JP2021508313A - 腫瘍関連抗原エピトープの微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）配列変異体 - Google Patents

腫瘍関連抗原エピトープの微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）配列変異体 Download PDF

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Abstract

本発明は、癌免疫療法、特に腫瘍関連抗原エピトープ配列の配列変異体に関する。即ち、本発明は、腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体の同定の方法を提供する。該微生物叢配列変異体は自己抗原とは異なり、したがって、強い免疫応答を惹起し得るので、そのような微生物叢配列変異体は抗癌医薬の調製に有用である。したがって、微生物叢配列変異体を含む医薬、そのような医薬の調製方法、及びそのような医薬の使用が提供される。
【選択図】なし

Description

本発明は、癌免疫療法の分野、特にヒトのミクロビオーム（ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）におけるヒト腫瘍関連抗原のエピトープの細菌配列変異体の同定の方法に関する。本発明はまた、そのようなヒトのミクロビオームの細菌配列変異体を含むワクチンを提供する方法及びそのようなワクチンに関する。更に、本発明は、そのようなワクチンでヒト個体を治療する方法も提供する。
癌は、世界で主要な死因の１つである。世界保健機関によれば、２０１２年だけで、世界中で１，４００万の新たな症例と８２０万の癌関連死が報告され、今後２０年以内に、新たな癌症例数が約７０％増加すると予測されている。これまでのところ、世界の年間総新規症例数の６０％超が、アフリカ、アジア、中南米で発生している。これらの地域はまた、世界の癌による死亡の７０％を占めている。男性の間では、癌の最も一般的な５部位は、肺、前立腺、結腸直腸、胃、及び肝臓であり、一方、女性では、乳房、結腸直腸、肺、子宮頸部、及び胃である。
癌は、外科手術、放射線療法、細胞傷害性化学療法、及び内分泌操作により長年対処されてきた。これらは通常、疾患を最もよく制御するために順番に組み合わされる。しかしながら、これらの標準的治療法の真の有効性に対する主要な制限は、治療に伴う正常組織の付随的損傷、低治癒率、及び固有の薬物耐性をもたらすそれらの不正確な特異性にある。
近年、特に腫瘍及び正常細胞の発現プロファイリングの大きな進歩により、癌治療法の開発が著しく進歩しており、最近の研究及び免疫療法又は分子標的療法における最初の臨床結果が、この疾患に対する認識を変え始めている。
有望な抗癌免疫療法が現実のものとなり、宿主免疫系が腫瘍抗原を認識できるという証拠が、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）及び欧州医薬品局（ＥＭＡ）という規制当局により現在承認されている抗癌剤の開発につながった。様々な治療アプローチには、特に、エクスビボで増殖した腫瘍浸潤リンパ球の養子免疫伝達、癌細胞ワクチン、免疫刺激サイトカイン及びその変異体、パターン認識受容体（ＰＲＲ）アゴニスト、及び腫瘍抗原又は免疫チェックポイントを標的とする免疫調節モノクローナル抗体が含まれる（非特許文献１）。
残念なことに、かなりの割合の患者が依然としてこれらの免疫療法のいくつかに対する固有の耐性を示すか、又は治療過程で耐性を獲得することさえあり得る。例えば、３年生存率は、切除不能又は転移性黒色腫における抗ＣＴＬＡ−４抗体イピルムマブで約２０％であると報告されおり（非特許文献２及び非特許文献３）、一方、ＰＤ１を標的とする別のチェックポイント阻害剤、ニボルマブによる３年生存率は、腎細胞癌（ＲＣＣ）で４４％、ＮＳＣＬＣで１８％であると報告されている（非特許文献４及び非特許文献５）。
したがって、根本的な薬物耐性は、これらの免疫療法の有効性に対する確固たる障壁となっている。したがって、この障壁を打破するには、癌治療への異なるアプローチが必要であることは明らかである。
これらの免疫療法を用いて治療された多数の対象における応答の欠如は、欠陥のある抗腫瘍免疫応答と関連している可能性がある（ＡＰＣによる抗原提示における欠陥又はＴ細胞による抗原認識における欠陥として）。換言すれば、免疫療法に対する陽性反応は、ヒト癌細胞によって発現されるＭＨＣクラスＩ拘束性抗原を認識することができる特定のリンパ球サブセットを発達させる免疫系の能力と相関する（非特許文献６）。
この仮説は、腫瘍浸潤リンパ球の養子免疫伝達への応答が患者に輸血されたＣＤ８＋Ｔ細胞の数と直接相関することを示すデータによって強く支持される（非特許文献７）。
したがって、強力な抗腫瘍応答は、免疫反応性ペプチドの提示及びこれらの抗原を認識するように「訓練された」十分な数の反応性細胞の存在に依存する。
腫瘍抗原ベースのワクチン接種は、癌治療に対する独自のアプローチであり、これは、特定の耐久性のある方法で腫瘍を認識、攻撃、破壊するために患者自身の免疫システムを動員させることができるため、大きな関心を集めている。腫瘍細胞は実際、免疫系によって認識されやすい多数のペプチド抗原を発現することが知られている。したがって、このような抗原に基づくワクチンは、患者の全生存期間を改善するだけでなく、腫瘍抗原の低毒性及び低分子量に起因して、免疫応答のモニタリング及びＧＭＰグレード製品の調製にも大きな機会を提供する。腫瘍抗原の例には、特に、通常はサイレントな遺伝子又は過剰発現された遺伝子から転写されたタンパク質の副産物、及びオンコウイルスによって発現されたタンパク質（非特許文献８）、細胞性タンパク質の点突然変異から生じるネオ抗原が含まれる。後者は、ＣＴＬＡ４阻害剤で治療された患者における全生存期間の増加と直接関連していることが示されているので、特に興味深い（非特許文献９及び非特許文献１０）。
しかし、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）の大部分は、（既存の）ヒトタンパク質であるため、自己抗原と考えられる。胸腺選択プロセス中に、十分な親和性を有するペプチド／自己ＭＨＣ複合体を認識するＴ細胞は、クローン的に枯渇する（ｃｌｏｎａｌｌｙ ｄｅｐｌｅｔｅｄ）。自己免疫疾患に対する保護を提供することにより、Ｔ細胞レパートリー選択のこのメカニズムは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）に対する免疫性を発達させる可能性も低減する。これは、癌反応性ＴＣＲが一般に親和性が弱いという事実によって例示される。更に、これまで、選択された腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及びＭＨＣに対する高い結合親和性を有する腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）で行われたワクチン試験の大部分は、強力な免疫を誘発することを示しておらず、胸腺選択の結果を反映していると思われる。
したがって、癌ワクチンを開発することができるヒト腫瘍抗原の数は限られている。更に、突然変異した又は修飾された自己タンパク質に由来する抗原は、免疫寛容及び／又は望ましくない自己免疫副作用を誘発する可能性がある。
したがって、当該技術分野で遭遇する制限、特に現在利用可能な免疫療法に対する耐性を克服することができる代替の癌治療薬を同定することが当技術分野において必要とされている。
Ｇａｌｕｚｚｉ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１４ Ｄｅｃ ３０；５（２４）：１２４７２−５０８ Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＣＴＬＡ−４ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１４ Ｄｅｃ ４；３７１（２３）：２１８９−２１９９ Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｏｌｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｄａｔａ ｆｒｏｍ Ｐｈａｓｅ ＩＩ ａｎｄ Ｐｈａｓｅ ＩＩＩ Ｔｒｉａｌｓ ｏｆ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｉｎ Ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ ｏｒ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１５ Ｊｕｎ １０；３３（１７）：１８８９−９４ ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｖｉｖａｌ，Ｄｕｒａｂｌｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ａｎｄ Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｓａｆｅｔｙ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ Ｔｒｅａｔｅｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１５ Ｊｕｎ ２０；３３（１８）：２０１３−２０ Ｇｅｔｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｖｅｒａｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ（Ａｎｔｉ−Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ １ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＢＭＳ−９３６５５８，ＯＮＯ−４５３８）ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ Ｔｒｅａｔｅｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ−Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１５ Ｊｕｎ ２０；３３（１８）：２００４−１２ Ｋｖｉｓｔｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３ Ａｐｒ；２５（２）：２８４−９０ Ｂｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ：ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｆｔｅｒ ｆａｉｌｕｒｅ ｔｏ ｐｒｉｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３ Ｓｅｐ １；１９（１７）：４７９２−８００ Ｋｖｉｓｔｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３ Ａｐｒ；２５（２）：２８４−９０ Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＣＴＬＡ−４ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１４ Ｄｅｃ ４；３７１（２３）：２１８９−２１９９ Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｏ−ａｎｔｉｇｅｎｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ｔｕｍｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐａｔｉｅｎｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１４ Ｍａｙ；２４（５）：７４３−５０
前記に鑑みて、本発明の目的は、上で概説した現在の癌免疫療法の欠点を克服し、ヒト腫瘍関連抗原のエピトープの配列変異体を同定する方法を提供することである。特に、本発明の目的は、腫瘍関連抗原エピトープの配列変異体の供給源であるヒトのミクロビオーム中の細菌タンパク質を同定する方法を提供することである。更に、本発明の目的は、特定のＭＨＣ分子によって提示され得るこれらの細菌タンパク質からペプチドを同定する方法を提供することである。
これらの目的は、以下及び添付の特許請求の範囲に示す発明主題によって解決される。
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル、及び試薬に、これらは変わる可能性があるので、限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。特段の断りがない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
以下に、本発明の要素について説明する。これら要素は、具体的な実施形態と共に列挙されるが、これらを任意の方式で任意の数組み合わせて更なる実施形態を生み出すことができることを理解すべきである。様々に記載される実施例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載される実施形態に限定することを意図するものではない。この記載は、明示的に記載された実施形態を任意の数の開示された及び／又は好ましい要素と組み合わせる実施形態をサポート及び包含すると理解すべきである。更に、特に指定しない限り、本願におけるすべての記載された要素の任意の入れ換え及び組合せが本願の記載によって開示されるとみなすべきである。
本明細書及びその後に続く特許請求の範囲全体を通して、特に必要としない限り、用語「含む」並びに「含み」及び「含んでいる」などの変形は、指定されている部材、整数、又は工程を含むが、任意の他の指定されていない部材、整数、又は工程を除外するものではないことを意味すると理解される。用語「からなる」は、任意の他の指定されていない部材、整数、又は工程が除外される、用語「含む」の具体的な実施形態である。本発明において、用語「含む」は、用語「からなる」を包含する。したがって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなっていてもよく、追加の何かを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」、並びに本発明の説明（特に、特許請求の範囲）において使用される同様の参照は、本明細書に指定されているか又は文脈上明示的に否定されていない限り、単数及び複数の両方を網羅すると解釈すべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、範囲内の各別個の値を個別に参照する簡易的な方法として機能することを意図する。本明細書において特に指定しない限り、各個別の値は、本明細書に個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。明細書中のいずれの言語も、本発明の実施に必須の任意の請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
用語「実質的に」は、「完全に」を除外するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含んでいなくてもよい。必要な場合、用語「実質的に」は、本発明の定義から省略されることもある。
数値ｘに関連する用語「約」は、ｘ±１０％を意味する。
腫瘍関連抗原エピトープの細菌配列変異体の同定方法
本発明は、ヒトのミクロビオームに存在する細菌タンパク質が、ヒト腫瘍関連抗原のエピトープの配列変異体であるペプチドを含むという驚くべき発見に基づいている。したがって、本発明者らは、ヒトミクロビオームにおけるヒト腫瘍関連エピトープの「エピトープミミクリー」を見出した。興味深いことに、このようなエピトープミミクリーは、自己抗原を認識するＴ細胞のクローン枯渇によるヒトＴ細胞のレパートリー制限を回避する可能な方法を提供する。特に、自己抗原と異なるが自己抗原と配列類似性を共有する抗原／エピトープは、（ｉ）Ｔ細胞受容体の交差反応性により依然として認識されることができる（例えば、Ｄｅｇａｕｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｏｓｓ−Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＴＣＲ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，ａｎｄ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１６；７：８９．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１６．０００８９；Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｉｍｉｌａｒ ｆｏｒｅｉｇｎ ａｎｄ ｓｅｌｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｎａｉｖｅ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｓｉｚｅ ａｎｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１５ Ｊａｎ ２０；４２（１）：９５−１０７参照）及び（ｉｉ）そのような抗原／エピトープは、Ｔ細胞教育プロセス中で枯渇していないＴ細胞／ＴＣＲによって認識されると期待される。したがって、そのような抗原／エピトープは、自己抗原との潜在的な交差反応性を有するＴ細胞のクローン拡大につながる強い免疫応答を引き起こすことができる。このメカニズムは現在、自己免疫疾患の一部を説明するために提案されている。
数千もの異なる細菌種で構成されるヒトのミクロビオームは、遺伝的多様性と潜在的な抗原性成分の大きな源である。腸は、微生物叢との接触及び交換の最大の領域と考えることができる。結果として、腸は、体内で最大の免疫器官である。ヒトの腸上皮における特化と胸腺外Ｔ細胞の成熟は、現在、１０年超に亘って知られている。腸は、我々の微生物叢を認識でき、調節機構によって厳しく制御される免疫細胞の大きな一群を含む。
本発明によれば、腸内に存在する細菌種の大きなレパートリーは、ヒト腫瘍抗原と潜在的な類似性を有する信じ難いほどの抗原源を提供する。これらの抗原は、複雑な状況で特殊な細胞に提示され、大量のコシグナルがＴＬＲ活性化因子として免疫細胞に伝えられる。その結果、微生物叢は、完全な機能的応答を誘発でき、大きなＴメモリサブセットの成熟を促進する、又は完全なクローンの枯渇又は消耗を引き起こす場合がある。ヒト腫瘍抗原と類似性を共有する細菌成分の同定は、腫瘍関連抗原のエピトープの選択のための新しい源を提供し、これらは、（ｉ）Ｔ細胞枯渇の問題を克服し、且つ（ｉｉ）腸内の免疫系を既に「プライミング（ｐｒｉｍｅｄ）」しているはずであり、それにより、他のソースの抗原及び人為的に変異させ抗原／エピトープと比較して、より強い免疫応答を提供する。
第１の態様において、本発明は、腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体の同定のための方法を提供し、前記方法は、以下の工程：
（ｉ）目的の腫瘍関連抗原の選択、
（ｉｉ）工程（ｉ）で選択した前記腫瘍関連抗原に含まれる少なくとも１つのエピトープの同定とその配列の決定、及び
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で同定された前記エピトープ配列の少なくとも１つの微生物叢配列変異体の同定を含む。
更に、本発明は特に、腫瘍関連抗原エピトープの微生物叢配列変異体の同定のための方法も提供し、前記方法は、以下の工程：
（１）微生物叢配列を腫瘍関連抗原エピトープの配列と比較し、腫瘍関連抗原エピトープの微生物叢配列変異体を同定すること、及び
（２）任意に、工程（１）で前記微生物叢配列変異体が同定された前記腫瘍関連抗原エピトープを含む腫瘍関連抗原を決定することを含む。
本明細書で使用される「微生物叢配列変異体」及び「腫瘍関連抗原エピトープ配列」（「エピトープ配列」とも呼ばれる）という用語は、（ｉ）（ポリ）ペプチド配列及び（ｉｉ）核酸配列を意味する。したがって、「微生物叢配列変異体」は、（ｉ）（ポリ）ペプチド又は（ｉｉ）核酸分子であり得る。したがって、「腫瘍関連抗原エピトープ配列」（「エピトープ配列」とも呼ばれる）は、（ｉ）（ポリ）ペプチド又は（ｉｉ）核酸分子であり得る。好ましくは、微生物叢配列変異体は、（ポリ）ペプチドである。したがって、腫瘍関連抗原エピトープ配列（「エピトープ配列」とも呼ばれる）は、（ポリ）ペプチドであることも好ましい。
本明細書中でペプチド又は核酸レベルを意味し得る用語「エピトープ配列」とは異なり、本明細書で使用される用語「エピトープ」は、特にペプチドを意味する。本明細書で使用される「エピトープ」（「抗原決定基」としても知られる）は、免疫系、特に抗体、Ｔ細胞受容体、及び／又はＢ細胞受容体によって認識される抗原の一部（又は断片）である。したがって、１つの抗原は、少なくとも１つのエピトープを有し、即ち単一の抗原は、１つ以上のエピトープを有する。「抗原」は、典型的には、適応免疫応答の受容体の標的として、特に抗体、Ｔ細胞受容体、及び／又はＢ細胞受容体の標的となる。抗原は、（ｉ）ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、（ｉｉ）多糖、（ｉｉｉ）脂質、（ｉｖ）リポタンパク質又はリポペプチド、（ｖ）糖脂質、（ｖｉ）核酸、又は（ｖｉｉ）低分子薬又は毒素であり得る。したがって、抗原は、ペプチド、タンパク質、多糖、脂質、リポタンパク質及び糖脂質を含むそれらの組合せ、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイＤＮＡ、プラスミド）、又は低分子薬（例えば、シクロスポリンＡ、パクリタキセル、ドキソルビシン、メトトレキサート、５−アミノレブリン酸）、又はそれらの任意の組合せであり得る。本発明の文脈において、抗原は、典型的には、（ｉ）ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、（ｉｉ）リポタンパク質又はリポペプチド、及び（ｉｉｉ）糖タンパク質又は糖ペプチドから選択され、より好ましくは、抗原は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である。
用語「腫瘍関連抗原」（「腫瘍抗原」とも呼ばれる）は、腫瘍細胞で産生される抗原を意味し、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を含む。古典的定義によれば、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）は、腫瘍細胞内／上にのみ存在し、他の細胞内／上には存在しない抗原であるのに対し、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、腫瘍細胞及び非腫瘍細胞（「正常な」細胞）内／上に存在する抗原である。腫瘍関連抗原は、ある種の癌／腫瘍に特異的である（又は関連する）ことが多い。
本発明の文脈において、即ち、本願全体を通して、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」、及びこれらの用語の変形は、好ましくは通常のペプチド結合によって、或いは、イソステリックペプチド（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の場合などのように、修飾されたペプチド結合によって互いに結合された少なくとも２つのアミノ酸を含むペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を意味する。特に、「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」という用語は、非ペプチド構造要素を含むペプチド類似体として定義される「ペプチド模倣物」も含み、これらのペプチドは、天然の親ペプチドの生物学的作用を模倣する又はそれに拮抗することができる。ペプチド模倣体は、酵素で切断可能なペプチド結合などの古典的なペプチド特性を欠く。特に、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、遺伝暗号によって定義された２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を、これらのアミノ酸に加えて含むことができ、又は遺伝暗号によって定義された２０個のアミノ酸以外のアミノ酸から構成されることができる。特に、本発明の文脈におけるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、翻訳後成熟プロセスなどの天然プロセス又は化学プロセスによって修飾されたアミノ酸から等しく構成することができ、これらは当業者によく知られている。そのような修飾は、文献に十分詳述されている。これらの修飾は、ポリペプチドの任意の箇所に現れることがあり、即ち、ペプチド骨格中、アミノ酸鎖中、更にはカルボキシ又はアミノ末端に現れることがある。特に、ペプチド又はポリペプチドは、ユビキチン化に続いて分岐する、又は分岐の有無にかかわらず環状であり得る。このタイプの修飾は、当業者によく知られた天然又は合成の翻訳後プロセスの結果であり得る。本発明の文脈における用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」は、特に、修飾されたペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質も含む。例えば、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合固定、脂質又は脂質誘導体の共有結合固定、ホスファチジルイノシトールの共有結合固定、共有結合又は非共有結合の架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、ＰＥＧ化を含むグリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセス、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化、硫酸化（ｓｕｌｆａｔａｔｉｏｎ）、アルギニル化又はユビキチン化などのアミノ酸付加などを含むことができる。このような修飾は、文献に十分に詳述されている（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（１９９３）２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８３）Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６ ａｎｄ Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，６６３：４８−６２）。したがって、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」は、好ましくは、リポペプチド、リポタンパク質、糖ペプチド、糖タンパク質などを含む。
特に好ましい実施形態において、本発明に係る微生物叢配列変異体は、「古典的」（ポリ）ペプチドであり、それにより「古典的」（ポリ）ペプチドは、典型的には、遺伝暗号によって定義される２０種のアミノ酸から選択されるアミノ酸が、通常のペプチド結合により互いに結合されて構成される。
核酸は、好ましくは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、発現エレメントを含む又は含まない相補的ＲＮＡ／ＤＮＡ配列、ミニ遺伝子、遺伝子断片、調節エレメント、プロモーター、及びそれらの組合せから選択される、一本鎖、二本鎖、又は部分二本鎖核酸を含むことが好ましい。核酸（分子）及び／又はポリヌクレオチドの更なる好ましい例としては、例えば、組換えポリヌクレオチド、ベクター、オリゴヌクレオチド、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｔＲＮＡなどのＲＮＡ分子、又は前記したＤＮＡ分子が挙げられる。したがって、核酸（分子）は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であることが好ましく、ゲノムＤＮＡ；ｃＤＮＡ；ｒＲＮＡ；ｍＲＮＡ；アンチセンスＤＮＡ；アンチセンスＲＮＡ；相補的ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ配列；発現エレメント、調節エレメント、及び／又はプロモーターを含む又は含まない相補的ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ配列；ベクター；及びそれらの組合せから選択されることが好ましい。
したがって、「微生物叢配列変異体」という用語は、微生物叢、即ち微生物叢起源の核酸配列又は（ポリ）ペプチド配列を意味する（配列が微生物叢で同定されると、通常、当技術分野で知られる組換え手段によっても取得することができる）。「微生物叢配列変異体」は、微生物叢に存在する完全な（ポリ）ペプチド又は核酸、又は、好ましくは、少なくとも５個のアミノ酸（１５個のヌクレオチド）、好ましくは少なくとも６個のアミノ酸（１８個のヌクレオチド）、より好ましくは少なくとも７個のアミノ酸（２１個のヌクレオチド）、更により好ましくは少なくとも８個のアミノ酸（２４個のヌクレオチド）の長さを有する（完全な）微生物叢（ポリ）ペプチド／タンパク質又は核酸分子の断片を意味し得る。また、微生物叢配列変異体は、５０個のアミノ酸以下、より好ましくは４０個のアミノ酸以下、更により好ましくは３０個のアミノ酸以下、最も好ましくは２５個のアミノ酸以下の長さを有することが好ましい。したがって、微生物叢配列変異体は、好ましくは５〜５０個のアミノ酸、より好ましくは６〜４０個のアミノ酸、更により好ましくは７〜３０個のアミノ酸、最も好ましくは８〜２５個のアミノ酸、例えば８〜２４個のアミノ酸の長さを有する。例えば、「微生物叢配列変異体」は、微生物叢タンパク質／核酸分子の断片であることができ、断片は、９個又は１０個アミノ酸（２７個又は３０個のヌクレオチド）の長さを有する。好ましくは、微生物叢配列変異体は、前記の微生物叢タンパク質の断片である。特に好ましくは、微生物叢配列変異体は、８〜１２個のアミノ酸の長さ（ペプチドとして；核酸分子としては、２４〜３６個のヌクレオチドに対応）を有し、より好ましくは、微生物叢配列変異体は、８〜１０個のアミノ酸の長さ（ペプチドとして；核酸分子としては、２４〜３０個のヌクレオチドに対応）を有し、最も好ましくは、微生物叢配列変異体は、９又は１０個のアミノ酸の長さ（ペプチドとして；核酸分子としては、２７又は３０個のヌクレオチドに対応）を有する。このような長さを有するペプチドは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答に重要なＭＨＣ（主要組織適合性複合体）クラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）に結合することができる。また、微生物叢配列変異体は、１３〜２４個のアミノ酸の長さ（ペプチドとして；核酸分子としては、３９〜７２個のヌクレオチドに対応）を有することも好ましい。そのような長さのペプチドは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞（Ｔヘルパー細胞）応答に重要なＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）クラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）に結合することができる。
本明細書で使用される「微生物叢」という用語は、これまでに植物から動物に至るまで研究されたあらゆる多細胞生物中又は上に存在する、片利共生微生物、相利共生微生物、及び病原微生物を意味する。特に、微生物叢は、宿主の免疫学的、ホルモン的、代謝的恒常性にとって重要であることが分かっている。微生物叢は、細菌、古細菌、原生生物、真菌、及びウイルスを含む。したがって、微生物叢配列変異体は、好ましくは、細菌配列変異体、古細菌配列変異体、原生生物配列変異体、真菌配列変異体、及びウイルス配列変異体からなる群から選択される。より好ましくは、微生物叢配列変異体は、細菌配列変異体又は古細菌配列変異体である。最も好ましくは、微生物叢配列変異体は、細菌配列変異体である。
解剖学的には、微生物叢は、皮膚、結膜、乳腺、膣、胎盤、精液、子宮、卵胞、肺、唾液、口腔（特に、口腔粘膜）、及び胃腸管（特に、腸）を含む多くの組織及び生物流体のいずれかの上又は内部に存在する。本発明の文脈において、微生物叢配列変異体は、好ましくは胃腸管の微生物叢の配列変異体（胃腸管に存在する微生物）、より好ましくは腸の微生物叢の配列変異体（腸内に存在する微生物）である。したがって、微生物叢配列変異体は、腸内細菌配列変異体（即ち、腸内に存在する細菌の配列変異体）であることが最も好ましい。
微生物叢は、多くの多細胞生物（これまでに植物から動物に至るまで研究されたあらゆる多細胞生物）内及び上に存在するが、哺乳動物内及び上に存在する微生物叢が好ましい。本発明により意図される哺乳動物としては、例えば、ヒト、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、実験用げっ歯類などの家畜が挙げられる。ヒトの内部及び上部に存在する微生物叢が最も好ましい。そのような微生物叢は、本明細書では「哺乳動物微生物叢」又は「ヒト微生物叢」と呼ばれる（ここで、哺乳動物／ヒトという用語は、具体的には、微生物叢の局在化／居住を意味する）。好ましくは、腫瘍関連抗原エピトープは、（微生物叢配列変異体の）微生物叢がその内部／上部に存在する同一種のものである。好ましくは、微生物叢配列変異体は、ヒト微生物叢配列変異体である。したがって、腫瘍関連抗原は、ヒト腫瘍関連抗原であることが好ましい。
一般に、本明細書において、即ち本願全体を通して使用される「配列変異体」という用語は、参照配列と類似する（特に少なくとも５０％の配列同一性を意味する、以下を参照）が、（１００％）同一ではない配列を意味する。したがって、配列変異体は、参照配列と比較して少なくとも１つの変化を含む。即ち、「微生物叢配列変異体」は、「腫瘍関連抗原エピトープ配列」であるその参照配列と比較して、類似しているが少なくとも１つの変化を含む。したがって、微生物叢配列変異体は、「腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体」とも呼ばれる。換言すれば、「微生物叢配列変異体」は、微生物叢配列（微生物叢起源の配列）であり、腫瘍関連抗原エピトープ配列の配列変異体である。即ち、「微生物叢配列変異体」は、腫瘍関連抗原エピトープ配列と比較して、類似しているが少なくとも１つの変化を含む微生物叢配列（微生物叢起源の配列）である。したがって、「微生物叢配列変異体」は、微生物叢配列である（微生物叢配列ではない微生物叢配列の配列変異体ではない）。一般に、配列変異体（即ち、微生物叢配列）は、特に配列の全長に亘って、参照配列（腫瘍関連抗原エピトープ配列）と少なくとも５０％の配列同一性を共有し、配列同一性は、以下のように計算することができる。好ましくは、配列変異体は、特に配列の全長に亘って、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を参照配列と共有する。したがって、微生物叢配列変異体は、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を腫瘍関連抗原エピトープ配列と共有することが好ましい。特に好ましくは、微生物叢配列変異体は、腫瘍関連抗原エピトープ配列と、１個、２個、又は３個のアミノ酸のみ、より好ましくは１個又は２個のアミノ酸のみが異なる。換言すれば、微生物叢配列変異体は、腫瘍関連抗原エピトープ配列と比較して、３個以下のアミノ酸変化（即ち、１個、２個、又は３個のアミノ酸変化）、より好ましくは２個以下のアミノ酸変化（即ち、１個又は２個のアミノ酸変化）を含むことが特に好ましい。最も好ましくは、微生物叢配列変異体は、腫瘍関連抗原エピトープ配列と比較して、１個又は正確に２個（即ち、２個以上又は２個以下）のアミノ酸変化を含む。
好ましくは、配列変異体は、参照配列の特定の機能を保存する。本発明の文脈において、この機能は「エピトープ」としての機能性であり、即ち、免疫系、特に抗体、Ｔ細胞受容体、及び／又はＢ細胞受容体によって認識され、好ましくは、免疫応答を引き起こすことができる。
「配列変異体」という用語は、ヌクレオチド配列変異体及びアミノ酸配列変異体を含む。例えば、アミノ酸配列変異体は、参照配列と比較して１個以上のアミノ酸が欠失又は置換された変更された配列であり、又は参照アミノ酸配列と比較して１個以上のアミノ酸が挿入された変更された配列を有する。変更の結果として、アミノ酸配列変異体は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、更により好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％、参照配列と同一であるアミノ酸配列を有する。例えば、少なくとも９０％同一である変異体配列は、参照配列の１００個のアミノ酸当たり１０個以下の変化（即ち、欠失、挿入、又は置換の任意の組合せ）を有する。特に好ましくは、微生物叢配列変異体は、腫瘍関連抗原エピトープ配列と、１個、２個、又は３個のアミノ酸のみ、より好ましくは１個又は２個のアミノ酸のみが異なる。換言すれば、微生物叢配列変異体は、腫瘍関連抗原エピトープ配列と比較して、３個以下のアミノ酸変化（即ち、１個、２個、又は３個のアミノ酸変化）、より好ましくは２個以下のアミノ酸変化（即ち、１個又は２個のアミノ酸変化）を含むことが特に好ましい。
