CN111201032A - 肿瘤相关抗原表位的小型生物群序列变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及癌症免疫疗法，特别涉及肿瘤相关抗原表位序列的序列变体。即，本发明提供了一种鉴定肿瘤相关抗原表位序列的小型生物群序列变体的方法。这种小型生物群序列变体可用于制备抗癌药物，因为它们与自身抗原不同，并且因此它们可引起强烈的免疫应答。因此，提供了包含小型生物群序列变体的药物，制备这些药物的方法和这些药物的用途。

Description

肿瘤相关抗原表位的小型生物群序列变体
技术领域
本发明涉及癌症免疫疗法领域，具体地涉及鉴定人微生物组中人肿瘤相关抗原的表位的细菌序列变体的方法。本发明还涉及提供包括人微生物组的这类细菌序列变体的疫苗的方法，并且涉及这类疫苗。而且，本发明还提供了用这类疫苗治疗人类个体的方法。
背景技术
癌症是全世界死亡的主要原因之一。根据世界卫生组织，仅在2012年，全世界报告了1400万新病例和820万癌症相关死亡，预计未来二十年内新癌症病例的数量将增加约70％。到目前为止，全球每年新增病例的60％以上发生在非洲、亚洲和中南美洲。这些地区也占世界癌症死亡的70％。在男性中，五个最常见的癌症部位是肺、前列腺、结肠直肠、胃和肝；而在女性中，五个最常见的癌症部位是乳房、结肠直肠、肺、子宫颈和胃。
癌症长期以来利用手术、放射疗法、细胞毒性化学疗法和内分泌操作来管理，其通常按顺序组合以便最好地控制疾病。然而，这些标准疗法的真实功效的主要限制是它们的不精确特异性，其导致治疗引起的正常组织的附带损害、低治愈率和内在抗药性。
在过去的几年中，癌症疗法的发展有了巨大的增长，这主要由于肿瘤和正常细胞表达型分析的巨大进步，并且，免疫疗法或分子靶向疗法的最近研究和首次临床结果已经开始改变我们对这种疾病的认知能力。
有希望的抗癌免疫疗法现已成为现实，并且宿主免疫系统能够识别肿瘤抗原的证据已导致抗癌药物的发展，其现已获得美国食品药品管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)等监管机构的批准。各种治疗方法包括离体扩展的肿瘤浸润淋巴细胞的过继转移、癌细胞疫苗、免疫刺激细胞因子及其变体、模式识别受体(PRR)激动剂、和靶向肿瘤抗原或免疫检查点的免疫调节单克隆抗体等(Galuzzi L.et al.，Classification of currentanticancer immunotherapies.Oncotarget.2014 Dec 30；5(24):12472-508)。
不幸地，显著比例的患者仍然可以对这些免疫疗法中的一些存在内在抗性，或甚至在治疗过程中获得抗性。例如，据报道，抗-CTLA-4抗体伊匹单抗(Ipilumumab)在不可切除或转移性黑色素瘤中的三年生存率为约20％(Snyder et al.，Genetic basis forclinical response to CTLA-4 blockade in melanoma.N Engl J Med.2014 Dec 4；371(23):2189-2199；Schadendorf D et al..Pooled Analysis of Long-Term SurvivalData from Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable orMetastatic Melanoma.J Clin Oncol.2015 Jun 10；33(17):1889-94)，同时，据报道，另一种检查点抑制剂，靶向PD1的纳武单抗的三年生存率在肾细胞癌(RCC)中为44％，和在NSCLC中为18％(McDermottet al.，Survival，Durable Response，and Long-Term Safety inPatients With Previously Treated Advanced Renal Cell Carcinoma ReceivingNivolumab.J Clin Oncol.2015 Jun 20；33(18):2013-20；Gettingeret al.,OverallSurvival and Long-Term Safety of Nivolumab(Anti-Programmed Death 1 Antibody，BMS-936558，ONO-4538)in Patients With Previously Treated Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer.J Clin Oncol.2015 Jun 20；33(18):2004-12)。
因此，基础耐药性代表了这些免疫疗法功效的固定障碍。因此很清楚，需要一种不同的癌症治疗途径来打破这种障碍。
在用这些免疫疗法治疗的大量受试者中没有应答可能与缺乏的抗肿瘤免疫应答相关(如通过APC的抗原呈递或通过T细胞的抗原识别中的缺陷)。换句话说，对免疫疗法的阳性应答与免疫系统发展能够识别人癌细胞表达的MHC I类限制性抗原的特异性淋巴细胞亚群的能力相关(Kvistborget al.，Human cancer regression antigens.Curr OpinImmunol.2013 Apr；25(2):284-90)。
证明对肿瘤浸润性淋巴细胞过继转移的应答与转移至患者的CD8+T细胞的数量直接相关的数据强有力地支持该假设(Besser et al.,Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in patients with metastatic melanoma：intent-to-treatanalysis and efficacy after failure to prior immunotherapies.Clin CancerRes.2013 Sep 1；19(17):4792-800)。
因此，有效的抗肿瘤应答将取决于免疫反应性肽的呈递和足够数量的“训练”以识别这些抗原的反应性细胞的存在。
基于肿瘤抗原的疫苗接种代表了癌症疗法的独特方法，该癌症疗法因为其可以征募患者自身的免疫系统以特异性且持久的方式识别、攻击和破坏肿瘤而获得了相当大的兴趣。实际上已知肿瘤细胞表达大量易被免疫系统识别的肽抗原。因此，基于这些抗原的疫苗不仅提供了提高患者总体存活率的好机会，而且由于肿瘤抗原的低毒性和低分子量，还提供了监测免疫应答和制备GMP级产品的好机会。肿瘤抗原的实例包括由正常沉默基因或过表达基因转录的蛋白质的副产物和由肿瘤病毒表达的蛋白质的副产物(Kvistborg etal.,Curr Opin Immunol.2013 Apr；25(2):284-90)以及由细胞蛋白质的点突变引起的新抗原等。后者特别令人感兴趣，因为已经显示它们与用CTLA4抑制剂治疗的患者的总体存活率的增加直接相关(Snyder et al.,Genetic basis for clinical response to CTLA-4blockade in melanoma.N Engl J Med.2014 Dec 4；371(23):2189-2199；Brown et al.，Neo-antigens predicted by tumor genome meta-analysis correlate with increasedpatient survival.Genome Res.2014 May；24(5):743-50)。
然而，大多数肿瘤相关抗原(TAA)和肿瘤特异性抗原(TSA)是(现有的)人蛋白质，并且因此被认为是自身抗原。在胸腺选择过程中，以足够的亲和力识别肽/自身MHC复合物的T细胞克隆地耗尽。通过提供针对自身免疫疾病的保护，这种T细胞所有组成成分(repertoire)选择的机制还降低了针对肿瘤相关抗原(TAA)和肿瘤特异性抗原(TSA)发展免疫力的可能性。这通过癌症反应性TCR通常具有弱亲和力的事实来例证。此外，到目前为止，大多数用对MHC具有高结合亲和力的选择的肿瘤相关抗原(TAA)和肿瘤特异性抗原(TSA)进行的疫苗试验尚未显示出引起强烈的免疫力，这可能反映了胸腺选择的结果。
因此，可以开发癌症疫苗的人肿瘤抗原的数量是有限的。此外，衍生自突变或修饰的自身蛋白的抗原可以诱导免疫耐受和/或不希望的自身免疫副作用。
因此，本领域需要鉴定可选的癌症治疗剂，其可以克服该领域中遇到的限制，特别是对目前可获得的免疫疗法的抗性。
鉴于上述情况，本发明的目的是克服上述概括的当前癌症免疫疗法的缺点，并提供鉴定人肿瘤相关抗原的表位的序列变体的方法。特别是，本发明的目的是提供鉴定人微生物组中细菌蛋白的方法，该细菌蛋白是肿瘤相关抗原表位的序列变体的来源。而且，本发明的一个目的是提供鉴定可由特异性MHC分子呈递的来自这些细菌蛋白的肽的方法。
这些目的通过下面和所附权利要求中提出的主题实现。
尽管下面详细描述了本发明，但应理解本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限制。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与具体实施方式一起列出，然而，应该理解，它们可以以任何方式和任何数目组合以产生另外的实施方式。不应将各种描述的实例和优选实施方式解释为将本发明仅限于明确描述的实施方式。该描述应被理解为支持和包含将明确描述的实施方式与任何数量的公开和/或优选要素组合的实施方式。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中的所有描述的要素的任何排列和组合应该被认为是由本申请的说明书公开的。
在整个说明书和所附权利要求中，除非上下文另有要求，否则术语“包括(comprise)”和诸如“包括(comprises、comprising)”的变体将被理解为暗示包括叙述的成员、整数或步骤，但不排除任何其他未叙述的成员、整数或步骤。术语“由……组成”是术语“包括”的特定实施方式，其中排除任何其他未叙述的成员、整数或步骤。在本发明的上下文中，术语“包括”包含术语“由……组成”。因此，术语“包括”涵盖“包含(include)”以及“由……组成”，如，“包括”X的组合物可以仅由X组成，或者可以包含另外的一些，如X+Y。
除非在本文中另有说明或明显与上下文相矛盾，否则在描述本发明的上下文中使用的术语“一(a、an)”和“该”以及类似的参考(特别是在权利要求的上下文中)应被解释为涵盖单数和复数。本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值被并入说明书中，如同其在本文中单独陈述一样。说明书中的任何语言都不应被解释为指示对于本发明的实践必不可少的任何未要求保护的要素。
词语“基本上地”不排除“完全地”，如，“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，可以从本发明的定义中省略词语“基本上”。
与数值x相关的术语“约”表示x±10％。
用于鉴定肿瘤相关抗原表位的细菌序列变体的方法
本发明基于以下令人惊讶的发现：在人微生物组中发现的细菌蛋白含有肽，其是人肿瘤相关抗原的表位的序列变体。因此，本发明人在人微生物组中发现了人肿瘤相关表位的“表位模拟(mimicry)”。有趣的是，这种表位模拟提供了绕过由于识别自身抗原的T细胞的克隆耗尽导致的人T细胞的所有组成成分限制的可能方法。特别地，不同于自身抗原但与自身抗原共享序列相似性的抗原/表位，(i)由于T细胞受体的交叉反应性仍然可以被识别(参见，例如，Degauque et al.，Cross-Reactivity of TCR Repertoire：CurrentConcepts，Challenges，and Implication for Allotransplantation.Frontiers inImmunology.2016；7:89.doi:10.3389/fimmu.2016.00089；Nelson et al.，T cellreceptor cross-reactivity between similar foreign and self peptidesinfluences naive cell population size and autoimmunity.Immunity.2015 Jan 20；42(1):95-107)；(ii)预期这样的抗原/表位被在T细胞培养过程中尚未耗尽的T细胞/TCR识别。因此，这样的抗原/表位能够引发强烈的免疫应答，导致与自身抗原具有潜在的交叉反应性的T细胞的克隆扩展。目前提出这种机制来解释部分自身免疫疾病。
人微生物组——由数千种不同的细菌物种组成——是遗传多样性和潜在抗原成分的重要来源。肠道可以被认为是与小型生物群接触和交换的最大区域。因此，肠道是体内最大的免疫器官。人肠道上皮中的特化和胸腺外T细胞成熟到目前已知十多年了。肠道含有大量免疫细胞，其可识别我们的小型生物群，并由监管机制严格控制。
根据本发明，存在于肠道中的细菌物种的大的所有组成成分提供了令人难以置信的抗原来源，该抗原与人肿瘤抗原具有潜在的相似性。这些抗原在复杂环境中呈递给特化的细胞，伴有大量共信号作为TLR激活剂递送给免疫细胞。结果，小型生物群可能引发完整的功能应答并驱动大T记忆亚群的成熟，或者一些时间导致完全克隆耗尽或衰竭。鉴定与人肿瘤抗原共享相似性的细菌成分将为选择肿瘤相关抗原表位提供新的来源，其(i)克服了T细胞耗尽的问题，并且(ii)应当已经“引发”了肠道中的免疫系统，由此与其他来源的抗原和人工突变的抗原/表位相比，提供更强的免疫应答。
在第一方面，本发明提供了用于鉴定肿瘤相关抗原表位序列的小型生物群序列变体的方法，该方法包括下面的步骤：
(i)选择感兴趣的肿瘤相关抗原，
(ii)鉴定步骤(i)中选择的肿瘤相关抗原中包括的至少一个表位并且测定其序列，和
(iii)鉴定步骤(ii)中鉴定的表位序列的至少一种小型生物群序列变体。
此外，本发明还特别提供了用于鉴定肿瘤相关抗原表位的小型生物群序列变体的方法，该方法包括下面的步骤：
(1)比较小型生物群序列与肿瘤相关抗原表位的序列，并鉴定肿瘤相关抗原表位的小型生物群序列变体；和
(2)任选地，确定包括肿瘤相关抗原表位的肿瘤相关抗原，其中在步骤(1)中针对肿瘤相关抗原表位鉴定小型生物群序列变体。
如本文所用，术语“小型生物群序列变体”和“肿瘤相关抗原表位序列”(也称为“表位序列”)是指(i)(多)肽序列和(ii)核酸序列。因此，“小型生物群序列变体”可以是(i)(多)肽或(ii)核酸分子。因此，“肿瘤相关抗原表位序列”(也称为“表位序列”)可以是(i)(多)肽或(ii)核酸分子。优选地，小型生物群序列变体是(多)肽。因此，还优选的是肿瘤相关抗原表位序列(也称为“表位序列”)是(多)肽。
与本文中可指肽或核酸水平的术语“表位序列”相反，如本文所用，术语“表位”特别是指肽。如本文所用，“表位”(也称为“抗原决定簇”)是被免疫系统特别是抗体、T细胞受体和/或B细胞受体识别的抗原的部分(或片段)。因此，一种抗原具有至少一个表位，即单个抗原具有一个或多个表位。“抗原”通常用作适应性免疫应答受体的靶标，特别是作为抗体、T细胞受体和/或B细胞受体的靶标。抗原可以是(i)肽、多肽、或者蛋白质，(ii)多糖，(iii)脂质，(iv)脂蛋白或脂肽，(v)糖脂，(vi)核酸，或(vii)小分子药物或毒素。因此，抗原可以是肽、蛋白质、多糖、脂质、包括脂蛋白和糖脂的其组合、核酸(例如DNA、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、诱饵DNA、质粒)或小分子药物(如，环孢菌素A、紫杉醇、多柔比星、甲氨蝶呤、5-氨基乙酰丙酸)或其任何组合。在本发明的上下文中，抗原通常选自(i)肽、多肽或蛋白质，(ii)脂蛋白或脂肽和(iii)糖蛋白或糖肽；更优选地，抗原是肽、多肽或蛋白质。
术语“肿瘤相关抗原”(也称为“肿瘤抗原”)是指在肿瘤细胞中产生的抗原，并且包括肿瘤相关抗原(TAA)和肿瘤特异性抗原(TSA)。根据经典定义，肿瘤特异性抗原(TSA)是仅存在于肿瘤细胞中/上而不存在于任何其他细胞中/上的抗原，而肿瘤相关抗原(TAA)是存在于肿瘤细胞和非肿瘤细胞(“正常”细胞)中/上的抗原。肿瘤相关抗原通常对某种癌症/肿瘤具有特异性(或与之相关)。
在本发明的上下文中，即贯穿本申请，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”和这些术语的变体是指包含至少两个氨基酸的肽、寡肽、多肽或蛋白质，至少两个氨基酸优选地通过正常肽键彼此连接，或者可选地通过修饰的肽键彼此连接——例如在等构肽的情况下。特别地，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”还包括“肽模拟物”，其定义为含有非肽结构元件的肽类似物，该肽能够模拟或拮抗天然亲本肽的生物作用(一种或多种)。肽模拟物缺乏经典肽特性，诸如酶促可裂变的肽键。特别地，除了遗传密码所定义的20种氨基酸之外，肽、多肽或蛋白质还可以包含遗传密码所定义的20种氨基酸之外的氨基酸，或者它可以由遗传密码所定义的20种氨基酸之外的氨基酸组成。特别地，本发明上下文中的肽、多肽或蛋白质同样可以由通过天然过程(诸如，翻译后成熟过程)或通过化学过程修饰的氨基酸组成，这些是本领域技术人员公知的。这些修饰在文献中有详细说明。这些修饰可出现在多肽的任何位置：肽骨架中、氨基酸链中或甚至羧基或氨基末端处。特别地，肽或多肽可以在泛素化后分支或在有或没有支化的情况下是环状的。这种类型的修饰可以是本领域技术人员熟知的天然或合成翻译后过程的结果。在本发明的上下文中，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”特别还包括修饰的肽、多肽和蛋白质。例如，肽、多肽或蛋白质修饰可包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价固定、脂质或脂质衍生物的共价固定、磷脂酰肌醇的共价固定、共价或非共价交联、环化、二硫键形成、去甲基化、包括PEG化的糖基化、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解过程、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、庚烯酸化、硫酸化，氨基酸加成(诸如，精氨酸化)或泛素化。这些修饰在文献中有详细说明(Proteins Structure andMolecular Properties(1993)2nd Ed.，T.E.Creighton，New York；Post-translationalCovalent Modifications of Proteins(1983)B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，NewYork；Seifter et al.(1990)Analysis for protein modifications and nonproteincofactors，Meth.Enzymol.182：626-646 and Rattan et al.，(1992)Protein Synthesis：Post-translational Modifications and Aging，Ann NY Acad Sci，663：48-62)。因此，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”优选包括例如脂肽、脂蛋白、糖肽、糖蛋白等。
在一个特别优选的实施方式中，根据本发明的小型生物群序列变体是“经典”(多)肽，而“经典”(多)肽通常由通过正常的肽键相互连接的选自通过遗传密码定义的20种氨基酸的氨基酸组成。
核酸优选包含单链、双链或部分双链核酸，优选地选自基因组DNA、cDNA、RNA、siRNA、反义DNA、反义RNA、核酶、互补RNA/DNA序列——具有或不具有表达元件、小基因、基因片段、调节元件、启动子、及其组合。核酸(分子)和/或多核苷酸的进一步优选的实例包括如重组多核苷酸、载体、寡核苷酸、RNA分子(诸如，rRNA、mRNA或tRNA)、或如上所述的DNA分子。因此，优选的是核酸(分子)是DNA分子或RNA分子；优选地，选自基因组DNA；cDNA；rRNA；mRNA；反义DNA；反义RNA；互补RNA和/或DNA序列；具有或不具有表达元件、调节元件和/或启动子的RNA和/或DNA序列；载体；及其组合。
因此，术语“小型生物群序列变体”是指小型生物群中发现的核酸序列或(多)肽序列，即小型生物群起源的(一旦该序列在小型生物群中鉴定，它通常也可以通过本领域熟知的重组措施获得)。“小型生物群序列变体”可以指小型生物群中发现的完整(多)肽或核酸，或优选地，(完整的)小型生物群(多)肽/蛋白质或核酸分子的片段，其长度为至少5个氨基酸(15个核苷酸)，优选至少6个氨基酸(18个核苷酸)，更优选至少7个氨基酸(21个核苷酸)，和甚至更优选至少8个氨基酸(24个核苷酸)。还优选地，小型生物群序列变体具有不大于50个氨基酸，更优选地不大于40个氨基酸，甚至更优选地不大于30个氨基酸和最优选地不大于25个氨基酸的长度。因此，小型生物群序列变体优选地具有5-50个氨基酸，更优选地6-40个氨基酸，甚至更优选地7-30个氨基酸和最优选地8-25个氨基酸，例如8-24个氨基酸的长度。例如，“小型生物群序列变体”可以是小型生物群蛋白质/核酸分子的片段，该片段长度为9或10个氨基酸(27或30个核苷酸)。优选地，小型生物群序列变体是如上所述的小型生物群蛋白的片段。特别优选地，小型生物群序列变体的长度为8-12个氨基酸(作为肽；对应于作为核酸分子的24-36个核苷酸)，更优选地，小型生物群序列变体的长度为8-10个氨基酸(作为肽；对应于作为核酸分子的24-30个核苷酸)，最优选地小型生物群序列变体的长度为9或10个氨基酸(作为肽；对应于作为核酸分子的27或30个核苷酸)。具有这样长度的肽可以结合MHC(主要组织相容性复合物)I类(MHC I)，其对于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答是至关重要的。还优选的是，小型生物群序列变体的长度为13-24个氨基酸(作为肽；对应于作为核酸分子的39-72个核苷酸)。具有这种长度的肽可以结合MHC(主要组织相容性复合物)II类(MHC II)，其对于CD4+T细胞(T辅助细胞)应答是至关重要的。
如本文所用，术语“小型生物群”是指迄今为止从植物到动物研究的所有多细胞生物体中和上发现的共栖、共生和病原微生物。特别是，小型生物群已被发现对其宿主的免疫、激素和代谢稳态至关重要。小型生物群包括细菌、古细菌、原生生物、真菌和病毒。因此，小型生物群序列变体优选地选自细菌序列变体、古细菌序列变体、原生生物序列变体、真菌序列变体和病毒序列变体。更优选地，小型生物群序列变体是细菌序列变体或古细菌序列变体。最优选地，小型生物群序列变体是细菌序列变体。
解剖学上，小型生物群位于许多组织和生物流体中的任一之上或内，其包括皮肤、结膜、乳腺、阴道、胎盘、精液、子宫、卵巢卵泡、肺、唾液、口腔(特别是口腔粘膜)和胃肠道，特别是肠道。在本发明的上下文中，小型生物群序列变体优选地是胃肠道的小型生物群(驻留在胃肠道中的微生物)的序列变体，更优选地是肠道的小型生物群(驻留在肠道中的微生物)的序列变体。因此，最优选的是，小型生物群序列变体是肠道细菌序列变体(即，驻留在肠道中的细菌的序列变体)。
虽然小型生物群可以在许多多细胞生物体中和上发现(迄今为止从植物到动物所研究的所有多细胞生物体)，但在哺乳动物中和哺乳动物上发现的小型生物群是优选的。本发明考虑的哺乳动物包括例如人，灵长类动物，家养动物例如牛、绵羊、猪、马，实验室啮齿动物等。在人中和人上发现的小型生物群是最优选的。这种小型生物群在本文中称为“哺乳动物小型生物群”或“人小型生物群”(其中术语哺乳动物/人特指小型生物群的定位/驻留)。优选地，肿瘤相关抗原表位属于同一物种，(小型生物群序列变体的)小型生物群在其中/上驻留。优选地，小型生物群序列变体是人小型生物群序列变体。因此，优选的是，肿瘤相关抗原是人肿瘤相关抗原。
通常，如本文所用，即在整个本申请中，术语“序列变体”是指与参考序列相似(特别是指至少50％的序列同一性，见下文)，但不是(100％)同一的序列。因此，序列变体与参考序列相比包含至少一个改变。即，与其参考序列——其是“肿瘤相关抗原表位序列”——相比，“小型生物群序列变体”是相似的，但包含至少一个改变。因此，还将小型生物群序列变体称为“肿瘤相关抗原表位序列的小型生物群序列变体”。换句话说，“小型生物群序列变体”是小型生物群序列(小型生物群起源的序列)，它是肿瘤相关抗原表位序列的序列变体。也就是说，“小型生物群序列变体”是小型生物群序列(小型生物群起源的序列)，其与肿瘤相关抗原表位序列相比是相似的，但包含至少一个改变。因此，“小型生物群序列变体”是小型生物群序列(而不是小型生物群序列的序列变体——其不是小型生物群序列)。通常，序列变体(即，小型生物群序列)，特别是在序列的整个长度上，与参考序列(肿瘤相关抗原表位序列)共享至少50％序列同一性，由此序列同一性可以如下所述计算。优选地，序列变体，特别是在序列的整个长度上，与参考序列共享至少60％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、更优选至少90％、特别优选至少95％、最优选至少99％的序列同一性。因此，优选的是，小型生物群序列变体与肿瘤相关抗原表位序列共享至少60％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、还更优选至少90％、特别优选至少95％、最优选至少99％序列同一性。特别优选地，小型生物群序列变体不同于肿瘤相关抗原表位序列，仅在于一个、两个或三个氨基酸，更优选地仅在于一个或两个氨基酸。换句话说，特别优选地，与肿瘤相关抗原表位序列相比，小型生物群序列变体包括不大于三个氨基酸改变(即，一个、两个或三个氨基酸改变)，更优选地不大于两个氨基酸改变(即，一个或两个氨基酸改变)。最优选地，与肿瘤相关抗原表位序列相比，小型生物群序列变体包括一个单个或准确地两个(即，不少于或大于两个)氨基酸改变。
优选地，序列变体保留参考序列的特定功能。在本发明的上下文中，该功能是作为“表位”的功能性，即它可以被免疫系统识别，特别是被抗体、T细胞受体和/或B细胞受体识别，并且优选地，它可以引发免疫应答。
术语“序列变体”包括核苷酸序列变体和氨基酸序列变体。例如，氨基酸序列变体具有改变的序列，其中与参考序列相比，氨基酸中的一个或多个被缺失或取代，或者与参考氨基酸序列相比插入一个或多个氨基酸。作为改变的结果，氨基酸序列变体具有与参考序列相比，至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少75％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少85％、更优选至少90％、特别优选至少95％、最优选至少99％同一的氨基酸序列。例如，至少90％同一的变体序列具有参考序列的每100个氨基酸不超过10个改变(即缺失、插入或取代的任何组合)。特别优选地，小型生物群序列变体不同于肿瘤相关抗原表位序列，仅在于一个、两个或三个氨基酸，更优选地仅在于一个或两个氨基酸。换句话说，特别优选地，与肿瘤相关抗原表位序列相比，小型生物群序列变体包括不大于三个氨基酸改变(即，一个、两个或三个氨基酸改变)，更优选地不大于两个氨基酸改变(即，一个或两个氨基酸改变)。
在本发明的上下文中，与本发明的查询氨基酸序列共享至少例如95％的“序列同一性”的氨基酸序列意指主题氨基酸的序列与查询序列同一，除了主题氨基酸序列可以包括查询氨基酸序列的每100个氨基酸最多五个氨基酸改变。换句话说，为了获得与查询氨基酸序列具有至少95％同一性的序列的氨基酸序列，可以插入另一氨基酸或用另一氨基酸取代或缺失主题序列中最多5％(100中的5个)氨基酸残基，优选在变体或片段的上述定义中。当然，这同样适用于核酸序列。
对于没有精确一致性的(氨基酸或核酸)序列，可以确定第一序列(例如序列变体)相对于第二序列(例如，参考序列)的“％同一性”。通常，可以比对待比较的两个序列以给出序列之间的最大相关性。这可以包括在一个或两个序列中插入“间隙”，以增强比对程度。然后可以对所比较的每个序列的整个长度确定％同一性(所谓的“全局比对”)，其特别适合于相同或相似长度的序列，或者对短的限定长度的序列确定％同一性(所谓的“局部比对”)，其更适合于不等长度的序列。
比较两个或更多个序列的同一性(有时也称为“相似性”或“同源性”)的方法在本领域内是已知的。两个(或更多个)序列同一的百分比可以，如，使用数学算法确定。可以使用的数学算法的优选但非限制的实例是Karlin et al.(1993)，PNAS USA，90:5873-5877的算法。这种算法集成在BLAST程序家族中，如BLAST或NBLAST程序(还可以参见Altschul etal.，1990，J.Mol.Biol.215，403-410或Altschul et al.(1997)，Nucleic Acids Res，25:3389-3402)(通过NCBI在万维网站点ncbi.nlm.nih.gov的主页访问)和FASTA(Pearson(1990)，Methods Enzymol.183，63-98；Pearson and Lipman(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 85，2444-2448.)。可以通过这些程序鉴定与其他序列在一定程度上同一的序列。此外，可以使用在Wisconsin序列Analysis Package，version 9.1(Devereux et al.，1984，Nucleic Acids Res.，387-395)中可用的程序，例如程序BESTFIT和GAP来确定两个多核苷酸之间的％同一性和两个多肽序列之间的％同一性和％同源性或同一性。BESTFIT使用(Smith and Waterman(1981)，J.Mol.Biol.147，195-197.)的“局部同源性”算法并发现了两个序列之间的相似性的最佳单一区域。
优选地，小型生物群序列变体(仅在)对于MHC分子的一级和/或二级锚定残基方面不同于肿瘤相关抗原表位序列。更优选地，小型生物群序列变体不同于肿瘤相关抗原表位序列，(仅)在于其包含(仅)在MHC分子的一级和/或二级锚定残基中的氨基酸取代。HLA亚型的锚定残基在本领域内是已知的，并且由Protein Data Bank中的现有p-HLA复合物的结构数据的大通量分析限定。而且，MHC亚型的锚定基序也可以在IEDB中发现(URL：www.iedb.org；按等位基因浏览)或在SYFPEITHI中发现(URL：http://www.syfpeithi.de/)。例如，对于9个氨基酸大小HLA.A2.01肽，提供主要接触点的肽一级锚定残基位于残基位置P1、P2和P9处。
因此，优选的是，小型生物群序列变体的核心序列与肿瘤相关抗原表位序列的核心序列是同一的，其中核心序列由除三个最N-末端和三个最C-末端氨基酸以外的所有氨基酸组成。换句话说，与肿瘤相关抗原表位序列相比，小型生物群序列变体的任何改变优选地位于三个N-末端和/或三个C-末端氨基酸内，而不在“核心序列”中(序列中间的氨基酸)。换句话说，与肿瘤相关抗原表位序列相比，小型生物群序列变体改变(错配)优选地仅允许在(至少)三个N-末端氨基酸中和/或在(至少)三个C-末端氨基酸中，更优选地改变(错配)仅允许在两个N-末端氨基酸中和/或在两个C-末端氨基酸中。这并不意味着必须改变所有三个(优选地所有两个)N-末端和/或C-末端氨基酸，而仅仅是那些是可以改变氨基酸的仅有氨基酸位置。例如，在9个氨基酸的肽中，三个中间氨基酸可以代表核心序列，并且改变可以优选地仅发生在三个N-末端和三个C-末端氨基酸位置中的任何位置处，更优选地改变/取代可以仅发生在两个N-末端和/或两个C-末端氨基酸位置中的任何位置处。
更优选地，(肿瘤相关抗原表位序列的)核心序列由除两个最N末端和两个最C末端氨基酸之外的所有氨基酸组成。例如，在9个氨基酸的肽(肿瘤相关抗原表位序列)中，5个中间氨基酸可以代表核心序列，并且改变可以优选地仅发生在(肿瘤相关抗原表位序列的)两个N-末端和两个C-末端氨基酸位置中的任何位置处。
还优选的是，(肿瘤相关抗原表位序列的)核心序列由除最N末端和最C末端氨基酸外的所有氨基酸组成。例如，在9个氨基酸的肽(肿瘤相关抗原表位序列)中，7个中间氨基酸可以代表核心序列，并且改变可以优选地仅发生在N-末端位置(P1)和C-末端氨基酸位置(P9)处。
最优选地，(肿瘤相关抗原表位序列的)核心序列由除两个最N-末端氨基酸和最C-末端氨基酸外的所有氨基酸组成。例如，在9个氨基酸的肽(肿瘤相关抗原表位序列)中，6个中间氨基酸可以代表核心序列，并且改变可以优选地仅发生在两个N-末端位置(P1和P2)和C-末端氨基酸位置(P9)中的任何位置处。
特别优选的是，小型生物群序列变体——如具有9个氨基酸的长度，包含位置1(P1；最N-末端氨基酸位置)的苯丙氨酸(F)或赖氨酸(K)。而且，优选的是，小型生物群序列变体——如具有9个氨基酸的长度，包括位置2(P2)的亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)。而且，优选的是，小型生物群序列变体——如具有9个氨基酸的长度，包括位置9(P9)的缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。最优选地，小型生物群序列变体——如具有9个氨基酸的长度，包括位置1(P1；最N-末端氨基酸位置)的苯丙氨酸(F)或赖氨酸(K)，位置2(P2)的亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)和/或位置9(P9)的缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。
小型生物群序列变体的核心序列也可以不同于肿瘤相关抗原表位序列的核心序列。在该情况下，优选地任何氨基酸取代(与肿瘤相关抗原表位序列的核心序列相比，在小型生物群序列变体的核心序列中)为如下面所描述的保守氨基酸取代。
通常，氨基酸取代，特别是在除MHC分子的锚定位置(一个或多个)(如，MHC-1亚型HLA.A2.01的P1、P2和P9)以外的位置，优选地是保守氨基酸取代。保守取代的实例包括将一个脂肪族残基取代为另一个，诸如取代Ile、Val、Leu或Ala为另一个；或者将一个极性残基取代为另一个，诸如Lys和Arg之间；Glu和Asp之间；或Gln和Asn之间。其他这样的保守取代，例如，具有相似疏水性的整个区域的取代是众所周知的(Kyte and Doolittle,1982,J.Mol.Biol.157(1):105-132)。保守氨基酸取代的实例在下面表1中呈现：
Figure BDA0002443643050000101
Figure BDA0002443643050000111
(表1)
特别地，上述(小型生物群)序列变体及其优选实施方式的描述应用于根据本发明方法的步骤(iii)，其中所选择的肿瘤相关抗原表位的小型生物群序列变体被鉴定。因此，根据本发明的方法的步骤(iii)中的鉴定特别基于上面针对小型生物群序列变体所概述的原理。
在根据本发明的鉴定肿瘤相关抗原表位序列的小型生物群序列变体的方法的步骤(i)中，选择感兴趣的肿瘤相关抗原。这可以例如基于待预防和/或治疗的癌症来完成。与不同类型的癌症有关的抗原在本领域中是众所周知的。可以例如从癌症/肿瘤表位数据库，例如，从数据库“Tantigen”(TANTIGEN version 1.0,Dec 1,2009；由Bioinformatics Coreat Cancer Vaccine Center,Dana-Farber Cancer Institute开发；URL:http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/)检索合适的癌症/肿瘤表位。可以在步骤(i)中使用用于选择的肿瘤相关抗原的数据库的进一步实例包括“Peptide Database”(https://www.cancerresearch.org/scientists/events-and-resources/peptide-database)和“CTdatabase”(http://www.cta.lncc.br/)。另外，肿瘤相关抗原还可以基于本领域内已知的文献诸如科技文章选择。
