살해 T 세포(세포 독성 T 림프구(CTL)로도 지칭됨)에 제공한다. CTL은 TCR(T 세포 수용체) 이외에 CD8 수용체를 발현한다. CTL의 TCR이 MHC 클래스 I 분자 내의 에피토프에 맞는 경우, CTL의 CD8 수용체는 MHC 클래스 I 분자에 도킹하고, CTL은 세포가 세포 자멸에 의해 프로그래밍된 세포 사멸을 수행하는 것을 촉발시킨다. 이러한 경로는 암 세포가 직접 공격받기 때문에 암의 예방 및/또는 치료에 특히 유용하다. 인간의 경우, MHC 클래스 I은 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 분자를 포함한다.
전형적으로, 8 내지 12개, 바람직하게는 8 내지 10개의 아미노산의 길이를 갖는 펩티드(에피토프)는 MHC I에 의해 제시된다. 항원의 어떤 에피토프가 MHC I에 의해 제시될 수 있는지/MHC I에 결합할 수 있는지를 상기에 예시된 데이터베이스에 의해 식별할 수 있다(예를 들어 탄티젠(탄티젠 버전 1.0, Dec 1, 2009; 다나-파버 캔서 인스티튜트의 암 백신 센터의 바이오인포메틱스 코어에서 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/)은 에피토프 및 해당 HLA 하위 유형의 목록을 제공한다). 바람직한 분석 툴은 "IEDB"(Immune Epitope Database and Analysis Resource, IEDB Analysis Resource v2.17, supported by a contract from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, a component of the National Institutes of Health in the Department of Health and Human Services; URL: http://www.iedb.org/)이고, 이는 예를 들어 MHC-I 처리 예측을 제공한다(http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_processing.html). 이로써, 프로테아좀 절단, TAP 이동 및 MHC 클래스 I 분석 툴에 관한 정보는 펩티드 제시 예측과 조합될 수 있다. 또 다른 바람직한 데이터베이스는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 데이터 은행 SYFPEITHI(MHC 리간드 및 펩티드 모티프의 데이터베이스(버전 1.0, DFG-Sonderforschungsbereich 685 및 유럽 연합(EU BIOMED CT95-1627, BIOTECH CT95-0263 및 EU QLQ-CT-1999-00713)에 의해 후원됨; URL: www.syfpeithi.de))이고, 이는 MHC 분자로부터 용출된 펩티드를 편집한다. SYFPEITHI 데이터베이스가 공개된 보고서로부터 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자에 결합하는 것으로 공지된 펩티드 서열만을 포함하기 때문에, SYFPEITHI 데이터베이스가 바람직하다. 특히 바람직하게는, 시험관내 데이터로부터 수득된 결과(예컨대 SYFPEITHI 데이터베이스 및 IEDB 데이터베이스에서 편집된 것)는 용출 분석으로부터 수득한 인간 선형 에피토프 및 MHC 클래스 I 제한을 포함하는 제한적인 검색에 의해 인실리코(in silico) 예측 MHC 결합 데이터베이스, 예를 들어 IEDB 데이터베이스에서 확장될 수 있다.
MHC I에 의해 제시되는 에피토프/MHC I에 결합하는 에피토프의 상기에 기재된 데이터베이스 선택에 부가적으로 또는 대안적으로, MHC 클래스 I에 대한 후보자 펩티드의 결합은 바람직하게는 시험관내 또는 인실리코 MHC 결합 시험에 의해 시험될 수 있다. 또한, 시험관내 또는 인실리코 결합 시험은 또한, 예를 들어 인실리코 결합 시험을 먼저 사용하여 제1 선택을 수득하고 나중 단계에서 시험관내 결합 시험을 사용하여 예를 들어 인실리코 결합 시험에 의해 수득된 결과를 확인함으로써 병행될 수 있다. 또한, 이는 일반적으로 적용된다: 펩티드, 예컨대 에피토프 또는 미생물 서열 변이체의 결합은 바람직하게는 본원에 기재된 시험관내 또는 인실리코 MHC 결합 시험에 의해 시험될 수 있다.
이에 있어서, MHC 클래스 I에 대한 결합을 결정하기 위해, IEDB 솔루션즈 센터에 의해 제공된 임계값(컷오프(cut-off))(URL: https://help.iedb.org/hc/en-us/articles/114094151811-Selecting-thresholds-cut-offs-for-MHC-class-I-and-II-binding-predictions)이 사용될 수 있다. 즉, MHC 클래스 I의 경우, URL[https://help.iedb.org/hc/en-us/articles/114094151811-Selecting-thresholds-cut-offs-for-MHC-class-I-and-II-binding-predictions]에 나타내고 하기 표 2에 나타낸 컷오프가 사용될 수 있다:
Figure pct00001
MHC 클래스 I 결합의 예측(MHC 인실리코 결합 시험)을 공개적으로 입수가능한 툴, 예컨대 "NetMHCpan", 예를 들어 "NetMHCpan 3.0 서버" 또는 "NetMHCpan 4.0 서버"(덴마크 기술 대학교 (DTU)의 생물학 서열 분석 센터; URL: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)를 사용하여 수행할 수 있다. NetMHCpan 방법, 특히 NetMHCpan 3.0 이상의 버전은 인간(HLA-A, B, C, E) 및 다른 종의 172개의 MHC 분자를 포함하는 180000 초과의 정량적 결합 데이터에 대해 학습된다. 일반적으로, 친화도는 강한 바인더 및 약한 바인더에 대한 기본 임계값을 남김으로써 예측될 수 있다. 예를 들어, HLA-A*0201의 경우, 50 nM 미만의 계산된 친화도는 "강한 바인더"를 나타내고, 50 내지 255 nM(또는 50 내지 300 nM)의 친화도는 "중간 바인더"를 나타낸다.
NetMHCpan, 예를 들어 NetMHCpan 3.0 또는 NetMHCpan 4.0에서, 예측된 친화도의 순위는 400000개의 랜덤 천연 펩티드의 세트와 비교될 수 있고, 이는 %순위 결합 친화도의 척도로서 사용될 수 있다. 이러한 값은 보다 높거나 낮은 평균 예측 친화도에 대한 특정 분자의 고유한 편향에 의해 영향받지 않는다. 예를 들어(예를 들어 HLA-A*0201의 경우), 매우 강한 바인더는 0.5 미만의 %순위를 갖는 것으로 정의될 수 있고, 강한 바인더는 1.0 미만의 %순위를 갖는 것으로 정의될 수 있고, 중간 바인더는 1.0 내지 2.0의 %순위를 갖는 것으로 정의될 수 있고, 약한 바인더는 2.0 초과의 %순위를 갖는 것으로 정의될 수 있다.
시험관내 시험 방법은 숙련가에게 주지되어 있다. 예를 들어, 숙련가는 문헌[Tourdot et al., A general strategy to enhance immunogenicity of low-affinity HLA-A2.1-associated peptides: implication in the identification of cryptic tumor epitopes. Eur J Immunol. 2000 Dec; 30(12):3411-21]에서 HLA-A*0201에 의해 제시된 펩티드에 대해 인증된 실험 프로토콜을 사용할 수 있다. 이에 있어서, 기준 펩티드, 예컨대 HIV pol 589-597이 추가적으로 시험에서 사용될 수 있다. 이는, 예를 들어 하기 수학식에 의해 기준 펩티드를 사용하여 관찰된 결합과 비교된 시험관내 친화도의 계산을 가능하게 한다:
상대적 친화도 = HLA-A*0201의 발현의 20%를 유도하는 각각의 펩티드의 농도 / HLA-A*0201의 발현의 20%를 유도하는 기준 펩티드의 농도
여기서, 100%는 기준 펩티드, 예를 들어 HIV pol 589-597을 예를 들어 100 μM 농도에서 사용시 검출된 HLA-A*0201 발현의 수준이다. 예를 들어, 1 미만의 상대적 친화도를 나타내는 펩티드는 "강한 바인더"로서 간주될 수 있고, 1 내지 2의 상대적 친화도를 나타내는 펩티드는 "중간 바인더"로서 간주될 수 있고, 3 초과의 상대적 친화도를 나타내는 펩티드는 "약한 바인더"로서 간주될 수 있다.
또한, 단계 (ii)에서 식별된 종양-관련된 항원 에피토프가 MHC 클래스 II에 의해 제시될 수 있는 것이 바람직하다. 달리 말하면, 단계 (ii)에서 식별된 종양-관련된 항원 에피토프가 MHC 클래스 II에 결합할 수 있는 것이 바람직하다. MHC 클래스 II(주요 조직적합성 복합체 클래스 II, MHC-II)는 에피토프를 면역 세포, 예컨대 T 헬퍼 세포(CD4+ T 세포)에 제공한다. 이어서, 헬퍼 T 세포는 적절한 면역 반응 촉발을 보조하고, 이는 B 세포의 활성화에 기인하여 전력의 항체 면역 반응을 야기할 수 있다. 인간의 경우, MHC 클래스 II는 HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ 및 HLA-DR 분자를 포함한다.
전형적으로, 13 내지 24개의 아미노산의 길이를 갖는 펩티드(에피토프)는 MHC II에 의해 제시될 수 있다. 항원의 어떤 에피토프가 MHC II에 의해 제시될 수 있는지/MHC II에 결합할 수 있는지를 MHC I에 대해 상기에 나타낸 데이터베이스에 의해 확인할 수 있다(단지 MHC II에 관련된 툴이 MHC I 대신에 사용될 수 있다). 부가적으로 또는 대안적으로, MHC 클래스 II에 대한 후보자 펩티드의 결합은 바람직하게는 본원에 기재된 시험관내 또는 인실리코 MHC 결합 시험에 의해 시험될 수 있고, 이는 유사한 방식으로 MHC II에 적용된다.
본 발명에 따른 미생물 서열 변이체의 식별 방법의 단계 (iii)에서 에피토프 서열의 하나 이상의 미생물 서열 변이체의 식별은 바람직하게는 하기에 의해 수행된다:
- 단계 (ii)에서 선택된 에피토프 서열을 하나 이상의 미생물 서열과 비교함, 및
- 상기 하나 이상의 미생물 서열이 상기 에피토프 서열의 하나 이상의 미생물 서열 변이체를 함유하는지를 식별함(상기에 나타냄).
달리 말하면, 본 발명에 따른 방법의 단계 (iii)은 바람직하게는 하기를 포함한다:
- 단계 (ii)에서 선택된 에피토프 서열을 하나 이상의 미생물 서열과 비교함, 및
- 상기 하나 이상의 미생물 서열이 상기 에피토프 서열의 하나 이상의 미생물 서열 변이체를 함유하는지를 식별함(상기에 나타냄).
특히, 단계 (ii)에서 선택된 에피토프 서열은, 미생물 서열을 찾기 위해, 특히 (단계 (ii)에서 선택된 에피토프 서열과의 50% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 60% 이상 서열 동일성, 보다 바람직하게는 70% 이상 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 75% 이상 서열 동일성을 갖는) 유사한 서열을 포함하는 하나 이상의 미생물 서열을 식별하기 위해 쿼리 서열(인풋 서열/기준 서열)로서 사용될 수 있다.
이에 있어서, 상기에 개괄된 미생물 서열 변이체, 및 특히 상기에 기재된 미생물 서열 변이체의 바람직한 실시양태에 대한 기준(특히 유사성 및 % 서열 동일성에 관함)이 적용된다. 예를 들어, 제1 단계에서, 서열 유사성 검색, 예컨대 BLAST 또는 FASTA가 수행될 수 있다. 예를 들어, 단백질 BLAST(blastp)는 PAM30 단백질 치환 매트릭스를 사용하여 수행될 수 있다. PAM30 단백질 치환 매트릭스는 시간에 따른 부위 당 아미노산 변화를 설명하며, 35개 미만의 아미노산의 길이를 갖는 쿼리에 대해 권장된다. 단백질 BLAST의 추가적 (부가적) 예시된 파라미터는 2의 단어 크기(짧은 쿼리에 대해 제안됨); 20000000의 예상 값(E)(가능한 매치의 수를 최대화하도록 조정됨); 및/또는 '0'으로 설정된 조성-기반 통계(이는 30개의 아미노산보다 짧은 인풋 서열이며 이는 갭이 없는 정렬만 허용한다)일 수 있다.
이후, 결과는, 8 내지 12개의 아미노산의 길이를 갖는 서열(예를 들어 8개의 아미노산의 길이를 갖는 서열, 9개의 아미노산의 길이를 갖는 서열, 10개의 아미노산의 길이를 갖는 서열, 11개의 아미노산의 길이를 갖는 서열, 또는 12개의 아미노산의 길이를 갖는 서열), 바람직하게는 8 내지 10개의 아미노산의 길이를 갖는 서열, 가장 바람직하게는 9 또는 10 개의 아미노산의 길이를 갖는 서열만이 수득되도록, 서열 길이에 관해 필터링될 수 있다.
또한, 결과는 상기에 기재된 바와 같이 코어 서열이 아닌 특정 위치, 바람직하게는 N- 및/또는 C-말단에서만 허용되도록 (추가적으로) 필터링될 수 있다. 구체적 예로서, 결과는, 9개의 아미노산의 길이를 갖고, 위치 P1, P2 및 P9에서만 허용되는 미스매치/치환을 갖고, 서열 당 최대 2개의 미스매치가 허용되는 서열이 수득되도록 필터링될 수 있다.
에피토프 서열이 비교되는 하나 이상의 미생물 서열은 임의의 미생물 서열 또는 임의의 미생물 서열 편집본(예컨대 임의의 미생물 서열 데이터베이스)일 수 있다.
바람직하게는, 단계 (iii)에서 미생물 서열 변이체는 미생물 (서열) 데이터베이스를 기초로 식별된다. 이러한 데이터베이스는 바람직하게는 다수의 개체(대상체)의 미생물 (서열) 데이터를 포함할 수 있다. 이러한 데이터베이스의 예는 "인간 소화관 미생물 유전체의 통합된 참고 카탈로그(Integrated reference catalog of the human gut microbiome)"(버전 1.0, March 2014; Li et al. MetaHIT Consortium. An integrated catalog of reference genes in the human gut microbiome. Nat Biotechnol. 2014 Aug;32(8):834-41; URL: http://meta.genomics.cn/meta/home)이고, 이는 주요 인간 미생물 유전체 프로파일링 활동으로부터의 데이터(미국 국립보건원 인간 미생물 유전체 프로젝트(NIH-HMP) 및 유럽 인간 창자관 이니셔티브 메타게놈(MetaHIT))를 포함한다.
또한, 미생물 데이터베이스가 다수의 개체가 아닌 단일 개체의 미생물 데이터를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로, 미생물 서열 변이체(또는 이를 포함하는 약제)는 개체에 대해 구체적으로 맞춰질 수 있다. 본 발명의 (방법에 의해 식별된) 미생물 서열 변이체가 자기 항원과 상이하여 면역계의 자기 관용을 피한다는 장점에 더하여, 개체에서 존재하는 미생물 서열 변이체는, 개체가 이러한 미생물 서열 변이체에 대해 "프라이밍"될 수 있다는 장점, 즉, 개체가 미생물 서열 변이체에 의해 프라이밍된 기억 T 세포를 가질 수 있다는 추가적 장점을 갖는다. 특히, 인간 종양-관련된 항원 에피토프의 미생물 서열 변이체에 대한 기존 기억 T 세포는 미생물 서열 변이체의 도전으로 재활성화될 것이고, 항종양 반응의 수립을 강화시키고 가속화시켜 치료적 효능을 추가적으로 증가시킬 것이다.
다수의 개체가 아닌 단일 개체의 미생물 데이터를 포함하는 데이터베이스는 예를 들어 개체의 하나 이상의 대변 샘플의 사용에 의해 편집될 수 있다. 예를 들어, 미생물(특히 박테리아) 핵산(예컨대 DNA) 또는 (폴리)펩티드는 대변 샘플로부터 추출될 수 있고 당분야에 공지된 방법에 의해 서열결정될 수 있다. 이어서, 서열은 미생물 데이터, 특히 서열만을 함유하는 데이터베이스로 편집될 수 있다. 이러한 데이터베이스를 편집하기 위해, 예를 들어 국제 인간 미생물 유전체 표준(IHMS) 프로젝트에 의해 개발되고 제공된 하나 이상의 표준 작업 절차(SOP)가 사용될 수 있다(URL: http://www.microbiome-standards.org/#SOPS). IHMS 프로젝트(URL: http://www.microbiome-standards.org)는 제7 프레임워크 프로그램(프로젝트 ID: 261376) 하에 유럽 위원회가 후원하며, 인간 미생물 유전체 필드에서 데이터 품질 및 비교가능성을 최적화하도록 설계된 표준 작업 절차(SOP)의 개발을 조정하였다. IHMS는 14개의 표준 작업 절차(SOP)(대변 샘플 수집, 식별 및 추출, 서열결정 및 데이터 분석을 위한 SOP를 포함함)을 개발하였다. 예를 들어, IHMS SOP는 데이터베이스 편집의 전체 공정에 사용될 수 있다(즉, 각각의 단계에서 SOP가 사용될 수 있다). 또 다른 예에서, 하나 이상의 단계는 하나 이상의 SOP를 사용할 수 있는 반면에, 다른 단계는 다른 방법을 사용한다. 특히 바람직한 예에서, 대변 샘플로부터 추출된 DNA의 서열결정은 예를 들어 Illumina HiSeq 상에서 4000만의 페어 엔드 리드(pair end read)에서 수행될 수 있다. 서열은 예를 들어 미생물 서열 변이체(예를 들어 박테리아 펩티드)를 발현하는 후보자 박테리아의 게놈 부분의 식별을 위한 바이오인포메틱스 파이프라인을 사용하여 분석될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체의 식별 방법의 단계 (iii)은 하기 하위 단계를 포함한다:
(iii-a) 임의적으로, 단일 또는 다수의 개체의 샘플의 미생물 단백질 서열 또는 핵산 서열을 식별하는 단계,
(iii-b) 상기 단일 또는 다수의 개체의 미생물 단백질 서열 또는 핵산 서열을 포함하는 데이터베이스를 편집하는 단계, 및
(iii-c) 단계 (iii-b)에서 편집한 데이터베이스에서, 단계 (ii)에서 식별된 에피토프 서열의 하나 이상의 미생물 서열 변이체를 식별하는 단계.
단계 (iii-a)의 샘플은 바람직하게는 대변 샘플이다. 편집할 데이터베이스가 단일 또는 다수의 개체에 관련되는지에 따라, 단일 또는 다수의 개체의 하나 이상의 대변 샘플이 사용될 수 있다.
식별 단계 (iii-a)는 바람직하게는 미생물(특히 박테리아) 핵산(예컨대 DNA) 또는 (폴리)펩티드를 샘플, 특히 대변 샘플로부터 추출하고, 예를 들어 상기에 기재된 바와 같이 이를 서열결정함을 포함하다. 임의적으로, 서열은 상기에 기재된 바와 같이 분석될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다:
(iv) MHC 분자, 특히 MHC I 분자에 대한 하나 이상의 미생물 서열 변이체의 결합을 시험하고, 결합 친화도를 수득하는 단계.
MHC 분자, 특히 MHC I 또는 MHC II에 대한 하나 이상의 미생물 서열 변이체의 결합을 상기에 기재된 바와 같이 시험관내 또는 인실리코 MHC 결합 시험에 의해 시험할 수 있다. 따라서, 중간 바인더, 강한 바인더 및 매우 강한 바인더를 상기에 기재된 바와 같이 선택할 수 있다.
바람직하게는, MHC에 대한 결합을 하나 이상의 미생물 서열 변이체의 경우 MHC 분자에 대해, 및 추가적으로 (각각의 기준) 에피토프("상응하는" 종양-관련된 항원 에피토프 서열)의 경우 MHC 분자, 특히 MHC I 또는 MHC II 분자에 대해 (상기에 기재된 바와 같이 시험관내 및/또는 인실리코) 시험하고, 결합 친화도를 바람직하게는 둘 모두(에피토프 서열 및 이의 미생물 서열 변이체)에 대해 수득하였다.
결합 시험 후에, 바람직하게는 MHC, 특히 MHC I 또는 MHC II에 중간으로, 강하게 또는 매우 강하게 결합하는 미생물 서열 변이체만이 선택된다. 보다 바람직하게는 강한 바인더 및 매우 강한 바인더만이 선택되고, 가장 바람직하게는, MHC, 특히 MHC I 또는 MHC II에 대해 매우 강하게 결합하는 미생물 서열 변이체만이 선택된다.
보다 바람직하게는, MHC, 특히 MHC I 또는 MHC II에 강하게 또는 매우 강하게 결합하는 미생물 서열 변이체만이 선택되고, 여기서 (각각의 기준) 에피토프("상응하는" 종양-관련된 항원 에피토프 서열)는 MHC, 특히 MHC I 또는 MHC II에 중간으로, 강하게 또는 매우 강하게 결합한다. 보다 더 바람직하게는, MHC, 특히 MHC I 또는 MHC II에 대해 매우 강하게 결합하는 미생물 서열 변이체만이 선택되고, 여기서 (각각의 기준) 에피토프는 MHC, 특히 MHC I 또는 MHC II에 대해 중간으로, 강하게 또는 매우 강하게 결합한다. 가장 바람직하게는, MHC, 특히 MHC I 또는 MHC II에 매우 강하게 결합하는 미생물 서열 변이체만이 선택되고, 여기서 (각각의 기준) 에피토프는 MHC, 특히 MHC I 또는 MHC II에 대해 강하게 또는 매우 강하게 결합한다.
또한, 본 발명에 따른 방법에 따른 방법의 단계 (iv)가, 미생물 서열 변이체에 대해 수득된결합 친화도 및 각각의 기준 에피토프에 대해 수득된 결합 친화도의 비교, 및 각각의 기준 에피토프보다, MHC, 특히 MHC I 또는 MHC II에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 미생물 서열 변이체의 선택을 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:
(v) 미생물 서열 변이체를 함유하는 미생물 단백질의 세포 국소화를 결정하는 단계.
이에 있어서, 미생물 서열 변이체를 함유하는 미생물 단백질이 (i) 분비되고/되거나 (ii) 막관통 도메인을 포함하는지가 바람직하게는 결정된다. 막 내에/상에 분비되거나 존재하는 미생물 단백질은 면역 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 미생물 단백질에 포함되거나 분비되거나(예를 들어 신호 펩티드를 포함한다) 막관통 도메인을 포함하는 미생물 서열 변이체가 바람직하다. 특히, 분비된 단백질(또는 신호 펩티드를 갖는 단백질)에 포함되는 미생물 서열 변이체가 바람직한데, 이는 분비된 엑소좀에 함유되는 분비된 성분 또는 단백질이 APC에 의해 보다 제시되기 쉽기 때문이다.
미생물 서열 변이체를 함유하는 미생물 단백질의 세포 국소화를 결정하기 위해, 단계 (v)는 바람직하게는 세포 국소화 결정 전에, 미생물 서열 변이체를 함유하는 미생물 단백질의 서열의 식별을 추가로 포함한다.
세포 국소화, 특히 단백질이 분비되거나 막관통 도메인을 포함하는지를 숙련가에게 주지된 방법에 의해 인실리코 또는 시험관내 시험할 수 있다. 예를 들어, "SignalP 4.1 서버"(덴마크 기술 대학교(DTU)의 생물학 서열 분석 센터; URL: www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) 및/또는 "포비어스(Phobius)"(조합된 막관통 토폴로지 및 신호 펩티드 예측기, 스톡홀름 생물정보학 센터; URL: phobius.sbc.su.se)가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 2개의 예측 툴(예를 들어 SignalP 4.1 서버 및 포비어스)가 조합될 수 있다.
예를 들어, 단백질이 분비되는지를 시험하기 위해, 신호 펩티드의 존재가 평가될 수 있다. 신호 펩티드는 진핵생물에서 세포질 막을 가로지르는 전좌를 위한 이의 패신저(카고(cargo)) 단백질을 표적화하는 보편적인 단백질-분류 신호이다. 신호 펩티드의 존재를 시험하기 위해, 예를 들어 "SignalP 4.1 서버"(덴마크 기술 대학교(DTU)의 생물학 서열 분석 센터; URL: www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) 및/또는 "포비어스"(조합된 막관통 토폴로지 및 신호 펩티드 예측기, 스톡홀름 생물정보학 센터; URL: phobius.sbc.su.se)가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 2개의 예측 툴(예를 들어 SignalP 4.1 서버 및 포비어스)이 조합될 수 있다.
또한, 단백질이 막관통 도메인을 포함하는지가 결정될 수 있다. 신호 펩티드 및 막관통 도메인 둘 모두는 소수성이나, 막관통 나선은 전형적으로 보다 긴 소수성 영역을 갖는다. 예를 들어, SignalP 4.1 서버 및 포비어스는 막관통 도메인으로부터 신호 펩티드를 구별하는 능력을 갖는다. 바람직하게는, 최소 수의 2개의 예측된 막관통 나선은 막과 세포질 단백질 사이를 구별하도록 설정되어 최종 컨센서스 목록을 전달한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 상기에 기재된 단계 (iv) 및 상기에 기재된 단계 (v)를 포함한다. 바람직하게는, 단계 (iv) 후에 단계 (v)가 뒤따른다. 또한, 단계 (v) 후에 단계 (iv)가 뒤따르는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 방법이 하기 단계를 포함하는 것이 또한 바람직하다:
- 미생물 서열 변이체를 포함하는 미생물 단백질에 애노테이션을 수행하는 단계.
애노테이션 단계는 기준 데이터베이스, 예를 들어 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 및/또는 미국 국립 생물공학정보 센터(NCBI) 기준 서열 데이터베이스(RefSeq)에 대한 (BLAST-기반) 비교에 의해 수행될 수 있다. RefSeq는 게놈 DNA, 전사체 및 단백질을 포함하는, 통합되고 중복되지 않은 서열 세트를 제공한다. KEGG에서, KO(KEGG 오쏠로지(Orthology)) 데이터베이스에 저장된 분자-수준 기능이 사용될 수 있다. 이러한 기능은 공통 선조로부터 진화한 상이한 종의 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 함유하는 오쏘로그(orthologue)의 군으로 분류된다.
상기에 기재된 바와 같이, 인간 항원 에피토프의 미생물 서열 변이체는, (완전) 인간 에피토프와 비교하여, 인간 펩티드를 정확히 인식할 수 있는 T 세포가 자기 항원을 인식하여 성숙 동안 고갈되었다는 점에서 유리하며, 이는 미생물 서열 변이체의 경우 그러하지 않다. 따라서, 미생물 서열 변이체는 증가된 면역원성을 제공한다. 또한, 당분야에 주지된 바와 같이, MHC(HLA) 결합(상기에 기재된 바와 같이 확인/시험될 수 있음)이 T 세포 면역원성에 대한 지표인 것이 당분야에 공지되어 있다.
그러나, 미생물 서열 변이체의 면역원성은 (단독으로 또는 상응하는 인간 에피토프와 비교하여) 또한 (예를 들어 이의 증가된 면역원성을 확인하기 위해) (추가적으로) 시험될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법이 하기 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다:
(vi) 미생물 서열 변이체의 면역원성을 시험하는 단계.
숙련가는, 인실리코, 시험관내 및 생체내/생체외 시험을 포함하는 다양한 면역원성 시험 방법에 친숙하다. 일반적으로, 면역원성 시험을 위한 분석의 예는 스크리닝 분석, 예컨대 ADA(항-약물 항체) 스크리닝, 확인 분석, 적정 및 동형 분석, 및 중화 항체를 사용하는 분석을 포함한다. 상기 분석에 대한 플랫폼/분석 포맷의 예는 ELISA 및 브리징(bridging) ELISA, 전자화학발광(ECL) 및 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery; MSD), 유세포 분석법, SPEAD(산 해리를 동반한 고체 상 추출), 방사선 면역 침전(RIP), 표면 플라스몬 공명(SPR), 비드(bead)-기반 분석, 바이오레이어 간섭 분석, 바이오센서 분석 및 바이오 분석(예컨대 세포 증식 분석)을 포함한다. 다양한 분석이 예를 들어 문헌[Review article Meenu Wadhwa, Ivana Knezevic, Hye-Na Kang, Robin Thorpe: Immunogenicity assessment of biotherapeutic products: An overview of assays and their utility, Biologicals, Volume 43, Issue 5, 2015, Pages 298-306, ISSN 1045-1056, https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2015.06.004]에 보다 상세히 기재되어 있고, 이는 본원에 참고로 포함된다. 또한, 면역원성 시험에 대한 가이드라인은 FDA에 의해 제공된다(Assay development and validation for immunogenicity testing for therapeutic protein products. Guidance for Industry. FDA, 2016). 인실리코 면역원성 시험(특히 면역 정보학 툴을 적용함)은 특히 상기에 기재된 인실리코 MHC(HLA) 결합 시험을 포함한다.
구체적 예로서, 시험 물질(예를 들어 임의의 적합한 투여 형태의 미생물 서열 변이체)은 개체(동물 또는 인간)에게 면역을 위해 투여될 수 있다. 이후, 개체의 면역 반응은 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 면역 세포, 예컨대 비장 세포는 예를 들어 면역 세포(예를 들어 비장 세포)의 시토카인 방출(예를 들어 IFNγ)을 예를 들어 ELISA에 의해 측정함으로써 평가될 수 있다. 대안적으로, ADA(항-약물 항체)가 또한 평가될 수 있다.
다른 주지된 분석의 예는 MHC 다량체 분석, 예컨대 사량체 분석(예를 들어 문헌[Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH, McHeyzer-Williams MG, Bell JI, McMichael AJ, Davis MM. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 1996 Oct 4;274(5284):94-6]에 기재된 바와 같음) 또는 오량체 분석을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 세포 독성 T 세포에 대한 면역원성(또는 세포 독성 T 세포 반응)은 구체적으로 세포 독성 T 세포 반응을 평가함으로써 시험된다. 특히, 세포 독성 분석이 수행될 수 있다. 예를 들어, 시험 물질(예를 들어 임의의 적합한 투여 형태의 미생물 서열 변이체)이 종양(미생물 서열 변이체에 상응하는 항원을 발현함)을 갖는 개체(동물 또는 인간)에게 투여될 수 있고, 종양 크기가 관찰/측정된다. 또한, 세포 독성은 예를 들어 종양 세포주(미생물 서열 변이체에 상응하는 항원을 발현함)를 사용함으로써 시험관내 시험될 수 있다.
세포 독성 분석, 특히 T 세포 독성 분석은 상기에 기재된 면역원성 분석과 같이 또는 상기에 기재된 (다른) 면역원성 분석에 더하여 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 하기 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다:
(vi) 미생물 서열 변이체의 세포 독성을 시험하는 단계.
바람직하게는, 미생물 서열 변이체의 T 세포 독성이 시험된다.
바람직하게는, 미생물 서열 변이체에 상응하는 항원을 발현하는 특이적 세포에 관한 세포 독성이 (상기에 기재된 바와 같이) 시험된다.