本発明の文脈において、本発明のクエリアミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも９５％の「配列同一性を共有する」アミノ酸配列は、対象アミノ酸配列の配列が、対象アミノ酸配列がクエリアミノ酸配列の１００アミノ酸ごとに最大５個のアミノ酸変化を含む場合があることを除き、クエリ配列と同一であることを意味することが意図される。換言すれば、クエリアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性の配列を有するアミノ酸配列を得るために、好ましくは変異体又は断片の前記定義内において、対象配列中のアミノ酸残基の最大５％（１００個中５個）を挿入する又は別のアミノ酸に置換する若しくは欠失させることができる。言うまでもなく、同じことが核酸配列にも同様に当てはまる。
正確な対応のない（アミノ酸又は核酸）配列の場合、第１の配列（例えば、配列変異体）の「％同一性」は、第２の配列（例えば、参照配列）に対して決定される。一般に、比較される２つの配列は、配列間に最大の相関が与えられるようにアライメントされ得る。これは、一方又は両方の配列に「ギャップ」を挿入して、アライメントの程度を高めることを含み得る。次に、％同一性は、比較される各配列の全長に亘って（いわゆる、「グローバルアラインメント」、同一又は類似の長さの配列に特に適している）、又はより短い決まった長さに亘って（いわゆる、「ローカルアライメント」、長さが等しくない配列により適している）決定される。
２つ以上の配列の同一性（「類似性」又は「相同性」とも呼ばれる）を比較する方法は、当技術分野で周知である。２つ（又はそれ以上）の配列が同一であるパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを使用して決定することができる。使用できる数学的アルゴリズムの好ましいが限定的ではない例は、Ｋａｒｌｉｎら（１９９３）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９０：５８７３−５８７７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ワールド・ワイド・ウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖでＮＣＢＩのホームページからアクセス可能なＢＬＡＳＴファミリーのプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴ又はＮＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０又はＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５：３３８９−３４０２も参照）及びＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３，６３−９８；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ８５，２４４４−２４４８．）に組み込まれている。他の配列とある程度同一な配列は、これらのプログラムによって同定できる。更に、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３８７−３９５）で利用可能なプログラム、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰプログラムを使用して、２つのポリヌクレオチド間の％同一性及び２つのポリペプチド配列間の％同一性及び％相同性又は同一性を決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７，１９５−１９７．）の「ローカルホモロジー」アルゴリズムを使用し、２つの配列間の類似性の最良の単一領域を見つけ出す。
好ましくは、微生物叢配列変異体は、ＭＨＣ分子の一次及び／又は二次アンカー残基において（のみ）腫瘍関連抗原エピトープ配列と異なる。より好ましくは、微生物叢配列変異体は、ＭＨＣ分子の一次及び／又は二次アンカー残基に（のみ）アミノ酸置換を含むという点において（のみ）、腫瘍関連抗原エピトープ配列と異なる。ＨＬＡサブタイプのアンカー残基は当技術分野で知られており、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋの既存のｐ−ＨＬＡ複合体の構造データのラージスループット分析（ｌａｒｇｅ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって定義された。更に、ＭＨＣサブタイプのアンカーモチーフは、ＩＥＤＢ（ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ；対立遺伝子によるブラウズ（ｂｒｏｗｓｅ ｂｙ ａｌｌｅｌｅ））又はＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／）にも存在し得る。例えば、９個のアミノ酸サイズのＨＬＡ．Ａ２．０１ペプチドの場合、主要な接触点を提供するペプチドの一次アンカー残基は、残基位置Ｐ１、Ｐ２、及びＰ９に位置する。
したがって、微生物叢配列変異体のコア配列は、腫瘍関連抗原エピトープ配列のコア配列と同一であることが好ましく、コア配列は、３個の最もＮ末端側及び３個の最もＣ末端側のアミノ酸以外のすべてのアミノ酸からなる。換言すれば、腫瘍関連抗原エピトープ配列と比較した微生物叢配列変異体の変化は、好ましくは「コア配列」（配列の中央のアミノ酸）ではなく、３個のＮ末端側及び／又は３個のＣ末端側アミノ酸内に位置する。換言すれば、微生物叢配列変異体では、腫瘍関連抗原エピトープ配列と比較したときの変化（ミスマッチ）は、（少なくとも）３個のＮ末端側アミノ酸及び／又は（少なくとも）３個のＣ末端側アミノ酸、より好ましくは変化（ミスマッチ）は、２個のＮ末端側アミノ酸及び／又は２個のＣ末端側アミノ酸においてのみ許容される。これは、３個全部（好ましくは２個全部）のＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸を変更する必要があることを意味するのではなく、アミノ酸を変更できる唯一のアミノ酸位置であることを意味しているに過ぎない。例えば、９個のアミノ酸のペプチドでは、３個の中間アミノ酸がコア配列を表すことができ、３個のＮ末端側及び３個のＣ末端側アミノ酸位置のいずれかでのみ変更が起こり得ることが好ましく、変更／置換が、２個のＮ末端側及び／又は２個のＣ末端側アミノ酸位置のいずれかでのみ生じ得ることがより好ましい。
より好ましくは、（腫瘍関連抗原エピトープ配列の）コア配列は、２個の最もＮ末端側及び２個の最もＣ末端側のアミノ酸以外のすべてのアミノ酸からなる。例えば、９個のアミノ酸のペプチド（腫瘍関連抗原エピトープ配列）では、５つの中間アミノ酸がコア配列を表すことができ、（腫瘍関連抗原エピトープ配列の）２個のＮ末端と２個のＣ末端アミノ酸位置のいずれかでのみ変更が生じ得ることが好ましい。
（腫瘍関連抗原エピトープ配列の）コア配列は、また、最もＮ末端及び最もＣ末端のアミノ酸以外のすべてのアミノ酸からなることが好ましい。例えば、９個のアミノ酸のペプチド（腫瘍関連抗原エピトープ配列）では、７個の中間アミノ酸がコア配列を表すことができ、変更は、Ｎ末端位置（Ｐ１）及びＣ末端アミノ酸位置（Ｐ９）でのみ起こり得ることが好ましい。
最も好ましくは、（腫瘍関連抗原エピトープ配列の）コア配列は、２個の最もＮ末端側のアミノ酸及び最もＣ末端側のアミノ酸以外のすべてのアミノ酸からなる。例えば、９個のアミノ酸のペプチド（腫瘍関連抗原エピトープ配列）では、６個の中間アミノ酸がコア配列を表すことができ、変更が、２個のＮ末端位置（Ｐ１及びＰ２）及びＣ末端アミノ酸位置（Ｐ９）のいずれかでのみ生じ得ることが好ましい。
微生物叢配列変異体、例えば、９個のアミノ酸の長さを有する微生物叢配列変異体は、位置１（Ｐ１；最もＮ末端側のアミノ酸位置）にフェニルアラニン（Ｆ）又はリジン（Ｋ）を含むことを特に好ましい。更に、微生物叢配列変異体、例えば、９個のアミノ酸の長さを有する微生物叢配列変異体は、位置２（Ｐ２）にロイシン（Ｌ）又はメチオニン（Ｍ）を含むことが好ましい。更に、微生物叢配列変異体、例えば、９個のアミノ酸の長さを有する微生物叢配列変異体は、位置９（Ｐ９）にバリン（Ｖ）又はロイシン（Ｌ）を含むことが好ましい。最も好ましくは、微生物叢配列変異体、例えば、９個のアミノ酸の長さを有する微生物叢配列変異体は、位置１（Ｐ１；最もＮ末端側のアミノ酸位置）にフェニルアラニン（Ｆ）又はリジン（Ｋ）、位置２（Ｐ２）にロイシン（Ｌ）又はメチオニン（Ｍ）、及び／又は位置９（Ｐ９）にバリン（Ｖ）又はロイシン（Ｌ）を含む。
微生物叢配列変異体のコア配列は、また、腫瘍関連抗原エピトープ配列のコア配列と異なってもよい。この場合、（腫瘍関連抗原エピトープ配列のコア配列と比較したときの微生物叢配列変異体のコア配列における）任意のアミノ酸置換は、以下に記載する保存的アミノ酸置換であることが好ましい。
一般に、アミノ酸置換、特にＭＨＣ分子のアンカー位置以外の位置でのアミノ酸置換（例えば、ＭＨＣ−ＩサブタイプＨＬＡ．Ａ２．０１のＰ１、Ｐ２、及びＰ９）は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的置換の例としては、ある脂肪族残基の、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＡｌａなどの別の脂肪族残基への置換、又は１つの極性残基の別のものとの置換、例えば、ＬｙｓとＡｒｇの間、Ｇｌｕ及びＡｓｐ、又はＧｌｎとＡｓｎなどが挙げられる。他のそのような保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換はよく知られている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５− １３２）。保存的アミノ酸置換の例を以下の表１に示す。
特に、（微生物叢）配列変異体及びその好ましい実施形態の前記説明は、選択された腫瘍関連抗原エピトープの微生物叢配列変異体が同定される本発明に係る方法の工程（ｉｉｉ）に適用される。したがって、本発明に係る方法の工程（ｉｉｉ）での同定は、特に、微生物叢配列変異体について上で概説した原理に基づく。
本発明に係る腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体の同定のための方法の工程（ｉ）では、目的の腫瘍関連抗原が選択される。これは、例えば、予防及び／又は治療する癌に基づいて行うことができる。異なるタイプの癌に関連する抗原は、当技術分野で周知である。適切な癌／腫瘍エピトープは、例えば、癌／腫瘍エピトープデータベース、例えば、データベース「Ｔａｎｔｉｇｅｎ」（ＴＡＮＴＩＧＥＮ ｖｅｒｓｉｏｎ １．０，Ｄｅｃ １，２００９；ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｏｒｅ ａｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｃｖｃ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｔａｄｂ／）などから取得することができる。選択のための工程（ｉ）で使用できる腫瘍関連抗原のデータベースの更なる例としては、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈ．ｏｒｇ／ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ／ｅｖｅｎｔｓ−ａｎｄ−ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｅｐｔｉｄｅ−ｄａｔａｂａｓｅ）及び「ＣＴｄａｔａｂａｓｅ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｔａ．ｌｎｃｃ．ｂｒ／）が挙げられる。更に、腫瘍関連抗原は、当技術分野で知られている科学論文などの文献に基づいて選択することもできる。
抗原のデータベースを提供するインターネットリソース（上に例示）を文献検索と組み合わせることが特に好ましい。例えば、工程（ｉ）のサブ工程（ｉ−ａ）では、１つ以上の腫瘍関連抗原を、Ｔａｎｔｉｇｅｎ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅ、及び／又はＣＴｄａｔａｂａｓｅなどのデータベースから同定し、サブ工程（ｉ−ｂ）では、サブ工程（ｉ−ａ）でデータベースから選択された１つ以上の抗原に関する具体的な文献を特定し、調査することができる。このような文献は、抗原の特異的な腫瘍発現の調査に特に関連していることがあり、例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｄｉｓｃｏｖｅｒ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２ Ｄｅｃ １５；７２（２４）：６３５１−６１；Ｃｈｅｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｐｒｉｏｒｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ：ａ ｎａｔｉｏｎａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｐｉｌｏｔ ｐｒｏｊｅｃｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９ Ｓｅｐ １；１５（１７）：５３２３−３７がある。
その後、サブ工程（ｉ−ｃ）で更なる選択を行うことができ、サブ工程（ｉｂ）の文献調査の結果に基づいて、サブ工程（ｉ−ａ）でデータベースから選択された１つ以上の抗原を選択（即ち、維持）又は「破棄」することができる。
任意に、選択された抗原は、選択後の発現プロファイルに関してアノテートすることができる（例えば、サブ工程が実行される場合、サブ工程（ｉ−ａ）又は（ｉ−ｃ）の後）。この目的のために、Ｇｅｎｔ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｄｉｃａｌｇｅｎｏｍｅ．ｋｒｉｂｂ．ｒｅ．ｋｒ／ＧＥＮＴ／）、代謝遺伝子ビジュアライザー（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒａｖ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）、又はｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／）などのツールを使用することができる。それにより、１つ以上の選択された抗原を更に定義することができ、例えば、潜在的な適応、考えられる副作用との関連、及び／又は「ドライバー」抗原（癌の原因となる変更）であるか「パッセンジャー」抗原（偶発的な変化又は癌の結果として生じる変化）であるかに関して定義することができる（例えば、Ｔａｎｇ Ｊ，Ｌｉ Ｙ，Ｌｙｏｎ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｄｒｉｖｅｒ−ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ ｖｉａ ｓｐｏｒａｄｉｃ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｄｏｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ：ａ ｐｒｏｏｆ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｓｔｕｄｙ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０１４；３３（７）：８１４−８２２参照）。
好ましくは、工程（ｉｉ）で同定された腫瘍関連抗原エピトープは、ＭＨＣクラスＩにより提示され得る。換言すれば、工程（ｉｉ）で同定された腫瘍関連抗原エピトープは、ＭＨＣクラスＩに結合できることが好ましい。ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ、ＭＨＣ−Ｉ）は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）とも呼ばれるキラーＴ細胞にエピトープを提示する。ＣＴＬは、ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）に加えて、ＣＤ８受容体を発現する。ＣＴＬのＣＤ８受容体がＭＨＣクラスＩ分子にドッキングすると、ＣＴＬのＴＣＲがＭＨＣクラスＩ分子内のエピトープに適合すれば、ＣＴＬは、細胞をアポトーシスによりプログラムされた細胞死に誘導する。癌細胞は直接攻撃されるため、この経路は、癌の予防及び／又は治療に特に有用である。ヒトでは、ＭＨＣクラスＩは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃ分子を含む。
通常、長さが８〜１２個、好ましくは８〜１０個のペプチド（エピトープ）がＭＨＣ Ｉによって提示される。抗原のどのエピトープがＭＨＣ Ｉによって提示される／それに結合するかは、上に例示したデータベースによって特定することができる（例えば、Ｔａｎｔｉｇｅｎ（ＴＡＮＴＩＧＥＮ ｖｅｒｓｉｏｎ １．０，Ｄｅｃ １，２００９；Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅでＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｏｒｅによって開発；ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｃｖｃ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｔａｄｂ／）は、対応するＨＬＡサブタイプを有するエピトープのリストを提供する）。好ましい分析ツールは、「ＩＥＤＢ」（Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，ＩＥＤＢ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｖ２．１７、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ ＳｅｒｖｉｃｅｓにおけるＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈの一部であるＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓからの契約によって支援されている；ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／）であり、例えば、ＭＨＣ−Ｉプロセシング予測（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ａｎａｌｙｚｅ／ｈｔｍｌ／ｍｈｃ＿ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．ｈｔｍｌ）を提供する。これにより、プロテアソーム切断、ＴＡＰ輸送、及びＭＨＣクラスＩ分析ツールに関する情報を、ペプチド提示の予測のために組み合わせることができる。別の好ましいデータベースは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）データバンク「ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ＭＨＣリガンド及びペプチドモチーフのデータベース（Ｖｅｒ．１．０、ＤＦＧ−Ｓｏｎｄｅｒｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｂｅｒｅｉｃｈ ６８５、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ：ＥＵ ＢＩＯＭＥＤ ＣＴ９５−１６２７，ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＴ９５−０２６３、ＥＵ ＱＬＱ−ＣＴ−１９９９−００７１３によって支援されている；ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ）であり、ＭＨＣ分子から溶出されたペプチドをコンパイルしている。ＳＹＦＰＥＩＴＨＩデータベースは、公開された報告からのクラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣ分子に結合することが知られているペプチド配列のみを含むため、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩデータベースが好ましい。特に好ましくは、インビトロデータ（ＳＹＦＰＥＩＴＨＩデータベース及びＩＥＤＢデータベースにコンパイルされたものなど）から得られた結果は、制限検索によって拡張することができ、例えば、溶出アッセイから得られたヒト直鎖エピトープを含み、インシリコ予測ＭＨＣ結合データベース、例えば、ＩＥＤＢデータベースにおいて、ＭＨＣクラスＩ制限を含む。
ＭＨＣ Ｉにより提示される／それに結合するエピトープの前記データベース選択に加えて又はそれに代えて、ＭＨＣクラスＩへの候補ペプチドの結合を、好ましくは、ＭＨＣインビトロ又はインシリコ結合試験により試験することができる。更に、例えば、インシリコ結合試験で得られた結果を確認するために、例えば、最初にインシリコ結合試験を使用して第１の選択を取得し、後の工程でインビトロ結合試験を使用するなどして、インビトロ又はインシリコ結合試験を組み合わせてもよい。これは一般的にも当てはまる：エピトープ又は微生物叢配列変異体などのペプチドの結合は、好ましくは、明細書に記載のＭＨＣインビトロ又はインシリコ結合試験により試験することができる。
この文脈では、ＭＨＣクラスＩへの結合を決定するために、ＩＥＤＢ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｃｅｎｔｅｒが提供する閾値（カットオフ）（ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｈｅｌｐ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ｈｃ／ｅｎ−ｕｓ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／１１４０９４１５１８１１−Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ−ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ−ｃｕｔ−ｏｆｆｓ−ｆｏｒ−ＭＨＣ−ｃｌａｓｓ−Ｉ−ａｎｄ−ＩＩ−ｂｉｎｄｉｎｇ−ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ）を用いることができる。即ち、ＭＨＣクラスＩの場合、ｈｔｔｐｓ：／／ｈｅｌｐ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ｈｃ／ｅｎ−ｕｓ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／１１４０９４１５１８１１−Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ−ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ−ｃｕｔ−ｏｆｆｓ−ｆｏｒ−ＭＨＣ−ｃｌａｓｓ−Ｉ−ａｎｄ−ＩＩ−ｂｉｎｄｉｎｇ−ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓに示され、表２に説明されるカットオフを用いることができる。
ＭＨＣクラスＩ結合の予測（ＭＨＣインシリコ結合試験）は、「ＮｅｔＭＨＣｐａｎ」などの公開ツールを使用して実行でき、例えば、「ＮｅｔＭＨＣｐａｎ ３．０ Ｓｅｒｖｅｒ」又は「ＮｅｔＭＨＣｐａｎ ４．０ Ｓｅｒｖｅｒ」（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋ ＤＴＵ；ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｐａｎ／）。ＮｅｔＭＨＣｐａｎ法、特にＮｅｔＭＨＣｐａｎ ３．０以降のバージョンは、ヒト（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ）及びその他の種の１７２種のＭＨＣ分子をカバーする１８００００を超える定量的結合データについて訓練されている。一般に、親和性は、強いバインダーと弱いバインダーのデフォルトの閾値をそのままにして予測できる。例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の場合、５０ｎＭ未満の計算された親和性は、「強いバインダー」を示し、５０〜２５５ｎＭ（又は５０ｎＭ〜３００ｎＭ）の親和性は、「中程度のバインダー」を示す。
ＮｅｔＭＨＣｐａｎ、例えば、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ ３．０又はＮｅｔＭＨＣｐａｎ ４．０では、予測される親和性のランクを、４００，０００個のランダムな天然ペプチドのセットと比較することができ、これを％ランク結合親和性の尺度として使用することができる。この値は、特定の分子の、より高い又はより低い平均予測親和性への固有のバイアスに影響されない。例えば、（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１などの場合）、非常に強いバインダーは、％ランク＜０．５を有するとして定義され、強いバインダーは、％ランク＜１．０を有するとして定義してもよく、中程度のバインダーは、％ランク１．０〜２．０を有するとして定義してもよく、弱いバインダーは、％ランク＞２．０を有するとして定義してもよい。
インビトロ試験の方法は、当業者に周知である。例えば、当業者は、Ｔｏｕｒｄｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｌｏｗ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ＨＬＡ−Ａ２．１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙｐｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｄｅｃ；３０（１２）：３４１１−２１において、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１によって提示されるペプチド用に検証された実験プロトコルを用いることができる。この文脈において、ＨＩＶ ｐｏｌ ５８９−５９７などの参照ペプチドを試験で更に使用することができる。これにより、参照ペプチドで観察された結合に対するインビトロ親和性の計算が可能になり、例えば、次の式によって行うことができる。
相対親和性＝ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の発現の２０％を誘導する各ペプチドの濃度／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の発現の２０％を誘導する参照ペプチドの濃度
（式中、１００％は、参照ペプチド、例えば、ＨＩＶ ｐｏｌ ５８９−５９７（例えば、１００μＭの濃度で使用）で検出されたＨＬＡ−Ａ＊０２０１発現のレベルである。）例えば、１未満の相対親和性を示すペプチドは、「強いバインダー」と考えることができ、１〜２の間の相対親和性を示すペプチドは、「中程度のバインダー」と考えることができ、３を超える相対親和性を示すペプチドは、「弱いバインダー」と考えることができる。
工程（ｉｉ）で同定された腫瘍関連抗原エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩにより提示できることも好ましい。換言すれば、工程（ｉｉ）で同定された腫瘍関連抗原エピトープが、ＭＨＣクラスＩＩに結合できることが好ましい。ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ、ＭＨＣ−ＩＩ）は、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）などの免疫細胞にエピトープを提示する。次に、ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞の活性化による最大の抗体免疫応答につながる可能性のある適切な免疫応答を引き起こすのに役立つ。ヒトでは、ＭＨＣクラスＩＩは、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＱ、及びＨＬＡ−ＤＲ分子を含む。
通常、ＭＨＣ ＩＩは、１３〜２４個のアミノ酸の長さを有するペプチド（エピトープ）を提示する。抗原のどのエピトープがＭＨＣ ＩＩによって提示されることができる／又はそれに結合できるかは、ＭＨＣ Ｉについて上で概説したデータベースによって特定できる（ＭＨＣ ＩではなくＭＨＣ ＩＩに関連するツールを使用すればよい）。追加的又は代替的に、候補ペプチドのＭＨＣクラスＩＩへの結合は、好ましくは、本明細書に記載のＭＨＣインビトロ又はインシリコ結合試験により試験され、これはＭＨＣ ＩＩにも同様に適用される。
本発明に係る微生物叢配列変異体の同定のための方法の工程（ｉｉｉ）におけるエピトープ配列の少なくとも１つの微生物叢配列変異体の同定は、好ましくは以下によって行われる：
工程（ｉｉ）で選択したエピトープ配列を１つ以上の微生物叢配列と比較すること、及び
１つ以上の微生物叢配列が、エピトープ配列の１つ以上の微生物叢配列変異体を含むかどうかを特定すること（上で概説した通り）。
換言すれば、本発明に係る方法の工程（ｉｉｉ）は、好ましくは以下を含む：
工程（ｉｉ）で選択したエピトープ配列を１つ以上の微生物叢配列と比較すること、及び
１つ以上の微生物叢配列が、エピトープ配列の１つ以上の微生物叢配列変異体を含むかどうかを特定すること（上で概説した通り）。
特に、工程（ｉｉ）で選択したエピトープ配列は、特に、類似の配列（工程（ｉｉ）で選択したエピトープ配列と少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも７５％の配列同一性を有する）を含む１つ以上の微生物叢配列を同定するために、微生物叢配列を検索するためのクエリ配列（入力配列／参照配列）として使用できる。
これに関連して、上で概説した微生物叢配列変異体、特に前記微生物叢配列変異体の好ましい実施形態の基準（特に、類似性及び％配列同一性に関する基準）が適用される。例えば、第１の工程で、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの配列類似性検索を行うことができる。例えば、タンパク質ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）は、ＰＡＭ３０タンパク質置換マトリックスを使用して行うことができる。ＰＡＭ３０タンパク質置換マトリックスは、部位ごとの経時的なアミノ酸変化率を記述し、長さが３５個の未満のアミノ酸のクエリに推奨される。タンパク質ＢＬＡＳＴの更に（追加の）例示されたパラメータは、ワードサイズ２（短いクエリに推奨される）；２０００００００の期待値（Ｅ）（可能な一致の数を最大化するために調整）；及び／又は「０」に設定された組成ベースの統計は、３０アミノ酸よりも短い入力配列であり、ギャップのないアライメントのみを許容する。
その後、結果を、例えば、配列の長さに関してフィルタリングし、例えば、８〜１２個のアミノ酸の長さを有する配列のみ（例えば、８個のアミノ酸の長さを有する配列のみ、９個のアミノ酸の長さを有する配列のみ、１０個のアミノ酸の長さを有する配列のみ、１１個のアミノ酸の長さを有する配列のみ、又は１２個のアミノ酸の長さを有する配列のみ）に関して、好ましくは８〜１０個のアミノ酸の長さを有する配列のみ、最も好ましくは９又は１０個のアミノ酸の長さを有する配列のみが得られるようにする。
更に、ミスマッチ／置換が特定の位置でのみ、好ましくはＮ及び／又はＣ末端でのみ許容され、前述したコア配列では許容されないように、結果を（更に）フィルタリングすることができる。特定の例として、結果は、位置Ｐ１、Ｐ２、及びＰ９でのみ許容されるミスマッチ／置換を有し、１つの配列当たり許容される最大２個のミスマッチを有する９個のアミノ酸の長さを有する配列のみが得られるようにフィルタリングすることができる。
エピトープ配列と比較される１つ以上の微生物叢配列は、微生物叢配列又は微生物叢配列の編集物（微生物叢配列データベースなど）であり得る。
好ましくは、工程（ｉｉｉ）の微生物叢配列変異体は、微生物叢（配列）データベースに基づいて同定される。そのようなデータベースは、好ましくは、複数の個体（被験体）の微生物叢（配列）データを含むことができる。そのようなデータベースの例は、「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ」（ｖｅｒｓｉｏｎ １．０，Ｍａｒｃｈ ２０１４；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．ＭｅｔａＨＩＴ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ａｕｇ；３２（８）：８３４−４１；ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｍｅｔａ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｎ／ｍｅｔａ／ｈｏｍｅ）であり、これは、主要なヒト微生物叢プロファイリングの取り組み、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＮＩＨ−ＨＭＰ）、及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔｒａｃｔ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＭｅｔａＨＩＴ）を含む。
微生物叢データベースは、単一個体の微生物叢データを含むことが好ましいが、複数の個体の微生物叢データは含まないことが好ましい。このようにして、微生物叢配列変異体（又はそれを含む医薬）は、個人に合わせて具体的に調整することができる。本発明の（方法により同定される）微生物叢配列変異体は自己抗原と異なり、それにより免疫系の自己寛容を回避するという利点に加えて、個体に存在する微生物叢配列変異体は、個体は、そのような微生物叢配列変異体について「プライミング」されてもよい、即ち、個体は、微生物叢配列変異体によってプライミングされたメモリーＴ細胞を有してもよいという更なる利点を有する。特に、ヒト腫瘍関連抗原エピトープの微生物叢配列変異体に対する既存のメモリーＴ細胞は、微生物叢配列変異体の接種で再活性化され、抗腫瘍応答の確立を強化及び加速し、それにより治療効果を更に高める。
複数の個体ではなく、単一個体の微生物叢データを含むデータベースは、例えば、個体の１つ以上の糞便サンプルを使用することにより編集することができる。例えば、微生物（特に細菌）核酸（ＤＮＡなど）又は（ポリ）ペプチドを糞便サンプルから抽出し、当技術分野で公知の方法により配列決定することができる。配列は、微生物叢データ、特に配列のみを含むデータベースに編集される。このようなデータベースを編集するには、例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＩＨＭＳ）プロジェクトにより開発提供された１つ以上の標準操作手順（ＳＯＰ）を使用できる（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ−ｓｔａｎｄａｒｄｓ．ｏｒｇ／＃ＳＯＰＳ）。ＩＨＭＳプロジェクト（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ−ｓｔａｎｄａｒｄｓ．ｏｒｇ）は、Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ（プロジェクトＩＤ：２６１３７６）の下で欧州委員会によって支援され、データ品質及びコンパラビリティをヒトの微生物叢分野で最適化するために設計された標準操作手順（ＳＯＰ）の開発をコーディネートした。ＩＨＭＳは、糞便サンプルの収集、同定、抽出、配列決定、及びデータ分析のための標準操作手順（ＳＯＰ）を含む１４種のＳＯＰを開発した。例えば、ＩＨＭＳ ＳＯＰは、データベースをコンパイルするプロセス全体で使用することができる（即ち、各工程で、ＳＯＰを使用することができる）。別の例では、１つ以上の工程が１つ以上のＳＯＰを使用し、一方で、他の工程が他の方法を使用する。特に好ましい例では、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ．で４０００万ペアエンドリード（４０ ｍｉｌｌｉｏｎ ｐａｉｒ ｅｎｄ ｒｅａｄｓ）で、糞便サンプルから抽出されたＤＮＡの配列決定を行うことができる。配列は、例えば、微生物叢配列変異体（例えば、細菌ペプチド）を発現する候補細菌のゲノム部分の同定のためのバイオインフォマティクスパイプラインを使用して分析できる。