特别优选的是，将提供抗原数据库(如上所例示)的互联网资源与文献检索相结合。例如，在步骤(i)的子步骤(i-a)中，可以从数据库(诸如Tantigen、Peptide Database和/或CTdatabase)中鉴定一种或多种肿瘤相关抗原，以及在子步骤(i-b)中，可以鉴定和研究关于来自数据库的子步骤(i-a)中选择的一种或多种抗原的特定文献。这些文献可以具体涉及抗原的特定肿瘤表达的研究，例如Xu et al.,An integrated genome-wideapproach to discover tumor-specific antigens as potential immunologic andclinical targets in cancer.Cancer Res.2012 Dec 15；72(24):6351-61；Cheevers etal.,The prioritization of cancer antigens:a national cancer institute pilotproject for the acceleration of translational research.Clin Cancer Res.2009Sep 1；15(17):5323-37。
此后，可以在子步骤(i-c)中进行又一轮选择，其中可以基于子步骤(i-b)中的文献研究的结果，选择(即维持)或“丢弃”来自数据库的子步骤(i-a)中选择的一种或多种抗原。
任选地，选择的抗原可以在选择后关于表达型进行注释(如，如果执行这些子步骤，在子步骤(i-a)或(i-c)后)。为了该目的，可以使用工具，诸如Gent(http://medicalgenome.kribb.re.kr/GENT/),metabolic gene visualizer(http://merav.wi.mit.edu/)或protein Atlas(https://www.proteinatlas.org/)。由此，可以进一步限定一种或多种选择的抗原，如，关于潜在适应症，其与可能的副作用的关系和/或它是“驱动”抗原(癌症致病性改变)还是“过客”抗原(由癌症引起的偶然变化或变化)(参见，例如，Tang J,Li Y,Lyon K,et al.Cancer driver-passenger distinction viasporadic human and dog cancer comparison:a proof of principle study withcolorectal cancer.Oncogene.2014；33(7):814-822)。
优选地，在步骤(ii)中鉴定的肿瘤相关抗原表位可以通过MHC I类呈递。换句话说，优选的是，在步骤(ii)中鉴定的肿瘤相关抗原表位可以结合至MHC I类。MHC I类(主要组织相容性复合物I类，MHC-I)呈递表位至杀伤T细胞——也称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。除了TCR(T-细胞受体)以外，CTL还表达CD8受体。当CTL的CD8受体与MHC I类分子对接(dock)时，如果CTL的TCR符合MHC I类分子内的表位，则CTL触发细胞通过细胞凋亡进行程序性细胞死亡。因为癌细胞被直接攻击，该途径在癌症的预防和/或治疗中特别有用。在人中，MHC I类包含HLA-A、HLA-B和HLA-C分子。
通常，具有8-12个、优选8-10个氨基酸长度的肽(表位)由MHC I呈递。抗原的哪个表位可以通过MHC I呈递/结合至MHC I，可以通过上面示例的数据库鉴定(例如，Tantigen(TANTIGEN version 1.0,Dec 1,2009；由Bioinformatics Core at Cancer VaccineCenter,Dana-Farber Cancer Institute开发；URL:http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/)提供了具有对应HLA亚型的表位的列表)。一种优选的分析工具是“IEDB”(ImmuneEpitope Database and Analysis Resource,IEDB Analysis Resource v2.17,由来自National Institute of Allergy and Infectious Diseases——National Institutesof Health in the Department of Health and Human Services的一个组成部分——的合同支持；URL:http://www.iedb.org/)，其提供了例如，MHC-I处理预测(http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_processing.html)。因此，可以组合关于蛋白酶体切割、TAP转运和MHC I类分析工具的信息以预测肽呈递。另一个优选的数据库是主要组织相容性复合物(MHC)数据库“SYFPEITHI：MHC配体和肽基序的数据库(Ver.1.0,由DFG-Sonderforschungsbereich 685和European Union:EU BIOMED CT95-1627、BIOTECHCT95-0263和EU QLQ-CT-1999-00713支持；URL:www.syfpeithi.de)，其编译从MHC分子洗脱的肽。由于SYFPEITHI数据库仅包括来自发表的报告中的已知结合I类和II类MHC分子的肽序列，因此SYFPEITHI数据库是优选的。特别优选地，从体外数据(例如在SYFPEITHI数据库和IEDB数据库中编译的那些)获得的结果可以通过限制性检索扩展，例如包括从洗脱测定和利用MHC I类限制获得的人线性表位——在计算机模拟预测MHC结合数据库，如IEDB数据库中。
除了上述由MHC I呈递/结合至MHC I的表位的数据库选择之外或作为另外一种选择，候选肽与MHC I类的结合可优选通过MHC体外或计算机模拟结合测试进行测试。而且，体外或计算机模拟结合测试还可以组合，例如通过首先使用计算机模拟结合测试来获得第一选择，和在随后的步骤通过使用例如体外结合测试来确认用计算机模拟结合测试获得的结果。这通常也适用：肽诸如表位或小型生物群序列变体的结合可优选通过本文所述的MHC体外或计算机模拟结合测试进行测试。
在该上下文中，对于结合至MHC I类的确定，可以使用由IEDB Solutions Center提供的阈值(截止值)(URL:https://help.iedb.org/hc/en-us/articles/114094151811-Selecting-thresholds-cut-offs-for-MHC-class-I-and-II-binding-predictions)。即，对于MHC I类，可以使用在https://help.iedb.org/hc/en-us/articles/114094151811-Selecting-thresholds-cut-offs-for-MHC-class-I-and-II-binding-predictions中显示并在表2中概述的截止值：
表2：MHC I类结合预测的截止值：
Figure BDA0002443643050000131
Figure BDA0002443643050000141
(来源于URL:https://help.iedb.org/hc/en-us/articles/114094151811-Selecting-thresholds-c ut-offs-for-MHC-class-I-and-II-binding-predictions)
可以使用公开可用的工具进行MHC I类结合的预测(MHC计算机模拟结合测试)，比如“NetMHCpan”，例如“NetMHCpan 3.0Server”或“NetMHCpan 4.0 Server”(Center forbiological sequence analysis,Technical University of Denmark DTU；URL:http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)。NetMHCpan方法，特别是NetMHCpan 3.0或更高的版本，接受超过180000个定量结合数据的训练，该数据涵盖来自人类(HLA-A、B、C、E)和其他物种的172种MHC分子。通常，可以通过为强和弱结合物保留默认阈值来预测亲和力。例如，对于HLA-A*0201，低于50nM的计算亲和力可以表示“强结合物”，和50至255nM(或50nM和300nM)之间的亲和力可以表示“中等结合物”。
在NetMHCpan中，例如在NetMHCpan 3.0或在NetMHCpan 4.0中，可以将预测的亲和力的等级与一组400000个随机天然肽进行比较，其可以用作％等级结合亲和力的量度。该值不受某些分子对更高或更低的平均预测亲和力的固有偏差的影响。例如(如，对于HLA-A*0201)，非常强的结合物可以被定义为具有％等级<0.5，强结合物可以被定义为具有％等级<1.0，中等结合物可以被定义为具有从1.0到2.0的％等级，和弱结合物可定义为具有％等级>2.0。
用于体外测试的方法是本领域技术人员公知的。例如，技术人员可以使用实验方案，如对于由HLA-A*0201呈递的肽验证的(Tourdot et al.,A general strategy toenhance immunogenicity of low-affinity HLA-A2.1-associated peptides:implication in the identification of cryptic tumor epitopes.Eur JImmunol.2000 Dec；30(12):3411-21)。在该上下文中，可以在测试中另外地使用参考肽，诸如HIV pol 589-597。这使得能够计算体外亲和力相对于用参考肽观察到的结合，例如，通过以下等式：
相对亲和力＝包括20％的HLA-A*0201的表达的每个肽的浓度/包括20％的HLA-A*0201的表达的参考肽的浓度。
(其中100％为利用参考肽——如HIV pol 589-597，例如在100μM浓度下使用的——检测的HLA-A*0201表达的水平)。例如，展示低于1的相对亲和力的肽可以被认为是“强结合物”，展示在1和2之间的相对亲和力的肽可以被认为是“中等结合物”，和展示大于3的相对亲和力的肽可以被认为是“弱结合物”。
还优选的是，步骤(ii)中鉴定的肿瘤相关抗原表位可以由MHC II类呈递。换句话说，优选的是，步骤(ii)中鉴定的肿瘤相关抗原表位可以结合MHC II类。MHC II类(主要组织相容性复合物II类，MHC-II)呈递表位至免疫细胞，如T辅助细胞(CD4+T细胞)。然后，辅助T细胞有助于引发适当的免疫应答，这可能由于B细胞的活化而导致全力抗体免疫应答。在人类中，MHC II类包含HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR分子。
通常，由MHC II呈递长度为13-24个氨基酸的肽(表位)。可以通过上文针对MHC I概述的数据库鉴定抗原的哪个表位可以通过MHC II呈递/结合至MHC II(可以仅仅仅使用与MHC II相关的工具代替MHC I)。另外或可选地，候选肽与MHC II类的结合可优选通过本文所述的MHC体外或计算机模拟结合测试进行测试，所述测试也以类似方式应用于MHC II。
优选通过以下完成在根据本发明的用于鉴定小型生物群序列变体的方法的步骤(iii)中的表位序列的至少一种小型生物群序列变体的鉴定：
-比较步骤(ii)中选择的表位序列与一个或多个小型生物群序列，和
-鉴定一个或多个小型生物群序列是否包含表位序列的一个或多个小型生物群序列变体(如上所概述)。
换句话说，根据本发明的方法的步骤(iii)优选地包括：
-比较步骤(ii)中选择的表位序列与一个或多个小型生物群序列，和
-鉴定一个或多个小型生物群序列是否包含表位序列的一个或多个小型生物群序列变体(如上所概述)。
具体而言，在步骤(ii)中选择的表位序列可以用作查询序列(输入序列/参考序列)，以搜索小型生物群序列，特别是为了鉴定包括相似序列(与步骤(ii)中选择的表位序列具有至少50％序列同一性，优选地至少60％序列同一性，更优选地至少70％序列同一性，甚至更优选地至少75％序列同一性)的一个或多个小型生物群序列。
在这种情况下，应用上面概述的小型生物群序列变体的标准(特别是关于相似性和％序列同一性)，和特别是上述小型生物群序列变体的优选实施方式。例如，在第一步骤中，可以执行序列相似性检索，例如BLAST或FASTA。例如，可以使用PAM30蛋白质取代基质进行蛋白质BLAST(blastp)。PAM30蛋白质取代基质描述了每个位点随时间的氨基酸变化率，并且推荐用于长度低于35个氨基酸的查询。蛋白质BLAST的进一步(另外的)示例性参数可以是2的单词大小(建议用于简短查询)；20000000的期望值(E)(经调整以最大化可能匹配数量)；和/或设置为'0'的基于组合物的统计，其是短于30个氨基酸的输入序列，并且仅允许无间隙比对。
此后，可以过滤结果，例如关于序列长度，例如使得获得仅具有8-12个氨基酸长度的序列(如，仅具有8个氨基酸长度的序列、仅具有9个氨基酸长度的序列、仅具有10个氨基酸长度的序列、仅具有11个氨基酸长度的序列、或仅具有12个氨基酸长度的序列)，优选仅具有8-10个氨基酸长度的序列，最优选仅具有9或10个氨基酸长度的序列。
此外，可以(另外地)过滤结果，使得仅在某些位置，优选地仅在N-和/或C-末端，但不在如上所述的核心序列中允许错配/取代。作为具体实例，可以过滤结果，使得仅可以获得仅具有9个氨基酸长度的序列，其中仅在位置P1、P2和P9处允许错配/取代并且其中每个序列允许最多两个错配。
表位序列与之比较的一个或多个小型生物群序列可以是任何小型生物群序列或小型生物群序列的任何编译(诸如任何小型生物群序列数据库)。
优选地，基于小型生物群(序列)数据库鉴定步骤(iii)中的小型生物群序列变体。这样的数据库可以优选地包括多个个体(受试者)的小型生物群(序列)数据。这种数据库的实例是“人肠道微生物组的综合参考目录”(version 1.0,March 2014；Li et al.MetaHITConsortium.An integrated catalog of reference genes in the human gutmicrobiome.Nat Biotechnol.2014 Aug；32(8):834-41；URL:http://meta.genomics.cn/meta/home)，其包括来自主要人微生物组型分析工作——美国国立卫生研究院人微生物组项目(NIH-HMP)和人肠道倡议的欧洲宏基因组学(MetaHIT)——的数据。
还优选的是，小型生物群数据库包括单个个体而不是多个个体的小型生物群数据。以这种方式，小型生物群序列变体(或包含其的药物)可以特异性地为个体定制。除了本发明的(通过方法鉴定的)小型生物群序列变体不同于自身抗原，从而避免免疫系统的自身耐受性的优点之外，个体中存在的小型生物群序列变体具有额外的优点：个体可以被“引发”用于这种小型生物群序列变体，即个体可以具有由小型生物群序列变体引发的记忆T细胞。特别是，针对人肿瘤相关抗原表位的现有记忆T细胞将在小型生物群序列变体的挑战下重新激活，并将加强和加速抗肿瘤应答的建立，从而进一步提高治疗效果。
包括单个个体而不是多个个体的小型生物群数据的数据库可以例如通过使用个体的一个或多个粪便样品来编译。例如，可以通过本领域已知的方法从粪便样品中提取微生物(特别是细菌)核酸(例如DNA)或(多)肽并进行测序。然后可以在仅包含小型生物群数据——特别是序列——的数据库中编译序列。为了编译这样的数据库，可以使用例如由国际人类微生物组标准(IHMS)项目开发和提供的一个或多个标准操作程序(SOP)(URL:http://www.microbiome-standards.org/#SOPS)。IHMS项目(URL:http://www.microbiome-standards.org)在第七框架计划(项目ID：261376)下由欧盟委员会支持，并协调了人类微生物组领域中旨在优化数据质量和可比性的标准操作程序(SOP)的开发。IHMS开发了14个标准操作程序(SOP)，包括用于粪便样品收集、鉴定和提取、用于测序和用于数据分析的SOP。例如，IHMS SOP可用于编译数据库的整个过程(即，对于每个步骤，可以使用SOP)。在另一个实例中，一个或多个步骤可以使用一个或多个SOP，而其他步骤使用其他方法。在一个特别优选的实例中，可以进行从粪便样品中提取的DNA的测序，如，例如，在Illumina HiSeq上，在40,000,000对末端读数下。例如，可以使用生物信息学管道分析序列，用于鉴定表达小型生物群序列变体(例如，细菌肽)的候选细菌的基因组部分。
优选地，根据本发明的用于鉴定小型生物群序列变体的方法的步骤(iii)包括下面的子步骤：
(iii-a)任选地，从(a)单个或多个个体的样品(一种或多种)中鉴定小型生物群蛋白质序列或核酸序列，
(iii-b)编译包含单个或多个个体的小型生物群蛋白质序列或核酸序列的数据库，和
(iii-c)鉴定在步骤(iii-b)中编译的数据库中在步骤(ii)中鉴定的表位序列的至少一种小型生物群序列变体。
步骤(iii-a)中的样品优选地是粪便样品。取决于待编译的数据库涉及单个个体还是多个个体，可以使用单个或多个个体中的一个或多个粪便样品。
鉴定步骤(iii-a)优选地包括从样品——特别是粪便样品——中提取微生物(特别是细菌)核酸(诸如DNA)或(多)肽，及其测序，如上所述。任选地，可以如上所述分析序列。
优选地，根据本发明的方法进一步包括下面的步骤：
(iv)测试至少一种小型生物群序列变体与MHC分子，特别是MHC I分子的结合，并获得结合亲和力。
可以通过如上所述的MHC体外或计算机模拟结合测试来测试至少一种小型生物群序列变体与MHC分子，特别是MHC I或MHC II的结合。因此，如上所述，可以选择中等、强和非常强结合物。
优选地，对于至少一种小型生物群序列变体与MHC分子，和另外地，对(各自的参考)表位(“相应的”肿瘤相关抗原表位序列)与MHC分子，特别是MHC I或MHC II分子，测试与MHC的结合(如本文所述的体外和/或计算机模拟)，并且优选获得两者的结合亲和力(表位序列和其小型生物群序列变体)。
在结合测试后，优选地仅选择这种小型生物群序列变体，其中等地、强烈地或非常强烈地结合MHC，特别是MHC I或MHC II。更优选地，仅选择强的和非常强的结合物，并且最优选地，仅选择这样的小型生物群序列变体，其非常强烈地结合MHC，特别是MHC I或MHCII。
更优选地，仅选择这样的小型生物群序列变体，其强烈或非常强烈地结合MHC，特别是MHC I或MHC II，并且其中(各自的参考)表位(“相应的”肿瘤相关抗原表位序列)中等地、强烈地或非常强地结合MHC，特别是MHC I或MHC II。甚至更优选地，仅选择这样的小型生物群序列变体，其非常强烈地结合MHC，特别是MHC I或MHC II，并且其中(各自的参考)表位中等地、强烈地或非常强地结合MHC，特别是MHC I或MHC II。最优选地，仅选择这样的小型生物群序列变体，其非常强烈地结合MHC，特别是MHC I或MHC II，并且其中(各自的参考)表位强烈或非常强烈地结合MHC，特别是MHC I或MHC II。
还优选的是，根据本发明的方法的步骤(iv)进一步包括比较对于小型生物群序列变体和各自的参考表位获得的结合亲和力和选择与各自的参考表位相比具有与MHC——特别是MHC I或MHC II——更高的结合亲和力的小型生物群序列变体。
优选地，根据本发明的方法进一步包括下面的步骤：
(v)确定包含小型生物群序列变体的小型生物群蛋白质的细胞定位。
在这种情况下，优选确定含有小型生物群序列变体(i)的小型生物群蛋白是否被分泌和/或(ii)包含跨膜结构域。分泌或存在于膜中/上的小型生物群蛋白可引发免疫应答。因此，在本发明的上下文中，优选包含在小型生物群蛋白中的小型生物群序列变体，其被分泌(如，包括信号肽)或其包括跨膜结构域。特别地，包括在分泌蛋白(或具有信号肽的蛋白质)中的小型生物群序列变体是优选的，因为分泌的外泌体中包含的分泌的组分或蛋白质更易于由APC呈递。
为了确定包含小型生物群序列变体的小型生物群蛋白的细胞定位，步骤(v)优选地进一步包括鉴定含有小型生物群序列变体的小型生物群蛋白的序列，优选在确定细胞定位之前。
细胞定位，特别是蛋白质是被分泌还是包含跨膜结构域，可以通过本领域技术人员熟知的方法计算机模拟或体外测试。例如，可以使用“SignalP 4.1 Server”(Center forbiological sequence analysis,Technical University of Denmark DTU；URL:www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)和/或“Phobius”(A combined transmembranetopology and signal peptide predictor,Stockholm Bioinformatics Centre；URL:phobius.sbc.su.se)。优选地，可以组合两个预测工具(如,SignalP 4.1 Server和Phobius)。
例如，为了测试蛋白质是否被分泌，可以评估信号肽的存在。信号肽是普遍存在的蛋白质分选信号，其靶向其过客(货物)蛋白质，用于在原核生物中穿过细胞质膜转位。为了测试信号肽的存在，例如，可以使用“SignalP 4.1 Server”(Center for biologicalsequence analysis,Technical University of Denmark DTU；URL:www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)和/或“Phobius”(Acombined transmembrane topology and signalpeptide predictor,Stockholm Bioinformatics Centre；URL:phobius.sbc.su.se)。优选地，可以组合两个预测工具(如，SignalP4.1 Server和Phobius)。
而且，可以确定，蛋白质是否包括跨膜结构域。信号肽和跨膜结构域都是疏水的，但跨膜螺旋通常具有更长的疏水区。例如，SignalP 4.1 Server和Phobius具有区分信号肽与跨膜结构域的能力。优选地，设定最小数量的两个预测的跨膜螺旋以区分膜与细胞质蛋白，以递送最终的共有列表。
优选地，根据本发明的方法包括如上所述的步骤(iv)和如上所述的步骤(v)。优选地，步骤(v)在步骤(iv)之后。还优选的是，步骤(iv)在步骤(v)之后。
而且，还优选的是，根据本发明的方法包括下面的步骤：
-注释包括小型生物群序列变体的小型生物群蛋白。
注释可以通过针对参考数据库(基于BLAST的)，例如针对京都基因和基因组百科全书(KEGG)和/或针对国家生物技术信息中心(NCBI)参考序列数据库(RefSeq)的比较来执行。RefSeq提供了一组完整的非冗余序列，包括基因组DNA、转录物和蛋白质。在KEGG中，可以使用存储在KO(KEGG Orthology)数据库中的分子水平功能。这些功能被分类为直向同源物组，其包含由来自不同物种的基因编码的蛋白质，这些不同的物种从共同的祖先进化而来。
如上述，与(完全)人表位相比，人抗原表位的小型生物群序列变体具有以下优势：T细胞能够严格识别由于识别自体抗原在成熟期间耗尽的人肽，对于小型生物群序列变体，情况并非如此。因此，小型生物群序列变体提供增加的免疫原性。而且，本领域熟知MHC(HLA)结合(如上所述可以被确认/测试)为T细胞免疫原性的指标。
然而，还可以(另外)测试小型生物群序列变体(单独或与相应的人表位相比)的免疫原性(例如以确认其增加的免疫原性)。因此，优选地，根据本发明的方法进一步包括以下步骤：
(vi)测试小型生物群序列变体的免疫原性。
本领域技术人员熟悉测试免疫原性的各种方法，包括计算机、体外和体内/离体测试。通常，用于免疫原性测试的测定的实例包括筛选测定，比如ADA(抗药物抗体)筛选、验证测定、滴定和同种型测定和使用中和抗体的测定。用于这种测定的平台/测定形式的实例包括ELISA和桥联ELISA、电化学发光(ECL)和Meso Scale Discovery(MSD)、流式细胞术、SPEAD(固相提取与酸解离)、放射免疫沉淀(RIP)、表面等离子共振(SPR)、基于微球的测定、生物层干涉法、生物传感器测定和生物测定(比如细胞增殖测定)。例如，在综述文章MeenuWadhwa,Ivana Knezevic,Hye-Na Kang,Robin Thorpe:Immunogenicity assessment ofbiotherapeutic products:An overview of assays and their utility,Biologicals,第43卷,第5期,2015,第298-306页,ISSN 1045-1056,https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2015.06.004中更详细地描述了各种测定，其通过引用并入本文。此外，FDA还提供了免疫原性测试的指南(治疗性蛋白质产品的免疫原性测试的分析开发和验证。行业指南。FDA,2016年)。免疫原性的计算机模拟测试(特别是应用免疫信息学工具)具体包括如上所述的用于MHC(HLA)结合的计算机模拟测试。
作为具体实例，可以将测试物质(例如，任何合适的施用形式的小型生物群序列变体)施用至受试者(动物或人)用于免疫。此后，可以用各种方式测量受试者的免疫应答。例如，例如通过例如ELISA测量免疫细胞(例如脾细胞)的细胞因子释放(例如IFNγ)可以评估免疫细胞，比如脾细胞。可选地，还可以评估ADA(抗药物抗体)。
测定法的其他众所周知的实例包括MHC多聚体测定法，比如四聚体测定法(例如，如在Altman JD,Moss PA,Goulder PJ,Barouch DH,McHeyzer-Williams MG,Bell JI,McMichael AJ,Davis MM.Phenotypic analysis of antigen-specific Tlymphocytes.Science.1996 Oct4；274(5284):94-6中所描述的)或五聚体测定法。
在优选的实施方式中，例如通过具体地评估细胞毒性T细胞应答来测试关于细胞毒性T细胞的免疫原性(或细胞毒性T细胞应答)。特别地，可以进行细胞毒性测定。例如，可以将测试物质(例如，任何合适的施用形式的小型生物群序列变体)施用至患有肿瘤(表达与小型生物群序列变体对应的抗原)的受试者(动物或人)，并观察/测量肿瘤大小。例如，还可以通过使用肿瘤细胞系(表达与小型生物群序列变体对应的抗原)在体外测试细胞毒性。
细胞毒性测定，特别是T细胞细胞毒性测定，可以如上所述进行免疫原性测定或除了如上所述的免疫原性测定之外(其他免疫原性测定)。
因此，优选地，根据本发明的方法进一步包括以下步骤：
(vi)测试小型生物群序列变体的细胞毒性。
优选地，测试小型生物群序列变体的T-细胞细胞毒性。
优选地，测试细胞毒性关于表达与小型生物群序列变体对应的抗原的具体细胞(如本文所描述的)。
优选地，肿瘤相关抗原表位序列(其小型生物群序列变体将被鉴定)具有如SEQ IDNO：1-5、55-65和126-131中任一项所陈述的氨基酸序列。例如，肿瘤相关抗原表位序列(其小型生物群序列变体将被鉴定)具有如SEQ ID NO：58或59所陈述的氨基酸序列。例如，肿瘤相关抗原表位序列(其小型生物群序列变体将被鉴定)具有如SEQ ID NO：131所陈述的氨基酸序列。在具体的实施方式，肿瘤相关抗原表位序列(其小型生物群序列变体将被鉴定)具有如SEQ ID NO：1中所陈述的氨基酸序列。
制备药物的方法
在进一步方面，本发明提供了制备药物——优选地，用于预防和/或治疗癌症——的方法，其包括下面的步骤：
(a)根据如上所述根据本发明的方法鉴定肿瘤相关抗原表位序列的小型生物群序列变体；和
(b)制备包括小型生物群序列变体(即，肽或核酸)的药物。
优选地，药物是疫苗。如在本发明的上下文中所使用的，术语“疫苗”是指提供通常针对特定疾病，优选癌症的先天性和/或适应性免疫的生物制剂。因此，疫苗特别支持待治疗的受试者的免疫系统的先天性和/或适应性免疫应答。例如，如本文所述的小型生物群序列变体通常导致或支持待治疗的患者的适应性免疫应答。疫苗可进一步包含佐剂，其可导致或支持先天免疫应答。
优选地，药物的制备，即根据本发明的制备药物的方法的步骤(b)，包括用小型生物群序列变体或包括小型生物群序列变体的多肽/蛋白质(或包括小型生物群序列变体的核酸分子)负载纳米颗粒，其中小型生物群序列变体优选地为如上所述的肽。特别地，纳米颗粒用于递送小型生物群序列变体(包括小型生物群序列变体的多肽/蛋白质/核酸)，并且还可任选地充当佐剂。小型生物群序列变体(包括小型生物群序列变体的多肽/蛋白质/核酸)通常包封在纳米颗粒内或结合(装饰到)纳米颗粒表面(“包衣”)上。纳米颗粒，特别是用作疫苗的纳米颗粒是本领域已知的，并且描述于例如Shao K,Singha S,Clemente-CasaresX,Tsai S,Yang Y,Santamaria P(2015):Nanoparticle-based immunotherapy forcancer,ACS Nano 9(1):16-30；Zhao L,Seth A,Wibowo N,Zhao CX,Mitter N,Yu C,Middelberg AP(2014):Nanoparticle vaccines,Vaccine 32(3):327-37；和Gregory AE,Titball R,Williamson D(2013)Vaccine delivery using nanoparticles,Front CellInfect Microbiol.3:13,doi:10.3389/fcimb.2013.00013.eCollection 2013,Review中。与传统方法相比，纳米颗粒可以保护有效负载(抗原/佐剂)免受周围生物环境的影响，增加其半衰期，最小化其全身毒性，促进其向APC的递送，或甚至直接触发TAA特异性T细胞的活化。优选地，纳米颗粒的尺寸(直径)不大于300nm，更优选地不大于200nm，和最优选地不大于100nm。这样的纳米颗粒充分地避免吞噬细胞摄取，在循环中具有高结构完整性和长循环时间，能够在肿瘤生长的位点累积，并且能够深入渗透到肿瘤块中。
纳米颗粒的实例包括聚合物纳米颗粒，诸如聚(乙二醇)(PEG)和聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)；无机纳米颗粒，诸如金纳米颗粒、氧化铁珠、氧化铁氧化锌纳米颗粒、碳纳米管和介孔二氧化硅纳米颗粒；脂质体，诸如阳离子脂质体；免疫刺激复合物(ISCOM)；病毒样颗粒(VLP)；和自组装蛋白质。
聚合物纳米颗粒是基于/包含聚合物的纳米颗粒，聚合物诸如聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、聚(d,l-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(g-谷氨酸)(g-PGA)、聚(乙二醇)(PEG)和聚苯乙烯。聚合物纳米颗粒可以捕获抗原(如，小型生物群序列变体或包含其的(多)肽)或与抗原(如，小型生物群序列变体或包含其的(多)肽))结合/缀合。聚合物纳米颗粒可用于递送至，如，某些细胞，或利用其缓慢的生物降解速率而维持抗原释放。例如，g-PGA纳米颗粒可用于包封疏水性抗原。聚苯乙烯纳米颗粒可与多种抗原缀合，是因为它们可用各种官能团进行表面修饰。聚合物，诸如聚(L-乳酸)(PLA)、PLGA、PEG和天然聚合物(如多糖)，也可用于合成水凝胶纳米颗粒，其是一种纳米级亲水三维聚合物网络。纳米凝胶具有有利的性质，包括柔性网眼尺寸、用于多价缀合的大表面积、高含水量、和对抗原的高负载能力。因此，优选的纳米颗粒是纳米凝胶，诸如壳聚糖纳米凝胶。优选的聚合物纳米颗粒是基于/包含聚(乙二醇)(PEG)和聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的纳米颗粒。
无机纳米颗粒是基于/包含无机物质的纳米颗粒，并且这种纳米颗粒的实例包括金纳米颗粒、氧化铁珠、氧化铁氧化锌纳米颗粒、碳纳米颗粒(如，碳纳米管)和介孔二氧化硅纳米颗粒。无机纳米颗粒提供刚性结构和可控的合成。例如，金纳米颗粒可以容易地以不同的形状，诸如球形、棒形、立方体产生。无机纳米颗粒可以用诸如碳水化合物表面修饰。碳纳米颗粒提供良好的生物相容性，并且可以例如作为纳米管或(介孔)球产生。例如，可以将根据本发明的小型生物群序列变体(或包含其的(多)肽)的多个拷贝缀合到碳纳米颗粒，如碳纳米管上。介孔碳纳米颗粒优选地用于口服施用。二氧化硅基纳米颗粒(SiNP)也是优选的。SiNP具有生物相容性，并且在选择性肿瘤靶向和疫苗递送方面显示出优异的性质。SiNP表面上丰富的硅烷醇基团可用于进一步修饰以引入额外的功能，诸如细胞识别、特异性生物分子的吸收、与细胞的相互作用的改善和细胞摄取的增强。介孔二氧化硅纳米颗粒是特别优选的。
脂质体通常由磷脂形成，诸如1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。通常，阳离子脂质体是优选的。脂质体是自组装的，具有磷脂双层壳和水性核。脂质体可以作为单层囊泡(具有单个磷脂双层)或作为多层囊泡(具有由水层分开的几个同心磷脂壳)产生。因此，抗原可以包封在核中或不同的层/壳之间。优选的脂质体系统是批准用于人类的那些，诸如
Figure BDA0002443643050000221
V和
Figure BDA0002443643050000222
免疫刺激复合物(ISCOM)是约40nm(直径)的笼状颗粒，其是含有胶束的胶体皂甙，例如由皂苷佐剂Quil A、胆固醇、磷脂和(多)肽抗原(诸如小型生物群序列变体或包含其的多肽)制成。这些球形颗粒可以通过非极性相互作用来捕获抗原。已经描述了两种类型的ISCOM，其都由胆固醇、磷脂(通常是磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱)和皂甙(如QuilA)构成。
病毒样颗粒(VLP)是通过生物相容性衣壳蛋白的自组装形成的自组装纳米颗粒。由于自然优化的纳米颗粒大小和重复结构顺序，VLP可以诱导潜在的免疫应答。VLP可以衍生自多种病毒，其大小范围从20nm到800nm，通常在20-150nm的范围内。VLP可以被工程化以通过将这些肽/蛋白质融合到颗粒上或通过表达多种抗原来表达另外的肽或蛋白质。而且，抗原可以化学偶联到病毒表面上以产生生物缀合物VLP。
自组装的蛋白质的实例包括铁蛋白和大型穹窿蛋白质(major vault protein)(MVP)。铁蛋白是一种可以自组装成近球形的10nm结构的蛋白质。96个单位的MVP可以自组装成桶形穹窿纳米颗粒，其尺寸约为40nm宽和70nm长。当与MVP混合时，通过自组装过程可以将与最小相互作用结构域基因融合的抗原包装在穹窿纳米颗粒内。因此，抗原(诸如根据本发明的小型生物群序列变体，或包含其的多肽)可以与自组装蛋白质或其片段/结构域，诸如MVP的最小的相互作用结构域融合。因此，本发明还提供了融合蛋白，其包括根据本发明的自组装蛋白(或其片段/结构域)和小型生物群序列变体。
通常，纳米颗粒(NP)的优选实例包括氧化铁珠、聚苯乙烯微球、聚(γ-谷氨酸)(γ-PGA)NP、氧化铁-氧化锌NP、阳离子化明胶NP、普朗尼克(pluronic)稳定的聚(硫化丙烯)(PPS)NP、PLGA NP、(阳离子)脂质体、(pH应答)聚合物胶束、PLGA、癌细胞膜包被的PLGA、脂质-磷酸钙(LCP)NP、脂质体-鱼精蛋白-透明质酸(LPH)NP、聚苯乙烯乳胶珠、磁珠、铁-葡聚糖颗粒和量子点纳米晶体。