바람직하게는, 종양-관련된 항원 에피토프 서열(이의 미생물 서열 변이체가 식별됨)은 서열번호 1 내지 5, 55 내지 65 및 126 내지 131 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어, 종양-관련된 항원 에피토프 서열(이의 미생물 서열 변이체가 식별됨)은 서열번호 58 또는 59에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어, 종양-관련된 항원 에피토프 서열(이의 미생물 서열 변이체가 식별됨)은 서열번호 131에 설정된 아미노산 서열을 갖는다. 구체적 실시양태에서, 종양-관련된 항원 에피토프 서열(이의 미생물 서열 변이체가 식별됨)은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
약제의 제조 방법
추가적 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 바람직하게는 암의 예방용 및/또는 치료용 약제의 제조 방법을 제공한다:
(a) 상기에 기재된 본 발명에 따른 방법에 따라 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체를 식별하는 단계; 및
(b) 미생물 서열 변이체(즉, 펩티드 또는 핵산)를 포함하는 약제를 제조하는 단계.
바람직하게는, 약제는 백신이다. 본 발명에 있어서 사용된 바와 같이, 용어 "백신"은 전형적으로 특정 질병, 바람직하게는 암에 대한 선천 및/또는 적응 면역력을 제공하는 생물학적 제제를 지칭한다. 따라서, 백신은 특히 치료받을 개체의 면역계의 선천 및/또는 적응 면역 반응을 지원한다. 예를 들어, 본원에 기재된 미생물 서열 변이체는 전형적으로 치료받을 환자의 적응 면역 반응을 야기하거나 지원한다. 백신은 선천 면역 반응을 야기하거나 지원할 수 있는 보조제를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 약제의 제조, 즉, 본 발명에 따른 약제의 제조 방법의 단계 (b)는 나노 입자에 미생물 서열 변이체, 또는 미생물 서열 변이체를 포함하는 폴리펩티드/단백질(또는 미생물 서열 변이체를 포함하는 핵산 분자)를 적재함을 포함하되, 상기 미생물 서열 변이체는 바람직하게는 상기에 기재된 펩티드이다. 특히, 나노 입자는 미생물 서열 변이체(미생물 서열 변이체를 포함하는 폴리펩티드/단백질/핵산)의 전달을 위해 사용되며, 임의적으로 또한 보조제로서 작용할 수 있다. 미생물 서열 변이체(미생물 서열 변이체를 포함하는 폴리펩티드/단백질/핵산)는 전형적으로 나노 입자 내에 캡슐화되거나 나노 입자의 표면("코팅")에 결합된다(장식된다). 특히 백신으로서 사용하기 위한 나노 입자는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Shao K, Singha S, Clemente-Casares X, Tsai S, Yang Y, Santamaria P (2015): Nanoparticle-based immunotherapy for cancer, ACS Nano 9(1):16-30]; [Zhao L, Seth A, Wibowo N, Zhao CX, Mitter N, Yu C, Middelberg AP (2014): Nanoparticle vaccines, Vaccine 32(3):327-37]; 및 [Gregory AE, Titball R, Williamson D (2013) Vaccine delivery using nanoparticles, Front Cell Infect Microbiol. 3:13, doi: 10.3389/fcimb.2013.00013. eCollection 2013, Review]에 기재된 바와 같다. 종래의 접근법과 비교하여, 나노 입자는 페이로드(payload)(항원/보조제)를 주위 생물학적 환경으로부터 보호하거나 이의 반감기를 증가시키거나 이의 전신 독성을 최소화하거나 APC로의 이의 전달을 촉진하거나 심지어 TAA-특이적 T 세포의 활성화을 직접 촉발시킬 수 있다. 바람직하게는, 나노 입자는 300 nm 이하, 보다 바람직하게는 200 nm 이하, 가장 바람직하게는 100 nm 이하의 크기(직경)를 갖는다. 이러한 나노 입자는 순환에서의 높은 구조적 완전성 및 긴 순환 시간에 의해 적절하게 포식 세포 흡수로부터 보호되고 종양 성장의 부위에서 축적될 수 있고 종양 덩어리 내로 깊게 침투할 수 있다.
나노 입자의 예는 중합체성 나노 입자, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 폴리 (D,L-락트산코-글리콜산)(PLGA); 무기 나노 입자, 예컨대 금 나노 입자, 산화 철 비드, 산화 철 산화 아연 나노 입자, 탄소 나노 튜브 및 메조 다공성 실리카 나노 입자; 리포좀, 예컨대 양이온성 리포좀; 면역 자극 복합체(ISCOM); 바이러스 유사 입자(VLP); 및 자기-조립된 단백질을 포함한다.
중합체성 나노 입자는 중합체, 예컨대 폴리(d,l-락티드-코-글리콜리드)(PLG), 폴리(d,l-락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(g-글루탐산)(g-PGA), 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 폴리스티렌을 기반으로 하는/포함하는 나노 입자이다. 중합체성 나노 입자는 항원(예를 들어 미생물 서열 변이체 또는 이를 포함하는 (폴리)펩티드)를 포착할 수 있거나 항원(예를 들어 미생물 서열 변이체 또는 이를 포함하는 (폴리)펩티드)에 결합/접합될 수 있다. 중합체성 나노 입자는 예를 들어 특정 세포로의 전달을 위해 사용될 수 있거나 이의 느린 생분해 속도로 인해 항원 방출을 지속시킬 수 있다. 예를 들어, g-PGA 나노 입자는 소수성 항원을 캡슐화시키는 데 사용될 수 있다. 폴리스티렌 나노 입자는 다양한 작용기에 의해 표면-변형될 수 있기 때문에 다양한 항원에 접합될 수 있다. 중합체, 예컨대 폴리(L-락트산)(PLA), PLGA, PEG, 및 천연 중합체, 예컨대 폴리사카라이드가 또한 일종의 나노 크기의 친수성 3-차원 중합체 네트워크인 하이드로겔 나노 입자를 합성하는 데 사용될 수 있다. 나노 겔은, 유연한 메쉬 크기, 다가 접합을 위한 큰 표면적, 높은 함수량, 및 항원에 대한 높은 적재 용량을 포함하는 유리한 특성을 갖는다. 따라서, 바람직한 나노 입자는 나노 겔, 예컨대 키토산 나노 겔이다. 바람직한 중합체성 나노 입자는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 폴리 (D,L-락트산-코-글리콜산)(PLGA)을 기반으로 하는/포함하는 나노 입자이다.
무기 나노 입자는 무기 물질을 기반으로 하는/포함하는 나노 입자이며, 이러한 나노 입자의 예는 금 나노 입자, 산화 철 비드, 산화 철 산화 아연 나노 입자, 탄소 나노 입자(예를 들어 탄소 나노 튜브) 및 메조 다공성 실리카 나노 입자를 포함한다. 무기 나노 입자는 강성 구조 및 제어가능한 합성을 제공한다. 예를 들어, 금 나노 입자는 용이하게 상이한 모양, 예컨대 구, 막대, 큐브로 제조될 수 있다. 무기 나노 입자는 예를 들어 탄수화물에 의해 표면-변형될 수 있다. 탄소 나노 입자는 양호한 생체 적합성을 제공하고, 예를 들어 나노 튜브 또는 (메조 다공성) 구로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체(또는 이를 포함하는 (폴리)펩티드)의 다수의 카피는 탄소 나노 입자, 예를 들어 탄소 나노 튜브에 접합될 수 있다. 메조 다공성 탄소 나노 입자는 경구 투여를 위해 바람직하다. 실리카-기반 나노 입자(SiNP)가 또한 바람직하다. SiNP는 생체 적합하고, 선택적 종양 표적화 및 백신 전달에 있어서 훌륭한 특성을 나타낸다. SiNP의 표면 상의 풍부한 실란올 기는, 추가적 기능, 예컨대 세포 인식, 특정 생체 분자의 흡수, 세포와의 상호작용의 개선, 및 세포 섭취의 증진을 도입하는 추가적 변형을 위해 사용될 수 있다. 메조 다공성 실리카 나노 입자가 특히 바람직하다.
리포좀은 전형적으로 인지질, 예컨대 1,2-다이올레오일-3-트라이메틸암모늄 프로판(DOTAP)에 의해 형성된다. 일반적으로, 양이온성 리포좀이 바람직하다. 리포좀은 인지질 이중층 쉘 및 수성 코어에 의해 자기-조립된다. 리포좀은 단일층상 소포체(단일 인지질 이중층을 가짐) 또는 다중층상 소포체(물의 층으로 분리된 여러 동심원 인지질 쉘을 가짐)로서 생성될 수 있다. 따라서, 항원은 코어 내에 또는 상이한 층/쉘 사이에 캡슐화될 수 있다. 바람직한 리포좀 시스템은 인간 사용을 위해 승인된 것, 예컨대 인플렉살(Inflexal, 등록상표) V 및 에팍살(Epaxal, 등록상표)이다.
면역 자극 복합체(ISCOM)는 약 40 nm(직경)의 케이지(cage) 유사 입자이며, 이는 사포닌 보조제 Quil A, 콜레스테롤, 인지질 및 (폴리)펩티드 항원(예컨대 미생물 서열 변이체 또는 이를 포함하는 폴리펩티드)로 이루어진 콜로이드성 사포닌 함유 미셀이다. 이들 구형 입자는 비극성 상호작용에 의해 항원을 포착할 수 있다. 2개의 유형의 ISCOM은 콜레스테롤, 인지질(전형적으로 포스파티딜에탄올아민 또는 포스-파티딜콜린) 및 사포닌(예컨대 QuilA)으로 구성된 것으로 기재되어 있다.
바이러스 유사 입자(VLP)는 생체 적합한 캡시드 단백질의 자기-조립체에 의해 형성된 자기-조립성 나노 입자이다. 자연적으로 최적화된 나노 입자 크기 및 반복적은 구조 순서 때문에, VLP는 강한 면역 반응을 유발할 수 있다. VLP는 20 내지 800 nm 범위, 전형적으로 20 내지 150 nm 범위의 크기의 다양한 바이러스로부터 유래될 수 있다. VLP는, 추가적 펩티드 또는 단백질을 발현하도록, 이들 펩티드/단백질을 입자에 융합시키거나 다수의 항원을 발현함으로써, 조작될 수 있다. 또한, 항원은 바이러스 표면에 화학적으로 커플링되어 생체 접합체 VLP를 생성할 수 있다.
자기-조립된 단백질의 예는 페리틴(ferritin) 및 주요 볼트 단백질(major vault protein; MVP)을 포함한다. 페리틴은 거의 구형인 10 nm 구조 내로 자기-조립될 수 있는 단밸이다. MVP의 96개의 단위는 배럴-모양의 볼트 나노 입자 내로 자기-조립될 수 있으며, 크기는 약 40 nm의 너비 및 70 nm의 길이를 갖는다. 최소 상호작용 도메인과 유전적으로 융합하는 항원은 MVP와 혼합시 자기-조립 공정에 의해 볼트 나노 입자 내부에 패키징될 수 있다. 따라서, 항원(예컨대 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체를 포함하는 폴리펩티드의 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체)은 자기-조립성 단백질 또는 이의 단편/도메인, 예컨대 MVP의 최소 상호작용 도메인에 융합될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 자기-조립성 단백질(또는 이의 단편/도메인) 및 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
일반적으로, 나노 입자(NP)의 바람직한 예는 산화 철 비드, 폴리스티렌 미소 구체, 폴리(γ-글루탐산)(γ-PGA) NP, 산화 철-산화 아연 NP, 양이온화된 젤라틴 NP, 플루로닉-안정화된 폴리(프로필렌 설파이드)(PPS) NP, PLGA NP, (양이온성) 리포좀, (pH-반응성) 중합체성 미셀, PLGA, 암 세포 막 코팅된 PLGA, 지질-칼슘-포스페이트(LCP) NP, 리포좀-프로타민-히알우론산 (LPH) NP, 폴리스티렌 라텍스 비드, 자성 비드, 철-덱스트란 입자 및 양자점 나노 결정을 포함한다.
바람직하게는, 단계 (b)는, 나노 입자에 보조제, 예를 들어 toll-유사 수용체(TLR) 작용제를 적재함을 추가로 포함한다. 이로써, 미생물 서열 변이체(미생물 서열 변이체를 포함하는 폴리펩티드/단백질/핵산)는 보조제와 함께 예를 들어 항원-제시 세포(APC), 예컨대 수지상 세포(DC)로 전달될 수 있다. 보조제는 나노 입자에 의해 캡슐화될 수 있거나 나노 입자의 표면에, 바람직하게는 유사하게 미생물 서열 변이체에 결합/접합될 수 있다.
또한, 약제의 제조, 즉, 본 발명에 따른 약제의 제조 방법의 단계 (b)가, 박테리아 세포에 미생물 서열 변이체를 적재함을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 박테리아 세포는 미생물 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하고/하거나 (펩티드로서 또는 폴리펩티드/단백질에 포함된) 미생물 서열 변이체를 발현할 수 있다. 이를 위해, 단계 (b)는 바람직하게는 박테리아 세포를 (본원에 있어서 바람직하게는 핵산인) 미생물 서열 변이체(를 포함하는/암호화하는 핵산 분자)에 의해 변형하는 단계를 포함한다. 이러한 박테리아 세포는 "살아있는 박테리아 백신 벡터"로서 제공될 수 있고, 상기 살아있는 박테리아 세포(예컨대 박테리아 또는 박테리아 포자, 예를 들어 내생 포자, 외생 포자 또는 미생물 낭포)는 백신으로서 제공될 수 있다. 이의 바람직한 예는 문헌[da Silva et al., J Microbiol. 2015 Mar 4;45(4):1117-29]에 기재되어 있다.
박테리아 세포(예컨대 박테리아 또는 박테리아 포자, 예를 들어 내생 포자, 외생 포자 또는 미생물 낭포), 특히 (전체) 소화관 박테리아 종이 유리할 수 있는데, 이는 이들이 함유하는 (폴리)펩티드 또는 핵산보다 큰 면역 반응을 촉발하는 잠재력을 갖기 때문이다. 바람직하게는, 박테리아 세포는 소화관 박테리아 세포, 즉 소화관에 사는 (박테리아의) 박테리아 세포이다.
대안적으로, 본 발명에 따른 박테리아 세포, 특히 소화관 박테리아는, 즉, 살아있는 소화관 박테리아의 프로바이오틱스(probiotics)의 형태로 존재할 수 있고, 따라서 이는 이것이 제공할 수 있는 건강상 이점 때문에 식품 보조제로서 사용될 수 있다. 이는 예를 들어 과립, 환약 또는 캡슐 내에 동결건조될 수 있거나 소비를 위한 유제품과 함께 직접 혼합될 수 있다.
바람직하게는, 약제의 제조, 즉, 본 발명에 따른 약제의 제조 방법의 단계 (b)는 약학 조성물의 제조를 포함한다. 이러한 약학 조성물은 바람직하게는 하기를 포함한다:
(i) 미생물 서열 변이체,
(ii) 미생물 서열 변이체를 포함하는 (재조합) 단백질,
(iii) 미생물 서열 변이체를 포함하는 (면역원성) 화합물,
(iv) 미생물 서열 변이체가 적재된 나노 입자,
(v) 미생물 서열 변이체가 적재된 항원-제시 세포,
(vi) 미생물 서열 변이체를 발현하는 숙주 세포, 예컨대 박테리아 세포, 또는
(vii) 미생물 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자; 및
임의적으로, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제.
본 발명에 따른 약제, 특히 약학 조성물 및 백신의 제조에 있어서 유용한 제형화 공정 기술은 문헌["Part 5 of Remington's "The Science and Practice of Pharmacy", 22nd Edition, 2012, University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins"]에 제공된다.
본원에 사용된 재조합 단백질은 자연적으로 발생하지 않는 단백질, 예를 들어 미생물 서열 변이체 및 추가적 성분을 포함하는 융합 단백질이다.
용어 "면역원성 화합물"은 본원에 정의된 미생물 서열 변이체를 포함하는 화합물을 지칭하며, 이는 또한 이를 투여받은 개체에서 미생물 서열 변이체에 대한 면역학적 반응을 유발하거나 유지하거나 지원할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 화합물은 하나 이상의 미생물 서열 변이체, 또는 대안적으로 단백질, 예컨대 담체 단백질, 또는 보조제에 결합된 상기 미생물 서열 변이체를 포함하는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 담체 단백질은 일반적으로 카고, 예컨대 미생물 서열 변이체를 수송할 수 있는 단백질이다. 예를 들어, 담체 단백질은 이의 카고를 막을 가로질러 수송할 수 있다.
추가적 성분으로서, 약학 조성물은 특히 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 비히클을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체는 전형적으로 액체 또는 비-액체 기반의 본 발명의 약학 조성물을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물이 액체 형태로 제공되는 경우, 담체는 전형적으로 무-발열원 물; 등장성 염수 또는 완충된 (수성) 용액, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 등의 완충된 용액일 것이다. 특히 본 발명의 약학 조성물의 주사를 위해, 나트륨 염, 바람직하게는 30 mM 이상의 나트륨 염, 칼슘 염, 바람직하게는 0.05 mM 이상의 칼슘 염, 및 임의적으로 칼륨 염, 바람직하게는 1 mM 이상의 칼륨 염을 함유하는, 물 또는 바람직하게는 완충액, 보다 바람직하게는 수성 완충액이 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에 따라, 나트륨 염, 칼슘 염, 및 임의적으로, 칼륨 염이 이들의 할로게나이드, 예를 들어 클로라이드, 요오다이드 또는 브로마이드의 형태, 또는 이들의 하이드록사이드, 카보네이트, 수소 카보네이트 또는 설페이트 등의 형태로 발생할 수 있다. 비제한적으로, 나트륨 염의 예는 예를 들어 NaCl, NaI, NaBr, Na2CO3, NaHCO3, Na2SO4를 포함하고, 임의적 칼륨 염의 예는 예를 들어 KCl, KI, KBr, K2CO3, KHCO3, K2SO4를 포함하고, 칼슘 염의 예는 예를 들어 CaCl2, CaI2, CaBr2, CaCO3, CaSO4, Ca(OH)2를 포함한다. 추가적으로, 전술된 양이온의 유기 음이온이 완충액에 함유될 수 있다. 보다 바람직한 실시양태에 따라, 상기에 정의된 바와 같이 주사 목적에 적합한 완충액은 나트륨 클로라이드(NaCl), 칼슘 클로라이드(CaCl2) 및 임의적으로 칼륨 클로라이드(KCl)로부터 선택된 염을 함유할 수 있되, 여기서 추가적 음이온이 클로라이드 외에 존재할 수 있다. 또한, CaCl2는 또 다른 염, 예컨대 KCl로 대체될 수 있다. 전형적으로, 주사 완충액의 염은 30 mM 이상의 나트륨 클로라이드(NaCl), 1 mM 이상의 칼륨 클로라이드(KCl) 및 0.05 mM 이상의 칼슘 클로라이드(CaCl2)의 농도로 존재한다. 주사 완충액은 특정 기준 매질에 관하여 고장성, 등장성 또는 저장성일 수 있다, 즉, 완충액은 특정 기준 매질에 관하여 높거나 같거나 낮은 염 함량을 가질 수 있고, 여기서 바람직하게는 삼투 또는 다른 농도 효과에 기인한 세포의 손상을 야기하지 않는 전술된 염의 농도가 사용될 수 있다. 기준 매질은 예를 들어 "생체내" 방법에서 발생하는 액체, 예컨대 혈액, 림프액, 세포액 또는 다른 체액, 또는 예를 들어 "시험관내" 방법에서 기준 매질로서 사용될 수 있는 액체, 예컨대 통상적 완충액 또는 액체이다. 상기 통상적 완충액 또는 액체는 숙련가에게 공지되어 있다. 염수(0.9% NaCl) 및 링거-락테이트 용액이 액체 기재로서 특히 바람직하다.
또한, 하나 이상의 양립성 고체 또는 액체 충전제 또는 희석제 또는 캡술화 화합물이 본 발명의 약학 조성물에 또한 사용될 수 있고, 이는 치료받을 개체에게 투여하기에 적합하다. 본원에 사용된 용어 "양립성"은 본 발명의 약학 조성물의 구성성분이, 전형적인 사용 조건 하에 본 발명의 약학 조성물의 약학적 효과를 실질적으로 감소시키는 상호작용이 발생하지 않도록, 본원에 정의된 미생물 서열 변이체와 혼합될 수 있음을 의미한다. 약학적으로 허용되는 담체, 충전제 및 희석제는 당연히 충분히 높은 순도 및 충분히 낮은 독성을 가져 이를 치료받을 개체에게 투여하기 위해 적합하도록 만들어야 한다. 약학적으로 허용되는 담체, 충전제 또는 이들의 구성성분으로서 사용될 수 있는 화합물의 몇몇 예는 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 또는 감자 전분; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트; 분말화된 트라라칸트; 말트; 젤라틴; 탈로우; 고체 활택제, 예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘; 칼슘 설페이트; 식물성 오일, 예컨대 땅콩 오일, 면실 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 테오브로마 오일; 폴리올, 예컨대폴리프로필렌 글리콜, 글리세롤, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 알긴산이다.
바람직하게는, 본원에 기재된 미생물 서열 변이체 또는 미생물 서열 변이체를 포함하는 폴리펩티드는, 예를 들어 공유 또는 비-공유 결합에 의해 면역-보조제 특성을 갖는, 예컨대 CD4+ Th1 세포의 자극을 제공하는 단백질/펩티드에 결합에 공동-투여되거나 결합될 수 있다. 본원에 기재된 미생물 서열 변이체는 바람직하게는 MHC 클래스 I에 결합하지만, CD4+ 헬퍼 에피토프가 효율적인 면역 반응을 제공하는 데 추가적으로 사용될 수 있다. Th1 헬퍼 세포는, 인터페론-감마(IFN-γ), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 및 인터류킨-2(IL-2)를 분비시키고 DC 및 T 세포 상의 공자극 신호의 발현을 증진시킴으로써 효율적인 수지상 세포(DC) 활성화 및 특이적 CTL 활성화를 지속시킬 수 있다(문헌[Galaine et al., Interest of Tumor-Specific CD4 T Helper 1 Cells for Therapeutic Anticancer Vaccine. Vaccines (Basel). 2015 Jun 30;3(3):490-502]).
예를 들어, 보조제 펩티드/단백질은 바람직하게는 면역 기억을 상기시키거나 비-특이적 도움을 제공하는 비-종양 항원일 수 있거나, 특정 종양-유래된 헬퍼 펩티드일 수 있다. 여러 헬퍼 펩티드는 비특이적 T 세포 도움을 제공하기 위한 것으로 기재되어 있고 예컨대 파상풍 헬퍼 펩티드, 키홀 림펫(keyhole limpet) 혈색소 펩티드 또는 PADRE 펩티드이다(문헌[Adotevi et al., Targeting antitumor CD4 helper T cells with universal tumor-reactive helper peptides derived from telomerase for cancer vaccine. Hum Vaccin Immunother. 2013 May;9(5):1073-7]; [Slingluff.The present and future of peptide vaccines for cancer: single or multiple, long or short, alone or in combination? Cancer J. 2011 Sep-Oct;17(5):343-50). 따라서, 파상풍 헬퍼 펩티드, 키홀 림펫 혈색소 펩티드 및 PADRE 펩티드는 상기 보조제 펩티드/단백질의 바람직한 예이다. 또한, 특정 종양-유래된 헬퍼 펩티드가 바람직하다. 특정 종양-유래된 헬퍼 펩티드는 전형적으로 MHC 클래스 II, 특히 HLA-DR, HLA-DP 또는 HLA-DQ에 의해 제시된다. 특정 종양-유래된 헬퍼 펩티드는 공유된 과발현된 종양 항원, 예컨대 HER2, NY-ESO-1, hTERT 또는 IL13RA2의 서열의 단편일 수 있다. 이러한 단편은 바람직하게는 10개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 11개 이상의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 12개 이상의 아미노산, 가장 바람직하게는 13개 이상의 아미노산의 길이를 갖는다. 특히, 13 내지 24개의 아미노산의 길이를 갖는, 공유된 과발현된 종양 항원, 예컨대 HER2, NY-ESO-1, hTERT 또는 IL13RA2의 단편이 바람직하다. 바람직한 단편은 MHC 클래스 II에 결합하고, 따라서 예를 들어 IEDB(Immune epitope database and analysis resource; Supported by a contract from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, a component of the National Institutes of Health in the Department of Health and Human Services　; URL: http://www.iedb.org/; http://tools.iedb.org/mhcii/)의 MHC 클래스 II 결합 예측 툴을 사용하여 식별될 수 있다.
바람직한 헬퍼 펩티드의 추가적 예는 UCP2 펩티드(예를 들어 WO 2013/135553 A1 또는 문헌[Dosset M, Godet Y, Vauchy C, Beziaud L, Lone YC, Sedlik C, Liard C, Levionnois E, Clerc B, Sandoval F, Daguindau E, Wain-Hobson S, Tartour E, Langlade-Demoyen P, Borg C, Adotevi O: Universal cancer peptide-based therapeutic vaccine breaks tolerance against telomerase and eradicates established tumor. Clin Cancer Res. 2012 Nov 15;18(22):6284-95. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-12-0896. Epub 2012 Oct 2]에 기재되어 있음) 및 BIRC5 펩티드(예를 들어 EP2119726 A1 또는 문헌[Widenmeyer M, Griesemann H, Stevanoviζ S, Feyerabend S, Klein R, Attig S, Hennenlotter J, Wernet D, Kuprash DV, Sazykin AY, Pascolo S, Stenzl A, Gouttefangeas C, Rammensee HG: Promiscuous survivin peptide induces robust CD4+ T-cell responses in the majority of vaccinated cancer patients. Int J Cancer. 2012 Jul 1;131(1):140-9. doi: 10.1002/ijc.26365. Epub 2011 Sep 14]에 기재되어 있음)를 포함한다. 가장 바람직한 헬퍼 펩티드는 UCP2 펩티드(아미노산 서열: KSVWSKLQSIGIRQH; 서열번호 159, 예를 들어 WO 2013/135553 A1 또는 문헌[Dosset M, Godet Y, Vauchy C, Beziaud L, Lone YC, Sedlik C, Liard C, Levionnois E, Clerc B, Sandoval F, Daguindau E, Wain-Hobson S, Tartour E, Langlade-Demoyen P, Borg C, Adotevi O: Universal cancer peptide-based therapeutic vaccine breaks tolerance against telomerase and eradicates established tumor. Clin Cancer Res. 2012 Nov 15;18(22):6284-95. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-12-0896. Epub 2012 Oct 2]에 기재된 바와 같음)이다.
따라서, 약학 조성물, 특히 백신은, 이의 면역원성을 추가로 증가시키기 위해 하나 이상의 보조 물질, 바람직하게는 상기에 기재된 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다. 상기에 정의된 미생물 서열 변이체 및 보조 물질(임의적으로, 본원에 기재된 본 발명의 백신에 함유될 수 있음)의 상승작용은 바람직하게는 이로써 달성된다. 다양한 유형의 보조 물질에 따라, 다양한 메커니즘이 이와 관련하여 고려될 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포(DC)의 성숙을 허용하는 화합물, 예를 들어 리포폴리사카라이드, TNF-알파 또는 CD40 리간드는 적합한 보조 물질의 제1 클래스를 형성한다. 일반적으로, 보조 물질로서, "위험 신호" 방식으로 면역계에 영향을 주는 임의의 제제(LPS, GP96 등), 또는 본 발명에 따른 면역 자극 보조제에 의해 생성된 면역 반응이 표적화된 방법으로 증진되고/되거나 영향을 받도록하는 시토카인, 예컨대 GM-CSF를 사용하는 것이 가능하다. 특히 바람직한 보조 물질은 시토카인, 예컨대 모노카인, 림포카인, 인터류킨 또는 케모카인(이는 추가로 선천 면역 반응을 촉진함), 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-베타 또는 TNF-알파, 성장 인자, 예컨대 hGH이다.
가장 바람직하게는, 보조제는 몬타니드(Montanide), 예컨대 몬타니드 ISA 51 VG 및/또는 몬타니드 ISA 720 VG이다. 이들 보조제는 수계 항원 배지와 혼합될 때 안정한 유중수 유화액을 제공한다. 몬타니드 ISA 51 VG는 만니드 모노올레에이트(mannide monooleate) 계면활성제 및 미네랄 오일의 블렌드를 기반으로 하는 반면에, 몬타니드 ISA 720 VG는 비-미네랄 오일을 사용한다(문헌[Aucouturier J, Dupuis L, Deville S, Ascarateil S, Ganne V. Montanide ISA 720 and 51: a new generation of water in oil emulsions as adjuvants for human vaccines. Expert Rev Vaccines. 2002 Jun;1(1):111-8]; [Ascarateil S, Puget A, Koziol M-E. Safety data of Montanide ISA 51 VG and Montanide ISA 720 VG, two adjuvants dedicated to human therapeutic vaccines. Journal for Immunotherapy of Cancer. 2015;3(Suppl 2):P428. doi:10.1186/2051-1426-3-S2-P428]).
본 발명의 백신에 포함될 수 있는 추가적 첨가제는 유화제, 예컨대 트윈(Tween, 등록상표); 습윤제, 예컨대 나트륨 라우릴 설페이트; 착색제; 맛-전달제, 약학 담체; 정제-형성제; 안정화제; 산화방지제; 방부제이다.
본 발명의 조성물, 특히 본 발명의 백신은 또한, 인간 Toll-유사 수용체 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 또는 TLR10에 대한 결합 친화도(리간드로서) 때문에 또는 뮤린 Toll-like 수용체 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 또는 TLR13에 대한 결합 친화도(리간드로서) 때문에 면역 자극성인 것으로 공지된 임의의 추가적 화합물을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물, 특히 본 발명의 백신에 첨가될 수 있는 화합물의 또 다른 클래스는, 본원에 있어서, CpG 핵산, 특히 CpG-RNA 또는 CpG-DNA일 수 있다. CpG-RNA 또는 CpG-DNA는 단일가닥 CpG-DNA(ss CpG-DNA), 이중가닥 CpG-DNA(dsDNA), 단일가닥 CpG-RNA(ss CpG-RNA) 또는 이중가닥 CpG-RNA(ds CpG-RNA)일 수 있다. CpG 핵산은 바람직하게는 CpG-RNA의 형태, 보다 바람직하게는 단일가닥 CpG-RNA(ss CpG-RNA)의 형태이다. CpG 핵산은 바람직하게는 적어도 하나 이상의 (미토겐) 시토신/구아닌 다이뉴클레오티드 서열(CpG 모티프)을 함유한다. 제1 바람직한 대안에 따라, 이들 서열에 함유된 하나 이상의 CpG 모티프, 특히 CpG 모티프의 C(시토신) 및 G(구아닌)는 메틸화되지 않는다. 이들 서열에 임의적으로 함유되는 모든 추가적 시토신 또는 구아닌은 메틸화되거나 메틸화되지 않는다. 그러나, 추가적 바람직한 대안에서, CpG 모티프의 C(시토신) 및 G(구아닌)는 또한 메틸화된 형태로 존재할 수 있다.