好ましくは、本発明に係る微生物叢配列変異体の同定のための方法の工程（ｉｉｉ）は、以下のサブ工程を含む：
（ｉｉｉ−ａ）任意に、単一又は複数の個体のサンプルから微生物叢のタンパク質配列又は核酸配列を同定すること、
（ｉｉｉ−ｂ）単一又は複数の個体の微生物叢のタンパク質配列又は核酸配列を含むデータベースを編集すること、
（ｉｉｉ−ｃ）工程（ｉｉｉ−ｂ）で編集されたデータベース内で、工程（ｉｉ）で同定されたエピトープ配列の少なくとも１つの微生物叢配列変異体を同定すること。
工程（ｉｉｉ−ａ）のサンプルは、好ましくは糞便サンプルである。コンパイルされるデータベースが単一の個体に関係するか複数の個体に関連するかによって、単一又は複数の個体の１つ以上の糞便サンプルを使用できる。
同定工程（ｉｉｉ−ａ）は、好ましくは、サンプル、特に糞便サンプルからの微生物（特に細菌）核酸（ＤＮＡなど）又は（ポリ）ペプチドの抽出、及び、例えば、前述したようなその配列決定を含む。任意に、前記したように配列を分析してもよい。
好ましくは、本発明に係る方法は、以下の工程を更に含む：
（ｉｖ）少なくとも１つの微生物叢配列変異体のＭＨＣ分子、特にＭＨＣ Ｉ分子への結合を試験し、結合親和性を得る工程。
少なくとも１つの微生物叢配列変異体のＭＨＣ分子、特にＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩへの結合は、前記したようにインビトロ又はインシリコ結合試験によりＭＨＣによって試験することができる。したがって、前記したように、中程度の、強力な、及び非常に強力なバインダーを選択することができる。
好ましくは、ＭＨＣ分子（特に、ＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩ分子）に対する少なくとも１つの微生物叢配列変異体について、更には、ＭＨＣ分子に対する（それぞれの参照）エピトープ（「対応する」腫瘍関連抗原エピトープ配列）について、（本明細書に記載されるようにインビトロ及び／又はインシリコで）ＭＨＣへの結合が試験され、結合親和性は、好ましくは、両方（エピトープ配列及びその微生物叢配列変異体）について得られる。
結合試験後、ＭＨＣ、特に、ＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩに対して中程度に、強力に、又は非常に強力に結合する微生物叢配列変異体のみが選択されることが好ましい。より好ましくは、強力及び非常に強力なバインダーのみが選択され、最も好ましくは、ＭＨＣ、特に、ＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩに非常に強力に結合する微生物叢配列変異体のみが選択される。
より好ましくは、ＭＨＣ、特に、ＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩに強力又は非常に強力に結合する微生物叢配列変異体のみが選択され、（それぞれの参照）エピトープ（「対応する」腫瘍関連抗原エピトープ配列）は、ＭＨＣ、特に、ＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩに中程度に、強力に、又は非常に強力に結合する。更により好ましくは、ＭＨＣ、特に、ＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩに非常に強く結合する微生物叢配列変異体のみが選択され、（それぞれの参照）エピトープは、ＭＨＣ、特に、ＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩに中程度に、強力に、又は非常に強力に結合する。最も好ましくは、ＭＨＣ、特に、ＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩに非常に強く結合する微生物叢配列変異体のみが選択され、（それぞれの参照）エピトープは、ＭＨＣ、特に、ＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩに強力又は非常に強力に結合する。
本発明に係る方法の工程（ｉｖ）は、微生物叢配列変異体及びそれぞれの参照エピトープについて得られた結合親和性の比較と、ＭＨＣ、特に、ＭＨＣ Ｉ又はＭＨＣ ＩＩに対してそれぞれの参照エピトープよりも高い結合親和性を有する微生物叢配列変異体の選択とを更に含むことも好ましい。
好ましくは、本発明に係る方法は、以下の工程を更に含む：
（ｖ）微生物叢配列変異体を含む微生物叢タンパク質の細胞局在を決定する工程。
この文脈において、微生物叢配列変異体を含む微生物叢タンパク質（ｉ）が分泌されるか、及び／又は（ｉｉ）膜貫通ドメインを含むかどうかを決定することが好ましい。膜内／膜上に分泌又は存在する微生物叢タンパク質は、免疫応答を引き起こすことがある。したがって、本発明の文脈においては、分泌される（例えば、シグナルペプチドを含む）微生物叢タンパク質に含まれる、又は膜貫通ドメインを含む微生物叢配列変異体が好ましい。特に、分泌されたエキソソームに含まれる分泌された成分又はタンパク質は、ＡＰＣによって提示される傾向がより高いため、分泌されたタンパク質（又はシグナルペプチドを有するタンパク質）に含まれる微生物叢配列変異体が好ましい。
微生物叢配列変異体を含む微生物叢タンパク質の細胞局在を決定するために、工程（ｖ）は、好ましくは細胞局在を決定する前に、微生物叢配列変異体を含む微生物叢タンパク質の配列を特定することを更に含むことが好ましい。
細胞局在、特にタンパク質が分泌されるか、膜貫通ドメインを含むかどうかは、当業者に周知の方法によりインシリコ又はインビトロで試験することができる。例えば、「ＳｉｇｎａｌＰ ４．１ Ｓｅｒｖｅｒ」（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋ ＤＴＵ；ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ）及び／又は「Ｐｈｏｂｉｕｓ」（Ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｏｐｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｒｅ；ＵＲＬ：ｐｈｏｂｉｕｓ．ｓｂｃ．ｓｕ．ｓｅ）を組み合わせることができる。
例えば、タンパク質が分泌されているかどうかを試験するために、シグナルペプチドの存在を評価することができる。シグナルペプチドは、原核生物の細胞膜を通過する移行のためにパッセンジャー（カーゴ）タンパク質を標的とする遍在性のタンパク質選別シグナルである。シグナルペプチドの存在を試験するには、例えば、「ＳｉｇｎａｌＰ ４．１ Ｓｅｒｖｅｒ」（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋ ＤＴＵ；ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ）及び／又は「Ｐｈｏｂｉｕｓ」（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋ ＤＴＵ；ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ）を使用できる。好ましくは、２つの予測ツール（例えば、ＳｉｇｎａｌＰ ４．１ ＳｅｒｖｅｒとＰｈｏｂｉｕｓなど）を組み合わせることができる。
更に、タンパク質が膜貫通ドメインを含むかどうかを決定することができる。シグナルペプチドと膜貫通ドメインはいずれも疎水性であるが、膜貫通ヘリックスは通常、より長い疎水性領域を有する。例えば、ＳｉｇｎａｌＰ ４．１ ＳｅｒｖｅｒとＰｈｏｂｉｕｓは、シグナルペプチドを膜貫通ドメインと識別する能力を有する。好ましくは、予測される２つの膜貫通ヘリックスの最小数を設定して、膜タンパク質と細胞質タンパク質を識別し、最終的なコンセンサスリストを得る。
好ましくは、本発明に係る方法は、上記工程（ｉｖ）及び前記工程（ｖ）を含む。工程（ｖ）が工程（ｉｖ）の後に行われることが好ましい。また、工程（ｉｖ）が工程（ｖ）の後に行われることが好ましい。
更に、本発明に係る方法が以下の工程を含むことも好ましい：
微生物叢配列変異体を含む微生物叢タンパク質のアノテーション工程。
アノテーションは、参照データベースとの（ＢＬＡＳＴベースの）比較によって、例えば、Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）及び／又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＲｅｆＳｅｑ）との比較によって行うことができる。ＲｅｆＳｅｑは、ゲノムＤＮＡ、転写産物、タンパク質など、統合された非冗長な配列のセットを提供する。ＫＥＧＧでは、ＫＯ（ＫＥＧＧ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）データベースに格納されている分子レベル機能を使用できる。これらの機能は、共通の祖先から進化した異なる種の遺伝子によってコードされたタンパク質を含むオルソログのグループに分類される。
前記のように、ヒト抗原エピトープの微生物叢配列変異体は、（完全な）ヒトエピトープと比較して、ヒトのペプチドを厳密に認識できるＴ細胞が、自己抗原を認識するとして成熟中には枯渇している（これは、微生物叢配列変異体には当てはまらない）という利点を有する。したがって、微生物叢配列変異体は免疫原性を高める。更に、当技術分野でよく知られているように、（前記したように確認／試験できる）ＭＨＣ（ＨＬＡ）結合は、Ｔ細胞免疫原性の指標である。
しかしながら、微生物叢配列変異体の免疫原性（単独で、又は対応するヒトエピトープと比較して）も（追加で）試験することができる（例えば、免疫原性の増加を確認するために）。したがって、本発明に係る方法は、以下の工程を更に含むことが好ましい：
（ｖｉ）微生物叢配列変異体の免疫原性を試験する工程。
当業者は、インシリコ、インビトロ、及びインビボ／エクスビボ試験を含む免疫原性を試験するための様々な方法に精通している。一般に、免疫原性試験のアッセイの例としては、ＡＤＡ（抗薬物抗体）スクリーニングなどのスクリーニングアッセイ、確認アッセイ、滴定及びアイソタイピングアッセイ、中和抗体を使用するアッセイが挙げられる。このようなアッセイのプラットフォーム／アッセイ形式の例としては、ＥＬＩＳＡ及びブリッジングＥＬＩＳＡ、電気化学発光（ＥＣＬ）及びメソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）、フローサイトメトリー、ＳＰＥＡＤ（酸解離を伴う固相抽出）、放射免疫沈降（ＲＩＰ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ビーズベースのアッセイ、バイオレイヤー干渉法、バイオセンサーアッセイ、及びバイオアッセイ（細胞増殖アッセイなど）が挙げられる。各種アッセイについては、例えば、レビュー記事のＭｅｅｎｕ Ｗａｄｈｗａ，Ｉｖａｎａ Ｋｎｅｚｅｖｉｃ，Ｈｙｅ−Ｎａ Ｋａｎｇ，Ｒｏｂｉｎ Ｔｈｏｒｐｅ：Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ａｓｓａｙｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｔｉｌｉｔｙ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ４３，Ｉｓｓｕｅ ５，２０１５，Ｐａｇｅｓ ２９８−３０６，ＩＳＳＮ １０４５−１０５６，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．２０１５．０６．００４により詳細に記載されており、これを、参照により本明細書に援用する。更に、免疫原性試験のガイドラインがＦＤＡによって提供されている（Ａｓｓａｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ．ＦＤＡ，２０１６）。免疫原性のインシリコ試験（特に、バイオインフォマティクスのツールの適用）は、特に、前記したＭＨＣ（ＨＬＡ）結合のインシリコ試験を含む。
特定の例として、試験物質（例えば、任意の適切な投与形態の微生物叢配列変異体）を免疫感作のために被験体（動物又はヒト）に投与することができる。その後、被験体の免疫応答を、各種方法で測定することができる。例えば、脾細胞などの免疫細胞を評価することができる。これは、例えば、ＥＬＩＳＡにより、免疫細胞（例えば、脾細胞）のサイトカイン放出（例えば、ＩＦＮγ）を測定することによって行うことができる。或いは、ＡＤＡ（抗薬物抗体）を評価することもできる。
アッセイの他のよく知られた例としては、テトラマーアッセイ（例えば、Ａｌｔｍａｎ ＪＤ，Ｍｏｓｓ ＰＡ，Ｇｏｕｌｄｅｒ ＰＪ，Ｂａｒｏｕｃｈ ＤＨ，ＭｃＨｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＭＧ，Ｂｅｌｌ ＪＩ，ＭｃＭｉｃｈａｅｌ ＡＪ，Ｄａｖｉｓ ＭＭ．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６ Ｏｃｔ ４；２７４（５２８４）：９４−６に記載）又はペンタマーアッセイなどのＭＨＣマルチマーアッセイが挙げられる。
好ましい実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞に関する免疫原性（又は細胞傷害性Ｔ細胞応答）が試験される。これは、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞応答を特異的に評価することにより行われる。特に、細胞傷害性アッセイを行うことができる。例えば、試験物質（例えば、任意の適切な投与形態の微生物叢配列変異体など）は、腫瘍（微生物叢配列変異体が対応する抗原を発現する）を有する被験体（動物又はヒト）に投与することができ、腫瘍サイズが観察／測定される。細胞傷害性は、また、例えば、腫瘍細胞株（微生物叢配列変異体が対応する抗原を発現する）を使用することによって、インビトロで試験することもできる。
細胞傷害性アッセイ、特に、Ｔ細胞細胞傷害性アッセイは、前記した免疫原性アッセイとして、又は前記した（他の）免疫原性アッセイに加えて行うことができる。
したがって、本発明に係る方法は、以下の工程を更に含むことが好ましい：
（ｖｉ）微生物叢配列変異体の細胞傷害性を試験する工程。
好ましくは、微生物叢配列変異体のＴ細胞細胞傷害性が試験される。
好ましくは、微生物叢配列変異体が対応する抗原を発現する特定の細胞に関する細胞傷害性を試験する（本明細書に記載の通り）。
好ましくは、腫瘍関連抗原エピトープ配列（その微生物叢配列変異体が同定される）は、配列番号１〜５、５５〜６５、及び１２６〜１３１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する。例えば、腫瘍関連抗原エピトープ配列（その微生物叢配列変異体が同定される）は、配列番号５８又は５９に示されるアミノ酸配列を有する。例えば、腫瘍関連抗原エピトープ配列（その微生物叢配列変異体が同定される）は、配列番号１３１に示されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態においては、腫瘍関連抗原エピトープ配列（その微生物叢配列変異体が同定される）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。
医薬を調製するための方法
更なる態様において、本発明は、好ましくは癌の予防及び／又は治療のための医薬を調製するための方法を提供し、以下の工程を含む：
（ａ）前記した本発明に係る方法に係る腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体の同定；及び
（ｂ）微生物叢配列変異体（即ち、ペプチド又は核酸）を含む医薬の調製。
好ましくは、医薬はワクチンである。本発明の文脈で使用されるとき、「ワクチン」という用語は、典型的には特定の疾患、好ましくは癌に対して自然免疫及び／又は適応免疫を提供する生物学的製剤を意味する。したがって、ワクチンは、特に、治療対象の免疫系の自然免疫応答及び／又は適応免疫応答を支援する。例えば、本明細書に記載の微生物叢配列変異体は、典型的には、治療対象の患者に適応免疫応答をもたらす又は支援する。ワクチンは、自然免疫応答をもたらす又は支援するアジュバントを更に含むことができる。
好ましくは、医薬の調製、即ち、本発明に係る医薬を調製するための方法の工程（ｂ）は、微生物叢配列変異体、又は微生物叢配列変異体（又は微生物叢配列変異体を含む核酸分子）を含むポリペプチド／タンパク質をナノ粒子にロードすることを含み、微生物叢配列変異体は、好ましくは前記したペプチドである。特に、ナノ粒子は、微生物叢配列変異体（微生物叢配列変異体を含むポリペプチド／タンパク質／核酸）の送達に使用され、任意に、アジュバントとしても作用し得る。微生物叢配列変異体（微生物叢配列変異体を含むポリペプチド／タンパク質／核酸）は通常、ナノ粒子内にカプセル化されるか、ナノ粒子の表面に結合（装飾）される（「コーティング」）。特に、ワクチンとして使用するためのナノ粒子は、当技術分野で知られており、例えば、Ｓｈａｏ Ｋ，Ｓｉｎｇｈａ Ｓ，Ｃｌｅｍｅｎｔｅ−Ｃａｓａｒｅｓ Ｘ，Ｔｓａｉ Ｓ，Ｙａｎｇ Ｙ，Ｓａｎｔａｍａｒｉａ Ｐ（２０１５）：Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ，ＡＣＳ Ｎａｎｏ ９（１）：１６−３０；Ｚｈａｏ Ｌ，Ｓｅｔｈ Ａ，Ｗｉｂｏｗｏ Ｎ，Ｚｈａｏ ＣＸ，Ｍｉｔｔｅｒ Ｎ，Ｙｕ Ｃ，Ｍｉｄｄｅｌｂｅｒｇ ＡＰ（２０１４）：Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｖａｃｃｉｎｅ ３２（３）：３２７−３７；ａｎｄ Ｇｒｅｇｏｒｙ ＡＥ，Ｔｉｔｂａｌｌ Ｒ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ Ｄ（２０１３）Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：１３，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｃｉｍｂ．２０１３．０００１３．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１３，Ｒｅｖｉｅｗ．に記載されている。従来のアプローチと比較して、ナノ粒子はペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）（抗原／アジュバント）を周囲の生物学的環境から保護し、半減期を延長し、全身毒性を最小限に抑え、ＡＰＣへの送達を促進し、又はＴＡＡ特異的Ｔ細胞の活性化を直接引き起こしさえする。好ましくは、ナノ粒子は、３００ｎｍ以下、より好ましくは２００ｎｍ以下、最も好ましくは１００ｎｍ以下のサイズ（直径）を有する。そのようなナノ粒子は、食細胞の取り込みから適切に保護され、循環における構造的完全性が高く循環時間が長く、腫瘍成長部位に蓄積することができ、腫瘍塊に深く浸透することができる。
ナノ粒子の例としては、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）やポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）などの高分子ナノ粒子；金ナノ粒子、酸化鉄ビーズ、酸化鉄酸化亜鉛ナノ粒子、カーボンナノチューブ、メソポーラスシリカナノ粒子などの無機ナノ粒子；カチオン性リポソームなどのリポソーム；免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）；ウイルス様粒子（ＶＬＰ）；及び自己組織化タンパク質などが挙げられる。
高分子ナノ粒子は、ポリ（ｄ，ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ（ｄ，ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ｇ−グルタミン酸）（ｇ−ＰＧＡ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、及びポリスチレンなどのポリマーに基づく／を含む高分子ーナノ粒子である。高分子ナノ粒子は、抗原（例えば、微生物叢配列変異体又はそれを含む（ポリ）ペプチド）を捕捉する、又は抗原に結合する／コンジュゲートする（例えば、微生物叢配列変異体又はそれを含む（ポリ）ペプチド）ことができる。高分子ナノ粒子を、例えば、特定の細胞への送達に使用することができ、又はそれらの低い生分解速度により抗原放出を持続することができる。例えば、ｇ−ＰＧＡナノ粒子を使用して、疎水性抗原をカプセル化できる。ポリスチレンナノ粒子は、さまざまな官能基で表面修飾できるため、さまざまな抗原にコンジュゲートできる。ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＡ）、ＰＬＧＡ、ＰＥＧなどのポリマー、及び多糖類などの天然ポリマーを使用して、ナノサイズの親水性３次元ポリマーネットワークの一種であるヒドロゲルナノ粒子を合成することもできる。ナノゲルは、柔軟なメッシュサイズ、多価コンジュゲーションのための大きな表面積、高含水量、及び抗原の高ローディング能などの好ましい特性を有する。したがって、好ましいナノ粒子は、キトサンナノゲルなどのナノゲルである。好ましい高分子ナノ粒子は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及びポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）に基づく／を含むナノ粒子である。
無機ナノ粒子は、無機物質に基づく／を含むナノ粒子であり、そのようなナノ粒子の例としては、金ナノ粒子、酸化鉄ビーズ、酸化鉄酸化亜鉛ナノ粒子、カーボンナノ粒子（カーボンナノチューブなど）、及びメソポーラスシリカナノ粒子が挙げられる。無機ナノ粒子は、剛性構造と制御可能な合成を提供する。例えば、金ナノ粒子は、球、棒、立方体などの各種形状で容易に生成できる。無機ナノ粒子は、例えば、炭水化物で表面修飾されていてもよい。カーボンナノ粒子は、良好な生体適合性を提供し、例えば、ナノチューブ又は（メソポーラス）球として生成され得る。例えば、本発明に係る微生物叢配列変異体の複数のコピー（又はそれを含む（ポリ）ペプチド）は、カーボンナノ粒子、例えばカーボンナノチューブにコンジュゲートさせることができる。経口投与には、メソポーラスカーボンナノ粒子が好ましい。シリカベースのナノ粒子（ＳｉＮＰ）も好ましい。ＳｉＮＰは生体適合性があり、選択的腫瘍ターゲティング及びワクチン送達において優れた特性を示す。ＳｉＮＰの表面の豊富なシラノール基は、細胞の認識、特定の生体分子の吸収、細胞との相互作用の改善、及び細胞取り込みの向上などの追加的機能を導入するための更なる修飾に使用できる。メソポーラスシリカナノ粒子が特に好ましい。
リポソームは通常、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）などのリン脂質によって形成される。一般に、カチオン性リポソームが好ましい。リポソームは、リン脂質二重層シェルと水性コアで自己組織化する。リポソームは、単一層ラメラベシクル（単一のリン脂質二重層を有する）又は多重層ラメラベシクル（水の層で分離されたいくつかの同心リン脂質シェルを有する）として生成され得る。したがって、抗原をコア内又は異なる層／シェル間にカプセル化することができる。好ましいリポソーム系は、Ｉｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）Ｖ及びＥｐａｘａｌ（登録商標）などの、ヒトでの使用が承認されているものである。
免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）は、例えばサポニンアジュバントＱｕｉｌ Ａ、コレステロール、リン脂質、及び（ポリ）ペプチド抗原（微生物叢配列変異体又はそれを含むポリペプチドなど）で作られたミセルを含むコロイド状サポニンである、約４０ｎｍ（直径）のケージ様粒子である。これらの球状粒子は、無極性相互作用により抗原を捕捉できる。２種類のＩＳＣＯＭが記載されており、いずれも、コレステロール、リン脂質（通常、ホスファチジルエタノールアミン又はホスファチジルコリン）及びサポニン（ＱｕｉｌＡなど）からなる。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、生体適合性カプシドタンパク質の自己組織化により形成される自己組織化ナノ粒子である。天然に最適化されたナノ粒子サイズと繰り返しの構造秩序により、ＶＬＰは、強力な免疫応答を誘導することができる。ＶＬＰは、サイズが、２０ｎｍ〜８００ｎｍ、通常、２０〜１５０ｎｍの様々なウイルスに由来する。これらのペプチド／タンパク質を粒子に融合させる、又は複数の抗原を発現させることにより、ＶＬＰを操作して更なるペプチド又はタンパク質を発現させるようにすることができる。更に、抗原をウイルス表面に化学的に結合させて、バイオコンジュゲートＶＬＰを生成できる。
自己組織化タンパク質の例としては、フェリチン及び主要ヴォールトタンパク質（ＭＶＰ）が挙げられる。フェリチンは、ほぼ球形の１０ｎｍ構造に自己組織化できるタンパク質である。ＭＶＰの９６ユニットは、幅約４０ｎｍ、長さ７０ｎｍの樽型のヴォールトナノ粒子に自己組織化できる。最小相互作用ドメインと遺伝的に融合された抗原は、ＭＶＰと混合されたときに自己組織化プロセスによってヴォールトナノ粒子内にパッケージ化できる。したがって、抗原（例えば、これを含むポリペプチドの本発明に係る微生物叢配列変異体など）は、自己組織化タンパク質、又はＭＶＰの最小相互作用ドメインなどのその断片／ドメインに融合させることができる。したがって、本発明はまた、自己組織化タンパク質（又はその断片／ドメイン）及び本発明に係る微生物叢配列変異体を含む融合タンパク質を提供する。
一般に、ナノ粒子（ＮＰ）の好ましい例としては、酸化鉄ビーズ、ポリスチレンミクロスフェア、ポリ（γ−グルタミン酸）（γ−ＰＧＡ）ＮＰ、酸化鉄−酸化亜鉛ＮＰ、カチオン化ゼラチンＮＰ、プルロニック（登録商標）安定化ポリ（プロピレンスルフィド）（ＰＰＳ）ＮＰ、ＰＬＧＡ ＮＰ、（カチオン性）リポソーム、（ｐＨ応答性）高分子ミセル、ＰＬＧＡ、癌細胞膜コーティングＰＬＧＡ、脂質−リン酸カルシウム（ＬＣＰ）ＮＰ、リポソーム−プロタミン−ヒアルロン酸（ＬＰＨ）ＮＰ、ポリスチレンラテックスビーズ、磁気ビーズ、鉄デキストラン粒子、及び量子ドットナノ結晶を挙げることができる。
好ましくは、工程（ｂ）は、ナノ粒子にアジュバント、例えばｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストをロードすることを更に含む。それにより、微生物叢配列変異体（微生物叢配列変異体を含むポリペプチド／タンパク質／核酸）をアジュバントと共に、例えば樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達することができる。アジュバントは、好ましくは微生物叢配列変異体と同様に、ナノ粒子によってカプセル化されるか、ナノ粒子の表面に結合／コンジュゲートされてもよい。
医薬の調製、即ち、本発明に係る医薬を調製するための方法の工程（ｂ）は、細菌細胞に微生物叢配列変異体をロードすることを含むことも好ましい。例えば、細菌細胞は、微生物叢配列変異体をコードする核酸分子を含み、及び／又は微生物叢配列変異体（ペプチドとして又はポリペプチド／タンパク質に含まれる）を発現する。この目的のために、工程（ｂ）は、（この文脈では、好ましくは核酸である）微生物叢配列変異体（を含む／コードする核酸分子）で細菌細胞の形質転換の工程を含むことが好ましい。そのような細菌細胞は「生細菌ワクチンベクター」として機能でき、生細菌細胞（例えば、細菌又は細菌胞子など、例えば、内生胞子、外胞子、又は微生物嚢胞など）は、ワクチンとして役立ち得る。その好ましい例は、ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５ Ｍａｒ ４；４５（４）：１１１７−２９に記載される。
細菌細胞（細菌又は細菌胞子、例えば、内生胞子、外胞子、又は微生物嚢胞など）、特に（全体の）腸内細菌種が有利であり得る。これは、それらが含む（ポリ）ペプチド又は核酸よりも大きな免疫応答を引き起こす可能性があるからである。好ましくは、細菌細胞は、腸内細菌細胞、即ち、腸内に存在する（細菌の）細菌細胞である。
或いは、本発明に係る細菌細胞、特に腸内細菌は、プロバイオティクス、即ち生きている腸内細菌の形態であってもよく、したがって、提供できる健康上の利益のために食品添加物として使用することができる。それらは、例えば、顆粒、丸剤、又はカプセルに凍結乾燥する、又は消費のために乳製品と直接混合することができる。
好ましくは、医薬の調製、即ち、本発明に係る医薬を調製するための方法の工程（ｂ）は、医薬組成物の調製を含む。そのような医薬組成物は、好ましくは、
（ｉ）微生物叢配列変異体；
（ｉｉ）前記微生物叢配列変異体を含む（組換え）タンパク質；
（ｉｉｉ）前記微生物叢配列変異体を含む（免疫原性）化合物；
（ｉｖ）前記微生物叢配列変異体をロードしたナノ粒子；
（ｖ）前記微生物叢配列変異体をロードした抗原提示細胞；
（ｖｉ）前記微生物叢配列変異体を発現する細菌細胞などの宿主細胞；又は
（ｖｉｉ）前記微生物叢配列変異体をコードする核酸分子；及び
任意に、薬学的に許容される担体及び／又はアジュバントを含む。
本発明に係る医薬、特に、医薬組成物及びワクチンの調製の文脈において有用な製剤プロセシング技術は、「Ｐａｒｔ ５ ｏｆ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ “Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ」に示されている。
本明細書で使用される組換えタンパク質は、自然界には存在しないタンパク質、例えば、微生物叢配列変異体及び更なる成分を含む融合タンパク質である。
「免疫原性化合物」という用語は、本明細書で定義される微生物叢配列変異体を含む化合物を意味し、それが投与される被験体の微生物叢配列変異体に対する免疫学的応答を誘発、維持、又は支援することもできる。いくつかの実施形態では、免疫原性化合物は、少なくとも１つの微生物叢配列変異体、又は担体タンパク質などのタンパク質又はアジュバントに連結されたそのような微生物叢配列変異体を含む少なくとも１つの化合物を含む。担体タンパク質は通常、微生物叢配列変異体などのカーゴを輸送できるタンパク質である。例えば、担体タンパク質は、そのカーゴを、膜を横切って輸送する。
更なる成分として、医薬組成物は、特に、薬学的に許容される担体及び／又はビヒクルを含むことができる。本発明の文脈において、薬学的に許容される担体は、典型的には、本発明の医薬組成物の液体又は非液体ベース（ｌｉｑｕｉｄ ｏｒ ｎｏｎ−ｌｉｑｕｉｄ ｂａｓｉｓ）を含む。本発明の医薬組成物が液体形態で提供される場合、担体は、典型的には、パイロジェンフリー水であり、等張生理食塩水又は緩衝（水）溶液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩などの緩衝液である。特に、本発明の医薬組成物の注射の場合、水又は好ましくは緩衝液、より好ましくは水性緩衝液を使用することができ、これらは、ナトリウム塩、好ましくは、３０ｍＭのナトリウム塩、カルシウム塩、好ましくは少なくとも０．０５ｍＭのカルシウム塩、及び任意にカリウム塩、好ましくは少なくとも１ｍＭのカリウム塩を含む。好ましい実施形態によれば、ナトリウム塩、カルシウム塩、及び任意にカリウム塩は、それらのハロゲン化物、例えば、それらの水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、又は硫酸塩などの形態の塩化物、ヨウ化物、又は臭化物などの形態で存在し得る。限定されるものではないが、ナトリウム塩の例としては、例えば、ＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＳＯ４が挙げられ、任意のカリウム塩の例としては、例えば、ＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＳＯ４が挙げられ、カルシウム塩の例としては、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＩ２、ＣａＢｒ２、ＣａＣＯ３、ＣａＳＯ４、Ｃａ（ＯＨ）２が挙げられる。更に、前記カチオンの有機アニオンは、緩衝液に含まれていてもよい。より好ましい実施形態によれば、上で定義された注射目的に適した緩衝液は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、及び任意に塩化カリウム（ＫＣｌ）から選択される塩を含むことができ、塩化物に加えて、更なるアニオンが存在してもよい。ＣａＣｌ２は、ＫＣｌなどの別の塩に置き換えることもできる。通常、注射用緩衝液の塩は、少なくとも３０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、少なくとも１ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、及び少なくとも０，０５ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の濃度で存在する。注射用緩衝液は、特定の参照媒体に関して高張、等張、又は低張であり得る、即ち、緩衝液は、特定の参照媒体に関してより高い、同一、又はより低い塩含有量を有することがあり、好ましくは、前述の塩を、浸透又は他の濃度効果による細胞の損傷をもたらさない濃度で使用することができる。参照媒体は、例えば、血液、リンパ液、細胞質液、又は他の体液など、「インビトロ」法において生じる液体、又は、例えば、一般的な緩衝液や液体など、「インビトロ」法において参照培地として使用され得る液体である。そのような一般的な緩衝液又は液体は、当業者に知られている。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）及びＲｉｎｇｅｒ−Ｌａｃｔａｔｅ溶液が、液体ベースとして特に好ましい。
更に、本発明の医薬組成物には、１以上の適合性のある固体若しくは液体の充填剤若しくは希釈剤又は封入化合物を更に使用してよく、これらは、治療される被験体に投与するのに好適である。用語「適合性のある」とは、本明細書で使用するとき、本発明の医薬組成物のこれら構成成分が、典型的な使用条件下で本発明の医薬組成物の薬学的有効性を実質的に低下させる相互作用が生じないように、本明細書で定義される微生物叢配列変異体と混合できることを意味する。薬学的に許容される担体、充填剤、及び希釈剤は、当然のことながら、これらが治療される被験体への投与に適したものになるのに十分に高い純度及び十分に低い毒性を有していなければならない。薬学的に許容される担体、充填剤、又はこれらの構成成分として使用することができる化合物のいくつかの例は、例えば、ラクトース、グルコース及びショ糖などの糖類；例えば、コーンスターチ又はバレイショデンプンなどのデンプン；例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース；粉末状トラガカントなどのセルロース及びその誘導体；麦芽；ゼラチン；獣脂；例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなどの固体滑剤；硫酸カルシウム；例えば、落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及びカカオ属の油などの植物油；例えば、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；アルギン酸である。
好ましくは、本明細書に記載の微生物叢配列変異体又は該微生物叢配列変異体を含むポリペプチドは、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞の刺激を提供するなどの免疫アジュバント特性を有するタンパク質／ペプチドと共投与されてもよく、又は例えば共有結合若しくは非共有結合によって連結されてもよい。本明細書に記載の微生物叢配列変異体は、好ましくはＭＨＣクラスＩに結合するが、効率的な免疫応答を提供するためにＣＤ４＋ヘルパーエピトープを更に使用してもよい。Ｔｈ１ヘルパー細胞は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）を分泌し、樹状細胞（ＤＣ）及びＴ細胞における共刺激シグナルの発現を増強することにより、効率的なＤＣ活性化及び特異的ＣＴＬ活性化を維持することができる（Ｇａｌａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｅｓｔ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４ Ｔ Ｈｅｌｐｅｒ １ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１５ Ｊｕｎ ３０；３（３）：４９０−５０２）。