优选地，步骤(b)还包括用佐剂，例如Toll样受体(TLR)激动剂负载纳米颗粒。因此，小型生物群序列变体(包含小型生物群序列变体的多肽/蛋白质/核酸)可以与佐剂一起递送，例如递送至抗原呈递细胞(APC)，诸如树突细胞(DC)。佐剂可以被纳米颗粒包封或结合到/缀合到纳米颗粒的表面，优选类似于小型生物群序列变体。
还优选的是，药物的制备，即根据本发明的制备药物的方法的步骤(b)，包括用小型生物群序列变体负载细菌细胞。例如，细菌细胞可包含编码小型生物群序列变体和/或表达小型生物群序列变体的核酸分子(作为肽或包含在多肽/蛋白质中)。为此，步骤(b)优选包括用小型生物群序列变体(包含/编码小型生物群序列变体的核酸分子)(在本文中优选地为核酸)转化细菌细胞的步骤。这样的细菌细胞可以作为“活细菌疫苗载体”，其中活细菌细胞(诸如细菌或细菌孢子，如内生孢子、外生孢子或微生物孢囊)可以用作疫苗。其优选实例描述于da Silva et al.,J Microbiol.2015 Mar4；45(4):1117-29中。
细菌细胞(诸如细菌或细菌孢子，如，内生孢子、外生孢子或微生物孢囊)，特别是(整个)肠道细菌物种，可能是有利的，因为它们有可能引发比它们包含的(多)肽或核酸更强的免疫应答。优选地，细菌细胞是肠细菌细胞，即，驻留在肠道中的(杆菌属)细菌细胞。
可选地，根据本发明的细菌细胞，特别是肠道细菌可以是益生菌的形式，即，活肠道细菌的形式，其因此可以用作食品添加剂，因为它可以提供健康益处。这些可以例如冻干在颗粒、丸剂或胶囊中，或直接与乳制品混合，以供食用。
优选地，药物的制备，即，根据本发明的制备药物的方法的步骤(b)，包括制备药物组合物。这种药物组合物优选包括：
(i)小型生物群序列变体；
(ii)包括小型生物群序列变体的(重组)蛋白；
(iii)包括小型生物群序列变体的(免疫原性)化合物；
(iv)负载有小型生物群序列变体的纳米颗粒；
(v)负载有小型生物群序列变体的抗原呈递细胞；
(vi)表达小型生物群序列变体的宿主细胞，诸如细菌细胞；或
(vii)编码小型生物群序列变体的核酸分子；
和，任选地，药学上可接受的载体和/或佐剂。
根据本发明，在制备药物，特别是药物组合物和疫苗的背景下，有用的制剂加工技术在“Part 5 of Remington’s“The Science and Practice of Pharmacy”,22ndEdition,2012,University of the Sciences in Philadelphia,Lippincott Williams&Wilkins”中陈述。
如本文所用，重组蛋白是非天然存在的蛋白质，例如包含小型生物群序列变体和其他组分的融合蛋白。
术语“免疫原性化合物”是指包含如本文所定义的小型生物群序列变体的化合物，其还能够在施用其的受试者中诱导、维持或支持针对小型生物群序列变体的免疫应答。在一些实施方式中，免疫原性化合物包含至少一种小型生物群序列变体，或者可选地至少一种包含这种小型生物群序列变体的化合物，其与蛋白质如载体蛋白或佐剂连接。载体蛋白通常是一种能够运输货物诸如小型生物群序列变体的蛋白质。例如，载体蛋白可以将其货物运输穿过膜。
作为另外的成分，药物组合物可以特别地包含药学上可接受的载体和/或媒介。在本发明的上下文中，药学上可接受的载体通常包括本发明药物组合物的液体或非液体基质。如果本发明的药物组合物以液体形式提供，则载体通常是无热原的水；等渗盐水或缓冲(水性)溶液，如，磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液。具体而言，，可以使用水或优选缓冲液，更优选水性缓冲液，其含有钠盐，优选至少30mM的钠盐、钙盐，优选至少0.05mM的钙盐，和任选地钾盐，优选至少1mM的钾盐，用于注射本发明药物组合物。根据优选的实施方式，钠、钙和任选的钾盐可以以其卤化物如氯化物、碘化物或溴化物的形式存在，以其氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或硫酸盐等形式存在。但不限于此，钠盐的实例包括，如，NaCl、NaI、NaBr、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4，任选的钾盐的实例包括如KCl、KI、KBr、K2CO3、KHCO3、K2SO4，和钙盐的实例包括如CaCl2、CaI2、CaBr2、CaCO3、CaSO4、Ca(OH)2。此外，上述阳离子的有机阴离子可以包含在缓冲液中。根据更优选的实施方式，适用于如上定义的注射目的的缓冲液可以含有选自氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2)和任选的氯化钾(KCl)的盐，其中除了氯化物，可以存在另外的阴离子。CaCl2也可以用另一种盐如KCl代替。通常，注射缓冲液中的盐以至少30mM氯化钠(NaCl)、至少1mM氯化钾(KCl)和至少0.05mM氯化钙(CaCl2)的浓度存在。注射缓冲液相对于特定参考介质可以是高渗的、等渗的或低渗的，即缓冲液可以具有相对于特定参考介质更高、相同或更低的盐含量，其中优选地，可以使用前述盐的这种浓度，其不会导致由于渗透或其他浓度效应引起的细胞损伤。参考介质例如是“体内”方法中存在的液体，诸如血液、淋巴液、细胞溶液或其他体液、或如液体，其可用作“体外”方法中的参考介质，诸如普通缓冲液或液体。这种常见的缓冲液或液体是技术人员已知的。特别优选盐水(0.9％NaCl)和林格-乳酸盐溶液作为液体基质。
而且，一种或多种相容的固体或液体填料或稀释剂或包封化合物也可用于本发明的药物组合物，其适于施用至待治疗的受试者。本文所用的术语“相容的”是指本发明的药物组合物的这些成分能够与如本文所定义的小型生物群序列变体以不发生相互作用的方式混合，该相互作用将显著降低在通常使用条件下本发明药物组合物的药物效果。当然，药学上可接受的载体、填料和稀释剂必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使它们适于施用至待治疗的受试者。可用作药学上可接受的载体、填料或其成分的化合物的一些实例是糖，诸如例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如例如玉米淀粉或马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素；粉末黄蓍；麦芽；明胶；牛脂；固体助流剂，诸如例如硬脂酸、硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，诸如例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和来自可可的油；多元醇，诸如例如聚丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；海藻酸。
优选地，可以将如本文所述的小型生物群序列变体，或包含小型生物群序列变体的多肽，例如通过共价或非共价键共同施用或连接至具有免疫佐剂性质——诸如提供CD4+Th1细胞的刺激——的蛋白质/肽。虽然如本文所述的小型生物群序列变体优选结合MHC I类，但CD4+辅助表位可另外用于提供有效的免疫应答。Th1辅助细胞能够通过分泌干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-2(IL-2)和增强在DC和T细胞上的共刺激信号的表达来维持有效的树突状细胞(DC)活化和特异性CTL活化(Galaine et al.,Interestof Tumor-Specific CD4T Helper 1Cells for Therapeutic AnticancerVaccine.Vaccines(Basel).2015 Jun 30；3(3):490-502)。
例如，佐剂肽/蛋白质可以优选地是回忆免疫记忆或提供非特异性辅助的非肿瘤抗原，或可以是特异性肿瘤衍生的辅助肽。文献中已经描述了几种辅助肽，用于提供非特异性T细胞辅助，诸如破伤风辅助肽、匙孔血蓝蛋白肽或PADRE肽(Adotévi et al.,Targetingantitumor CD4 helper T cells with universal tumor-reactive helper peptidesderived from telomerase for cancer vaccine.Hum Vaccin Immunother.2013 May；9(5):1073-7,Slingluff.The present and future of peptide vaccines for cancer:single or multiple,long or short,alone or in combination？Cancer J.2011 Sep-Oct；17(5):343-50)。因此，破伤风辅助肽、匙孔血蓝蛋白肽和PADRE肽是这种佐剂肽/蛋白质的优选实例。而且，特异性肿瘤衍生的辅助肽是优选的。特异性肿瘤衍生的辅助肽通常由MHC II类呈递，特别是由HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ呈递。特异性肿瘤衍生的辅助肽可以是共有过表达的肿瘤抗原的序列的片段，诸如HER2、NY-ESO-1、hTERT或IL13RA2。这些片段优选具有至少10个氨基酸，更优选至少11个氨基酸，甚至更优选至少12个氨基酸，最优选至少13个氨基酸的长度。特别地，优选具有13至24个氨基酸长度的共享过表达的肿瘤抗原的片段，诸如HER2、NY-ESO-1、hTERT或IL13RA2。优选的片段与MHC II类结合，并且因此可以使用例如IEDB的MHC II类结合预测工具进行鉴定(Immune epitope database and analysisresource；Supported by a contract from the National Institute of Allergy andInfectious Diseases,a component of the National Institutes of Health in theDepartment of Health and Human Services；URL:http://www.iedb.org/；http://tools.iedb.org/mhcii/)。
优选的辅助肽的进一步实例包括UCP2肽(例如，如在WO 2013/135553A1中或在Dosset M,Godet Y,Vauchy C,Beziaud L,Lone YC,Sedlik C,Liard C,Levionnois E,Clerc B,Sandoval F,Daguindau E,Wain-Hobson S,Tartour E,Langlade-Demoyen P,Borg C,Adotévi O:Universal cancer peptide-based therapeutic vaccine breakstolerance against telomerase and eradicatesestablishedtumor.Clin CancerRes.2012 Nov 15；18(22):6284-95.doi:10.1158/1078-0432.CCR-12-0896.Epub 2012Oct 2中所描述的)和BIRC5肽(例如如在EP2119726A1中或在Widenmeyer M,Griesemann H,
Figure BDA0002443643050000251
S,Feyerabend S,Klein R,Attig S,Hennenlotter J,Wernet D,Kuprash DV,Sazykin AY,Pascolo S,Stenzl A,Gouttefangeas C,Rammensee HG:Promiscuoussurvivin peptide induces robust CD4+T-cell responses in the majority ofvaccinated cancer patients.Int J Cancer.2012 Jul 1；131(1):140-9.doi:10.1002/ijc.26365.Epub 2011 Sep 14中所描述的)。最优选的辅助肽是UCP2肽(氨基酸序列：KSVWSKLQSIGIRQH；SEQ ID NO：159，例如如在WO 2013/135553A1或在Dosset M,Godet Y,Vauchy C,Beziaud L,Lone YC,Sedlik C,Liard C,Levionnois E,Clerc B,Sandoval F,Daguindau E,Wain-Hobson S,Tartour E,Langlade-Demoyen P,Borg C,Adotévi O:Universal cancer peptide-based therapeutic vaccine breaks tolerance againsttelomerase and eradicates established tumor.Clin Cancer Res.2012 Nov 15；18(22):6284-95.doi:10.1158/1078-0432.CCR-12-0896.Epub 2012 Oct 2中所描述的)。
因此，药物组合物，特别是疫苗，可另外包含一种或多种辅助物质，以进一步增加其免疫原性，优选上述佐剂。如上所述的小型生物群序列变体和辅助物质的协同作用优选由此实现，该辅助物质可任选地包含在如上所述的本发明的疫苗中。取决于各种类型的辅助物质，在这方面可以考虑各种机制。例如，允许树突细胞(DC)成熟的化合物，例如脂多糖、TNF-α或CD40配体，形成第一类合适的辅助物质。通常，可以使用以“危险信号”(LPS，GP96等)的方式影响免疫系统的任何试剂或细胞因子如GM-CSF作为辅助物质，细胞因子如GM-CSF可以允许以靶向方式增强和/或影响通过免疫刺激根据本发明的佐剂产生的免疫应答。特别优选的辅助物质是进一步促进先天免疫应答的细胞因子，诸如单核因子、淋巴因子、白介素或趋化因子，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β或TNF-α、生长因子，诸如hGH。
最优选地，佐剂是Montanide，比如Montanide ISA 51VG和/或Montanide ISA720VG。当与水基抗原介质混合时，那些佐剂可提供稳定的油包水乳液。Montanide ISA51VG基于甘露糖单油酸酯表面活性剂和矿物油的掺混物，而Montanide ISA720VG使用非矿物油(Aucouturier J,Dupuis L,Deville S,Ascarateil S,Ganne V.Montanide ISA 720and 51:a new generation of water in oil emulsions as adjuvants for humanvaccines.Expert Rev Vaccines.2002Jun；1(1):111-8；Ascarateil S,Puget A,KoziolM-E.Safety data of Montanide ISA 51VG and Montanide ISA 720VG,two adjuvantsdedicated to human therapeutic vaccines.Journal for Immunotherapy ofCancer.2015；3(Suppl 2):P428.doi:10.1186/2051-1426-3-S2-P428)。
可包括在本发明疫苗中的其它添加剂是乳化剂，诸如例如
Figure BDA0002443643050000261
润湿剂，诸如例如十二烷基硫酸钠；着色剂；赋味剂、药物载体；片剂形成剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂。
本发明的组合物，特别是本发明的疫苗，还可以另外含有任何其他化合物，其已知由于与人Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10的结合亲和力(作为配体)，或由于与鼠Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13的结合亲和力(作为配体)，具有免疫刺激作用。
在本文中，可以加入本发明组合物中——特别是本发明的疫苗——的另一类化合物可以是CpG核酸，特别是CpG-RNA或CpG-DNA。CpG-RNA或CpG-DNA可以是单链CpG-DNA(ssCpG-DNA)、双链CpG-DNA(dsDNA)、单链CpG-RNA(ss CpG-RNA)或双链CpG-RNA(ds CpG-RNA)。CpG核酸优选地为CpG-RNA的形式，更优选地为单链CpG-RNA(ss CpG-RNA)的形式。CpG核酸优选含有至少一种或多种(促有丝分裂的)胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸序列(一个或多个)(CpG基序)。根据第一个优选的替代方案，包含在这些序列中的至少一个CpG基序，特别是CpG基序的C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)是未甲基化的。任选地包含在这些序列中的所有其他胞嘧啶或鸟嘌呤可以是甲基化的或未甲基化的。然而，根据进一步优选的替代方案，CpG基序的C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)也可以甲基化形式存在。
特别优选的佐剂是聚肌苷酸：聚胞苷酸(也称为“聚I：C”)和/或其衍生的聚-ICLC。聚I：C是错配的双链RNA，其中一条链是肌苷酸的聚合物，另一条是胞苷酸的聚合物。聚I：C是已知与toll样受体3(TLR3)相互作用的免疫刺激物。聚I：C在结构上类似于双链RNA，其是TLR3的“天然”刺激物。因此，聚I：C可以被认为是双链RNA的合成类似物。聚-ICLC是羧甲基纤维素、聚肌苷酸-聚胞苷酸和聚-L-赖氨酸双链RNA的合成复合物。与聚I：C类似，聚-ICLC也是TLR3的配体。聚I：C和聚-ICLC通常刺激细胞毒性细胞因子的释放。聚-ICLC的优选实例是
Figure BDA0002443643050000262
小型生物群序列变体和包括其的药物
在进一步方面，本发明还提供了肿瘤相关抗原表位序列的小型生物群序列变体，优选通过如上所述的鉴定小型生物群序列变体的方法获得。
因此，根据本发明的小型生物群序列变体的特征、定义和优选实施方式对应于上面针对通过鉴定小型生物群序列变体的方法获得的小型生物群序列变体的描述的那些。例如，优选地，小型生物群序列变体具有不大于50个氨基酸，更优选地不大于40个氨基酸，甚至更优选地不大于30个氨基酸和最优选地不大于25个氨基酸的长度。因此，小型生物群序列变体优选地具有5-50个氨基酸，更优选地6-40个氨基酸，甚至更优选地7-30个氨基酸和最优选地8-25个氨基酸，例如8-24个氨基酸的长度。例如，小型生物群序列变体优选地是(细菌)肽，优选地具有8-12个氨基酸，更优选地8-10个氨基酸，比如9或10个氨基酸的长度，如上所述。此外，小型生物群序列变体与肿瘤相关抗原表位序列共享优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、还更优选至少90％、特别优选至少95％和最优选至少99％的序列同一性，如上所述。特别优选地，小型生物群序列变体不同于肿瘤相关抗原表位序列，仅在于一个、两个或三个氨基酸，更优选地仅在于一个或两个氨基酸。换句话说，特别优选地，与肿瘤相关抗原表位序列相比，小型生物群序列变体包括不大于三个氨基酸改变(即，一个、两个或三个氨基酸改变)，更优选地不大于两个氨基酸改变(即，一个或两个氨基酸改变)。还优选的是，小型生物群序列变体的核心序列与肿瘤相关抗原表位序列的核心序列同一，其中核心序列由除三个最N末端和三个最C-末端氨基酸之外的所有氨基酸组成，如上所述。此外，通过如上所述的用于鉴定小型生物群序列变体的方法获得的上述小型生物群序列变体的优选实施方式相应地适用于根据本发明的小型生物群序列变体。
根据本发明的小型生物群序列变体的具体实例包括(多)肽，其包含根据SEQ IDNO6-18中任一个的氨基酸序列和编码这些(多)肽的核酸分子，或由其组成。这些实例涉及IL13RA2表位的小型生物群序列变体。白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2或IL13RA2)是由IL13RA2基因在人类中编码的膜结合蛋白。以非穷举的方式，已报道IL13RA2是潜在的免疫疗法靶标(参见Beard et al.；Clin Cancer Res；72(11)；2012)。IL13RA2的高表达进一步与结直肠癌的侵袭、肝转移和不良预后相关(Barderas et al.；Cancer Res；72(11)；2012)。优选地，根据本发明的小型生物群序列变体包括根据SEQ ID NO：6或18的氨基酸序列或由其组成，或编码根据SEQ ID NO：6或18的氨基酸序列。更优选地，根据本发明的小型生物群序列变体包含根据SEQ ID NO：18的氨基酸序列或由其组成，或编码根据SEQ ID NO：18的氨基酸序列。
IL13RA2的表位的小型生物群序列变体的进一步优选的实例包括(多)肽，该(多)肽包括根据SEQ ID NO 132-141和158中任一个的氨基酸序列或由其组成，和编码这种(多)肽的核酸分子。优选地，根据本发明的小型生物群序列变体包括根据SEQ ID NO：139的氨基酸序列或由其组成，或编码根据SEQ ID NO：139的氨基酸序列。
根据本发明的小型生物群序列变体的其他优选的实例包括(多)肽，该(多)肽包括根据SEQ ID NO 66-84和126中任一个的氨基酸序列或由其组成，和编码这种(多)肽的核酸分子。那些实例涉及FOXM1(叉头框转录因子M1)的表位的小型生物群序列变体。FOXM1包括鉴定为细胞毒性T淋巴细胞表位的表位，并且在各种肿瘤和癌(包括胰腺肿瘤、卵巢癌和结肠直肠癌)中过表达。优选地，根据本发明的小型生物群序列变体包括根据SEQ ID NO：75的氨基酸序列或由其组成，或编码根据SEQ ID NO：75的氨基酸序列。
还优选地，小型生物群序列变体不由如SEQ ID NO：33(IISAVVGIA)、34(ISAVVGIV)或35(LFYSLADLI)中任一个所陈述的氨基酸序列组成或包括其。更优选地，小型生物群序列变体不由如SEQ ID NOs 33-35、36(ISAVVGIAV)、37(SAVVGIAVT)、38(YIISAVVGI)、39(AYIISAVVG)、40(LAYIISAVV)、41(ISAVVGIAA)、42(SAVVGIAAG)、43(RIISAVVGI)、44(QRIISAVVG)、45(AQRIISAVV)、46(SAVVGIVV)、47(AISAVVGI)、48(GAISAVVG)、49(AGAISAVV)或50(LLFYSLADL)中任一个所陈述的氨基酸序列组成或包括其。甚至更优选地，小型生物群序列变体不包括如SEQ ID NO:51(ISAVVG)和/或SEQ ID NO：52(SLADLI)中所陈述的氨基酸序列。最优选地，小型生物群序列变体不是具有如SEQ ID NO：53(IISAVVGIL；Her2/neu的表位)或SEQ ID NO：54(LLYKLADLI；ALDH1A1的表位)中所陈述的氨基酸序列的肿瘤相关抗原表位序列的序列变体(如本文所限定)。
在进一步方面，本发明还提供了包含如上所述的根据本发明的小型生物群序列变体的药物，其优选通过如上所述的根据本发明的药物制备方法获得。
因此，根据本发明的药物的特征、定义和优选实施方式对应于上面针对通过制备药物的方法制备的药物的描述的那些。例如，根据本发明的药物优选包含如上所述的纳米颗粒，其负载有如上所述的根据本发明的小型生物群序列变体。特别地，这种纳米颗粒可以进一步负载有如上所述的佐剂。此外，药物优选包含表达根据本发明的小型生物群序列变体的如上所述的细菌细胞。
优选地，药物包括：
(i)如上所述的小型生物群序列变体；
(ii)如上所述的包括小型生物群序列变体的(重组)蛋白；
(iii)如上所述的包括小型生物群序列变体的(免疫原性)化合物；
(iv)如上所述的负载有小型生物群序列变体的纳米颗粒；
(v)负载有小型生物群序列变体的抗原呈递细胞；
(vi)表达小型生物群序列变体的如上所述的宿主细胞，诸如细菌细胞；或
(vii)编码小型生物群序列变体的核酸分子；和
任选地，如上所述的药学上可接受的载体和/或佐剂。优选地，药物是药物组合物(药物组合物的形式/配制为药物组合物)。更优选地，药物是如上所述的疫苗。此外，上述用于通过如上所述的制备药物的方法制备的药物的优选实施方式相应地适用于根据本发明的药物。
本发明的组合物，特别是本发明的疫苗，还可以包含本文对于本发明的药物组合物所定义的药学上可接受的载体、佐剂和/或媒介。在本发明的组合物，特别是本发明的疫苗的具体背景下，药学上可接受的载体的选择原则上通过本发明的组合物，特别是本发明的疫苗的施用方式来确定。本发明的组合物，特别是本发明的疫苗，可以例如全身或局部施用。用于全身施用的途径通常包括例如透皮、口服、肠胃外途径，包括皮下、静脉内、肌肉内、动脉内、皮内和腹膜内注射和/或鼻内施用途径。用于局部施用的途径通常包括例如局部施用途径，但也包括皮内、透皮、皮下或肌内注射或病灶内、颅内、肺内、心内、结内和舌下注射。更优选地，本发明的组合物，特别是疫苗，可以通过皮内、皮下、结内或口服施用。甚至更优选地，本发明的组合物，特别是疫苗，可以通过皮下、结内或口服途径施用。特别优选地，本发明的组合物，特别是疫苗，可以通过皮下或口服途径施用。最优选地，本发明的组合物，特别是疫苗，可以通过口服途径施用。因此，本发明的组合物，特别是本发明的疫苗，优选以液体或固体形式配制。
可以通过利用动物模型的常规实验确定待施用的本发明的组合物，特别是本发明的疫苗的合适量。这些模型包括但不限于兔、绵羊、小鼠、大鼠、狗和非人灵长类动物模型。用于注射的优选单位剂型包括水、生理盐水或其混合物的无菌溶液。应将此类溶液的pH调节至约7.4。用于注射的合适载体包括水凝胶、用于控制或延迟释放的装置、聚乳酸和胶原基质。用于局部施用的合适的药学上可接受的载体包括适用于洗剂、乳膏、凝胶等的那些。如果要口服施用本发明的组合物，特别是本发明的疫苗，片剂、胶囊等是优选的单位剂型。用于制备可用于口服施用的单位剂型的药学上可接受的载体在现有技术中是众所周知的。其选择将取决于次要考虑因素，例如味道、成本和可储存性，这对于本发明的目的而言并不重要，并且本领域技术人员可以毫无困难地进行。
如上定义的本发明药物组合物还可以以任何口服可接受的剂型口服施用，包括但不限于胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在口服使用片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服使用需要水性悬浮液时，将活性成分，即如上定义的本发明的转运货物缀合分子与乳化剂和悬浮剂混合。如果需要，还可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。
本发明的药物组合物也可以局部施用，特别是当治疗靶标包括局部施加易于接近的区域或器官时，例如包括皮肤疾病或任何其他可接近的上皮组织的疾病。对于这些区域或器官中的每一个，容易制备合适的局部制剂。对于局部施加，本发明的药物组合物可以配制成悬浮或溶解在一种或多种载体中的合适的软膏，其含有本发明的免疫刺激组合物，特别是其如上定义的组分。用于局部施用的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯，聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可选地，可以将本发明的药物组合物配制成合适的洗剂或乳膏。在本发明的上下文中，合适的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
本发明药物组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1.3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的媒介和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，比如天然的药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙基化形式。这些油溶液或悬浮液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，诸如羧甲基纤维素或类似的分散剂，它们通常用于配制药学上可接受的剂型，包括乳液和悬浮液。通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其他常用表面活性剂，例如Tween、Span和其他乳化剂或生物利用度增强剂也可用于配制本发明的药物组合物的目的。
对于静脉内、皮肤或皮下注射，或在痛苦部位注射，活性成分优选地为肠胃外可接受的水溶液形式，其不含热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够使用例如等渗媒介如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸化林格氏注射液制备合适的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。将给予个体的无论是多肽、肽，还是核酸分子、根据本发明的其他药学上有用的化合物，施用优选地为“预防有效量”或“治疗有效量”(根据具体情况)，这足以显示对个体的益处。施用的实际量、施用的速率和时间过程将取决于正在治疗的性质和严重程度。
在这种情况下，当使用上述药物时，治疗的处方，如剂量等决定，通常由普通医师和其他医生负责，并且通常考虑待治疗的疾病、个体患者的状况，递送的部位，施用方法和医师已知的其他因素。上面提到的技术和协议的实例可以在REMINGTON'S PHARMACEUTICALSCIENCES,16th edition,Osol,A.(ed),1980中找到。
因此，本发明的药物组合物通常包含“安全和有效量”的本发明药物组合物的组分，特别是如本文所定义的小型生物群序列变体。如本文所用，“安全和有效量”是指足以显著诱导疾病或病症的阳性改变的如本文所定义的小型生物群序列变体的量，即在所寻求的组织、系统、动物或人体中引发生物或药用应答的如本文所定义的小型生物群序列变的量。有效量可以是用于缓解所治疗的疾病或病症的症状的“治疗有效量”和/或用于预防所预防的疾病或病症的症状的“预防有效量”。该术语还包括活性小型生物群序列变体的这样的量，该量足以减少疾病进展，特别是减少或抑制肿瘤生长或感染，从而引发所寻求的应答，特别是这种应答可能是直接针对小型生物群序列变体的免疫应答(即“抑制有效量”)。然而，与此同时，“安全和有效量”足够小以避免严重的副作用，也就是说允许优点和风险之间的合理关系。确定这些限制通常属于合理的医学判断范围。此外，本发明的药物组合物的组分，特别是如上定义的小型生物群序列变体的“安全和有效量”将在随行医生的知识和经验范围内根据待治疗的具体病症以及待治疗的患者的年龄和身体状况、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合、本文定义的特定小型生物群序列变体的活性、病情的严重程度、治疗的持续时间、伴随疗法的性质、所用的特定药学上可接受的载体的性质和类似因素而变化。本发明的药物组合物可以用于人并且还用于兽医医疗目的，优选用于人类医疗目的，通常用作药物组合物或用作疫苗。
根据本发明的药物组合物，特别是疫苗组合物或制剂可以作为药物制剂施用，所述药物制剂可以含有本文所述的任何形式的如本文所定义的小型生物群序列变体。
在本发明的上下文中使用的术语“药物制剂”和“药物组合物”特别是指这样的制剂，其形式是使活性成分(一种或多种)的生物活性明确有效并且不含有将对施用所述制剂的受试者有毒的额外的组分。
在本发明的上下文中，治疗的“功效”可以基于疾病过程中响应于根据本发明的用途或方法的变化来衡量。例如，癌症治疗的功效可以通过肿瘤体积的减小和/或无进展存活时间的增加和/或原发癌切除后复发风险的降低来衡量。更具体地，对于通过免疫疗法治疗的癌症，通过新的免疫相关应答标准(irRC)，可以通过免疫治疗剂的抗肿瘤应答的临床模式谱来评估功效，该免疫相关应答标准根据实体瘤的应答评估标准(RECIST)和世界卫生组织(WHO)标准(J.Natl.Cancer Inst.2010,102(18):1388–1397)改编。
根据本发明的药物组合物，特别是疫苗组合物或制剂也可以作为药物制剂施用，所述药物制剂可以含有本文所述任何形式的负载有本发明的小型生物群序列变体的抗原呈递细胞。
根据本发明的疫苗和/或组合物还可以配制成药物组合物和其单位剂量，特别是与上文和下文所述的常规使用的佐剂、免疫调节物质、载体、稀释剂或赋形剂一起，并且以此形式可以用作固体，诸如片剂或填充胶囊，或液体，诸如溶液、悬浮液、乳液、酏剂(elixir)或填充有它们的胶囊，全部用于口服使用，或以无菌注射溶液的形式通过注射或连续输注用于肠胃外(包括皮下和皮内)使用。
在本发明的上下文中，特别是在根据本发明的药物组合物和疫苗的背景下，可注射组合物通常基于可注射的无菌盐水或磷酸盐缓冲盐水或本领域已知的其他可注射载体。此类药物组合物和其单位剂型可包含常规比例的成分，有或没有其它活性化合物或原理，并且这种单位剂型可含有与所用的预期日剂量范围相当的任何合适有效量的活性成分。
根据本发明的组合物，特别是药物组合物和疫苗可以是液体制剂，包括但不限于水性或油性悬浮液、溶液、乳液、糖浆和酏剂。该组合物还可以配制成干燥产品，用于在使用前与水或其它合适的媒介重构。这种液体制剂可含有添加剂，包括但不限于悬浮剂、乳化剂、非水性媒介和防腐剂。悬浮剂包括但不限于山梨糖醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶和氢化食用脂肪。乳化剂包括但不限于卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯和阿拉伯胶。防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸甲酯或丙酯和山梨酸。分散剂或润湿剂包括但不限于聚(乙二醇)、甘油、牛血清白蛋白、
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Figure BDA0002443643050000312
根据本发明的组合物，特别是药物组合物和疫苗，也可以配制为可以通过植入或通过肌内注射施用的长效制剂。
根据本发明的组合物，特别是药物组合物和疫苗也可以是固体组合物，其可以是以常规方式配制的片剂或锭剂形式。例如，用于口服施用的片剂和胶囊可含有常规赋形剂，包括但不限于粘合剂、填料、润滑剂、崩解剂和润湿剂。结合剂包括但不限于糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶、淀粉粘液和聚乙烯吡咯烷酮。填料包括但不限于乳糖、糖、微晶纤维素、玉米淀粉、磷酸钙和山梨糖醇。润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、滑石、聚乙二醇和二氧化硅。崩解剂包括但不限于马铃薯淀粉和淀粉乙醇酸钠。润湿剂包括但不限于十二烷基硫酸钠。片剂可根据本领域熟知的方法被包被。
根据本发明的组合物，特别是药物组合物和疫苗，也可以以持续释放形式施用或从持续释放药物递送系统施用。
此外，根据本发明的组合物，特别是药物组合物和疫苗可以适于通过重复施用来递送。
医疗
在进一步方面，本发明提供如上所述的用于预防和/或治疗癌症的小型生物群序列变体/药物。因此，本发明提供了一种在有需要的受试者中预防和/或治疗癌症或启动、增强或延长抗肿瘤应答的方法，其包括给受试者施用如上所述根据本发明的小型生物群序列变体/药物。