특히 바람직한 보조제는 폴리이노신산:폴리시티딜산("폴리 I:C"로도 지칭됨) 및/또는 이의 유도체 폴리-ICLC이다. 폴리 I:C는 미스매치된 이중가닥 RNA로서, 하나의 가닥이 이노신산의 중합체이고, 나머지 가닥이 시티딜산의 중합체이다. 폴리 I:C는 toll-유사 수용체 3(TLR3)과 상호작용하는 것으로 공지된 면역 자극제이다. 폴리 I:C는 TLR3의 "천연" 자극제인 이중가닥 RNA와 구조적으로 유사하다. 따라서, 폴리 I:C는 이중가닥 RNA의 합성 유사체로서 간주된다. 폴리-ICLC는 카복시메틸셀룰로스, 폴리이노신산-폴리시티딜산, 및 폴리-L-리신 이중가닥 RNA의 합성 복합체이다. 폴리 I:C와 유사하게, 폴리-ICLC가 또한 TLR3에 대한 리간드이다. 폴리 I:C 및 폴리-ICLC는 전형적으로 세포 독성 시토카인의 방출을 자극한다. 폴리-ICLC의 바람직한 예는 힐토놀(Hiltonol, 등록상표)이다.
미생물 서열 변이체 및 이를 포함하는 약제
추가적 양태에서, 본 발명은 또한 바람직하게는 상기에 기재된 미생물 서열 변이체의 식별 방법에 의해 수득되는 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체를 제공한다.
따라서, 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체의 특징, 정의 및 바람직한 실시양태는 미생물 서열 변이체의 식별 방법에 의해 수득되는 미생물 서열 변이체에 대해 상기에 기재된 것에 상응한다. 예를 들어, 미생물 서열 변이체는 50개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 40개 이하의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 30개 이하의 아미노산, 가장 바람직하게는 25개 이하의 아미노산의 길이를 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 미생물 서열 변이체는 바람직하게는 5 내지 50개의 아미노산, 보다 바람직하게는 6 내지 40개의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 7 내지 30개의 아미노산, 가장 바람직하게는 8 내지 25개의 아미노산, 예를 들어 8 내지 24개의 아미노산의 길이를 갖는다. 예를 들어, 미생물 서열 변이체는 바람직하게는 상기에 기재된 바와 같이 8 내지 12개의 아미노산, 보다 바람직하게는 8 내지 10개의 아미노산, 예컨대 9 또는 10개의 아미노산의 길이를 갖는 (박테리아) 펩티드이다. 또한, 미생물 서열 변이체는 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 85% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 상기에 기재된 바와 같이 종양-관련된 항원 에피토프 서열과 공유한다. 특히 바람직하게는, 미생물 서열 변이체는 1, 2 또는 3개의 아미노산, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 아미노산에서만 종양-관련된 항원 에피토프 서열과 상이하다. 달리 말하면, 미생물 서열 변이체가, 종양-관련된 항원 에피토프 서열과 비교하여, 3개 이하의 아미노산 변경(즉, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변경), 보다 바람직하게는 2개 이하의 아미노산 변경(즉, 1 또는 2개의 아미노산 변경)을 포함하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 상기에 기재된 바와 같이, 미생물 서열 변이체의 코어 서열은 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 코어 서열과 동일하되, 상기 코어 서열은 N-말단에 가까운 3개의 아미노산 및 C-말단에 가까운 3개의 아미노산을 제외한 모든 아미노산으로 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 상기에 기재된 바와 같이 미생물 서열 변이체의 식별 방법에 의해 수득된 미생물 서열 변이체에 대해 나타낸 바람직한 실시양태는 그에 맞춰 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체에 적용된다.
본 발명에 따른 미생물 서열 변이체의 특정 예는 서열번호 6 내지 18 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 (폴리)펩티드, 및 상기 (폴리)펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 이들 예는 IL13RA2의 에피토프의 미생물 서열 변이체에 관한 것이다. 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Rα2 또는 IL13RA2)는, 인간에서 IL13RA2 유전자에 의해 암호화되는 막 결합된 단백질이다. 철저한 방식으로, IL13RA2는 잠재적 면역 요법 표적으로서 보고되었다(문헌[Beard et al.; Clin Cancer Res; 72(11); 2012] 참조). IL13RA2의 높은 발현은 추가로 대장암의 침윤, 간 전이 및 불량한 예후와 연관된다(문헌[Barderas et al.; Cancer Res; 72(11); 2012]). 바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체는 서열번호 6 또는 18에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나, 서열번호 6 또는 18에 따른 아미노산 서열을 암호화한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체는 서열번호 18에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나, 서열번호 18에 따른 아미노산 서열을 암호화한다.
IL13RA2의 에피토프의 미생물 서열 변이체의 추가로 바람직한 예는 서열번호 132 내지 141 및 158 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 (폴리)펩티드, 및 상기 (폴리)펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체 서열번호 139에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나, 서열번호 139에 따른 아미노산 서열을 암호화한다.
본 발명에 따른 미생물 서열 변이체의 다른 바람직한 예는 서열번호 66 내지 84 및 126 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 (폴리)펩티드, 및 상기 (폴리)펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 이들 예는 FOXM1(포크헤드 박스(forkhead box) M1)의 에피토프의 미생물 서열 변이체에 관한 것이다. FOXM1은 세포 독성 T 림프구 에피토프로서 식별된 에피토프를 포함하고 다양한 종양 및 암(췌장 종양, 난소암 및 대장암)에서 과발현된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체는 서열번호 75에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나, 서열번호 75에 따른 아미노산 서열을 암호화한다.
또한, 미생물 서열 변이체는 서열번호 33(IISAVVGIA), 34(ISAVVGIV) 또는 35(LFYSLADLI) 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열로 이루어지지 않거나 이를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 미생물 서열 변이체는 서열번호 33 내지 35, 36(ISAVVGIAV), 37(SAVVGIAVT), 38(YIISAVVGI), 39(AYIISAVVG), 40(LAYIISAVV), 41(ISAVVGIAA), 42(SAVVGIAAG), 43(RIISAVVGI), 44(QRIISAVVG), 45(AQRIISAVV), 46(SAVVGIVV), 47(AISAVVGI), 48(GAISAVVG), 49(AGAISAVV) 또는 50(LLFYSLADL) 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열로 이루어지지 않거나 이를 포함하지 않는다. 보다 더 바람직하게는, 미생물 서열 변이체는 서열번호 51(ISAVVG) 및/또는 서열번호 52(SLADLI)에 제시된 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 가장 바람직하게는, 미생물 서열 변이체는, 서열번호 53(IISAVVGIL; Her2/neu의 에피토프) 또는 서열번호 54(LLYKLADLI; ALDH1A1의 에피토프)에 제시된 아미노산 서열을 갖는 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 서열 변이체(본원에 정의된 바와 같음)가 아니다.
추가적 양태에서, 본 발명은 또한 상기에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체를 포함하는 약제를 제공하며, 이는 바람직하게는 상기에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 약제의 제조 방법에 의해 수득가능하다.
따라서, 본 발명에 따른 약제의 특징, 정의 및 바람직한 실시양태는 약제의 제조 방법에 의해 제조된 약제에 대해 상기에 기재된 것에 상응한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 약제는 바람직하게는 상기에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체가 적재된 상기에 기재된 바와 같은 나노 입자를 포함한다. 특히, 상기 나노 입자에 상기에 기재된 바와 같은 보조제를 추가로 적재할 수 있다. 또한, 약제는 바람직하게는 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체를 발현하는 상기에 기재된 바와 같은 박테리아 세포를 포함한다.
바람직하게는, 약제는 하기를 포함한다:
(i) 상기에 기재된 바와 같은 미생물 서열 변이체,
(ii) 상기에 기재된 바와 같은 미생물 서열 변이체를 포함하는 (재조합) 단백질,
(iii) 상기에 기재된 바와 같은 미생물 서열 변이체를 포함하는 (면역원성) 화합물,
(iv) 상기에 기재된 바와 같은 미생물 서열 변이체가 적재된 나노 입자,
(v) 미생물 서열 변이체가 적재된 항원-제시 세포,
(vi) 미생물 서열 변이체를 발현하는, 상기에 기재된 바와 같은 숙주 세포, 예컨대 박테리아 세포, 또는
(vii) 미생물 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자; 및
임의적으로, 상기에 기재된 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제.
바람직하게는, 약제는 약학 조성물이다(약학 조성물의 형태로 존재하거나 약학 조성물로서 제형화된다). 보다 바람직하게는, 약제는 상기에 기재된 바와 같은 백신이다. 또한, 상기에 기재된 바와 같은 약제의 제조 방법에 의해 제조된 약제에 대해 상기에 나타낸 바람직한 실시양태는 그에 맞춰 본 발명에 따른 약제에 적용된다.
본 발명의 조성물, 특히 본 발명의 백신은 또한 본 발명의 약학 조성물에 대해 상기에 정의된 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체, 보조제 및/또는 비히클을 포함할 수 있다. 특정한 본 발명의 조성물에 있어서, 특히 본 발명의 백신에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체의 선택은 본 발명의 조성물, 특히 본 발명의 백신이 투여되는 방식에 의해 원칙적으로 결정된다. 본 발명의 조성물, 특히 본 발명의 백신은 예를 들어 전신으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 전신 투여 경로는 일반적으로 예를 들어 경피, 경구, 비경구 경로(피하, 정맥내, 근육내, 동맥내, 피내 및 복강내 주사를 포함함) 및/또는 비강내 투여 경로를 포함한다. 국소 투여 경로는 예를 들어 국소 투여 경로, 뿐만 아니라 피내, 경피, 피하 또는 근육내 주사, 또는 병변내, 두개내, 폐내, 심장내, 절내(intranodal) 및 설하 주사를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물, 특히 백신은 피내, 피하, 절내 또는 경구 투여될 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명의 조성물, 특히 백신은 피하, 절내 또는 경구 경로로 투여될 수 있다. 특히 바람직하게는, 본 발명의 조성물, 특히 백신은 피하 또는 경구 경로로 투여될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 조성물, 특히 백신은 경구 경로로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물, 특히 본 발명의 백신은 바람직하게는 액체 또는 고체 형태로 제형화된다.
본 발명의 조성물, 특히 본 발명의 백신의 투여하기에 적합한 양은 동물 모델을 사용한 통상적 실험에 의해 결정될 수 있다. 이러한 모델은 비제한적으로 토끼, 양, 마우스, 래트, 개 및 비-인간 영장류 모델을 포함한다. 주사를 위해 바람직한 단위 투여량 형태는 물, 생리 식염수 또는 이들의 혼합물의 멸균 용액을 포함한다. 이러한 용액의 pH는 약 7.4로 조정되어야 한다. 주사를 위해 적합한 담체는 하이드로겔, 제어되거나 지연된 방출을 위한 장치, 폴리락트산 및 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 국소 도포를 위해 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 로션, 크림, 겔 등에서 사용하기에 적합한 것을 포함한다. 본 발명의 조성물, 특히 본 발명의 백신이 경구로 투여되는 경우, 정제, 캡슐 등이 바람직한 단위 투여량 형태이다. 경구 투여를 위해 사용될 수 있는 단위 투여량 형태의 제조를 위한 약학적으로 허용되는 담체는 종래 분야에 주지되어 있다. 이의 선택은 이차 고려사항, 예컨대 맛, 비용 및 저장성에 좌우될 것이며, 이는 본 발명의 목적을 위해 중요하지 않고, 어려움 없이 당업자에 의해 고려될 수 있다.
또한, 상기에 정의된 본 발명의 약학 조성물은 임의의 경구로 허용가능한 투여량 형태(비제한적으로 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함함)로 경구로 투여될 수 있다. 경구 사용을 위한 정제의 경우, 통상적으로 사용되는 담체는 락토스 및 옥수수 전분을 포함한다. 또한, 윤활제, 예컨대 스테아르산 마그네슘이 전형적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여의 경우, 유용한 희석제는 락토스 및 건조된 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁액이 경구 사용에 필요한 경우, 활성 성분, 즉, 상기에 정의된 본 발명의 수송 카고 접합 분자는 유화제 및 현탁제와 조합된다. 필요에 따라, 특정 감미제, 향미제 또는 착색제가 또한 첨가될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 또한, 특히 치료의 표적이 국소 도포에 의해 용이하게 접근가능한 부분 또는 기관을 포함하는 경우(예를 들어 피부 또는 임의의 다른 접근가능한 상피 조직의 질병을 포함함), 국소적으로 투여될 수 있다. 적합한 국소 제형은 이들 부분 또는 기관 각각에 대해 용이하게 제조될 수 있다. 국소 도포를 위해, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 면역 자극성 조성물, 특히 하나 이상의 담체에 현탁되거나 용해된 상기에 정의된 바와 같은 이의 성분을 함유하는 적합한 연고로 제형화될 수 있다. 국소 투여를 위한 담체는 비제한적으로 미네랄 오일, 액체 바셀린, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화성 왁스 및 물을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 약학 조성물은 적합한 로션 또는 크림으로 제형화될 수 있다. 본 발명에 있어서, 적합한 담체는 비제한적으로 미네랄 오일, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스터 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알코올 및 물을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물의 멸균 주사가능한 형태는 수성 또는 유지성 현탁액일 수 있다. 이들 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 당분야에 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 또한, 멸균 주사가능한 제제는 비독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액, 예를 들어 1,3-부탄다이올 중의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매는 물, 링거 용액 및 등장성 나트륨 클로라이드 용액이다. 또한, 멸균의 지방유가 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노- 및 다이-글리세리드를 포함하는 임의의 완하성 지방유가 사용될 수 있다. 지방산, 예컨대 올레산 및 이의 글리세리드 유도체는 천연의 약학적으로 허용되는 오일, 예컨대 올리브 오일 또는 피마자유, 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 버전과 같이 주사제의 제조에 유용하다. 또한, 이들 오일 용액 또는 현탁액은 약학적으로 허용되는 투여량 형태(유화액 및 현탁액을 포함함)의 제형화에서 통상적으로 사용되는 장쇄 알코올 희석제 또는 분산제 예컨대 카복시메틸 셀룰로스 또는 유사한 분산제를 함유할 수 있다. 또한, 통상적으로 사용되는 다른 계면활성제, 예컨대 트윈, 스판(Span), 및 약학적으로 허용되는 고체, 액체 또는 투여량 형태의 제조에서 통상적으로 사용되는 다른 유화제 또는 생체 이용률 증진제가 본 발명의 약학 조성물의 제형화를 위해 사용될 수 있다.
정맥내, 피부 또는 피하 주사, 또는 고통 부위의 주사를 위해, 활성 성분은 바람직하게는 무-발열원이며 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태로 존재할 수 있다. 당업자는 예를 들어 등장성 비히클을 사용하는 적합한 용액, 예컨대 나트륨 클로라이드 주사, 링거 주사, 락테이티드 링거 주사를 제조할 수 있다. 방부제, 안정화제, 완충액, 산화방지제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다. 개체에게 투여할 것이 폴리펩티드, 펩티드 또는 핵산 분자, 또는 본 발명에 따른 다른 약학적으로 유용한 화합물인지에 상관 없이, 투여는 바람직하게는 (경우에 따라) 개체에게 이익을 나타내기에 충분한 "예방적 유효량" 또는 "치료적 유효량"으로 사용된다. 투여되는 실제 양 및 투여의 속도 및 시간 코스는 치료할 것의 성질 및 심각도에 좌우될 것이다.
이에 있어서, 상기 약제가 사용될 때 치료 처방전, 예를 들어 투여량의 결정 등은 전형적으로 일반의 및 다른 의사의 책임 하에 놓이며, 전형적으로 치료할 장애, 개별적 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사에게 공지된 다른 인자를 고려한다. 상기에 언급된 기술 및 프로토콜의 예는 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980]에서 찾아볼 수 있다.
따라서, 본 발명의 약학 조성물은 전형적으로 "안전하고 유효한 양"의 본 발명의 약학 조성물의 성분, 특히 본원에 정의된 미생물 서열 변이체를 포함한다. 본원에 사용된 "안전하고 유효한 양"은 질병 또는 장애의 긍정적 변형을 유의미하게 유발하기에 충분한 본원에 정의된 미생물 서열 변이체의 양, 즉, 추구되는 조직, 시스템, 동물 또는 인간에서의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 본원에 정의된 미생물 서열 변이체의 양을 의미한다. 유효량은 치료할 질병 또는 질환의 증상의 완화를 위한 "치료적 유효량" 및/또는 치료할 질병 또는 질환의 증상의 예방을 위한 "예방적 유효량"일 수 있다. 또한, 상기 용어는 질병의 진행을 감소시키거나 종양 성장 또는 감염을 현저히 감소시키거나 억제하여 추구하는 반응을 유도하는 데 충분한 활성 미생물 서열 변이체의 양을 포함하며, 특히 상기 반응은 미생물 서열 변이체에 대한 면역 반응일 수 있다(즉, "억제 유효량"). 그러나, 동시에, "안전하고 유효한 양"은 심각한 부작용을 피하기에, 즉, 유리점과 위험성 사이의 합리적인 관계를 가능하게 하기에 충분히 적다. 이들 제한의 결정은 전형적으로 합리적인 의학적 판단의 범위 내에 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물의 성분, 특히 본원에 정의된 미생물 서열 변이체의 "안전하고 유효한 양"은 의사의 지식 및 경험 내에서, 치료할 특정 질환, 뿐만 아니라 치료 받을 환자의 나이 및 신체적 상태, 체중, 일반적 건강, 성별, 식단, 투여 시간, 배설 속도, 약물 조합, 본원에 정의된 특정 미생물 서열 변이체의 활성, 질환의 심각도, 치료 기간, 수반하는 요법의 성질, 사용되는 특정한 약학적으로 허용되는 담체 및 유사한 인자와 관련하여 변할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 인간 및 가축 의학 용도, 바람직하게는 인간 의학 용도를 위해, 일반적으로 약학 조성물로서 또는 백신으로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물, 특히 백신 조성물, 또는 제형은 본원에 기재된 임의의 형태의 본원에 정의된 미생물 서열 변이체를 함유할 수 있는 약학 제형으로서 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서 사용된 용어 "약학 제형" 및 "약학 조성물"은, 활성 성분의 생물학적 활성이 명백히 효과적이도록 하는 형태로 존재하고 제형을 투여 받을 개체에게 독성인 추가적 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
본 발명에 있어서, 치료의 "효능"은 질병 동안 본 발명에 따른 사용 또는 방법에 반응에 대한 변화를 기반으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 암 치료의 효능은 종양 부피의 감소 및/또는 무진행 생존 시간의 증가및/또는 원발암의 절제후 재발의 감소된 위험성에 의해 측정될 수 있다. 면역 요법에 의해 치료되는 암의 경우 보다 구체적으로, 효능의 평가는, 고형암 반응 평가 기준(RECIST) 및 세계 보건 기구(WHO) 기준으로부터 개직된 새로운 면역-관련된 반응 기준(irRC)을 통한 면역 요법제에 대한 항종양 반응의 임상적 패턴의 스펙트럼에 의해 이루어질 수 있다(문헌[J. Natl. Cancer Inst. 2010, 102(18): 1388-1397]).
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물, 특히 백신 조성물, 또는 제형은 본원에 기재된 임의의 형태로 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체가 적재된 항원 제시 세포를 함유할 수 있는 약학 제형으로서 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 백신 및/또는 조성물은 통상적으로 사용되는 보조제, 면역 중재 물질, 또는 상기 및 하기에 기재되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 약학 조성물 및 이의 단위 투여량으로서 제형화될 수 있고, 이러한 형태에서, 고체, 예컨대 정제 또는 충전된 캡슐, 또는 액체, 예컨대 용액, 현탁액, 유화액, 엘릭시르 또는 이로 충전된 캡슐로서, 경구 사용을 위해, 또는 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구(피하 및 피내를 포함함) 사용을 위한 멸균 주사가능한 용액의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 특히 본 발명에 따른 약학 조성물 및 백신에 있어서, 주사가능한 조성물은 전형적으로 주사가능한 멸균 염수 또는 포스페이트-완충된 염수 또는 당분야에 공지된 다른 주사가능한 담체를 기반으로 한다. 이러한 약학 조성물 및 단위 이의 투여량 형태는, 추가적 활성 화합물 또는 원리의 유무에 관계 없이, 성분들을 통상적인 비율로 포함할 수 있고, 이러한 단위 투여량 형태는 사용하도록 의도된 일일 투여량 범위에 상응하는 임의의 적합한 유효량의 활성 성분을 함유할 수 있다.
조성물, 특히 본 발명에 따른 약학 조성물 및 백신은, 비제한적으로 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 유화액, 시럽 및 엘릭시르를 포함하는 액체 제형일 수 있다. 또한, 조성물은, 사용전 물 또는 다른 적합한 비히클에 의한 재구성을 위한 건조 제품으로 제형화될 수 있다. 이러한 액체 제제는, 비제한적으로 현탁제, 유화제, 비수성 비히클 및 방부제를 포함하는 첨가제를 함유할 수 있다. 현탁제는 비제한적으로 소르비톨 시럽, 메틸 셀룰로스, 글루코스/당 시럽, 젤라틴, 하이드록시에틸 셀룰로스, 카복시메틸 셀룰로스, 알루미늄 스테아레이트 겔, 및 수소화된 식용 지방을 포함한다. 유화제는 비제한적으로 레시틴, 소르비탄 모노올레에이트 및 아카시아를 포함한다. 방부제는 비제한적으로메틸 또는 프로필 p-하이드록시벤조에이트 및 소르브산을 포함한다. 분산제 또는 습윤제는 비제한적으로 폴리(에틸렌 글리콜), 글리세롤, 소 혈청 알부민, 트윈(등록상표), 스판(등록상표)을 포함한다.
또한, 조성물, 특히 본 발명에 따른 약학 조성물 및 백신은 데포 제제로서 제형화될 수 있고, 이는 주입 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 조성물, 특히 본 발명에 따른 약학 조성물 및 백신은 고체 조성물일 수 있고, 이는 종래 방법으로 제형화된 정제 또는 로젠지의 형태일 수 있다. 예를 들어, 경구 투여를 위한 정제 및 캡슐은 비제한적으로 결합제, 충전제, 윤활제, 붕해제 및 습윤제를 포함하는 종래의 부형제를 함유할 수 있다. 결합제는 비제한적으로 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨, 트라가칸트, 전분 풀 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 충전제는 비제한적으로 락토스, 당, 미정질 셀룰로스, 옥수수 전분, 칼슘 포스페이트 및 소르비톨을 포함한다. 윤활제는 비제한적으로 스테아르산 마그네슘, 스테아르산, 활석, 폴리에틸렌 글리콜 및 실리카를 포함한다. 붕해제는 비제한적으로 감자 전분 및 나트륨 전분 글리콜레이트를 포함한다. 습윤제는 비제한적으로 나트륨 라우릴 설페이트를 포함한다. 정제는 당분야에 주지된 방법에 따라 코팅될 수 있다.
또한, 조성물, 특히 본 발명에 따른 약학 조성물 및 백신은 서방형 형태로 또는 서방형 약물 전달 시스템으로부터 투여될 수 있다.
또한, 조성물, 특히 본 발명에 따른 약학 조성물 및 백신은 반복된 투여에 의한 전달에 적합할 수 있다.
의학적 치료
추가적 양태에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기에 기재된 미생물 서열 변이체/약제를 제공한다. 따라서, 본 발명은, 암을 예방하고/하거나 치료하거나, 항종양 반응을 개시하거나 증진시키거나 연장시키는 것이 필요한 개체에서 암을 예방하고/하거나 치료하거나, 항종양 반응을 개시하거나 증진시키거나 연장시키는 방법을 제공하되, 이는 상기 개체에게 상기에 기재된 미생물 서열 변이체/본 발명에 따른 약제를 투여여하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "암"은 악성 신생물을 지칭한다. 특히, 본원에서 용어 "암"은, 제어되지 않는 세포 분열, 및 침윤을 통한 인접 조직 내로의 직접 성장 또는 전이에 의한 먼 부위 내로의 전이에 의한 다른 조직을 침입하는 이들 세포의 능력을 특징으로 하는 질병 또는 장애의 클래스의 임의의 구성원을 지칭한다. 전이는 암 세포가 혈류 또는 림프 시스템을 통해 이동하는 단계로서 정의된다.
바람직하게는, 약제는 항암제, 보다 바람직하게는 면역 체크포인트 조절제와 조합으로 투여된다.
본 발명은 본 발명에 따른 약제의 투여를 포괄하되, 여기서 상기 약제는 암의 치료 및/또는 안정화, 및/또는 암 재발의 예방에 유용한 다른 치료 양생법 또는 공동-제제(예를 들어 다수의 약물 양생법) 전에, 이와 동시에 또는 이와 순차적으로 치료적 유효량으로 개체에게 투여된다. 본 발명에 따른 약제는 동일하거나 상이한 조성물로, 및 상기 공동-제제와 동일하거나 상이한 투여 경로로 투여될 수 있다.
상기 다른 치료 양생법 또는 공동-제제는 방사선 요법, 화학 요법, 수술, 표적화된 요법(소분자, 펩티드 및 단클론 항체를 포함함) 및 항혈관신생 요법으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 항혈관신생 요법은 종양-연관된 맥관 구조를 직접적으로 또는 간접적으로 표적화하는 제제의 투여로서 본원에서 정의된다. 바람직한 항암제는 화학 요법제, 표적화된 약물 및/또는 면역 요법제, 예컨대 면역 체크포인트 조절제를 포함한다.
종래의 화학 요법제는 세포 독성을 갖는다, 즉, 이는 신속하게 분열하는 세포(대부분의 암 세포의 주요 특성 중 하나임)를 살해함으로써 작용한다. 본원에 정의된 미생물 서열 변이체와의 조합에 대해 바람직한 화학 요법제는 암 치료를 위해 숙련가에게 공지된 화학 요법제이다. 조합에 대해 바람직한 화학 요법제는 5-플루오로우라실(5-FU), 카페시타빈(젤로다(Xeloda, 등록상표)), 이리노테칸(캄프토사르(Camptosar, 등록상표)) 및 옥살리플라틴(엘록사틴(Eloxatin, 등록상표))을 포함한다. 또한, 본원에 정의된 미생물 서열 변이체는 바람직하게는 (i) FOLFOX(5-FU, 류코보린 및 옥살리플라틴); (ii) CapeOx(카페시타빈 및 옥살리플라틴); (iii) 5-FU 및 류코보린; (iv) FOLFOXIRI(류코보린, 5-FU, 옥살리플라틴 및 이리노테칸); 및 (v) FOLFIRI(5-FU, 류코보린 및 이리노테칸)로부터 선택된 조합된 화학 요법와 조합되는 것이 바람직하다. 확산되지 않은 암에서, (i) FOLFOX(5-FU, 류코보린 및 옥살리플라틴); (ii) CapeOx(카페시타빈 및 옥살리플라틴); 또는 (iii) 5-FU 및 류코보린과의 조합이 바람직하다. 확산된 암의 경우, (iv) FOLFOXIRI(류코보린, 5-FU, 옥살리플라틴 및 이리노테칸); (i) FOLFOX(5-FU, 류코보린 및 옥살리플라틴); 또는 (v) FOLFIRI(5-FU, 류코보린 및 이리노테칸)와의 조합이 바람직하다.
본원에 정의된 미생물 서열 변이체와의 조합을 위한 표적화된 약물은 VEGF-표적화된 약물 및 EGFR-표적화된 약물을 포함한다. VEGF-표적화된 약물의 바람직한 예는 베바시주맙(아바스타틴(Avastin, 등록상표)), 라무시루맙(시람자(Cyramza, 등록상표)) 또는 지브-아플리베르셉트(잘트랩(Zaltrap, 등록상표))를 포함한다. EGFR-표적화된 약물의 바람직한 예는 세툭시맙(에르비툭스(Erbitux, 등록상표)), 파니투무맙(벡티빅스(Vectibix, 등록상표)) 또는 레고라페팁(스티바르가(Stivarga, 등록상표))을 포함한다.
본원에 정의된 미생물 서열 변이체와의 조합을 위한 면역 요법제는 백신, 키메라 항원 수용체(CAR), 체크포인트 조절제 및 종양 분해 바이러스 요법을 포함한다.
본원에 정의된 미생물 서열 변이체와의 조합을 위해 바람직한 백신은 TroVax, OncoVax, IMA910, ETBX-011, MicOryx, EP-2101, MKC1106-PP, CDX-1307, V934/V935, MelCancerVac, Imprime PGG, FANG, Tecemotide, AlloStim, DCVax, GI-6301, AVX701, OCV-C02를 포함한다.
인공 T 세포 수용체(키메라 T 세포 수용체, 키메라 면역 수용체, 키메라 항원 수용체(CAR)로도 공지됨)는 면역 효과기 세포에 임의의 특이성을 접목하는 조작된 수용체이다. 인공 T 세포 수용체(CAR)는 입양 세포 수송에 있어서 바람직하다. 이를 위해, T 세포는 환자로부터 제거되고 변형되어 이들은 암에 특이적인 수용체를 발현한다. 암 세포를 인식하고 살해할 수 있는 T 세포가 환자 내로 재도입된다.
바람직하게는, 본원에 정의된 미생물 서열 변이체와의 조합을 위한 면역 체크포인트 조절제는 CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR, ICOS, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, GITR, TNFR 및/또는 FasR/DcR3로부터 선택된 하나 이상의 면역 체크포인트 포인트 분자의 활성제 또는 억제제; 또는 이들의 하나 이상의 리간드의 활성제 또는 억제제이다.
보다 바람직하게는, 면역 체크포인트 조절제는 (공-)자극성 체크포인트 분자의 활성제 또는 억제성 체크포인트 분자의 억제제, 또는 이들의 조합이다. 따라서, 면역 체크포인트 조절제는 보다 바람직하게는 (i) CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR 및/또는 ICOS의 활성제, 또는 (ii) A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PDL-1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR 및/또는 FasR/DcR3의 억제제이다.
보다 더 바람직하게는, 면역 체크포인트 조절제는 억제성 체크포인트 분자의 억제제이다(바람직하게는 자극성 체크포인트 분자의 억제제는 아니다). 따라서, 면역 체크포인트 조절제는 보다 더 바람직하게는 A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PDL-1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR 및/또는 DcR3 또는 이들의 리간드의 억제제이다.
또한, 면역 체크포인트 조절제가 자극성 또는 공자극 체크포인트 분자의 활성제인 것이 바람직하다(바람직하게는 억제성 체크포인트 분자의 활성제는 아니다). 따라서, 면역 체크포인트 조절제는 보다 바람직하게는 CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR 및/또는 ICOS 또는 이들의 리간드의 활성제이다.