例えば、アジュバントペプチド／タンパク質は、好ましくは、免疫記憶を思い出させる非腫瘍抗原であり得るか、又は非特異的な助けを提供するか、又は特異的な腫瘍由来のヘルパーペプチドであり得る。非特異的なＴ細胞の助けを提供するためのいくつかのヘルパーペプチド、例えば、破傷風ヘルパーペプチド、キーホールリンペットヘモシアニンペプチド又はＰＡＤＲＥペプチド（Ａｄｏｔｅａｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ＣＤ４ ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｔｕｍｏｒ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｈｅｌｐｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１３ Ｍａｙ；９（５）：１０７３−７，Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆ．Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ：ｓｉｎｇｌｅ ｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ，ｌｏｎｇ ｏｒ ｓｈｏｒｔ，ａｌｏｎｅ ｏｒ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ？ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１１ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；１７（５）：３４３−５０）が文献に記載されている。したがって、破傷風ヘルパーペプチド、キーホールリンペットヘモシアニンペプチド及びＰＡＤＲＥペプチドが、このようなアジュバントペプチド／タンパク質の好ましい例である。更に、特異的腫瘍由来ヘルパーペプチドが好ましい。特異的腫瘍由来ヘルパーペプチドは、典型的には、ＭＨＣクラスＩＩ、特にＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ又はＨＬＡ−ＤＱによって提示される。特異的腫瘍由来ヘルパーペプチドは、ＨＥＲ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｈＴＥＲＴ、又はＩＬ１３ＲＡ２などの共有過剰発現腫瘍抗原の配列の断片であってもよい。そのような断片は、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１１個のアミノ酸、更に好ましくは少なくとも１２個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも１３個のアミノ酸の長さを有する。特に、１３〜２４個のアミノ酸の長さを有する、ＨＥＲ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｈＴＥＲＴ又はＩＬ１３ＲＡ２などの共有過発現腫瘍抗原の断片が好ましい。好ましい断片は、ＭＨＣクラスＩＩに結合するので、例えば、ＩＥＤＢのＭＨＣクラスＩＩ結合予測ツール（Ｉｍｍｕｎｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅ；保健福祉省における国立衛生研究所の一部であるアメリカ国立アレルギー・感染症研究所との契約によって支援；ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／；ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ｍｈｃｉｉ／）を使用して同定することができる。
好ましいヘルパーペプチドの更なる例としては、ＵＣＰ２ペプチド（例えば、国際公開第２０１３／１３５５５３ Ａ１号、又はＤｏｓｓｅｔ Ｍ，Ｇｏｄｅｔ Ｙ，Ｖａｕｃｈｙ Ｃ，Ｂｅｚｉａｕｄ Ｌ，Ｌｏｎｅ ＹＣ，Ｓｅｄｌｉｋ Ｃ，Ｌｉａｒｄ Ｃ，Ｌｅｖｉｏｎｎｏｉｓ Ｅ，Ｃｌｅｒｃ Ｂ，Ｓａｎｄｏｖａｌ Ｆ，Ｄａｇｕｉｎｄａｕ Ｅ，Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ Ｓ，Ｔａｒｔｏｕｒ Ｅ，Ｌａｎｇｌａｄｅ−Ｄｅｍｏｙｅｎ Ｐ，Ｂｏｒｇ Ｃ，Ａｄｏｔｅａｖｉ Ｏ：Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅ ｂｒｅａｋｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ａｎｄ ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２ Ｎｏｖ １５；１８（２２）：６２８４−９５．ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８−０４３２．ＣＣＲ−１２−０８９６．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｏｃｔ ２に記載）及びＢＩＲＣ５ペプチド（例えば、欧州特許出願公開第２１１９７２６ Ａ１号又はＷｉｄｅｎｍｅｙｅｒ Ｍ，Ｇｒｉｅｓｅｍａｎｎ Ｈ，Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ Ｓ，Ｆｅｙｅｒａｂｅｎｄ Ｓ，Ｋｌｅｉｎ Ｒ，Ａｔｔｉｇ Ｓ，Ｈｅｎｎｅｎｌｏｔｔｅｒ Ｊ，Ｗｅｒｎｅｔ Ｄ，Ｋｕｐｒａｓｈ ＤＶ，Ｓａｚｙｋｉｎ ＡＹ，Ｐａｓｃｏｌｏ Ｓ，Ｓｔｅｎｚｌ Ａ，Ｇｏｕｔｔｅｆａｎｇｅａｓ Ｃ，Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ ＨＧ：Ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｒｏｂｕｓｔ ＣＤ４＋ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｊｏｒｉｔｙ ｏｆ ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１２ Ｊｕｌ １；１３１（１）：１４０−９．ｄｏｉ：１０．１００２／ｉｊｃ．２６３６５．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｓｅｐ １４に記載）が挙げられる。最も好ましいヘルパーペプチドは、ＵＣＰ２ペプチド（アミノ酸配列：ＫＳＶＷＳＫＬＱＳＩＧＩＲＱＨ；配列番号１５９、例えば国際公開第２０１３／１３５５５３ Ａ１号、又はＤｏｓｓｅｔ Ｍ，Ｇｏｄｅｔ Ｙ，Ｖａｕｃｈｙ Ｃ，Ｂｅｚｉａｕｄ Ｌ，Ｌｏｎｅ ＹＣ，Ｓｅｄｌｉｋ Ｃ，Ｌｉａｒｄ Ｃ，Ｌｅｖｉｏｎｎｏｉｓ Ｅ，Ｃｌｅｒｃ Ｂ，Ｓａｎｄｏｖａｌ Ｆ，Ｄａｇｕｉｎｄａｕ Ｅ，Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ Ｓ，Ｔａｒｔｏｕｒ Ｅ，Ｌａｎｇｌａｄｅ−Ｄｅｍｏｙｅｎ Ｐ，Ｂｏｒｇ Ｃ，Ａｄｏｔｅａｖｉ Ｏ：Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅ ｂｒｅａｋｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ａｎｄ ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２ Ｎｏｖ １５；１８（２２）：６２８４−９５．ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８−０４３２．ＣＣＲ−１２−０８９６．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｏｃｔ ２に記載）である。
したがって、医薬組成物、特にワクチンは、その免疫原性を更に高めるために、１以上の補助物質、好ましくは上記のアジュバントを更に含有していてもよい。好ましくは、それによって、上記の通り定義された微生物叢配列変異体と上記の通り本発明のワクチン中に任意で含まれていてもよい補助物質との相乗作用が達成される。補助物質の様々な種類に応じて、様々な機序がこれに関して検討され得る。例えば、樹状細胞（ＤＣ）を成熟させる化合物、例えば、リポ多糖類、ＴＮＦ−α又はＣＤ４０リガンドは、好適な補助物質の第１のクラスを形成する。一般に、「危険シグナル」（ＬＰＳ、ＧＰ９６など）又はＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインのように免疫系に影響を与える任意の剤を補助物質として使用することが可能であり、これにより、本発明に係る免疫刺激性アジュバントによって生じる免疫応答を増強する及び／又はターゲティングされた方法で影響を与えることが可能になる。特に好ましい補助物質は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−β又はＴＮＦ−αなどの、自然免疫応答を更に促すサイトカイン、例えばモノカイン、リンホカイン、インターロイキン又はケモカイン、ｈＧＨなどの成長因子である。
最も好ましくは、アジュバントは、モンタニドＩＳＡ ５１ ＶＧ及び／又はモンタニドＩＳＡ ７２０ ＶＧなどのモンタニドである。これらアジュバントは、水ベースの抗原性媒体と混合されたとき、安定した油中水型エマルションになる。モンタニドＩＳＡ ５１ ＶＧは、モノオレイン酸マンニド界面活性剤と鉱物油とのブレンドを原料とするが、モンタニドＩＳＡ ７２０ ＶＧは非鉱物油を使用する（Ａｕｃｏｕｔｕｒｉｅｒ Ｊ，Ｄｕｐｕｉｓ Ｌ，Ｄｅｖｉｌｌｅ Ｓ，Ａｓｃａｒａｔｅｉｌ Ｓ，Ｇａｎｎｅ Ｖ．Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０ ａｎｄ ５１：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｉｎ ｏｉｌ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ ａｓ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００２ Ｊｕｎ；１（１）：１１１−８；Ａｓｃａｒａｔｅｉｌ Ｓ，Ｐｕｇｅｔ Ａ，Ｋｏｚｉｏｌ Ｍ−Ｅ．Ｓａｆｅｔｙ ｄａｔａ ｏｆ Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５１ ＶＧ ａｎｄ Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０ ＶＧ，ｔｗｏ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｄｅｄｉｃａｔｅｄ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．２０１５；３（Ｓｕｐｐｌ ２）：Ｐ４２８．ｄｏｉ：１０．１１８６／２０５１−１４２６−３−Ｓ２−Ｐ４２８）。
本発明のワクチンに含まれ得る更なる添加物は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）などの乳化剤；ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤；着色剤；味覚付与剤、医薬用担体；錠剤形成剤；安定化剤；酸化防止剤；防腐剤である。
本発明の組成物、特に本発明のワクチンは、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０に対する（リガンドとしての）結合親和性から、又はマウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２若しくはＴＬＲ１３への（リガンドとしての）結合親和性から、免疫刺激性であることが知られている任意の更なる化合物を更に含有していてもよい。
この文脈において、本発明の組成物、特に本発明のワクチンに添加され得る別のクラスの化合物は、ＣｐＧ核酸、特にＣｐＧ−ＲＮＡ又はＣｐＧ−ＤＮＡであり得る。ＣｐＧ−ＲＮＡ又はＣｐＧ−ＤＮＡは、一本鎖ＣｐＧ−ＤＮＡ（ｓｓ ＣｐＧ−ＤＮＡ）、二本鎖ＣｐＧ−ＤＮＡ（ｄｓ ＤＮＡ）、一本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｓｓ ＣｐＧ−ＲＮＡ）又は二本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｄｓ ＣｐＧ−ＲＮＡ）であり得る。ＣｐＧ核酸は、好ましくはＣｐＧ−ＲＮＡの形態であり、より好ましくは一本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｓｓ ＣｐＧ−ＲＮＡ）の形態である。ＣｐＧ核酸は、好ましくは、少なくとも１以上の（分裂促進性の）シトシン／グアニンジヌクレオチド配列（ＣｐＧモチーフ）を含有する。第１の好ましい変形例によれば、これら配列に含有される少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、特にＣｐＧモチーフのＣ（シトシン）及びＧ（グアニン）は、メチル化されていない。これらの配列に任意に含有されるすべての更なるシトシン又はグアニンは、メチル化されていても、メチル化されていなくてもよい。しかしながら、更なる好ましい変形例によれば、ＣｐＧモチーフのＣ（シトシン）及びＧ（グアニン）が、メチル化された形態で存在していてもよい。
特に好ましいアジュバントは、ポリイノシン：ポリシチジン酸（「ポリＩ：Ｃ」とも称される）及び／又はその誘導体であるポリ−ＩＣＬＣである。ポリＩ：Ｃは、一方の鎖がイノシン酸のポリマーであり、他方がシチジン酸のポリマーであるミスマッチ二本鎖ＲＮＡである。ポリＩ：Ｃは、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）と相互作用することが知られている免疫刺激剤である。ポリＩ：Ｃは、ＴＬＲ３の「天然の」刺激剤である二本鎖ＲＮＡに構造的に類似している。したがって、ポリＩ：Ｃを二本鎖ＲＮＡの合成アナログであるとみなしてよい。ポリ−ＩＣＬＣは、カルボキシメチルセルロース、ポリイノシン−ポリシチジン酸、及びポリ−Ｌ−リジン二本鎖ＲＮＡの合成複合体である。ポリＩ：Ｃと同様に、ポリ−ＩＣＬＣもＴＬＲ３のリガンドである。ポリＩ：Ｃ及びポリ−ＩＣＬＣは、典型的には、細胞傷害性サイトカインの放出を刺激する。ポリＩＣＬＣの好ましい例は、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）である。
微生物叢配列変異体及びそれを含む医薬
更なる態様では、本発明はまた、好ましくは上記の通り微生物叢配列変異体の同定方法によって得ることができる、腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体を提供する。
したがって、本発明に係る微生物叢配列変異体の特徴、定義及び好ましい実施形態は、微生物叢配列変異体の同定方法によって得られた微生物叢配列変異体について上述したものに対応する。例えば、微生物叢配列変異体は、５０個以下のアミノ酸、より好ましくは４０個以下のアミノ酸、更により好ましくは３０個以下のアミノ酸、最も好ましくは２５個以下のアミノ酸の長さを有することが好ましい。したがって、微生物叢配列変異体は、好ましくは５〜５０個のアミノ酸、より好ましくは６〜４０個のアミノ酸、更により好ましくは７〜３０個のアミノ酸、最も好ましくは８〜２５個のアミノ酸、例えば８〜２４個のアミノ酸の長さを有する。例えば、微生物叢配列変異体は、好ましくは、上記の通り、好ましくは８〜１２個のアミノ酸、より好ましくは８〜１０個のアミノ酸、例えば９個又は１０個のアミノ酸の長さを有する（細菌）ペプチドである。更に、微生物叢配列変異体は、上記の通り、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を腫瘍関連抗原エピトープ配列と共有する。特に好ましくは、微生物叢配列変異体は、腫瘍関連抗原エピトープ配列と、１個、２個、又は３個のアミノ酸のみ、より好ましくは１個又は２個のアミノ酸のみが異なる。換言すれば、微生物叢配列変異体は、腫瘍関連抗原エピトープ配列と比較して、３個以下のアミノ酸変化（即ち、１個、２個、又は３個のアミノ酸変化）、より好ましくは２個以下のアミノ酸変化（即ち、１個又は２個のアミノ酸変化）を含むことが特に好ましい。また、上記の通り、微生物叢配列変異体のコア配列は、腫瘍関連抗原エピトープ配列のコア配列と同一であることが好ましく、コア配列は、３個の最もＮ末端側及び３個の最もＣ末端側のアミノ酸以外のすべてのアミノ酸からなる。更に、上記の微生物叢配列変異体の同定方法によって得られる微生物叢配列変異体について上述した好ましい実施形態は、本発明に係る微生物叢配列変異体にも適宜適用される。
本発明に係る微生物叢配列変異体の具体例としては、配列番号６〜１８のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含むか又はからなる（ポリ）ペプチド、及びそのような（ポリ）ペプチドをコードしている核酸分子が挙げられる。これら例は、ＩＬ１３ＲＡ２のエピトープの微生物叢配列変異体に関する。インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２（ＩＬ−１３Ｒα２又はＩＬ１３ＲＡ２）は、ヒトにおいてＩＬ１３ＲＡ２遺伝子によってコードされている膜結合型タンパク質である。網羅的ではないが、ＩＬ１３ＲＡ２は、潜在的な免疫療法ターゲットとして報告されている（Ｂｅａｒｄ ｅｔ ａｌ．；Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；７２（１１）；２０１２を参照）。ＩＬ１３ＲＡ２の高発現は、更に、結腸直腸癌における浸潤、肝転移及び予後不良と関連付けられている（Ｂａｒｄｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；７２（１１）；２０１２）。好ましくは、本発明に係る微生物叢配列変異体は、配列番号６若しくは１８に係るアミノ酸配列を含む若しくはからなる、又は配列番号６若しくは１８に係るアミノ酸配列をコードしている。より好ましくは、本発明に係る微生物叢配列変異体は、配列番号１８に係るアミノ酸配列を含む若しくはからなる、又は配列番号１８に係るアミノ酸配列をコードしている。
ＩＬ１３ＲＡ２のエピトープの微生物叢配列変異体の更なる好ましい例としては、配列番号１３２〜１４１及び１５８のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含む又はからなる（ポリ）ペプチド、及びそのような（ポリ）ペプチドをコードしている核酸分子が挙げられる。好ましくは、本発明に係る微生物叢配列変異体は、配列番号１３９に係るアミノ酸配列含む若しくはからなる、又は配列番号１３９に係るアミノ酸配列をコードしている。
本発明に係る微生物叢配列変異体の他の好ましい例としては、配列番号６６〜８４及び１２６のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含む又はからなる（ポリ）ペプチド、及びそのような（ポリ）ペプチドをコードしている核酸分子が挙げられる。これら例は、ＦＯＸＭ１（フォークヘッドボックスＭ１）のエピトープの微生物叢配列変異体に関する。ＦＯＸＭ１は、細胞傷害性Ｔリンパ球エピトープとして同定されたエピトープを含み、膵臓腫瘍、卵巣癌及び結腸直腸癌を含む様々な腫瘍及び癌において過剰発現する。好ましくは、本発明に係る微生物叢配列変異体は、配列番号７５に係るアミノ酸配列を含む若しくはからなる、又は配列番号７５に係るアミノ酸配列をコードしている。
また、微生物叢配列変異体は、配列番号３３（ＩＩＳＡＶＶＧＩＡ）、３４（ＩＳＡＶＶＧＩＶ）、又は３５（ＬＦＹＳＬＡＤＬＩ）のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなっておらず、含んでもいないことが好ましい。より好ましくは、微生物叢配列変異体は、配列番号３３〜３５、３６（ＩＳＡＶＶＧＩＡＶ）、３７（ＳＡＶＶＧＩＡＶＴ）、３８（ＹＩＩＳＡＶＶＧＩ）、３９（ＡＹＩＩＳＡＶＶＧ）、４０（ＬＡＹＩＩＳＡＶＶ）、４１（ＩＳＡＶＶＧＩＡＡ）、４２（ＳＡＶＶＧＩＡＡＧ）、４３（ＲＩＩＳＡＶＶＧＩ）、４４（ＱＲＩＩＳＡＶＶＧ）、４５（ＡＱＲＩＩＳＡＶＶ）、４６（ＳＡＶＶＧＩＶＶ）、４７（ＡＩＳＡＶＶＧＩ）、４８（ＧＡＩＳＡＶＶＧ）、４９（ＡＧＡＩＳＡＶＶ）、又は５０（ＬＬＦＹＳＬＡＤＬ）のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなっておらず、含んでもいない。更により好ましくは、微生物叢配列変異体は、配列番号５１（ＩＳＡＶＶＧ）及び／又は配列番号５２（ＳＬＡＤＬＩ）に記載のアミノ酸配列を含まない。最も好ましくは、微生物叢配列変異体は、配列番号５３（ＩＩＳＡＶＶＧＩＬ；Ｈｅｒ２／ｎｅｕのエピトープ）又は配列番号５４（ＬＬＹＫＬＡＤＬＩ；ＡＬＤＨ１Ａ１のエピトープ）に記載のアミノ酸配列を有する腫瘍関連抗原エピトープ配列の（本明細書で定義した通りの）配列変異体ではない。
更なる態様では、本発明はまた、好ましくは上記の通り本発明に係る医薬の調製方法によって得ることができる、上記の本発明に係る微生物叢配列変異体を含む医薬を提供する。
したがって、本発明に係る医薬の特徴、定義及び好ましい実施形態は、医薬の調製方法によって調製された医薬について上述したものに対応する。例えば、本発明に係る医薬は、好ましくは、上記の通り本発明に係る微生物叢配列変異体がロードされた上記のナノ粒子を含む。特に、そのようなナノ粒子には、上記の通りアジュバントが更にロードされてもよい。更に、医薬は、好ましくは、本発明に係る微生物叢配列変異体を発現する上記の細菌細胞を含む。
好ましくは、医薬は、
（ｉ）上記の微生物叢配列変異体；
（ｉｉ）上記の微生物叢配列変異体を含む（組換え）タンパク質；
（ｉｉｉ）上記の微生物叢配列変異体を含む（免疫原性）化合物；
（ｉｖ）上記の微生物叢配列変異体をロードしたナノ粒子；
（ｖ）微生物叢配列変異体をロードした抗原提示細胞；
（ｖｉ）微生物叢配列変異体を発現する、上記の細菌細胞などの宿主細胞；又は
（ｖｉｉ）微生物叢配列変異体をコードする核酸分子；及び
任意に、上記の薬学的に許容される担体及び／又はアジュバントを含む。好ましくは、医薬は、医薬組成物である（の形態である／として製剤化される）。より好ましくは、医薬は、上記のワクチンである。更に、上記の医薬の調製方法によって調製された医薬について上述した好ましい実施形態は、本発明に係る医薬にも適宜適用される。
本発明の組成物、特に本発明のワクチンは、本発明の医薬組成物に関して本明細書に定義した薬学的に許容される担体、アジュバント、及び／又はビヒクルを含んでいてもよい。本発明の組成物、特に本発明のワクチンの特定の文脈において、薬学的に許容される担体の選択は、原則として、本発明の組成物、特に本発明のワクチンを投与する方法によって決定される。本発明の組成物、特に本発明のワクチンは、例えば、全身に又は局所に投与することができる。一般的に全身投与のための経路としては、例えば、経皮、経口、非経口の経路が挙げられ、これには、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、及び腹腔内への注射並びに／又は鼻内投与の経路が含まれる。一般的に局所投与のための経路としては、例えば、局部投与経路が挙げられるが、皮内、経皮、皮下、若しくは筋肉内への注射、又は病巣内、頭蓋内、肺内、心腔内、鼻腔内、及び舌下への注射も挙げられる。より好ましくは、本発明の組成物、特にワクチンは、皮内、皮下、結節内又は経口によって投与してよい。更により好ましくは、本発明の組成物、特にワクチンは、皮下、結節内、又は経口の経路によって投与してもよい。特に好ましくは、本発明の組成物、特にワクチンは、皮下又は経口の経路によって投与してよい。最も好ましくは、本発明の組成物、特にワクチンは、経口経路によって投与されてもよい。したがって、本発明の組成物、特に本発明のワクチンは、好ましくは液体又は固体の形態に製剤化される。
投与される本発明の組成物、特に本発明ワクチンの好適な量は、動物モデルを用いたルーチンな実験によって決定することができる。そのようなモデルとしては、限定するものではないが、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラット、イヌ、及び非ヒト霊長類のモデルが挙げられる。注射に好ましい単位剤形としては、水、生理食塩水、又はそれらの混合物の滅菌溶液が挙げられる。そのような溶液のｐＨは、約７．４に調整されなければならない。注射に好適な担体としては、ヒドロゲル、制御放出又は遅延放出のためのデバイス、ポリ乳酸及びコラーゲンマトリックスが挙げられる。局所塗布に好適な薬学的に許容される担体としては、ローション、クリーム、ゲルなどにおける使用に適したものが挙げられる。本発明の組成物、特に本発明のワクチンを経口投与する場合、錠剤、カプセル剤等が好ましい単位剤形である。経口投与に使用することができる単位剤形を調製するための薬学的に許容される担体は、先行技術において周知である。その選択は、味、コスト及び貯蔵性などの二次的な考慮事項に依存するが、これらは本発明の目的にとって重要ではなく、当業者であれば容易に行うことができる。
上で定義された本発明の医薬組成物はまた、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤又は液剤を含むがこれらに限定されない、任意の経口的に許容される剤形で経口投与することもできる。経口使用するための錠剤の場合、一般的に使用される担体としては、ラクトース及びコーンスターチが挙げられる。また、典型的には、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も添加される。カプセル形態で経口投与する場合、有用な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。経口使用のために水性懸濁剤が必要な場合、活性成分、即ち、上で定義された本発明のトランスポーターカーゴコンジュゲート分子を、乳化剤及び懸濁化剤と組み合わせる。必要に応じて、特定の甘味剤、香料又は着色剤を添加してもよい。
本発明の医薬組成物はまた、特に治療の標的が局所塗布によって容易にアクセス可能な領域又は器官、例えば、皮膚又は他の任意のアクセス可能な上皮組織の疾患を含む場合には、局部的に投与してもよい。好適な局部剤形は、これら領域又は器官のそれぞれに対して容易に調製される。局部塗布の場合、本発明の医薬組成物は、１以上の担体に懸濁又は溶解している本発明の免疫刺激性組成物、特に上で定義されたその成分を含有する好適な軟膏剤に製剤化されてもよい。局部投与のための担体としては、鉱物油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、及び水が挙げられるが、これらに限定されない。或いは、本発明の医薬組成物は、好適なローション又はクリームに製剤化されてもよい。本発明の文脈において、好適な担体としては、鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物の滅菌注射液の形態は、水性又は油性の懸濁剤であってよい。これら懸濁剤は、好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、当技術分野で公知の技術に従って製剤化され得る。また、滅菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用溶液又は懸濁液、例えば１．３−ブタンジオール溶液であってもよい。使用することができる、許容されるビヒクル及び溶媒は、水、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム溶液である。更に、溶媒又は懸濁媒体としては、従来、滅菌固定油が使用されている。この目的のためには、合成のモノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の刺激のない（ｂｌａｎｄ）固定油を使用してよい。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、オリーブ油又はヒマシ油などの天然の薬学的に許容される油、特にそれらのポリオキシエチル化されたバージョンなどと同様に、注射液の調製に有用である。これら油剤又は懸濁剤はまた、乳剤及び懸濁化剤を含む薬学的に許容される剤形の製剤化において一般的に使用されるカルボキシメチルセルロース又は類似の分散剤などの長鎖アルコール希釈剤又は分散剤を含有していてもよい。本発明の医薬組成物の製剤化の目的のために、薬学的に許容される固体、液体、又は他の剤形の製造において一般的に使用されるＴｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、及び他の乳化剤又はバイオアベイラビリティーエンハンサーなどの他の一般的に使用される界面活性剤を使用してもよい。
静脈内、皮膚、若しくは皮下への注射、又は患部への注射の場合、活性成分は、好ましくは、パイロジェンフリーであり、且つ好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態である。当業者であれば、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを使用して、好適な溶液をうまく調製することができる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤が含まれていてもよい。個体に投与されるのが本発明に係るポリペプチド、ペプチド、又は核酸分子、他の薬学的に有用な化合物であるかどうかにかかわらず、好ましくは、「予防的に有効な量」又は「治療的に有効な量」（場合により）が投与され、これは、個体に対して効果を示すのに十分である。実際に投与される量、並びに投与の速度及び時間経過は、治療されるものの性質及び重症度に依存する。
この文脈において、治療の処方、例えば、上記の医薬を使用するときの投薬量などの決定は、典型的には、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、典型的には、治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、及び医師に公知の他の要因を考慮する。上記の技術及びプロトコルの例は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０に見出すことができる。
したがって、本発明の医薬組成物は、典型的には、「安全且つ有効な量」の本発明の医薬組成物の成分、特に本明細書で定義される微生物叢配列変異体を含む。本明細書で使用するとき、「安全且つ有効な量」とは、疾患又は障害の有益な変化を著しく誘導するのに十分な本明細書で定義される微生物叢配列変異体の量、即ち、組織、系、動物又はヒトにおいて求められている生物学的又は医学的応答を惹起する本明細書で定義される微生物叢配列変異体の量を意味する。有効な量は、治療される疾患又は状態の症状を緩和するための「治療的に有効な量」、及び／又は予防される疾患又は状態の症状を予防するための「予防的に有効な量」であってよい。この用語はまた、疾患の進行を低減するのに十分な、特に腫瘍の成長又は感染を低減又は阻害し、それによって求められている応答を惹起するのに十分な活性微生物叢配列変異体の量を含み、特にそのような応答は、微生物叢配列変異体に対する免疫応答であり得る（即ち、「阻害有効量」）。しかしながら、同時に、「安全且つ有効な量」とは、重篤な副作用を回避するのに十分少ない量、即ち、利点とリスクとの間の道理にかなった関係を可能にするのに十分少ない量である。これら限度の決定は、通常、賢明な医学的判断の範囲内である。本発明の医薬組成物の成分の、特に上で定義された微生物叢配列変異体の「安全且つ有効な量」は、更に、主治医の知識及び経験の範囲内で、治療される具体的な状態に関連して、また、治療される患者の年齢及び身体状態、体重、一般的な健康状態、性別、食生活、投与の時間、排出の速度、薬物の組合せ、本明細書で定義される特異的微生物叢配列変異体の活性、状態の重症度、治療の期間、併用する治療の性質、使用される具体的な薬学的に許容される担体の性質、及び類似の要因によっても変化する。本発明の医薬組成物は、一般的な医薬組成物として又はワクチンとして、ヒトに、また獣医学的目的のために、好ましくはヒトの医学的目的のために使用することができる。
本発明に係る医薬組成物、特にワクチン組成物、又は製剤は、本明細書に記載される任意の形態で本明細書で定義される微生物叢配列変異体を含有することができる医薬製剤として投与することができる。
「医薬製剤」及び「医薬組成物」という用語は、本発明の文脈で使用するとき、特に、活性成分の生物活性が疑いの余地なく有効であるような形態であり、且つ該製剤を投与する被験体に対して毒性である追加の成分を含有しない調製品を指す。
本発明の文脈において、治療の「有効性」は、本発明に係る使用又は方法に応答した疾患の経過の変化に基づいて測定することができる。例えば、癌の治療の「有効性」は、腫瘍体積の減少、及び／又は無増悪生存時間の増加、及び／又は原発性癌の切除後の再発リスクの減少によって測定することができる。より具体的には、免疫療法によって治療される癌の場合、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）及びＷｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）基準（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２０１０，１０２（１８）：１３８８−１３９７）を改変した新規の免疫関連反応基準（ｉｒＲＣ）を介して、免疫療法剤に対する抗腫瘍応答の臨床パターンのスペクトルによって有効性を評価することができる。
本発明に係る医薬組成物、特にワクチン組成物、又は製剤は、本明細書に記載される任意の形態で本発明に係る微生物叢配列変異体がロードされた抗原提示細胞を含有し得る医薬製剤として投与することもできる。
また、本発明に係るワクチン及び／又は組成物は、特に上記及び下記のとおり従来使用されているアジュバント、免疫調節性物質、担体、希釈剤又は賦形剤と共に、医薬組成物及びその単位用量として製剤化されてもよく、そのような形態では、錠剤又は充填カプセル剤などの固体、又は液剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤などの液体、又はそれが充填されたカプセル剤として（すべて経口使用のため）、或いは注射又は持続注入による非経口（皮下及び皮内を含む）使用のための滅菌注射用溶液の形態で使用することができる。
本発明の文脈において、特に本発明に係る医薬組成物及びワクチンの文脈において、注射用組成物は、典型的には、注射用滅菌生理食塩水、又はリン酸緩衝生理食塩水、又は当技術分野において公知の他の注射用担体を原料とする。このような医薬組成物及びその単位剤形は、追加の活性化合物又は原理を用いて又は用いずに従来の割合で成分を含んでいてよく、このような単位剤形は、使用される意図する一日量範囲に見合った任意の好適な有効量の活性成分を含有し得る。
本発明に係る組成物、特に医薬組成物及びワクチンは、水性又は油性の懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤及びエリキシル剤を含むがこれらに限定されない液体製剤であってもよい。また、組成物は、使用前に水又は他の好適なビヒクルで再構成するための乾燥製品として製剤化されてもよい。そのような液体超製品は、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル及び防腐剤を含むがこれらに限定されない添加剤を含有していてよい。懸濁化剤としては、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／液糖、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、及び硬化食用油脂が挙げられるが、これらに限定されない。乳化剤としては、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン、及びアカシアが挙げられるが、これらに限定されない。防腐剤としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル又はｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、及びソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。分散剤又は湿潤剤としては、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール、ウシ血清アルブミン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｐａｎ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明に係る組成物、特に医薬組成物及びワクチンはまた、移植又は筋肉内注射によって投与され得るデポ製剤として製剤化されてもよい。
本発明に係る組成物、特に医薬組成物及びワクチンはまた、固体組成物であってもよく、これは従来の方法で製剤化された錠剤又はロゼンジの形態であってもよい。例えば、経口投与用の錠剤及びカプセル剤は、結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤及び湿潤剤を含むがこれらに限定されない従来の賦形剤を含有していてよい。結合剤としては、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、デンプン糊、及びポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。充填剤としては、ラクトース、糖、微結晶セルロース、コーンスターチ、リン酸カルシウム、及びソルビトールが挙げられるが、これらに限定されない。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール、及びシリカが挙げられるが、これらに限定されない。崩壊剤としては、バレイショデンプン及びデンプングリコール酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。湿潤剤としては、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。錠剤は、当技術分野で周知の方法に従ってコーティングされてもよい。