如本文所用，术语“癌症”是指恶性肿瘤。特别地，术语“癌症”在本文中是指一类疾病或紊乱的任何成员，其特征在于细胞的不受控制的分裂和这些细胞侵入其他组织的能力，或者通过侵入直接生长到邻近组织中，或者通过转移植入远处部位。转移定义为癌细胞通过血流或淋巴系统转运的阶段。
优选地，药物与抗癌剂组合施用，更优选与免疫检查点调节剂组合施用。
本发明包括根据本发明的药物的施用，其中用于治疗和/或稳定癌症和/或预防癌症复发(例如多种药物方案)的其他治疗方案或辅助剂之前、同时或相继地将其以治疗有效量施用至受试者。根据本发明的药物可以作为所述活性助剂以相同或不同的组合物和通过相同或不同的施用途径施用。
所述其他治疗方案或活性助剂可选自放射疗法、化疗、手术、靶向疗法(包括小分子、肽和单克隆抗体)和抗血管生成疗法。抗血管生成疗法在本文中定义为直接或间接靶向肿瘤相关脉管系统的药剂的施用。优选的抗癌剂包括化学治疗剂、靶向药物和/或免疫治疗剂，例如免疫检查点调节剂。
传统的化学治疗剂是细胞毒性的，即它们通过杀死快速分裂的细胞起作用，快速分裂是大多数癌细胞的主要特性之一。与本文定义的小型生物群序列变体组合的优选化学治疗剂是本领域技术人员已知的用于治疗癌症的化学治疗剂。用于组合的优选化学治疗剂包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨
Figure BDA0002443643050000321
伊立替康
Figure BDA0002443643050000322
和奥沙利铂
Figure BDA0002443643050000323
还优选的是，本文定义的小型生物群序列变体与组合的化学疗法组合，组合的化学疗法优选地选自(i)FOLFOX(5-FU、甲酰四氢叶酸和奥沙利铂)；(ii)CapeOx(卡培他滨和奥沙利铂)；(iii)5-FU和甲酰四氢叶酸；(iv)FOLFOXIRI(甲酰四氢叶酸、5-FU、奥沙利铂和伊立替康)；和(v)FOLFIRI(5-FU、甲酰四氢叶酸和伊立替康)。在非扩散性癌症中，与(i)FOLFOX(5-FU、甲酰四氢叶酸和奥沙利铂)；(ii)CapeOx(卡培他滨和奥沙利铂)；或(iii)5-FU和甲酰四氢叶酸的组合是优选的。对于已经扩散的癌症，与(iv)FOLFOXIRI(甲酰四氢叶酸、5-FU、奥沙利铂和伊立替康)；(i)FOLFOX(5-FU、甲酰四氢叶酸和奥沙利铂)或(v)FOLFIRI(5-FU、甲酰四氢叶酸和伊立替康)的组合是优选的。
与本文定义的小型生物群序列变体组合的靶向药物包括VEGF靶向药物和EGFR靶向药物。VEGF靶向药物的优选实例包括贝伐单抗
Figure BDA0002443643050000331
雷莫芦单抗
Figure BDA0002443643050000332
或阿柏西普(ziv-aflibercept)
Figure BDA0002443643050000335
EGFR靶向药物的优选实例包括西妥昔单抗
Figure BDA0002443643050000333
帕尼单抗
Figure BDA0002443643050000334
或瑞格非尼
Figure BDA0002443643050000336
与本文定义的小型生物群序列变体组合的免疫治疗剂包括疫苗、嵌合抗原受体(CAR)、检查点调节剂和溶瘤病毒疗法。
与本文定义的小型生物群序列变体组合的优选疫苗包括TroVax、OncoVax、IMA910、ETBX-011、MicOryx、EP-2101、MKC1106-PP、CDX-1307、V934/V935、MelCancerVac、Imprime PGG、FANG、Tecemotide、AlloStim、DCVax、GI-6301、AVX701、OCV-C02。
人工T细胞受体(也称为嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体、嵌合抗原受体(CAR))是工程化受体，其将任意特异性移植到免疫效应细胞上。人工T细胞受体(CAR)在过继性细胞转移的背景下是优选的。为此，从患者体内取出T细胞并进行修饰，使其表达对癌症特异的受体。然后可以识别并杀死癌细胞的T细胞被重新引入患者体内。
优选地，与本文定义的小型生物群序列变体组合的免疫检查点调节剂是选自CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、VISTA、CEACAM1、GARP、PS、CSF1R、CD94/NKG2A、TDO、GITR、TNFR和/或FasR/DcR3的一种或多种免疫检查点分子的活化剂或抑制剂；或其一种或多种配体的活化剂或抑制剂。
更优选地，免疫检查点调节剂是(共)刺激检查点分子的活化剂或抑制性检查点分子的抑制剂或其组合。因此，免疫检查点调节剂更优选地为(i)CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR和/或ICOS的活化剂或(ii)A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PDL-1、PD-L2、TIM-3、VISTA、CEACAM1、GARP、PS、CSF1R、CD94/NKG2A、TDO、TNFR和/或FasR/DcR3的抑制剂。
甚至更优选地，免疫检查点调节剂是抑制性检查点分子的抑制剂(但优选不是刺激性检查点分子的抑制剂)。因此，免疫检查点调节剂甚至更优选地是A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PDL-1、PD-L2、TIM-3、VISTA、CEACAM1、GARP、PS、CSF1R、CD94/NKG2A、TDO、TNFR和/或DcR3或其配体的抑制剂。
还优选的是，免疫检查点调节剂是刺激性或共刺激性检查点分子的活化剂(但优选不是抑制性检查点分子的活化剂)。因此，免疫检查点调节剂更优选地是CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR和/或ICOS或其配体的活化剂。
甚至更优选的是，免疫检查点调节剂是CD40途径、IDO途径、LAG3途径、CTLA-4途径和/或PD-1途径的调节剂。特别地，免疫检查点调节剂优选地是CD40、LAG3、CTLA-4、PD-L1、PD-L2、PD-1和/或IDO的调节剂，更优选地，免疫检查点调节剂是CTLA-4、PD-L1、PD-L2、PD-1、LAG3和/或IDO的抑制剂，或CD40的活化剂，甚至更优选地，免疫检查点调节剂是CTLA-4、PD-L1、PD-1、LAG3和/IDO的抑制剂，甚至更优选地，免疫检查点调节剂是LAG3、CTLA-4和/或PD-1的抑制剂，和最优选地，免疫检查点调节剂是CTLA-4和/或PD-1的抑制剂。
因此，用于与本文定义的小型生物群序列变体组合的检查点调节剂可选自CTLA-4途径或PD-1途径的已知调节剂。优选地，用于与本文定义的小型生物群序列变体组合的检查点调节剂可以选自CTLA-4途径或PD-1途径的已知调节剂。特别优选地，免疫检查点调节剂是PD-1抑制剂。CTLA-4途径和PD-1途径的优选抑制剂包括单克隆抗体
Figure BDA0002443643050000341
(伊匹单抗；Bristol Myers Squibb)和替西利姆单抗(Pfizer/MedImmune)以及
Figure BDA0002443643050000343
(尼沃单抗；Bristol Myers Squibb)、
Figure BDA0002443643050000342
(彭布利单抗；Merck)、杜伐单抗(MedImmune/AstraZeneca)、MEDI4736(AstraZeneca；参见WO2011/066389A1)，MPDL3280A(Roche/Genentech；参见US8,217,149B2)、匹利珠单抗(CT-011；CureTech)、MEDI0680(AMP-514；AstraZeneca)、MSB-0010718C(Merck)、MIH1(Affymetrix)和兰布利单抗(例如在WO2008/156712中公开为hPD109A及其人源化衍生物h409All、h409A16和h409A17；Hamid et al.,2013；N.Engl.J.Med.369:134-144)。更优选的检查点抑制剂包括CTLA-4抑制剂
Figure BDA0002443643050000344
(伊匹单抗；Bristol Myers Squibb)和替西利姆单抗(Pfizer/MedImmune)以及PD-1抑制剂
Figure BDA0002443643050000345
(尼沃单抗；Bristol Myers Squibb)、
Figure BDA0002443643050000346
(彭布利单抗；Merck)、匹利珠单抗(CT-011；CureTech)、MEDI0680(AMP-514；AstraZeneca)、AMP-224和兰布利单抗(例如在WO2008/156712中公开为hPD109A及其人源化衍生物h409All、h409A16和h409A17；Hamid etal.,2013；N.Engl.J.Med.369:134-144)。
还优选的是，与本文定义的小型生物群序列变体组合的免疫检查点调节剂选自彭布利单抗、伊匹单抗、尼沃单抗、MPDL3280A、MEDI4736、替西利姆单抗、Avelumab、PDR001、LAG525、INCB24360、伐利单抗、乌洛单抗、AMP-224和CM-24。
通过在肿瘤中复制，将溶瘤病毒工程化以引起细胞裂解，因此活化抗肿瘤免疫应答。与本文定义的小型生物群序列变体组合的溶瘤病毒疗法优选选自JX594(胸苷激酶失活的痘苗病毒)、ColoAd1(腺病毒)、NV1020(HSV衍生的)、ADXS11-001(减毒李斯特菌疫苗)、
Figure BDA0002443643050000347
(人呼肠孤病毒的特殊制剂)、PANVAC(重组痘苗病毒CEA-MUC-1-TRICOM)、Ad5-hGCC-PADRE(重组腺病毒疫苗)和vvDD-CDSR(痘苗病毒)。
优选地，(i)小型生物群序列变体与(ii)化学治疗剂、靶向药物和/或免疫治疗剂，诸如免疫检查点调节剂大约同时施用。
“大约同时”，如本文所用，具体是指同时施用，或在施用(i)化学治疗剂、靶向药物和/或免疫治疗剂(诸如免疫检查点调节剂)之后直接施用(ii)小型生物群序列变体，或在施用(i)小型生物群序列变体之后直接施用(ii)化学治疗剂、靶向药物和/或免疫治疗剂(诸如免疫检查点调节剂)。技术人员理解“在......之后直接”包括准备第二次施用所需的时间-特别是暴露和消毒第二次施用的位置以及适当制备“施用装置”(如，注射器、泵等)所需的时间。同时施用还包括如果(i)小型生物群序列变体和(ii)化学治疗剂、靶向药物和/或免疫治疗剂(诸如免疫检查点调节剂)的施用时间段重叠，或如果，例如，通过例如输注在在较长的时间段内，诸如30分钟、1小时、2小时或甚至更长时间施用一种组分，并且在这样长的时间段内的某个时间施用另一种成分。如果使用不同的施用途径和/或不同的施用部位，则大约同时施用(i)小型生物群序列变体和(ii)化学治疗剂、靶向药物和/或免疫治疗剂(诸如免疫检查点调节剂)是特别优选的。
还优选的是，连续施用(i)小型生物群序列变体和(ii)化学治疗剂、靶向药物和/或免疫治疗剂(诸如免疫检查点调节剂)。这意味着在(ii)化学治疗剂、靶向药物和/或免疫治疗剂(诸如免疫检查点调节剂)之前或之后施用(i)小型生物群序列变体。在连续施用中，施用第一组分和施用第二组分之间的时间优选不超过一周，更优选不超过3天，甚至更优选不超过2天，和最优选不超过24小时。特别优选的是，(i)小型生物群序列变体和(ii)化学治疗剂、靶向药物和/或免疫治疗剂(诸如免疫检查点调节剂)在同一天施用，其中施用第一组分(小型生物群序列变体的检查点调节剂)和施用第二组分(另一种检查点调节剂和小型生物群序列变体)之间的时间优选不超过6小时、更优选不超过3小时、甚至更优选不超过2小时、和最优选不超过1小时。
优选地，(i)小型生物群序列变体和(ii)化学治疗剂、靶向药物和/或免疫治疗剂(诸如免疫检查点调节剂)通过相同的施用途径施用。还优选的是，(i)小型生物群序列变体和(ii)化学治疗剂、靶向药物和/或免疫治疗剂(诸如免疫检查点调节剂)通过不同的施用途径施用。
此外，(i)小型生物群序列变体和(ii)化学治疗剂、靶向药物和/或免疫治疗剂(诸如免疫检查点调节剂)优选在不同的组合物中提供。可选地，(i)小型生物群序列变体和(ii)化学治疗剂、靶向药物和/或免疫治疗剂(诸如免疫检查点调节剂)优选在相同的组合物中提供。
因此，本发明提供了药物制剂，其包含根据本发明的小型生物群序列变体和至少一种药学可接受的载体，根据本发明的小型生物群序列变体与至少一种可用于治疗和/或稳定癌症和/或预防癌症复发的活性助剂组合。
此外，根据本发明的小型生物群序列变体可以在手术后施用，在该手术中已经除去实体瘤以预防复发和/或转移。
此外，在根据本发明的方法和用途中成像或诊断组合物的施用可以单独进行或与用于成像和/或诊断癌症的活性助剂组合进行。
本发明可以应用于患有癌症或有患癌风险的任何受试者。特别地，所述小型生物群序列变体的治疗效果可以是引发针对参考肿瘤相关抗原表位的免疫应答，特别是依赖于CD8+细胞毒性T细胞和/或由MHC I类分子介导的应答。
在进一步方面，本发明还提供了一种用于确定如本文所述的肿瘤相关抗原表位序列的小型生物群序列变体是否存在于个体中的(体外)方法，包括确定如本文所述的肿瘤相关抗原表位序列的小型生物群序列变体是否存在于个体的(分离的)样品中的步骤。优选地，(分离的)样品是粪便样品或血液样品。在这种情况下，小型生物群序列变体优选通过本文所述的根据本发明的用于鉴定小型生物群序列变体的方法来鉴定/获得。
例如，可以基于包含小型生物群序列变体的小型生物群(诸如细菌)的检测来进行确定小型生物群序列变体的存在。为此，可以收集粪便样品，并且可以从粪便样品中分离核酸和/或蛋白质/(多)肽。然后分离的核酸和/或蛋白质/(多)肽可以是被测序。例如，可以使用如上所述的由国际人类微生物组标准(IHMS)项目开发和提供的一个或多个标准操作程序(SOP)(URL:http://www.microbiome-standards.org/#SOPS)。作为具体实例，从粪便样品中提取的DNA的测序可以在Illumina HiSeq上以4000万对末端读数进行。可以使用生物信息学管道分析序列，以鉴定表达细菌肽的候选细菌的基因组部分。另一种方法可以通过使用特别设计的PCR引物对和实时PCR单次检测小型生物群序列变体。
此外，可以例如基于能够识别小型生物群序列变体的免疫应答和/或预先存在的记忆T细胞来进行小型生物群序列变体的存在的确定。为此，可以在分离的血液样品中处理免疫应答，例如通过将小型生物群序列变体(肽)与纯化的外周血单核细胞(PBMC)共孵育和通过ELISPOT测定评估免疫应答。这种测定是本领域熟知的(Calarota SA,BaldantiF.Enumeration and characterization of human memory T cells by enzyme-linkedimmunospot assay.Clin Dev Immunol.2013；2013:637649)。可选地，通过淋巴组织增生应答或细胞内染色评估记忆T细胞和T细胞活化可用于确定小型生物群序列变体或能够识别小型生物群序列变体的预先存在的记忆T细胞的存在。
因此，如上所述根据本发明的用于在有需要的受试者中预防和/或治疗癌症或启动、增强或延长抗肿瘤应答的方法可以进一步包括确定由待施用于受试者的药物组成的肿瘤相关抗原表位序列的小型生物群序列变体是否存在于受试者体内的步骤。可以如上所述执行这种确定。
优选地，在如上所述的根据本发明的用于在有需要的受试者中预防和/或治疗癌症或启动、增强或延长抗肿瘤应答的方法中，由待施用的药物组成的肿瘤相关抗原表位序列的小型生物群序列变体存在于受试者体内。不受任何理论的束缚，可以想到患者可以具有由小型生物群序列变体引发的记忆T细胞。然后可以利用对包含小型生物群序列变体的施用药物的攻击来重新活化针对小型生物群序列变体的现有记忆T细胞，并且该现有记忆T细胞将被将加强，并加速抗肿瘤应答的建立。
还优选的是，在如上所述的根据本发明的在有需要的受试者中预防和/或治疗癌症或启动、增强或延长抗肿瘤应答的方法中，由待施用的药物组成的肿瘤相关抗原表位序列的小型生物群序列变体不存在于受试者体内。不受任何理论的束缚，可以想到在肠道中特定的小型生物群序列变体的过度表达和小型生物群序列变体的非常高的亲和力可能导致能够识别这种小型生物群序列变体的T细胞所有组成成分的耗尽，并可能降低临床疗效。
附图说明
在下文中，将给出附图的简要描述。附图旨在更详细地说明本发明。然而，它们不旨在以任何方式限制本发明的主题。
图1显示了实施例6中使用的免疫方案的示意图。
图2显示了实施例6，第1组(IL13RA2-B)和第2组(IL13RA2-A)的ELISPOT-IFNγ结果。用于疫苗接种的肽(在每组的支架之间)和ELISPOT培养中使用的刺激物(X轴)表示在图表上。(A)特定ELISPOT-IFNγ斑点的数目(减去培养基条件)。每个点代表来自相应条件四倍组(quadruplicate)的一个个体/小鼠的平均值。(B)对于每个个体，将特异性ELISPOT-IFNγ应答的水平与ConA刺激进行比较(值：100％)。统计学分析：用于组内比较的配对t检验和用于组间比较的非配对t检验；*p<0.05。
图3显示了实施例7的结果。
图4显示了实施例12中用FOXM1-B2接种疫苗的小鼠的ELISPOT-IFNγ结果。图中显示了用于疫苗接种和离体刺激脾细胞的肽。该图显示了特定的ELISPOT-IFNγ点的数量(减去培养基条件)。每个点代表来自相应条件两倍组的一个个体/小鼠的平均值。
图5显示了实施例14中细菌肽IL13RA2-BL(SEQ ID NO：139)强力地结合HLA-A*0201，而对应的人肽不结合HLA-A*0201。
图6显示了实施例15中HHD DR3转基因小鼠的结果。用IL13RA2-BL(FLPFGFILPV；SEQ ID NO：139)使HHD DR3转基因小鼠免疫。在第21天，对小鼠实施安乐死并获取脾脏。制备脾细胞并用IL13RA2-BL(FLPFGFILPV；SEQ ID NO：139)或IL13RA2-H(WLPFGFILI；SEQ IDNO：1)进行体外刺激。对总脾细胞进行Elispot。将数据标准化为来自脾细胞混合物的T细胞的数量。每个点代表来自相应条件两倍组的一个个体/小鼠的平均值。
图7显示了实施例15中HHD DR1转基因小鼠的结果。用IL13RA2-BL(FLPFGFILPV；SEQ ID NO：139)使HHD DR1转基因小鼠免疫。在第21天，对小鼠实施安乐死并获取脾脏。制备脾细胞并用IL13RA2-BL(FLPFGFILPV；SEQ ID NO：139)或IL13RA2-HL(WLPFGFILIL；SEQID NO：131)体外刺激。对总的脾细胞进行Elispot，每个点代表来自相应条件三倍组的一个个体/小鼠的平均值。
图8显示了实施例16中用H2Db B2接种疫苗的C57BL/6小鼠，和用细菌肽H2Db B2离体刺激的对照小鼠(用OVA和IFA接种疫苗)或鼠参考肽H2Db M2的ELISPOT-IFNγ结果。该图显示了具体的ELISPOT-IFNγ点的数量(减去培养基条件)。每个点代表来自相应条件三倍组的一个个体/小鼠的平均值。
图9显示实施例16中用H2 Ld B5接种疫苗的BALB/c小鼠和用细菌肽H2 Ld B5离体刺激的对照小鼠(用OVA和IFA接种疫苗)或鼠参考肽H2 Ld M5的ELISPOT-IFNγ结果。该图显示了具体的ELISPOT-IFNγ点的数量(减去培养基条件)。每个点代表来自相应条件三倍组的一个个体/小鼠的平均值。
实施例
在下文中，呈现了说明本发明的各种实施方式和方面的特定实施例。然而，本发明不限于本文所述的具体实施方式的范围。给出以下制备和实施例以使本领域技术人员能够更清楚地理解和实践本发明。然而，本发明的范围不受示例性实施方式的限制，这些实施方式仅用于说明本发明的单个方面，并且功能上等同的方法在本发明的范围内。实际上，根据前面的描述、附图和以下实施例，除了本文所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。所有这些修改都落入所附权利要求的范围内。
实施例1：人微生物组中肿瘤相关表位的细菌序列变体的鉴定
1.肿瘤相关抗原(TAA)和肿瘤特异性抗原(TSA)的选择
根据经典定义，肿瘤特异性抗原(TSA)来自仅存在于肿瘤细胞上的抗原(蛋白质)，但不存在于任何其他细胞类型上，而肿瘤相关抗原(TAA)存在于一些肿瘤细胞上，也存在于某些肿瘤细胞和“正常”(非肿瘤)细胞上。如本文所用，术语“肿瘤相关抗原”包括肿瘤相关(TAA)以及肿瘤特异性抗原(TSA)。
肿瘤相关蛋白/抗原的选择基于文献进行，特别是基于众所周知的TAA和TSA列表。例如，可以从数据库获得大量潜在的TAA和TSA，例如肿瘤T细胞抗原数据库(“TANTIGEN”；http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/)、肽数据库(https://www.cancerresearch.org/scientists/events-and-resources/peptide-database)或CTdatabase(http://www.cta.lncc.br/)。可以手动将来自这些数据库的数据与上述文献进行比较，以鉴定可行的肿瘤相关抗原。例如，关于肿瘤中抗原的特异性表达的文献，诸如Xu et al.,Anintegrated genome-wide approach to discover tumor-specific antigens aspotential immunologic and clinical targets in cancer.Cancer Res.2012 Dec 15；72(24):6351-61；Cheevers et al.,The prioritization of cancer antigens:anational cancer institute pilot project for the acceleration of translationalresearch.Clin Cancer Res.2009 Sep 1；15(17):5323-37，可以用于优选处理感兴趣的抗原。鉴定了超过600种候选抗原的列表。使用可用工具对所有选择的抗原进行关于表达型分析的注释，可用工具诸如Gent(http://medicalgenome.kribb.re.kr/GENT/)、代谢基因可视仪(http://merav.wi.mit.edu/)、蛋白质Atlas(https://www.proteinatlas.org/)或GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)。另外，对于每种抗原，指定了潜在适应症，与可能的副作用的关系，以及驱动与过客抗原。
在600种抗原中，基于以下事实选择白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2或IL13RA2)：(i)它包含被鉴定为CTL(细胞毒性T淋巴细胞)的表位(Okano F,Storkus WJ,Chambers WH,Pollack IF,Okada H.Identification of a novel HLA-A*0201-restricted,cytotoxic T lymphocyte epitope in a human glioma-associatedantigen,interleukin 13 receptor alpha2 chain.Clin Cancer Res.2002 Sep；8(9):2851-5)；(ii)IL13RA2在肿瘤T细胞抗原数据库和CT数据库中被引用为脑肿瘤中的过表达基因；(iii)用Gent，代谢基因可视仪和蛋白质图谱等工具证实IL13RA2的过表达和选择性表达，分析基因表达数据(微阵列研究)；和(iv)在脑肿瘤(Debinski et al.,Molecularexpression analysis of restrictive receptor for interleukin 13,a brain tumor-associated cancer/testis antigen.Mol Med.2000 May；6(5):440-9)，在头颈部肿瘤(Kawakami et al.,Interleukin-13 receptor alpha2 chain in human head and neckcancer serves as a unique diagnostic marker.Clin Cancer Res.2003 Dec 15；9(17):6381-8)和在黑色素瘤(Beard et al.,Gene expression profiling usingnanostring digital RNA counting to identify potential target antigens formelanoma immunotherapy.Clin Cancer Res.2013 Sep 15；19(18):4941-50)的文献中也报道了过表达。
具体而言，IL13RA2的过表达和选择性表达的确认(点(iii))如下进行：来自“TheCancer Genome Atlas”(TCGA；可在https://cancergenome.nih.gov/获得))产生的组织图谱(RNA-seq数据37正常组织和17种癌症类型)的mRNA数据的分析突出显示正常组织中IL13RA2 mRNA的低基础水平(睾丸除外)和几种肿瘤类型中高水平的IL13RA2 mRNA表达，其中在胶质瘤样品中观察到最高表达。当使用Metabolic gEne RApid Visualizer(可从http://merav.wi.mit.edu/获得，分析来自International Genomic Consortium和NCBIGEO数据集的数据)进行IL13RA2 mRNA表达时在观察到相同的情况，其中在大多数测试的正常组织(除睾丸外)中的非常低的基础表达，和在黑色素瘤样品、胶质母细胞瘤和甲状腺和胰腺原发性肿瘤的一些样品中的强表达。
IL13RA2是膜结合蛋白，其由IL13RA2基因在人体中编码。以非穷举的方式，已报道IL13RA2是潜在的免疫疗法靶标(参见Beard et al.；Clin Cancer Res；72(11)；2012)。IL13RA2的高表达进一步与结肠直肠癌的侵袭、肝转移和不良预后相关(Barderas et al.；Cancer Res；72(11)；2012)。因此，IL13RA2可以被认为是驱动肿瘤抗原。
2.在所选择的肿瘤相关抗原中选择一种或多种感兴趣的表位
在下一步中，鉴定选择的肿瘤相关抗原的表位——其通过MHC-I特异性呈递。为此，利用“免疫表位数据库和分析资源”(IEDB；http://www.iedb.org/；特别是对于MHC-I分析：http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_processing.html-如用于IL13RA2分析，也参见http://tools.immuneepitope.org/processing/)分析(IL13RA2的)肿瘤相关抗原序列，结合蛋白酶体切割、TAP转运和MHC I类分析工具用于预测肽呈递。即，将IL13RA2的蛋白质序列提交给IEDB分析工具以鉴定可由HLA.A2.1呈递的潜在表位。由此，获得具有HLA A2.1结合特性的371个潜在表位的列表。该列表的两个表位先前被描述为潜在的表位：WLPFGFILI(SEQ ID NO：1)，其由Okano等人描述和功能验证(Okano F,StorkusWJ,Chambers WH,Pollack IF,Okada H.Identification of anovel HLA-A*0201-restricted,cytotoxic T lymphocyte epitope in a human glioma-associatedantigen,interleukin 13 receptor alpha2 chain.Clin Cancer Res.2002 Sep；8(9):2851-5)和LLDTNYNLF(SEQ ID NO：2)，其在IEDB数据库中报道，如在黑素瘤肽组研究中发现的(Gloger et al.,Mass spectrometric analysis of the HLA class I peptidome ofmelanoma cell lines as a promising tool for the identification of putativetumor-associated HLA epitopes.Cancer Immunol Immunother.2016 Nov；65(11):1377-1393)。
为了鉴定表位，其具有很好的机会被MHC在肿瘤细胞表面有效呈递，在具有HLAA2.1结合特性的371个潜在表位列表中，使用NetMHCpan 3.0工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)计算371个候选表位对HLA A2.1的计算机模拟亲和力，其中最高可接受的亲和力为3000nM(IC50)。由此，获得了54个IL13RA2表位的列表。
3.鉴定人微生物组中所选择的表位的细菌序列变体
最后，将54个选择的IL13RA2-表位与“人肠道微生物组的综合参考目录”(可从http://meta.genomics.cn/meta/home获得)进行比较，以鉴定54个选择的人IL13RA2-表位的小型生物群序列变体。为此，使用“PAM-30”蛋白质取代基质进行蛋白质BLAST检索(blastp)，其描述了每个部位随时间的氨基酸变化率，并推荐用于低于35个氨基酸的长度查询；单词大小为2，也建议用于短查询；期望值(E)为20000000，调整以最大化可能匹配的数目；基于组合的统计设置为'0'，输入序列短于30个氨基酸，和仅允许无间隙比对。然后，将blastp结果过滤以获得长度为9个氨基酸的微生物肽序列(用于结合HLA-A2.1)，仅在人肽的开始和/或末端处允许错配，每个序列允许最多两个错配。由此，获得了514个细菌序列(九肽，长度为9个氨基酸，用作过滤器)的列表，其由人微生物组中选择的IL13RA2表位的细菌序列变体组成。
实施例2：测试选择的细菌序列变体与MHC的结合
由于微生物模拟物与MHC分子的结合对于抗原呈递至细胞毒性T细胞是必需的，因此使用NetMHCpan 3.0工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)计算514个细菌序列与MHC I类HLA.A2.01的亲和力。该工具接受超过180000个定量结合数据的训练，结合数据涵盖来自人类(HLA-A、B、C、E)和其他物种的172个MHC分子。514个细菌序列(实施例1的blastp结果)用作输入，并且通过设定强和弱结合物的默认阈值来预测亲和力。将与一组400000随机天然肽相比较的预测亲和力的等级用作结合亲和力的量度。该值不受某些分子对更高或更低的平均预测亲和力的固有偏差的影响。非常强的结合物被定义为具有％等级<0.5，强结合物被定义为具有％等级≥0.5且<1.0，中等结合物被定义为具有％等级≥1.0且≤2.0(特别地，中等结合物包括“中等至强”结合物，其被定义为具有％等级≥1.0和<1.5)并且弱结合物被定义为具有％等级<2.0。即，从514个细菌序列中，仅选择那些，其显示出非常强的亲和力(％等级<0.5)，并且其中人参考表位显示至少中等至强的亲和力(对于人肽)(％等级<1.5)，优选地其中人参考表位显示至少强的亲和力(对于人肽)(％等级<1)。
由此，鉴定出以下13个细菌序列变体(肽1-肽13)。
(表3):
Figure BDA0002443643050000401
Figure BDA0002443643050000411
实施例3：确定包含选择的细菌序列变体的细菌蛋白的注释和细胞定位
接下来，进行含有所选细菌表位序列变体的细菌蛋白的注释。为此，基于blast的比较针对京都基因和基因组百科全书(KEGG)(http://www.genome.jp/kegg/)和国家生物技术信息中心(NCBI)参考序列数据库(RefSeq)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)。RefSeq提供了一组完整的非冗余序列，包括基因组DNA、转录物和蛋白质。在KEGG中，使用存储在KO(KEGG Orthology)数据库中的分子水平功能。这些功能按直系同源分组，其中包含由来自不同物种的基因编码的蛋白质，这些不同物种是从共同的祖先进化而来的。
在下一步骤中，使用两种不同的程序进行含有所选细菌表位序列变体的细菌蛋白的细胞定位的预测，之后递送具有共有预测的含肽蛋白的列表。首先，进行基于信号肽存在的预测来鉴定细胞内或细胞外蛋白质的二分法检索策略。信号肽是普遍存在的蛋白质分选信号，该蛋白质分选信号靶向它们的过客蛋白质，用于在原核生物中穿过细胞质膜转运。在这种情况下，SignalP 4.1.(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)和Phobius服务器(phobius.sbc.su.se)二者都用于递送共有预测。如果通过两种方法都检测到信号肽的存在，则认为该蛋白质可能是细胞外或周质的。如果不是，蛋白质可能属于外/内膜，或者是细胞质。其次，进行跨膜拓扑的预测。信号肽和跨膜结构域都是疏水的，但跨膜螺旋通常具有更长的疏水区域。SignalP 4.1.和Phobius有能力区分信号肽和跨膜结构域。设定最少2个预测的跨膜螺旋以区分膜和细胞质蛋白，以递送最终的共有列表。关于细菌蛋白的潜在细胞定位的数据对于选择免疫原性肽是感兴趣的，假设分泌的外泌体中包含的分泌的组分或蛋白质更易于由APC呈递。
表4显示了含有表4中所示的13种细菌肽的细菌蛋白的SEQ ID NO，它们的注释和细胞定位：
Figure BDA0002443643050000412
Figure BDA0002443643050000421
基于表3和4中所示的数据，选择根据SEQ ID NO：18的细菌肽(氨基酸序列：FLPFGFILV；在本文中也称为“IL13RA2-B”)进一步研究，其是根据SEQ ID NO：1(WLPFGFILI，参见表2；在本文中也称为“IL13RA2-H”)的人IL13RA2参考表位的序列变体。有效地，人参考表位具有中等亲和力，并且在肿瘤细胞的表面呈递。该MHC呈递在几项已发表的研究中得到证实(Okano et al.,Identification of a novel HLA-A*0201-restricted,cytotoxic Tlymphocyte epitope in a human glioma-associated antigen,interleukin 13receptor alpha2 chain.Clin Cancer Res.2002 Sep；8(9):2851-5)。
细菌序列变体(SEQ ID NO：18)对HLA.A2.01具有非常强的结合亲和力。此外，该细菌肽序列变体包含在细菌蛋白中，预测其在跨膜水平表达，从而增加成为外来体的一部分的可能性，所述外来体将被抗原呈递细胞(APC)捕获用于MHC呈递。
实施例4：细菌肽IL13RA2-B(SEQ ID NO：18)在体外对HLA-A*0201等位基因的亲和 力优于人表位IL13RA2-H(SEQ ID NO：1)
该实施例提供了证据，即序列SEQ ID NO：18的细菌肽(FLPFGFILV；在本文中也称为“IL13RA2-B”)在体外对HLA-A*0201等位基因具有高亲和力，而对应的衍生自IL13RA2(WLPFGFILI，SEQ ID NO：1，在本文中也称为“IL13RA2-H”)的参考人肽具有低亲和力。
A.材料和方法
A1.测量肽与T2细胞系的亲和力。