면역 체크포인트 조절제가 CD40 경로, IDO 경로, LAG3 경로, CTLA-4 경로 및/또는 PD-1 경로의 조절제인 것이 보다 더 바람직하다. 특히, 면역 체크포인트 조절제는 바람직하게는 CD40, LAG3, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1 및/또는 IDO의 조절제이고, 보다 바람직하게는 면역 체크포인트 조절제는 CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1, LAG3, 및/또는 IDO의 억제제, 또는 CD40의 활성제이고, 보다 더 바람직하게는 면역 체크포인트 조절제는 CTLA-4, PD-L1, PD-1, LAG3 및/또는 IDO의 억제제이고, 보다 더 바람직하게는 면역 체크포인트 조절제는 LAG3, CTLA-4 및/또는 PD-1의 억제제이고, 가장 바람직하게는 면역 체크포인트 조절제는 CTLA-4 및/또는 PD-1의 억제제이다.
따라서, 본원에 정의된 미생물 서열 변이체와의 조합을 위한 체크포인트 조절제는 CTLA-4 경로 또는 PD-1 경로의 공지된 조절제로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본원에 정의된 미생물 서열 변이체와의 조합을 위한 체크포인트 조절제는 CTLA-4 경로 또는 PD-1 경로의 공지된 조절제로부터 선택될 수 있다. 특히 바람직하게는, 면역 체크포인트 조절제는 PD-1 억제제이다. CTLA-4 경로 및 PD-1 경로의 바람직한 억제제는 단클론 항체 여보이(Yervoy, 등록상표)(이필리무맙; 브리스톨 메이어스 스큅(Bristol Myers Squibb)) 및 트레멜리무맙(화이자(Pfizer)/메드이뮨(MedImmune)), 뿐만 아니라 옵디보(Opdivo, 등록상표)(니볼루맙; 브리스톨 메이어스 스큅), 케이트루다(Keytruda, 등록상표)(펨브롤리주맙; 메르크(Merck)), 두르발루맙(메드이뮨/아스트라제네카(AstraZeneca)), MEDI4736(아스트라제네카; WO 2011/066389 A1 참조), MPDL3280A(로슈(Roche)/제넨테크(Genentech); US 8,217,149 B2 참조), 피딜리주맙(CT-011; 큐어테크(CureTech)), MEDI0680(AMP-514; 아스트라제네카), MSB-0010718C(메르크), MIH1(어피메트릭스(Affymetrix)) 및 람브롤리주맙(예를 들어 WO 2008/156712; 문헌[Hamid et al., 2013; N. Engl. J. Med. 369: 134-144]에서 hPD109A 및 이의 인간화된 유도체 h409All, h409A16 및 h409A17로서 개시됨). 보다 바람직한 체크포인트 억제제는 CTLA-4 억제제 여보이(등록상표)(이필리무맙; 브리스톨 메이어스 스큅) 및 트레멜리무맙(화이자/메드이뮨), 뿐만 아니라 PD-1 억제제 옵디보(등록상표)(니볼루맙; 브리스톨 메이어스 스큅), 케이트루다(펨브롤리주맙; 메르크), 피딜리주맙(CT-011; 큐어테크), MEDI0680(AMP-514; 아스트라제네카), AMP-224 및 람브롤리주맙(예를 들어 WO 2008/156712; 문헌[Hamid O. et al., 2013; N. Engl. J. Med. 369: 134-144]에서 hPD109A 및 이의 인간화된 유도체 h409All, h409A16 및 h409A17로서 개시됨)을 포함한다.
또한, 본원에 정의된 미생물 서열 변이체와의 조합을 위한 면역 체크포인트 조절제는 펨브롤리주맙, 이필리무맙, 니볼루맙, MPDL3280A, MEDI4736, 트레멜리무맙, 아벨루맙, PDR001, LAG525, INCB24360, 바를릴루맙, 우렐루맙, AMP-224 및 CM-24로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
종양 분해 바이러스는 종양에서 복제에 의해 세포 용해를 야기하여 항종양 면역 반응을 활성화시키도록 조작된다. 본원에 정의된 미생물 서열 변이체와의 조합을 위한 종양 분해 바이러스 요법은 바람직하게는 JX594(티미딘 키나제-비활성화된 백시니아 바이러스), ColoAd1(아데노 바이러스), NV1020(HSV-유래됨), ADXS11-001(약화된 리스테리아 백신), 레올리신(Reolysin, 등록상표)(인간 레오 바이러스의 특별한 제형), PANVAC(재조합 백시니아-바이러스 CEA-MUC-1-TRICOM), Ad5-hGCC-PADRE(재조합 아데노 바이러스 백신) 및 vvDD-CDSR(백시니아 바이러스)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, (i) 미생물 서열 변이체, 및 (ii) 화학 요법제, 표적화된 약물 및/또는 면역 요법제, 예컨대 면역 체크포인트 조절제가 거의 동시에 투여된다.
본원에 사용된 "거의 동시에"는 특히 동시 투여; 또는 (i) 화학 요법제, 표적화된 약물 및/또는 면역 요법제, 예컨대 면역 체크포인트 조절제의 투여 직후에, (ii) 미생물 서열 변이체가 투여되거나, (i) 미생물 서열 변이체의 투여 직후에, (ii) 화학 요법제, 표적화된 약물 및/또는 면역 요법제, 예컨대 면역 체크포인트 조절제가 투여되는 것을 의미한다. 숙련가는, "직후"가 제2 투여를 준비하는 데 필요한 시간, 특히 제2 투여를 위한 위치의 노출 및 소독, 및 "투여 장치"(예를 들어 시린지, 펌프 등)의 적절한 준비에 필요한 시간을 포함함을 이해한다. 동시 투여는 또한 (i) 미생물 서열 변이체의 투여 및 (ii) 화학 요법제, 표적화된 약물 및/또는 면역 요법제, 예컨대 면역 체크포인트 조절제의 투여의 기간이 중첩되는 경우, 또는 예를 들어 하나의 성분이 보다 긴 시간, 예컨대 30분, 1시간, 2시간 이상 동안 예를 들어 주입에 의해 투여되고, 나머지 성분이 상기 긴 기간 중 언젠가 투여되는 경우를 포함한다. 거의 동시에 (i) 미생물 서열 변이체의 투여 및 (ii) 화학 요법제, 표적화된 약물 및/또는 면역 요법제, 예컨대 면역 체크포인트 조절제의 투여는 특히 상이한 투여 경로 및/또는 상이한 투여 부위가 사용되는 경우 바람직하다.
또한, (i) 미생물 서열 변이체, 및 (ii) 화학 요법제, 표적화된 약물 및/또는 면역 요법제, 예컨대 면역 체크포인트 조절제가 연속적으로 투여되는 것이 또한 바람직하다. 이는 (i) 미생물 서열 변이체가 (ii) 화학 요법제, 표적화된 약물 및/또는 면역 요법제, 예컨대 면역 체크포인트 조절제 전에 또는 후에 투여됨을 의미한다. 연속적 투여에서, 제1 성분의 투여 및 제2 성분의 투여 사이의 시간은 바람직하게는 1주일 이하, 보다 바람직하게는 3일 이하, 보다 더 바람직하게는 2일 이하, 가장 바람직하게는 24시간 이하이다. 특히, (i) 미생물 서열 변이체, 및 (ii) 화학 요법제, 표적화된 약물 및/또는 면역 요법제, 예컨대 면역 체크포인트 조절제가 동일한 날에 투여되되, 제1 성분(미생물 서열 변이체의 체크포인트 조절제)의 투여와 제2 성분(미생물 서열 변이체의 체크포인트 조절제의 나머지)의 투여 사이의 시간은 바람직하게는 6시간 이하, 보다 바람직하게는 3시간 이하, 보다 더 바람직하게는 2시간 이하, 가장 바람직하게는 1시간 이하인 것이 바람직하다.
바람직하게는, (i) 미생물 서열 변이체, 및 (ii) 화학 요법제, 표적화된 약물 및/또는 면역 요법제, 예컨대 면역 체크포인트 조절제는 동일한 투여 경로를 통해 투여된다. 또한, (i) 미생물 서열 변이체, 및 (ii) 화학 요법제, 표적화된 약물 및/또는 면역 요법제, 예컨대 면역 체크포인트 조절제는 별개의 투여 경로로 투여되는 것이 바람직하다.
또한, (i) 미생물 서열 변이체, 및 (ii) 화학 요법제, 표적화된 약물 및/또는 면역 요법제, 예컨대 면역 체크포인트 조절제는 바람직하게는 별개의 조성물로 제공된다. 대안적으로, (i) 미생물 서열 변이체, 및 (ii) 화학 요법제, 표적화된 약물 및/또는 면역 요법제, 예컨대 면역 체크포인트 조절제는 바람직하게는 동일한 조성물로 제공된다.
따라서, 본 발명은 암의 치료 및/또는 안정화, 및/또는 암 재발의 예방을 위해 유용한 하나 이상의 공동-제제와 조합된 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체는, 고형 종양이 재발 및/또는 전이에 대한 예방으로서 제거되는 수술 후에 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 방법 및 사용에서 이미지화 또는 진단 조성물의 투여는 단독으로 또는 암의 이미지화 및/또는 진단에 유용한 공동-제제와 조합으로 수행될 수 있다.
본 발명은 암을 앓거나 암이 발병할 위험이 높은 임의의 개체에게 적용될 수 있다. 특히, 상기 미생물 서열 변이체의 치료적 효과는 기준 종양-관련된 항원 에피토프에 대한 면역 반응, 특히 CD8+ 세포 독성 T 세포에 의존적이고/이거나 MHC 클래스 I 분자에 의해 매개되는 반응을 유도하는 것일 수 있다.
추가적 양태에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체가 개체에서 존재하는지를 결정하는 (시험관내) 방법을 제공하되, 이는 본원에 기재된 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체가 개체의 (단리된) 샘플에 존재하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, (단리된) 샘플은 대변 샘플 또는 혈액 샘플이다. 본원에 있어서, 미생물 서열 변이체는 바람직하게는 본원에 기재된 본 발명에 따른 미생물 서열 변이체의 식별 방법에 의해 식별된다/수득된다.
예를 들어, 미생물 서열 변이체의 존재의 결정은, 상기 미생물 서열 변이체를 갖는 미생물, 예컨대 박테리아의 검출을 기반으로 수행될 수 있다. 이를 위해, 대변 샘플을 채취할 수 있고, 핵산 및/또는 단백질/(폴리)펩티드는 대변 샘플로부터 단리될 수 있다. 이어서, 단리된 핵산 및/또는 단백질/(폴리)펩티드는 서열결정될 수 있다. 예를 들어, 국제 인간 미생물 유전체 표준(IHMS) 프로젝트에 의해 개발되고 제공된 하나 이상의 표준 작업 절차(SOP)가 상기에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다(URL: http://www.microbiome-standards.org/#SOPS). 구체적 예로서, 대변 샘플로부터 추출된 DNA의 서열결정은 4000만의 페어 엔드 리드에서 Illumina HiSeq 상에서 수행될 수 있다. 서열은 박테리아 펩티드를 발현하는 후보자 박테리아의 게놈 부분의 식별을 위한 바이오인포메틱스 파이프라인을 사용하여 분석될 수 있다. 또 다른 접근법은 특이적으로 설계된 PCR 프라이머 쌍 및 실시간 PCR의 사용에 의한 미생물 서열 변이체의 단일 검출일 수 있다.
또한, 미생물 서열 변이체의 존재의 결정은 예를 들어 면역 반응 및/또는 미생물 서열 변이체를 인식할 수 있는 기존 기억 T 세포를 기반으로 수행될 수 있다. 이를 위해, 면역 반응은 단리된 혈액 샘플에서 예를 들어 미생물 서열 변이체(펩티드)와 정제된 말초혈 단핵 세포(PBMC)의 공동-항온처리 및 ELISPOT 분석에 의한 면역 반응의 평가에 의해 다뤄질 수 있다. 이러한 분석은 당분야에 주지되어 있다(문헌[Calarota SA, Baldanti F. Enumeration and characterization of human memory T cells by enzyme-linked immunospot assays. Clin Dev Immunol. 2013;2013:637649]). 대안적으로, 기억 T 세포, 및 림프구 증식 반응에 의한 T 세포 활성화의 평가, 또는 세포내 염색이, 미생물 서열 변이체, 또는 상기 미생물 서열 변이체를 인식할 수 있는 기존 기억 T 세포의 존재를 결정하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 상기에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른, 암의 예방 및/또는 치료 또는 항종양 반응의 개시, 증진 또는 연장이 필요한 개체에서 암을 예방하고/하거나 치료하거나, 항종양 반응을 개시하거나 증진시키거나 연장시키는 방법은, 상기 개체에게 투여할 약제에 포함된 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체가 상기 개체에서 존재하는지를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 결정은 상기에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
바람직하게는, 상기에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른, 암의 예방 및/또는 치료 또는 항종양 반응의 개시, 증진 또는 연장이 필요한 개체에서 암을 예방하고/하거나 치료하거나, 항종양 반응을 개시하거나 증진시키거나 연장시키는 방법에서, 투여할 약제에 포함된 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체는 개체에서 존재한다. 임의의 이론에 구애받지 않고, 환자가 미생물 서열 변이체에 의해 프라이밍된 기억 T 세포를 가질 수 있는 것이 가능하다. 이어서, 미생물 서열 변이체에 대한 존재하는 기억 T 세포는 미생물 서열 변이체를 포함하는 투여된 약제의 도전으로 재활성화될 수 있고 항종양 반응의 수립을 강화시키고 가속화시킬 것이다.
또한, 상기에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른, 암의 예방 및/또는 치료 또는 항종양 반응의 개시, 증진 또는 연장이 필요한 개체에서 암을 예방하고/하거나 치료하거나, 항종양 반응을 개시하거나 증진시키거나 연장시키는 방법에서, 투여할 약제에 포함되는 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체는 개체에서 존재하지 않는 것이 바람직하다. 임의의 이론에 구애받지 않고, 소화관에서 특정 미생물 서열 변이체의 과발현 및 미생물 서열 변이체의 매우 높은 친화도는 이러한 미생물 서열 변이체를 인식할 수 있는 T 세포 래퍼토리의 소진을 야기할 수 있고 임상적 효능을 감소시킬 수 있는 것이 가능하다.
하기에, 첨부된 도면의 간단한 설명이 제공된다. 도면은 본 발명을 보다 상세히 예시하도록 의도된다. 그러나, 이는 본 발명의 주제를 어떠한 방식으로도 제한하려는 것은 아니다.
도 1은 실시예 6에 사용된 면역 계획의 개략도를 보여준다.
도 2는 군 1(IL13RA2-B) 및 군 2(IL13RA2-A)에 대한 실시예 6의 ELISPOT-IFNγ 결과를 보여준다. 백신 접종에 사용된 펩티드(각각의 군 아래에 괄호 사이에 나타냄) 및 ELISPOT 배양에 사용된 자극(X-축)은 그래프 상에 표시되어 있다. (A) 특정 ELISPOT-IFNγ 스팟의 수(배지 조건 감함). 각각의 도트는 상응하는 조건의 4회 실험으로부터의 하나의 개체/마우스에 대한 평균 값을 나타낸다. (B) 각각의 개체에 대해, 특정 ELISPOT-IFNγ 반응의 수준을 ConA 자극(값: 100%)과 비교한다. 통계 분석: 군 내 비교를 위한 대응 t-검정 및 군 간 비교를 위한 비대응 t-검정; * p<0.05.
도 3은 실시예 7의 결과를 보여준다.
도 4는, FOXM1-B2로 백신 접종시킨 마우스에 대한 실시예 12 ELISPOT-IFNγ 결과를 보여준다. 백신 접종 및 비장 세포의 생체외 자극에 사용된 펩티드는 그래프 상에 표시되어 있다. 본 도면은 특정 ELISPOT-IFNγ 스팟의 수를 보여준다(배지 조건 감함). 각각의 도트는 상응하는 조건의 2회 실험으로부터의 하나의 개체/마우스에 대한 평균 값을 나타낸다.
도 5는, 실시예 14에서, 박테리아 펩티드 IL13RA2-BL(서열번호 139)이 HLA-A*0201에 강하게 결합하는 반면에, 상응하는 인간 펩티드는 HLA-A*0201에 결합하지 않음을 보여준다.
도 6은 HHD DR3 형질전환된 마우스에 대한 실시예 15의 결과를 보여준다. HHD DR3 형질전환된 마우스를 IL13RA2-BL(FLPFGFILPV; 서열번호 139)로 면역시켰다. 제21일에, 마우스를 안락사시키고, 비장을 채취하였다. 비장 세포를 준비하고 IL13RA2-BL(FLPFGFILPV; 서열번호 139) 또는 IL13RA2-H(WLPFGFILI; 서열번호 1)로 시험관내 자극시켰다. Elispot를 전체 비장 세포에 대해 수행하였다. 데이터를 비장 세포 혼합물의 T 세포의 수에 대해 정규화시켰다. 각각의 도트는 상응하는 조건의 2회 실험으로부터의 하나의 개체/마우스에 대한 평균 값을 나타낸다.
도 7은 HHD DR1 형질전환된 마우스에 대한 실시예 15의 결과를 보여준다. HHD DR1 형질전환된 마우스를 IL13RA2-BL(FLPFGFILPV; 서열번호 139)로 면역시켰다. 제21일에, 마우스를 안락사시키고, 비장을 채취하였다. 비장 세포를 준비하고 IL13RA2-BL(FLPFGFILPV; 서열번호 139) 또는 IL13RA2-HL(WLPFGFILIL; 서열번호 131)로 시험관내 자극시켰다. Elispot를 전체 비장 세포에 대해 수행하였다. 각각의 도트는 상응하는 조건의 3회 실험으로부터의 하나의 개체/마우스에 대한 평균 값을 나타낸다.
도 8은 박테리아 펩티드 H2 Db B2 또는 뮤린 기준 펩티드 H2 Db M2로 생체외 자극시킨, H2 Db B2로 백신 접종시킨 C57BL/6 마우스 및 대조군 마우스(OVA + IFA로 백신 접종시킴)에 대한 실시예 16 ELISPOT-IFNγ 결과를 보여준다. 본 도면은 특정 ELISPOT-IFNγ 스팟의 수를 보여준다(배지 조건 감함). 각각의 도트는 상응하는 조건의 3회 실험으로부터의 하나의 개체/마우스에 대한 평균 값을 나타낸다.
도 9는 박테리아 펩티드 H2 Ld B5 또는 뮤린 기준 펩티드 H2 Ld M5로 생체외 자극시킨, H2 Ld B5로 백신 접종시킨 BALB/c 마우스 및 대조군 마우스(OVA + IFA로 백신 접종시킴)에 대한 실시예 16의 ELISPOT-IFNγ 결과를 보여준다. 본 도면은 특정 ELISPOT-IFNγ 스팟의 수를 보여준다(배지 조건 감함). 각각의 도트는 상응하는 조건의 3회 실험으로부터의 하나의 개체/마우스에 대한 평균 값을 나타낸다.
실시예
하기에, 본 발명의 다양한 실시양태 및 양태를 예시하는 특정 실시예가 제시된다. 그러나, 본 발명은 본원에 기재된 특정 실시양태에 의해 그 범위가 제한되지 않아야 한다. 하기 제조 및 실시예는 당업자가 본 발명을 보다 명확하게 이해하고 실시할 수 있도록 제공된다. 그러나, 본 발명은 발명의 단일 양태의 예시로서 의도된 예시된 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않으며, 기능적으로 동등한 방법은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에 기재된 것에 추가하여 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명, 수반되는 도면 및 하기 실시예로부터 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다. 이러한 모든 변형은 첨부된 특허청구범위의 범위 내에 속한다.
실시예 1: 인간 미생물 유전체에서 종양-관련된 에피토프의 박테리아 서열 변이체의 식별
1. 종양-연관된 항원(TAA) 및 종양-특이적 항원(TSA)의 선택
고전적 정의에 따라, 종양-특이적 항원(TSA)은 임의의 다른 세포 유형이 아닌 종양 세포 상에만 존재하는 항원(단백질)으로부터 기인하는 반면에, 종양-연관된 항원(TAA)은 일부 종양 세포 및 또한 일부 "정상" (비-종양) 세포 상에 존재한다. 본원에 사용된 용어 "종양-관련된 항원"은 종양-연관된 항원(TAA) 및 종양-특이적 항원(TSA)을 포괄한다.
종양-관련된 단백질/항원의 선택을 문헌, 특히 TAA 및 TSA의 주지된 목록을 기반으로 수행하였다. 예를 들어, 많은 수의 잠재적 TAA 및 TSA가 데이터베이스, 예컨대 종양 T 세포 항원 데이터베이스("탄티젠"; http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/), 펩티드 데이터베이스(https://www.cancerresearch.org/scientists/events-and-resources/peptide-database) 또는 CT데이터베이스(http://www.cta.lncc.br/)로부터 수득될 수 있다. 이들 데이터베이스로부터 수득된 데이터를, 실현가능한 종양-관련된 항원을 식별하기 위해 최신 문헌과 수동으로 비교할 수 있다. 예를 들어, 종양에서 항원의 특이적 발현과 관련된 문헌, 예컨대 문헌[Xu et al., An integrated genome-wide approach to discover tumor-specific antigens as potential immunologic and clinical targets in cancer. Cancer Res. 2012 Dec 15;72(24):6351-61]; [Cheevers et al., The prioritization of cancer antigens: a national cancer institute pilot project for the acceleration of translational research. Clin Cancer Res. 2009 Sep 1;15(17):5323-37]은, 관심 항원을 우선적으로 처리하는 데 유용할 수 있다. 600개 초과의 후보자 항원의 목록이 식별되었다. 모든 선택된 항원에, 이용가능한 툴, 예컨대 Gent (http://medicalgenome.kribb.re.kr/GENT/), metabolic gene visualizer(http://merav.wi.mit.edu/), protein Atlas(https://www.proteinatlas.org/) 또는 GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)를 사용하여 발현 프로필에 대해 애노테이션을 수행하였다. 또한, 각각의 항원에 대해, 잠재적 지표, 가능한 부작용에 대한 관련성, 및 드라이버 항원 대 패신저 항원을 명시하였다.
600개의 항원 중에서, 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Rα2 또는 IL13RA2)를 하기 사실을 기반으로 선택하였다: (i) IL13RA2는 CTL(세포 독성 T 림프구) 에피토프로서 식별된 에피토프를 포함한다(문헌[Okano F, Storkus WJ, Chambers WH, Pollack IF, Okada H. Identification of a novel HLA-A*0201-restricted, cytotoxic T lymphocyte epitope in a human glioma-associated antigen, interleukin 13 receptor alpha2 chain. Clin Cancer Res. 2002 Sep;8(9): 2851-5]); (ii) IL13RA2는 종양 T 세포 항원 데이터베이스 및 CT 데이터베이스에서, 뇌 종양에서 과발현된 유전자로서 언급된다; (iii) IL13RA2의 과발현 및 선택적 발현은, 유전자 발현으로부터 데이터를 분석하는, Gent, Metabolic gene visualizer 및 protein Atlas를 툴로서 사용하여 확인되었다(마이크로 어레이 연구); 및 (iv) 과발현은 또한 문헌에서, 뇌 종양에서(문헌[Debinski et al., Molecular expression analysis of restrictive receptor for interleukin 13, a brain tumor-associated cancer/testis antigen. Mol Med. 2000 May;6(5):440-9]), 두경부 종양에서(문헌[Kawakami et al., Interleukin-13 receptor alpha2 chain in human head and neck cancer serves as a unique diagnostic marker. Clin Cancer Res. 2003 Dec 15;9(17):6381-8]), 및 흑색종에서(문헌[Beard et al., Gene expression profiling using nanostring digital RNA counting to identify potential target antigens for melanoma immunotherapy. Clin Cancer Res. 2013 Sep 15;19(18):4941-50]) 보고되었다.
특히, IL13RA2의 과발현 및 선택적 발현의 확인(상기 포인트 (iii))을 하기와 같이 수행하였다: TCGA("The Cancer Genome Atlas"; https://cancergenome.nih.gov/에서 입수가능))에 의해 생성된 tissue atlas(RNA-seq 데이터 37개의 정상 조직 및 17개의 암 유형)로부터의 mRNA 데이터의 분석은, 정상 조직에서(고환 제외) IL13RA2 mRNA의 낮은 기저 수준 및 여러 종양 유형에서 IL13RA2 mRNA 발현의 높은 수준을 강조하며, 최고 발현은 교종 샘플에서 관찰되었다. IL13RA2 mRNA 발현을 Metabolic gEne RApid Visualizer(http://merav.wi.mit.edu/에서 입수가능, 국제 게놈 컨소시엄 및 NCBI GEO 데이터세트로부터 데이터를 분석함)를 사용하여 수행하였을 때, 동일한 결과를 수득하였고, 여기서 교환을 제외한 대부분의 정상 조직에서 매우 낮은 기저 발현, 및 흑색종 샘플, 교아종, 및 갑상선 및 췌장의 원발성 종양의 일부 샘플에서 강한 발현이 관찰되었다.
IL13RA2는 IL13RA2 유전자에 의해 인간에서 암호화되는 막 결합된 단백질이다. 비전면 방식으로, IL13RA2는 잠재적 면역 요법 표적으로서 보고되었다(문헌[Beard et al.; Clin Cancer Res; 72(11); 2012] 참조). IL13RA2의 높은 발현은 대장암에서 침윤, 간 전이 및 불량한 예후와 추가로 연관되었다(문헌[Barderas et al.; Cancer Res; 72(11); 2012]). 따라서, IL13RA2는 드라이버 종양 항원으로서 간주될 수 있다.
2. 선택된 종양-관련된 항원에서 하나 이상의 관심 에피토프의 선택
다음 단계에서, 특이적으로 MHC-I에 의해 제시되는 선택된 종양-관련된 항원의 에피토프를 식별하였다. 이를 위해, (IL13RA2의) 종양-관련된 항원 서열을 프로테아좀 절단, TAP 수송, 및 펩티드 제시의 예측을 위한 MHC 클래스 I 분석 툴을 조합한 "면역 에피토프 데이터베이스 및 분석 리소스"(IEDB; http://www.iedb.org/; MHC-I 분석의 경우 특히: http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_processing.html - IL13RA2 분석을 위해 사용됨, 또한 http://tools.immuneepitope.org/processing/ 참조)에 의해 분석하였다. 즉, IL13RA2의 단백질 서열을 HLA.A2.1에 의해 제시될 수 있는 잠재적 에피토프의 식별을 위한 IEDB 분석 툴에 제출하였다. 이로써, HLA A2.1 결합 특성을 갖는 371개의 잠재적 에피토프의 목록을 수득하였다. 목록의 2개의 에피토프는 잠재적 에피토프로서 이전에 기재되었다: WLPFGFILI(서열번호 1)(오카노(Okano) 등에 의해 기재되고 기능적으로 입증되었다)(문헌[Okano F, Storkus WJ, Chambers WH, Pollack IF, Okada H. Identification of a novel HLA-A*0201-restricted, cytotoxic T lymphocyte epitope in a human glioma-associated antigen, interleukin 13 receptor alpha2 chain. Clin Cancer Res. 2002 Sep;8(9): 2851-5]) 및 LLDTNYNLF(서열번호 2)(흑색종 펩티돔(peptidome) 연구에서 밝혀진 바와 같이 IEDB 데이터베이스에서 보고됨)(문헌[Gloger et al., Mass spectrometric analysis of the HLA class I peptidome of melanoma cell lines as a promising tool for the identification of putative tumor-associated HLA epitopes. Cancer Immunol Immunother. 2016 Nov;65(11):1377-1393]).
종양 세포의 표면에서 MHC에 의해 효율적으로 제시될 수 있는 좋은 기회를 갖는 에피토프를 식별하기 위해, HLA A2.1 결합 특성을 갖는 371개의 잠재적 에피토프의 목록에서, HLA A2.1에 대한 371개의 후보자 에피토프의 인실리코 친화도를 NetMHCpan 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)을 사용하여 계산하였다(이때 최대 허용되는 친화도(IC50)는 3000 nM이다). 이로써, 54개의 IL13RA2 에피토프의 목록을 수득하였다.
3. 인간 미생물 유전체에서 선택된 에피토프의 박테리아 서열 변이체의 식별
최종적으로, 54개의 선택된 IL13RA2-에피토프를, 54개의 선택된 인간 IL13RA2-에피토프의 미생물 서열 변이체를 식별하기 위해 "인간 소화관 미생물 유전체의 통합된 참고 카탈로그"(http://meta.genomics.cn/meta/home에서 입수가능)와 비교하였다. 이를 위해, 단백질 BLAST 조사(blastp)를 "PAM-30" 단백질 치환 매트릭스를 사용하여 수행하였으며, 이는 시간에 따른 부위 당 아미노산 변화의 비를 기술하고 35개 이하의 아미노산의 길이를 갖는 쿼리에 대해 권장된다; 2의 단어 크기(또한 짧은 쿼리에 대해 제안됨); 20000000의 예상 값(E)(가능한 매치의 수를 최대화하도록 조정됨); '0'으로 설정된 조성-기반-통계(이는 30개의 아미노산보다 짧은 인풋 서열이며 이는 갭이 없는 정렬만 허용한다). 이후에, blastp 결과를 필터링하여 인간 펩티드의 시작부 및/또는 말단부에서만 미스매치를 허용하는, (HLA-A2.1에 대한 결합을 위한) 9개의 아미노산의 길이를 갖는 미생물 펩티드 서열을 배타적으로 수득하였고, 여기서 서열 당 최대 2개의 미스매치가 허용된다. 이로써, 514개의 박테리아 서열의 목록(노나펩티드, 9개의 아미노산의 길이를 필터로서 사용하였다)을 수득하였고, 이는 인간 미생물 유전체에서 선택된 IL13RA2 에피토프의 박테리아 서열 변이체로 이루어졌다.
실시예 2: MHC에 대한 선택된 박테리아 서열 변이체의 결합 시험
MHC 분자에 대한 미생물 모방체의 결합이 세포 독성 T 세포에 대한 항원 제시에 필수적이기 때문에, MHC 클래스 I HLA.A2.01에 대한 514개의 박테리아 서열의 친화도를 NetMHCpan 3.0 툴(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)을 사용하여 계산하였다. 이러한 툴은 인간(HLA-A, B, C, E) 및 다른 종의 172개의 MHC 분자를 포함하는 180000개 초과의 정량적 결합 데이터에 대해 훈련되어 있다. 514개의 박테리아 서열(실시예 1의 blastp 결과)를 인풋으로서 사용하였고, 친화도를 강한 바인더 및 약한 바인더에 대한 기본 임계값을 설정함으로써 예측하였다. 400000개의 랜덤 천연 펩티드 세트와 비교한 예측된 친화도의 순위를 결합 친화도의 척도로서 사용하였다. 이러한 값은 높거나 낮은 평균 예측된 친화도에 대한 특정 분자의 고유한 편항에 영향을 받지 않는다. 매우 강한 바인더는 0.5 미만의 %순위를 갖는 것으로 정의되고, 강한 바인더는 0.5 이상 내지 1.0 미만의 %순위를 갖는 것으로 정의되고, 중간 바인더는 1.0 이상 내지 2.0 이하의 %순위를 갖는 것으로 정의되고(특히, 중간 바인더는 1.0 이상 내지 1.5 미만의 %순위를 갖는 것으로 정의되는 "중간 내지 강한" 바인더를 포함한다), 약한 바인더는 2.0 미만의 %순위를 갖는 것으로 정의된다. 즉, 514개의 박테리아 서열로부터, 매우 강한 친화도(%순위 < 0.5)를 나타내는 것만이 선택되었고, 여기서 인간 기준 에피토프는 (인간 펩티드에 대해) 적어도 중간 내지 강한 친화도(%순위 < 1.5)를 나타내고, 바람직하게는 여기서 인간 기준 에피토프는 (인간 펩티드에 대해) 적어도 강한 친화도(%순위 < 1)를 나타낸다.