本発明に係る組成物、特に医薬組成物及びワクチンはまた、徐放性の形態で、又は徐放性薬物送達システムから投与することもできる。
更に、本発明に係る組成物、特に医薬組成物及びワクチンは、反復投与による送達に適応させることもできる。
医学的処置
更なる態様では、本発明は、癌の予防及び／又は治療において使用するための上記の微生物叢配列変異体／医薬を提供する。したがって、本発明は、癌を予防及び／若しくは治療する方法、又はそれを必要とする被験体における抗腫瘍応答を開始させる、増強する、若しくは延長する方法であって、上記の本発明に係る微生物叢配列変異体／医薬を該被験体に投与することを含む方法を提供する。
用語「癌」は、本明細書で使用するとき、悪性新生物を指す。特に、用語「癌」とは、本明細書において、無制御の細胞分裂、及び浸潤を介した隣接組織への直接成長又は転移による遠隔部位への移植のいずれかによって他の組織に浸潤するこれら細胞の能力を特徴とする疾患又は障害のクラスの任意のメンバーを指す。転移は、癌細胞が血流又はリンパ系を介して輸送される段階であると定義される。
好ましくは、医薬は、抗癌剤、より好ましくは免疫チェックポイント調節剤と組み合わせて投与される。
本発明は、本発明に係る医薬の投与であって、癌を治療及び／若しくは安定化する、並びに／又は癌の再発を予防するのに有用な他の治療レジメン又は併用剤（ｃｏ−ａｇｅｎｔｓ）（例えば、多剤レジメン）の前に、同時に、又は逐次、治療的に有効な量で被験体に投与される投与を包含する。本発明に係る医薬は、該併用剤と同一又は異なる組成物で、該併用剤と同一又は異なる投与経路で投与してよい。
該他の治療レジメン又は併用剤は、放射線療法、化学療法、外科手術、標的療法（低分子、ペプチド及びモノクローナル抗体を含む）、及び抗血管新生療法からなる群から選択され得る。抗血管新生療法は、腫瘍関連血管系を直接又は間接的に標的とする剤の投与であると本明細書では定義される。好ましい抗癌剤は、化学療法剤、標的薬及び／又は免疫チェックポイント調節剤などの免疫療法剤を含む。
従来の化学療法剤は、細胞傷害性である、即ち、ほとんどの癌細胞の主な性質の１つである急速に分裂する細胞を殺傷することによって作用する。本明細書で定義される微生物叢配列変異体と組み合わせるのに好ましい化学療法剤は、癌の治療に関して当業者に知られている化学療法剤である。組み合わせるのに好ましい化学療法剤としては、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、及びオキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））が挙げられる。また、本明細書で定義される微生物叢配列変異体を、好ましくは（ｉ）ＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵ、ロイコボリン、及びオキサリプラチン）（ｉｉ）ＣａｐｅＯｘ（カペシタビン及びオキサリプラチン）；（ｉｉｉ）５−ＦＵ及びロイコボリン；（ｉｖ）ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ（ロイコボリン、５−ＦＵ、オキサリプラチン、及びイリノテカン）；及び（ｖ）ＦＯＬＦＩＲＩ（５−ＦＵ、ロイコボリン、及びイリノテカン）から選択される複合化学療法と組み合わせることも好ましい。転移していない癌では、（ｉ）ＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵ、ロイコボリン、及びオキサリプラチン）；（ｉｉ）ＣａｐｅＯｘ（カペシタビン及びオキサリプラチン）；又は（ｉｉｉ）５−ＦＵ及びロイコボリンとの組合せが好ましい。また、転移した癌については、（ｉｖ）ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ（ロイコボリン、５−ＦＵ、オキサリプラチン、イリノテカン）；（ｉ）ＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵ、ロイコボリン、及びオキサリプラチン）；又は（ｖ）ＦＯＬＦＩＲＩ（５−ＦＵ、ロイコボリン、及びイリノテカン）との組合せが好ましい。
本明細書で定義される微生物叢配列変異体と組み合わせるための標的薬としては、ＶＥＧＦ標的薬及びＥＧＦＲ標的薬が挙げられる。ＶＥＧＦ標的化薬の好ましい例としては、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、ラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ（登録商標））、又はジブ−アフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））が挙げられる。ＥＧＦＲ標的薬の好ましい例としては、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））又はレゴラフェニブ（Ｓｔｉｖａｒｇａ（登録商標））が挙げられる。
本明細書で定義される微生物叢配列変異体と組み合わるための免疫療法剤としては、ワクチン、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、チェックポイント調節剤、及び腫瘍溶解性ウイルス療法が挙げられる。
本明細書で定義される微生物叢配列変異体と組み合わせるのに好ましいワクチンとしては、ＴｒｏＶａｘ、ＯｎｃｏＶａｘ、ＩＭＡ９１０、ＥＴＢＸ−０１１、ＭｉｃＯｒｙｘ、ＥＰ−２１０１、ＭＫＣ１１０６−ＰＰ、ＣＤＸ−１３０７、Ｖ９３４／Ｖ９３５、ＭｅｌＣａｎｃｅｒＶａｃ、Ｉｍｐｒｉｍｅ ＰＧＧ、ＦＡＮＧ、Ｔｅｃｅｍｏｔｉｄｅ、ＡｌｌｏＳｔｉｍ、ＤＣＶａｘ、ＧＩ−６３０１、ＡＶＸ７０１、ＯＣＶ−Ｃ０２が挙げられる。
人工Ｔ細胞受容体（キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）としても知られている）は、任意の特異性を免疫エフェクター細胞に移植した遺伝子操作された受容体である。養子細胞移植では、人工Ｔ細胞受容体（ＣＡＲ）が好ましい。この目的のために、患者からＴ細胞を取り出し、癌に特異的な受容体を発現するように改変する。その後、癌細胞を認識し、殺傷することができるＴ細胞を、患者に再導入する。
好ましくは、本明細書で定義される微生物叢配列変異体と組み合わせるための免疫チェックポイント調節剤は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＧＡＲＰ、ＰＳ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＴＤＯ、ＧＩＴＲ、ＴＮＦＲ、及び／若しくはＦａｓＲ／ＤｃＲ３から選択される１以上の免疫チェックポイントポイント分子の活性化剤又は阻害剤、又はそれらの１以上のリガンドの活性化剤又は阻害剤である。
より好ましくは、免疫チェックポイント調節剤は、（共）刺激性チェックポイント分子の活性化剤、若しくは抑制性チェックポイント分子の阻害剤、又はそれらの組合せである。したがって、免疫チェックポイント調節剤は、より好ましくは、（ｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ及び／若しくはＩＣＯＳの活性化剤、又は（ｉｉ）Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＧＡＲＰ、ＰＳ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＴＤＯ、ＴＮＦＲ及び／若しくはＦａｓＲ／ＤｃＲ３の阻害剤である。
更により好ましくは、免疫チェックポイント調節剤は、抑制性チェックポイント分子の阻害剤である（が、好ましくは、刺激性チェックポイント分子の阻害剤ではない）。したがって、免疫チェックポイント調節剤は、更により好ましくは、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＧＡＲＰ、ＰＳ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＴＤＯ、ＴＮＦＲ及び／若しくはＤｃＲ３の阻害剤、又はそれらのリガンドの阻害剤である。
また、免疫チェックポイント調節剤は、刺激性又は共刺激性のチェックポイント分子の活性化剤であることが好ましい（が、好ましくは、抑制性チェックポイント分子の活性化剤ではない）。したがって、免疫チェックポイント調節剤は、より好ましくは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ及び／若しくはＩＣＯＳの活性化剤、又はそれらのリガンドの活性化剤である。
免疫チェックポイント調節剤は、ＣＤ４０経路、ＩＤＯ経路、ＬＡＧ３経路、ＣＴＬＡ−４経路、及び／又はＰＤ−１経路の調節因子であることが更により好ましい。特に、免疫チェックポイント調節剤は、好ましくは、ＣＤ４０、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−１及び／又はＩＤＯの調節因子であり、より好ましくは、免疫チェックポイント調節剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、及び／若しくはＩＤＯの阻害剤又はＣＤ４０の活性化剤であり、更により好ましくは、免疫チェックポイント調節剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＬＡＧ３及び／又はＩＤＯの阻害剤であり、更により好ましくは、免疫チェックポイント調節剤は、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ−４及び／又はＰＤ−１の阻害剤であり、最も好ましくは、免疫チェックポイント調節剤は、ＣＴＬＡ−４及び／又はＰＤ−１の阻害剤である。
したがって、本明細書で定義される微生物叢配列変異体と組み合わせるためのチェックポイント調節剤は、ＣＴＬＡ−４経路又はＰＤ−１経路の既知の調節因子から選択されてよい。好ましくは、本明細書で定義される微生物叢配列変異体と組み合わせるためのチェックポイント調節剤は、ＣＴＬＡ−４経路又はＰＤ−１経路の既知の調節因子から選択されてよい。特に好ましくは、免疫チェックポイント調節剤は、ＰＤ−１阻害剤である。ＣＴＬＡ−４経路及びＰＤ−１経路の好ましい阻害剤としては、モノクローナル抗体Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）（イピリムマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）及びトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、並びにＯｐｄｉｖｏ（登録商標）（ニボルマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（ペンブロリズマブ；Ｍｅｒｃｋ）、デュルバルマブ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＭＥＤＩ４７３６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；国際公開第２０１１／０６６３８９ Ａ１号を参照）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；米国特許第８，２１７，１４９ Ｂ２号を参照）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ−５１４；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ）、ＭＩＨ１（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）及びランブロリズマブ（例えば、国際公開第２００８／１５６７１２号にｈＰＤ１０９Ａ並びにそのヒト化誘導体ｈ４０９Ａｌｌ、ｈ４０９Ａ１６及びｈ４０９Ａ１７として開示されている；Ｈａｍｉｄ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６９：１３４−１４４）が挙げられる。より好ましいチェックポイント阻害剤としては、ＣＴＬＡ−４阻害剤Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）（イピリムマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）及びトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、並びにＰＤ−１阻害剤Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）（ニボルマブ；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（ペンブロリズマブ；Ｍｅｒｃｋ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ−５１４；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＡＭＰ−２２４及びランブロリズマブ（例えば、ＨＰＤ１０９Ａとして開示されている。例えば、国際公開２００８／１５６７１２号にｈＰＤ１０９Ａ並びにそのヒト化誘導体ｈ４０９Ａｌｌ、ｈ４０９Ａ１６及びｈ４０９Ａ１７として開示されている；Ｈａｍｉｄ Ｏ．ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６９：１３４−１４４が挙げられる。
また、本明細書に定義される微生物叢配列変異体と組み合わせるための免疫チェックポイント調節剤は、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ，ＭＥＤＩ４７３６、トレメリムマブ、アベルマブ、ＰＤＲ００１、ＬＡＧ５２５、ＩＮＣＢ２４３６０、バルリルマブ、ウレルマブ、ＡＭＰ−２２４、及びＣＭ−２４からなる群から選択されることが好ましい。
腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍において複製し、それによって、抗腫瘍免疫応答を活性化する事により、細胞溶解を引き起こすように遺伝子操作されている。本明細書で定義される微生物叢配列変異体と組み合わせるための腫瘍溶解性ウイルス療法は、好ましくは、ＪＸ５９４（チミジンキナーゼ不活化ワクチンウイルス）、ＣｏｌｏＡｄ１（アデノウイルス）、ＮＶ１０２０（ＨＳＶ由来）、ＡＤＸＳ１１−００１（弱毒性リステリアワクチン）、Ｒｅｏｌｙｓｉｎ（登録商標）（ヒトレオウイルスの特殊製剤）、ＰＡＮＶＡＣ（組換え型ワクシニアウイルスＣＥＡ−ＭＵＣ−１−ＴＲＩＣＯＭ）、Ａｄ５−ｈＧＣＣ−ＰＡＤＲＥ（組換え型アデノウイルスワクチン）、及びｖｖＤＤ−ＣＤＳＲ（ワキシニアウイルス）などからなる群から選択される。
好ましくは、（ｉ）微生物叢配列変異体と、（ｉｉ）化学療法剤、標的薬及び／又は免疫チェックポイント調節剤などの免疫療法剤とをほぼ同時に投与する。
「ほぼ同時に」とは、本明細書で使用するとき、特に、同時に投与するか、又は（ｉ）化学療法剤、標的薬及び／又は免疫チェックポイント調節剤などの免疫療法剤の投与直後に（ｉｉ）微生物叢配列変異体を投与するか、又は（ｉ）微生物叢配列変異体の投与直後に（ｉｉ）化学療法剤、標的薬及び／又は免疫チェックポイント調節剤などの免疫療法剤を投与することを意味する。「直後」には、第２の投与の準備を行うために必要な時間、特に、第２の投与のための箇所を露出させ、消毒することに加えて「投与デバイス」（例えば、シリンジ、ポンプなど）の適切な準備を行うために必要な時間を含むことを、当業者は理解する。同時投与はまた、（ｉ）微生物叢配列変異体の投与期間と（ｉｉ）化学療法剤、標的薬及び／又は免疫チェックポイント調節剤などの免疫療法剤の投与期間とが重複している場合、又は例えば、一方の成分がより長い期間、例えば３０分間、１時間、２時間、又は更にはそれ以上の期間にわたって例えば点滴によって投与され、他方の成分がそのような長い期間の間のいつかの時点で投与される場合も含む。（ｉ）微生物叢配列変異体と（ｉｉ）化学療法剤、標的薬及び／又は免疫チェックポイント調節剤などの免疫療法剤とをほぼ同時に投与することは、異なる投与経路及び／又は異なる投与部位が使用される場合に特に好ましい。
また、（ｉ）微生物叢配列変異体と（ｉｉ）化学療法剤、標的薬及び／又は免疫チェックポイント調節剤などの免疫療法剤とが連続して投与されることも好ましい。これは、（ｉ）微生物叢配列変異体が、（ｉｉ）化学療法剤、標的薬及び／又は免疫チェックポイント調節剤などの免疫療法剤の前又は後に投与されることを意味する。連続投与において、第１成分の投与と第２成分の投与との間の時間は、好ましくは１週間以内、より好ましくは３日間以内、更により好ましくは２日間以内、最も好ましくは２４時間以内である。（ｉ）微生物叢配列変異体と（ｉｉ）化学療法剤、標的薬及び／又は免疫チェックポイント調節剤などの免疫療法剤とは、第１の成分（微生物叢配列変異体のチェックポイント調節剤）の投与と第２の成分（チェックポイント調節剤及び微生物叢配列変異体のうちの他方）の投与との間の時間が、好ましくは６時間以内、より好ましくは３時間以内、更により好ましくは２時間以内、最も好ましくは１時間以内になるように同日に投与されることが特に好ましい。
好ましくは、（ｉ）微生物叢配列変異体と（ｉｉ）化学療法剤、標的薬及び／又は免疫チェックポイント調節剤などの免疫療法剤とは、同じ投与経路を介して投与される。また、（ｉ）微生物叢配列変異体と（ｉｉ）化学療法剤、標的薬及び／又は免疫チェックポイント調節剤などの免疫療法剤とは、異なる投与経路を介して投与されることも好ましい。
更に、（ｉ）微生物叢配列変異体と（ｉｉｉ）化学療法剤、標的薬及び／又は免疫チェックポイント調節剤などの免疫療法剤とは、好ましくは、別個の組成物で提供される。或いは、（ｉ）微生物叢配列変異体と（ｉｉｉ）化学療法剤、標的薬及び／又は免疫チェックポイント調節剤などの免疫療法剤とは、好ましくは、同じ組成物で提供される。
したがって、本発明は、癌の治療及び／若しくは安定化、並びに／又は癌の再発の予防に有用な、少なくとも１つの併用剤と組み合わせた本発明に係る微生物叢配列変異体と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と、を含む医薬製剤を提供する。
更に、本発明に係る微生物叢配列変異体は、再発及び／又は転移に対する予防として固形腫瘍を切除した手術の後に投与することができる。
更に、本発明に係る方法及び使用におけるイメージング又は診断組成物の投与は、単独で、又は癌のイメージング及び／又は診断に有用な併用剤と組み合わせて行うことができる。
本発明は、癌に罹患しているか又は癌を発症するリスクがある任意の被験体に適用することができる。特に、該微生物叢配列変異体の治療効果は、参照腫瘍関連抗原エピトープに対する免疫応答、特にＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞に依存する応答及び／又はＭＨＣクラスＩ分子によって媒介される応答を惹起することであり得る。
更なる態様において、本発明はまた、本明細書に記載の腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体が個体中に存在するかどうかを判定するための（インビトロにおける）方法であって、本明細書に記載の腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体が個体の（単離された）サンプル中に存在するかどうかを判定する工程を含む方法を提供する。好ましくは、（単離された）サンプルは、糞便サンプル又は血液サンプルである。この文脈において、微生物叢配列変異体は、好ましくは、本明細書に記載の本発明に係る微生物叢配列変異体の同定方法によって同定／入手される。
例えば、微生物叢配列変異体の存在の判定は、微生物叢配列変異体を保有する細菌などの微生物叢の検出に基づいて行ってよい。この目的のために、糞便サンプルを採取してよく、該糞便サンプルから核酸及び／又はタンパク質／（ポリ）ペプチドを単離してよい。次いで、単離された核酸及び／又はタンパク質／（ポリ）ペプチドの配列を決定してよい。例えば、上述のように、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＩＨＭＳ）プロジェクトにより開発提供された１以上の標準操作手順（ＳＯＰ）を使用できる（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ−ｓｔａｎｄａｒｄｓ．ｏｒｇ／＃ＳＯＰＳ）。具体例として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ．で４０００万ペアエンドリードで、糞便サンプルから抽出されたＤＮＡの配列決定を行うことができる。配列は、細菌ペプチドを発現する候補細菌のゲノム部分の同定のためのバイオインフォマティクスパイプラインを使用して分析できる。別のアプローチは、特別に設計されたＰＣＲプライマー対及びリアルタイムＰＣＲを使用することによって、微生物叢配列変異体の単一検出を行うことであり得る。
更に、微生物叢配列変異体の存在の判定は、例えば、免疫応答及び／又は微生物叢配列変異体を認識することができる既存のメモリーＴ細胞に基づいて行われてもよい。この目的のために、免疫応答は、例えば、微生物叢配列変異体（ペプチド）と精製された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）との共インキュベーション、及びＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる免疫応答の評価によって、単離された血液サンプル中で処理されてもよい。そのようなアッセイは、当技術分野において周知である（Ｃａｌａｒｏｔａ ＳＡ，Ｂａｌｄａｎｔｉ Ｆ．Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ａｓｓａｙｓ．Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；２０１３：６３７６４９）。或いは、リンパ球増殖反応又は細胞内染色によるメモリーＴ細胞及びＴ細胞活性化の評価を使用して、微生物叢配列変異体又は微生物叢配列変異体を認識することができる既存のメモリーＴ細胞の存在を判定してもよい。
したがって、上記の本発明に係る癌を予防及び／若しくは治療する方法、又はそれを必要とする被験体における抗腫瘍応答を開始させる、増強する、若しくは延長する方法は、被験体に投与される医薬に含まれる腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体が被験体中に存在するかどうかを判定する工程を更に含んでいてもよい。そのような判定は、上記の通り行ってよい。
好ましくは、上記の本発明に係る癌を予防及び／若しくは治療する方法、又はそれを必要とする被験体における抗腫瘍応答を開始させる、増強する、若しくは延長する方法では、投与される医薬に含まれる腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体が被験体中に存在する。何らかの理論に束縛されるものではないが、患者は、微生物叢配列変異体によってプライミングされたメモリーＴ細胞を有し得ると考えられる。その後、微生物叢配列変異体を含む、投与された医薬のチャレンジによって、微生物叢配列変異体に対する既存のメモリーＴ細胞を再活性化することができ、そして、抗腫瘍応答の確立が強化及び加速される。
また、上記の本発明に係る癌を予防及び／若しくは治療する方法、又はそれを必要とする被験体における抗腫瘍応答を開始させる、増強する、若しくは延長する方法では、投与される医薬に含まれる腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体が被験体中に存在しないことが好ましい。何らかの理論に束縛されるものではないが、腸内における特定の微生物叢配列変異体の過剰発現及び該微生物叢配列変異体の非常に高い親和性が、そのような微生物叢配列変異体を認識することができるＴ細胞レパートリーを疲弊させ得、臨床的有効性を低下させ得ると考えられる。
以下では、添付の図の簡単な説明が与えられる。これら図は、本発明をより詳細に説明することを意図している。しかし、これら図は、本発明の主題を何ら制限することを意図していない。
実施例６で使用する免疫感作スキームの概要図を示す。 実施例６について、群１（ＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ）及び群２（ＩＬ１３ＲＡ２−Ａ）のＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγ結果を示す。ワクチン接種に使用したペプチド（各群の下の括弧内）及びＥＬＩＳＰＯＴ培養に使用した刺激（Ｘ軸）をグラフに示す。（Ａ）特異的ＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγスポットの数（培地条件を差し引いた）。各ドットは、４連で対応する条件から得られた１頭の個体／マウスについての平均値を表す。（Ｂ）各個体について、特異的ＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγ応答のレベルをＣｏｎＡ刺激（値：１００％）と比較する。統計解析：郡内比較については対応ｔ検定、群間比較については独立ｔ検定；＊ｐ＜０．０５。 実施例７の結果を示す。 実施例１２について、ＦＯＸＭ１−Ｂ２をワクチン接種したマウスのＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγ結果を示す。ワクチン接種に使用したペプチド及び脾細胞のエクスビボ刺激をグラフ上に示す。この図は、特異的ＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγスポットの数（培地条件を差し引いた）を示す。各ドットは、２連で対応する条件から得られた１頭の個体／マウスについての平均値を表す。 実施例１４について、細菌ペプチドＩＬ１３ＲＡ２−ＢＬ（配列番号１３９）はＨＬＡ−Ａ＊０２０１に強く結合するが、対応するヒトペプチドはＨＬＡ−Ａ＊０２０１に結合しないことを示す。 実施例１５について、ＨＨＤ ＤＲ３トランスジェニックマウスの結果を示す。ＨＨＤ ＤＲ３トランスジェニックマウスをＩＬ１３ＲＡ２−ＢＬ（ＦＬＰＦＧＦＩＬＰＶ；配列番号１３９）で免疫した。２１日目に、マウスを安楽死させ、脾臓を摘出した。脾細胞を調製し、インビトロにおいてＩＬ１３ＲＡ２−ＢＬ（ＦＬＰＦＧＦＩＬＰＶ；配列番号１３９）又はＩＬ１３ＲＡ２−Ｈ（ＷＬＰＦＧＦＩＬＩ；配列番号１）のいずれかで刺激した。全脾細胞に対してＥｌｉｓｐｏｔを実施した。脾細胞混合物由来のＴ細胞の数に対してデータを正規化した。各ドットは、２連で対応する条件から得られた１頭の個体／マウスについての平均値を表す。 実施例１５について、ＨＨＤ ＤＲ１トランスジェニックマウスの結果を示す。ＨＨＤ ＤＲ１トランスジェニックマウスをＩＬ１３ＲＡ２−ＢＬ（ＦＬＰＦＧＦＩＬＰＶ；配列番号１３９）で免疫した。２１日目に、マウスを安楽死させ、脾臓を摘出した。脾細胞を調製し、インビトロにおいてＩＬ１３ＲＡ２−ＢＬ（ＦＬＰＦＧＦＩＬＰＶ；配列番号１３９）又はＩＬ１３ＲＡ２−ＨＬ（ＷＬＰＦＧＦＩＬＩＬ；配列番号１３１）のいずれかで刺激した。全脾細胞に対してＥｌｉｓｐｏｔを実施した。各ドットは、３連で対応する条件から得られた１頭の個体／マウスについての平均値を表す。 実施例１６について、エクスビボにおいて細菌ペプチドＨ２ Ｄｂ Ｂ２又はマウス参照ペプチドＨ２ Ｄｂ Ｍ２で刺激した、Ｈ２ Ｄｂ Ｂ２をワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウス及びコントロールマウス（ＯＶＡ＋ＩＦＡをワクチン接種）についてのＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγ結果を示す。この図は、特異的ＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγスポットの数（培地条件を差し引いた）を示す。各ドットは、３連で対応する条件から得られた１頭の個体／マウスについての平均値を表す。 実施例１６について、エクスビボにおいて細菌ペプチドＨ２ Ｌｄ Ｂ５又はマウス参照ペプチドＨ２ Ｌｄ Ｍ５で刺激した、Ｈ２ Ｌｄ Ｂ５をワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウス及びコントロールマウス（ＯＶＡ＋ＩＦＡをワクチン接種）についてのＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγ結果を示す。この図は、特異的ＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγスポットの数（培地条件を差し引いた）を示す。各ドットは、３連で対応する条件から得られた１頭の個体／マウスについての平均値を表す。
以下に、本発明の様々な実施形態及び態様を説明する具体例を提示する。しかし、本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。以下の調製及び実施例は、当業者が本発明をより明確に理解し、実施することができるように与えられるものである。しかし、本発明は、例示される実施形態によって範囲が限定されるものではなく、前記実施形態は、本発明の１つの態様を説明することのみを意図し、機能的に等価な方法は、本発明の範囲内である。実際、本明細書に記載するものに加えて本発明の様々な変形例は、上述の記載、添付図面、及び以下の実施例から当業者に容易に明らかになる。すべてのかかる変形例は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
実施例１：ヒトミクロビオームにおける腫瘍関連エピトープの細菌配列変異体の同定
１．腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）の選択
古典的定義によれば、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）は、腫瘍細胞にのみ存在するが、任意の他の細胞型には存在しない抗原（タンパク質）に由来し、一方、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、幾つかの腫瘍細胞に存在し、幾つかの「正常」（非腫瘍）細胞にも存在する。用語「腫瘍関連抗原」は、本明細書で使用するとき、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及び腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を包含する。
文献に基づいて、具体的には、ＴＡＡ及びＴＳＡの周知のリストに基づいて、腫瘍関連タンパク質／抗原の選択を実施した。例えば、腫瘍Ｔ細胞抗原データベース（「ＴＡＮＴＩＧＥＮ」；ｈｔｔｐ：／／ｃｖｃ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｔａｄｂ／）、ペプチドデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈ．ｏｒｇ／ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ／ｅｖｅｎｔｓ−ａｎｄ−ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｅｐｔｉｄｅ−ｄａｔａｂａｓｅ）、又はＣＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｔａ．ｌｎｃｃ．ｂｒ／）などのデータベースから、多数のＴＡＡ及びＴＳＡ候補を入手することができる。可能性の高い腫瘍関連抗原を同定するために、これらデータベースから入手したデータを最近の文献と手動で比較してよい。例えば、腫瘍における抗原の特異的発現に関する文献、例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｄｉｓｃｏｖｅｒ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２ Ｄｅｃ １５；７２（２４）：６３５１−６１；Ｃｈｅｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｐｒｉｏｒｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ：ａ ｎａｔｉｏｎａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｐｉｌｏｔ ｐｒｏｊｅｃｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９ Ｓｅｐ １；１５（１７）：５３２３−３７は、興味深い抗原を最優先するために有用であり得る。６００を超える候補抗原のリストが同定された。Ｇｅｎｔ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｄｉｃａｌｇｅｎｏｍｅ．ｋｒｉｂｂ．ｒｅ．ｋｒ／ＧＥＮＴ／）、ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｇｅｎｅ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒａｖ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／）、又はＧＥＰＩＡ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｐｉａ．ｃａｎｃｅｒ−ｐｋｕ．ｃｎ）などの利用可能なツールを使用して、すべての選択された抗原に発現プロファイルに関するアノテーションを付ける。更に、各抗原について、潜在的適応、可能性のある副作用との関連、及びドライバー対パッセンジャー抗原を特定した。
６００種の抗原の中から、インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２（ＩＬ−１３Ｒα２又はＩＬ１３ＲＡ２）を選択したが、これは、（ｉ）それが、ＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）エピトープとして同定されたエピトープを含んでいる（Ｏｋａｎｏ Ｆ，Ｓｔｏｒｋｕｓ ＷＪ，Ｃｈａｍｂｅｒｓ ＷＨ，Ｐｏｌｌａｃｋ ＩＦ，Ｏｋａｄａ Ｈ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ，ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ２ ｃｈａｉｎ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２ Ｓｅｐ；８（９）：２８５１−５）、（ｉｉ）ＩＬ１３ＲＡ２は、腫瘍Ｔ細胞抗原データベース及びＣＴデータベースにおいて脳腫瘍で過剰発現する遺伝子として言及されている、（ｉｉｉ）遺伝子発現から得られた分析データ（マイクロアレイ試験）を分析するＧｅｎｔ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｇｅｎｅ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒ、及びｐｒｏｔｅｉｎ ａｔｌａｓなどのツールを用いて、ＩＬ１３ＲＡ２の過剰発現及び選択的発現が確認された、並びに（ｉｖ）脳腫瘍（Ｄｅｂｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １３，ａ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ／ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０００ Ｍａｙ；６（５）：４４０−９）、頭頸部腫瘍（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ２ ｃｈａｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ ｓｅｒｖｅｓ ａｓ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００３ Ｄｅｃ １５；９（１７）：６３８１−８）、及びメラノーマ（Ｂｅａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｄｉｇｉｔａｌ ＲＮＡ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｏｒ ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３ Ｓｅｐ １５；１９（１８）：４９４１−５０）における過剰発現が文献でも報告されている、という事実に基づくものであった。