该实验方案类似于由HLA-A*0201呈递的肽验证的方案(Tourdot et al.,Ageneral strategy to enhance immunogenicity of low-affinity HLA-A2.1-associated peptides:implication in the identification of cryptic tumorepitopes.Eur J Immunol.2000 Dec；30(12):3411-21)。用表达HLA-A*0201分子的人肿瘤细胞T2实现肽的亲和力测量，但是人肿瘤细胞T2为TAP1/2阴性且不能呈递内源肽。
在37℃下，将T2细胞(每孔2.105个细胞)与肽——肽的浓度从100μM递减到0.1μM——在补充有100ng/μl的人β2m的AIMV培养基中孵育16小时。然后将细胞洗涤两次并用与PE偶联的抗HLA-A2抗体(克隆BB7.2，BD Pharmagen)标记。
通过FACS(Guava Easy Cyte)进行分析。对于每个肽浓度，从背景噪声中减去与感兴趣的肽相关的标记的几何平均值，并报告为针对在100μM的浓度下参考肽HIV pol 589-597获得的HLA-A*0202标记的几何平均值的百分比。然后如下确定相对亲和力：
相对亲和力＝诱导20％的HLA-A*0201表达的每个肽的浓度/诱导20％的HLA-A*0201表达的参考肽的浓度。
A2.肽的溶解
通过考虑氨基酸组成使每个肽溶解。对于不包含任何半胱氨酸、甲硫氨酸或色氨酸的肽，DMSO的添加可能高达总体积的10％。将其他肽重悬浮于水或pH 7.4的PBS中。
B.结果
对于T2细胞：可变肽浓度的平均荧光强度：关于偶连IL13RA2肽(IL13RA2-H和IL13RA2-B)，人肽不与HLA-A*0201结合，而细菌肽IL13RA2-B与HLA-A*0201强烈结合：在100μM下112.03对18.64；在10μM下40.77对11.61；在1μM下12.18对9.41；在0.1μM下9.9对7.46。另外，在4.4μM下IL13RA2-B诱导20％的HLA-A*0201表达(IL13RA2-H，对100μM)。
从第二个不同的T2细胞克隆获得了类似的结果。
实施例5：细菌肽IL13RA2-B(SEQ ID NO：18)在体外具有对HLA-A*0201等位基因的 优异亲和力。
该实施例提供了证据，即与相应的衍生自IL13RA2(WLPFGFILI，SEQ ID NO：1，在本文中也称为“IL13RA2-H”)的参考人肽的其他序列变体相比，序列SEQ ID NO：18的细菌肽(FLPFGFILV；在本文中也称为“IL13RA2-B”)对HLA-A*0201等位基因具有更高的亲和力。在该实验中，将序列SEQ ID NO：18的细菌肽(FLPFGFILV；在本文中也称为“IL13RA2-B”)与下述相比：
-肽“1A9V”，如Eguchi Junichi et al.,2006,Identification of interleukin-13 receptor alpha 2 peptide analogues capable of inducing improved antigliomaCTL responses.Cancer Research 66(11):5883-5891所描述，其中SEQ ID NO：1的位置1的色氨酸被丙氨酸(1A)取代，和SEQ ID NO：1的位置9的异亮氨酸被缬氨酸(9V)取代；
-肽“1I9A”，其中SEQ ID NO：1的位置1的色氨酸被异亮氨酸(1I)取代，和SEQ IDNO：1的位置9的异亮氨酸被丙氨酸(9A)取代；和
-肽“1F9M”，其中SEQ ID NO：1的位置1的色氨酸被苯丙氨酸(1F)取代，和SEQ IDNO：1的位置9的异亮氨酸被甲硫氨酸(9M)取代。
A.材料和方法
实验方案、材料和方法对应于实施例4中概述的那些，唯一的区别在于使用上述抗原肽。
B.结果
获得以下体外结合亲和力(表5)：
肽 体外结合亲和力
IL13RA2-B(SEQ ID N°18) 0.49
1A9V 3.06
1I9A 2.22
1F9M 2.62
因此，根据本发明的抗原肽(IL13RA2-B(SEQ ID N°31))显示出比测试的所有其他肽更高的对HLA-A*0201的结合亲和力，而肽“1A9V”，如Eguchi Junichi et al.,2006,Identification of interleukin-13 receptor alpha 2 peptide analogues capableof inducing improved antiglioma CTL responses.Cancer Research 66(11):5883-5891所描述，显示出测试的肽的最低亲和力。
实施例6：用细菌肽IL13RA2-B(SEQ ID NO：18)对小鼠进行疫苗接种，在ELISPOT- IFNγ测定中诱导改善的T细胞应答
A.材料和方法
A.1小鼠模型
表6中概述了使用的模型的特征：
小鼠模型 C57BL/6J Bm<sup>tm1Unc</sup>IAb<sup>-/-</sup>Tg(HLA-DRA HLA-DRB1*0301)<sup>#Gjh</sup>Tg(HLA-A/H2-D/B2M)<sup>1Bpe</sup>
缩写 β/A2/DR3
描述 免疫组分，无小鼠I类和II类MHC
住处(housing) SOPF条件(ABSL3)
小鼠数目 24个成年(>8周龄)
在几篇报道中描述了这些小鼠(Koller et al.,Normal development of micedeficient in beta 2M,MHC class I proteins,and CD8+T cells.Science.1990 Jun 8；248(4960):1227-30.Cosgrove et al.,Mice lacking MHC class IImolecules.Cell.1991 Sep 6；66(5):1051-66；Pascolo et al.,HLA-A2.1-restrictededucation and cytolytic activity of CD8(+)T lymphocytes from beta2microglobulin(beta2m)HLA-A2.1 monochain transgenic H-2Db beta2m doubleknockout mice.J Exp Med.1997 Jun 16；185(12):2043-51)。
A.2.免疫方案
免疫方案如图1所示。简言之，将14只β/A2/DR3小鼠随机分配(基于小鼠性别和年龄)至两个实验组，每组用特定的疫苗接种肽(vacc-pAg)联合常见辅助肽(h-pAg)免疫(如下表7中所概述)。成对比较vacc-pAg(第1组对第2组)。因此，在每个波中比较单个肽的天然和优化形式。
表7.实验组组成。h-pAg：'辅助'肽；vacc-pAg：疫苗接种肽。加强注射的数目显示在括号中。
组 肽(vacc-pAg) 辅助(h-pAg) 引发 加强 动物数目
1 IL13RA2-B(100μg)SEQ ID N°18 HHD-DR3(150μg)SEQ ID N°32 + +(1X) 6
2 IL13RA2-H(100μg)SEQ ID N°1 HHD-DR3(150μg)SEQ ID N°32 + +(1X) 6
肽提供为如下：
·成对vacc-pAg：IL13RA2-H和IL13RA2-B；所有均以4mg/ml(4mM)浓度产生和提供；
·h-pAg：HHD-DR3肽(SEQ ID NO:32)；冻干提供(50.6mg；Eurogentec批次1611166)并以10mg/mL浓度在纯蒸馏水中重悬浮。
在第0天(d0)用引发注射免疫动物，并在第14天用加强注射免疫动物。每只小鼠在尾根处皮下注射100μL油基乳液，该油基乳液包含：
·100μg的vacc-pAg(每只小鼠25μL 4mg/mL的原液)；
·150μg的h-pAg(每只小鼠15μL 10mg/mL的原液)；
·10μL的PBS以达到(每只小鼠)50μL的总体积；
·以1：1(v：v)比添加不完全弗氏佐剂(IFA)(每只小鼠50μL)。
针对每个vacc-pAg制备单独的乳剂，如下：在15mL管中将IFA试剂加入到vacc-pAg/h-pAg/PBS混合物中并在涡旋下混合1分钟，重复循环直至形成稠乳液。
A.3.小鼠分析
在加强注射后7天(即在第21天)，使动物安乐死并获取脾脏。通过机械破坏器官然后进行70μm过滤和Ficoll密度梯度纯化来制备脾细胞。
脾细胞立即用于ELISPOT-IFNγ测定(表8)。以四联组重复实验条件，每孔使用2×105个总脾细胞，并在存在vacc-pAg(10μM)、伴刀豆球蛋白A(ConA，2.5μg/mL)或仅培养基的情况下培养以评估它们分泌IFNγ的能力。按照制造商的说明使用商业ELISPOT-IFNγ试剂盒(Diaclone Kit Mujrine IFNγELISpot)，并在孵育约16小时后进行测定。
表8.ELISPOT-IFNγ测定的设置.
Figure BDA0002443643050000461
在与ImmunoSpot 5.4软件(CTL-Europe)接口(interface)的Grand
Figure BDA0002443643050000462
S6Ultimate UV图像分析仪上计数斑点。使用Prism-5软件(GraphPad Software Inc.)进行数据绘图和统计分析。
还通过流式细胞术分析细胞悬浮液，用于T细胞计数标准化。在靶向鼠(1:10稀释的'抗mCD16/CD32CF11克隆'-内源)Fc受体的Fc-阻断试剂存在下，将单克隆抗体混合物(数据未显示)施加于纯化的白细胞上。在黑暗中和在4℃下，在96孔板中进行孵育15-20分钟。染色后通过离心洗涤细胞以除去过量的单克隆抗体混合物，并将其重悬于PBS中，用于数据采集。
所有数据采集均使用与FACS-Diva软件(BD Bioscience)接口的LSR-II Fortessa流式细胞仪进行。使用FlowJo-9软件(TreeStar Inc.)使用门控策略(未示出)进行数据分析。
表9.FACS板EXP-1.
靶标 标签 克隆 提供者 稀释
mCD3εγ FITC 145-2C11 Biolegend 1/100
mCD4 PE RM4-5 Biolegend 1/100
mCD8α APC 53-6,7 Biolegend 1/100
B.结果
总共14只β/A2/DR3小鼠用于该实验(参见表8)。在处死时，通过流式细胞术分析脾T细胞群，显示大部分属于CD4+T细胞亚群。
表10.个体小鼠特征(第1组&第2组)。通过唯一的耳标ID号鉴定每只小鼠。a疫苗接种方案开始时的年龄(以周计)；b总的白细胞中T细胞的百分比；c总的T细胞中CD4+或CD8+T细胞的百分比；d板(P)数。
Figure BDA0002443643050000471
在用适当的刺激平板接种和孵育后，揭示并计数产IFNγ的细胞。然后将数据归一化为每106个总T细胞的许多特定斑点(减去在“仅培养基”条件下获得的平均计数)。
接下来使用各个平均值(从四倍组获得)绘制组平均值曲线(参见图3A)。由于T细胞的功能能力可能因个体而异，因此数据也表示为每个个体的ConA应答的百分比(参见图3B)。
总之，与IL13RA2-H pA(参考人)疫苗接种的动物(第2组)相比，用IL13RA2-B pAg细菌肽的疫苗接种在ELISPOT-IFNγ测定中诱导改善的T细胞应答。对于第1组(IL13RA2-B)，用IL13RA2-B pAg离体再刺激促进比IL13RA2-H pAg更高的应答。第2组(IL13RA2-H)的情况不是这样的。每种病症的ConA诱导的应答百分比(平均值+/-SEM)如下：
·第1组(IL13RA2-B)/IL13RA2-B pAg：56.3％+/-18.1
·第1组(IL13RA2-B)/IL13RA2-H pAg：32.3％+/-11.8
·第2组(IL13RA2-H)/IL13RA2-B pAg：2.0％+/-0.8
·第2组(IL13RA2-H)/IL13RA2-H pAg：1.1％+/-0.8
因此，这些结果提供了实验证据，即靶向IL13RA2的肿瘤抗原免疫疗法能够改善体内T细胞应答，并且如实施例1-3中所述鉴定的IL13RA2-B细菌肽(SEQ ID NO：18)对于此目的是特别有效的。
实施例7：细菌肽IL13RA2-B(SEQ ID NO:18)提供针对肿瘤细胞的体外细胞毒性
该实施例提供了证据，即序列SEQ ID NO：18的细菌肽(FLPFGFILV；在本文中也称为“IL13RA2-B”)提供针对U87细胞的体外细胞毒性，U87细胞是表达IL13RA2的肿瘤细胞。相反，衍生自IL13RA2的对应参考人肽(WLPFGFILI，SEQ ID NO：1，在本文中也称为“IL13RA2-H”)不提供针对U87细胞的体外细胞毒性。
方法：
简而言之，使用来自用IL13RA2-H或IL13RA2-H免疫的小鼠的CD8T细胞。在从免疫小鼠中分选脾细胞后获得这些细胞，并将其置于U87细胞(表达IL13RA2的肿瘤细胞)之上。
更详细地，从用IL13RA2-H(WLPFGFILI，SEQ ID NO：1)或IL13RA2-B(FLPFGFILV，SEQ ID NO：18)免疫的HHD小鼠的脾细胞中纯化CD3+T细胞。为此，如实施例6中所述，在第0天和第14天，在尾根用100μL含有疫苗接种肽加辅助肽加CFA(完全弗氏佐剂)的油基乳剂皮下注射B6β2mko HHD/DR3小鼠。在第21天，即加强注射后7天，将动物安乐死并获取脾脏。通过机械破坏器官制备脾细胞。使用来自Miltenyi biotec的小鼠总T细胞分离试剂盒，使用推荐的方法进行CD3+纯化。使用适当的活力标记物CD8、CD4、CD3和CD45，通过细胞计数验证细胞的有效纯化和活力。
将U87-MG细胞以6×105个细胞/孔接种在平底24孔培养板中，并在含有10％的FCS(胎牛血清)和抗生素的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)中于37℃孵育24小时。24小时后，除去培养基并用含有纯化的T CD3+细胞的培养基替换。使用以下比例的T细胞与U87-MG细胞：1/0.5、1/1和1/5。
在共培养U87-MG细胞和CD3+T细胞72小时后，收获来自孔的所有细胞，并在用DAPI和荧光膜联蛋白V免疫染色CD45阴性细胞后评估特异性U87-MG细胞死亡，然后进行细胞计数分析。
结果：
结果显示在图3中。通常，在用IL13RA2-B处理而不是用IL13RA2-H处理后观察到U87细胞裂解。
实施例8：鉴定人微生物组中肿瘤相关抗原FOXM1的表位的细菌序列变体
在本实施例中，在600种抗原中，基于以下事实选择叉头框转录因子M1(FOXM1)：(i)它包括鉴定为CTL(细胞毒性T淋巴细胞)表位的表位(Yokomine K,Senju S,NakatsuraT,Irie A,Hayashida Y,Ikuta Y,Harao M,Imai K,Baba H,Iwase H,Nomori H,TakahashiK,Daigo Y,Tsunoda T,Nakamura Y,Sasaki Y,Nishimura Y.The forkhead box M1transcription factor as a candidate of target for anti-cancerimmunotherapy.Int J Cancer.2010 May 1；126(9):2153-63.doi:10.1002/ijc.24836)；(ii)在包括GEPIA、Gent、代谢基因可视仪和蛋白质图谱的多个数据库中发现FOXM1在许多肿瘤中过表达，分析了基因表达数据(微阵列研究)；和(iii)在脑肿瘤(Hodgson JG,YehRF,Ray A,Wang NJ,Smirnov I,Yu M,Hariono S,Silber J,Feiler HS,Gray JW,SpellmanPT,Vandenberg SR,Berger MS,James CD Comparative analyses of gene copy numberand mRNA expression in glioblastoma multiforme tumors and xenografts.NeuroOncol.2009 Oct；11(5):477-87.doi:10.1215/15228517-2008-113)、在胰腺肿瘤(Xia JT,Wang H,Liang LJ,Peng BG,Wu ZF,Chen LZ,Xue L,Li Z,Li W.Overexpression of FOXM1is associated with poor prognosis and clinicopathologic stage of pancreaticductal adenocarcinoma.Pancreas.2012May；41(4):629-35.doi:10.1097/MPA.0b013e31823bcef2)、在卵巢癌(Wen N,Wang Y,Wen L,Zhao SH,Ai ZH,Wang Y,Wu B,Lu HX,Yang H,Liu WC,Li Y.Overexpression of FOXM1predicts poor prognosis andpromotes cancer cell proliferation,migration and invasion in epithelialovarian cancer.J Transl Med.2014 May 20；12:134.doi:10.1186/1479-5876-12-134)、在结肠直肠癌(Zhang HG,Xu XW,Shi XP,Han BW,Li ZH,Ren WH,Chen PJ,Lou YF,Li B,Luo XY.Overexpression of forkhead box protein M1(FOXM1)plays a critical rolein colorectal cancer.Clin Transl Oncol.2016May；18(5):527-32.doi:10.1007/s12094-015-1400-1)和许多其他癌症中也报道了过表达。
具体而言，上面所描述的肿瘤/癌症中的FOXM1的过表达和选择性表达的确认如下进行：来自“The Cancer Genome Atlas”(TCGA；可在https://cancergenome.nih.gov/获得))产生的组织图谱(RNA-seq数据37正常组织和17种癌症类型)的mRNA数据的分析突出显示正常组织中FOXM1 mRNA的低基础水平(睾丸除外)和几种肿瘤类型中高水平的FOXM1mRNA表达。当使用Metabolic gEne RApid Visualizer(可从http://merav.wi.mit.edu/获得，分析来自International Genomic Consortium和NCBI GEO数据集的数据)进行FOXM1 mRNA表达时观察到相同的情况，其中在大多数测试的正常组织(除胚胎外)中具有非常低的基础表达，和在包括乳腺癌样品、食道癌样品、肺癌样品、黑素瘤样品、结直肠样品和胶质母细胞瘤样品的许多肿瘤样品中具有强表达。
FOXM1是参与G1-S和G2-M进程的转录因子，其由FOXM1基因在人体中编码。以非穷举的方式，已经提出FOXM1为潜在的免疫疗法靶标(Yokomine K,Senju S,Nakatsura T,Irie A,Hayashida Y,Ikuta Y,Harao M,Imai K,Baba H,Iwase H,Nomori H,TakahashiK,Daigo Y,Tsunoda T,Nakamura Y,Sasaki Y,Nishimura Y；The forkhead boxM1transcription factor as a candidate of target for anti-cancerimmunotherapy.Int J Cancer.2010 May 1；126(9):2153-63.doi:10.1002/ijc.24836)。FOXM1的高表达进一步与参与例如肿瘤生长、血管生成、迁移、侵袭、上皮间质转化、转移和化疗耐药性的致癌转化相关(Wierstra I.FOXM1(Forkhead box M1)in tumorigenesis:overexpression in human cancer,implication in tumorigenesis,oncogenicfunctions,tumor-suppressive properties,and target of anticancer therapy.AdvCancer Res.2013；119:191-419.doi:10.1016/B978-0-12-407190-2.00016-2)。因此，FOXM1可以被认为是驱动肿瘤抗原。
在下一步中，鉴定选择的肿瘤相关抗原的表位——其通过MHC-I特异性呈递。为此，利用“免疫表位数据库和分析资源”(IEDB；http://www.iedb.org/；特别是对于MHC-I分析：http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_processing.html-如用于FOXM1分析，也参见http://tools.immuneepitope.org/processing/)分析(FOXM1的)肿瘤相关抗原序列，结合蛋白酶体切割、TAP转运和MHC I类分析工具用于预测肽呈递。即，将FOXM1的蛋白质序列提交给IEDB分析工具以鉴定可由HLA.A2.1呈递的潜在表位。由此，获得具有HLA A2.1结合特性的756个潜在表位的列表。该列表的三个表位先前被描述为潜在的表位：YLVPIQFPV(SEQ ID NO：55)，SLVLQPSVKV(SEQ ID NO：56)/LVLQPSVKV(SEQ ID NO：57)和GLMDLSTTPL(SEQ ID NO：58)/LMDLSTTPL(SEQ ID NO：59)，其由Yokomine等人描述和功能验证(Yokomine K,Senju S,Nakatsura T,Irie A,Hayashida Y,Ikuta Y,Harao M,ImaiK,Baba H,Iwase H,Nomori H,Takahashi K,Daigo Y,Tsunoda T,Nakamura Y,Sasaki Y,Nishimura Y.The forkhead box M1 transcription factor as a candidate of targetfor anti-cancer immunotherapy.Int J Cancer.2010 May 1；126(9):2153-63.doi:10.1002/ijc.24836)。
为了鉴定表位，其具有很好的机会被MHC在肿瘤细胞表面有效呈递，在具有HLAA2.1结合特性的756个表位列表中，使用NetMHCpan 4.0工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)计算756个候选表位对HLA A2.1的计算机模拟亲和力，其中最高可接受的亲和力为3000nM(IC50)。由此，获得了35个FOXM1表位的列表。
最后，将35个选择的FOXM1-表位与“人肠道微生物组的综合参考目录”(可从http://meta.genomics.cn/meta/home获得)进行比较，以鉴定35个选择的人FOXM1-表位的小型生物群序列变体。为此，使用“PAM-30”蛋白质取代基质进行蛋白质BLAST检索(blastp)，其描述了每个部位随时间的氨基酸变化率，并推荐用于低于35个氨基酸的长度查询；单词大小为2，也建议用于短查询；期望值(E)为20000000，调整以最大化可能匹配的数目；基于组合的统计设置为'0'，输入序列短于30个氨基酸，和仅允许无间隙比对。然后，将blastp结果过滤以获得长度为9或10个氨基酸的微生物肽序列(用于结合HLA-A2.1)，仅在人肽的开始和/或末端处允许错配，每个序列允许最多两个错配(除了最多两个错配以外，第三错配接受具有相似特性的氨基酸，即如上所述的保守氨基酸取代。由此，获得了573个细菌序列的列表，其由人微生物组中选择的FOXM1表位的细菌序列变体组成。
实施例9:测试选择的细菌序列变体与MHC的结合
由于微生物模拟物与MHC分子的结合对于抗原呈递至细胞毒性T细胞是必需的，因此使用NetMHCpan 4.0工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)计算573个细菌序列与MHC I类HLA.A2.01的亲和力。573个细菌序列(实施例8的blastp结果)用作输入，并且通过设定强和弱结合物的默认阈值来预测亲和力。将与一组400000随机天然肽相比较的预测亲和力的等级用作结合亲和力的量度。该值不受某些分子对更高或更低的平均预测亲和力的固有偏差的影响。非常强的结合物被定义为具有％等级<0.5，强结合物被定义为具有％等级≥0.5且<1.0，中等结合物被定义为具有％等级≥1.0且≤2.0并且弱结合物被定义为具有％等级<2.0。即，从573个细菌序列中，仅选择那些，其显示出非常强的亲和力(％等级<0.5)，并且其中人参考表位显示至少强亲和力(对于人肽)(％等级<1)。
由此，鉴定出以下20个细菌序列变体(表11)：
Figure BDA0002443643050000501
Figure BDA0002443643050000511
实施例10:确定包含选择的细菌序列变体的细菌蛋白的注释和细胞定位
接下来，进行含有所选细菌表位序列变体的细菌蛋白的注释。为此，基于blast的比较针对京都基因和基因组百科全书(KEGG)(http://www.genome.jp/kegg/)和国家生物技术信息中心(NCBI)参考序列数据库(RefSeq)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)。RefSeq提供了一组完整的非冗余序列，包括基因组DNA、转录物和蛋白质。在KEGG中，使用存储在KO(KEGG Orthology)数据库中的分子水平功能。这些功能按直系同源分组，其中包含由来自不同物种的基因编码的蛋白质，这些不同物种是从共同的祖先进化而来的。
在下一步骤中，使用两种不同的程序进行含有所选细菌表位序列变体的细菌蛋白的细胞定位的预测，之后递送具有共有预测的含肽蛋白的列表。首先，进行基于信号肽存在的预测来鉴定细胞内或细胞外蛋白质的二分法检索策略。信号肽是普遍存在的蛋白质分选信号，该蛋白质分选信号靶向它们的过客蛋白质，用于在原核生物中穿过细胞质膜转运。在这种情况下，SignalP 4.1.(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)和Phobius服务器(phobius.sbc.su.se)二者都用于递送共有预测。如果通过两种方法都检测到信号肽的存在，则认为该蛋白质可能是细胞外或周质的。如果不是，蛋白质可能属于外/内膜，或者是细胞质。其次，进行跨膜拓扑的预测。信号肽和跨膜结构域都是疏水的，但跨膜螺旋通常具有更长的疏水区域。SignalP 4.1.和Phobius有能力区分信号肽和跨膜结构域。设定最少2个预测的跨膜螺旋以区分膜和细胞质蛋白，以递送最终的共有列表。关于细菌蛋白的潜在细胞定位的数据对于选择免疫原性肽是感兴趣的，假设分泌的外泌体中包含的分泌的组分或蛋白质更易于由APC呈递。
表12显示了含有表11中所示的细菌肽的细菌蛋白的SEQ ID NO，它们的注释和细胞定位：
Figure BDA0002443643050000512
Figure BDA0002443643050000521
Figure BDA0002443643050000531
基于表11和12中所示的数据，选择根据SEQ ID NO：75的细菌肽(氨基酸序列：LMDLSTTEV；也称为“FOXM1-B2”)用于进一步研究，其是根据SEQ ID NO：59(LMDLSTTPL；也称为“FOXM1-H2”)的人FOXM1参考表位的序列变体。有效地，人参考表位具有中等/高亲和力，并且在肿瘤细胞的表面呈递。该MHC呈递在几项已发表的研究中得到证实(Yokomine K,Senju S,Nakatsura T,Irie A,Hayashida Y,Ikuta Y,Harao M,Imai K,Baba H,Iwase H,Nomori H,Takahashi K,Daigo Y,Tsunoda T,Nakamura Y,Sasaki Y,Nishimura Y.Theforkhead box M1 transcription factor as a candidate of target for anti-cancerimmunotherapy.Int J Cancer.2010 May 1；126(9):2153-63.doi:10.1002/ijc.24836)。
细菌序列变体SEQ ID NO：75(LMDLSTTEV)对HLA.A2.01具有非常强的结合亲和力。此外，该细菌肽序列变体包含在细菌蛋白中，预测其被分泌，从而增加被抗原呈递细胞(APC)捕获用于MHC呈递的可能性。
实施例11:细菌肽FOXM1 B2(SEQ ID NO：75)在体外结合HLA-A*0201等位基因，并 且在体外对HLA-A*0201等位基因的亲和力优于人表位
该实施例提供了证据，即序列SEQ ID NO：75的细菌肽(LMDLSTTEV；在本文中也称为“FOXM1-B2”)在体外结合HLA-A*0201等位基因，并且在体外对HLA-A*0201等位基因具有高亲和力，而对应衍生自FOXM1-H2(LMDLSTTPL，SEQ ID NO：59，在本文中也称为“FOXM1-H2”)的参考人肽具有略低的亲和力。
A.材料和方法
A1.测量肽与T2细胞系的亲和力。
该实验方案类似于由HLA-A*0201呈递的肽验证的方案(Tourdot et al.,Ageneral strategy to enhance immunogenicity of low-affinity HLA-A2.1-associated peptides:implication in the identification of cryptic tumorepitopes.Eur J Immunol.2000 Dec；30(12):3411-21)。用表达HLA-A*0201分子的人肿瘤细胞T2实现肽的亲和力测量，但是人肿瘤细胞T2为TAP1/2阴性且不能呈递内源肽。
在37℃下，将T2细胞(每孔2.105个细胞)与肽——肽的浓度从100μM递减到0.1μM——在补充有100ng/μl的人β2m的AIMV培养基中孵育16小时。然后将细胞洗涤两次并用与PE偶联的抗HLA-A2抗体(克隆BB7.2，BD Pharmagen)标记。
通过FACS(Guava Easy Cyte)进行分析。对于每个肽浓度，从背景噪声中减去与感兴趣的肽相关的标记的几何平均值，并报告为针对在100μM的浓度下参考肽HIV pol 589-597获得的HLA-A*0202标记的几何平均值的百分比。然后如下确定相对亲和力：
相对亲和力＝诱导20％的HLA-A*0201表达的每个肽的浓度/诱导20％的HLA-A*0201表达的参考肽的浓度。
A2.肽的溶解
通过考虑氨基酸组成使每个肽溶解。对于不包含任何半胱氨酸、甲硫氨酸或色氨酸的肽，DMSO的添加可能高达总体积的10％。将其他肽重悬浮于水或pH 7.4的PBS中。
B.结果
对于T2细胞：可变肽浓度的平均荧光强度：细菌肽FOXM1-B2(SEQ ID NO：75)和人肽FOXM1-H2(SEQ ID NO：59)二者均与HLA-A*0201结合。然而，细菌肽FOXM1-B2(SEQ ID NO：75)与HLA-A*0201的结合亲和力优于人肽FOXM1-H2(SEQ ID NO：59)，即，在100μM下105对77.6；在25μM下98.2对65.4；和在3μM下12.7对0.9。另外，在6.7μM下细菌肽FOXM1-B2诱导20％的HLA-A*0201表达，而对于相同的表达需要更高浓度的人肽FOXM1-H2，即12.6μM。
从第二个实验中获得了相似的结果。这些数据显示细菌肽FOXM1-B2明显优于相应的人肽FOXM1-H2。
实施例12:用细菌肽FOXM1-B2(SEQ ID NO：75)对小鼠进行疫苗接种，在ELISPOT- IFNγ测定中诱导改善的T细胞应答
A.材料和方法
A.1小鼠模型
表13中概述了使用的模型的特征：
小鼠模型 C57BL/6J B2m<sup>tm1Unc</sup>IAb<sup>-/-</sup>Tg(HLA-DRA HLA-DRB1*0301)<sup>#Gjh</sup>Tg(HLA-A/H2-D/B2M)<sup>1Bpe</sup>
缩写 β/A2/DR3
描述 免疫组分，无小鼠I类和II类MHC
住处(housing) SOPF条件(ABSL3)
小鼠数目 15个成年(>8周龄)
在几篇报道中描述了这些小鼠(Koller et al.,Normal development of micedeficient in beta 2M,MHC class I proteins,and CD8+T cells.Science.1990 Jun 8；248(4960):1227-30.Cosgrove et al.,Mice lacking MHC class IImolecules.Cell.1991 Sep 6；66(5):1051-66；Pascolo et al.,HLA-A2.1-restrictededucation and cytolytic activity of CD8(+)T lymphocytes from beta2microglobulin(beta2m)HLA-A2.1 monochain transgenic H-2Db beta2m doubleknockout mice.J Exp Med.1997 Jun 16；185(12):2043-51)。
A.2.免疫方案
免疫方案如图1所示。简言之，将15只β/A2/DR3小鼠用特定的疫苗接种肽(vacc-pAg)联合常见辅助肽(h-pAg)免疫(如下表14中所概述)。成对比较vacc-pAg(第1组对第2组)。因此，在每个波中比较单个肽的天然和优化形式。
表14.实验组组成。h-pAg：'辅助'肽；vacc-pAg：疫苗接种肽。加强注射的数目显示在括号中。
Figure BDA0002443643050000551
肽提供为如下：
·成对vacc-pAg：FOXM1-B2和FOXM1-H2；所有均以4mg/ml(4mM)浓度产生和提供；
·h-pAg：HHD-DR3肽(SEQ ID NO:32)；冻干提供(50.6mg；Eurogentec批次1611166)并以10mg/mL浓度在纯蒸馏水中重悬浮。
在第0天(d0)用引发注射免疫动物，并在第14天用加强注射免疫动物。每只小鼠在尾根处皮下注射100μL油基乳液，该油基乳液包含：
·100μg的vacc-pAg(每只小鼠25μL 4mg/mL的原液)；
·150μg的h-pAg(每只小鼠15μL 10mg/mL的原液)；
·10μL的PBS以达到(每只小鼠)50μL的总体积；
·以1：1(v：v)比添加不完全弗氏佐剂(IFA)(每只小鼠50μL)。
针对每个vacc-pAg制备单独的乳剂，如下：在15mL管中将IFA试剂加入到vacc-pAg/h-pAg/PBS混合物中并在涡旋下混合1分钟，重复循环直至形成稠乳液。
A.3.小鼠分析
在加强注射后7天(即在第21天)，使动物安乐死并获取脾脏。通过机械破坏器官然后进行70μm过滤和Ficoll密度梯度纯化来制备脾细胞。
脾细胞立即用于ELISPOT-IFNγ测定(表15)。以二联组重复实验条件，每孔使用2×105个总脾细胞，并在存在vacc-pAg(10μM)、伴刀豆球蛋白A(ConA，2.5μg/mL)或仅培养基的情况下培养以评估它们分泌IFNγ的能力。按照制造商的说明使用商业ELISPOT-IFNγ试剂盒(Diaclone Kit Mujrine IFNγELISpot)，并在孵育约16小时后进行测定。
表15.ELISPOT-IFNγ测定的设置.