이로써, 하기 13개의 박테리아 서열 변이체(펩티드 1 내지 펩티드 13)가 식별되었다(표 3).
박테리아 펩티드, 서열번호 인간 기준 에피토프, 서열번호 친화도 인간 펩티드 %순위 친화도 인간 펩티드 [nM] 친화도 박테리아 펩티드 %순위 친화도 박테리아 펩티드 [nM]
6 3 1.3 143.467 0.18 13.5048
7 3 1.3 143.467 0.06 6.6623
8 3 1.3 143.467 0.20 16.0441
9 4 0.5 35.5261 0.01 2.8783
10 4 0.5 35.5261 0.02 3.6789
11 4 0.5 35.5261 0.04 5.0586
12 4 0.5 35.5261 0.05 5.8467
13 4 0.5 35.5261 0.18 13.3325
14 4 0.5 35.5261 0.40 25.3124
15 5 0.09 8.0315 0.04 5.5211
16 5 0.09 8.0315 0.40 26.9535
17 5 0.09 8.0315 0.40 26.9535
18 1 0.8 66.1889 0.08 7.4445
실시예 3: 선택된 박테리아 서열 변이체를 포함하는 박테리아 단백질의 애노테이션 및 세포 국소화의 결정
다음으로, 선택된 박테리아 에피토프 서열 변이체를 함유하는 박테리아 단백질의 애노테이션을 수행하였다. 이를 위해, 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG)(http://www.genome.jp/kegg/) 및 미국 국립 생물공학정보 센터(NCBI) 기준 서열 데이터베이스(RefSeq)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/) 둘 모두에 대한 blast-기반 비교를 수행하였다. RefSeq는 게놈 DNA, 전사체 및 단백질을 포함하는, 통합되고 중복되지 않은 서열 세트를 제공한다. KEGG에서, KO(KEGG 오쏠로지) 데이터베이스에 저장된 분자-수준 기능이 사용될 수 있다. 이러한 기능은 공통 선조로부터 진화한 상이한 종의 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 함유하는 오쏘로그의 군으로 분류된다.
다음 단계에서, 선택된 박테리아 에피토프 서열 변이체를 함유하는 박테리아 단백질의 세포 국소화의 예측을 2개의 상이한 절차를 사용하여 수행하였고, 이후에 컨센서스 예측을 포함하는, 펩티드-함유 단백질의 목록을 전달한다. 먼저, 신호 펩티드의 존재의 예측을 기반으로 세포내 또는 세포외 단백질을 식별하는 둘로 갈리는 조사 전략을 수행하였다. 신호 펩티드는 진핵생물에서 세포질 막을 가로지르는 전좌를 위한 이의 패신저 단백질을 표적화하는 보편적인 단백질-분류 신호이다. 이에 있어서, SignalP 4.1.(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) 및 포비어스 서버(phobius.sbc.su.se) 둘 모두를 사용하여 컨센서스 예측을 전달한다. 신호 펩티드의 존재가 2개의 접근법에 의해 검출되는 경우, 이는 단백질이 세포외 또는 세포질에 존재할 가능성이 있는 것으로 해석되었다. 그렇지 않은 경우, 단백질은 아마 외막/내막에 속하거나 세포질에 존재한다. 두번째로, 막관통 토폴로지의 예측이 수행된다. 신호 펩티드 및 막관통 도메인 둘 모두는 소수성이나, 막관통 나선은 전형적으로 보다 긴 소수성 영역을 갖는다. SignalP 4.1. 및 포비어스는 신호 펩티드를 막관통 도메인과 구별하는 능력을 갖는다. 2개의 예측된 막관통 나선의 최소 수는 막과 세포질 단백질 사이를 구별하도록 설정되어 최종 컨센서스 리스트를 전달한다. 박테리아 단백질의 잠재적 세포 국소화에 관한 데이터는 면역원성 펩티드는 선택에 관심이 있으며, 분비된 엑소좀에 함유되는 분비된 성분 또는 단백질이 APC에 의해 보다 제시되기 쉬운 것을 추정한다.
표 4는 표 4에 나타낸 13개의 박테리아 펩티드를 함유하는 박테리아 단백질의 서열번호, 이의 애노테이션 및 세포 국소화를 보여준다.
Figure pct00002
표 3 및 4의 데이터를 기반으로, 서열번호 1에 따른 인간 IL13RA2 기준 에피토프(WLPFGFILI, 표 2 참조; 본원에서 "IL13RA2-H"로도 지칭됨)의 서열 변이체인, 서열번호 18에 따른 박테리아 펩티드(아미노산 서열: FLPFGFILV; 본원에서 "IL13RA2-B"로도 지칭됨)를 추가적 연구를 위해 선택하였다. 실질적으로, 인간 기준 에피토프는 중간 친화도를 가지며, 종양 세포의 표면에서 제시된다. 이러한 MHC 제시를 여러 공개된 연구에서 확인하였다(문헌[Okano et al., Identification of a novel HLA-A*0201-restricted, cytotoxic T lymphocyte epitope in a human glioma-associated antigen, interleukin 13 receptor alpha2 chain. Clin Cancer Res. 2002 Sep;8(9):2851-5]).
박테리아 서열 변이체(서열번호 18)는 HLA.A2.01에 대한 매우 강한 결합 친화도를 갖는다. 또한, 이러한 박테리아 펩티드 서열 변이체는 박테리아 단백질에 포함되며, 이는 막관통 수준에서 발현되어, MHC 제시를 위한 항원-제시 세포(APC)에 의해 포착될 엑소좀의 부분으로 정의되는 확률을 증가시키는 것으로 예측된다.
실시예 4: 박테리아 펩티드 IL13RA2-B(서열번호 18)는 인간 에피토프 IL13RA2-H(서열번호 1)보다 우수한 HLA-A*0201 대립유전자에 대한 시험관내 친화도를 갖는다.
본 실시예는 서열번호 18의 박테리아 펩티드(FLPFGFILV; 본원에서 "IL13RA2-B"로도 지칭됨)가 HLA-A*0201 대립유전자에 대한 높은 시험관내 친화도를 가지는 반면에, IL13RA2로부터 유래된 상응하는 기준 인간 펩티드(WLPFGFILI, 서열번호 1, 본원에서 "IL13RA2-H"로도 지칭됨)는 낮은 친화도를 갖는 것을 입증한다.
A. 재료 및 방법
A.1. T2 세포주에 대한 펩티드의 친화도 측정
실험 프로토콜은 HLA-A*0201에 의해 제시된 펩티드에 대해 인증된 것과 유사하다(문헌[Tourdot et al., A general strategy to enhance immunogenicity of low-affinity HLA-A2.1-associated peptides: implication in the identification of cryptic tumor epitopes. Eur J Immunol. 2000 Dec; 30(12):3411-21]). 펩티드의 친화도 측정을 HLA-A*0201 분자를 발현하나 TAP1/2 음성이고 내인성 펩티드를 제시할 수 없는 인간 종양 세포 T2를 사용하여 수행하였다.
T2 세포(2.105 세포/웰)를 100 ng/μl의 인간 β2m이 보충된 AIMV 배지에서 37℃에서 16시간 동안 펩티드의 농도를 100 μM에서 0.1 μM로 감소시키면서 항온처리하였다. 이어서, 세포를 2회 세척하고 PE에 커플링된 항-HLA-A2 항체로 표시하였다(클론 BB7.2, 비디 파밍겐(BD Pharmagen)).
분석을 FACS(구아바 이지 사이트(Guava Easy Cyte))에 의해 수행하였다. 각각의 펩티드 농도에 대하여, 관심 펩티드에 연관된 라벨링의 기하 평균을 백그라운드 노이즈로부터 감하고 100 μM의 농도에서 기준 펩티드 HIV pol 589-597에 대해 수득된 HLA-A*0202 라벨링의 기하 평균의 백분율로서 보고하였다. 이어서, 상대 친화도를 하기와 같이 결정한다:
상대 친화도 = HLA-A*0201의 발현의 20%를 유발하는 각각의 펩티드의 농도 / HLA-A*0201의 발현의 20%를 유발하는 기준 펩티드의 농도.
A.2. 펩티드의 가용화
각각의 펩티드를 아미노산 조성을 고려하여 가용화시켰다. 임의의 시스테인, 메티오닌 또는 트립토판을 포함하지 않는 펩티드의 경우, DMSO의 첨가가 전체 부피의 10% 이하까지 가능하다. 다른 펩티드는 물 또는 PBS(pH 7.4)에 재현탁된다.
B. 결과
T2 세포의 경우: 다양한 펩티드 농도에 대한 평균 형광 강도: 커플 IL13RA2 펩티드(IL13RA2-H 및 IL13RA2-B)에 관하여, 인간 펩티드는 HLA-A*0201에 결합하지 않는 반면에, 박테리아 펩티드 IL13RA2-B는 HLA-A*0201에 강하게 결합한다: 100 μM 에서 112.03 vs 18.64; 10 μM에서 40.77 vs 11.61; 1 μM에서 12.18 vs 9.41; 0.1 μM에서 9.9 vs 7.46. 또한, 4.4 μM에서 IL13RA2-B는 HLA-A*0201의 발현의 20%를 유발한다(IL13RA2-H의 경우 100 μM).
유사한 결과를 제2의 별개의 T2 세포 클론으로부터 수득하였다.
실시예 5: 박테리아 펩티드 IL13RA2-B(서열번호 18)는 HLA-A*0201 대립유전자에 대한 우수한 시험관내 친화도를 갖는다.
본 실시예는, 서열번호 18의 박테리아 펩티드(FLPFGFILV; 본원에서 "IL13RA2-B"로도 지칭됨)가 IL13RA2로부터 유래된 상응하는 기준 인간 펩티드(WLPFGFILI, 서열번호 1, 본원에서 "IL13RA2-H"로도 지칭됨)의 다른 서열 변이체보다 높은 HLA-A*0201 대립유전자에 대한 친화도를 갖는 것을 입증한다. 본 실험에서, 서열번호 18의 박테리아 펩티드(FLPFGFILV; 본원에서 "IL13RA2-B"로도 지칭됨)를 하기와 비교하였다:
- 문헌[Eguchi Junichi et al., 2006, Identification of interleukin-13 receptor alpha 2 peptide analogues capable of inducing improved antiglioma CTL responses. Cancer Research 66(11): 5883-5891]에 기재된 바와 같은, 서열번호 1의 위치 1의 트립토판이 알라닌으로 치환되고(1A), 서열번호 1의 위치 9의 이소류신이 발린으로 치환된(9V), 펩티드 "1A9V";
- 서열번호 1의 위치 1의 트립토판이 이소류신으로 치환되고(1I) 서열번호 1의 위치 9의 이소류신이 알라닌으로 치환된(9A), 펩티드 "1I9A"; 및
- 서열번호 1의 위치 1의 트립토판이 페닐알라닌으로 치환되고(1F) 서열번호 1의 위치 9의 이소류신이 메티오닌으로 치환된(9M), 펩티드 "1F9M".
A. 재료 및 방법
실험 프로토콜, 재료 및 방법은 실시예 4에 개괄된 것에 상응하나, 상기 언급된 항원 펩티드를 사용한 점만이 다르다.
B. 결과
하기 시험관내 결합 친화도를 수득하였다(표 5).
펩티드 시험관내 결합 친화도
IL13RA2-B (서열번호 18) 0.49
1A9V 3.06
1I9A 2.22
1F9M 2.62
따라서, 본 발명에 따른 항원 펩티드(IL13RA2-B(서열번호 31))는 시험된 모든 다른 펩티드보다 상당히 높은 HLA-A*0201에 대한 결합 친화도를 나타낸 반면에, 문헌[Eguchi Junichi et al., 2006, Identification of interleukin-13 receptor alpha 2 peptide analogues capable of inducing improved antiglioma CTL responses. Cancer Research 66(11): 5883-5891]에 기재된 바와 같은 펩티드 "1A9V"는 시험된 펩티드 중 최저 친화도를 나타냈다.
실시예 6: 마우스를 박테리아 펩티드 IL13RA2-B(서열번호 18)에 의해 백신 접종시키는 것은 ELISPOT-IFNγ 분석에서 개선된 T 세포 반응을 유발한다.
A. 재료 및 방법
A.1. 마우스 모델
사용된 모델의 특징을 하기 표 6에 개괄하였다.
마우스 모델 C57BL/6J B2m tm1UncIAb-/-Tg(HLA-DRA HLA-DRB1*0301)#Gjh Tg(HLA-A/H2-D/B2M)1Bpe
두문자어 β/A2/DR3
설명 면역적격, 마우스 클래스 I 및 클래스 II MHC 없음
하우징 SOPF 조건(ABSL3)
마우스의 수 다 자란 24마리(8주령 초과)
이들 마우스는 여러 보고서에 기재되어 있다(문헌[Koller et al., Normal development of mice deficient in beta 2M, MHC class I proteins, and CD8+ T cells. Science. 1990 Jun 8;248(4960):1227-30]; [Cosgrove et al., Mice lacking MHC class II molecules. Cell. 1991 Sep 6;66(5):1051-66]; [Pascolo et al., HLA-A2.1-restricted education and cytolytic activity of CD8(+) T lymphocytes from beta2 microglobulin (beta2m) HLA-A2.1 monochain transgenic H-2Db beta2m double knockout mice. J Exp Med. 1997 Jun 16;185(12):2043-51]).
A.2. 면역 계획
면역 계획은 도 1에 도시되어 있다. 간략히, 14마리의 β/A2/DR3 마우스를 무작위로 (마우스 성별 및 연령을 기준으로) 2개의 실험군에 배정하고, 각각을 공통 헬퍼 펩티드(h-pAg)와 조합된 특정 백신 접종 펩티드(vacc-pAg)로 면역시켰다(하기 표 7에 개괄됨). vacc-pAg를 커플로 비교하였다(군 1 대 군 2). 이로써, 단일 펩티드의 천연 및 최적화된 버전 모두를 각각의 파에서 비교하였다.
실험군 조성. h-pAg: '헬퍼' 펩티드; vacc-pAg: 백신 접종 펩티드. 부스트 주사의 수는 괄호 안에 표시되어 있다.
군 펩티드 (vacc-pAg) 헬퍼 (h-pAg) 기본 부스트 동물 수
1 IL3RA2-B (100 μg) 서열번호 18 HHD-DR3 (150 μg) 서열번호 32 + + (1X) 6
2 IL3RA2-H (100 μg) 서열번호 1 HHD-DR3 (150 μg) 서열번호 32 + + (1X) 6
펩티드를 하기와 같이 제공하였다:
· vacc-pAg의 커플: IL13RA2-H 및 IL13RA2-B; 모두 4 mg/ml(4 mM) 농도로 생산되고 제공됨;
· h-pAg: HHD-DR3 펩티드(서열번호 32); 동결건조되고(50.6 mg; 유로젠텍(Eurogentec) 배취 1611166) 순수한 증류수에 10 mg/mL 농도로 재현탁된 상태로 제공됨.
동물을 제0일(d0)에 기본 주사로 면역시키고 d14에 부스트 주사로 면역시켰다. 각각의 마우스에게 하기를 함유하는 100 μL의 유성 유화액을 꼬리 맨 아래 부분에 피하 주사하였다:
· 100 μg의 vacc-pAg(마우스 당 25 μL의 4 mg/mL 스톡);
· 150 μg의 h-pAg(마우스 당 15 μL의 10 mg/mL 스톡);
· 50 μL의 총 부피에 도달시키는 10 μL의 PBS(마우스 당);
· 1:1(v:v) 비로 첨가된 불완전 프로이드 보조제(IFA)(마우스 당 50 μL).
하기와 같이, 별개의 유화액을 각각의 vacc-pAg에 대해 제조하였다: IFA 시약을 15 mL 튜브에서 vacc-pAg/h-pAg/PBS 혼합물에 첨가하고 농후한 유화액을 형성할 때까지 볼텍스 상에서 1분의 반복된 주기 동안 혼합하였다.
A.3. 마우스 분석
부스트 주사 7일 후에(즉, d21에), 동물을 안락사시키고, 비장을 채취하였다. 비장 세포를, 기관의 기계적 분열 후에, 70 μm-여과 및 Ficoll 밀도 구배 정제에 의해 준비하였다.
비장 세포를 ELISPOT-IFNγ 분석에서 즉시 사용하였다(표 8). 실험 조건을, 웰 당 2*105개의 총 비장 세포를 사용하여, 4회 실험으로 반복하고, vacc-pAg(10 μM) 또는 콘카나발린 A(ConA, 2.5 μg/mL)의 존재 하에, 또는 배지만 존재 하에 배양하여 이의 IFNγ 분비 능력을 평가하였다. 상업적 ELISPOT-IFNγ 키트(디아클론 키트 뮤즈린(Diaclone Kit Mujrine) IFNγ ELISPOT)를 제조사의 지시에 따라 사용하고, 분석을 약 16시간의 항온처리 후에 수행하였다.
ELISPOT-IFNγ 분석의 셋업
군 자극 웰 동물 총
1 IL13RA2-B (10 μM) 서열번호 18 4 6 24
IL13RA2-H (10 μM) 서열번호 1 4 6 24
ConA(2.5 μg/ml) 4 6 24
배지 4 6 24
2 IL13RA2-B (10 μM) 서열번호 18 4 6 24
IL13RA2-H (10 μM) 서열번호 1 4 6 24
ConA(2.5 μg/ml) 4 6 24
배지 4 6 24
스팟을, 이뮤노스팟(Immunospot) 5.4 소프트웨어에 접속된 그랜드 이뮤노스팟(Grand Immunospot, 등록상표) S6 얼티밋 UV 이미지 애널라이저(Ultimate UV Image Analyzer)(CTL-유럽) 상에 계수하였다. 데이터 플롯팅 및 통계 분석을 프리즘-5 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드(GraphPad Software Inc.))를 사용하여 수행하였다.
세포 현탁액을 T 세포수 정규화를 위해 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 단클론 항체 칵테일(데이터는 제시되지 않음)을 정제된 백혈구 상에 뮤린(1:10 희석된 '항-mCD16/CD32 CF11 클론' - 내부 소스) Fc 수용체를 표적화하는 Fc-차단 시약의 존재 하에 적용하였다. 항온처리를 96-웰 플레이트에서 암(dark)에서 4℃에서 15 내지 120분 동안 수행하였다. 세포를 염색 후에 원심분리에 의해 세척하여 과량의 단클론 항체 칵테일을 제거하고, 데이터 획득을 위해 PBS에 재현탁하였다.
모든 데이터 획득을 FACS-Diva 소프트웨어에 접속된 LSR-II Fortessa 유세포 측정기(비디 바이오사이언스(BD Bioscience))를 사용하여 수행하였다. 데이터 분석을 게이팅(gating) 전략(나타내지 않음)을 사용하는 FlowJo-9 소프트웨어(트리스타 인코포레이티드(TreeStar Inc.))를 사용하여 수행하였다.
FACS 패널 EXP-1
표적 라벨 클론 제공업체 희석
mCD3εγ FITC 145-2C11 바이오레전드(Biolegend) 1/100
mCD4 PE RM4-5 바이오레전드 1/100
mCD8α APC 53-6,7 바이오레전드 1/100
B. 결과
총 14마리의 β/A2/DR3 마우스를 본 실험에서 사용하였다(표 8 참조). 희생시, 비장 T 세포 집단을 유세포 분석법에 의해 분석하였고, 이는 대부분이 CD4+ T 세포 서브세트에 속해 있음을 보여준다.
Figure pct00003
적절한 자극과 함께 플레이팅하고 항온처리한 후에, IFNγ-생산 세포가 표면화되었고, 이를 계수하였다. 이어서, 데이터를 106개의 총 T 세포 당 특정 스팟의 수('배지만 존재' 조건에서 수득된 평균 수를 감함)로서 정규화하였다.
개별적 평균 값(4회 실험으로부터 수득됨)을 다음으로 군 평균 값을 플롯팅하는 데 사용하였다(도 3A 참조). T 세포의 기능적 능력이 개체마다 다를 수 있는 것과 같이, 데이터를 또한 개체 당 ConA 반응의 백분율로서 표현하였다(도 3B 참조).
종합적으로, IL13RA2-B pAg 박테리아 펩티드에 의한 백신 접종은, IL13RA2-H pA(기준 인간)-백신 접종시킨 동물(군 2)과 비교하여, ELISPOT-IFNγ 분석에서 개선된 T 세포 반응을 유발하였다. 군 1(IL13RA2-B)의 경우, IL13RA2-B pAg에 의한 생체외 재자극은 IL13RA2-H pAg에 의한 것보다 높은 반응을 촉진하였다. 군 2(IL13RA2-H)의 경우는 그렇지 않았다. 각각의 조건에 대한 ConA-유발된 반응의 백분율(평균 +/- SEM)은 하기와 같았다:
· 군 1 (IL13RA2-B) / IL13RA2-B pAg: 56.3% +/- 18.1
· 군 1 (IL13RA2-B) / IL13RA2-H pAg: 32.3% +/- 11.8
· 군 2 (IL13RA2-H) / IL13RA2-B pAg: 2.0% +/- 0.8
· 군 2 (IL13RA2-H) / IL13RA2-H pAg: 1.1% +/- 0.8
따라서, 이러한 결과는, IL13RA2를 표적화하는 종양-항원 면역 요법이 생체내 T 세포 반응을 개선할 수 있고, 실시예 1 내지 3에 개괄된 바와 같이 식별되는 IL13RA2-B 박테리아 펩티드(서열번호 18)가 이러한 목적을 위해 특히 효율적인 것의 실험 증거를 제공한다.
실시예 7: 박테리아 펩티드 IL13RA2-B(서열번호 18)는 종양 세포에 대한 시험관내 세포 독성을 제공한다.
본 실시예는, 서열번호 18의 박테리아 펩티드(FLPFGFILV; 본원에서 "IL13RA2-B"로도 지칭됨)가, IL13RA2를 발현하는 종양 세포인 U87 세포에 대한 시험관내 세포 독성을 제공한다는 증거를 제공한다. 대조적으로, IL13RA2로부터 유래된 상응하는 기준 인간 펩티드(WLPFGFILI, 서열번호 1, 본원에서 "IL13RA2-H"로도 지칭됨)는 U87 세포에 대한 시험관내 세포 독성을 제공하지 않는다.
A. 방법
간략히, IL13RA2-H 또는 IL13RA2-H로 면역시킨 마우스의 CD8 T 세포를 사용하였다. 이들 세포를, 면역시킨 마우스의 비장 세포의 분류 후에 수득하였고, U87 세포(IL13RA2를 발현하는 종양 세포)의 상부에 위치시켰다.
보다 상세히, CD3+ T 세포를, IL13RA2-H(WLPFGFILI, 서열번호 1) 또는 IL13RA2-B(FLPFGFILV, 서열번호 18)로 면역시킨 HHD 마우스의 비장 세포로부터 정제하였다. 이를 위해, B6 β2mko HHD/DR3 마우스에게, 실시예 6에 기재된 바와 같이, 제0일 및 제14일에 백신 접종 펩티드 + 헬퍼 펩티드 + CFA(완전 프로이드 보조제)를 함유하는 100 μL의 유성 유화액으로 꼬리 맨 아래 부분에 피하 주사하였다. d21에, 부스트 주사 7일 후에, 동물을 안락사시키고, 비장을 채취하였다. 비장 세포를 기관의 기계적 분열에 의해 준비하였다. CD3+ 정제를 권고되는 절차를 사용하여 마우스 전체 T 세포 단리 키트(밀테나이 바이오테크(Miltenyi biotec))를 사용하여 수행하였다. 세포의 효율적인 정제 및 생존능을 생존능에 대한 적절한 마커 CD8, CD4, CD3 및 CD45를 사용하여 세포 분석법에 의해 입증하였다.
U87-MG 세포를 6 × 105 세포/웰로 평저 24-웰 배양 플레이트에 시딩하고 24시간 동안 37℃에서 FCS(fetal calf serum) 및 항생제를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 항온처리하였다. 24시간 후에, 배양 배지를 제거하고 정제된 T CD3+ 세포를 함유하는 배지로 교체하였다. 하기 비의 T 세포 대 U87-MG 세포가 사용되었다: 1/0.5, 1/1 및 1/5.
U87-MG 세포 및 CD3+ T 세포의 공동-배양 72시간 후에, 웰의 모든 세포를 채취하고, 특정 U87-MG 세포 사멸을 CD45 음성 세포를 DAPI 및 형광 아넥신(annexin) V에 의해 면역 염색시킨 후에 평가한 후에, 세포 분석하였다.
B. 결과
결과를 도 3에 나타냈다. 일반적으로, U87 세포 용해가 IL13RA2-H에 의한 처리가 아닌 IL13RA2-B에 의한 처리 후에 관찰되었다.
실시예 8: 인간 미생물 유전체에서 종양-관련된 항원 FOXM1의 에피토프의 박테리아 서열 변이체의 식별
본 실시예에서, 600개의 항원 중에서, 포크헤드 박스 M1(FOXM1)을 하기 사실을 기반으로 선택하였다: (i) FOXM1은 CTL(세포 독성 T 림프구) 에피토프로서 식별되는 에피토프를 포함한다(문헌Yokomine K, Senju S, Nakatsura T, Irie A, Hayashida Y, Ikuta Y, Harao M, Imai K, Baba H, Iwase H, Nomori H, Takahashi K, Daigo Y, Tsunoda T, Nakamura Y, Sasaki Y, Nishimura Y. The forkhead box M1 transcription factor as a candidate of target for anti-cancer immunotherapy. Int J Cancer. 2010 May 1;126(9):2153-63. doi: 10.1002/ijc.24836]); (ii) FOXM1은 유전자 발현으로부터 데이터를 분석하는 여러 데이터베이스(GEPIA, Gent, Metabolic gene visualizer 및 protein Atlas를 포함함)에서 많은 종양에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다(마이크로 어레이 연구); 및 (iii) 과발현은 또한 뇌 종양에서(문헌[Hodgson JG, Yeh RF, Ray A, Wang NJ, Smirnov I, Yu M, Hariono S, Silber J, Feiler HS, Gray JW, Spellman PT, Vandenberg SR, Berger MS, James CD Comparative analyses of gene copy number and mRNA expression in glioblastoma multiforme tumors and xenografts. Neuro Oncol. 2009 Oct;11(5):477-87. doi: 10.1215/15228517-2008-113]), 췌장 종양에서(문헌[Xia JT, Wang H, Liang LJ, Peng BG, Wu ZF, Chen LZ, Xue L, Li Z, Li W. Overexpression of FOXM1 is associated with poor prognosis and clinicopathologic stage of pancreatic ductal adenocarcinoma. Pancreas. 2012 May;41(4):629-35. doi: 10.1097/MPA.0b013e31823bcef2]), 난소암에서(문헌[Wen N, Wang Y, Wen L, Zhao SH, Ai ZH, Wang Y, Wu B, Lu HX, Yang H, Liu WC, Li Y.Overexpression of FOXM1 predicts poor prognosis and promotes cancer cell proliferation, migration and invasion in epithelial ovarian cancer. J Transl Med. 2014 May 20;12:134. doi: 10.1186/1479-5876-12-134]), 대장암에서(문헌[Zhang HG, Xu XW, Shi XP, Han BW, Li ZH, Ren WH, Chen PJ, Lou YF, Li B, Luo XY.Overexpression of forkhead box protein M1 (FOXM1) plays a critical role in colorectal cancer. Clin Transl Oncol. 2016 May;18(5):527-32. doi: 10.1007/s12094-015-1400-1]), 및 많은 다른 암에서 보고되었다.
특히, 상기에 기재된 바와 같은 종양/암에서 FOXM1의 과발현 및 선택적 발현의 확인을 하기와 같이 수행하였다: "TCGA"(https://cancergenome.nih.gov/에서 입수가능)에 의해 생성된 tissue atlas(RNA-seq 데이터 37개의 정상 조직 및 17개의 암 유형)로부터의 mRNA 데이터의 분석은 정상 조직에서(고환 제외) FOXM1 mRNA 의 낮은 기저 수준 및 여러 종양 유형에서 FOXM1 mRNA 발현의 높은 수준을 강조한다. FOXM1 mRNA 발현을 Metabolic gEne RApid Visualizer(http://merav.wi.mit.edu/에서 입수가능, 국제 게놈 컨소시엄 및 NCBI GEO 데이터세트의 데이터를 분석함)을 사용하여 수행하였을 때 동일한 결과를 수득하였고, 여기서 시험된 대부분의 정상 조직(배아 제외)에서 매우 낮은 기저 발현,및 유방암 샘플, 식도암 샘플, 폐암 샘플, 흑색종 샘플, 대장 샘플 및 교아종 샘플을 포함하는 많은 종양 샘플에서 강한 발현이 관찰되었다.
FOXM1은 FOXM1 유전자에 의해 인간에서 암호화되는 G1-S 및 G2-M 진행에 수반되는 전사 인자이다. 비전면 방식으로, FOXM1은 잠재적 면역 요법 표적으로서 제안되었다(문헌[Yokomine K, Senju S, Nakatsura T, Irie A, Hayashida Y, Ikuta Y, Harao M, Imai K, Baba H, Iwase H, Nomori H, Takahashi K, Daigo Y, Tsunoda T, Nakamura Y, Sasaki Y, Nishimura Y; The forkhead box M1 transcription factor as a candidate of target for anti-cancer immunotherapy. Int J Cancer. 2010 May 1;126(9):2153-63. doi: 10.1002/ijc.24836]). FOXM1의 높은 발현은, 예를 들어 종양 성장, 혈관신생, 이동, 침윤, 상피-간충직 전이, 전이 및 화학 요법 약물 내성에 참여하는 발암성 변화에 추가로 연관되었다(문헌[Wierstra I.FOXM1 (Forkhead box M1) in tumorigenesis: overexpression in human cancer, implication in tumorigenesis, oncogenic functions, tumor-suppressive properties, and target of anticancer therapy. Adv Cancer Res. 2013;119:191-419. doi: 10.1016/B978-0-12-407190-2.00016-2]). 따라서, FOXM1은 드라이버 종양 항원으로서 간주될 수 있다.