具体的には、ＩＬ１３ＲＡ２の過剰発現及び選択的発現の確認（ポイント（ｉｉｉ））は、以下の通り実施した：「Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ」（ＴＣＧＡ；ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で利用可能））によって作成されたｔｉｓｓｕｅ ａｔｌａｓから得られたｍＲＮＡデータ（３７の正常組織及び１７の癌型のＲＮＡ配列データ）の解析から、正常細胞ではＩＬ１３ＲＡ２ ｍＲＮＡの基礎レベルが低く（精巣を除いて）、幾つかの腫瘍型ではＩＬ１３ＲＡ２ ｍＲＮＡの発現レベルが高く、グリオーマサンプルで最も高い発現がみられることが明らかになった。Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｇＥｎｅ ＲＡｐｉｄ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒａｖ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／で利用可能、ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ及びＮＣＢＩ ＧＥＯ ｄａｔａｓｅｔからのデータを解析）を使用してＩＬ１３ＲＡ２のｍＲＮＡ発現を実施したときにも同様の結果がみられ、精巣を除く、試験した正常細胞の大部分では基礎発現が非常に低く、メラノーマサンプル、神経膠芽腫、並びに甲状腺及び膵臓の原発性腫瘍の幾つかのサンプルでは発現が強かった。
ＩＬ１３ＲＡ２は、ヒトにおいてＩＬ１３ＲＡ２遺伝子によってコードされている膜結合型タンパク質である。網羅的ではないが、ＩＬ１３ＲＡ２は、免疫療法標的候補として報告されている（Ｂｅａｒｄ ｅｔ ａｌ．；Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；７２（１１）；２０１２を参照）。ＩＬ１３ＲＡ２の高発現は、更に、結腸直腸癌における浸潤、肝転移、及び予後不良に関連している（Ｂａｒｄｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；７２（１１）；２０１２）。したがって、ＩＬ１３ＲＡ２をドライバー腫瘍抗原であるとみなすことができた。
２．選択された腫瘍関連抗原において対象となる１以上のエピトープの選択
次の工程では、ＭＨＣ−Ｉによって特異的に提示される、選択された腫瘍関連抗原のエピトープを同定した。この目的のために、「Ｉｍｍｕｎｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅ」（ＩＥＤＢ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／；ＭＨＣ−Ｉ分析については、具体的に、ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ａｎａｌｙｚｅ／ｈｔｍｌ／ｍｈｃ＿ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．ｈｔｍｌ（ＩＬ１３ＲＡ２解析に使用する場合）、ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ／も参照）を、ペプチド提示を予測するためのプロテアソーム切断、ＴＡＰ輸送、及びＭＨＣクラスＩの分析ツールと併用して、（ＩＬ１３ＲＡ２の）腫瘍関連抗原配列を分析した。即ち、ＨＬＡ．Ａ２．１によって提示される可能性のあるエピトープ候補を同定するためのＩＥＤＢ解析ツールにＩＬ１３ＲＡ２のタンパク質配列を送信した。それによって、ＨＬＡ Ａ２．１結合特性を有する３７１のエピトープ候補のリストを得た。このリストのうちの２つのエピトープ：Ｏｋａｎｏら（Ｏｋａｎｏ Ｆ，Ｓｔｏｒｋｕｓ ＷＪ，Ｃｈａｍｂｅｒｓ ＷＨ，Ｐｏｌｌａｃｋ ＩＦ，Ｏｋａｄａ Ｈ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ，ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ２ ｃｈａｉｎ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２ Ｓｅｐ；８（９）：２８５１−５）によって報告され、機能的に検証されたＷＬＰＦＧＦＩＬＩ（配列番号１）及びメラノーマのペプチドーム研究（Ｇｌｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐｅｐｔｉｄｏｍｅ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｓ ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＨＬＡ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１６ Ｎｏｖ；６５（１１）：１３７７−１３９３）で見出されたとＩＥＤＢデータベースに報告されているＬＬＤＴＮＹＮＬＦ（配列番号２）は、エピトープ候補として既に報告されていた。
腫瘍細胞の表面でＭＨＣによって効率的に提示される見込みのあるエピトープを同定するために、ＨＬＡ Ａ２．１結合特性を有する３７１のエピトープ候補のリストにおいて、ＨＬＡ Ａ２．１に対する３７１の候補エピトープのリストのインシリコにおける親和性を、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ ３．０ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｐａｎ／）を使用して計算し、最大許容親和性は３，０００ｎＭ（ＩＣ５０）であった。それによって、５４のＩＬ１３ＲＡ２エピトープのリストが得られた。
３．ヒトミクロビオームにおける選択されたエピトープの細菌配列変異体の同定
最後に、５４の選択されたヒトＩＬ１３ＲＡ２エピトープの微生物叢配列変異体を同定するために、５４の選択されたＩＬ１３ＲＡ２エピトープを「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ」（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｔａ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｎ／ｍｅｔａ／ｈｏｍｅで利用可能）と比較した。この目的のために、部位ごとの経時的なアミノ酸変化率を記述し、３５アミノ酸長未満のクエリに推奨される「ＰＡＭ−３０」タンパク質置換マトリックスを使用して、タンパク質ＢＬＡＳＴサーチ（ｂｌａｓｔｐ）を実施した。ワードサイズは、同様に短いクエリに提唱される２、期待値（Ｅ）は、可能な一致の数を最大化するために調整された２０，０００，０００を使用し、組成ベースの統計は「０」に設定し、入力配列は３０アミノ酸よりも短く、ギャップのないアラインメントのみ許容した。その後、ｂｌａｓｔｐの結果をフィルタリングして、ヒトペプチドの最初及び／又は最後にのみミスマッチを許容し、１配列当たり最大２つのミスマッチを許容して、（ＨＬＡ−Ａ２．１に結合するための）９アミノ酸長の微生物ペプチド配列のみを得た。それによって、ヒトミクロビオームにおける選択されたＩＬ１３ＲＡ２エピトープの細菌配列変異体からなる、５１４の細菌配列のリスト（９アミノ酸長をフィルタとして使用したので、ノナペプチド）が得られた。
実施例２：選択された細菌配列変異体のＭＨＣに対する結合の試験
細胞傷害性Ｔ細胞への抗原提示には微生物ミミクリーのＭＨＣ分子に対する結合が必須であるので、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ３．０ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｐａｎ／）を使用して、５１４の細菌配列のＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ．Ａ２．０１に対する親和性を計算した。このツールに、ヒト（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ）及び他の種由来の１７２のＭＨＣ分子を網羅する１８０，０００を超える定量的結合データを教え込む。５１４の細菌配列（実施例１のｂｌａｓｔｐの結果）をインプットとして使用し、強い及び弱いバインダーについてデフォルト閾値を設定することによって親和性を予測した。４００，０００のランダムな天然配列のセットと比較した予測親和性のランクを結合親和性の尺度として使用した。この値は、より高い又はより低い平均予測親和性に対する特定の分子の固有バイアスによって影響を受けない。％ランク＜０．５を有するものを非常に強いバインダーと定義し、％ランク≧０．５且つ＜１．０を有するものを強いバインダーと定義し、％ランク≧１．０且つ≦２．０を有するものを中程度のバインダーと定義し（具体的には、中程度のバインダーは、％ランク≧１．０且つ＜１．５を有するものと定義される「中程度〜強い」バインダーを含む）、％ランク＜２．０を有するものを弱いバインダーと定義する。即ち、５１４の細菌配列から、非常に強い親和性（％ランク＜０．５）を示し、ヒト参照エピトープが（ヒトペプチドについて）少なくとも中程度〜強い親和性（％ランク＜１．５）を示し、好ましくは、ヒト参照エピトープが（ヒトペプチドについて）少なくとも強い親和性（％ランク＜１）を示すものだけを選択した。
それによって、以下の１３の細菌配列変異体（ペプチド１〜ペプチド１３が同定された（表３）：
実施例３：選択された細菌配列変異体を含む細菌タンパク質のアノテーション及び細胞局在の決定
次に、選択された細菌エピトープ配列変異体を含有する細菌タンパク質にアノテーションを付けた。この目的のために、Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／）及びｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＲｅｆＳｅｑ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｆｓｅｑ／）の両方に対してｂｌａｓｔに基づく比較を行った。ＲｅｆＳｅｑは、ゲノムＤＮＡ、転写物、及びタンパク質を含む統合された重複していない配列セットを提供する。ＫＥＧＧでは、ＫＯ（ＫＥＧＧ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）データベースに保存されている分子レベル機能を使用した。この機能を、共通の祖先から進化した異なる種由来の遺伝子にコードされているタンパク質を含有するオーソログの群に分類する。
次の工程では、２つの異なる手順を使用して、選択された細菌エピトープ配列変異体を含有する細菌タンパク質の細胞局在の予測を実施する。その後、予測のコンセンサスが取れたペプチド含有タンパク質のリストが得られる。先ず、シグナルペプチドの存在の予測に基づいて細胞内又は細胞外のタンパク質を同定するための二分探索ストラテジを実行した。シグナルペプチドは、原核生物における原形質膜を横断する移行のためにそのパッセンジャータンパク質を標的とする遍在性タンパク質選別シグナルである。これに関しては、コンセンサス予測を得るために、ＳｉｇｎａｌＰ ４．１．（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ）及びｔｈｅ Ｐｈｏｂｉｕｓ ｓｅｒｖｅｒ（ｐｈｏｂｉｕｓ．ｓｂｃ．ｓｕ．ｓｅ）の両方を使用した。シグナルペプチドの存在が２つのアプローチによって検出された場合、そのタンパク質は細胞外又は周辺質に存在する可能性が高いと解釈した。検出されなかった場合、そのタンパク質は、恐らく、外膜／内膜に属するか、又は周辺質に存在する。次に、膜貫通トポロジーの予測を実施する。シグナルペプチドと膜貫通ドメインはいずれも疎水性であるが、膜貫通ヘリックスは通常、より長い疎水性領域を有する。ＳｉｇｎａｌＰ ４．１ ＳｅｒｖｅｒとＰｈｏｂｉｕｓは、シグナルペプチドを膜貫通ドメインと識別する能力を有する。予測される２つの膜貫通ヘリックスの最小数を設定して、膜タンパク質と細胞質タンパク質を識別し、最終的なコンセンサスリストを得る。分泌された成分又は分泌されたエキソソームに含有されているタンパク質がＡＰＣによって提示されやすいと仮定すると、細菌タンパク質の細胞局在の可能性に関するデータは、免疫原性ペプチドの選択のために着目すべきものである。
表４は、表４に示す１３の細菌ペプチドを含有する細菌タンパク質の配列番号、そのアノテーション及び細胞局在を示す：
表３及び４に示すデータに基づいて、配列番号１（ＷＬＰＦＧＦＩＬＩ、表２を参照、本明細書では「ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈ」とも称される）に係るヒトＩＬ１３ＲＡ２参照エピトープの配列変異体である配列番号１８（アミノ酸配列：ＦＬＰＦＧＦＩＬＶ；本明細書では「ＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ」とも称される）に係る細菌ペプチドを、更なる試験のために選択した。実際、ヒト参照エピトープは中間親和性を有し、腫瘍細胞の表面で提示される。このＭＨＣ提示は幾つかの公開されている研究で確認されている（Ｏｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ，ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ２ ｃｈａｉｎ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２ Ｓｅｐ；８（９）：２８５１−５）。
細菌配列変異体（配列番号１８）は、ＨＬＡ．Ａ２．０１に対して非常に強い結合親和性を有する。更に、この細菌ペプチド配列変異体は、膜貫通レベルで発現すると予測される細菌タンパク質に含まれることから、ＭＨＣ提示のために抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって捕捉されるエキソソームの一部である可能性が高まる。
実施例４：細菌ペプチドＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ（配列番号１８）は、インビトロにおいてＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１アレルに対してヒトエピトープＩＬ１３ＲＡ２−Ｈ（配列番号１）よりも優れた親和性を有する
この実施例は、配列番号１８（ＦＬＰＦＧＦＩＬＶ；本明細書では「ＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ」とも称される）の配列の細菌ペプチドがインビトロにおいてＨＬＡ−Ａ＊０２０１アレルに対して高い親和性を有するが、ＩＬ１３ＲＡ２（ＷＬＰＦＧＦＩＬＩ、配列番号１、本明細書では「ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈ」とも称される）に由来する、対応する参照ヒトペプチドは低い親和性を有するという証拠を与える。
Ａ．材料及び方法
Ａ１．Ｔ２細胞株に対するペプチドの親和性の測定
実験プロトコルは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１によって提示されるペプチドについて検証されているもの（Ｔｏｕｒｄｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｌｏｗ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ＨＬＡ−Ａ２．１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙｐｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｄｅｃ；３０（１２）：３４１１−２１）と同様である。ペプチドの親和性測定は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を発現するが、ＴＡＰ１／２陰性であり且つ内因性ペプチドを提示することができないヒト腫瘍細胞Ｔ２を用いて行われる。
１００ｎｇ／μＬ ヒトβ２ｍを添加したＡＩＭＶ培地中で１００μＭ〜０．１μＭの漸減濃度のペプチドと共に、Ｔ２細胞（２．１０５細胞／ウェル）を３７℃で１６時間インキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、ＰＥに結合している抗ＨＬＡ−Ａ２抗体で標識した（クローンＢＢ７．２、ＢＤ Ｐｈａｒｍａｇｅｎ）。
ＦＡＣＳ（Ｇｕａｖａ Ｅａｓｙ Ｃｙｔｅ）によって分析を実施した。各ペプチド濃度について、対象ペプチドに結合している標識の幾何平均をバックグラウンドノイズから差し引き、１００μＭの濃度の参照ペプチドＨＩＶ ｐｏｌ ５８９−５９７で得られたＨＬＡ−Ａ＊０２０２標識の幾何平均の割合として報告する。次いで、以下の通り相対親和性を求める：
相対親和性＝ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の発現の２０％を誘導する各ペプチドの濃度／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の発現の２０％を誘導する参照ペプチドの濃度。
Ａ２．ペプチドの可溶化
アミノ酸組成を考慮して各ペプチドを可溶化させた。システイン、メチオニン、又はトリプトファンをいずれも含まないペプチドについては、総体積の１０％になるまでＤＭＳＯを添加することが可能である。他のペプチドは、水又はＰＢＳ ｐＨ７．４に再懸濁させる。
Ｂ．結果
Ｔ２細胞の場合：可変ペプチド濃度についての平均蛍光強度：カップルＩＬ１３ＲＡ２ペプチド（ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈ及びＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ）に関して、ヒトペプチドはＨＬＡ−Ａ＊０２０１に結合しないが、細菌ペプチドＩＬ１３ＲＡ２−ＢはＨＬＡ−Ａ＊０２０１に強く結合する：１００μＭでは１１２．０３対１８．６４；１０μＭでは４０．７７対１１．６１；１μＭでは１２．１８対９．４１；０．１μＭでは９．９対７．４６。また、４．４μＭのＩＬ１３ＲＡ２−Ｂが、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の発現の２０％を誘導する（ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈの１００μＭに対して）。
第２の異なるＴ２細胞クローンからも同様の結果が得られた。
実施例５：細菌ペプチドＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ（配列番号１８）は、インビトロにおいてＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１アレルに対して優れた親和性を有する
この実施例は、配列番号１８（ＦＬＰＦＧＦＩＬＶ；本明細書では「ＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ」とも称される）の配列の細菌ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１アレルに対してＩＬ１３ＲＡ２由来の対応する参照ヒトペプチドの他の配列変異体（ＷＬＰＦＧＦＩＬＩ、配列番号１、本明細書では「ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈ」とも称される）よりも高い親和性を有するという証拠を与える。この実験では、配列番号１８（ＦＬＰＦＧＦＩＬＶ；本明細書では「ＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ」とも称される）の配列の細菌ペプチドを、以下と比較した：
− 配列番号１の１位のトリプトファンがアラニン（１Ａ）によって置換され、配列番号１の９位のイソロイシンがバリン（９Ｖ）によって置換された、Ｅｇｕｃｈｉ Ｊｕｎｉｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ２ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｎｔｉｇｌｉｏｍａ ＣＴＬ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６６（１１）：５８８３−５８９１に記載のペプチド「１Ａ９Ｖ」、
− 配列番号１の１位のトリプトファンがイソロイシン（１Ｉ）によって置換され、配列番号１の９位のイソロイシンがアラニン（９Ａ）によって置換されたペプチド「１Ｉ９Ａ」、及び
− 配列番号１の１位のトリプトファンがフェニルアラニン（１Ｆ）によって置換され、配列番号１の９位のイソロイシンがメチオニン（９Ｍ）によって置換されたペプチド「１Ｆ９Ｍ」。
Ａ．材料及び方法
実験プロトコル、材料、及び方法は、上述の抗原性ペプチドを使用したことのみを除いて、実施例４に概説したものに一致する。
Ｂ．結果
以下のインビトロ結合親和性が得られた（表５）：
したがって、本発明に係る抗原性ペプチド（ＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ（配列番号３１）は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対して、試験したすべての他のペプチドよりも顕著に高い結合親和性を示し、一方、Ｅｇｕｃｈｉ Ｊｕｎｉｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ２ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｎｔｉｇｌｉｏｍａ ＣＴＬ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６６（１１）：５８８３−５８９１に記載のペプチド「１Ａ９Ｖ」は、試験したペプチドのうち最も低い親和性を示した。
実施例６：細菌ペプチドＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ（配列番号１８）によるマウスへのワクチン接種は、ＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγアッセイにおいて改善されたＴ細胞応答を誘導する。
Ａ．材料及び方法
Ａ．１ マウスモデル
使用したモデルの特徴を表６に概説する。
これらのマウスは、いくつかの報告に記載されている（Ｋｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｒｍａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｂｅｔａ ２Ｍ，ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９０ Ｊｕｎ ８；２４８（４９６０）：１２２７−３０．Ｃｏｓｇｒｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｅｌｌ．１９９１ Ｓｅｐ ６；６６（５）：１０５１−６６；Ｐａｓｃｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＨＬＡ−Ａ２．１−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＤ８（＋）Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｂｅｔａ２ ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ｂｅｔａ２ｍ）ＨＬＡ−Ａ２．１ ｍｏｎｏｃｈａｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｈ−２Ｄｂ ｂｅｔａ２ｍ ｄｏｕｂｌｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９７ Ｊｕｎ １６；１８５（１２）：２０４３−５１）。
Ａ．２ 免疫感作スキーム
免疫感作スキームを図１に示す。簡潔に述べると、１４頭のβ／Ａ２／ＤＲ３マウスを無作為に（マウスの性別及び年齢に基づいて）２つの実験群に割り当て、それぞれを共通のヘルパーペプチド（ｈ−ｐＡｇ）と組み合わせた特定のワクチン接種ペプチド（ｖａｃｃ−ｐＡｇ）で免疫した（以下の表７に概説される）。ｖａｃｃ−ｐＡｇを対で比較した（群１対群２）。これにより、単一のペプチドの天然型と最適化型の両方を各群で比較した。
ペプチドは以下のように提供した。
・ｖａｃｃ−ｐＡｇの対：ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈ及びＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ；いずれも、４ｍｇ／ｍＬ（４ｍＭ）の濃度で製造、提供。
・ｈ−ｐＡｇ：ＨＨＤ−ＤＲ３ペプチド（配列番号３２）；凍結乾燥し（５０．６ｍｇ；Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ ｂａｔｃｈ １６１１１６６）、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で純蒸留水に再懸濁した。
動物を０日目（ｄ０）に初回免疫注射で、ｄ１４に追加免疫注射で免疫した。各マウスの尾の付け根に、以下を含む油性エマルジョンを１００μＬ皮下注射した。
・１００μｇのｖａｃｃ−ｐＡｇ（マウス１頭当たり４ｍｇ／ｍＬストック２５μＬ）。
・１５０μｇのｈ−ｐＡｇ（マウス１頭当たり１０ｍｇ／ｍＬストック１５μＬ）。
・総容量が５０μＬになるようにＰＢＳを１０μＬ（マウス１頭当たり）。
・１：１（ｖ：ｖ）の比率（マウス１頭当たり５０μＬ）で添加される不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）。
以下のように、各ｖａｃｃ−ｐＡｇについて別々のエマルジョンを調製した：ＩＦＡ試薬を、１５ｍＬチューブ中のｖａｃｃ−ｐＡｇ／ｈ−ｐＡｇ／ＰＢＳ混合物に添加し、濃厚なエマルジョンを形成するまで１分間の反復サイクルでボルテックスで混合した。
Ａ．３ マウス解析
追加免疫注射の７日間後（即ち、ｄ２１）、動物を安楽死させ、脾臓を摘出した。脾細胞は、臓器を機械的に破砕した後、７０μｍフィルタリング及びＦｉｃｏｌｌ密度勾配精製することによって調製した。
脾細胞を直ちにＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγアッセイに使用した（表８）。１ウェル当たり２×１０５総脾細胞を使用して、実験条件を４連で繰り返し、それらのＩＦＮγ分泌能を評価するために、ｖａｃｃ−ｐＡｇ（１０μＭ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、２．５μｇ／ｍＬ）、又は培地のみの存在下で培養した。市販のＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγキット（Ｄｉａｃｌｏｎｅ Ｋｉｔ Ｍｕｊｒｉｎｅ ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ）を製造会社の指示にしたがって使用し、アッセイは、約１６時間のインキュベーション後に実施した。
ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ５．４ソフトウェア（ＣＴＬ−Ｅｕｒｏｐｅ）とインターフェースをとったＧｒａｎｄ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓ６ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＵＶ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒでスポットを数えた。データプロッティング及び統計分析は、Ｐｒｉｓｍ−５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて行った。
細胞懸濁液をまた、Ｔ細胞数の正規化のために、フローサイトメトリーによっても分析した。モノクローナル抗体カクテル（データは示さず）を、マウス（１：１０希釈「抗ｍＣＤ１６／ＣＤ３２ ＣＦ１１クローン」−内部供給）Ｆｃ受容体を標的とするＦｃ遮断試薬の存在下で精製白血球に適用した。インキュベーションは、９６ウェルプレート中、暗所で４℃にて１５〜２０分間行った。染色後に遠心分離によって細胞を洗浄して過剰のモノクローナル抗体カクテルを除去し、データ取得のためにＰＢＳに再懸濁した。
すべてのデータ取得は、ＦＡＣＳ−Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とインターフェースをとったＬＳＲ−ＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いて行われた。データの分析は、ゲーティングストラテジ（図示せず）を用いるＦｌｏｗＪｏ−９ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ Ｉｎｃ．）を用いて行った。
Ｂ．結果
合計１４頭のβ／Ａ２／ＤＲ３マウスをこの実験に使用した（表８参照）。屠殺時に、脾臓Ｔ細胞群をフローサイトメトリーによって分析したところ、大多数がＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットに属することが示された。
プレーティングし、適切な刺激でインキュベートした後、ＩＦＮγ産生細胞が現れ、これを計数した。次いで、データを、１０６個の全Ｔ細胞当たりの特定のスポットの数（「培地のみ」の条件で得られた平均数を差し引いたもの）として正規化した。
次に、個々の平均値（４連から得た）を用いて群平均値をプロットした（図３Ａ参照）。Ｔ細胞の機能的能力は個体ごとに異なる可能性があるので、データは個体当たりのＣｏｎＡ応答の割合（％）としても表した（図３Ｂ参照）。
全体として、ＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ ｐＡｇ細菌ペプチドによるワクチン接種は、ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈ ｐＡ（参照ヒト）−ワクチン接種動物（群２）と比較して、ＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγアッセイにおいて改善されたＴ細胞応答を誘導した。群１（ＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ）では、ＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ ｐＡｇによるエクスビボ再刺激は、ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈ ｐＡｇの場合よりも高い応答を促した。群２（ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈ）の場合はそうではなかった。各条件についてのＣｏｎＡ誘導応答の割合（％）（平均＋／−ＳＥＭ）は以下の通りであった。
・群１（ＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ）／ＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ ｐＡｇ：５６．３％＋／−１８．１
・群１（ＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ）／ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈ ｐＡｇ：３２．３％＋／−１１．８
・群２（ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈ）／ＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ ｐＡｇ：２．０％＋／−０．８
・群２（ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈ）／ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈ ｐＡｇ：１．１％＋／−０．８
したがって、これらの結果は、ＩＬ１３ＲＡ２を標的とする腫瘍抗原免疫療法が、インビボでのＴ細胞応答を改善することができ、実施例１〜３で記載するように同定されたＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ細菌ペプチド（配列番号１８）がその目的に特に有効であるという実験的証拠を与える。
実施例７：細菌ペプチドＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ（配列番号１８）は、インビトロにおいて腫瘍細胞に対する細胞傷害性を与える
この実施例は、配列番号１８（ＦＬＰＦＧＦＩＬＶ；本明細書では「ＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ」とも称される）の配列の細菌ペプチドが、ＩＬ１３ＲＡ２を発現している腫瘍細胞であるＵ８７細胞に対する細胞傷害性をインビトロにおいて与えるという証拠を与える。対照的に、ＩＬ１３ＲＡ２（ＷＬＰＦＧＦＩＬＩ、配列番号１、本明細書では「ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈ」とも称される）に由来する、対応する参照ヒトペプチドは、インビトロにおいてＵ８７細胞に対する細胞傷害性を与えない。
方法：
簡潔に述べると、ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈ又はＩＬ１３ＲＡ２−Ｈで免疫したマウス由来のＣＤ８ Ｔ細胞を使用した。免疫されたマウス由来の脾細胞の選別後にこれら細胞を入手し、Ｕ８７細胞（ＩＬ１３ＲＡ２を発現している腫瘍細胞）上に置いた。
より詳細には、ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈ（ＷＬＰＦＧＦＩＬＩ、配列番号１）又はＩＬ１３ＲＡ２−Ｂ（ＦＬＰＦＧＦＩＬＶ、配列番号１８）で免疫されたＨＨＤマウスの脾細胞からＣＤ３＋Ｔ細胞を精製した。この目的のために、実施例６に記載の通り、０日目及び１４日目に、ワクチン接種ペプチド＋ヘルパーペプチド＋ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）を含有する油性エマルジョン１００μＬをＢ６β２ｍｋｏＨＨＤ／ＤＲ３マウスの尾の付け根に皮下注射した。２１日目、即ち、追加免疫注射の７日間後に、動物を安楽死させ、脾臓を摘出した。臓器を機械的に破砕することによって脾細胞を調製した。推奨された手順を使用し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ製のマウス全Ｔ細胞単離キットを使用して、ＣＤ３＋の精製を実施した。細胞の効率的な精製及び生存率を、生存率についての適切なマーカーＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、及びＣＤ４５を使用してサイトメトリーによって検証した。
平底２４ウェル培養プレートに６×１０５細胞／ウェルでＵ８７−ＭＧ細胞を播種し、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）及び抗生物質を含有するＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）中において３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後、培養培地を除去し、精製されたＴ ＣＤ３＋細胞を含有する培地に交換した。以下のＴ細胞対Ｕ８７−ＭＧ細胞比を使用した：１／０．５、１／１、及び１／５。
Ｕ８７−ＭＧ細胞及びＣＤ３＋Ｔ細胞を共培養した７２時間後、ウェルからすべての細胞を回収し、ＤＡＰＩ及び蛍光アネキシンＶでＣＤ４５陰性細胞を免疫染色し、続いて、サイトメトリー分析を行った後に、特異的Ｕ８７−ＭＧ細胞死を評価した。
結果：
結果を図３に示す。概して、ＩＬ１３ＲＡ２−Ｂによる処理後にＵ８７細胞の溶解が観察されたが、ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈでは観察されなかった。
実施例８：ヒトミクロビオームにおける腫瘍関連抗原ＦＯＸＭ１のエピトープの細菌配列変異体の同定