Figure BDA0002443643050000561
在与ImmunoSpot 5.4软件(CTL-Europe)接口(interface)的Grand
Figure BDA0002443643050000562
S6Ultimate UV图像分析仪上计数斑点。使用Prism-5软件(GraphPad Software Inc.)进行数据绘图和统计分析。
还通过流式细胞术分析细胞悬浮液，用于T细胞计数标准化。在靶向鼠(1:10稀释的'抗mCD16/CD32CF11克隆'-内源)Fc受体的Fc-阻断试剂存在下，将单克隆抗体混合物(数据未显示)施加于纯化的白细胞上。在黑暗中和在4℃下，在96孔板中进行孵育15-20分钟。染色后通过离心洗涤细胞以除去过量的单克隆抗体混合物，并将其重悬于PBS中，用于数据采集。
所有数据采集均使用与FACS-Diva软件(BD Bioscience)接口的LSR-II Fortessa流式细胞仪进行。使用FlowJo-9软件(TreeStar Inc.)使用门控策略(未示出)进行数据分析。
表16.FACS板EXP-1.
靶标 标签 克隆 提供者 稀释
mCD3εγ FITC 145-2C11 Biolegend 1/100
mCD4 PE RM4-5 Biolegend 1/100
mCD8α APC 53-6,7 Biolegend 1/100
B.结果
总共14只β/A2/DR3小鼠用于该实验(参见表15)。在处死时，通过流式细胞术分析脾T细胞群，显示大部分属于CD4+T细胞亚群。
表17.个体小鼠特征(第1组&第2组)。通过唯一的耳标ID号鉴定每只小鼠。a疫苗接种方案开始时的年龄(以周计)；b总的白细胞中T细胞的百分比；c总的T细胞中CD4+或CD8+T细胞的百分比；d板(P)数。
Nb 小鼠Id 性别 年龄(周)<sub>a</sub> T细胞(％)<sub>b</sub> T4(％)<sub>c</sub> T8(％)<sub>d</sub>
1 731 M 22 16.9 80.6 9.58
2 736 M 27 19.9 70.8 15
3 744 F 24 24.1 71.9 12.3
4 753 F 24 19.2 63.2 17.9
5 758 F 24 23.2 68.3 17.7
11 733 M 22 25.4 71.2 12.6
12 738 M 24 30.9 74.9 12.2
13 746 F 22 25.7 70.9 10.8
14 755 F 24 20.5 68.4 14.8
15 756 F 26 15.8 70.7 14.1
21 740 M 24 22.1 77.6 13.7
22 742 F 22 25.6 70.3 16.5
23 748 F 22 17.1 55.1 16.3
24 749 F 23 14 65.5 17.5
25 752 F 24 15.4 60.3 20.1
在用适当的刺激平板接种和孵育后，揭示并计数产IFNγ的细胞。然后将数据归一化为每106个总T细胞的许多特定斑点(减去在“仅培养基”条件下获得的平均计数)。
接下来使用各个平均值(从四倍组获得)绘制组平均值曲线(参见图4)。总体上，用FOXM1-B2pAg细菌肽(SEQ ID NO：75)接种疫苗在ELISPOT-IFNγ测定中诱导强T细胞应答。用FOXM1-B2pAg离体再刺激促进比人FOXM1-H2pAg肽更高的应答。然而，在用FOXM1–H2离体再刺激之后，可以观察到T细胞的有效活化，这显示用FOXM1-B2肽接种疫苗可以驱动识别人肿瘤相关抗原FOXM1-H2的T细胞的活化，因此支持将FOXM1-B2在人类中用于接种疫苗。
因此，这些结果提供了实验证据，即靶向FOXM1的肿瘤抗原免疫疗法能够改善体内T细胞应答，并且如实施例8和9中所述鉴定的FOXM1-B2细菌肽(SEQ ID NO：75)对于此目的是特别有效的。
实施例13:人微生物组中肿瘤相关表位的10aa细菌序列变体的验证
在下文中，证明了根据本发明鉴定的具有10个氨基酸(10aa)的长度的细菌序列能够诱导针对肿瘤相关表位的免疫活化。
基本上出于与实施例1中描述的相同的原因选择白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2或IL13RA2)作为肿瘤相关抗原。简而言之，IL13RA2选择基于以下事实：(i)它包含被鉴定为CTL(细胞毒性T淋巴细胞)的表位(Okano F,Storkus WJ,Chambers WH,Pollack IF,Okada H.Identification of a novel HLA-A*0201-restricted,cytotoxic Tlymphocyte epitope in a human glioma-associated antigen,interleukin 13receptor alpha2 chain.Clin Cancer Res.2002 Sep；8(9):2851-5)；(ii)IL13RA2在肿瘤T细胞抗原数据库和CT数据库中被引用为脑肿瘤中的过表达基因；(iii)用Gent，代谢基因可视仪和蛋白质图谱等工具证实IL13RA2的过表达和选择性表达，分析基因表达数据(微阵列研究)；(iv)在脑肿瘤(Debinski et al.,Molecular expression analysis ofrestrictive receptor for interleukin 13,a brain tumor-associated cancer/testis antigen.Mol Med.2000 May；6(5):440-9)，在头颈部肿瘤(Kawakami et al.,Interleukin-13 receptor alpha2 chain in human head and neck cancer serves asa unique diagnostic marker.Clin Cancer Res.2003 Dec 15；9(17):6381-8)和在黑色素瘤(Beard et al.,Gene expression profiling using nanostring digital RNAcounting to identify potential target antigens for melanomaimmunotherapy.Clin Cancer Res.2013 Sep 15；19(18):4941-50)的文献中也报道了过表达；和(v)，已经鉴定出能够诱导针对IL13RA2表位(SEQ ID NO：1)的T细胞活化的9aa细菌序列(SEQ ID NO：18)(实施例1-7)。
鉴定了IL13RA2的表位，其具有10个氨基酸的长度并且其通过MHC-I特异性呈递。为此，利用“免疫表位数据库和分析资源”(IEDB；http://www.iedb.org/；特别是对于MHC-I分析：http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_processing.html-如用于IL13RA2分析，也参见http://tools.immuneepitope.org/processing/)分析(IL13RA2的)肿瘤相关抗原序列，结合蛋白酶体切割、TAP转运和MHC I类分析工具用于预测肽呈递。即，将IL13RA2的蛋白质序列提交给IEDB分析工具以鉴定可由HLA.A2.1呈递的潜在表位。使用NetMHCpan3.0工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)计算候选表位对HLAA2.1的计算机模拟亲和力，其中最高可接受的亲和力为3000nM(IC50)，以鉴定表位，其具有很好的机会通过MHC亲和力有效呈递。由此，获得了10个氨基酸的19个潜在IL13RA2表位的列表。
将19个选择的IL13RA2-表位与“人肠道微生物组的综合参考目录”(可从http://meta.genomics.cn/meta/home获得)进行比较，以鉴定小型生物群序列变体。为此，使用“PAM-30”蛋白质取代基质进行蛋白质BLAST检索(blastp)，其描述了每个部位随时间的氨基酸变化率，并推荐用于低于35个氨基酸的长度查询；单词大小为2，也建议用于短查询；期望值(E)为20000000，调整以最大化可能匹配的数目；基于组合的统计设置为'0'，输入序列短于30个氨基酸，和仅允许无间隙比对。然后，将blastp结果过滤以获得长度为10个氨基酸的微生物肽序列(用于结合HLA-A2.1)，仅在人肽的开始和/或末端处允许错配，每个序列允许最多3个错配。此外，仅选择了细菌序列，其显示非常强的亲和力(％等级<0.5)，并且其中人参考表位显示至少强的亲和力(对于人肽)(％等级<1.5)。由此鉴定出与5IL13RA2肿瘤相关肽具有相似性的11个细菌肽的列表。
表18：与人IL13RA2的表位具有相似性的10aa细菌肽
Figure BDA0002443643050000581
Figure BDA0002443643050000591
接下来，鉴定出包含表18中显示的细菌肽的细菌蛋白。而且，如上所述进行含有选择的细菌表位序列变体的细菌蛋白的注释。结果显示在表19中。
表19显示了含有表18中所显示的细菌肽的细菌蛋白的SEQ ID NO，它们的注释和细胞定位：
Figure BDA0002443643050000592
Figure BDA0002443643050000601
表19显示在人小型生物群中表达的最不同的细菌蛋白中，即在五种不同的细菌蛋白中鉴定了根据SEQ ID NO：139的细菌肽(FLPFGFILPV；在本文中也称为“IL13RA2-BL”)。为此，选择根据SEQ ID NO：139的细菌肽(FLPFGFILPV)用于体外和体内实验测试。相应的人IL13RA2表位WLPFGFILIL(IL13RA2-HL，SEQ ID NO：131)包括IL13RA2-H肽的序列(SEQ IDNO：1)。
实施例14:细菌肽IL13RA2-BL(SEQ ID NO：139)在体外与HLA-A*0201等位基因结 合，并且在体外对HLA-A*0201等位基因的亲和力优于对应的人表位
该实施例提供了证据，即序列SEQ ID NO：139的细菌肽(FLPFGFILPV；在本文中也称为“IL13RA2-BL”)在体外与HLA-A*0201等位基因结合，并且对HLA-A*0201等位基因具有高亲和力，而对应的衍生自IL13RA2的参考人肽显示低亲和力。
A.材料和方法
A1.测量肽与T2细胞系的亲和力。
该实验方案类似于由HLA-A*0201呈递的肽验证的方案(Tourdot et al.,Ageneral strategy to enhance immunogenicity of low-affinity HLA-A2.1-associated peptides:implication in the identification of cryptic tumorepitopes.Eur J Immunol.2000 Dec；30(12):3411-21)。用表达HLA-A*0201分子的人肿瘤细胞T2实现肽的亲和力测量，但是人肿瘤细胞T2为TAP1/2阴性且不能呈递内源肽。
在37℃下，将T2细胞(每孔2.105个细胞)与肽——肽的浓度从100μM递减到0.1μM——在补充有100ng/μl的人β2m的AIMV培养基中孵育16小时。然后将细胞洗涤两次并用与PE偶联的抗HLA-A2抗体(克隆BB7.2，BD Pharmagen)标记。
通过FACS(Guava Easy Cyte)进行分析。对于每个肽浓度，从背景噪声中减去与感兴趣的肽相关的标记的几何平均值，并报告为针对在100μM的浓度下参考肽HIV pol 589-597获得的HLA-A*0202标记的几何平均值的百分比。然后如下确定相对亲和力：
相对亲和力＝诱导20％的HLA-A*0201表达的每个肽的浓度/诱导20％的HLA-A*0201表达的参考肽的浓度。
A2.肽的溶解
通过考虑氨基酸组成使每个肽溶解。对于不包含任何半胱氨酸、甲硫氨酸或色氨酸的肽，DMSO的添加可能高达总体积的10％。将其他肽重悬浮于水或pH 7.4的PBS中。
B.结果
对于T2细胞：可变肽浓度的平均荧光强度：细菌肽IL13RA2-BL(SEQ ID NO：139)与HLA-A*0201结合，而对应的人肽不与HLA-A*0201结合。细菌肽IL13RA2-BL(SEQ ID NO：139)显示了与HLA-A*0201的强结合亲和力，即，在100μM下69％的最大HIV pol 589-597结合活性；在25μM 96％和在6.25μM下43％。结果也显示在图5中。
实施例15:用细菌肽IL13RA2-B(SEQ ID NO：139)对小鼠进行疫苗接种，在 ELISPOT-IFNγ测定中诱导改善的T细胞应答
A.材料和方法
A.1小鼠模型
两种不同的小鼠模型被用于该研究。表20中概述了使用的模型的特征：
Figure BDA0002443643050000611
在几篇报道中描述了这些小鼠(Koller et al.,Normal development of micedeficient in beta 2M,MHC class I proteins,and CD8+T cells.Science.1990 Jun 8；248(4960):1227-30.Cosgrove et al.,Mice lacking MHC class IImolecules.Cell.1991 Sep 6；66(5):1051-66；Pascolo et al.,HLA-A2.1-restrictededucation and cytolytic activity of CD8(+)T lymphocytes from beta2microglobulin(beta2m)HLA-A2.1 monochain transgenic H-2Db beta2m doubleknockout mice.J Exp Med.1997 Jun 16；185(12):2043-51)。
A.2.免疫方案
免疫方案如图1所示。将小鼠用特定的疫苗接种肽(vacc-pAg)联合常见辅助肽(h-pAg)免疫。
肽提供为如下：
·vacc-pAg：IL13RA2-BL；所有均以4mg/ml(4mM)浓度产生和提供；
·h-pAg：HHD-DR3肽(SEQ ID NO：32)；以4mg/ml(4mM)浓度提供对β/A2/DR3HHDDR3小鼠的免疫。
·h-pAg：UCP2肽(SEQ ID NO：159)；以4mg/ml(4mM)浓度提供对β/A2/DR1HHDDR1小鼠的免疫。
在第0天(d0)用引发注射免疫动物，并在第14天用加强注射免疫动物。每只小鼠在尾根处皮下注射100μL油基乳液，该油基乳液包含：
·100μg的vacc-pAg(每只小鼠25μL 4mg/mL的原液)；
·150μg的h-pAg(每只小鼠15μL 10mg/mL的原液)；
·10μL的PBS以达到(每只小鼠)50μL的总体积；
·以1：1(v：v)比添加不完全弗氏佐剂(IFA)(每只小鼠50μL)。
针对每个vacc-pAg制备单独的乳剂，如下：在15mL管中将IFA试剂加入到vacc-pAg/h-pAg/PBS混合物中并在涡旋下混合1分钟，重复循环直至形成稠乳液。
A.3.小鼠分析
在加强注射后7天(即在第21天)，使动物安乐死并获取脾脏。通过机械破坏器官然后进行70μm过滤和Ficoll密度梯度纯化来制备脾细胞。
脾细胞立即用于ELISPOT-IFNγ测定(表21))。以四联组重复实验条件，每孔使用2×105个总脾细胞，并在存在vacc-pAg(10μM)、伴刀豆球蛋白A(ConA，2.5μg/mL)或仅培养基的情况下培养以评估它们分泌IFNγ的能力。按照制造商的说明使用商业ELISPOT-IFNγ试剂盒(Diaclone Kit Mujrine IFNγELISpot)，并在孵育约16小时后进行测定。
表21.ELISPOT-IFNγ测定的设置.
Figure BDA0002443643050000621
在与ImmunoSpot 5.4软件(CTL-Europe)接口(interface)的Grand
Figure BDA0002443643050000622
S6Ultimate UV图像分析仪上计数斑点。使用Prism-5软件(GraphPad Software Inc.)进行数据绘图和统计分析。
结果显示在图6和7中。结果显示用IL13RA2-BL肽(SEQ ID NO：139)免疫小鼠导致小鼠中脾细胞对IL13RA2-BL和对IL13RA2-HL(SEQ ID NO：131)的强烈应答。因此，IL13RA2-BL具有强免疫原性，并且能够驱动针对人肽IL13RA2-HL的有效的免疫应答。
实施例16:验证在小鼠模型中鉴定小型生物群序列变体的方法
本发明涉及鉴定由小型生物群比如共生细菌表达的肽，并且能够促进针对感兴趣的肿瘤特异性抗原的免疫应答。特别地，该方法能够鉴定细菌肽，该细菌肽是肿瘤相关肽的序列变体，并且能够与人MHC(比如HLA.A2.01)结合。本文所述的实施例提供了证据：根据本发明的方法能够鉴定对MHC(例如，HLA.A2)具有强的结合亲和力的表位的小型生物群序列变体，并且用表位的小型生物群序列变体进行疫苗接种能够诱导针对其各自的参考表位的免疫原性。
不受任何理论的束缚，本发明人假设参考表位(“来自自身”)在胸腺选择过程中导致特定的T细胞克隆耗尽。此外，在不受任何理论束缚的情况下，本发明人还假设免疫系统已经被共生细菌的细菌蛋白/肽引发和/或具有对共生细菌的细菌蛋白/肽更好反应的能力。
上述体内实验是使用从人小型生物群中鉴定出的细菌肽和从人肿瘤中鉴定出的肿瘤相关抗原的表位在表达1类和2类MHC的HLA转基因小鼠(HHD DR3小鼠)中进行的。然而，人和小鼠中的共生细菌种类不同，并且人肿瘤特异性抗原的表位序列在小鼠基因组中可能并不总是具有完整的同源物。因此，人肿瘤抗原的表位在小鼠中可能代表更具免疫原性的“非自身”序列，而在人类中它们代表较低免疫原性的“自身”序列。
鉴于此，在本实施例中，在小鼠共生细菌蛋白中鉴定了表位的小型生物群序列变体。那些小鼠小型生物群序列变体引起针对野生型小鼠中的小鼠抗原表位的免疫原性。
1.鉴定鼠微生物组中的细菌序列变体
为了鉴定鼠蛋白的表位，将小鼠注释蛋白用作参考序列。选择了两个感兴趣的小鼠参考表位，即，BALB/c小鼠的小鼠基因Phtf1的“H2 Ld M5”(VSSVFLLTL；SEQ ID NO：160)，和C57BL/6小鼠的小鼠基因Stra6的“H2 Db M2”(INMLVGAIM；SEQ ID NO：161)。Phtf1编码假定的同源域转录因子1，其在小鼠睾丸中是高度表达的，但是也在大部分小鼠组织中以低水平表达。Stra6(受视黄酸6刺激)编码视黄醇吸收的受体，其为在小鼠胎盘中高度表达，但是也在小鼠卵巢、肾、脑、乳腺、肠道和脂肪垫中以中等水平表达的蛋白质。
为了鉴定其鼠小型生物群序列变体，收集来自BALB/c和C57BL/6小鼠的粪便样品用于小鼠共生小型生物群测序。收集后，使用IHMS程序(International Human MicrobiomeStandards；URL:http://www.microbiome-standards.org/#SOPS)提取微生物DNA。使用Illumina(NextSeq500)技术进行测序，并生成了小鼠肠道基因目录。
使用与上述有关人类肠道微生物组的实施例基本相同的同一性标准，鉴定上述鼠参考表位的鼠小型生物群序列变体。特别地，为了在人类小型生物群和人肿瘤相关表位的背景下再现在以上实施例中使用的标准，基于对鼠参考序列的分子模拟进一步选择肽，假设选的鼠参考肽在不同的小鼠器官中以低-中水平表达，并且具有以中低水平与1类小鼠MHC结合的能力。
表22显示了选择两个细菌肽候选物用于体内研究：
Figure BDA0002443643050000631
Figure BDA0002443643050000641
细菌肽H2 Ld B5(SEQ ID NO：162)是在BALB/c小鼠的小型生物群中发现的蛋白质的片段。H2 Ld B5是Phtf1肽(H2 Ld M5；SEQ ID NO：160)的序列变体。
细菌肽H2 Db B2(SEQ ID NO：163)是在C57BL/6小鼠的小型生物群中发现的蛋白质的片段。H2 Db B2是Stra6肽(H2 Db M2；SEQ ID NO：161)的序列变体。
2.细菌肽H2 Ld B5(SEQ ID NO：162)和H2 Db B2(SEQ ID NO：163)诱导小鼠的免疫原性并且允许针对小鼠同源物肽反应的T细胞的活化。
A.材料和方法
A.1小鼠模型
从查尔斯河(Charles River)(法国)获得7周龄的健康雌性BALB/c小鼠(n＝12)和健康雌性C57BL/6J小鼠(n＝11)。根据FELASA指南对动物进行单独鉴定并使其保持SPF健康状态。
A.2.免疫方案
免疫方案如图1所示。简言之，将BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠随机分配至每个小鼠品系的两个实验组中，每组用如表23中所显示的特定的接种疫苗肽(vacc-pAg)联合常见的辅助肽(OVA 323-339肽；序列：ISQAVHAAHAEINEAGR；SEQ ID NO：164)和不完全弗氏佐剂(IFA)免疫。
表23：实验组
组 小鼠 肽(vacc-pAg) 辅助(h-pAg) 引发 加强 动物数目
1 BALB/c No OVA 323-339 + +(1X) 6
2 BALB/c H2 Ld B5 OVA 323-339 + +(1X) 6
3 C57BL/6 No OVA 323-339 + +(1X) 5
4 C57BL/6 H2 Db B2 OVA 323-339 + +(1X) 6
肽提供为如下：
·成对vacc-pAg：H2 Ld B5和H2 Db B2；所有均以4mg/ml(4mM)浓度产生和提供；和
·h-pAg：OVA 323-339(SEQ ID NO：164)；以4mg/ml(4mM)浓度提供。
在第0天(d0)用引发注射免疫动物，并在第14天用加强注射免疫动物。每只小鼠在尾根处皮下注射100μL油基乳液，该油基乳液包含：
·100μg的vacc-pAg(每只小鼠25μL 4mg/mL的原液)；
·150μg的h-pAg(每只小鼠15μL 10mg/mL的原液)；
·10μL的PBS以达到(每只小鼠)50μL的总体积；
·以1：1(v：v)比添加不完全弗氏佐剂(IFA)(每只小鼠50μL)。
针对每个vacc-pAg制备单独的乳剂，如下：在15mL管中将IFA试剂加入到vacc-pAg/h-pAg/PBS混合物中并在涡旋下混合1分钟，重复循环直至形成稠乳液。
A.3.小鼠分析
在加强注射后7天(即在第21天)，使动物安乐死并获取脾脏。通过机械破坏器官然后进行70μm过滤和Ficoll密度梯度纯化来制备脾细胞。立即评估脾重量、脾细胞数目和活力(表24)。
表24：ELISPOT-IFNγ测定的设置.
Figure BDA0002443643050000651
脾细胞用于ELISPOT-IFNγ测定(表X)。以四联组重复实验条件，每孔使用2×105个总脾细胞，并在存在vacc-pAg(10μM)，小鼠肽同源物，阳性对照(1ng/ml佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)和500ng/ml离子霉素)或仅培养基的情况下培养以评估它们分泌IFNγ的能力。
按照制造商的说明使用商业ELISPOT-IFNγ试剂盒(Diaclone Kit Mujrine IFNγ ELISpot)，并在孵育约16小时后进行测定。
表25.ELISPOT-IFNγ测定的设置.