다음 단계에서, 특이적으로 MHC-I에 의해 제시되는 선택된 종양-관련된 항원의 에피토프를 식별하였다. 이를 위해, (FOXM1의) 종양-관련된 항원 서열을 프로테아좀 절단, TAP 수송, 및 펩티드 제시의 예측을 위한 MHC 클래스 I 분석 툴을 조합한, "면역 에피토프 데이터베이스 및 분석 리소스"(IEDB; http://www.iedb.org/; MHC-I 분석의 경우 특히: http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_processing.html - FOXM1 분석의 경우 사용됨, 또한 http://tools.immuneepitope.org/processing/ 참조)에 의해 분석하였다. 즉, FOXM1의 단백질 서열을 HLA.A2.1에 의해 제시될 수 있는 잠재적 에피토프의 식별을 위한 IEDB 분석 툴에 제출하였다. 이로써, HLA A2.1 결합 특성을 갖는 756개의 잠재적 에피토프의 목록을 수득하였다. 상기 목록의 3개의 에피토프는 잠재적 에피토프로서 이전에 기재되었다: YLVPIQFPV(서열번호 55), SLVLQPSVKV(서열번호 56)/LVLQPSVKV(서열번호 57) 및 GLMDLSTTPL(서열번호 58)/LMDLSTTPL(서열번호 59)(요코미네(Yokomine) 등에 의해 기재되고 기능적으로 입증되었다)(문헌[Yokomine K, Senju S, Nakatsura T, Irie A, Hayashida Y, Ikuta Y, Harao M, Imai K, Baba H, Iwase H, Nomori H, Takahashi K, Daigo Y, Tsunoda T, Nakamura Y, Sasaki Y, Nishimura Y. The forkhead box M1 transcription factor as a candidate of target for anti-cancer immunotherapy. Int J Cancer. 2010 May 1;126(9):2153-63. doi: 10.1002/ijc.24836]).
종양 세포의 표면에서 MHC에 의해 효율적으로 제시될 수 있는 좋은 기회를 갖는 에피토프를 식별하기 위해, HLA A2.1 결합 특성을 갖는 756개의 잠재적 에피토프의 목록에서, HLA A2.1에 대한 756개의 후보자 에피토프의 인실리코 친화도를 NetMHCpan 4.0 툴(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)을 사용하여 계산하였다(이때, 최대 허용되는 친화도(IC50)는 3000 nM이다). 이로써, 35개의 FOXM1 에피토프의 목록을 수득하였다.
최종적으로, 35개의 선택된 FOXM1-에피토프를, 35개의 선택된 인간 FOXM1-에피토프의 미생물 서열 변이체를 식별하기 위해 "인간 소화관 미생물 유전체의 통합된 참고 카탈로그"(http://meta.genomics.cn/meta/home에서 입수가능)와 비교하였다. 이를 위해, 단백질 BLAST 조사(blastp)를 "PAM-30" 단백질 치환 매트릭스를 사용하여 수행하였으며, 이는 시간에 따른 부위 당 아미노산 변화의 비를 기술하고 35개 이하의 아미노산의 길이를 갖는 쿼리에 대해 권장된다; 2의 단어 크기(또한 짧은 쿼리에 대해 제안됨); 20000000의 예상 값(E)(가능한 매치의 수를 최대화하도록 조정됨); '0'으로 설정된 조성-기반-통계(이는 30개의 아미노산보다 짧은 인풋 서열이며 이는 갭이 없는 정렬만 허용한다). 이후에, blastp 결과를 필터링하여 인간 펩티드의 시작부 및/또는 말단부에서만 미스매치를 허용하는, (HLA-A2.1에 대한 결합을 위한) 9 또는 10개의 아미노산의 길이를 갖는 미생물 펩티드 서열을 수득하였고, 여기서, 서열 당 최대 2개의 미스매치가 허용된다(상기 최대 2개의 미스매치에 더하여, 제3 미스매치가 유사한 특성을 갖는 아미노산에 대해 허용되었다(즉, 상기에 기재된 보존적 아미노산 치환)). 이로써, 573개의 박테리아 서열의 목록을 수득하였고, 이는 인간 미생물 유전체에서 선택된 FOXM1 에피토프의 박테리아 서열 변이체로 이루어졌다.
실시예 9: MHC에 대한 선택된 박테리아 서열 변이체의 결합 시험
MHC 분자에 대한 미생물 모방체의 결합이 세포 독성 T 세포에 대한 항원 제시에 필수적이기 때문에, MHC 클래스 I HLA.A2.01에 대한 573개의 박테리아 서열의 친화도를 NetMHCpan 4.0 툴(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)을 사용하여 계산하였다. 573개의 박테리아 서열(실시예 8의 blastp 결과)을 인풋으로서 사용하였고, 친화도를 강한 바인더 및 약한 바인더에 대한 기본 임계값을 설정함으로써 예측하였다. 400000개의 랜덤 천연 펩티드 세트와 비교한 예측된 친화도의 순위를 결합 친화도의 척도로서 사용하였다. 이러한 값은 높거나 낮은 평균 예측된 친화도에 대한 특정 분자의 고유한 편항에 영향을 받지 않는다. 매우 강한 바인더는 0.5 미만의 %순위를 갖는 것으로 정의되고, 강한 바인더는 0.5 이상 내지 1.0 미만의 %순위를 갖는 것으로 정의되고, 중간 바인더는 1.0 이상 내지 2.0 이하의 %순위를 갖는 것으로 정의되고, 약한 바인더는 2.0 미만의 %순위를 갖는 것으로 정의된다. 즉, 573개의 박테리아 서열로부터, 매우 강한 친화도(%순위 < 0.5)를 나타내는 것만이 선택되었고, 여기서 인간 기준 에피토프는 (인간 펩티드에 대해) 적어도 강한 친화도(%순위 < 1)를 나타낸다.
이로써, 하기 20개의 박테리아 서열 변이체를 식별하였다(표 11).
인간 기준 에피토프,
서열번호 		박테리아 펩티드,
서열번호 		친화도 인간 펩티드 [nM] 친화도 인간 펩티드 %순위 친화도 박테리아 펩티드 [nM] 친화도 박테리아 펩티드 %순위
60 66 33.8685 0.5 36.7574 0.5
61 67 35.0299 0.5 24.6073 0.4
61 68 35.0299 0.5 18.9641 0.25
62 69 22.1919 0.3 3.4324 0.015
62 70 22.1919 0.3 5.4835 0.04
62 71 22.1919 0.3 32.5867 0.5
55 72 2.0623 0.01 10.1452 0.125
55 73 2.0623 0.01 18.7154 0.25
59 74 36.1922 0.5 28.9885 0.4
59 75 36.1922 0.5 20.6064 0.3
63 76 58.7874 0.7 1.7952 0.01
63 77 58.7874 0.7 4.8682 0.04
63 78 58.7874 0.7 20.2275 0.3
63 79 58.7874 0.7 2.5715 0.01
63 80 58.7874 0.7 3.0709 0.01
63 81 58.7874 0.7 2.1973 0.01
64 82 39.9764 0.6 35.5715 0.5
65 83 4.1604 0.025 14.2518 0.175
62 84 22.1919 0.3 8.3115 0.09
실시예 10: 선택된 박테리아 서열 변이체를 포함하는 박테리아 단백질의 애노테이션 및 세포 국소화의 결정
다음으로, 선택된 박테리아 에피토프 서열 변이체를 함유하는 박테리아 단백질의 애노테이션을 수행하였다. 이를 위해, 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG)(http://www.genome.jp/kegg/) 및 미국 국립 생물공학정보 센터(NCBI) 기준 서열 데이터베이스(RefSeq)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/) 둘 모두에 대한 blast-기반 비교를 수행하였다. RefSeq는 게놈 DNA, 전사체 및 단백질을 포함하는, 통합되고 중복되지 않은 서열 세트를 제공한다. KEGG에서, KO(KEGG 오쏠로지) 데이터베이스에 저장된 분자-수준 기능이 사용될 수 있다. 이러한 기능은 공통 선조로부터 진화한 상이한 종의 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 함유하는 오쏘로그의 군으로 분류된다.
다음 단계에서, 선택된 박테리아 에피토프 서열 변이체를 함유하는 박테리아 단백질의 세포 국소화의 예측을 2개의 상이한 절차를 사용하여 수행하였고, 이후에 컨센서스 예측을 포함하는, 펩티드-함유 단백질의 목록을 전달한다. 먼저, 신호 펩티드의 존재의 예측을 기반으로 세포내 또는 세포외 단백질을 식별하는 둘로 갈리는 조사 전략을 수행하였다. 신호 펩티드는 진핵생물에서 세포질 막을 가로지르는 전좌를 위한 이의 패신저 단백질을 표적화하는 보편적인 단백질-분류 신호이다. 이에 있어서, SignalP 4.1.(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) 및 포비어스 서버(phobius.sbc.su.se) 둘 모두를 사용하여 컨센서스 예측을 전달한다. 신호 펩티드의 존재가 2개의 접근법에 의해 검출되는 경우, 이는 단백질이 세포외 또는 세포질에 존재할 가능성이 있는 것으로 해석되었다. 그렇지 않은 경우, 단백질은 아마 외막/내막에 속하거나 세포질에 존재한다. 두번째로, 막관통 토폴로지의 예측이 수행된다. 신호 펩티드 및 막관통 도메인 둘 모두는 소수성이나, 막관통 나선은 전형적으로 보다 긴 소수성 영역을 갖는다. SignalP 4.1. 및 포비어스는 신호 펩티드를 막관통 도메인과 구별하는 능력을 갖는다. 2개의 예측된 막관통 나선의 최소 수는 막과 세포질 단백질 사이를 구별하도록 설정되어 최종 컨센서스 리스트를 전달한다. 박테리아 단백질의 잠재적 세포 국소화에 관한 데이터는 면역원성 펩티드는 선택에 관심이 있으며, 분비된 엑소좀에 함유되는 분비된 성분 또는 단백질이 APC에 의해 보다 제시되기 쉬운 것을 추정한다.
표 12는 표 11에 나타낸 박테리아 펩티드를 함유하는 박테리아 단백질의 서열번호, 이의 애노테이션 및 세포 국소화를 보여준다.
Figure pct00004
Figure pct00005
표 11 및 12의 데이터를 기반으로, 서열번호 59에 따른 인간 FOXM1 기준 에피토프(LMDLSTTPL; "FOXM1-H2"로도 지칭됨)의 서열 변이체인, 서열번호 75에 따른 박테리아 펩티드(아미노산 서열: LMDLSTTEV;"FOXM1-B2"로도 지칭됨)를 추가적 연구를 위해 선택하였다. 실질적으로, 인간 기준 에피토프는 중간/높은 친화도를 가지며, 종양 세포의 표면에 제시된다. 이러한 MHC 제시를 여러 공개된 연구에서 확인하였다(문헌[Yokomine K, Senju S, Nakatsura T, Irie A, Hayashida Y, Ikuta Y, Harao M, Imai K, Baba H, Iwase H, Nomori H, Takahashi K, Daigo Y, Tsunoda T, Nakamura Y, Sasaki Y, Nishimura Y. The forkhead box M1 transcription factor as a candidate of target for anti-cancer immunotherapy. Int J Cancer. 2010 May 1;126(9):2153-63. doi: 10.1002/ijc.24836]).
서열번호 75(LMDLSTTEV)의 박테리아 서열 변이체는 HLA.A2.01에 대한 강한 결합 친화도를 갖는다. 또한, 이러한 박테리아 펩티드 서열 변이체는 박테리아 단백질에 포함되며, 이는 분비되어 MHC 제시를 위한 항원-제시 세포(APC)에 의해 포착될 확률을 증가시키는 것으로 예측된다.
실시예 11: 박테리아 펩티드 FOXM1 B2(서열번호 75)는 HLA-A*0201 대립유전자에 시험관내 결합하며 인간 에피토프보다 우수한 HLA-A*0201 대립유전자에 대한 시험관내 친화도를 갖는다.
본 실시예는, 서열번호 75의 박테리아 펩티드(LMDLSTTEV; 본원에서 "FOXM1-B2"로도 지칭됨)가 HLA-A*0201 대립유전자에 시험관내 결합하고 HLA-A*0201 대립유전자에 대해 시험관내 높은 친화도를 가지는 반면에, FOXM1-H2로부터 유래된 상응하는 기준 인간 펩티드(LMDLSTTPL, 서열번호 59, 본원에서 "FOXM1-H2"로도 지칭됨)는 약간 낮은 친화도를 갖는다는 것을 입증한다.
A. 재료 및 방법
A.1. T2 세포주에 대한 펩티드의 친화도 측정
실험 프로토콜은 HLA-A*0201에 의해 제시되는 펩티드에 대해 인증된 것과 유사하다(문헌[Tourdot et al., A general strategy to enhance immunogenicity of low-affinity HLA-A2.1-associated peptides: implication in the identification of cryptic tumor epitopes. Eur J Immunol. 2000 Dec; 30(12):3411-21]). 펩티드의 친화도 측정을, HLA-A*0201 분자를 발현하나 TAP1/2 음성이고 내인성 펩티드를 제시할 수 없는 인간 종양 세포 T2를 사용하여 수행하였다.
T2 세포(2.105 세포/웰)를 100 ng/μl의 인간 β2m이 보충된 AIMV 배지에서 37℃에서 16시간 동안 펩티드의 농도를 100 μM에서 0.1 μM로 감소시키면서 항온처리하였다. 이어서, 세포를 2회 세척하고 PE에 커플링된 항-HLA-A2 항체로 표시하였다(클론 BB7.2, 비디 파밍겐).
분석을 FACS(구아바 이지 사이트)에 의해 수행하였다. 각각의 펩티드 농도에 대하여, 관심 펩티드에 연관된 라벨링의 기하 평균을 백그라운드 노이즈로부터 감하고 100 μM의 농도에서 기준 펩티드 HIV pol 589-597에 대해 수득된 HLA-A*0202 라벨링의 기하 평균의 백분율로서 보고한다. 이어서, 상대 친화도를 하기와 같이 결정한다:
상대 친화도 = HLA-A*0201의 발현의 20%를 유발하는 각각의 펩티드의 농도 / HLA-A*0201의 발현의 20%를 유발하는 기준 펩티드의 농도.
A.2. 펩티드의 가용화
각각의 펩티드를 아미노산 조성을 고려하여 가용화시켰다. 임의의 시스테인, 메티오닌 또는 트립토판을 포함하지 않는 펩티드의 경우, DMSO의 첨가가 전체 부피의 10% 이하까지 가능하다. 다른 펩티드는 물 또는 PBS(pH 7.4)에 재현탁된다.
B. 결과
T2 세포의 경우: 다양한 펩티드 농도에 대한 평균 형광 강도: 박테리아 펩티드 FOXM1-B2(서열번호 75) 및 인간 펩티드 FOXM1-H2(서열번호 59) 모두는 HLA-A*0201에 결합한다. 그러나, 박테리아 펩티드 FOXM1-B2(서열번호 75)는 인간 펩티드 FOXM1-H2(서열번호 59)보다 양호한 HLA-A*0201에 대한 결합 친화도를 갖는다, 즉, 100 μM 에서 105 vs 77.6; 25 μM에서 98.2 vs 65.4; 및 3 μM에서 12.7 vs 0.9. 또한, 박테리아 펩티드 FOXM1-B2는 HLA-A*0201의 발현의 20%를 유발하는 반면에, 동일한 발현을 위해, 보다 높은 농도, 즉, 12.6 μM의 인간 펩티드 FOXM1-H2가 필요하다.
유사한 결과를 제2 실험으로부터 수득하였다. 이들 데이터는, 박테리아 펩티드 FOXM1-B2가 상응하는 인간 펩티드 FOXM1-H2보다 명백히 우수함을 보여준다.
실시예 12: 마우스에게 박테리아 펩티드 FOXM1-B2(서열번호 75)로 백신 접종시키는 것은 ELISPOT-IFNγ 분석에서 개선된 T 세포 반응을 유발한다.
A. 재료 및 방법
A.1. 마우스 모델
사용된 모델의 특징을 하기 표 13에 개괄하였다.
마우스 모델 C57BL/6J B2m tm1UncIAb-/-Tg(HLA-DRA HLA-DRB1*0301)#Gjh Tg(HLA-A/H2-D/B2M)1Bpe
두문자어 β/A2/DR3
설명 면역적격, 마우스 클래스 I 및 클래스 II MHC 없음
하우징 SOPE 조건(ABSL3)
마우스의 수 다 자란 15마리(8주령 초과)
이들 마우스는 여러 보고서에 기재되어 있다(문헌[Koller et al., Normal development of mice deficient in beta 2M, MHC class I proteins, and CD8+ T cells. Science. 1990 Jun 8;248(4960):1227-30]; [Cosgrove et al., Mice lacking MHC class II molecules. Cell. 1991 Sep 6;66(5):1051-66]; [Pascolo et al., HLA-A2.1-restricted education and cytolytic activity of CD8(+) T lymphocytes from beta2 microglobulin (beta2m) HLA-A2.1 monochain transgenic H-2Db beta2m double knockout mice. J Exp Med. 1997 Jun 16;185(12):2043-51]).
A.2. 면역 계획
면역 계획은 도 1에 도시되어 있다. 간략히, 15마리의 β/A2/DR3 마우스를 공통 헬퍼 펩티드(h-pAg)와 조합된 특정 백신 접종 펩티드(vacc-pAg)로 면역시켰다(하기 표 14에 개괄됨). vacc-pAg를 커플로 비교하였다(군 1 대 군 2). 이로써, 단일 펩티드의 천연 및 최적화된 버전 모두를 각각의 파에서 비교하였다.
실험군 조성. h-pAg: '헬퍼' 펩티드; vacc-pAg: 백신 접종 펩티드. 부스트 주사의 수는 괄호 안에 표시되어 있다.
군 펩티드 (vacc-pAg) 헬퍼 (h-pAg) 기본 부스트 동물 수
1 FOXM1-B2 (100 μg) HHD-DR3 (150 μg) + + (1X) 15
펩티드를 하기와 같이 제공하였다:
· vacc-pAg의 커플: FOXM1-B2 and FOXM1-H2; 모두 4 mg/ml(4 mM) 농도로 생산되고 제공됨;
· h-pAg: HHD-DR3 펩티드 (서열번호 32); 동결건조되고(50.6 mg; 유로젠텍 배취 1611166) 순수한 증류수에 10 mg/mL 농도로 재현탁된 상태로 제공됨.
동물을 제0일(d0)에 기본 주사로 면역시키고 d14에 부스트 주사로 면역시켰다. 각각의 마우스에게 하기를 함유하는 100 μL의 유성 유화액을 꼬리 맨 아래 부분에 피하 주사하였다:
· 100 μg의 vacc-pAg(마우스 당 25 μL의 4 mg/mL 스톡);
· 150 μg의 h-pAg(마우스 당 15 μL의 10 mg/mL 스톡);
· 50 μL의 총 부피에 도달시키는 10 μL의 PBS(마우스 당);
· 1:1(v:v) 비로 첨가된 불완전 프로이드 보조제(IFA)(마우스 당 50 μL).
하기와 같이, 별개의 유화액을 각각의 vacc-pAg에 대해 제조하였다: IFA 시약을 15 mL 튜브에서 vacc-pAg/h-pAg/PBS 혼합물에 첨가하고 농후한 유화액을 형성할 때까지 볼텍스 상에서 1분의 반복된 주기 동안 혼합하였다.
A.3. 마우스 분석
부스트 주사 7일 후에(즉, d21에), 동물을 안락사시키고, 비장을 채취하였다. 비장 세포를, 기관의 기계적 분열 후에, 70 μm-여과 및 Ficoll 밀도 구배 정제에 의해 준비하였다.
비장 세포를 ELISPOT-IFNγ 분석에서 즉시 사용하였다(표 15). 실험 조건을 웰 당 2*105개의 총 비장 세포를 사용하여, 2회 실험으로 반족하고, vacc-pAg(10 μM) 또는 콘카나발린 A(ConA, 2.5 μg/mL)의 존재 하에, 배지만 존재 하에 배양하여 이의 IFNγ 분비 능력을 평가하였다. 상업적 ELISPOT-IFNγ 키트(디아클론 키트 뮤즈린 IFNγ ELISPOT)를 제조사의 지시에 따라 사용하고, 분석을 약 16시간의 항온처리 후에 수행하였다.
ELISPOT-IFNγ 분석의 셋업
군 자극 웰 동물 총
1 FOXM1-H2 (10 μM) 2 15 30
FOXM1-B2 (10 μM) 2 15 30
ConA (2.5 μg/ml) 2 15 30
배지 2 15 30
스팟을, 이뮤노스팟 5.4 소프트웨어에 접속된 그랜드 이뮤노스팟(등록상표) S6 얼티밋 UV 이미지 애널라이저(CTL-유럽) 상에 계수하였다. 데이터 플롯팅 및 통계 분석을 프리즘-5 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드)를 사용하여 수행하였다.
세포 현탁액을 T 세포수 정규화를 위해 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 단클론 항체 칵테일(데이터는 제시되지 않음)을 정제된 백혈구 상에 뮤린(1:10 희석된 '항-mCD16/CD32 CF11 클론' - 내부 소스) Fc 수용체를 표적화하는 Fc-차단 시약의 존재 하에 적용하였다. 항온처리를 96-웰 플레이트에서 암에서 4℃에서 15 내지 120분 동안 수행하였다. 세포를 염색 후에 원심분리에 의해 세척하여 과량의 단클론 항체 칵테일을 제거하고, 데이터 획득을 위해 PBS에 재현탁하였다.
모든 데이터 획득을 FACS-Diva 소프트웨어에 접속된 LSR-II Fortessa 유세포 측정기(비디 바이오사이언스)를 사용하여 수행하였다. 데이터 분석을 게이팅 전략(나타내지 않음)을 사용하는 FlowJo-9 소프트웨어(트리스타 인코포레이티드)를 사용하여 수행하였다.
FACS 패널 EXP-1
표적 라벨 클론 제공업체 희석
mCD3εγ FITC 145-2C11 바이오레전드 1/100
mCD4 PE RM4-5 바이오레전드 1/100
mCD8α APC 53-6,7 바이오레전드 1/100
B. 결과
총 14마리의 β/A2/DR3 마우스를 본 실험에서 사용하였다(표 15 참조). 희생시, 비장 T 세포 집단을 유세포 분석법에 의해 분석하였고, 이는 대부분이 CD4+ T 세포 서브세트에 속해 있음을 보여준다.
개별적 마우스 특징(군 1 및 2). 각각의 마우스는 고유의 귀 태그 ID 번호에 의해 확인된다. a 백신 접종 프로토콜의 개시시 연령(단위: 주); b 전체 백혈구에서 T 세포의 백분율; c 전체 T 세포에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 백분율; d 플레이트(P) 번호.
번호 마우스 Id 성별 연령 (주) a T 세포 (%) b T4 (%) c T8(%) d
1 731 M 22 16.9 80.6 9.58
2 736 M 27 19.9 70.8 15
3 744 F 24 24.1 71.9 12.3
4 753 F 24 19.2 63.2 17.9
5 758 F 24 23.2 68.3 17.7
11 733 M 22 25.4 71.2 12.6
12 738 M 24 30.9 74.9 12.2
13 746 F 22 25.7 70.9 10.8
14 755 F 24 20.5 68.4 14.8
15 756 F 26 15.8 70.7 14.1
21 740 M 24 22.1 77.6 13.7
22 742 F 22 25.6 70.3 16.5
23 748 F 22 17.1 55.1 16.3
24 749 F 23 14 65.5 17.5
25 752 F 24 15.4 60.3 20.1
적절한 자극과 함께 플레이팅하고 항온처리한 후에, IFNγ-생산 세포가 표면화되었고, 이를 계수하였다. 이어서, 데이터를 106개의 총 T 세포 당 특정 스팟의 수('배지만 존재' 조건에서 수득된 평균 수를 감함)로서 정규화하였다.
개별적 평균 값(4회 실험으로부터 수득됨)을 다음으로 군 평균 값을 플롯팅하는 데 사용하였다(도 4 참조). 종합적으로, FOXM1-B2 pAg 박테리아 펩티드(서열번호 75)에 의한 백신 접종은 ELISPOT-IFNγ 분석에서 강한 T 세포 반응을 유발하였다. FOXM1-B2 pAg에 의한 생체외 재자극은 인간 FOXM1-H2 pAg 펩티드에 의한 것보다 높은 반응을 촉진하였다. 그러나, T 세포의 효율적인 활성화가 FOXM1-H2에 의한 생체외 재자극 후에 관찰될 수 있었고, 이는 FOXM1-B2 펩티드에 의한 백신 접종이 인간 종양-연관된 항원 FOXM1-H2를 인식하는 T 세포의 활성화를 추진시켜 인간에서 백신 접종을 위한 FOXM1-B2의 사용을 지원함을 보여준다.
따라서, 이러한 결과는, FOXM1을 표적화하는 종양-항원 면역 요법이 생체내 T 세포 반응을 개선할 수 있고, 실시예 8 및 9에 개괄된 바와 같이 식별된 FOXM1-B2 박테리아 펩티드(서열번호 75)가 이러한 목적을 위해 특히 효율적인 것의 실험 증거를 제공한다.
실시예 13: 인간 미생물 유전체에서 종양-관련된 에피토프의 10 aa 박테리아 서열 변이체의 확인
하기에서, 본 발명에 따라 식별된 10개의 아미노산(10 aa)의 길이를 갖는 박테리아 서열이 종양-연관된 에피토프에 대한 면역 활성화를 유발할 수 있음이 입증된다.
인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Rα2 또는 IL13RA2)는 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 동일한 이유로 종양-연관된 항원으로서 선택되었다. 간략히, IL13RA2 선택은 하기 사실을 기반으로 한다: (i) IL13RA2는 CTL(세포 독성 T 림프구) 에피토프로서 식별된 에피토프를 포함한다(문헌[Okano F, Storkus WJ, Chambers WH, Pollack IF, Okada H. Identification of a novel HLA-A*0201-restricted, cytotoxic T lymphocyte epitope in a human glioma-associated antigen, interleukin 13 receptor alpha2 chain. Clin Cancer Res. 2002 Sep;8(9): 2851-5]); (ii) IL13RA2는 뇌 종양에서 과발현되는 유전자로서 종양 T 세포 항원 데이터베이스 및 CT 데이터베이스에서 언급된다; (iii) IL13RA2의 과발현 및 선택적 발현은 유전자 발현으로부터 데이터를 분석하는, Gent, Metabolic gene visualizer 및 protein Atlas를 툴로서 사용하여 확인되었다(마이크로 어레이 연구); (iv) 과발현은 또한 문헌에서 뇌 종양에서(문헌[Debinski et al., Molecular expression analysis of restrictive receptor for interleukin 13, a brain tumor-associated cancer/testis antigen. Mol Med. 2000 May;6(5):440-9]), 두경부 종양에서(문헌[Kawakami et al., Interleukin-13 receptor alpha2 chain in human head and neck cancer serves as a unique diagnostic marker. Clin Cancer Res. 2003 Dec 15;9(17):6381-8]) 및 흑색종에서(문헌[Beard et al., Gene expression profiling using nanostring digital RNA counting to identify potential target antigens for melanoma immunotherapy. Clin Cancer Res. 2013 Sep 15;19(18):4941-50]) 보고되었다; 및 (v) IL13RA2 에피토프(서열번호 1)에 대한 T 세포 활성화를 유발할 수 있는 9 aa 박테리아 서열(서열번호 18)는 이미 식별되었다(실시예 1 내지 7).
10개의 아미노산의 길이를 갖고 특이적으로 MHC-I에 의해 제시되는 IL13RA2의 에피토프를 식별하였다. 이를 위해, (IL13RA2의) 종양-관련된 항원 서열을 프로테아좀 절단, TAP 수송, 및 펩티드 제시의 예측을 위한 MHC 클래스 I 분석 툴을 조합한 "면역 에피토프 데이터베이스 및 분석 리소스"(IEDB; http://www.iedb.org/; MHC-I 분석의 경우 특히: http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_processing.html - IL13RA2 분석을 위해 사용됨, 또한 http://tools.immuneepitope.org/processing/ 참조)에 의해 분석하였다. 즉, IL13RA2의 단백질 서열을, HLA.A2.1에 의해 제시될 수 있는 잠재적 에피토프의 식별을 위한 IEDB 분석 툴에 제출하였다. MHC 친화도에 의해 효율적으로 제시될 수 있는 좋은 기회를 갖는 에피토프를 식별하기 위해, HLA A2.1에 대한 후보자 에피토프의 인실리코 친화도를 NetMHCpan 3.0 툴(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)을 사용하여 계산하였다(이때 서용되는 최대 친화도(IC50)는 3000 nM이다). 이로써, 10개의 아미노산 길이의 19개의 잠재적 IL13RA2 에피토프의 목록을 수득하였다.
19개의 선택된 IL13RA2-에피토프를 미생물 서열 변이체를 식별하기 위해 "인간 소화관 미생물 유전체의 통합된 참고 카탈로그"(http://meta.genomics.cn/meta/home에서 입수가능)와 비교하였다. 이를 위해, 단백질 BLAST 조사(blastp)를, "PAM-30" 단백질 치환 매트릭스를 사용하여 수행하였으며, 이는 시간에 따른 부위 당 아미노산 변화의 비를 기술하고 35개 이하의 아미노산의 길이를 갖는 쿼리에 대해 권장된다; 2의 단어 크기(또한 짧은 쿼리에 대해 제안됨); 20000000의 예상 값(E)(가능한 매치의 수를 최대화하도록 조정됨); '0'으로 설정된 조성-기반-통계(이는 30개의 아미노산보다 짧은 인풋 서열이며 이는 갭이 없는 정렬만 허용한다). 이후에, blastp 결과를 필터링하여, 인간 펩티드의 시작부 및/또는 말단부에서만 미스매치를 허용하는, (HLA-A2.1에 대한 결합을 위한) 10개의 아미노산의 길이를 갖는 미생물 펩티드 서열을 배타적으로 수득하였고, 여기서 서열 당 최대 3개의 미스매치가 허용된다. 또한, 매우 강한 친화도(%순위 < 0.5)를 나타내는 박테리아 서열만이 선택되었고, 여기서 인간 기준 에피토프는 (인간 펩티드에 대해) 적어도 강한 친화도(%순위 < 1.5)를 나타냈다. 이로써, 5개의 IL13RA2 종양-연관된 펩티드와 유사성을 갖는 11개의 박테리아 펩티드의 목록이 식별되었다.
인간 IL13RA2의 에피토프와 유사성을 갖는 10aa 박테리아 펩티드
박테리아 펩티드, 서열번호 인간 기준 에피토프, 서열번호 친화도 인간 펩티드 %순위 친화도 인간 펩티드 [nM] 친화도 박테리아 펩티드 %순위 친화도 박테리아 펩티드 [nM]
132 127 0.7 54.6434 0.4 24.6345
133 127 0.7 54.6434 0.06 6.4119
134 127 0.7 54.6434 0.4 23.1945
135 128 0.125 9.6997 0.25 17.3756
136 129 0.7 51.5016 0.05 5.5782
137 129 0.7 51.5016 0.05 5.5782
138 130 0.7 50.2853 0.4 25.6338
139 131 1.3 136.856 0.03 4.4932
140 131 1.3 136.856 0.06 6.4084
158 131 1.3 136.856 0.05 5.8225
141 130 0.7 50.2853 0.4 26.8938
다음으로, 표 18에 나타낸 박테리아 펩티드를 함유하는 박테리아 단백질을 식별하였다. 또한, 선택된 박테리아 에피토프 서열 변이체의 박테리아 단백질의 애노테이션을 상기에 기재된 바와 같이 수행하였다. 결과를 표 19에 나타냈다.