本実施例では、６００種の抗原の中から、フォークヘッドボックスＭ１（ＦＯＸＭ１）を選択したが、これは、（ｉ）それが、ＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）エピトープとして同定されたエピトープを含んでいる（Ｙｏｋｏｍｉｎｅ Ｋ，Ｓｅｎｊｕ Ｓ，Ｎａｋａｔｓｕｒａ Ｔ，Ｉｒｉｅ Ａ，Ｈａｙａｓｈｉｄａ Ｙ，Ｉｋｕｔａ Ｙ，Ｈａｒａｏ Ｍ，Ｉｍａｉ Ｋ，Ｂａｂａ Ｈ，Ｉｗａｓｅ Ｈ，Ｎｏｍｏｒｉ Ｈ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ｄａｉｇｏ Ｙ，Ｔｓｕｎｏｄａ Ｔ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ，Ｓａｓａｋｉ Ｙ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｙ．Ｔｈｅ ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ｍ１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｓ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１０ Ｍａｙ １；１２６（９）：２１５３−６３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｉｊｃ．２４８３６）；（ｉｉ）遺伝子発現から得られたデータ（マイクロアレイ試験）を分析するＧＥＰＩＡ、Ｇｅｎｔ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｇｅｎｅ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒ、及びｐｒｏｔｅｉｎ ａｔｌａｓを含む幾つかのデータベースにおいて、ＦＯＸＭ１が多くの腫瘍で過剰発現することが見出されている、並びに（ｉｉｉ）脳腫瘍（Ｈｏｄｇｓｏｎ ＪＧ，Ｙｅｈ ＲＦ，Ｒａｙ Ａ，Ｗａｎｇ ＮＪ，Ｓｍｉｒｎｏｖ Ｉ，Ｙｕ Ｍ，Ｈａｒｉｏｎｏ Ｓ，Ｓｉｌｂｅｒ Ｊ，Ｆｅｉｌｅｒ ＨＳ，Ｇｒａｙ ＪＷ，Ｓｐｅｌｌｍａｎ ＰＴ，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇ ＳＲ，Ｂｅｒｇｅｒ ＭＳ，Ｊａｍｅｓ ＣＤ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ．２００９ Ｏｃｔ；１１（５）：４７７−８７．ｄｏｉ：１０．１２１５／１５２２８５１７−２００８−１１３）、膵腫瘍（Ｘｉａ ＪＴ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｌｉａｎｇ ＬＪ，Ｐｅｎｇ ＢＧ，Ｗｕ ＺＦ，Ｃｈｅｎ ＬＺ，Ｘｕｅ Ｌ，Ｌｉ Ｚ，Ｌｉ Ｗ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦＯＸＭ１ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｐａｎｃｒｅａｓ．２０１２ Ｍａｙ；４１（４）：６２９−３５．ｄｏｉ：１０．１０９７／ＭＰＡ．０ｂ０１３ｅ３１８２３ｂｃｅｆ２）、卵巣癌（Ｗｅｎ Ｎ，Ｗａｎｇ Ｙ，Ｗｅｎ Ｌ，Ｚｈａｏ ＳＨ，Ａｉ ＺＨ，Ｗａｎｇ Ｙ，Ｗｕ Ｂ，Ｌｕ ＨＸ，Ｙａｎｇ Ｈ，Ｌｉｕ ＷＣ，Ｌｉ Ｙ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦＯＸＭ１ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１４ Ｍａｙ ２０；１２：１３４．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７９−５８７６−１２−１３４）、結腸直腸癌（Ｚｈａｎｇ ＨＧ，Ｘｕ ＸＷ，Ｓｈｉ ＸＰ，Ｈａｎ ＢＷ，Ｌｉ ＺＨ，Ｒｅｎ ＷＨ，Ｃｈｅｎ ＰＪ，Ｌｏｕ ＹＦ，Ｌｉ Ｂ，Ｌｕｏ ＸＹ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍ１（ＦＯＸＭ１）ｐｌａｙｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１６ Ｍａｙ；１８（５）：５２７−３２．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０９４−０１５−１４００−１）、及び多くの他の癌でも過剰発現が報告されている、という事実に基づくものであった。
具体的には、上記の腫瘍／癌におけるＦＯＸＭ１の過剰発現及び選択的発現の確認は、以下の通り実施した：「Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ」（ＴＣＧＡ；ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で利用可能））によって作成されたｔｉｓｓｕｅ ａｔｌａｓから得られたｍＲＮＡデータ（３７の正常組織及び１７の癌型のＲＮＡ配列データ）の解析から、正常細胞ではＦＯＸＭ１ ｍＲＮＡの基礎レベルが低く（精巣を除いて）、幾つかの腫瘍型ではＦＯＸＭ１ ｍＲＮＡの発現レベルが高いことが明らかになった。Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｇＥｎｅ ＲＡｐｉｄ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒａｖ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／で利用可能、ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ及びＮＣＢＩ ＧＥＯ ｄａｔａｓｅｔからのデータを解析）を使用してＦＯＸＭ１のｍＲＮＡ発現を実施したときにも同様の結果がみられ、胚を除く）試験した正常細胞の大部分では基礎発現が非常に低く、乳癌、食道癌、肺癌、メラノーマのサンプル、結腸直腸サンプル、及び神経膠芽腫のサンプルを含む多くの腫瘍サンプルでは発現が強かった。
ＦＯＸＭ１は、ヒトにおいてＦＯＸＭ１遺伝子によってコードされているＧ１−Ｓ及びＧ２−Ｍの進行に関与する転写因子である。網羅的ではないが、ＦＯＸＭ１は、免疫療法標的候補として提唱されている（Ｙｏｋｏｍｉｎｅ Ｋ，Ｓｅｎｊｕ Ｓ，Ｎａｋａｔｓｕｒａ Ｔ，Ｉｒｉｅ Ａ，Ｈａｙａｓｈｉｄａ Ｙ，Ｉｋｕｔａ Ｙ，Ｈａｒａｏ Ｍ，Ｉｍａｉ Ｋ，Ｂａｂａ Ｈ，Ｉｗａｓｅ Ｈ，Ｎｏｍｏｒｉ Ｈ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ｄａｉｇｏ Ｙ，Ｔｓｕｎｏｄａ Ｔ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ，Ｓａｓａｋｉ Ｙ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｙ；Ｔｈｅ ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ｍ１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｓ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１０ Ｍａｙ １；１２６（９）：２１５３−６３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｉｊｃ．２４８３６）。ＦＯＸＭ１の高発現は、更に、例えば、腫瘍の成長、血管新生、移動、浸潤、上皮間葉転換、転移、及び化学療法薬耐性に関与する癌化にも関連している（Ｗｉｅｒｓｔｒａ Ｉ．ＦＯＸＭ１（Ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ｍ１）ｉｎ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ：ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ，ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ，ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｔｕｍｏｒ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３；１１９：１９１−４１９．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｂ９７８−０−１２−４０７１９０−２．０００１６−２）。したがって、ＦＯＸＭ１をドライバー腫瘍抗原とみなすことができた。
次の工程では、ＭＨＣ−Ｉによって特異的に提示される、選択された腫瘍関連抗原のエピトープを同定した。この目的のために、「Ｉｍｍｕｎｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅ」（ＩＥＤＢ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／；ＭＨＣ−Ｉ分析については、具体的に、ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ａｎａｌｙｚｅ／ｈｔｍｌ／ｍｈｃ＿ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．ｈｔｍｌ（ＦＯＸＭ１解析に使用する場合）、ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ／も参照）を、ペプチド提示を予測するためのプロテアソーム切断、ＴＡＰ輸送、及びＭＨＣクラスＩの分析ツールと併用して、（ＦＯＸＭ１の）腫瘍関連抗原配列を分析した。即ち、ＨＬＡ．Ａ２．１によって提示される可能性のあるエピトープ候補を同定するためのＩＥＤＢ解析ツールにＦＯＸＭ１のタンパク質配列を送信した。それによって、ＨＬＡ Ａ２．１結合特性を有する７５６のエピトープ候補のリストを得た。このリストのうちの３つのエピトープ：Ｙｏｋｏｍｉｎｅら（Ｙｏｋｏｍｉｎｅ Ｋ，Ｓｅｎｊｕ Ｓ，Ｎａｋａｔｓｕｒａ Ｔ，Ｉｒｉｅ Ａ，Ｈａｙａｓｈｉｄａ Ｙ，Ｉｋｕｔａ Ｙ，Ｈａｒａｏ Ｍ，Ｉｍａｉ Ｋ，Ｂａｂａ Ｈ，Ｉｗａｓｅ Ｈ，Ｎｏｍｏｒｉ Ｈ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ｄａｉｇｏ Ｙ，Ｔｓｕｎｏｄａ Ｔ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ，Ｓａｓａｋｉ Ｙ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｙ．Ｔｈｅ ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ｍ１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｓ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１０ Ｍａｙ １；１２６（９）：２１５３−６３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｉｊｃ．２４８３６）によって報告され、機能的に検証されたＹＬＶＰＩＱＦＰＶ（配列番号５５）、ＳＬＶＬＱＰＳＶＫＶ（配列番号５６）／ＬＶＬＱＰＳＶＫＶ（配列番号５７）、及びＧＬＭＤＬＳＴＴＰＬ（配列番号５８）／ＬＭＤＬＳＴＴＰＬ（配列番号５９）は、エピトープ候補として既に報告されていた。
腫瘍細胞の表面でＭＨＣによって効率的に提示される見込みのあるエピトープを同定するために、ＨＬＡ Ａ２．１結合特性を有する７５６のエピトープ候補のリストにおいて、ＨＬＡ Ａ２．１に対する７５６の候補エピトープのインシリコにおける親和性を、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ ４．０ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｐａｎ／）を使用して計算し、最大許容親和性は３，０００ｎＭ（ＩＣ５０）であった。それによって、３５のＦＯＸＭ１エピトープのリストが得られた。
最後に、３５の選択されたヒトＦＯＸＭ１エピトープの微生物叢配列変異体を同定するために、３５の選択されたＦＯＸＭ１エピトープを「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ」（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｔａ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｎ／ｍｅｔａ／ｈｏｍｅで利用可能）と比較した。この目的のために、部位ごとの経時的なアミノ酸変化率を記述し、３５アミノ酸長未満のクエリに推奨される「ＰＡＭ−３０」タンパク質置換マトリックスを使用して、ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ ｓｅａｒｃｈ（ｂｌａｓｔｐ）を実施した。ワードサイズは、同様に短いクエリに提唱される２、期待値（Ｅ）は、可能な一致の数を最大化するために調整された２０，０００，０００を使用し、組成ベースの統計は「０」に設定し、入力配列は３０アミノ酸よりも短く、ギャップのないアラインメントのみ許容した。その後、ｂｌａｓｔｐの結果をフィルタリングして、ヒトペプチドの最初及び／又は最後にのみミスマッチを許容し、１配列当たり最大２つのミスマッチを許容して（最大２つのミスマッチに加えて、類似の特性を有するアミノ酸、即ち、上記保存的アミノ酸置換については第３のミスマッチを許容した）、（ＨＬＡ−Ａ２．１に結合するための）９又は１０アミノ酸長の微生物ペプチド配列のみを得た。それによって、ヒトミクロビオームにおける選択されたＦＯＸＭ１エピトープの細菌配列変異体からなる、５７３の細菌配列のリストが得られた。
実施例９：選択された細菌配列変異体のＭＨＣに対する結合の試験
細胞傷害性Ｔ細胞への抗原提示には微生物ミミクリーのＭＨＣ分子に対する結合が必須であるので、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ４．０ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｐａｎ／）を使用して、５７３の細菌配列のＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ．Ａ２．０１に対する親和性を計算した。５７３の細菌配列（実施例８のｂｌａｓｔｐの結果）をインプットとして使用し、強い及び弱いバインダーについてデフォルト閾値を設定することによって親和性を予測した。４００，０００のランダムな天然配列のセットと比較した予測親和性のランクを結合親和性の尺度として使用した。この値は、より高い又はより低い平均予測親和性に対する特定の分子の固有バイアスによって影響を受けない。％ランク＜０．５を有するものを非常に強いバインダーと定義し、％ランク≧０．５且つ＜１．０を有するものを強いバインダーと定義し、％ランク≧１．０且つ≦２．０を有するものを中程度のバインダーと定義し、％ランク＜２．０を有するものを弱いバインダーと定義する。即ち、５７３の細菌配列から、非常に強い親和性（％ランク＜０．５）を示し、ヒト参照エピトープが（ヒトペプチドについて）少なくとも強い親和性（％ランク＜１）を示すものだけを選択した。
それによって、以下の２０の細菌配列変異体が同定された（表１１）：
実施例１０：選択された細菌配列変異体を含む細菌タンパク質のアノテーション及び細胞局在の決定
次に、選択された細菌エピトープ配列変異体を含有する細菌タンパク質にアノテーションを付けた。この目的のために、Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／）及びｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＲｅｆＳｅｑ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｆｓｅｑ／）の両方に対してｂｌａｓｔに基づく比較を行った。ＲｅｆＳｅｑは、ゲノムＤＮＡ、転写物、及びタンパク質を含む統合された重複していない配列セットを提供する。ＫＥＧＧでは、ＫＯ（ＫＥＧＧ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）データベースに保存されている分子レベル機能を使用した。この機能を、共通の祖先から進化した異なる種由来の遺伝子にコードされているタンパク質を含有するオーソログの群に分類する。
次の工程では、２つの異なる手順を使用して、選択された細菌エピトープ配列変異体を含有する細菌タンパク質の細胞局在の予測を実施する。その後、予測のコンセンサスが取れたペプチド含有タンパク質のリストが得られる。先ず、シグナルペプチドの存在の予測に基づいて細胞内又は細胞外のタンパク質を同定するための二分探索ストラテジを実行した。シグナルペプチドは、原核生物における原形質膜を横断する移行のためにそのパッセンジャータンパク質を標的とする遍在性タンパク質選別シグナルである。これに関しては、コンセンサス予測を得るために、ＳｉｇｎａｌＰ ４．１．（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ）及びｔｈｅ Ｐｈｏｂｉｕｓ ｓｅｒｖｅｒ（ｐｈｏｂｉｕｓ．ｓｂｃ．ｓｕ．ｓｅ）の両方を使用した。シグナルペプチドの存在が２つのアプローチによって検出された場合、そのタンパク質は細胞外又は周辺質に存在する可能性が高いと解釈した。検出されなかった場合、そのタンパク質は、恐らく、外膜／内膜に属するか、又は周辺質に存在する。次に、膜貫通トポロジーの予測を実施する。シグナルペプチドと膜貫通ドメインはいずれも疎水性であるが、膜貫通ヘリックスは通常、より長い疎水性領域を有する。ＳｉｇｎａｌＰ ４．１ ＳｅｒｖｅｒとＰｈｏｂｉｕｓは、シグナルペプチドを膜貫通ドメインと識別する能力を有する。予測される２つの膜貫通ヘリックスの最小数を設定して、膜タンパク質と細胞質タンパク質を識別し、最終的なコンセンサスリストを得る。分泌された成分又は分泌されたエキソソームに含有されているタンパク質がＡＰＣによって提示されやすいと仮定すると、細菌タンパク質の細胞局在の可能性に関するデータは、免疫原性ペプチドの選択のために着目すべきものである。
表１２は、表１１に示す細菌ペプチドを含有する細菌タンパク質の配列番号、そのアノテーション及び細胞局在を示す：
表１１及び１２に示すデータに基づいて、配列番号５９（ＬＭＤＬＳＴＴＰＬ、「ＦＯＸＭ１−Ｈ２」とも称される）に係るヒトＦＯＸＭ１参照エピトープの配列変異体である配列番号７５（アミノ酸配列：ＬＭＤＬＳＴＴＥＶ；「ＦＯＸＭ１−Ｂ２」とも称される）に係る細菌ペプチドを、更なる試験のために選択した。実際、ヒト参照エピトープは中／高親和性を有し、腫瘍細胞の表面で提示される。このＭＨＣ提示は幾つかの公開されている研究で確認されている（Ｙｏｋｏｍｉｎｅ Ｋ，Ｓｅｎｊｕ Ｓ，Ｎａｋａｔｓｕｒａ Ｔ，Ｉｒｉｅ Ａ，Ｈａｙａｓｈｉｄａ Ｙ，Ｉｋｕｔａ Ｙ，Ｈａｒａｏ Ｍ，Ｉｍａｉ Ｋ，Ｂａｂａ Ｈ，Ｉｗａｓｅ Ｈ，Ｎｏｍｏｒｉ Ｈ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ｄａｉｇｏ Ｙ，Ｔｓｕｎｏｄａ Ｔ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ，Ｓａｓａｋｉ Ｙ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｙ．Ｔｈｅ ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ｍ１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｓ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１０ Ｍａｙ １；１２６（９）：２１５３−６３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｉｊｃ．２４８３６）。
配列番号７５（ＬＭＤＬＳＴＴＥＶ）の細菌配列変異体は、ＨＬＡ．Ａ２．０１に対して強い結合親和性を有する。更に、この細菌ペプチド配列変異体は、分泌されると予測される細菌タンパク質に含まれることから、ＭＨＣ提示のために抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって捕捉される可能性が高まる。
実施例１１：細菌ペプチドＦＯＸＭ１ Ｂ２（配列番号７５）は、インビトロにおいてＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１アレルに結合し、インビトロにおいてＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１アレルに対してヒトエピトープよりも優れた親和性を有する
この実施例は、配列番号７５（ＬＭＤＬＳＴＴＥＶ；本明細書では「ＦＯＸＭ１−Ｂ２」とも称される）の配列の細菌ペプチドが、インビトロにおいてＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１アレルに結合し、インビトロにおいてＨＬＡ−Ａ＊０２０１アレルに対して高い親和性を有するが、ＦＯＸＭ１−Ｈ２（ＬＭＤＬＳＴＴＰＬ、配列番号５９、本明細書では「ＦＯＸＭ１−Ｈ２」とも称される）に由来する、対応する参照ヒトペプチドは僅かに低い親和性を有するという証拠を与える。
Ａ．材料及び方法
Ａ１．Ｔ２細胞株に対するペプチドの親和性の測定
実験プロトコルは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１によって提示されるペプチドについて検証されているもの（Ｔｏｕｒｄｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｌｏｗ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ＨＬＡ−Ａ２．１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙｐｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｄｅｃ；３０（１２）：３４１１−２１）と同様である。ペプチドの親和性測定は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を発現するが、ＴＡＰ１／２陰性であり且つ内因性ペプチドを提示することができないヒト腫瘍細胞Ｔ２を用いて行われる。
１００ｎｇ／μＬ ヒトβ２ｍを添加したＡＩＭＶ培地中で１００μＭ〜０．１μＭの漸減濃度のペプチドと共に、Ｔ２細胞（２．１０５細胞／ウェル）を３７℃で１６時間インキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、ＰＥに結合している抗ＨＬＡ−Ａ２抗体で標識した（クローンＢＢ７．２、ＢＤ Ｐｈａｒｍａｇｅｎ）。
ＦＡＣＳ（Ｇｕａｖａ Ｅａｓｙ Ｃｙｔｅ）によって分析を実施した。各ペプチド濃度について、対象ペプチドに結合している標識の幾何平均をバックグラウンドノイズから差し引き、１００μＭの濃度の参照ペプチドＨＩＶ ｐｏｌ ５８９−５９７で得られたＨＬＡ−Ａ＊０２０２標識の幾何平均の割合として報告する。次いで、以下の通り相対親和性を求める：
相対親和性＝ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の発現の２０％を誘導する各ペプチドの濃度／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の発現の２０％を誘導する参照ペプチドの濃度。
Ａ２．ペプチドの可溶化
アミノ酸組成を考慮して各ペプチドを可溶化させた。システイン、メチオニン、又はトリプトファンをいずれも含まないペプチドについては、総体積の１０％になるまでＤＭＳＯを添加することが可能である。他のペプチドは、水又はＰＢＳ ｐＨ７．４に再懸濁させる。
Ｂ．結果
Ｔ２細胞の場合：可変ペプチド濃度についての平均蛍光強度：細菌ペプチドＦＯＸＭ１−Ｂ２（配列番号７５）及びヒトペプチドＦＯＸＭ１−Ｈ２（配列番号５９）は、いずれもＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１に結合するが、細菌ペプチドＦＯＸＭ１−Ｂ２（配列番号７５）はＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対してヒトペプチドＦＯＸＭ１−Ｈ２（配列番号５９）よりも良好な結合親和性を有する、即ち、１００μＭでは１０５対７７．６；２５μＭでは９８．２対６５．４；３μＭでは１２．７対０．９。また、細菌ペプチドＦＯＸＭ１−Ｂ２は、６．７μＭでＨＬＡ−Ａ＊０２０１の発現の２０％を誘導するが、ヒトペプチドＦＯＸＭ１−Ｈ２では、同じ発現のためにより高濃度、即ち、１２．６μＭが必要である。
第２の実験からも同様の結果が得られた。これらデータは、細菌ペプチドＦＯＸＭ１−Ｂ２が、対応するヒトペプチドＦＯＸＭ１−Ｈ２よりも明らかに優れていることを示す。
実施例１２：細菌ペプチドＦＯＸＭ１−Ｂ２（配列番号７５）によるマウスへのワクチン接種は、ＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγアッセイにおいて改善されたＴ細胞応答を誘導する。
Ａ．材料及び方法
Ａ．１ マウスモデル
使用したモデルの特徴を表１３に概説する。
これらのマウスは、いくつかの報告に記載されている（Ｋｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｒｍａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｂｅｔａ ２Ｍ，ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９０ Ｊｕｎ ８；２４８（４９６０）：１２２７−３０．Ｃｏｓｇｒｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｅｌｌ．１９９１ Ｓｅｐ ６；６６（５）：１０５１−６６；Ｐａｓｃｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＨＬＡ−Ａ２．１−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＤ８（＋）Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｂｅｔａ２ ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ｂｅｔａ２ｍ）ＨＬＡ−Ａ２．１ ｍｏｎｏｃｈａｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｈ−２Ｄｂ ｂｅｔａ２ｍ ｄｏｕｂｌｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９７ Ｊｕｎ １６；１８５（１２）：２０４３−５１）。
Ａ．２ 免疫感作スキーム
免疫感作スキームを図１に示す。簡潔に述べると、１５頭のβ／Ａ２／ＤＲ３マウスを、共通のヘルパーペプチド（ｈ−ｐＡｇ）と組み合わせた特定のワクチン接種ペプチド（ｖａｃｃ−ｐＡｇ）で免疫した（以下の表１４に概説される）。ｖａｃｃ−ｐＡｇを対で比較した（群１対群２）。これにより、単一のペプチドの天然型と最適化型の両方を各群で比較した。
ペプチドは以下のように提供した。
・ｖａｃｃ−ｐＡｇの対：ＦＯＸＭ１−Ｂ２及びＦＯＸＭ１−Ｈ２；いずれも、４ｍｇ／ｍＬ（４ｍＭ）の濃度で製造、提供。
・ｈ−ｐＡｇ：ＨＨＤ−ＤＲ３ペプチド（配列番号３２）；凍結乾燥し（５０．６ｍｇ；Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ ｂａｔｃｈ １６１１１６６）、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で純蒸留水に再懸濁した。
動物を０日目（ｄ０）に初回免疫注射で、ｄ１４に追加免疫注射で免疫した。各マウスの尾の付け根に、以下を含む油性エマルジョンを１００μＬ皮下注射した。
・１００μｇのｖａｃｃ−ｐＡｇ（マウス１頭当たり４ｍｇ／ｍＬストック２５μＬ）。
・１５０μｇのｈ−ｐＡｇ（マウス１頭当たり１０ｍｇ／ｍＬストック１５μＬ）。
・総容量が５０μＬになるようにＰＢＳを１０μＬ（マウス１頭当たり）。
・１：１（ｖ：ｖ）の比率（マウス１頭当たり５０μＬ）で添加される不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）。
以下のように、各ｖａｃｃ−ｐＡｇについて別々のエマルジョンを調製した：ＩＦＡ試薬を、１５ｍＬチューブ中のｖａｃｃ−ｐＡｇ／ｈ−ｐＡｇ／ＰＢＳ混合物に添加し、濃厚なエマルジョンを形成するまで１分間の反復サイクルでボルテックスで混合した。
Ａ．３ マウス解析
追加免疫注射の７日間後（即ち、ｄ２１）、動物を安楽死させ、脾臓を摘出した。脾細胞は、臓器を機械的に破砕した後、７０μｍフィルタリングＦｉｃｏｌｌ密度勾配精製することによって調製した。
脾細胞を直ちにＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγアッセイに使用した（表１５）。１ウェル当たり２×１０５総脾細胞を使用して、実験条件を２連で繰り返し、それらのＩＦＮγ分泌能を評価するために、ｖａｃｃ−ｐＡｇ（１０μＭ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、２．５μｇ／ｍＬ）、又は培地のみの存在下で培養した。市販のＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγキット（Ｄｉａｃｌｏｎｅ Ｋｉｔ Ｍｕｊｒｉｎｅ ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ）を製造会社の指示にしたがって使用し、アッセイは、約１６時間のインキュベーション後に実施した。
ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ５．４ソフトウェア（ＣＴＬ−Ｅｕｒｏｐｅ）とインターフェースをとったＧｒａｎｄ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓ６ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＵＶ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒでスポットを数えた。データプロッティング及び統計分析は、Ｐｒｉｓｍ−５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて行った。
細胞懸濁液をまた、Ｔ細胞数の正規化のために、フローサイトメトリーによっても分析した。モノクローナル抗体カクテル（データは示さず）を、マウス（１：１０希釈「抗ｍＣＤ１６／ＣＤ３２ ＣＦ１１クローン」−内部供給）Ｆｃ受容体を標的とするＦｃ遮断試薬の存在下で精製白血球に適用した。インキュベーションは、９６ウェルプレート中、暗所で４℃にて１５〜２０分間行った。染色後に遠心分離によって細胞を洗浄して過剰のモノクローナル抗体カクテルを除去し、データ取得のためにＰＢＳに再懸濁した。
すべてのデータ取得は、ＦＡＣＳ−Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とインターフェースをとったＬＳＲ−ＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いて行われた。データの分析は、ゲーティングストラテジ（図示せず）を用いるＦｌｏｗＪｏ−９ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ Ｉｎｃ．）を用いて行った。
Ｂ．結果
合計１４頭のβ／Ａ２／ＤＲ３マウスをこの実験に使用した（表１５参照）。屠殺時に、脾臓Ｔ細胞群をフローサイトメトリーによって分析したところ、大多数がＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットに属することが示された。
プレーティングし、適切な刺激でインキュベートした後、ＩＦＮγ産生細胞が現れ、これを計数した。次いで、データを、１０６個の全Ｔ細胞当たりの特定のスポットの数（「培地のみ」の条件で得られた平均数を差し引いたもの）として正規化した。
次に、個々の平均値（４連から得た）を用いて群平均値をプロットした（図４参照）。全体として、ＦＯＸＭ１−Ｂ２ ｐＡｇ細菌ペプチド（配列番号７５）によるワクチン接種は、ＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγアッセイにおいて強力なＴ細胞応答を誘導した。ＦＯＸＭ１−Ｂ２ ｐＡｇによるエクスビボ再刺激は、ヒトＦＯＸＭ１−Ｈ２ ｐＡｇペプチドよりも高い応答を促した。しかし、ＦＯＸＭ１−Ｈ２によるエクスビボ再刺激後にＴ細胞の効率的な活性化を観察することができ、これは、ＦＯＸＭ１−Ｂ２ペプチドのワクチン接種が、ヒト腫瘍関連抗原ＦＯＸＭ１−Ｈ２を認識するＴ細胞の活性化をドライブできることを示すので、ヒトにおけるワクチン接種にＦＯＸＭ１−Ｂ２を使用することを支持するものである。
したがって、これらの結果は、ＦＯＸＭ１を標的とする腫瘍抗原免疫療法が、インビボでのＴ細胞応答を改善することができ、実施例８及び９で記載するように同定されたＦＯＸＭ１−Ｂ２細菌ペプチド（配列番号７５）がその目的に特に有効であるという実験的証拠を与える。
実施例１３：ヒトミクロビオームにおける腫瘍関連エピトープの１０ａａ細菌配列変異体の検証
以下では、本発明に従って同定した１０アミノ酸（１０ａａ）長の細菌配列が、腫瘍関連エピトープに対する免疫活性化を誘導できることを実証する。
実施例１に記載したのと本質的に同じ理由からインターロイキン１３受容体サブユニットアルファ−２（ＩＬ−１３Ｒα２又はＩＬ１３ＲＡ２）を腫瘍関連抗原として選択した。簡潔に述べると、（ｉ）それが、ＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）エピトープとして同定されたエピトープを含んでいる（Ｏｋａｎｏ Ｆ，Ｓｔｏｒｋｕｓ ＷＪ，Ｃｈａｍｂｅｒｓ ＷＨ，Ｐｏｌｌａｃｋ ＩＦ，Ｏｋａｄａ Ｈ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ，ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ２ ｃｈａｉｎ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２ Ｓｅｐ；８（９）：２８５１−５）、（ｉｉ）ＩＬ１３ＲＡ２は、腫瘍Ｔ細胞抗原データベース及びＣＴデータベースにおいて脳腫瘍で過剰発現する遺伝子として言及されている、（ｉｉｉ）遺伝子発現から得られた分析データ（マイクロアレイ試験）を分析するＧｅｎｔ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｇｅｎｅ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒ、及びｐｒｏｔｅｉｎ ａｔｌａｓなどのツールを用いて、ＩＬ１３ＲＡ２の過剰発現及び選択的発現が確認された、（ｉｖ）脳腫瘍（Ｄｅｂｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １３，ａ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ／ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０００ Ｍａｙ；６（５）：４４０−９）、頭頸部腫瘍（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ２ ｃｈａｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ ｓｅｒｖｅｓ ａｓ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００３ Ｄｅｃ １５；９（１７）：６３８１−８）、及びメラノーマ（Ｂｅａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｄｉｇｉｔａｌ ＲＮＡ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｏｒ ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３ Ｓｅｐ １５；１９（１８）：４９４１−５０）における過剰発現が文献でも報告されている、並びに（ｖ）ＩＬ１３ＲＡ２エピトープ（配列番号１）に対するＴ細胞活性化を誘導することができる９ａａ細菌配列（配列番号１８）が既に同定されている（実施例１〜７）という事実に基づいてＩＬ１３ＲＡ２を選択した。
１０アミノ酸長を有し、ＭＨＣ−Ｉによって特異的に提示されるＩＬ１３ＲＡ２のエピトープを同定した。この目的のために、「Ｉｍｍｕｎｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅ」（ＩＥＤＢ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／；ＭＨＣ−Ｉ分析については、具体的に、ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ａｎａｌｙｚｅ／ｈｔｍｌ／ｍｈｃ＿ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．ｈｔｍｌ（ＩＬ１３ＲＡ２解析に使用する場合）、ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ／も参照）を、ペプチド提示を予測するためのプロテアソーム切断、ＴＡＰ輸送、及びＭＨＣクラスＩの分析ツールと併用して、（ＩＬ１３ＲＡ２の）腫瘍関連抗原配列を分析した。即ち、ＨＬＡ．Ａ２．１によって提示される可能性のあるエピトープ候補を同定するためのＩＥＤＢ解析ツールにＩＬ１３ＲＡ２のタンパク質配列を送信した。ＨＬＡ Ａ２．１に対する候補エピトープのインシリコにおける親和性を、最大許容親和性は３，０００ｎＭ（ＩＣ５０）でＮｅｔＭＨＣｐａｎ ３．０ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｐａｎ／）を使用して計算して、ＭＨＣ親和性によって効率的に提示される見込みのあるエピトープを同定した。それによって、１０アミノ酸のＩＬ１３ＲＡ２エピトープ候補１９個のリストが得られた。