Figure BDA0002443643050000661
在与ImmunoSpot 5.4软件(CTL-Europe)接口(interface)的Grand
Figure BDA0002443643050000662
S6Ultimate UV图像分析仪上计数斑点。使用Prism-5软件(GraphPad Software Inc.)进行数据绘图和统计分析。
B.结果
结果显示在图8(对于C57BL/6小鼠)和9(对于BALB/c小鼠)中。总体上，用细菌肽H2Db B2(SEQ ID NO：163)和H2 Ld B5(SEQ ID NO：162)接种疫苗在ELISPOT-IFNγ测定中诱导提高的T细胞应答。此外，用细菌肽H2 Db B2和H2 Ld B5接种疫苗也分别在ELISPOT-IFNγ测定中诱导针对鼠参考表位H2 Db M2和H2 Ld M5的提高的T细胞应答。在对照小鼠(用OVA 323-339加IFA接种疫苗)中，在ELISPOT-IFNγ测定中未观察到响应细菌肽sH2 Db B2和H2 Ld B5的离体刺激的T细胞应答的非特异性诱导。
总之，这些结果提供了实验证据：本文所述的鉴定小型生物群序列变体的方法对于鉴定诱导针对宿主参考肽的T细胞活化的微生物序列变体是有效的。
序列和SEQ ID号的表格(序列表):
Figure BDA0002443643050000671
Figure BDA0002443643050000681
Figure BDA0002443643050000691
Figure BDA0002443643050000701
Figure BDA0002443643050000711
Figure BDA0002443643050000721
Figure BDA0002443643050000731
Figure BDA0002443643050000741
Figure BDA0002443643050000751
Figure BDA0002443643050000761
Figure BDA0002443643050000771
Figure BDA0002443643050000781
Figure BDA0002443643050000791
Figure BDA0002443643050000801
Figure BDA0002443643050000811
Figure BDA0002443643050000821
Figure BDA0002443643050000831
Figure BDA0002443643050000841
Figure BDA0002443643050000851
Figure BDA0002443643050000861
Figure BDA0002443643050000871
Figure BDA0002443643050000881
Figure BDA0002443643050000891
Figure BDA0002443643050000901
Figure BDA0002443643050000911
Figure BDA0002443643050000921
Figure BDA0002443643050000931
序列表
<110> 恩特罗姆公司
<120> 肿瘤相关抗原表位的小型生物群序列变体
<130> EB01P006WO
<150> EP17195520.6
<151> 2017-10-09
<150> PCT/EP2017/075683
<151> 2017-10-09
<150> EP18305442.8
<151> 2018-04-11
<160> 164
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu Ile
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile Ser Thr
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Phe Leu Ile Ser Thr Thr Phe Gly Cys
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 6
Tyr Leu Tyr Thr Phe Leu Ile Ser Thr
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 7
Lys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile Ser Ile
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 8
Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile Gly Val
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 9
Phe Leu Ile Ser Thr Thr Phe Thr Ile
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 10
Phe Leu Ile Ser Thr Thr Phe Ala Ala
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 11
Thr Leu Ile Ser Thr Thr Phe Gly Val
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 12
Lys Leu Ile Ser Thr Thr Phe Gly Ile
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 13
Asn Leu Ile Ser Thr Thr Phe Gly Ile
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 14
Phe Leu Ile Ser Thr Thr Phe Ala Ser
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 15
Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Glu Ile
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 16
Ala Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Ala
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 17
Ala Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Ala
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 18
Phe Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu Val
1 5
<210> 19
<211> 930
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 19
Gln Tyr Thr Asn Val Lys Tyr Pro Phe Pro Tyr Asp Pro Pro Tyr Val
1 5 10 15
Pro Asn Glu Asn Pro Thr Gly Leu Tyr His Gln Lys Phe His Leu Ser
20 25 30
Lys Glu Gln Lys Gln Tyr Gln Gln Phe Leu Asn Phe Glu Gly Val Asp
35 40 45
Ser Cys Phe Tyr Leu Tyr Val Asn Lys Thr Phe Val Gly Tyr Ser Gln
50 55 60
Val Ser His Ser Thr Ser Glu Phe Asp Ile Thr Pro Phe Thr Val Glu
65 70 75 80
Gly Gln Asn Glu Leu His Val Ile Val Leu Lys Trp Cys Asp Gly Ser
85 90 95
Tyr Leu Glu Asp Gln Asp Lys Phe Arg Met Ser Gly Ile Phe Arg Asp
100 105 110
Val Tyr Leu Met Phe Arg Pro Glu Asn Tyr Val Trp Asp Tyr Asn Ile
115 120 125
Arg Thr Ser Leu Ser Asn Glu Asn Ser Lys Ala Lys Ile Glu Val Phe
130 135 140
Ile Met Asn Gln Gly Gln Leu Lys Asn Pro His Tyr Gln Leu Leu Asn
145 150 155 160
Ser Glu Gly Ile Val Leu Trp Glu Gln Tyr Thr Lys Asp Thr Ser Phe
165 170 175
Gln Phe Glu Val Ser Asn Pro Ile Leu Trp Asn Ala Glu Ala Pro Tyr
180 185 190
Leu Tyr Thr Phe Leu Ile Ser Thr Glu Glu Glu Val Ile Val Gln Gln
195 200 205
Leu Gly Ile Arg Glu Val Ser Ile Ser Glu Gly Val Leu Leu Ile Asn
210 215 220
Gly Lys Pro Ile Lys Leu Lys Gly Val Asn Arg His Asp Met Asp Pro
225 230 235 240
Val Thr Gly Phe Thr Ile Ser Tyr Glu Gln Ala Lys Lys Asp Met Thr
245 250 255
Leu Met Lys Glu His Asn Ile Asn Ala Ile Arg Thr Ser His Tyr Pro
260 265 270
Asn Ala Pro Trp Phe Pro Ile Leu Cys Asn Glu Tyr Gly Phe Tyr Val
275 280 285
Ile Ala Glu Ala Asp Leu Glu Ala His Gly Ala Val Ser Phe Tyr Gly
290 295 300
Gly Gly Tyr Asp Lys Thr Tyr Gly Asp Ile Val Gln Arg Pro Met Phe
305 310 315 320
Tyr Glu Ala Ile Leu Asp Arg Asn Glu Arg Asn Leu Met Arg Asp Lys
325 330 335
Asn Asn Pro Ser Ile Phe Met Trp Ser Met Gly Asn Glu Ala Gly Tyr
340 345 350
Ser Lys Ala Phe Glu Asp Thr Gly Arg Tyr Leu Lys Glu Leu Asp Pro
355 360 365
Thr Arg Leu Val His Tyr Glu Gly Ser Ile His Glu Thr Gly Gly His
370 375 380
Lys Asn Asp Thr Ser Met Ile Asp Val Phe Ser Arg Met Tyr Ala Ser
385 390 395 400
Val Asp Glu Ile Arg Asp Tyr Leu Ser Lys Pro Asn Lys Lys Pro Phe
405 410 415
Val Leu Cys Glu Phe Ile His Ala Met Gly Asn Gly Pro Gly Asp Ile
420 425 430
Glu Asp Tyr Leu Ser Leu Phe Tyr Glu Met Asp Arg Ile Ala Gly Gly
435 440 445
Phe Val Trp Glu Trp Ser Asp His Gly Ile Tyr Met Gly Lys Thr Glu
450 455 460
Glu Gly Ile Lys Lys Tyr Tyr Tyr Gly Asp Asp Phe Asp Ile Tyr Pro
465 470 475 480
Asn Asp Ser Asn Phe Cys Val Asp Gly Leu Thr Ser Pro Asp Arg Ile
485 490 495
Pro His Gln Gly Leu Leu Glu Tyr Lys Asn Ala Ile Arg Pro Ile Arg
500 505 510
Ala Ala Leu Lys Ser Ala Ile Tyr Pro Tyr Glu Val Thr Leu Ile Asn
515 520 525
Cys Leu Asp Phe Thr Asn Ala Lys Asp Leu Val Glu Leu Asn Ile Glu
530 535 540
Leu Leu Lys Asn Gly Glu Val Val Ala Asn Gln Arg Val Glu Cys Pro
545 550 555 560
Asp Ile Pro Pro Arg Cys Ser Thr Asn Ile Lys Ile Asp Tyr Pro His
565 570 575
Phe Lys Gly Val Glu Trp Gln Glu Gly Asp Tyr Val His Ile Asn Leu
580 585 590
Thr Tyr Leu Gln Lys Val Ala Lys Pro Leu Thr Pro Arg Asn His Ser
595 600 605
Leu Gly Phe Asp Gln Leu Leu Val Asn Glu Pro Ser Arg Lys Glu Phe
610 615 620
Trp Ser Val Gly Asn Glu Phe Asp Ile Gln Asn Arg Thr Pro Ile Asp
625 630 635 640
Asn Asn Glu Glu Ile Ser Ile Glu Asp Leu Gly Asn Lys Ile Gln Leu
645 650 655
His His Thr Asn Phe His Tyr Val Tyr Asn Lys Phe Thr Gly Leu Phe
660 665 670
Asp Ser Ile Val Trp Asn Gln Lys Ser Arg Leu Thr Lys Pro Met Glu
675 680 685
Phe Asn Ile Trp Arg Ala Leu Ile Asp Asn Asp Lys Lys His Ala Asp
690 695 700
Asp Trp Lys Ala Ala Gly Tyr Asp Arg Ala Leu Val Arg Val Tyr Lys
705 710 715 720
Thr Ser Leu Thr Lys Asn Pro Asp Thr Gly Gly Ile Ala Ile Val Ser
725 730 735
Glu Phe Ser Leu Thr Ala Val His Ile Gln Arg Ile Leu Glu Gly Ser
740 745 750
Ile Glu Trp Asn Ile Asp Arg Asp Gly Val Leu Thr Phe His Val Asp
755 760 765
Ala Lys Arg Asn Leu Ser Met Pro Phe Leu Pro Arg Phe Gly Ile Arg
770 775 780
Cys Phe Leu Pro Ser Ala Tyr Glu Glu Val Ser Tyr Leu Gly Phe Gly
785 790 795 800
Pro Arg Glu Ser Tyr Ile Asp Lys His Arg Ala Ser Tyr Phe Gly Gln
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Phe His Asn Leu Val Glu Arg Met Tyr Glu Asp Asn Ile Lys Pro Gln
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Glu Asn Ser Ser His Cys Gly Cys Arg Phe Val Ser Leu Gln Asn Asn
835 840 845
Ala Lys Asp Gln Ile Tyr Val Ala Ser Lys Glu Ala Phe Ser Phe Gln
850 855 860
Ala Ser Arg Tyr Thr Gln Glu Glu Leu Glu Lys Lys Arg His Asn Tyr
865 870 875 880
Glu Leu Val Lys Asp Glu Asp Thr Ile Leu Cys Leu Asp Tyr Lys Met
885 890 895
Ser Gly Ile Gly Ser Ala Ala Cys Gly Pro Glu Leu Ala Glu Gln Tyr
900 905 910
Gln Leu Lys Glu Glu Glu Ile Lys Phe Ser Leu Gln Ile Arg Phe Asp
915 920 925
Arg Ser
930
<210> 20
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 20
Met Lys Thr Ile Arg Lys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile Ser Ile Phe Val
1 5 10 15
Ile Leu Ser Leu Cys Ser Cys Tyr Asn Asp Thr His Ile Ile Thr Trp
20 25 30
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Gln Ile Pro Val Phe Gln Gly Ser Thr Pro Thr Lys Asp Ser Ser Ser
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Gln Tyr Glu Tyr Ser Phe
65 70
<210> 21
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 21
Met Ala Thr Leu Tyr Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile Gly Val Leu Tyr
1 5 10 15
His Ser Ala Trp Phe Leu Thr Gln Ala Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu Phe
20 25 30
Leu Ile Arg Leu Ile Leu Ser His Gln Ile Arg Thr Ser Cys Asn Ser
35 40 45
Ser Pro Leu Thr Arg Leu Lys Thr Cys Leu Met Ile Gly Trp Leu Leu
50 55 60
Leu Leu Phe Thr Pro Ile Leu Ser Gly Met Thr Ile Leu Ile Pro His
65 70 75 80
Gln Glu Ser Ser Thr Thr His Phe Ser Gln Asn Val Leu Leu Val Val
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Thr Gly Leu Val Ile Ile Val Ile Thr Ile Gly Leu Ala Leu Trp Met
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Ile Ile Glu Ser Arg His Lys Ile Lys Gln Leu Ala Asn Asn Ala Gly
180 185 190
<210> 22
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 22
Ile Cys Ala Lys Asn Asn Gly Asn Pro Asn Thr Ser Ser Thr Asn Tyr
1 5 10 15
Ala Phe Leu Ile Ser Thr Thr Phe Thr Ile Asn Lys Gly Phe Val Asp
20 25 30
Val Tyr Ser Glu Leu Asn His Ala Leu Tyr Ser Tyr Asp Thr Val Thr
35 40 45
Phe Ser Gly Gly Thr Ile Ile Ala Arg Thr Gly Ser Ser Ala Ser Ser
50 55 60
Ser Tyr Arg Pro Ile Arg Leu Gly Leu Asn Ser Ser Asn Pro Ile Val
65 70 75 80
Ile Asn Ala Pro Thr Phe Thr Leu Asp Leu Ser Lys Gln Ser Asp Gly
85 90 95
Ser Ala Met Thr Thr Tyr Ser Asp Val Ser Asn Asp Lys Val Lys Thr
100 105 110
Leu Leu Ala Ala Ser Gly Ser Ser Ala Asn His Tyr Ala Lys Leu Thr
115 120 125
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Thr Val Ser Val Lys Thr Asp Gly Gln Gln Gln Tyr Leu Phe Ile Ala
145 150 155 160
Arg Tyr Asp Ser Thr Gly His Leu Leu Glu Leu Gln Gln Arg Leu Arg
165 170 175
Gly Glu Glu Ala Ile Leu Lys Ala Glu Phe Thr Phe Pro Thr Val Ser
180 185 190
Pro Thr
<210> 23
<211> 1538
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 23
Met Glu His Lys Arg Lys Lys Gln Trp Ile Leu Ile Ile Met Leu Leu
1 5 10 15
Leu Thr Val Cys Ser Val Phe Val Val Tyr Ala Gly Arg Glu Trp Met
20 25 30
Phe Thr Asn Pro Phe Lys Pro Tyr Thr Phe Ser Ser Val Ser Tyr Ala
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65 70 75 80
Ala Ser Asp Lys Ser Phe Leu Ser Ala Glu Arg Val Val Ala Asp Gly
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100 105 110
Ile Ala Ser Glu Gly Ile Val Lys Leu Ser Ser Lys Gly Lys Tyr Ile
115 120 125
Ser Thr Val Ala Ser Val Glu Ala Glu Lys Gly Ser Val Arg Arg Asn
130 135 140
Ile Val Gly Met Val Pro Thr Glu His Gly Val Val Tyr Met Gln Lys
145 150 155 160
Glu Lys Glu Gly Ile Leu Val Ser Asn Thr Glu Gln Gly Ser Ser Lys
165 170 175
Val Phe Ser Val Ala Asp Ala Gln Asp Arg Ile Leu Cys Cys Ala Tyr
180 185 190
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Thr Val Asp Gly Ser Ile Pro Gln Glu Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Val
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Leu Tyr Ser Ala Asp Ile Gly Leu Arg Asp Ile Ile Arg Ile Pro Cys
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355 360 365
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370 375 380
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Ser Asp Ser Asp Ser Ser Gln Asp Leu Tyr Cys Val Leu Tyr Lys Val
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485 490 495
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Lys Val Ile His Lys Leu Gly Ala Lys Arg Ser Val Phe Val Ser Ser
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Val Leu Leu Thr Ala Gly Leu Gly Leu Arg Val Val Pro Asn Ile Trp
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Leu Leu Thr Leu Ser Ala Leu Leu Leu Gly Ala Gly Trp Gly Val Leu
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Leu Leu Leu Val Asn Leu Met Ile Val Glu Leu Pro Asp Glu Glu Lys
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Asn Arg Ala Tyr Ala Tyr Tyr Ser Val Ser Ser Leu Ser Gly Ala Asn
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Cys Ala Val Val Phe Gly Gly Phe Leu Leu Gln Trp Met Ser Tyr Thr
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Ala Leu Phe Ala Val Thr Ala Val Leu Ser Val Leu Leu Phe Leu Val
740 745 750
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820 825 830
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Gly Trp Lys His Leu Gly Leu Ala Val Ala Ala Phe Ile Tyr Ala Ala
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Gly Ser Phe Val Phe Gly Tyr Val Leu Val Leu Gly Val Gly Arg Gly
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Val Ser Arg Thr Glu Phe Gly Trp Leu Ser Ser Ala Gly Glu Pro
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Leu Met Val Cys Leu Cys Ile Leu Ile Ile Leu Ala Ala Gly Met
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Asp Ile Ser Arg Lys Ile Lys Lys Arg Ile Ser Arg Pro Ile Glu
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Leu Leu Thr Glu Ala Thr His Lys Phe Gly Asn Gly Glu Glu Gly
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Tyr Asp Glu Asn Asn Ile Val Asp Leu Asp Ile His Thr Arg Asp
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Glu Ile Glu Glu Leu Tyr His Ala Thr Gln Ser Met Gln Lys Ser
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Ile Ile Asn Tyr Met Asp Asn Leu Thr Arg Val Thr Ala Glu Lys
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Glu Arg Ile Gly Ala Glu Leu Asn Val Ala Thr Gln Ile Gln Ala
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Ser Met Leu Pro Cys Ile Phe Pro Ala Phe Pro Asp Arg Asp Glu
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Asp Phe Tyr Asp Phe Phe Met Val Asp Asp Arg His Met Ala Ile
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Val Met Ala Asp Val Ser Gly Lys Gly Val Pro Ala Ala Leu Phe
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Met Val Ile Gly Lys Thr Leu Ile Lys Asp His Thr Gln Pro Gly
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Glu Met Pro Phe Val Tyr Arg Arg Glu Thr Asn Thr Tyr Glu Ala
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Gln Leu Tyr Gly Met Asp Arg Leu Asp His Val Leu Asn Gln Gln
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Cys Leu Ser Ser Asn Pro Glu Glu Thr Leu Lys Leu Val Lys Ala
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Asp Ile Asp Ala Phe Val Gly Asp Asn Asp Gln Phe Asp Asp Ile
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Thr Met Leu Cys Leu Glu Tyr Thr Lys Lys Met Glu Asn Gln Arg
1520 1525 1530
Leu Leu Asn Asn Cys
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<210> 24
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 24
Met Ala Ala Cys Ala Ala Cys Arg Trp Leu Met Asn Glu Lys Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Thr Thr Phe Gly Val Gly Gln Leu Thr Leu Asn Ala Val Glu
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His Lys Ala Lys Gln Asp Cys Tyr
35 40
<210> 25
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 25
Met Ala Lys Leu Asn Ile Gly Ile Phe Thr Asp Thr Tyr Phe Pro Gln
1 5 10 15
Leu Asn Gly Val Ala Thr Ser Val Gln Thr Leu Arg Arg Glu Leu Glu
20 25 30
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Leu Arg Lys Ile His Gln Leu Lys Leu Asp Ile Ile His Thr Gln Thr
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Ile Pro Met Val His Thr Tyr His Thr Met Tyr Glu Asp Tyr Val His
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Tyr Ile Ala Gly Gly His Leu Ile Ser Ala Glu Gly Ala Arg Glu Phe
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Ile Ile Pro Thr Gly Ile Asp Thr Ser His Phe Arg Lys Ser Asn Tyr
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Ile Val Asn Phe Met Thr His Gly Glu Thr Gly Met Phe Phe Asp Asp
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Leu Pro Phe Leu Pro Arg His Arg Ser
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<210> 26
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 26
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Val Tyr Lys Leu Cys Gly Tyr Lys Asn Ile Asn Gly Glu Leu Asn Ile
260 265 270
Asp Asn Ser Phe Ser Leu Leu Lys Asn Thr Glu Asn Glu Tyr Phe Lys
275 280 285
Ile Phe Arg Trp Ile Tyr Ile Gly Glu Gly Asn Lys Thr Asp Lys Ile
290 295 300
Gly Ile Ala Arg Asn Val Leu Ser Leu Phe Ile Ala Asn Asp Asn Ile
305 310 315 320
Ala Ile Glu Asp Asn Val Phe Ile Ser Ile Gln Ser Ser Phe Lys Thr
325 330 335
Tyr Leu Lys Glu Asn Leu Asp Lys Tyr Val Ala Ile Arg Asn Gln Ile
340 345 350
Tyr Gln Glu Leu Asp Ala Ile Ile Ser Leu Ser Ser Ala Val Lys Lys
355 360 365
Asp Phe Leu Glu Gly Phe Lys His Asn Leu Leu Ala Cys Ile Thr Phe
370 375 380
Phe Phe Ser Thr Ile Val Leu Glu Val Leu Gly Gly Asn Ser Lys Ser
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Tyr Phe Leu Phe Thr Lys Glu Val Cys Ile Leu Cys Tyr Ala Val Phe
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Phe Ile Ser Phe Leu Tyr Leu Leu Trp Met Arg Gly Asp Ile Glu Val
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435 440 445
Ser Asp Leu Leu Ile Pro Lys Glu Ile Asp Ile Ile Leu Arg Asn Gly
450 455 460
Glu Glu Leu Lys Glu Gln Met Gly Tyr Ile Asp Leu Val Lys Lys Lys
465 470 475 480
Tyr Thr Ala Leu Trp Ile Cys Ser Leu Leu Thr Leu Cys Val Ile Val
485 490 495
Thr Val Leu Ser Pro Ile Gly Asn Met Phe Ala Gly Met Ile Phe Ala
500 505 510
Phe Lys Ser Ile Ile Val Ile Phe Gly Leu Leu Ile Phe Leu Leu Val
515 520 525
Arg Leu Gly Ser Phe Ile Leu
530 535
<210> 27
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 27
Met Asn Val Phe Ala Gly Ile Gln Phe Gly Ile Arg Lys Gly Leu Arg
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245 250 255
<210> 28
<211> 563
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 28
Met Asn Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Phe Ala Thr Val Leu Ile Val Thr
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130 135 140
Gly Ile Phe Asp Asn Ile Gly Pro Leu Leu Glu Pro Leu Phe Ile Ser
145 150 155 160
Ala Ala Leu Ser Leu Cys Val Ala Leu Ala Leu Ser Tyr Arg Phe Ser
165 170 175
Arg Thr Leu Thr Lys Pro Leu Glu Glu Ile Ser Glu Glu Val Ser Lys
180 185 190
Ile Asn Asp Asn Arg Tyr Leu Ser Phe Asp His Tyr Gln Tyr Asp Glu
195 200 205
Phe Asn Val Ile Ala Thr Lys Leu Lys Glu Gln Ala Asp Thr Ile Arg
210 215 220
Lys Thr Leu Lys Thr Leu Lys Asn Glu Arg Leu Lys Ile Asn Ser Ile
225 230 235 240
Leu Asp Lys Met Asn Glu Gly Phe Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Glu
245 250 255
Ile Leu Met Val Asn Lys Lys Ala Lys Gln Leu Phe Gly Asp Lys Met
260 265 270
Glu Val Asn Gln Pro Ile Gln Asp Phe Ile Phe Asp His Gln Ile Ile
275 280 285
Asp Gln Leu Glu Asn Ile Gly Val Glu Pro Lys Ile Val Thr Leu Lys
290 295 300
Lys Asp Glu Glu Val Tyr Asp Cys His Leu Ala Lys Val Glu Tyr Gly
305 310 315 320
Val Thr Leu Leu Phe Val Asn Ile Thr Asp Ser Val Asn Ala Thr Lys
325 330 335
Met Arg Gln Glu Phe Phe Ser Asn Val Ser His Glu Leu Lys Thr Pro
340 345 350
Met Thr Ser Ile Arg Gly Tyr Ser Glu Leu Leu Gln Thr Gly Met Ile
355 360 365
Asp Asp Pro Lys Ala Arg Lys Gln Ala Leu Asp Lys Ile Gln Lys Glu
370 375 380
Val Asp Gln Met Ser Ser Leu Ile Ser Asp Ile Leu Met Ile Ser Arg
385 390 395 400
Leu Glu Asn Lys Asp Ile Glu Val Ile Gln His Pro Val His Leu Gln
405 410 415
Pro Ile Val Asp Asp Ile Leu Glu Ser Leu Lys Val Glu Ile Glu Lys
420 425 430
Lys Glu Ile Lys Val Thr Cys Asp Leu Thr Pro Gln Thr Tyr Leu Ala
435 440 445
Asn His Gln His Val Gln Gln Leu Met Asn Asn Leu Ile Asn Asn Ala
450 455 460
Val Lys Tyr Asn Lys Gln Lys Gly Ser Leu Asn Ile His Ser Tyr Leu
465 470 475 480
Val Asp Gln Asp Tyr Ile Ile Glu Val Ser Asp Thr Gly Arg Gly Ile
485 490 495
Ser Leu Ile Asp Gln Gly Arg Val Phe Glu Arg Phe Phe Arg Cys Asp
500 505 510
Ala Gly Arg Asp Lys Glu Thr Gly Gly Thr Gly Leu Gly Leu Ala Ile
515 520 525
Val Lys His Ile Val Gln Tyr Tyr Lys Gly Thr Ile His Leu Glu Ser
530 535 540
Glu Leu Gly Lys Gly Thr Thr Phe Lys Ile Val Leu Pro Ile Asn Lys
545 550 555 560
Asp Ser Leu
<210> 29
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 29
Met Ser Ile Ser Leu Ala Glu Ala Lys Val Gly Met Ala Asp Lys Val
1 5 10 15
Asp Gln Gln Val Val Asp Glu Phe Arg Arg Ala Ser Leu Leu Leu Asp
20 25 30
Met Leu Ile Phe Asp Asp Ala Val Ser Pro Gly Thr Gly Gly Ser Thr
35 40 45
Leu Thr Tyr Gly Tyr Thr Cys Leu Lys Thr Pro Ser Thr Val Ala Val
50 55 60
Arg Glu Leu Asn Thr Glu Tyr Thr Pro Asn Glu Ala Lys Arg Glu Lys
65 70 75 80
Lys Thr Ala Asp Leu Lys Ile Phe Gly Gly Ser Tyr Gln Ile Asp Arg
85 90 95
Val Ile Ala Gln Thr Ser Gly Ala Val Asn Glu Val Glu Phe Gln Met
100 105 110
Arg Glu Lys Ile Lys Ala Ala Ala Asn Tyr Phe His Met Leu Val Ile
115 120 125
Asn Gly Thr Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Tyr Val Thr Asn Thr Phe
130 135 140
Asp Gly Leu Lys Lys Ile Leu Ser Gly Ser Asp Thr Glu Tyr Thr Ala
145 150 155 160
Glu Asp Val Asp Ile Ser Thr Ser Ala Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn
165 170 175
Ala Phe Leu Asp Ala Val Asp Thr Phe Ile Ser Lys Leu Ala Glu Lys
180 185 190
Pro Asp Ile Leu Met Met Asn Thr Glu Met Leu Thr Lys Val Arg Ser
195 200 205
Ala Ala Arg Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp Arg Ser Lys Asp Asp Phe Gly
210 215 220
Arg Ala Val Glu Thr Tyr Asn Gly Ile Lys Leu Leu Asp Ala Gly Tyr
225 230 235 240
Tyr Tyr Asn Gly Ser Thr Thr Glu Pro Val Val Ala Ile Glu Thr Asp
245 250 255
Gly Ser Thr Ala Ile Tyr Gly Ile Lys Ile Gly Leu Asn Ala Phe His
260 265 270
Gly Val Ser Pro Lys Gly Asp Lys Ile Ile Ala Gln His Leu Pro Asp
275 280 285
Phe Ser Gln Ala Gly Ala Val Lys Glu Gly Asp Val Glu Met Val Ala
290 295 300
Ala Thr Val Leu Lys Asn Ser Lys Met Ala Gly Val Leu Lys Gly Ile
305 310 315 320
Lys Ile Lys Pro Thr Glu
325
<210> 30
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 30
Met Pro Val Thr Leu Ala Glu Ala Lys Val Gly Met Ala Asp Lys Val
1 5 10 15
Asp Gln Gln Val Ile Asp Glu Phe Arg Arg Ser Ser Leu Leu Leu Asp
20 25 30
Met Leu Thr Phe Asp Asp Ser Val Ser Pro Gly Thr Gly Gly Ser Thr
35 40 45
Leu Thr Tyr Gly Tyr Val Arg Leu Lys Thr Pro Ser Thr Val Ala Val
50 55 60
Arg Ser Ile Asn Ser Glu Tyr Thr Ala Asn Glu Ala Lys Arg Glu Lys
65 70 75 80
Ala Thr Ala Asn Val Ile Ile Leu Gly Gly Ser Phe Glu Val Asp Arg
85 90 95
Val Ile Ala Asn Thr Ser Gly Ala Val Asp Glu Ile Asp Phe Gln Leu
100 105 110
Lys Glu Lys Thr Lys Ala Gly Ala Asn Tyr Phe His Asn Leu Val Ile
115 120 125
Asn Gly Thr Ser Ala Ala Ser Gly Ala Gly Phe Val Val Asn Thr Phe
130 135 140
Asp Gly Leu Lys Lys Ile Leu Ser Gly Ser Asp Thr Glu Tyr Thr Ser
145 150 155 160
Glu Ser Asp Ile Ser Thr Ser Ala Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Ala
165 170 175
Phe Leu Asp Glu Leu Asp Ala Phe Ile Ser Lys Leu Ala Glu Lys Pro
180 185 190
Asp Ile Leu Leu Met Asn Asn Glu Met Leu Thr Lys Thr Arg Ala Ala
195 200 205
Ala Arg Arg Ala Gly Phe Tyr Glu Arg Ser Val Asp Gly Phe Gly Arg
210 215 220
Thr Val Glu Lys Tyr Asn Gly Ile Pro Met Met Asp Ala Gly Gln Tyr
225 230 235 240
Tyr Asn Gly Ser Ala Thr Val Asp Val Ile Glu Thr Ser Thr Pro Ser
245 250 255
Thr Ser Ala Tyr Gly Glu Thr Asp Ile Tyr Ala Val Lys Leu Gly Leu
260 265 270
Asn Ala Phe His Gly Ile Ser Val Asp Gly Ser Lys Met Ile His Thr
275 280 285
Tyr Leu Pro Asp Leu Gln Ala Pro Gly Ala Val Lys Lys Gly Lys Val
290 295 300
Glu Leu Leu Ala Gly Ala Ile Leu Lys Asn Ser Lys Met Ala Gly Arg
305 310 315 320
Leu Lys Gly Ile Lys Ile Lys Pro Lys Thr Thr Ala Gly Gly
325 330
<210> 31
<211> 409
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 31
Met Val Phe Val Phe Ser Leu Leu Phe Ser Pro Phe Phe Ala Leu Phe
1 5 10 15
Phe Leu Leu Leu Tyr Leu Tyr Arg Tyr Lys Ile Lys Lys Ile His Val
20 25 30
Ala Leu Ser Val Phe Leu Val Ala Phe Ile Gly Ile Tyr Trp Tyr Pro
35 40 45
Trp Gly Asp Asn Gln Thr His Phe Ala Ile Tyr Tyr Leu Asp Ile Val
50 55 60
Asn Asn Tyr Tyr Ser Leu Ala Leu Ser Ser Ser His Trp Leu Tyr Asp
65 70 75 80
Tyr Val Ile Tyr His Ile Ala Ser Leu Thr Gly Gln Tyr Ile Trp Gly
85 90 95
Tyr Tyr Phe Trp Leu Phe Val Pro Phe Leu Phe Phe Ser Leu Leu Val
100 105 110
Trp Gln Ile Val Asp Glu Gln Glu Val Pro Asn Lys Glu Lys Trp Leu
115 120 125
Leu Leu Ile Leu Leu Ile Leu Phe Leu Gly Ile Arg Glu Leu Leu Asp
130 135 140
Leu Asn Arg Asn Thr Asn Ala Gly Leu Leu Leu Ala Ile Ala Thr Leu
145 150 155 160
Leu Trp Gln Lys Asn Lys Ala Leu Ser Ile Thr Cys Val Ile Val Ser
165 170 175
Leu Leu Leu His Asp Ser Val Arg Tyr Phe Ile Pro Phe Leu Pro Phe
180 185 190
Gly Phe Ile Leu Val Lys Gln Ser Gln Arg Lys Thr Asp Leu Ile Ile
195 200 205
Ile Thr Thr Ile Ile Ile Ser Gly Phe Leu Ile Lys Val Ile Ala Pro
210 215 220
Leu Val Val Ser Glu Arg Asn Ala Met Tyr Leu Glu Val Gly Gly Gly
225 230 235 240
Arg Gly Val Gly Ser Gly Phe Met Val Leu Gln Gly Tyr Val Asn Ile
245 250 255
Leu Ile Gly Ile Ile Gln Tyr Leu Ile Ile Arg Arg Asn Lys Ser Val
260 265 270
Ile Ala Lys Pro Leu Tyr Val Val Tyr Ile Val Ser Ile Leu Ile Ala
275 280 285
Ala Ala Leu Ser Ser Met Trp Val Gly Arg Glu Arg Phe Leu Leu Val
290 295 300
Ser Asn Ile Leu Ala Thr Ser Ile Ile Leu Thr Ser Trp Ser Lys Leu
305 310 315 320
Arg Leu Val Glu Gly Val Lys Val Leu Arg Asn Phe Gln Leu Ile Ile
325 330 335
Gly Ser Tyr Ser Met Lys Ile Ile Ile Asn Leu Leu Leu Val Tyr Ser
340 345 350
Ala His Tyr Val Phe Asn Ser Ala Thr Thr Asp Asn Gln Lys Glu Phe
355 360 365
Ser Ile Val Ala Arg Ser Phe Tyr Met Pro Thr Phe Met Leu Phe Asp
370 375 380
Ile Glu Asn Tyr Gly Phe Ser Asp Lys Lys Phe Met Asn Leu Tyr Asp
385 390 395 400
Arg Val Asp Ser Thr Ile Asp Gly Glu
405
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HHD-DR3
<400> 32
Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu
1 5 10 15
Arg Gly Leu Asn
20
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 33
Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Ala
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 34
Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Val
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 35
Leu Phe Tyr Ser Leu Ala Asp Leu Ile
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 36
Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Ala Val
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 37
Ser Ala Val Val Gly Ile Ala Val Thr
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 38
Tyr Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 39
Ala Tyr Ile Ile Ser Ala Val Val Gly
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 40
Leu Ala Tyr Ile Ile Ser Ala Val Val
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 41
Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Ala Ala
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 42
Ser Ala Val Val Gly Ile Ala Ala Gly
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 43
Arg Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 44
Gln Arg Ile Ile Ser Ala Val Val Gly
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 45
Ala Gln Arg Ile Ile Ser Ala Val Val
1 5
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 46
Ser Ala Val Val Gly Ile Val Val
1 5
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 47
Ala Ile Ser Ala Val Val Gly Ile
1 5
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 48
Gly Ala Ile Ser Ala Val Val Gly
1 5
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 49
Ala Gly Ala Ile Ser Ala Val Val