표 19는 표 18에 나타낸 박테리아 펩티드를 함유하는 박테리아 단백질의 서열번호, 이의 애노테이션 및 세포 국소화를 보여준다.
Figure pct00006
표 19는 서열번호 139에 따른 박테리아 펩티드(FLPFGFILPV; 본원에서 "IL13RA2-BL"로도 지칭됨)가 인간 미생물에서 발현되는 대부분의 별개의 박테리아 단백질에서, 즉, 5개의 별개의 박테리아 단백질에서 식별되었음을 보여준다. 이러한 이유로, 서열번호 139(FLPFGFILPV)에 따른 박테리아 펩티드를 시험관내 및 생체내 실험을 위해 선택하였다. 상응하는 인간 IL13RA2 에피토프 WLPFGFILIL(IL13RA2-HL, 서열번호 131)은 IL13RA2-H 펩티드의 서열(서열번호 1)을 포괄한다.
실시예 14: 박테리아 펩티드 IL13RA2-BL(서열번호 139)는 HLA-A*0201 대립유전자에 시험관내 결합하고 상응하는 인간 에피토프보다 우수한 HLA-A*0201 대립유전자에 대한 시험관내 친화도를 갖는다.
본 실시예는, 서열 서열번호 139의 박테리아 펩티드(FLPFGFILPV; 본원에서 "IL13RA2-BL"로도 지칭됨)가 HLA-A*0201 대립유전자에 시험관내 결합하고 HLA-A*0201 대립유전자에 대한 시험관내 높은 친화도를 갖는 반면에, IL13RA2로부터 유래된 상응하는 기준 인간 펩티드는 낮은 친화도를 나타냄의 증거를 제공한다.
A. 재료 및 방법
A.1. T2 세포주에 대한 펩티드의 친화도 측정
실험 프로토콜은 HLA-A*0201에 의해 제시되는 펩티드에 대해 인증된 것과 유사하다(문헌[Tourdot et al., A general strategy to enhance immunogenicity of low-affinity HLA-A2.1-associated peptides: implication in the identification of cryptic tumor epitopes. Eur J Immunol. 2000 Dec; 30(12):3411-21]). 펩티드의 친화도 측정을 HLA-A*0201 분자를 발현하나 TAP1/2 음성이고 내인성 펩티드를 제시할 수 없는 인간 종양 세포 T2를 사용하여 수행하였다.
T2 세포(2.105 세포/웰)를 100 ng/μl의 인간 β2m이 보충된 AIMV 배지에서 37℃에서 16시간 동안 펩티드의 농도를 100 μM에서 0.1 μM로 감소시키면서 항온처리하였다. 이어서, 세포를 2회 세척하고 PE에 커플링된 항-HLA-A2 항체로 표시하였다(클론 BB7.2, 비디 파밍겐).
분석을 FACS(구아바 이지 사이트)에 의해 수행하였다. 각각의 펩티드 농도에 대하여, 관심 펩티드에 연관된 라벨링의 기하 평균을 백그라운드 노이즈로부터 감하고 100 μM의 농도에서 기준 펩티드 HIV pol 589-597에 대해 수득된 HLA-A*0202 라벨링의 기하 평균의 백분율로서 보고한다. 이어서, 상대 친화도를 하기와 같이 결정한다:
상대 친화도 = HLA-A*0201의 발현의 20%를 유발하는 각각의 펩티드의 농도 / HLA-A*0201의 발현의 20%를 유발하는 기준 펩티드의 농도.
A.2. 펩티드의 가용화
각각의 펩티드를 아미노산 조성을 고려하여 가용화시켰다. 임의의 시스테인, 메티오닌 또는 트립토판을 포함하지 않는 펩티드의 경우, DMSO의 첨가가 전체 부피의 10% 이하까지 가능하다. 다른 펩티드는 물 또는 PBS(pH 7.4)에 재현탁된다.
B. 결과
T2 세포의 경우: 다양한 펩티드 농도에 대한 평균 형광 강도: 박테리아 펩티드 IL13RA2-BL(서열번호 139)은 HLA-A*0201에 결합하는 반면에, 상응하는 인간 펩티드는 HLA-A*0201에 결합하지 않는다. 박테리아 펩티드 IL13RA2-BL(서열번호 139)은 HLA-A*0201에 대한 강한 결합 친화도를 나타낸다(즉, 100 μM에서 최대 HIV pol 589-597 결합 활성의 69%; 25 μM에서 96%; 및 6.25 μM에서 43%). 또한, 결과를 도 5에 나타냈다.
실시예 15: 마우스를 박테리아 펩티드 IL13RA2-BL(서열번호 139)로 백신 접종시키는 것은 ELISPOT-IFNγ 분석에서 개선된 T 세포 반응을 유발한다.
A. 재료 및 방법
A.1. 마우스 모델
2개의 상이한 마우스 모델을 연구를 위해 사용하였다. 사용된 모델의 특징을 하기 표 20에 개괄하였다.
모델 1 C57BL/6J B2m tm1UncIAb-/-Tg(HLA-DRA HLA-DRB1*0301)#Gjh Tg(HLA-A/H2-D/B2M)1Bpe
두문자어 β/A2/DR3 HHDDR3
설명 면역적격, 마우스 클래스 I 및 클래스 II MHC 없음
모델 2 C57BL/6JB2mtm1UncIAb-/-Tg(HLA-DRA,HLA-DRB1*0101)#GjhTg(HLA-A/H2-D/B2M)1Bpe
두문자어 β/A2/DR1 HHDDR1
설명 면역적격, 마우스 클래스 I 및 클래스 II MHC 없음
이들 마우스는 여러 보고서에 기재되어 있다(문헌[Koller et al., Normal development of mice deficient in beta 2M, MHC class I proteins, and CD8+ T cells. Science. 1990 Jun 8;248(4960):1227-30]; [Cosgrove et al., Mice lacking MHC class II molecules. Cell. 1991 Sep 6;66(5):1051-66]; [Pascolo et al., HLA-A2.1-restricted education and cytolytic activity of CD8(+) T lymphocytes from beta2 microglobulin (beta2m) HLA-A2.1 monochain transgenic H-2Db beta2m double knockout mice. J Exp Med. 1997 Jun 16;185(12):2043-51]).
A.2. 면역 계획
면역 계획은 도 1에 도시되어 있다. 마우스를 공통 헬퍼 펩티드(h-pAg)와 조합된 특정 백신 접종 펩티드(vacc-pAg)로 면역시켰다.
펩티드를 하기와 같이 제공하였다:
· vacc-pAg: IL13RA2-BL; 모두 4 mg/ml(4 mM) 농도로 생산되고 제공됨;
· h-pAg: HHD-DR3 펩티드(서열번호 32); β/A2/DR3 HHDDR3 마우스의 면역을 위해 4 mg/ml(4 mM) 농도로 제공됨;
· h-pAg: UCP2 펩티드(서열번호 159); β/A2/DR1 HHDDR1 마우스의 면역을 위해 4 mg/ml(4 mM) 농도로 제공됨.
동물을 제0일(d0)에 기본 주사로 면역시키고 d14에 부스트 주사로 면역시켰다. 각각의 마우스에게 하기를 함유하는 100 μL의 유성 유화액을 꼬리 맨 아래 부분에 피하 주사하였다:
· 100 μg의 vacc-pAg(마우스 당 25 μL의 4 mg/mL 스톡);
· 150 μg의 h-pAg(마우스 당 15 μL의 10 mg/mL 스톡);
· 50 μL의 총 부피에 도달시키는 10 μL의 PBS(마우스 당);
· 1:1(v:v) 비로 첨가된 불완전 프로이드 보조제(IFA)(마우스 당 50 μL).
하기와 같이, 별개의 유화액을 각각의 vacc-pAg에 대해 제조하였다: IFA 시약을 15 mL 튜브에서 vacc-pAg/h-pAg/PBS 혼합물에 첨가하고 농후한 유화액을 형성할 때까지 볼텍스 상에서 1분의 반복된 주기 동안 혼합하였다.
A.3. 마우스 분석
부스트 주사 7일 후에(즉, d21에), 동물을 안락사시키고, 비장을 채취하였다. 비장 세포를, 기관의 기계적 분열 후에, 70 μm-여과 및 Ficoll 밀도 구배 정제에 의해 준비하였다.
비장 세포를 ELISPOT-IFNγ 분석에서 즉시 사용하였다(표 21). 실험 조건을, 웰 당 2*105개의 총 비장 세포를 사용하여, 4회 실험으로 반복하고, vacc-pAg(10 μM) 또는 콘카나발린 A(ConA, 2.5 μg/mL)의 존재 하에, 또는 배지만 존재 하에 배양하여 이의 IFNγ 분비 능력을 평가하였다. 상업적 ELISPOT-IFNγ 키트(디아클론 키트 뮤즈린 IFNγ ELISPOT)를 제조사의 지시에 따라 사용하고, 분석을 약 16시간의 항온처리 후에 수행하였다.
ELISPOT-IFNγ 분석의 셋업
군 백신 접종 펩티드(vacc-pAg) 자극 웰 동물 총
1 HHD DR3 마우스 (15마리의 마우스) IL13RA2 BL(vacc-pAg) + HHDDR3 헬퍼(h-pAg) + IFA 배지 2 15 30
ConA (2.5 μg/ml) 2 15 30
IL13RA2-BL 2 15 30
IL13RA2-L 2 15 30
2 HHD DR1 마우스 (5마리의 마우스) IL13RA2 BL(vacc-pAg) + UCP2 헬퍼(h-pAg) + IFA 배지 3 5 15
ConA (2.5 μg/ml) 3 5 15
IL13RA2-BL 3 5 15
IL13RA2-HL 3 5 15
스팟을, 이뮤노스팟 5.4 소프트웨어에 접속된 그랜드 이뮤노스팟(등록상표) S6 얼티밋 UV 이미지 애널라이저(CTL-유럽) 상에 계수하였다. 데이터 플롯팅 및 통계 분석을 프리즘-5 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드)를 사용하여 수행하였다.
결과는 도 6 및 7에 나타나 있다. 결과는 IL13RA2-BL 펩티드(서열번호 139)로 마우스를 면역시키는 것이 마우스에서 IL13RA2-BL 및 IL13RA2-HL(서열번호 131)에 대한 비장 세포의 강한 반응을 야기하는 것을 보여준다. 따라서, IL13RA2-BL은 강하게 면역원성이며 인간 펩티드 IL13RA2-HL에 대한 효과적인 면역 반응을 추진할 수 있다.
실시예 16: 마우스 모델에서 미생물 서열 변이체의 식별 방법의 확인
본 발명은, 미생물, 예컨대 편리공생 박테리아로부터 발현되고 관심 종양-특이적 항원에 대한 면역 반응을 촉진할 수 있는 펩티드의 식별에 관한 것이다. 특히, 상기 방법은, 종양-연관된 펩티드의 서열 변이체이고 인간 MHC(예컨대 HLA.A2.01)에 결합할 수 있는 서열 변이체인 박테리아 펩티드의 식별을 가능하게 한다. 본원에 기재된 본 실시예는, 본 발명에 따른 방법이 MHC(예를 들어 HLA.A2)에 대한 강한 결합 친화도를 갖는 에피토프의 미생물 서열 변이체의 식별을 가능하게 하고 에피토프의 미생물 서열 변이체에 의한 백신 접종이 각각의 기준 에피토프에 대한 면역원성을 유발할 수 있음의 증거를 제공한다.
임의의 이론에 구애받지 않고, 본 발명자는, ("자기로부터의") 기준 에피토프가 흉선 선택 동안 특정 T 세포 클론 소진을 야기함을 추정한다. 또한, 임의의 이론에 이론에 구애받지 않고, 본 발명자는 또한 면역계가 편리공생 박테리아의 박테리아 단백질/펩티드에 의해 프라이밍되었고/되었거나 편리공생 박테리아의 박테리아 단백질/펩티드에 더 잘 반응하는 능력을 갖는 것을 추정한다.
상기에 기재된 바와 같은 생체내 실험을 클래스 1 및 클래스 2 MHC를 발현하는 HLA 형질전환된 마우스(HHD DR3 마우스)에서 인간 미생물로부터 식별된 박테리아 펩티드, 및 인간 종양으로부터 식별된 종양-연관된 항원의 에피토프를 사용하여 수행하였다. 그러나, 편리공생 박테리아 종은 인간에서 및 마우스에서 상이하며, 인간 종양-특이적 항원의 에피토프 서열은 마우스 게놈에서 언제나 완전한 상동성을 갖는 것은 아니다. 따라서, 인간 종양 항원의 에피토프는 마우스에서 보다 면역원성의 "비-자기" 서열을 나타낼 수 있는 반면에, 이는 인간에서 덜 면역원성의 "자기" 서열을 나타낼 수 있다.
이러한 관점에서, 본 실시예에서, 에피토프의 미생물 서열 변이체는 마우스 편리공생 박테리아 단백질에서 식별되었다. 이러한 마우스 미생물 서열 변이체는 야생형 마우스에서 마우스 항원의 에피토프에 대한 면역원성을 유도한다.
1. 뮤린 미생물 유전체에서 박테리아 서열 변이체의 식별
뮤린 단백질의 에피토프를 식별하기 위해, 마우스 애노테이션 수행된 단백질을 기준 서열로서 사용하였다. 2개의 관심 마우스 기준 에피토프를 선택하였다(즉, BALB/c 마우스의 경우 마우스 유전자 Phtf1의 "H2 Ld M5"(VSSVFLLTL; 서열번호: 160), 및 C57BL/6 마우스의 경우 마우스 유전자 Stra6의 "H2 Db M2"(INMLVGAIM; 서열번호: 161). Phtf1은 마우스 고환에서 고도로 발현되나 대부분의 마우스 조직에서 낮은 수준으로 발현되는 추정상 호메오도메인 전사 인자 1을 암호화한다. Stra6(레티노산 6에 의해 자극됨)은, 마우스 태반에서 고도로 발현되나 마우스 난소, 신장, 뇌, 유선, 장 및 지방 패드에서 중간 수준으로 발현되는 단백질인 레티놀 흡수 수용체를 암호화한다.
이의 뮤린 미생물 서열 변이체를 식별하기 위해, BALB/c 및 C57BL/6 마우스의 대변 샘플을 마우스 편리공생 미생물 서열결정을 위해 채취하였다. 채취 후에, 미생물 DNA를 IHMS 절차(국제 인간 미생물 유전체 기준; URL: http://www.microbiome-standards.org/#SOPS)를 사용하여 추출하였다. 서열결정을 Illumina(NextSeq500) 기술을 사용하여 수행하고, 마우스 소화관 유전자 카탈로그를 생성하였다.
상기에 기재된 뮤린 기준 에피토프의 뮤린 미생물 서열 변이체를 인간 소화관 미생물 유전체과 관련하여 상기 실시예에서와 본질적으로 동일한 동일성 기준을 사용하여 식별하였다. 특히,인간 미생물 및 인간 종양-연관된 에피토프에 있어서 상기 실시예에서 사용된 기준을 재현하기 위해, 펩티드를 뮤린 기준 서열에 대한 분자 의태를 기반으로 추가로 선택하였고, 이는 선택된 뮤린 기준 펩티드가 낮은 수준 내지 중간 수준으로 상이한 마우스 기관에서 발현되고 중하 수준으로 마우스 MHC 클래스 1에 결합하는 능력을 가짐을 추정한다.
표 22는 2개의 박테리아 펩티드 후보자가 생체내 연구를 우해 선택되었음을 보여준다.
마우스 품종 BALB/c C57BL/6
마우스 유전자/단백질 Phtf1 Stra6
뮤린 에피토프
서열번호
펩티드 명칭
마우스 순위		 VSSVFLLTL
160
H2 Ld M5
2.5		 INMLVGAIM
161
H2 Db M2
3.5
미생물 서열
서열번호
펩티드 명칭
미생물 순위		 KPSVFLLTL
162
H2 Ld B5
0.07		 GAMLVGAVL
163
H2 Db B2
0.6
박테리아 펩티드 H2 Ld B5(서열번호 162)는 BALB/c 마우스의 미생물에서 발견되는 단백질의 단편이다. H2 Ld B5는 Phtf1 펩티드(H2 Ld M5; 서열번호 160)의 서열 변이체이다.
박테리아 펩티드 H2 Db B2(서열번호 163)는 C57BL/6 마우스의 미생물에서 발견되는 단백질의 단편이다. H2 Db B2는 Stra6 펩티드(H2 Db M2; 서열번호 161)의 서열 변이체이다.
2. 박테리아 펩티드 H2 Ld B5(서열번호 162) 및 H2 Db B2(서열번호 163)는 면역원성을 유발하고 마우스 상동 펩티드에 대해 반응하는 T 세포의 활성화를 허용한다.
A. 재료 및 방법
A.1. 마우스 모델
7주령의 건강한 암컷 BALB/c 마우스(n = 12) 및 건강한 암컷 C57BL/6J 마우스(n = 11)를 찰스 리버(Charles River, 프랑스 소재)로부터 입수하였다. 동물을 개별적으로 식별하고 FELASA 가이드라인에 따라 SPF 건강 상태를 유지하였다.
A.2. 면역 계획
면역 계획은 도 1에 도시되어 있다. 간략히, BALB/c마우스 및 C57BL/6 마우스를 각각의 마우스 품종에 대해 2개의 실험군으로 무작위로 할당하고, 각각의 군을 하기 표 23에 나타낸 바와 같이 공통의 헬퍼 펩티드(OVA 323-339 펩티드; 서열: ISQAVHAAHAEINEAGR; 서열번호 164) 및 불완전 프로이드 보조제(IFA)와 조합된 특정 백신 접종 펩티드(vacc-pAg)로 면역시켰다.
실험군
군 마우스 펩티드 (vacc-pAg) 헬퍼
(h-pAg) 		기본 부스트 동물 수
1 BALB/c 없음 OVA 323-339 + + (1X) 6
2 BALB/c H2 Ld B 5 OVA 323-339 + + (1X) 6
3 C57BL/6 없음 OVA 323-339 + + (1X) 5
4 C57BL/6 H2 Db B 2 OVA 323-339 + + (1X) 6
펩티드를 하기와 같이 제공하였다:
· vacc-pAg의 커플: H2 Ld B5 및 H2 Db B2; 모두 4 mg/ml(4 mM) 농도로 생산되고 제공됨; 및
· h-pAg: OVA 323-339(서열번호 164); 4 mg/ml(4 mM) 농도로 제공됨.
동물을 제0일(d0)에 기본 주사로 면역시키고 d14에 부스트 주사로 면역시켰다. 각각의 마우스에게 하기를 함유하는 100 μL의 유성 유화액을 꼬리 맨 아래 부분에 피하 주사하였다:
· 100 μg의 vacc-pAg(마우스 당 25 μL의 4 mg/mL 스톡);
· 150 μg의 h-pAg(마우스 당 15 μL의 10 mg/mL 스톡);
· 50 μL의 총 부피에 도달시키는 10 μL의 PBS(마우스 당);
· 1:1(v:v) 비로 첨가된 불완전 프로이드 보조제(IFA)(마우스 당 50 μL).
하기와 같이, 별개의 유화액을 각각의 vacc-pAg에 대해 제조하였다: IFA 시약을 15 mL 튜브에서 vacc-pAg/h-pAg/PBS 혼합물에 첨가하고 농후한 유화액을 형성할 때까지 볼텍스 상에서 1분의 반복된 주기 동안 혼합하였다.
A.3. 마우스 분석
부스트 주사 7일 후에(즉, d21에), 동물을 안락사시키고, 비장을 채취하였다. 비장 세포를, 기관의 기계적 분열 후에, 70 μm-여과 및 Ficoll 밀도 구배 정제에 의해 준비하였다. 비장 중량, 비장 세포수 및 생존능을 즉시 평가하였다(표 24).
Figure pct00007
비장 세포를 ELISPOT-IFNγ 분석에서 사용하였다(표 X). 실험 조건을, 웰 당 2*105개의 총 비장 세포를 사용하여, 4회 실험으로 반복하고, vacc-pAg(10 μM), 마우스 펩티드 상동체 또는 양성 대조군(1 ng/ml의 포르볼(Phorbol) 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) 및 500 ng/ml의 이노마이신)의 존재 하에, 또는 배지만 존재 하에 배양하여 IFNγ를 분비하는 이의 능력을 평가하였다.
상업적 ELISPOT-IFNγ 키트(디아클론 키트 뮤즈린 IFNγ ELISPOT)를 제조사의 지시에 따라 사용하고, 분석을 약 16시간의 항온처리 후에 수행하였다.
Figure pct00008
스팟을, 이뮤노스팟 5.4 소프트웨어에 접속된 그랜드 이뮤노스팟(등록상표) S6 얼티밋 UV 이미지 애널라이저(CTL-유럽) 상에 계수하였다. 데이터 플롯팅 및 통계 분석을 프리즘-5 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드)를 사용하여 수행하였다.
B. 결과
결과를 도 8(C57BL/6 마우스의 경우) 및 도 9(BALB/c 마우스의 경우)에 나타냈다. 종합적으로, 박테리아 펩티드 H2 Db B2(서열번호 163) 및 H2 Ld B5(서열번호 162)에 의한 백신 접종은 ELISPOT-IFNγ 분석에서 개선된 T 세포 반응을 유발하였다. 또한, 박테리아 펩티드 H2 Db B2 및 H2 Ld B5에 의한 백신 접종은 또한 각각 뮤린 기준 에피토프 H2 Db M2 및 H2 Ld M5에 대한 ELISPOT-IFNγ 분석에서 개선된 T 세포 반응을 유발하였다. 대조군 마우스에서(OVA 323-339 + IFA로 백신 접종시킴), T 세포 반응의 비특이적 유발이 ELISPOT-IFNγ 분석에서 박테리아 펩티드 H2 Db B2 및 H2 Ld B5에 의한 생체외 자극에 대한 반응으로 관찰되지 않았다.
요약하면, 이들 결과는, 상기에 기재된 바와 같은 미생물 서열 변이체의 식별 방법이 숙주 기준 펩티드에 대해 T 세포의 활성화를 유발하는 미생물 서열 변이체를 식별하는 데 효율적이라는 것의 실험 증거를 제공한다.