微生物叢配列変異体を同定するために、１９の選択されたＩＬ１３ＲＡ２エピトープを「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ」（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｔａ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｎ／ｍｅｔａ／ｈｏｍｅで利用可能）と比較した。この目的のために、部位ごとの経時的なアミノ酸変化率を記述し、３５アミノ酸長未満のクエリに推奨される「ＰＡＭ−３０」タンパク質置換マトリックスを使用して、ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ ｓｅａｒｃｈ（ｂｌａｓｔｐ）を実施した。ワードサイズは、同様に短いクエリに提唱される２、期待値（Ｅ）は、可能な一致の数を最大化するために調整された２０，０００，０００を使用し、組成ベースの統計は「０」に設定し、入力配列は３０アミノ酸よりも短く、ギャップのないアラインメントのみ許容した。その後、ｂｌａｓｔｐの結果をフィルタリングして、ヒトペプチドの最初及び／又は最後にのみミスマッチを許容し、１配列当たり最大３つのミスマッチを許容して、（ＨＬＡ−Ａ２．１に結合するための）１０アミノ酸長の微生物ペプチド配列のみを得た。更に、非常に強い親和性（％ランク＜０．５）を示し、ヒト参照エピトープが（ヒトペプチドについて）少なくとも強い親和性（％ランク＜１．５）を示す細菌配列だけを選択した。それによって、５つのＩＬ１３ＲＡ２腫瘍関連ペプチドと類似性を有する１１の細菌ペプチドのリストが同定された。
次に、表１８に示す細菌ペプチドを含有する細菌タンパク質を同定した。更に、上記の通り、選択された細菌エピトープ配列変異体を含有する細菌タンパク質にアノテーションを付けた。結果を表１９に示す。
表１９は、表１８に示す細菌ペプチドを含有する細菌タンパク質の配列番号、そのアノテーション及び細胞局在を示す：
表１９は、ヒト微生物叢で発現する最も性質の異なる細菌タンパク質、即ち、５つの性質の異なる細菌タンパク質において、配列番号１３９（ＦＬＰＦＧＦＩＬＰＶ、本明細書では「ＩＬ１３ＲＡ２−ＢＬ」とも称される）に係る細菌ペプチドが同定されたことを示す。この理由から、インビトロ及びインビボ実験試験のために配列番号１３９（ＦＬＰＦＧＦＩＬＰＶ）に係る細菌ペプチドを選択した。対応するヒトＩＬ１３ＲＡ２エピトープＷＬＰＦＧＦＩＬＩＬ（ＩＬ１３ＲＡ２−ＨＬ、配列番号１３１）は、ＩＬ１３ＲＡ２−Ｈペプチド（配列番号１）の配列を包含する。
実施例１４：細菌ペプチドＩＬ１３ＲＡ２−ＢＬ（配列番号１３９）は、インビトロにおいてＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１アレルに結合し、インビトロにおいてＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１アレルに対して、対応するヒトエピトープよりも優れた親和性を有する
この実施例は、配列番号１３９（ＦＬＰＦＧＦＩＬＰＶ；本明細書では「ＩＬ１３ＲＡ２−ＢＬ」とも称される）の配列の細菌ペプチドが、インビトロにおいてＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１アレルに結合し、インビトロにおいてＨＬＡ−Ａ＊０２０１アレルに対して高い親和性を有するが、ＩＬ１３ＲＡ２に由来する、対応する参照ヒトペプチドは低い親和性を示すという証拠を与える。
Ａ．材料及び方法
Ａ１．Ｔ２細胞株に対するペプチドの親和性の測定
実験プロトコルは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１によって提示されるペプチドについて検証されているもの（Ｔｏｕｒｄｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｌｏｗ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ＨＬＡ−Ａ２．１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙｐｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｄｅｃ；３０（１２）：３４１１−２１）と同様である。ペプチドの親和性測定は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を発現するが、ＴＡＰ１／２陰性であり且つ内因性ペプチドを提示することができないヒト腫瘍細胞Ｔ２を用いて行われる。
１００ｎｇ／μＬ ヒトβ２ｍを添加したＡＩＭＶ培地中で１００μＭ〜０．１μＭの漸減濃度のペプチドと共に、Ｔ２細胞（２．１０５細胞／ウェル）を３７℃で１６時間インキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、ＰＥに結合している抗ＨＬＡ−Ａ２抗体で標識した（クローンＢＢ７．２、ＢＤ Ｐｈａｒｍａｇｅｎ）。
ＦＡＣＳ（Ｇｕａｖａ Ｅａｓｙ Ｃｙｔｅ）によって分析を実施した。各ペプチド濃度について、対象ペプチドに結合している標識の幾何平均をバックグラウンドノイズから差し引き、１００μＭの濃度の参照ペプチドＨＩＶ ｐｏｌ ５８９−５９７で得られたＨＬＡ−Ａ＊０２０２標識の幾何平均の割合として報告する。次いで、以下の通り相対親和性を求める：
相対親和性＝ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の発現の２０％を誘導する各ペプチドの濃度／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の発現の２０％を誘導する参照ペプチドの濃度。
Ａ２．ペプチドの可溶化
アミノ酸組成を考慮して各ペプチドを可溶化させた。システイン、メチオニン、又はトリプトファンをいずれも含まないペプチドについては、総体積の１０％になるまでＤＭＳＯを添加することが可能である。他のペプチドは、水又はＰＢＳ ｐＨ７．４に再懸濁させる。
Ｂ．結果
Ｔ２細胞の場合：可変ペプチド濃度についての平均蛍光強度：細菌ペプチドＩＬ１３ＲＡ２−ＢＬ（配列番号１３９）はＨＬＡ−Ａ ＊ ０２０１に結合するが、対応するヒトペプチドはＨＬＡ−Ａ＊０２０１に結合しない。細菌ペプチドＩＬ１３ＲＡ２−ＢＬ（配列番号１３９）はＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対して強い結合を示す、即ち、１００μＭでは最大ＨＩＶ ｐｏｌ ５８９−５９７結合活性の６９％、２５μＭでは９６％；６．２５μＭでは４３％。結果を図５にも示す。
実施例１５：細菌ペプチドＩＬ１３ＲＡ２−ＢＬ（配列番号１３９）によるマウスへのワクチン接種は、ＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγアッセイにおいて改善されたＴ細胞応答を誘導する。
Ａ．材料及び方法
Ａ．１ マウスモデル
２つの異なるマウスモデルを試験に使用した。使用したモデルの特徴を表２０に概説する。
これらのマウスは、いくつかの報告に記載されている（Ｋｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｒｍａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｂｅｔａ ２Ｍ，ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９０ Ｊｕｎ ８；２４８（４９６０）：１２２７−３０．Ｃｏｓｇｒｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｅｌｌ．１９９１ Ｓｅｐ ６；６６（５）：１０５１−６６；Ｐａｓｃｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＨＬＡ−Ａ２．１−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＤ８（＋）Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｂｅｔａ２ ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ｂｅｔａ２ｍ）ＨＬＡ−Ａ２．１ ｍｏｎｏｃｈａｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｈ−２Ｄｂ ｂｅｔａ２ｍ ｄｏｕｂｌｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９７ Ｊｕｎ １６；１８５（１２）：２０４３−５１）。
Ａ．２ 免疫感作スキーム
免疫感作スキームを図１に示す。マウスを共通のヘルパーペプチド（ｈ−ｐＡｇ）と組み合わせた特定のワクチン接種ペプチド（ｖａｃｃ−ｐＡｇ）で免疫した。
ペプチドは以下のように提供した。
・ｖａｃｃ−ｐＡｇ：ＩＬ１３ＲＡ２−ＢＬ；すべて４ｍｇ／ｍＬ（４ｍＭ）の濃度で製造、提供。
・ｈ−ｐＡｇ：ＨＨＤ−ＤＲ３ペプチド（配列番号３２）；β／Ａ２／ＤＲ３ ＨＨＤＤＲ３マウスの免疫感作のため、４ｍｇ／ｍＬ（４ｍＭ）の濃度で提供。
・ｈ−ｐＡｇ：ＵＣＰ２ペプチド（配列番号１５９）；β／Ａ２／ＤＲ１ ＨＨＤＤＲ１マウスの免疫感作のため、４ｍｇ／ｍＬ（４ｍＭ）の濃度で提供。
動物を０日目（ｄ０）に初回免疫注射で、ｄ１４に追加免疫注射で免疫した。各マウスの尾の付け根に、以下を含む油性エマルジョンを１００μＬ皮下注射した。
・１００μｇのｖａｃｃ−ｐＡｇ（マウス１頭当たり４ｍｇ／ｍＬストック２５μＬ）。
・１５０μｇのｈ−ｐＡｇ（マウス１頭当たり１０ｍｇ／ｍＬストック１５μＬ）。
・総容量が５０μＬになるようにＰＢＳを１０μＬ（マウス１頭当たり）。
・１：１（ｖ：ｖ）の比率（マウス１頭当たり５０μＬ）で添加される不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）。
以下のように、各ｖａｃｃ−ｐＡｇについて別々のエマルジョンを調製した：ＩＦＡ試薬を、１５ｍＬチューブ中のｖａｃｃ−ｐＡｇ／ｈ−ｐＡｇ／ＰＢＳ混合物に添加し、濃厚なエマルジョンを形成するまで１分間の反復サイクルでボルテックスで混合した。
Ａ．３ マウス解析
追加免疫注射の７日間後（即ち、ｄ２１）、動物を安楽死させ、脾臓を摘出した。脾細胞は、臓器を機械的に破砕した後、７０μｍフィルタリングＦｉｃｏｌｌ密度勾配精製することによって調製した。
脾細胞を直ちにＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγアッセイに使用した（表２１）。１ウェル当たり２×１０５総脾細胞を使用して、実験条件を４連で繰り返し、それらのＩＦＮγ分泌能を評価するために、ｖａｃｃ−ｐＡｇ（１０μＭ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、２．５μｇ／ｍＬ）、又は培地のみの存在下で培養した。市販のＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγキット（Ｄｉａｃｌｏｎｅ Ｋｉｔ Ｍｕｊｒｉｎｅ ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ）を製造会社の指示にしたがって使用し、アッセイは、約１６時間のインキュベーション後に実施した。
ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ５．４ソフトウェア（ＣＴＬ−Ｅｕｒｏｐｅ）とインターフェースをとったＧｒａｎｄ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓ６ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＵＶ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒでスポットを数えた。データプロッティング及び統計分析は、Ｐｒｉｓｍ−５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて行った。
結果を図６及び７に示す。結果は、ＩＬ１３ＲＡ２−ＢＬペプチド（配列番号１３９）でマウスを免疫することによって、マウスにおいてＩＬ１３ＲＡ２−ＢＬに対して、またＩＬ１３ＲＡ２−ＨＬ（配列番号１３１）に対しても脾細胞の強い応答が引き起こされることを示す。したがって、ＩＬ１３ＲＡ２−ＢＬは、強力に免疫原性であり、ヒトペプチドＩＬ１３ＲＡ２−ＨＬに対する有効な免疫応答をドライブすることができる。
実施例１６：マウスモデルにおける微生物叢配列変異体を同定する方法の検証
本発明は、共生細菌などの微生物叢から発現し、対象となる腫瘍特異的抗原に対する免疫応答を促すことができるペプチドの同定に関する。具体的には、この方法によって、腫瘍関連ペプチドの配列変異体であり、ヒトＭＨＣ（例えば、ＨＬＡ．Ａ２．０１）に結合することができる細菌ペプチドを同定することが可能になる。本明細書に記載の実施例は、本発明に係る方法によって、ＭＨＣ（例えば、ＨＬＡ．Ａ２）に対して強い結合親和性を有するエピトープの微生物叢配列変異体の同定が可能になり、エピトープの微生物叢配列変異体によるワクチン接種が、それぞれの参照エピトープに対する免疫原性を誘導することができるという証拠を与える。
理論に縛られるものではないが、本発明者らは、参照エピトープ（「自己由来」）によって胸腺選択中に特異的Ｔ細胞クローン疲弊が生じると推測する。更に、理論に縛られるものではないが、本発明者らは、免疫系が、共生細菌の細菌タンパク質／ペプチドでプライミングされている、及び／又は共生細菌の細菌タンパク質／ペプチドに対してより良好に反応する能力を有するとも推測する。
ヒト微生物叢から同定された細菌ペプチド及びヒト腫瘍から同定された腫瘍関連抗原のエピトープを使用して、ＭＨＣクラス１及びクラス２を発現するＨＬＡトランスジェニックマウス（ＨＨＤ ＤＲ３マウス）において上記インビボ実験を実施した。しかし、共生細菌の種は、ヒト及びマウスにおいて異なり、ヒト腫瘍特異的抗原のエピトープ配列は、マウスゲノムにおいて完全なホモログを常に有している訳ではない。したがって、ヒト腫瘍抗原のエピトープは、マウスにおいてより免疫原性の高い「非自己」配列を表す場合もあるが、ヒトでは免疫原性の低い「自己」配列を表す。
これを考慮して、本実施例では、マウス共生細菌タンパク質においてエピトープの微生物叢配列変異体を同定した。これらマウス微生物叢配列変異体は、野生型マウスにおいてマウス抗原のエピトープに対する免疫原性を惹起する。
１．マウスミクロビオームにおける細菌配列変異体の同定
マウスタンパク質のエピトープを同定するために、マウスのアノテーションの付いているタンパク質を参照配列として使用した。対象となる２つのマウス参照エピトープ、即ち、ＢＡＬＢ／ｃマウスについてはマウス遺伝子Ｐｈｔｆ１の「Ｈ２ Ｌｄ Ｍ５」（ＶＳＳＶＦＬＬＴＬ；配列番号１６０）及びＣ５７ＢＬ／６マウスについてはマウス遺伝子Ｓｔｒａ６の「Ｈ２ Ｄｂ Ｍ２」（ＩＮＭＬＶＧＡＩＭ；配列番号１６１）を選択した。Ｐｈｔｆ１は、マウス精巣で高発現するが、マウス組織の大部分でも低レベルで発現する、推定ホメオドメイン転写因子１をコードしている。Ｓｔｒａ６（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ６）は、マウス胎盤で高発現するが、マウスの卵巣、腎臓、脳、乳腺、腸、及び脂肪パッドでも中レベルで発現するタンパク質である、レチノールを取り込むための受容体をコードしている。
そのマウス微生物叢配列変異体を同定するために、マウス共生細菌微生物叢の配列決定用にＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスの糞便サンプルを回収した。回収後、ＩＨＭＳ手法（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ；ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ−ｓｔａｎｄａｒｄｓ．ｏｒｇ／＃ＳＯＰＳ）を使用して、微生物のＤＮＡを抽出した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＮｅｘｔＳｅｑ５００）技術を使用して配列決定を行い、マウスの腸遺伝子カタログを作成した。
ヒト腸ミクロビオームに関連する上記実施例と本質的に同じ同一性基準を使用して、上記マウス参照エピトープのマウス微生物叢配列変異体を同定した。具体的には、ヒト微生物叢及びヒト腫瘍関連エピトープに関連して上記実施例で使用した基準を再現するために、選択されたマウス参照ペプチドが様々なマウス臓器において低〜中レベルで発現し、中低レベルでマウスＭＨＣクラス１に結合する能力を有すると仮定して、マウス参照配列に対する分子ミミクリーに基づいて、ペプチドを更に選択した。
表２２は、インビボ研究用に選択された２種の細菌ペプチド候補を示す。
細菌ペプチドＨ２ Ｌｄ Ｂ５（配列番号１６２）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの微生物叢でみられるタンパク質の断片である。Ｈ２ Ｌｄ Ｂ５は、Ｐｈｔｆ１ペプチド（Ｈ２ Ｌｄ Ｍ５；配列番号１６０）の配列変異体である。
細菌ペプチドＨ２ Ｄｂ Ｂ２（配列番号１６３）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの微生物叢でみられるタンパク質の断片である。Ｈ２ Ｄｂ Ｂ２は、Ｓｔｒａ６ペプチド（Ｈ２ Ｄｂ Ｍ２；配列番号１６１）の配列変異体である。
２．細菌ペプチドＨ２ Ｌｄ Ｂ５（配列番号１６２）及びＨ２ Ｄｂ Ｂ２（配列番号１６３）は、マウスにおいて免疫原性を誘導し、マウスホモログペプチドに対して反応するＴ細胞を活性化させる
Ａ．材料及び方法
Ａ．１ マウスモデル
７週齢の健常雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１２）及び健常雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝１１）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。動物を個別に識別し、ＦＥＬＡＳＡのガイドラインに従って、ＳＰＦ健康状態で維持した。
Ａ．２ 免疫感作スキーム
免疫感作スキームを図１に示す。簡潔に述べると、表２３に示す通り、ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスを無作為に各マウス系統ごとに２つの実験群に割り当て、各群を共通のヘルパーペプチド（ＯＶＡ ３２３−３３９ペプチド；配列：ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ；配列番号１６４）及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と組み合わせた特定のワクチン接種ペプチド（ｖａｃｃ−ｐＡｇ）で免疫した。
ペプチドは以下のように提供した。
・ｖａｃｃ−ｐＡｇの対：Ｈ２ Ｌｄ Ｂ５及びＨ２ Ｄｂ Ｂ２；いずれも、４ｍｇ／ｍＬ（４ｍＭ）の濃度で製造、提供。
・ｈ−ｐＡｇ：ＯＶＡ ３２３−３３９（配列番号１６４）；４ｍｇ／ｍＬ（４ｍＭ）の濃度で提供。
動物を０日目（ｄ０）に初回免疫注射で、ｄ１４に追加免疫注射で免疫した。各マウスの尾の付け根に、以下を含む油性エマルジョンを１００μＬ皮下注射した。
・１００μｇのｖａｃｃ−ｐＡｇ（マウス１頭当たり４ｍｇ／ｍＬストック２５μＬ）。
・１５０μｇのｈ−ｐＡｇ（マウス１頭当たり１０ｍｇ／ｍＬストック１５μＬ）。
・総容量が５０μＬになるようにＰＢＳを１０μＬ（マウス１頭当たり）。
・１：１（ｖ：ｖ）の比率（マウス１頭当たり５０μＬ）で添加される不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）。
以下のように、各ｖａｃｃ−ｐＡｇについて別々のエマルジョンを調製した：ＩＦＡ試薬を、１５ｍＬチューブ中のｖａｃｃ−ｐＡｇ／ｈ−ｐＡｇ／ＰＢＳ混合物に添加し、濃厚なエマルジョンを形成するまで１分間の反復サイクルでボルテックスで混合した。
Ａ．３ マウス解析
追加免疫注射の７日間後（即ち、ｄ２１）、動物を安楽死させ、脾臓を摘出した。脾細胞は、臓器を機械的に破砕した後、７０μｍフィルタリングＦｉｃｏｌｌ密度勾配精製することによって調製した。脾臓重量、脾細胞数、及び生存率を直ちに評価した（表２４）。
脾細胞をＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγアッセイに使用した（表Ｘ）。１ウェル当たり２×１０５総脾細胞を使用して、実験条件を４連で繰り返し、それらのＩＦＮγ分泌能を評価するために、ｖａｃｃ−ｐＡｇ（１０μＭ）、マウスペプチドホモログ、ポジティブコントロール（１ｎｇ／ｍＬ １３−酢酸１２−ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）及び５００ｎｇ／ｍＬ イオノマイシン）、又は培地のみの存在下で培養した。
市販のＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγキット（Ｄｉａｃｌｏｎｅ Ｋｉｔ Ｍｕｊｒｉｎｅ ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ）を製造会社の指示にしたがって使用し、アッセイは、約１６時間のインキュベーション後に実施した。
ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ５．４ソフトウェア（ＣＴＬ−Ｅｕｒｏｐｅ）とインターフェースをとったＧｒａｎｄ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓ６ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＵＶ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒでスポットを数えた。データプロッティング及び統計分析は、Ｐｒｉｓｍ−５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて行った。
Ｂ．結果
結果を図８（Ｃ５７ＢＬ／６マウスの場合）及び９（ＢＡＬＢ／ｃマウスの場合）に示す。全体として、細菌ペプチドＨ２ Ｄｂ Ｂ２（配列番号１６３）及びＨ２ Ｌｄ Ｂ５（配列番号１６２）によるワクチン接種は、ＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγアッセイにおいて改善されたＴ細胞応答を誘導した。更に、細菌ペプチドＨ２ Ｄｂ Ｂ２及びＨ２ Ｌｄ Ｂ５によるワクチン接種は、それぞれ、マウス参照エピトープＨ２ Ｄｂ Ｍ２及びＨ２ Ｌｄ Ｍ５に対するＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγアッセイにおいても改善されたＴ細胞応答を誘導した。コントロールマウス（ＯＶＡ ３２３−３３９＋ＩＦＡによるワクチン接種）では、ＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγアッセイにおいて、細菌ペプチドＨ２ Ｄｂ Ｂ２及びＨ２ Ｌｄ Ｂ５によるエクスビボ刺激に応答して、Ｔ細胞応答の非特異的誘導は観察されなかった。
まとめると、これらの結果は、本明細書に記載の微生物叢配列変異体を同定する方法が、宿主参照ペプチドに対するＴ細胞の活性化を誘導する微生物叢配列変異体の同定にとって有効であるという実験的証拠を与える。
配列及び配列番号の表（配列表）：

Claims (58)

  1. 腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体の同定のための方法であって、以下の工程：
    （ｉ）目的の腫瘍関連抗原の選択、
    （ｉｉ）工程（ｉ）で選択した前記腫瘍関連抗原に含まれる少なくとも１つのエピトープの同定とその配列の決定、及び
    （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で同定された前記エピトープ配列の少なくとも１つの微生物叢配列変異体の同定
    を含むことを特徴とする方法。
  2. 工程（ｉｉｉ）が、
    − 工程（ｉｉ）で選択した前記エピトープ配列を１つ以上の微生物叢配列と比較すること、及び
    − 前記１つ以上の微生物叢配列が、前記エピトープ配列の１つ以上の微生物叢配列変異体を含むかどうかを特定すること
    を含む請求項１に記載の方法。
  3. 前記微生物叢配列変異体が、前記腫瘍関連抗原エピトープ配列と少なくとも５０％の配列同一性を共有する請求項１から２のいずれかに記載の方法。
  4. 前記微生物叢配列変異体が、ヒト微生物叢配列変異体であり、前記腫瘍関連抗原が、ヒト腫瘍関連抗原である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記微生物叢配列変異体が、細菌配列変異体、古細菌配列変異体、原生生物配列変異体、真菌配列変異体、及びウイルス配列変異体からなる群から選択される請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記微生物叢配列変異体が、細菌配列変異体又は古細菌配列変異体である請求項５に記載の方法。
  7. 前記微生物叢配列変異体が、腸の微生物叢の配列変異体である請求項１から６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記微生物叢配列変異体が、腸内細菌配列変異体である請求項７に記載の方法。
  9. 前記微生物叢配列変異体が、ペプチドである請求項１から８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記ペプチドが、８個〜１２個のアミノ酸、好ましくは８個〜１０個のアミノ酸、最も好ましくは９個又は１０個のアミノ酸の長さを有する請求項９に記載の方法。
  11. 前記微生物叢配列変異体が、前記腫瘍関連抗原エピトープ配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％の配列同一性を共有する請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
  12. 前記微生物叢配列変異体のコア配列が、前記腫瘍関連抗原エピトープ配列のコア配列と同一であり、前記コア配列が、３個の最もＮ末端側及び３個の最もＣ末端側のアミノ酸以外のすべてのアミノ酸からなる請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
  13. 工程（ｉｉ）で同定された前記腫瘍関連抗原エピトープが、ＭＨＣＩに結合できる請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
  14. 工程（ｉｉｉ）の前記微生物叢配列変異体が、微生物叢データベースに基づいて同定される請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
  15. 前記微生物叢データベースが、複数の個体の微生物叢データを含む請求項１４に記載の方法。
  16. 前記微生物叢データベースが、単一個体の微生物叢データを含むが、複数の個体の微生物叢データは含まない請求項１４に記載の方法。
  17. 工程（ｉｉｉ）が、以下のサブ工程：
    （ｉｉｉ−ａ）任意に、単一又は複数の個体のサンプル（ａ）から微生物叢のタンパク質配列又は核酸配列を同定すること、
    （ｉｉｉ−ｂ）単一又は複数の個体の微生物叢のタンパク質配列又は核酸配列を含むデータベースを編集すること、
    （ｉｉｉ−ｃ）工程（ｉｉｉ−ｂ）で編集されたデータベース内で、工程（ｉｉ）で同定された前記エピトープ配列の少なくとも１つの微生物叢配列変異体を同定すること
    を含む請求項１４から１６のいずれかに記載の方法。
  18. 工程（ｉｉｉ−ａ）の前記サンプルが、糞便サンプルである請求項１７に記載の方法。
  19. 以下の工程：
    （ｉｖ）前記少なくとも１つの微生物叢配列変異体のＭＨＣ分子、特にＭＨＣ Ｉ分子への結合を試験し、結合親和性を得る工程
    を更に含む請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
  20. 工程（ｉｖ）が、ＭＨＣ分子、特に、ＭＨＣ Ｉ分子に対する（それぞれの参照）エピトープの結合を試験し、結合親和性を得ることを更に含む請求項１９に記載の方法。
  21. 工程（ｉｖ）が、前記微生物叢配列変異体及び前記それぞれの参照エピトープについて得られた前記結合親和性の比較と、ＭＨＣに対してそれぞれの参照エピトープよりも高い結合親和性を有する微生物叢配列変異体の選択とを更に含む請求項２０に記載の方法。
  22. 以下の工程：
    （ｖ）前記微生物叢配列変異体を含む微生物叢タンパク質の細胞局在を決定する工程
    を更に含む請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
  23. 工程（ｖ）が、好ましくは細胞局在を決定する前に、微生物叢配列変異体を含む微生物叢タンパク質の配列を特定することを更に含む請求項２２に記載の方法。
  24. 工程（ｉｖ）及び工程（ｖ）を含む請求項１９から２３のいずれかに記載の方法。
  25. 工程（ｖ）が工程（ｉｖ）の後に行われるか又は工程（ｉｖ）が工程（ｖ）の後に行われる請求項２４に記載の方法。
  26. 以下の工程：
    （ｖｉ）前記微生物叢配列変異体の免疫原性を試験する工程
    を更に含む請求項１から２５のいずれかに記載の方法。
  27. 以下の工程：
    （ｖｉｉ）前記微生物叢配列変異体の細胞傷害性を試験する工程
    を更に含む請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
  28. 前記腫瘍関連抗原エピトープ配列が、配列番号１〜５、５５〜６５、及び１２６〜１３１のいずれか１つに示される配列である請求項１から２８のいずれかに記載の方法。
  29. 前記腫瘍関連抗原エピトープ配列が、配列番号１に示される配列である請求項２９に記載の方法。
  30. 好ましくは請求項１から２９のいずれかに記載の方法によって得ることができることを特徴とする腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体。
  31. 前記微生物叢配列変異体が、好ましくは８個〜１２個のアミノ酸、より好ましくは８個〜１０個のアミノ酸、最も好ましくは９個又は１０個のアミノ酸の長さを有する（細菌）ペプチドである請求項３０に記載の微生物叢配列変異体。
  32. 前記微生物叢配列変異体が、前記腫瘍関連抗原エピトープ配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％の配列同一性を共有する、及び／又は前記微生物叢配列変異体のコア配列が、前記腫瘍関連抗原エピトープ配列のコア配列と同一であり、前記コア配列が、３個の最もＮ末端側及び３個の最もＣ末端側のアミノ酸以外のすべてのアミノ酸からなる請求項３１のいずれかに記載の微生物叢配列変異体。
  33. 前記微生物叢配列変異体が、配列番号６〜１８のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含むか又はからなる、好ましくは、前記微生物叢配列変異体が、配列番号６又は１８に係るアミノ酸配列を含むか又はからなる、より好ましくは、前記微生物叢配列変異体が、配列番号１８に係るアミノ酸配列を含むか又はからなる請求項３１から３２のいずれかに記載の微生物叢配列変異体。
  34. 前記微生物叢配列変異体が、配列番号６６〜８４及び１２６のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含むか又はからなり、好ましくは、前記微生物叢配列変異体が、配列番号７５に係るアミノ酸配列を含むか又はからなる請求項３１から３２のいずれかに記載の微生物叢配列変異体。
  35. 前記微生物叢配列変異体が、配列番号１３２〜１４１及び１５８のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含むか又はからなり、好ましくは、前記微生物叢配列変異体が、配列番号１３９に係るアミノ酸配列を含むか又はからなる請求項３１から３２のいずれかに記載の微生物叢配列変異体。
  36. 好ましくは癌の予防及び／又は治療のための医薬を調製するための方法であって、以下の工程：
    （ａ）請求項１から２９のいずれかに記載の方法に係る腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体の同定；及び
    （ｂ）前記微生物叢配列変異体を含む医薬の調製
    を含むことを特徴とする方法。
  37. 前記医薬がワクチンである請求項３６に記載の方法。
  38. 工程（ｂ）が、前記微生物叢配列変異体をナノ粒子にロードすることを含む請求項３６から３７のいずれかに記載の方法。
  39. 工程（ｂ）が、アジュバントを前記ナノ粒子にロードすることを更に含む請求項３８に記載の方法。
  40. 工程（ｂ）が、前記微生物叢配列変異体を細菌細胞にロードすることを含む請求項３６から３７のいずれかに記載の方法。
  41. 工程（ｂ）が、前記微生物叢配列変異体（を含む／コードする核酸分子）で細菌細胞の形質転換の工程を含む請求項４０に記載の方法。
  42. 工程（ｂ）が、医薬組成物の調製を含み、前記医薬組成物が、
    （ｉ）前記微生物叢配列変異体；
    （ｉｉ）前記微生物叢配列変異体を含む組換えタンパク質；
    （ｉｉｉ）前記微生物叢配列変異体を含む免疫原性化合物；
    （ｉｖ）前記微生物叢配列変異体をロードしたナノ粒子；
    （ｖ）前記微生物叢配列変異体をロードした抗原提示細胞；
    （ｖｉ）前記微生物叢配列変異体を発現する宿主細胞；又は
    （ｖｉｉ）前記微生物叢配列変異体をコードする核酸分子；及び
    任意に、薬学的に許容される担体及び／又はアジュバント
    を含む請求項３６から４１のいずれかに記載の方法。
  43. 好ましくは請求項３６から４２のいずれかに記載の方法によって得ることができる、請求項３０から３５のいずれかに記載の微生物叢配列変異体を含むことを特徴とする医薬。
  44. 請求項３０から３５のいずれかに記載の微生物叢配列変異体がロードされたナノ粒子を含む請求項４３に記載の医薬。
  45. 前記ナノ粒子にアジュバントが更にロードされている請求項４４に記載の医薬。
  46. 請求項３０から３５のいずれかに記載の微生物叢配列変異体を発現する細菌細胞を含む請求項４３に記載の医薬。
  47. （ｉ）前記微生物叢配列変異体；
    （ｉｉ）前記微生物叢配列変異体を含む組換えタンパク質；
    （ｉｉｉ）前記微生物叢配列変異体を含む免疫原性化合物；
    （ｉｖ）前記微生物叢配列変異体をロードしたナノ粒子；
    （ｖ）前記微生物叢配列変異体をロードした抗原提示細胞；
    （ｖｉ）前記微生物叢配列変異体を発現する宿主細胞；又は
    （ｖｉｉ）前記微生物叢配列変異体をコードする核酸分子；及び
    任意に、薬学的に許容される担体及び／又はアジュバント
    を含む請求項４３に記載の医薬。
  48. ワクチンである請求項４３から４７のいずれかに記載の医薬。
  49. 癌の予防及び／又は治療において使用するための請求項４３から４８のいずれかに記載の医薬。
  50. 抗癌剤、好ましくは免疫チェックポイント調節剤と組み合わせて投与される請求項４９に記載の医薬。
  51. 癌を予防及び／若しくは治療する方法、又はそれを必要とする被験体における抗腫瘍応答を開始させる、増強する、若しくは延長する方法であって、請求項４３から４８のいずれかに記載の医薬を前記被験体に投与することを含むことを特徴とする方法。
  52. 前記医薬が、抗癌剤、好ましくは免疫チェックポイント調節剤と組み合わせて投与される請求項５１に記載の方法。
  53. 請求項３０から３５のいずれかに記載の腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体が個体中に存在するかどうかを判定するための（インビトロにおける）方法であって、請求項３０から３５のいずれかに記載の腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体が前記個体の（単離された）サンプル中に存在するかどうかを判定する工程を含むことを特徴とする（インビトロにおける）方法。
  54. 前記（単離された）サンプルが、糞便サンプル又は血液サンプルである請求項５３に記載の方法。
  55. 前記腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体が、請求項１から２９のいずれかに記載の方法によって得られる請求項５３から５４のいずれかに記載の方法。
  56. − 好ましくは請求項５３から５５のいずれかに記載の方法に従って、前記被験体に投与される前記医薬に含まれる前記腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体が前記被験体中に存在するかどうかを判定する工程
    を更に含む請求項５１から５２のいずれかに記載の癌を予防及び／若しくは治療する方法、又は抗腫瘍応答を開始させる、増強する、若しくは延長する方法。
  57. 投与される前記医薬に含まれる前記腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体が、前記被験体中に存在する請求項５１から５２のいずれかに記載の癌を予防及び／若しくは治療する方法、又は抗腫瘍応答を開始させる、増強する、若しくは延長する方法。
  58. 投与される前記医薬に含まれる前記腫瘍関連抗原エピトープ配列の微生物叢配列変異体が、前記被験体中に存在しない請求項５１から５２のいずれかに記載の癌を予防及び／若しくは治療する方法、又は抗腫瘍応答を開始させる、増強する、若しくは延長する方法。
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