서열 및 서열번호(서열 목록)의 표
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
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Figure pct00020
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Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
SEQUENCE LISTING <110> ENTEROME S.A. <120> MICROBIOTA SEQUENCE VARIANTS OF TUMOR-RELATED ANTIGENIC EPITOPES <130> EB01P006WO <140> PCT/EP2018/077515 <141> 2018-10-09 <150> EP17195520.6 <151> 2017-10-09 <150> PCT/EP2017/075683 <151> 2017-10-09 <150> EP18305442.8 <151> 2018-04-11 <160> 164 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu Ile 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile Ser Thr 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Phe Leu Ile Ser Thr Thr Phe Gly Cys 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence variant <400> 6 Tyr Leu Tyr Thr Phe Leu Ile Ser Thr 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence variant <400> 7 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Bacterial protein <400> 118 Met Leu Lys Gln Trp Phe Lys Leu Thr Cys Leu Leu Tyr Ile Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ile Leu Ser Gly His Phe Glu Ala Lys Tyr Leu Ile Leu Gly Leu 20 25 30 Leu Gly Ser Ala Leu Ile Gly Tyr Phe Cys Leu Pro Ala Leu Thr Ile 35 40 45 Thr Ser Ser Ile Gly Lys Arg Asp Phe His Leu Leu Asp Ile Ser Phe 50 55 60 Pro Ala Phe Cys Gly Tyr Trp Leu Trp Leu Leu Lys Glu Ile Ile Lys 65 70 75 80 Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Ala Ile Leu Ser Pro Lys Met Lys Ile 85 90 95 Asn Pro Val Ile Ile Glu Ile Asp Tyr Ile Phe Asn Asn Pro Ala Ala 100 105 110 Val Thr Val Phe Val Asn Ser Ile Ile Leu Thr Pro Gly Thr Val Thr 115 120 125 Ile Asp Val Lys Asp Glu Arg Tyr Phe Tyr Val His Ala Leu Thr Asp 130 135 140 Ser Ala Ala Leu Gly Leu Met Asp Gly Glu Arg Gln Arg Arg Ile Ser 145 150 155 160 Arg Val Phe Glu Arg 165 <210> 119 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial protein <400> 119 Met Lys His Ile Thr Phe Ser Asn Gly Asp Lys Val Cys Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Gly Thr Trp Asn Met Gly 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Sequence variant <400> 135 Trp Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Ser Val 1 5 10 <210> 136 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence variant <400> 136 Phe Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Glu Ile 1 5 10 <210> 137 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence variant <400> 137 Phe Ile Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Glu Ile 1 5 10 <210> 138 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence variant <400> 138 Tyr Glu Leu Gln Asn Ile Val Leu Pro Ile 1 5 10 <210> 139 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence variant <400> 139 Phe Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu Pro Val 1 5 10 <210> 140 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence variant <400> 140 Phe Met Pro Phe Gly Phe Ile Leu Pro Ile 1 5 10 <210> 141 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence variant <400> 141 Phe Met Leu Gln Asn Ile Val Lys Asn Leu 1 5 10 <210> 142 <211> 380 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial protein <400> 142 Met Gly Gly Arg Trp Met Gly Tyr Ile Leu Ile Gly Ile Tyr Val Leu 1 5 10 15 Leu Val Leu Tyr His Leu Val Lys Asp Ile Asn Gly Asp Val Lys Trp 20 25 30 Ala Met Val Tyr Ile Thr Phe Gly Phe Leu Phe Tyr Leu Cys Ser His 35 40 45 Cys Glu Tyr Leu Asn Thr Tyr Asp Leu Ser Asn Tyr Asn Ala Gln Tyr 50 55 60 Ala Tyr Tyr Asn Pro Met Trp Asp Lys Ser Phe Thr Leu Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 Phe Leu Thr Met Met Arg Leu Gly Gln Ile Ala Glu Ile Ser Phe Val 85 90 95 Asn Trp Trp Trp Ile Thr Leu Ala Gly Ala Phe Leu Ile Ile Ile Ile 100 105 110 Ala Val Lys Ile His Arg Phe Asn Pro His His Phe Leu Val Phe Phe 115 120 125 Met Met Tyr Tyr Ile Ile Asn Leu Tyr Thr Gly Leu Lys Phe Phe Tyr 130 135 140 Gly Phe Cys Ile Tyr Leu Leu Ala Ser Gly Phe Leu Leu Arg Gly Gly 145 150 155 160 Arg Lys Asn Lys Leu Leu Tyr Val Phe Leu Thr Ala Val Ala Gly Gly 165 170 175 Met His Val Met Tyr Tyr Ala Phe Ile Leu Phe Ala Leu Ile Asn Thr 180 185 190 Asp Met Pro Ala Ser Met Glu Glu Cys Ser Leu Asn Ile Tyr Ser His 195 200 205 Ile Arg Arg His Arg Ile Ile Ala Val Leu Val Ile Ala Ser Leu Thr 210 215 220 Leu Ser Phe Val Leu Arg Leu Ser Gly Ser Ala Asn Glu Phe Leu Ser 225 230 235 240 Arg Val Phe Ser Phe Ile Asp Ser Asp Lys Met Asp Asp Tyr Leu Ser 245 250 255 Leu Ser Thr Asn Gly Gly Phe Tyr Ile Pro Val Ile Met Gln Leu Leu 260 265 270 Ser Leu Tyr Leu Ala Phe Ile Ile Lys Lys Gln Ser Lys Arg Ala Ser 275 280 285 Leu Leu Asn Gln Gln Tyr Thr Asp Val Leu Tyr Tyr Phe Asn Leu Leu 290 295 300 Gln Val Ile Phe Tyr Pro Leu Phe Met Ile Ser Thr Thr Phe Met Arg 305 310 315 320 Leu Ile Thr Ala Thr Ser Met Val Thr Ile Ala Ala Gly Gly Tyr Asn 325 330 335 Lys Phe Glu Ile Lys Gln Arg Lys Arg Phe Lys Ile Ile Gly Ala Ser 340 345 350 Phe Leu Ile Val Ala Ala Ser Leu Phe Arg Gln Leu Val Leu Gly His 355 360 365 Trp Trp Glu Thr Ala Val Val Pro Leu Phe His Leu 370 375 380 <210> 143 <211> 310 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial protein <400> 143 Met Glu Lys Gln Lys Ile Ile Phe Asp Val Asp Pro Gly Val Asp Asp 1 5 10 15 Cys Met Ala Leu Ile Leu Ser Phe Tyr Glu Pro Ser Ile Asp Val Gln 20 25 30 Met Ile Ser Thr Thr Phe Gly Asn Val Ser Val Glu Gln Thr Thr Lys 35 40 45 Asn Ala Leu Phe Ile Val Gln Asn Phe Ala Asp Lys Asp Tyr Pro Val 50 55 60 Tyr Lys Gly Ala Ala Gln Gly Leu Asn Ser Pro Ile His Asp Ala Glu 65 70 75 80 Glu Val His Gly Lys Asn Gly Leu Gly Asn Lys Ile Ile Ala His Asp 85 90 95 Val Thr Lys Gln Ile Ala Asn Lys Pro Gly Tyr Gly Ala Ile Glu Ala 100 105 110 Met Arg Asp Val Ile Leu Lys Asn Pro Asn Glu Ile Ile Leu Val Ala 115 120 125 Val Gly Pro Val Thr Asn Val Ala Thr Leu Phe Asn Thr Tyr Pro Glu 130 135 140 Thr Ile Asp Lys Leu Lys Gly Leu Val Leu Met Val Gly Ser Ile Asp 145 150 155 160 Gly Lys Gly Ser Ile Thr Pro Tyr Ala Ser Phe Asn Ala Tyr Cys Asp 165 170 175 Pro Asp Ala Ile Gln Val Val Leu Asp Lys Ala Lys Lys Leu Pro Ile 180 185 190 Ile Leu Ser Thr Lys Glu Asn Gly Thr Thr Cys Tyr Phe Glu Asp Asp 195 200 205 Gln Arg Glu Arg Phe Ala Lys Cys Gly Arg Leu Gly Pro Leu Phe Tyr 210 215 220 Asp Leu Cys Asp Gly Tyr Val Asp Lys Ile Leu Leu Pro Gly Gln Tyr 225 230 235 240 Ala Leu His Asp Thr Cys Ala Leu Phe Ser Ile Leu Lys Asp Glu Glu 245 250 255 Phe Phe Thr Arg Glu Lys Val Ser Met Lys Ile Asn Thr Thr Phe Asp 260 265 270 Glu Lys Arg Ala Gln Thr Lys Phe Arg Lys Cys Ala Ser Ser Asn Ile 275 280 285 Thr Leu Leu Thr Gly Val Asp Lys Gln Lys Val Ile Lys Arg Ile Glu 290 295 300 Lys Ile Leu Lys Arg Thr 305 310 <210> 144 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial protein <400> 144 Pro Gly Ala Gln Gly Arg Gly Ser Ala Ala Gly Gly Asp Asp Met Ile 1 5 10 15 Trp Glu Leu Leu Val Gln Leu Ala Ala Ala Phe Gly Ala Thr Val Gly 20 25 30 Phe Ala Val Leu Val Asn Ala Pro Pro Arg Glu Phe Val Trp Ala Gly 35 40 45 Val Thr Gly Ala Val Gly Trp Gly Cys Tyr Trp Leu Tyr Leu Gln Trp 50 55 60 Gln Pro Ser Val Ala Val Ala Ser Leu Leu Ala Ser Leu Met Leu Ala 65 70 75 80 Leu Leu Ser Arg Val Phe Ser Val Val Arg Arg Cys Pro Ala Thr Val 85 90 95 Phe Leu Ile Ser Gly Ile Phe Ala Leu Val Pro Gly Ala Gly Ile Tyr 100 105 110 Tyr Thr Ala Tyr Tyr Phe Ile Met Gly Asp Asn Ala Met Ala Val Ala 115 120 125 Lys Gly Val Glu Thr Phe Lys Ile Ala Val Ala Leu Ala Val Gly Ile 130 135 140 Val Leu Val Leu Ala Leu Pro Gly Arg Leu Phe Glu Ala Phe Ala Pro 145 150 155 160 Cys Ala Gly Lys Lys Lys Gly Glu Arg 165 <210> 145 <211> 563 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial protein <400> 145 Met Asn Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Phe Ala Thr Val Leu Ile Ile Thr 1 5 10 15 Leu Leu Phe Ser Ser Ser Val Ser Met Val Ile Leu Ser Asp Gln Met 20 25 30 Met Gln Thr Thr Arg Lys Asp Met Tyr Tyr Thr Val Lys Leu Val Glu 35 40 45 Asn Gln Ile Asp Tyr Gln Lys Pro Leu Glu Lys Gln Ile Asp Lys Leu 50 55 60 Asn Asp Leu Ala Tyr Thr Lys Asp Thr Arg Leu Thr Ile Ile Asp Lys 65 70 75 80 Glu Gly Asn Val Leu Ala Asp Ser Asp Lys Glu Gly Ile Gln Glu Asn 85 90 95 His Ser Gly Arg Ser Glu Phe Lys Glu Ala Leu Ser Asp Gln Phe Gly 100 105 110 Tyr Ala Thr Arg Tyr Ser Ser Thr Val Lys Lys Asn Met Met Tyr Val 115 120 125 Ala Tyr Tyr His Arg Gly Tyr Val Val Arg Ile Ala Ile Pro Tyr Asn 130 135 140 Gly Ile Phe Asp Asn Ile Gly Pro Leu Leu Glu Pro Leu Phe Ile Ser 145 150 155 160 Ala Ala Leu Ser Leu Cys Val Ala Leu Ala Leu Ser Tyr Arg Phe Ser 165 170 175 Arg Thr Leu Thr Lys Pro Leu Glu Glu Ile Ser Glu Glu Val Ser Lys 180 185 190 Ile Asn Asp Asn Arg Tyr Leu Ser Phe Asp His Tyr Gln Tyr Asp Glu 195 200 205 Phe Asn Val Ile Ala Thr Lys Leu Lys Glu Gln Ala Asp Thr Ile Arg 210 215 220 Lys Thr Leu Lys Thr Leu Lys Asn Glu Arg Leu Lys Ile Asn Ser Ile 225 230 235 240 Leu Asp Lys Met Asn Glu Gly Phe Ile Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Glu 245 250 255 Ile Leu Met Val Asn Lys Lys Ala Lys Gln Leu Phe Ser Asp Arg Met 260 265 270 Glu Val Asn Gln Pro Ile Gln Asp Phe Ile Phe Asp His Gln Ile Ile 275 280 285 Asp Gln Leu Glu Asn Ile Gly Val Glu Pro Lys Ile Val Thr Leu Lys 290 295 300 Lys Asp Glu Glu Val Tyr Asp Cys His Leu Ala Lys Val Glu Tyr Gly 305 310 315 320 Val Thr Leu Leu Phe Val Asn Val Thr Glu Ser Val Asn Ala Thr Lys 325 330 335 Met Arg Gln Glu Phe Phe Ser Asn Val Ser His Glu Leu Lys Thr Pro 340 345 350 Met Thr Ser Ile Arg Gly Tyr Ser Glu Leu Leu Gln Ala Gly Met Ile 355 360 365 Asp Asp Pro Lys Val Arg Lys Gln Ala Leu Asp Lys Ile Gln Lys Glu 370 375 380 Val Asp His Met Ser Gln Leu Ile Gly Asp Ile Leu Met Ile Ser Arg 385 390 395 400 Leu Glu Asn Lys Asp Ile Glu Val Ile Lys His Pro Val His Leu Gln 405 410 415 Pro Ile Val Asp Asp Ile Leu Glu Ser Leu Lys Val Glu Ile Glu Lys 420 425 430 Arg Glu Ile Thr Val Glu Cys Asp Leu Thr Ser Gln Thr Tyr Leu Ala 435 440 445 Asn His Gln His Ile Gln Gln Leu Met Asn Asn Leu Ile Asn Asn Ala 450 455 460 Val Lys Tyr Asn Lys Gln Lys Gly Ser Leu Asn Ile His Ser Tyr Leu 465 470 475 480 Val Asp Gln Asp Tyr Ile Ile Glu Val Ser Asp Thr Gly Arg Gly Ile 485 490 495 Ser Leu Ile Asp Gln Gly Arg Val Phe Glu Arg Phe Phe Arg Cys Asp 500 505 510 Ala Gly Arg Asp Lys Glu Thr Gly Gly Thr Gly Leu Gly Leu Ala Ile 515 520 525 Val Lys His Ile Val Gln Tyr Tyr Lys Gly Thr Ile His Leu Glu Ser 530 535 540 Glu Leu Gly Lys Gly Thr Thr Phe Lys Val Val Leu Pro Ile Ile Lys 545 550 555 560 Asp Ser Leu <210> 146 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial protein <400> 146 Met Ile Lys Cys Thr Val His Lys Leu Ser Pro Ser Lys Thr Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Glu Asp Ser Asn Lys Lys Thr Ile Ala Ser Thr Ile Lys Asp Ser 20 25 30 Leu Tyr Leu Tyr Lys Ile Pro Thr Lys Leu Ala Glu Ile Leu Glu Asp 35 40 45 Asp Asp Ile Val Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Asn Tyr Glu Leu Gln Asn 50 55 60 Ile Val Leu Pro Ile Lys Lys Ser Ser Glu Val Lys Ala Ser Ile Tyr 65 70 75 80 Lys Thr Glu Tyr Phe Glu Ile Asn Trp Leu Asn Thr Lys Ile Glu Asp 85 90 95 Leu Ser Ser Thr Val Asp Lys Lys Glu Lys Ala Ile Ile Arg Val Leu 100 105 110 Gly Ile Ile Glu Asn Lys Phe Lys Thr Leu His Leu Trp Ser Thr Ile 115 120 125 Asn Thr Leu Trp Ile Ile Val Leu Thr Ile Val Ile Leu Asn Leu Ile 130 135 140 <210> 147 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial protein <400> 147 Met Gly Ile Leu Leu Phe Ala Val Tyr Val Ile Leu Leu Ile Tyr Phe 1 5 10 15 Leu Phe Phe Ser Glu Glu Tyr Gly Arg Val Ala Gln Ala Glu Arg Val 20 25 30 Tyr Arg Tyr Asn Leu Val Pro Phe Val Glu Ile Arg Arg Phe Trp Val 35 40 45 Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Phe Ala Val Phe Thr Asn Ile Phe Gly 50 55 60 Asn Val Ile Gly Phe Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu Pro Val Ile Phe 65 70 75 80 Arg Arg Met Asn Ser Gly Phe Leu Ile Cys Ile Ser Gly Phe Val Leu 85 90 95 Ser Leu Thr Val Glu Val Ile Gln Leu Val Thr Lys Val Gly Cys Phe 100 105 110 Asp Val Asp Asp Met Ile Leu Asn Thr Leu Gly Ala Ala Leu Gly Tyr 115 120 125 Val Leu Phe Leu Ile Cys Asn His Ile Arg Arg Lys Phe His Tyr Gly 130 135 140 Lys Lys Ile 145 <210> 148 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial protein <400> 148 Met Lys Lys Glu Thr Lys His Ile Ile Arg Thr Leu Gly Thr Ile Leu 1 5 10 15 Phe Ile Leu Tyr Val Leu Ala Leu Ile Tyr Phe Leu Phe Phe Ser Glu 20 25 30 Glu Tyr Gly Arg Ala Ala Leu Glu Glu Arg Gln Tyr Arg Tyr Asn Leu 35 40 45 Ile Pro Phe Val Glu Ile Arg Arg Phe Trp Val Tyr Arg Arg Gln Leu 50 55 60 Gly Phe Met Ala Val Ala Ala Asn Leu Phe Gly Asn Val Ile Gly Phe 65 70 75 80 Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu Pro Val Ile Leu Asp Arg Met Arg Ser 85 90 95 Gly Trp Leu Ile Ile Leu Ala Gly Phe Gly Leu Ser Val Thr Val Glu 100 105 110 Val Ile Gln Leu Ile Thr Lys Val Gly Cys Phe Asp Val Asp Asp Met 115 120 125 Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ala Ala Leu Gly Tyr Leu Leu Phe Phe Ile 130 135 140 Cys Asp His Leu Arg Arg Lys Ile Tyr Gly Lys Lys Ile 145 150 155 <210> 149 <211> 161 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial protein <400> 149 Tyr Asp Asp Leu Arg Gly Phe Phe Leu Lys Lys Glu Thr Lys Thr Leu 1 5 10 15 Ile Arg Arg Met Gly Ile Leu Leu Phe Val Ile Tyr Ile Ile Phe Leu 20 25 30 Val Tyr Phe Leu Phe Phe Ser Glu Glu Tyr Gly Arg Ala Ala Glu Ala 35 40 45 Gln Arg Val Tyr Arg Tyr Asn Leu Ile Pro Phe Val Glu Ile Arg Arg 50 55 60 Phe Trp Ile Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Thr Phe Ala Val Phe Ser Asn 65 70 75 80 Ile Phe Gly Asn Val Ile Gly Phe Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu Pro 85 90 95 Val Ile Phe Arg Arg Met Asn Ser Gly Phe Leu Ile Cys Val Ser Gly 100 105 110 Phe Ile Leu Ser Leu Thr Val Glu Val Ile Gln Leu Val Thr Lys Val 115 120 125 Gly Cys Phe Asp Val Asp Asp Met Ile Leu Asn Thr Leu Gly Ala Thr 130 135 140 Leu Gly Tyr Val Leu Phe Phe Val Cys Asn His Ile Val Thr Val His 145 150 155 160 Trp <210> 150 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial protein <400> 150 Arg Leu Gln Lys Gln Glu Lys Thr Leu Lys Lys Glu Thr Lys His Ile 1 5 10 15 Ile Arg Thr Leu Gly Thr Ile Leu Phe Ile Leu Tyr Val Leu Ala Leu 20 25 30 Ile Tyr Phe Leu Phe Phe Ser Glu Glu Tyr Gly Arg Ala Ala Met Glu 35 40 45 Glu Arg Gln Tyr Arg Tyr Asn Leu Ile Pro Phe Val Glu Ile Arg Arg 50 55 60 Phe Trp Val Tyr Arg Lys Gln Leu Gly Leu Met Ala Val Val Thr Asn 65 70 75 80 Leu Phe Gly Asn Val Ile Gly Phe Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu Pro 85 90 95 Val Ile Leu Asp Lys Met Arg Ser Gly Trp Leu Ile Val Leu Ala Gly 100 105 110 Phe Gly Leu Ser Val Thr Val Glu Val Ile Gln Leu Ile Thr Lys Val 115 120 125 Gly Cys Phe Asp Val Asp Asp Met Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Tyr Leu Leu Phe Phe Ile Cys Asp His Leu Arg Arg Lys Ile 145 150 155 160 Tyr Gly Lys Lys Ile 165 <210> 151 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial protein <400> 151 Met Trp Phe Phe Ser Gln Lys Gln Glu Lys Thr Leu Lys Lys Glu Thr 1 5 10 15 Lys His Ile Ile Arg Thr Leu Gly Thr Val Leu Phe Ile Leu Tyr Val 20 25 30 Leu Ala Leu Ile Tyr Phe Leu Phe Phe Ser Glu Glu Tyr Gly Arg Val 35 40 45 Ala Met Glu Glu Arg Glu Tyr Arg Tyr Asn Leu Ile Pro Phe Val Glu 50 55 60 Ile Arg Arg Phe Trp Val Tyr Arg Lys Gln Leu Gly Phe Leu Ala Val 65 70 75 80 Cys Thr Asn Leu Phe Gly Asn Val Ile Gly Phe Leu Pro Phe Gly Phe 85 90 95 Ile Leu Pro Val Ile Leu Glu Arg Met Arg Ser Gly Trp Leu Ile Ile 100 105 110 Leu Ala Gly Phe Gly Leu Ser Val Thr Val Glu Val Ile Gln Leu Ile 115 120 125 Thr Lys Val Gly Cys Phe Asp Val Asp Asp Met Ile Leu Asn Thr Ala 130 135 140 Gly Ala Ala Leu Gly Tyr Leu Leu Phe Phe Ile Cys Asn His Leu Arg 145 150 155 160 Arg Lys Ile Tyr Gly Lys Lys Ile 165 <210> 152 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial protein <400> 152 Ala Phe Leu Ile Asn Thr Val Gly Asn Val Val Cys Phe Met Pro Phe 1 5 10 15 Gly Phe Ile Leu Pro Ile Ile Thr Glu Phe Gly Lys Arg Trp Tyr Asn 20 25 30 Thr Phe Leu Leu Ser Phe Leu Met Thr Phe Thr Ile Glu Thr Ile Gln 35 40 45 Leu Val Phe Lys Val Gly Ser Phe Asp Val Asp Asp Met Phe Leu Asn 50 55 60 Thr Val Gly Gly Val Ala Gly Tyr Ile Leu Val Val Ile Cys Lys Val 65 70 75 80 Ile Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Pro Glu Thr 85 90 <210> 153 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial protein <400> 153 Met Trp Lys Arg Thr Lys Thr His Gln Lys Val Cys Trp Val Leu Phe 1 5 10 15 Ile Gly Tyr Leu Leu Met Leu Thr Tyr Phe Met Phe Phe Ser Asp Gly 20 25 30 Phe Ser Arg Ser Glu Tyr Thr Glu Tyr His Tyr Asn Ile Thr Leu Phe 35 40 45 Lys Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Thr Tyr Arg Glu Leu Leu Gly Met Lys 50 55 60 Ala Phe Leu Ile Asn Thr Val Gly Asn Val Val Cys Phe Met Pro Phe 65 70 75 80 Gly Phe Ile Leu Pro Ile Ile Thr Glu Leu Gly Lys Arg Trp Tyr Asn 85 90 95 Thr Phe Leu Leu Ser Phe Leu Met Thr Phe Thr Ile Glu Thr Ile Gln 100 105 110 Leu Val Phe Lys Val Gly Ser Phe Asp Val Asp Asp Met Phe Leu Asn 115 120 125 Thr Val Gly Gly Ile Ala Gly Tyr Ile Leu Val Ile Ile Cys Lys Ala 130 135 140 Met Arg Arg Val Phe Tyr Asp Ser Glu Thr 145 150 <210> 154 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial protein <400> 154 Met Trp Lys Lys Glu Lys Thr His Gln Lys Ile Cys Trp Ile Leu Phe 1 5 10 15 Phe Ser Tyr Leu Leu Met Leu Thr Tyr Phe Met Phe Phe Ser Asp Gly 20 25 30 Phe Gly Arg Ser Glu Tyr Thr Glu Tyr His Tyr Asn Leu Thr Leu Phe 35 40 45 Lys Glu Ile Arg Arg Phe Tyr Thr Tyr Arg Glu Leu Val Gly Thr Lys 50 55 60 Ala Phe Leu Leu Asn Ile Val Gly Asn Val Val Cys Phe Met Pro Phe 65 70 75 80 Gly Phe Ile Leu Pro Ile Ile Thr Arg Leu Gly Glu Arg Trp Leu Asn 85 90 95 Thr Leu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Thr Leu Ser Ile Glu Thr Ile Gln 100 105 110 Leu Val Phe Arg Val Gly Ser Phe Asp Val Asp Asp Met Phe Leu Asn 115 120 125 Thr Val Gly Gly Ala Ala Gly Tyr Val Ser Val Thr Met Leu Lys Trp 130 135 140 Ile Arg Arg Ala Phe His Gly Ser Lys Asn Glu Lys Asp Phe Ile His 145 150 155 160 <210> 155 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial protein <400> 155 Met Ala Lys His Ser Thr Arg Asn Gln Arg Leu Gly Trp Val Leu Phe 1 5 10 15 Val Leu Tyr Leu Gly Ala Leu Phe Tyr Leu Met Phe Phe Ala Asp Met 20 25 30 Ala Glu Arg Gly Leu Gly Val Lys Glu Asn Tyr Thr Tyr Asn Leu Lys 35 40 45 Pro Phe Val Glu Ile Arg Arg Tyr Leu Phe Cys Ala Ser Gln Ile Gly 50 55 60 Phe Arg Gly Val Phe Leu Asn Leu Tyr Gly Asn Ile Leu Gly Phe Met 65 70 75 80 Pro Phe Gly Phe Ile Leu Gly Val Ile Ser Ser Arg Cys Arg Lys Tyr 85 90 95 Trp Tyr Asp Ala Val Ile Cys Thr Tyr Leu Leu Ser Tyr Ser Ile Glu 100 105 110 Met Ile Gln Leu Phe Phe Arg Ala Gly Ser Cys Asp Val Asp Asp Ile 115 120 125 Ile Leu Asn Thr Leu Gly Gly Thr Leu Gly Tyr Ile Ala Phe His Ile 130 135 140 Val Gln His Glu Arg Ile Arg Arg Tyr Phe Leu Lys His Pro Lys Lys 145 150 155 160 Lys Arg Pro Gln Gln 165 <210> 156 <211> 174 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial protein <400> 156 Met Glu Asn Ser Gly Ala Val Leu Arg Asp Gly Cys Leu Leu Ile Asp 1 5 10 15 Gly Glu Asn Met Ile Lys Lys Thr Arg Met His Gln Lys Ile Cys Trp 20 25 30 Val Leu Phe Ile Ser Tyr Leu Val Val Leu Thr Tyr Phe Met Phe Phe 35 40 45 Ser Asp Gly Phe Gly Arg Ser Gly His Glu Glu Tyr Ala Tyr Asn Leu 50 55 60 Ile Leu Phe Lys Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Lys Tyr Arg Glu Leu Leu 65 70 75 80 Gly Met Arg Ser Phe Leu Leu Asn Thr Val Gly Asn Val Ile Cys Phe 85 90 95 Met Pro Phe Gly Phe Ile Leu Pro Ile Ile Ser Arg Arg Gly Lys Lys 100 105 110 Trp Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Ser Phe Leu Met Ser Phe Gly Ile Glu 115 120 125 Thr Ile Gln Leu Ile Phe Lys Val Gly Ser Phe Asp Val Asp Asp Met 130 135 140 Phe Leu Asn Thr Leu Gly Gly Ile Ala Gly Tyr Ile Cys Val Cys Met 145 150 155 160 Ala Lys Gly Val Arg Arg Met Ala Ser Gly Ala Ser Asp Arg 165 170 <210> 157 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial protein <400> 157 Leu Cys Lys Ile Val Ala Ser Asn Phe Ser Ser Arg Ile Arg Phe Phe 1 5 10 15 Met Leu Gln Asn Ile Val Lys Asn Leu Glu Lys Val Lys Trp Leu Glu 20 25 30 Asp Ser Ser Ser Arg Phe Ser Arg Leu Lys Met 35 40 <210> 158 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence variant <400> 158 Phe Met Pro Phe Gly Phe Ile Leu Gly Val 1 5 10 <210> 159 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP2 peptide <400> 159 Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His 1 5 10 15 <210> 160 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 160 Val Ser Ser Val Phe Leu Leu Thr Leu 1 5 <210> 161 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 161 Ile Asn Met Leu Val Gly Ala Ile Met 1 5 <210> 162 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence variant <400> 162 Lys Pro Ser Val Phe Leu Leu Thr Leu 1 5 <210> 163 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence variant <400> 163 Gly Ala Met Leu Val Gly Ala Val Leu 1 5 <210> 164 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OVA 323-339 peptide <400> 164 Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly 1 5 10 15 Arg

Claims (58)

  1. (i) 관심 종양-관련된 항원을 선택하는 단계,
    (ii) 상기 단계 (i)에서 선택된 종양-관련된 항원에 포함되는 하나 이상의 에피토프를 식별하고 이의 서열을 결정하는 단계, 및
    (iii) 상기 단계 (ii)에서 식별된 에피토프 서열의 하나 이상의 미생물 서열 변이체를 식별하는 단계
    를 포함하는 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체를 식별하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    단계 (iii)이
    - 단계 (ii)에서 선택된 에피토프 서열을 하나 이상의 미생물 서열과 비교함, 및
    - 상기 하나 이상의 미생물 서열이 상기 에피토프 서열의 하나 이상의 미생물 서열 변이체를 함유하는지를 식별함
    을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    미생물 서열 변이체가 종양-관련된 항원 에피토프 서열과 50% 이상의 서열 동일성을 공유하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 서열 변이체가 인간 미생물 서열 변이체이고, 종양-관련된 항원이 인간 종양-관련된 항원인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 서열 변이체가 박테리아 서열 변이체, 고세균 서열 변이체, 원생생물 서열 변이체, 진균 서열 변이체 및 바이러스 서열 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서
    미생물 서열 변이체가 박테리아 서열 변이체 또는 고세균 서열 변이체인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 서열 변이체가 소화관 미생물 서열 변이체인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    미생물 서열 변이체가 소화관 박테리아 서열 변이체인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 서열 변이체가 펩티드인, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    펩티드가 8 내지 12개의 아미노산, 바람직하게는 8 내지 10개의 아미노산, 가장 바람직하게는 9 또는 10개의 아미노산의 길이를 갖는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 서열 변이체가 종양-관련된 항원 에피토프 서열과 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상의 서열 동일성을 공유하는, 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 서열 변이체의 코어 서열이 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 코어 서열과 동일하고, 상기 코어 서열이 N-말단에 가까운 3개의 아미노산 및 C-말단에 가까운 3개의 아미노산을 제외한 모든 아미노산으로 이루어지는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii)에서 식별된 종양-관련된 항원 에피토프가 MHC I에 결합할 수 있는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (iii)에서 미생물 서열 변이체가 미생물 데이터베이스를 기초로 식별되는, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    미생물 데이터베이스가 다수의 개체의 미생물 데이터를 포함하는, 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    미생물 데이터베이스가 다수의 개체의 미생물 데이터가 아닌 단일 개체의 미생물 데이터를 포함하는, 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (iii)이 하기 하위 단계를 포함하는, 방법:
    (iii-a) 임의적으로, 단일 또는 다수의 개체의 샘플의 미생물 단백질 서열 또는 핵산 서열을 식별하는 단계,
    (iii-b) 상기 단일 또는 다수의 개체의 미생물 단백질 서열 또는 핵산 서열을 포함하는 데이터베이스를 편집하는 단계, 및
    (iii-c) 단계 (iii-b)에서 편집한 데이터베이스에서, 단계 (ii)에서 식별된 에피토프 서열의 하나 이상의 미생물 서열 변이체를 식별하는 단계.
  18. 제17항에 있어서,
    단계 (iii-a)의 샘플이 대변 샘플인, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    (iv) MHC 분자, 특히 MHC I 분자에 대한 하나 이상의 미생물 서열 변이체의 결합을 시험하고, 결합 친화도를 수득하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    단계 (iv)가, MHC 분자, 특히 MHC I 분자에 대한 (각각의 기준) 에피토프의 결합을 시험하고, 결합 친화도를 수득함을 추가로 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    단계 (iv)가 미생물 서열 변이체에 대해 수득된 결합 친화도 및 각각의 기준 에피토프에 대해 수득된 결합 친화도를 비교하고, 각각의 기준 에피토프보다 높은 MHC에 대한 결합 친화도를 갖는 미생물 서열 변이체를 선택함을 추가로 포함하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    (v) 미생물 서열 변이체를 함유하는 미생물 단백질의 세포 국소화를 결정하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    단계 (v)가, 미생물 서열 변이체를 함유하는 미생물 단백질의 서열을, 바람직하게는 세포 국소화 결정 전에, 식별함을 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (iv) 및 단계 (v)를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    단계 (iv) 후에 단계 (v)를 뒤따르거나, 단계 (v) 후에 단계 (iv)가 뒤따르는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    (vi) 미생물 서열 변이체의 면역원성을 시험하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    (vii) 미생물 서열 변이체의 세포 독성을 시험하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  28. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양-관련된 항원 에피토프 서열이 서열번호 1 내지 5, 55 내지 65 및 126 내지 131 중 어느 하나에 제시된 서열인, 방법.
  29. 제29항에 있어서,
    종양-관련된 항원 에피토프 서열이 서열번호 1에 제시된 서열인, 방법.
  30. 바람직하게는 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득되는 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체.
  31. 제30항에 있어서,
    미생물 서열 변이체가 바람직하게는 8 내지 12개의 아미노산, 보다 바람직하게는 8 내지 10개의 아미노산, 가장 바람직하게는 9 또는 10개의 아미노산의 길이를 갖는 (박테리아) 펩티드인, 미생물 서열 변이체.
  32. 제31항에 있어서,
    미생물 서열 변이체가 종양-관련된 항원 에피토프 서열과 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상의 서열 동일성을 공유하고/하거나 미생물 서열 변이체의 코어 서열이 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 코어 서열과 동일하고, 상기 코어 서열이 N-말단에 가까운 3개의 아미노산 및 C-말단에 가까운 3개의 아미노산을 제외한 모든 아미노산으로 이루어지는, 미생물 서열 변이체.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서,
    서열번호 6 내지 18 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 바람직하게는 서열번호 6 또는 18에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 보다 바람직하게는 서열번호 18에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 미생물 서열 변이체.
  34. 제31항 또는 제32항에 있어서,
    서열번호 66 내지 84 및 126 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 바람직하게는 서열번호 75에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 미생물 서열 변이체.
  35. 제31항 또는 제32항에 있어서,
    서열번호 132 내지 141 및 158 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 바람직하게는 서열번호 139에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 미생물 서열 변이체.
  36. (a) 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 따라 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체를 식별하는 단계; 및
    (b) 상기 미생물 서열 변이체를 포함하는 약제를 제조하는 단계
    를 포함하는, 약제, 바람직하게는 암의 예방용 및/또는 치료용 약제의 제조 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    약제가 백신인, 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서,
    단계 (b)가 나노 입자에 미생물 서열 변이체를 적재함을 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    단계 (b)가 나노 입자에 보조제를 적재함을 추가로 포함하는, 방법.
  40. 제36항 또는 제37항에 있어서,
    단계 (b)가 박테리아 세포에 미생물 서열 변이체를 적재함을 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    단계 (b)가 박테리아 세포를 미생물 서열 변이체(를 포함하거나/암호화하는 핵산 분자)에 의해 변환시키는 단계를 포함하는, 방법.
  42. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b)가
    (i) 미생물 서열 변이체,
    (ii) 미생물 서열 변이체를 포함하는 재조합 단백질,
    (iii) 미생물 서열 변이체를 포함하는 면역원성 화합물,
    (iv) 미생물 서열 변이체가 적재된 나노 입자,
    (v) 미생물 서열 변이체가 적재된 항원-제시 세포,
    (vi) 미생물 서열 변이체를 발현하는 숙주 세포, 또는
    (vii) 미생물 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자; 및
    임의적으로, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제
    를 포함하는 약학 조성물의 제조를 포함하는, 방법.
  43. 바람직하게는 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득되는 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항의 미생물 서열 변이체를 포함하는 약제.
  44. 제43항에 있어서,
    제30항 내지 제35항 중 어느 한 항의 미생물 서열 변이체가 적재된 나노 입자를 포함하는, 약제.
  45. 제44항에 있어서,
    나노 입자에 보조제가 추가로 적재되는, 약제.
  46. 제43항에 있어서,
    제30항 내지 제35항 중 어느 한 항의 미생물 서열 변이체를 발현하는 박테리아 세포를 포함하는 약제.
  47. 제43항에 있어서,
    (i) 미생물 서열 변이체,
    (ii) 미생물 서열 변이체를 포함하는 재조합 단백질,
    (iii) 미생물 서열 변이체를 포함하는 면역원성 화합물,
    (iv) 미생물 서열 변이체가 적재된 나노 입자,
    (v) 미생물 서열 변이체가 적재된 항원-제시 세포,
    (vi) 미생물 서열 변이체를 발현하는 숙주 세포, 또는
    (vii) 미생물 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자; 및
    임의적으로, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제
    를 포함하는 약제.
  48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    백신인 약제.
  49. 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것인 약제.
  50. 제49항에 있어서,
    항암제, 바람직하게는 면역 체크포인트 조절제와 조합으로 투여되는 약제.
  51. 암을 예방하고/하거나 치료하거나 항종양 반응을 개시하거나 증진시키거나 연장시키는 것이 필요한 개체에서 암을 예방하고/하거나 치료하거나 항종양 반응을 개시하거나 증진시키거나 연장시키는 방법으로서, 상기 개체에게 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 약제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서,
    약제가 항암제, 바람직하게는 면역 체크포인트 조절제와 조합으로 투여되는, 방법.
  53. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항의 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체가 개체의 (단리된) 샘플에 존재하는지를 결정하는 단계를 포함하는, 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항의 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체가 개체에게 존재하는지를 결정하는 (시험관내) 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    (단리된) 샘플이 대변 샘플 또는 혈액 샘플인, 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서,
    종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체가 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득되는, 방법.
  56. 제51항 또는 제52항에 있어서,
    - 바람직하게는 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항의 방법에 따라, 개체에게 투여할 약제에 포함되는 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체가 개체에게 존재하는지를 결정하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  57. 제51항 또는 제52항에 있어서,
    투여할 약제에 포함되는 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체가 개체에게 존재하는, 방법.
  58. 제51항 또는 제52항에 있어서,
    투여할 약제에 포함되는 종양-관련된 항원 에피토프 서열의 미생물 서열 변이체가 개체에게 존재하지 않는, 방법.
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