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 50
Leu Leu Phe Tyr Ser Leu Ala Asp Leu
1 5
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 51
Ile Ser Ala Val Val Gly
1 5
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 52
Ser Leu Ala Asp Leu Ile
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 53
Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 54
Leu Leu Tyr Lys Leu Ala Asp Leu Ile
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Tyr Leu Val Pro Ile Gln Phe Pro Val
1 5
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Ser Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val
1 5 10
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Leu Val Leu Gln Pro Ser Val Lys Val
1 5
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Gly Leu Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu
1 5 10
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
Leu Met Asp Leu Ser Thr Thr Pro Leu
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Asn Leu Ser Leu His Asp Met Phe Val
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Lys Met Lys Pro Leu Leu Pro Arg Val
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Arg Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Ile Leu Leu Asp Ile Ser Phe Pro Gly
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Leu Leu Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 65
Tyr Met Ala Met Ile Gln Phe Ala Ile
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 66
Ser Leu Ser Leu His Asp Met Phe Leu
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 67
Lys Leu Lys Pro Leu Leu Pro Trp Ile
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 68
Lys Leu Lys Pro Leu Leu Pro Phe Leu
1 5
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 69
Met Leu Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 70
Leu Leu Ser Ser Tyr Leu Val Pro Ile
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 71
Phe Val Ser Ser Tyr Leu Val Pro Thr
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 72
Lys Val Val Pro Ile Gln Phe Pro Val
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 73
Lys Ile Val Pro Ile Gln Phe Pro Ile
1 5
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 74
Leu Met Asp Leu Ser Thr Thr Asn Val
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 75
Leu Met Asp Leu Ser Thr Thr Glu Val
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<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 76
Trp Leu Leu Asp Ile Ser Phe Pro Leu
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 77
His Leu Leu Asp Ile Ser Phe Pro Ala
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 78
Glu Leu Leu Asp Ile Ser Phe Pro Ala
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 79
Val Leu Leu Asp Ile Ser Phe Glu Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 80
Val Leu Leu Asp Ile Ser Phe Lys Val
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 81
Ile Met Leu Asp Ile Ser Phe Leu Leu
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 82
Leu Leu Asp Ile Ser Phe Pro Ser Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 83
Tyr Gln Ala Met Ile Gln Phe Leu Ile
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 84
Arg Leu Ser Ser Tyr Leu Val Glu Ile
1 5
<210> 85
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 85
Met Phe Gln Ser Val Phe Glu Gly Phe Glu Ser Phe Leu Phe Val Pro
1 5 10 15
Asn Thr Thr Ser Arg Ser Gly Val His Ile His Asp Ser Ile Asp Ser
20 25 30
Lys Arg Thr Met Thr Val Val Ile Val Ala Leu Leu Pro Ala Leu Leu
35 40 45
Phe Gly Met Tyr Asn Val Gly Tyr Gln His Tyr Leu Ala Ile Gly Glu
50 55 60
Leu Ala Gln Thr Ser Phe Trp Ser Leu Phe Leu Phe Gly Phe Leu Ala
65 70 75 80
Val Leu Pro Lys Ile Val Val Ser Tyr Val Val Gly Leu Gly Ile Glu
85 90 95
Phe Thr Ala Ala Gln Leu Arg His His Glu Ile Gln Glu Gly Phe Leu
100 105 110
Val Ser Gly Met Leu Ile Pro Met Ile Val Pro Val Asp Thr Pro Leu
115 120 125
Trp Met Ile Ala Val Ala Thr Ala Phe Ala Val Ile Phe Ala Lys Glu
130 135 140
Val Phe Gly Gly Thr Gly Met Asn Ile Phe Asn Ile Ala Leu Val Thr
145 150 155 160
Arg Ala Phe Leu Phe Phe Ala Tyr Pro Ser Lys Met Ser Gly Asp Glu
165 170 175
Val Phe Val Arg Thr Gly Asp Thr Phe Gly Leu Gly Ala Gly Gln Ile
180 185 190
Val Glu Gly Phe Ser Gly Ala Thr Pro Leu Gly Gln Ala Ala Thr His
195 200 205
Thr Gly Gly Gly Ala Leu His Leu Thr Asp Ile Leu Gly Asn Ser Leu
210 215 220
Ser Leu His Asp Met Phe Leu Gly Phe Ile Pro Gly Ser Ile Gly Glu
225 230 235 240
Thr Ser Thr Leu Ala Ile Leu Ile Gly Ala Val Ile Leu Leu Val Thr
245 250 255
Gly Ile Ala Ser Trp Arg Val Met Leu Ser Val Phe Ala Gly Gly Ile
260 265 270
Val Met Ser Leu Ile Cys Asn Trp Cys Ala Asn Pro Asp Ile Tyr Pro
275 280 285
Ala Ala Gln Leu Ser Pro Leu Glu Gln Ile Cys Leu Gly Gly Phe Ala
290 295 300
Phe Ala Ala Val Phe Met Ala Thr Asp Pro Val Thr Gly Ala Arg Thr
305 310 315 320
Asn Thr Gly Lys Tyr Ile Phe Gly Phe Leu Val Gly Val Leu Ala Ile
325 330 335
Leu Ile Arg Val Phe Asn Ser Gly Tyr Pro Glu Gly Ala Met Leu Ala
340 345 350
Val Leu Leu Met Asn Ala Phe Ala Pro Leu Ile Asp Tyr Phe Val Val
355 360 365
Glu Ala Asn Ile Arg His Arg Leu Lys Arg Ala Lys Asn Leu Thr Lys
370 375 380
<210> 86
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 86
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1 5 10 15
Phe Asn His Leu Lys Asp Arg Pro Asp Trp Asp Gly Tyr Ile Thr Leu
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Pro Trp Ile Lys
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 87
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1 5 10 15
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50 55 60
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<211> 880
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 88
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<212> PRT
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<223> 细菌蛋白
<400> 89
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 90
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<210> 91
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<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 91
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<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
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705 710 715
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<211> 358
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 93
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Val Leu Ser Gly Ile Ser Val Glu Val Lys Glu Thr Asp Asp Asp Tyr
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Thr Leu Ser Lys Val Thr Lys Asp Gly Lys Gln Ile Gln Asp Asn Asp
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Thr Phe Thr Val Thr Cys Leu Ala Ile Pro Lys His Met Glu Ala Tyr
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Pro Ala Asp Asp Asn Ile Val Phe Asp Gly Gly Asn Thr Ser Val Asp
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Asp Thr Trp Thr Gly Tyr Ile Ser Asp Gly Asp Ala Val Leu Ala Glu
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<223> 细菌蛋白
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Thr Asn Val Ala Gly Ala Val Tyr Asp Thr Tyr Leu Ser Ser Phe Met
115 120 125
Asn Glu Asp Gly Ser Val Asn Trp Leu Pro Val Cys Ala Asp Ala His
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Gly Phe Val Val Asn Lys Asp Leu Phe Glu Lys Tyr Asp Ile Pro Leu
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Pro Thr Asp Tyr Glu Ser Phe Val Ser Ala Cys Glu Ala Phe Glu Glu
165 170 175
Val Gly Ile Arg Gly Phe Thr Ala Asp Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Thr Cys
180 185 190
Met Glu Thr Leu Gln Gly Leu Ser Ala Ser Glu Leu Ser Ser Val Asp
195 200 205
Gly Arg Lys Trp Arg Thr Thr Tyr Ser Ala Pro Asp Asn Thr Lys Arg
210 215 220
Glu Gly Leu Asp Ser Thr Val Trp Pro Lys Ala Phe Glu Arg Met Glu
225 230 235 240
Gln Phe Ile Gln Asp Thr Gly Leu Ser Gln Asp Asp Leu Asp Met Asn
245 250 255
Tyr Asp Asp Ile
260
<210> 111
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 111
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65 70 75 80
Ile Tyr Met Met Lys Lys Ile Ser Arg Arg Ser Phe Leu Gln Ala Cys
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100 105 110
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245 250 255
Val Ala Ala Ile Asp Ala Phe Glu Ala Val Gly Ile Lys Gly Tyr Gln
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325
<210> 112
<211> 636
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 112
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<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 113
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<223> 细菌蛋白
<400> 114
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Pro Gly Val Met Ala Ile Pro Lys Ala Gly Ser Ala Glu His Val Lys
225 230 235 240
Glu Asn Phe Gly Ser Val Ser Ile Thr Leu Asp Thr Glu Asp Ile Glu
245 250 255
Leu Leu Asp Ile Ser Phe Pro Ala Pro Gln His Lys Ile Gln Leu Ala
260 265 270
Gly Trp
<210> 120
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 120
Met Met Lys Pro Asp Glu Ile Ala Lys Ala Phe Leu His Glu Met Asn
1 5 10 15
Pro Thr Asn Trp Asn Gly Gln Gly Glu Met Pro Ala Gly Phe Asp Thr
20 25 30
Arg Thr Met Glu Phe Ile Thr Asp Met Pro Asp Val Leu Leu Asp Ile
35 40 45
Ser Phe Glu Leu Cys Met Glu Asp Asp Gly Thr Phe Gln Trp Glu His
50 55 60
Tyr Cys Glu Leu Val Gln Glu Ser Ser Asp Thr Ile Val Asp Cys Ala
65 70 75 80
His Gly Tyr Gly Ile Asn Ser Val Gln Asn Leu Thr Asp Thr Ile Ser
85 90 95
Gln Leu Leu Glu Val Asn Val Lys
100
<210> 121
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 121
Met Arg Glu Asn Leu Ser Gly Ile Arg Val Val Arg Ala Phe Asn Ala
1 5 10 15
Glu Lys Tyr Gln Glu Asp Lys Phe Glu Gly Ile Asn Asn Arg Leu Thr
20 25 30
Asn Gln Gln Met Phe Asn Gln Arg Thr Phe Asn Phe Leu Ser Pro Ile
35 40 45
Met Tyr Leu Val Met Tyr Phe Leu Thr Leu Gly Ile Tyr Phe Ile Gly
50 55 60
Ala Asn Leu Ile Asn Gly Ala Asn Met Gly Asp Lys Ile Val Leu Phe
65 70 75 80
Gly Asn Met Ile Val Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gln Val Ile Met Ser
85 90 95
Phe Leu Met Leu Ala Met Ile Phe Met Met Leu Pro Arg Ala Ser Val
100 105 110
Ser Ala Arg Arg Ile Asn Glu Val Leu Asp Thr Pro Ile Ser Val Lys
115 120 125
Glu Gly Asn Val Thr Met Asn Asn Ser Asp Ile Lys Gly Cys Val Glu
130 135 140
Phe Lys Asn Val Ser Phe Lys Tyr Pro Asp Ala Asp Glu Tyr Val Leu
145 150 155 160
Leu Asp Ile Ser Phe Lys Val Asn Lys Gly Glu Thr Ile Ala Phe Ile
165 170 175
Gly Ser Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Leu Ile Asn Leu Ile Pro Arg
180 185 190
Phe Tyr Asp Ala Thr Ser Gly Glu Ile Leu Ile Asp Gly Ile Asn Val
195 200 205
Arg Asp Tyr Ser Phe Glu Tyr Leu Asn Asn Ile Ile Gly Tyr Val
210 215 220
<210> 122
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 122
Met Ile Leu Phe Arg His Trp Cys Trp Ser Phe Leu Gly Val Val Ile
1 5 10 15
Glu Ser Leu Pro Phe Ile Val Ile Gly Ala Ile Ile Ser Thr Ile Ile
20 25 30
Gln Phe Tyr Ile Ser Glu Asp Ile Ile Lys Arg Ile Val Pro Arg Arg
35 40 45
Arg Gly Leu Ala Phe Leu Val Ala Ala Phe Ile Gly Leu Val Phe Pro
50 55 60
Met Cys Glu Cys Ala Ile Val Pro Val Ala Arg Ser Leu Ile Lys Lys
65 70 75 80
Gly Val Pro Ile Gly Ile Thr Ile Thr Phe Met Leu Ser Val Pro Ile
85 90 95
Val Asn Pro Phe Val Ile Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Phe Glu Ala Asn
100 105 110
Leu Thr Ile Val Leu Ile Arg Val Val Gly Gly Ile Leu Cys Ser Ile
115 120 125
Ile Val Gly Met Leu Ile Thr Tyr Ile Phe Lys Asp Ser Thr Ile Glu
130 135 140
Ser Ile Ile Ser Asp Gly Tyr Leu Asp Leu Ser Cys Thr Cys Cys Ser
145 150 155 160
Ser Asn Lys Lys Tyr Tyr Ile Ser Lys Leu Asp Lys Leu Ile Thr Ile
165 170 175
Val Cys Gln Ala Ser Asn Glu Phe Leu Asn Ile Ser Val Tyr Val Ile
180 185 190
Leu Gly Ala Phe Ile Ser Ser Ile Phe Gly Ser Ile Ile Asn Glu Glu
195 200 205
Ile Leu Asn Asp Tyr Thr Phe Asn Asn Ile Leu Ala Val Ile Ile Met
210 215 220
Leu Asp Ile Ser Phe Leu Leu Ser Leu Cys Ser Glu Ala Asp Ala Phe
225 230 235 240
Val Gly Ser Lys Phe Leu Asn Asn Phe Gly Ile Pro Ala Val Ser Ala
245 250 255
Phe Met Ile Leu Gly Pro Met Met Asp Leu Lys Asn Ala Ile Leu Thr
260 265 270
Leu Gly Leu Phe Lys Arg Lys Phe Ala Thr Ile Leu Ile Ile Thr Ile
275 280 285
Leu Leu Val Val Thr Ala Phe Ser Ile Cys Leu Ser Phe Ile Ser Leu
290 295 300
<210> 123
<211> 638
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 123
Met Met Thr Ala Ala Gln Thr Leu Lys Glu Tyr Trp Gly Tyr Asp Gly
1 5 10 15
Phe Arg Pro Met Gln Glu Glu Ile Ile Ser Ser Ala Leu Glu Gly Arg
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Leu Ile Ala Leu Met Lys Asp Gln Val Gln Asn Leu Glu Ala Arg Gly
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Ile Arg Ala Ile Ala Val His Ala Gly Met Asn Arg Arg Glu Val Asp
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Thr Ala Leu Asn Asn Ala Ala Tyr Gly Asp Tyr Lys Phe Leu Tyr Val
100 105 110
Ser Pro Glu Arg Leu Gly Thr Ser Leu Phe Lys Ser Tyr Leu Glu Val
115 120 125
Leu Asp Val Asn Phe Ile Val Val Asp Glu Ala His Cys Ile Ser Gln
130 135 140
Trp Gly Tyr Asp Phe Arg Pro Asp Tyr Leu Arg Ile Gly Glu Met Arg
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Lys Val Leu Lys Ala Pro Leu Ile Ala Leu Thr Ala Thr Ala Thr Pro
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Glu Val Ala Arg Asp Ile Met Gln Lys Leu Val Arg Pro Gly Thr Pro
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Ser Gln Val Glu Arg Asn Leu Glu Asn Phe Thr Leu Leu Arg Ser Gly
195 200 205
Phe Glu Arg Pro Asn Leu Ser Tyr Ile Val Arg Glu Cys Glu Asp Lys
210 215 220
Thr Gly Gln Leu Leu Asn Ile Cys Gly Ser Val Pro Gly Ser Gly Ile
225 230 235 240
Val Tyr Met Arg Asn Arg Arg Lys Cys Glu Glu Val Ala Ala Leu Leu
245 250 255
Ser Gly Ser Gly Val Ser Ala Ser Phe Tyr His Ala Gly Leu Gly Ala
260 265 270
Leu Thr Arg Thr Glu Arg Gln Glu Ala Trp Lys Lys Gly Glu Ile Arg
275 280 285
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Ala Leu Leu Trp Asn Lys Thr Asp Ile Arg Arg Leu Arg Gln Leu Leu
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Asp Ile Ser Phe Pro Ser Leu Glu Tyr Ile Glu Asp Ile Tyr Gln Lys
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Leu Lys Phe Asp Leu Glu Ala Phe Ala Arg Asn Tyr Ser Leu Ser Arg
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Ile Val Pro Val Asp Glu Glu Arg Leu Ala His Leu Cys Gly Val Ser
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Val Pro Val Leu Arg Gln Leu Leu Tyr Asn Leu Ser Leu Glu His Val
485 490 495
Ile Arg Tyr Val Pro Cys Asp Lys Ala Thr Val Ile Phe Leu His His
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Leu Asp Lys Gly Lys Leu Leu Tyr Leu His Pro Asp Glu Ser
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<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 124
Met Pro Lys Pro Gly Ser Ser Leu Glu Asp Ala Arg Glu Gln Lys Phe
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Ser Ser Ala Val Thr Glu Tyr Gly Asp Leu Asn Pro Ser Glu Gly Ile
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Asn Asn Leu Ile Asp Glu Glu Leu Leu Gly Asn Asp Tyr Thr Lys Ser
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Pro Val Arg Lys Tyr Val Phe Lys Ser Glu Lys Thr Thr Leu Arg Glu
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Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 125
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1 5 10 15
Leu Tyr Gly Met Thr Val Met Ser Lys Ser Leu Glu Lys Met Ala Gly
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Gly Lys Leu Glu Arg Met Leu Lys Arg Met Thr Ser Ser Pro Phe Lys
35 40 45
Ser Leu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Thr Ile Ala Ile Gln Ser Ser Ser
50 55 60
Ala Met Thr Val Met Leu Val Gly Leu Val Asn Ser Gly Val Met Glu
65 70 75 80
Leu Arg Gln Thr Ile Gly Ile Ile Met Gly Ser Asn Ile Gly Thr Thr
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Phe Val Asn Leu Leu Lys Pro Glu Asn Phe Ser Pro Leu Ile Ala Leu
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Ala Gly Ile Leu Leu Ile Met Gly Ser Lys Arg Gln Arg Arg Arg Asp
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Leu Met Ser Gly Ala Val Ser Pro Leu Ala Glu Met Pro Gln Phe Ala
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Ala Val Phe Thr Gly Ile Ile Gln Ser Ser Ala Ala Ser Val Ala Ile
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Pro Ile Ile Met Gly Gln Asn Ile Gly Thr Cys Val Thr Ala Leu Ile
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Ser Ser Ile Gly Val Asn Arg Asn Ala Lys Arg Val Ala Val Val His
245 250 255
Ile Ser Phe Asn Val Ile Gly Thr Ala Val Cys Leu Ile Leu Phe Tyr
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Gly Gly Asp Met Ile Leu His Phe Thr Phe Leu Asn Gln Ala Val Gly
275 280 285
Ala Val Gly Ile Ala Phe Cys His Thr Ala Phe Asn Val Phe Thr Thr
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Ile Leu Leu Leu Pro Phe Ser Arg Gln Leu Glu Lys Leu Ala Arg Arg
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Leu Val Arg Thr Glu Asp Thr Arg Glu Ser Phe Ala Phe Leu Asp Pro
325 330 335
Leu Leu Leu Arg Thr Pro Gly Ala Ala Val Ser Glu Ser Val Ala Met
340 345 350
Ala Gly Arg Met Gly Gln Ala Ala Arg Glu Asn Ile Cys Leu Ala Thr
355 360 365
Asp Gln Leu Ser Gln Tyr Ser Arg Glu Arg Glu Thr Gln Ile Leu Gln
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Asn Glu Asp Lys Leu Asp Ile Tyr Glu Asp Arg Leu Ser Ser Tyr Leu
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Ser Arg Leu Leu His Ala Ile Gly Asp Phe Glu Arg Ile Gly Asp His
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Ala Val Asn Ile Gln Glu Ser Ala Gln Glu Leu His Asp Lys Glu Leu
435 440 445
Arg Phe Ser Asp Ser Ala Arg Glu Glu Leu Gln Val Leu Leu Ser Ala
450 455 460
Leu Asp Asp Ile Leu Asp Leu Thr Ile Arg Ser Phe Gln Ala Ala Asp
465 470 475 480
Val Glu Thr Ala Arg Arg Val Glu Pro Leu Glu Glu Thr Ile Asp Gln
485 490 495
Leu Ile Glu Glu Ile Arg Ser Arg His Ile Gln Arg Leu Gln Ala Gly
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Gln Cys Thr Ile Gln Leu Gly Phe Val Leu Ser Asp Leu Leu Thr Asn
515 520 525
Ile Glu Arg Ala Ser Asp His Cys Ser Asn Ile Ala Val Ser Val Ile
530 535 540
Glu Glu Cys Ser Gly Gly Pro Gly Arg His Ala Tyr Leu Gln Glu Val
545 550 555 560
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<213> 智人
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<213> 智人
<400> 129
Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu
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<211> 10
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<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 142
Met Gly Gly Arg Trp Met Gly Tyr Ile Leu Ile Gly Ile Tyr Val Leu
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Ala Val Lys Ile His Arg Phe Asn Pro His His Phe Leu Val Phe Phe
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Gly Phe Cys Ile Tyr Leu Leu Ala Ser Gly Phe Leu Leu Arg Gly Gly
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Arg Lys Asn Lys Leu Leu Tyr Val Phe Leu Thr Ala Val Ala Gly Gly
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Leu Ser Phe Val Leu Arg Leu Ser Gly Ser Ala Asn Glu Phe Leu Ser
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Arg Val Phe Ser Phe Ile Asp Ser Asp Lys Met Asp Asp Tyr Leu Ser
245 250 255
Leu Ser Thr Asn Gly Gly Phe Tyr Ile Pro Val Ile Met Gln Leu Leu
260 265 270
Ser Leu Tyr Leu Ala Phe Ile Ile Lys Lys Gln Ser Lys Arg Ala Ser
275 280 285
Leu Leu Asn Gln Gln Tyr Thr Asp Val Leu Tyr Tyr Phe Asn Leu Leu
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Gln Val Ile Phe Tyr Pro Leu Phe Met Ile Ser Thr Thr Phe Met Arg
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Leu Ile Thr Ala Thr Ser Met Val Thr Ile Ala Ala Gly Gly Tyr Asn
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Lys Phe Glu Ile Lys Gln Arg Lys Arg Phe Lys Ile Ile Gly Ala Ser
340 345 350
Phe Leu Ile Val Ala Ala Ser Leu Phe Arg Gln Leu Val Leu Gly His
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Trp Trp Glu Thr Ala Val Val Pro Leu Phe His Leu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 143
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 144
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<213> 人工序列
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<223> 细菌蛋白
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Met Gln Thr Thr Arg Lys Asp Met Tyr Tyr Thr Val Lys Leu Val Glu
35 40 45
Asn Gln Ile Asp Tyr Gln Lys Pro Leu Glu Lys Gln Ile Asp Lys Leu
50 55 60
Asn Asp Leu Ala Tyr Thr Lys Asp Thr Arg Leu Thr Ile Ile Asp Lys
65 70 75 80
Glu Gly Asn Val Leu Ala Asp Ser Asp Lys Glu Gly Ile Gln Glu Asn
85 90 95
His Ser Gly Arg Ser Glu Phe Lys Glu Ala Leu Ser Asp Gln Phe Gly
100 105 110
Tyr Ala Thr Arg Tyr Ser Ser Thr Val Lys Lys Asn Met Met Tyr Val
115 120 125
Ala Tyr Tyr His Arg Gly Tyr Val Val Arg Ile Ala Ile Pro Tyr Asn
130 135 140
Gly Ile Phe Asp Asn Ile Gly Pro Leu Leu Glu Pro Leu Phe Ile Ser
145 150 155 160
Ala Ala Leu Ser Leu Cys Val Ala Leu Ala Leu Ser Tyr Arg Phe Ser
165 170 175
Arg Thr Leu Thr Lys Pro Leu Glu Glu Ile Ser Glu Glu Val Ser Lys
180 185 190
Ile Asn Asp Asn Arg Tyr Leu Ser Phe Asp His Tyr Gln Tyr Asp Glu
195 200 205
Phe Asn Val Ile Ala Thr Lys Leu Lys Glu Gln Ala Asp Thr Ile Arg
210 215 220
Lys Thr Leu Lys Thr Leu Lys Asn Glu Arg Leu Lys Ile Asn Ser Ile
225 230 235 240
Leu Asp Lys Met Asn Glu Gly Phe Ile Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Glu
245 250 255
Ile Leu Met Val Asn Lys Lys Ala Lys Gln Leu Phe Ser Asp Arg Met
260 265 270
Glu Val Asn Gln Pro Ile Gln Asp Phe Ile Phe Asp His Gln Ile Ile
275 280 285
Asp Gln Leu Glu Asn Ile Gly Val Glu Pro Lys Ile Val Thr Leu Lys
290 295 300
Lys Asp Glu Glu Val Tyr Asp Cys His Leu Ala Lys Val Glu Tyr Gly
305 310 315 320
Val Thr Leu Leu Phe Val Asn Val Thr Glu Ser Val Asn Ala Thr Lys
325 330 335
Met Arg Gln Glu Phe Phe Ser Asn Val Ser His Glu Leu Lys Thr Pro
340 345 350
Met Thr Ser Ile Arg Gly Tyr Ser Glu Leu Leu Gln Ala Gly Met Ile
355 360 365
Asp Asp Pro Lys Val Arg Lys Gln Ala Leu Asp Lys Ile Gln Lys Glu
370 375 380
Val Asp His Met Ser Gln Leu Ile Gly Asp Ile Leu Met Ile Ser Arg
385 390 395 400
Leu Glu Asn Lys Asp Ile Glu Val Ile Lys His Pro Val His Leu Gln
405 410 415
Pro Ile Val Asp Asp Ile Leu Glu Ser Leu Lys Val Glu Ile Glu Lys
420 425 430
Arg Glu Ile Thr Val Glu Cys Asp Leu Thr Ser Gln Thr Tyr Leu Ala
435 440 445
Asn His Gln His Ile Gln Gln Leu Met Asn Asn Leu Ile Asn Asn Ala
450 455 460
Val Lys Tyr Asn Lys Gln Lys Gly Ser Leu Asn Ile His Ser Tyr Leu
465 470 475 480
Val Asp Gln Asp Tyr Ile Ile Glu Val Ser Asp Thr Gly Arg Gly Ile
485 490 495
Ser Leu Ile Asp Gln Gly Arg Val Phe Glu Arg Phe Phe Arg Cys Asp
500 505 510
Ala Gly Arg Asp Lys Glu Thr Gly Gly Thr Gly Leu Gly Leu Ala Ile
515 520 525
Val Lys His Ile Val Gln Tyr Tyr Lys Gly Thr Ile His Leu Glu Ser
530 535 540
Glu Leu Gly Lys Gly Thr Thr Phe Lys Val Val Leu Pro Ile Ile Lys
545 550 555 560
Asp Ser Leu
<210> 146
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 146
Met Ile Lys Cys Thr Val His Lys Leu Ser Pro Ser Lys Thr Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Glu Asp Ser Asn Lys Lys Thr Ile Ala Ser Thr Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Leu Tyr Leu Tyr Lys Ile Pro Thr Lys Leu Ala Glu Ile Leu Glu Asp
35 40 45
Asp Asp Ile Val Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Asn Tyr Glu Leu Gln Asn
50 55 60
Ile Val Leu Pro Ile Lys Lys Ser Ser Glu Val Lys Ala Ser Ile Tyr
65 70 75 80
Lys Thr Glu Tyr Phe Glu Ile Asn Trp Leu Asn Thr Lys Ile Glu Asp
85 90 95
Leu Ser Ser Thr Val Asp Lys Lys Glu Lys Ala Ile Ile Arg Val Leu
100 105 110
Gly Ile Ile Glu Asn Lys Phe Lys Thr Leu His Leu Trp Ser Thr Ile
115 120 125
Asn Thr Leu Trp Ile Ile Val Leu Thr Ile Val Ile Leu Asn Leu Ile
130 135 140
<210> 147
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 147
Met Gly Ile Leu Leu Phe Ala Val Tyr Val Ile Leu Leu Ile Tyr Phe
1 5 10 15
Leu Phe Phe Ser Glu Glu Tyr Gly Arg Val Ala Gln Ala Glu Arg Val
20 25 30
Tyr Arg Tyr Asn Leu Val Pro Phe Val Glu Ile Arg Arg Phe Trp Val
35 40 45
Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Phe Ala Val Phe Thr Asn Ile Phe Gly
50 55 60
Asn Val Ile Gly Phe Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu Pro Val Ile Phe
65 70 75 80
Arg Arg Met Asn Ser Gly Phe Leu Ile Cys Ile Ser Gly Phe Val Leu
85 90 95
Ser Leu Thr Val Glu Val Ile Gln Leu Val Thr Lys Val Gly Cys Phe
100 105 110
Asp Val Asp Asp Met Ile Leu Asn Thr Leu Gly Ala Ala Leu Gly Tyr
115 120 125
Val Leu Phe Leu Ile Cys Asn His Ile Arg Arg Lys Phe His Tyr Gly
130 135 140
Lys Lys Ile
145
<210> 148
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 148
Met Lys Lys Glu Thr Lys His Ile Ile Arg Thr Leu Gly Thr Ile Leu
1 5 10 15
Phe Ile Leu Tyr Val Leu Ala Leu Ile Tyr Phe Leu Phe Phe Ser Glu
20 25 30
Glu Tyr Gly Arg Ala Ala Leu Glu Glu Arg Gln Tyr Arg Tyr Asn Leu
35 40 45
Ile Pro Phe Val Glu Ile Arg Arg Phe Trp Val Tyr Arg Arg Gln Leu
50 55 60
Gly Phe Met Ala Val Ala Ala Asn Leu Phe Gly Asn Val Ile Gly Phe
65 70 75 80
Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu Pro Val Ile Leu Asp Arg Met Arg Ser
85 90 95
Gly Trp Leu Ile Ile Leu Ala Gly Phe Gly Leu Ser Val Thr Val Glu
100 105 110
Val Ile Gln Leu Ile Thr Lys Val Gly Cys Phe Asp Val Asp Asp Met
115 120 125
Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ala Ala Leu Gly Tyr Leu Leu Phe Phe Ile
130 135 140
Cys Asp His Leu Arg Arg Lys Ile Tyr Gly Lys Lys Ile
145 150 155
<210> 149
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 149
Tyr Asp Asp Leu Arg Gly Phe Phe Leu Lys Lys Glu Thr Lys Thr Leu
1 5 10 15
Ile Arg Arg Met Gly Ile Leu Leu Phe Val Ile Tyr Ile Ile Phe Leu
20 25 30
Val Tyr Phe Leu Phe Phe Ser Glu Glu Tyr Gly Arg Ala Ala Glu Ala
35 40 45
Gln Arg Val Tyr Arg Tyr Asn Leu Ile Pro Phe Val Glu Ile Arg Arg
50 55 60
Phe Trp Ile Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Thr Phe Ala Val Phe Ser Asn
65 70 75 80
Ile Phe Gly Asn Val Ile Gly Phe Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu Pro
85 90 95
Val Ile Phe Arg Arg Met Asn Ser Gly Phe Leu Ile Cys Val Ser Gly
100 105 110
Phe Ile Leu Ser Leu Thr Val Glu Val Ile Gln Leu Val Thr Lys Val
115 120 125
Gly Cys Phe Asp Val Asp Asp Met Ile Leu Asn Thr Leu Gly Ala Thr
130 135 140
Leu Gly Tyr Val Leu Phe Phe Val Cys Asn His Ile Val Thr Val His
145 150 155 160
Trp
<210> 150
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 150
Arg Leu Gln Lys Gln Glu Lys Thr Leu Lys Lys Glu Thr Lys His Ile
1 5 10 15
Ile Arg Thr Leu Gly Thr Ile Leu Phe Ile Leu Tyr Val Leu Ala Leu
20 25 30
Ile Tyr Phe Leu Phe Phe Ser Glu Glu Tyr Gly Arg Ala Ala Met Glu
35 40 45
Glu Arg Gln Tyr Arg Tyr Asn Leu Ile Pro Phe Val Glu Ile Arg Arg
50 55 60
Phe Trp Val Tyr Arg Lys Gln Leu Gly Leu Met Ala Val Val Thr Asn
65 70 75 80
Leu Phe Gly Asn Val Ile Gly Phe Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu Pro
85 90 95
Val Ile Leu Asp Lys Met Arg Ser Gly Trp Leu Ile Val Leu Ala Gly
100 105 110
Phe Gly Leu Ser Val Thr Val Glu Val Ile Gln Leu Ile Thr Lys Val
115 120 125
Gly Cys Phe Asp Val Asp Asp Met Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Tyr Leu Leu Phe Phe Ile Cys Asp His Leu Arg Arg Lys Ile
145 150 155 160
Tyr Gly Lys Lys Ile
165
<210> 151
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 151
Met Trp Phe Phe Ser Gln Lys Gln Glu Lys Thr Leu Lys Lys Glu Thr
1 5 10 15
Lys His Ile Ile Arg Thr Leu Gly Thr Val Leu Phe Ile Leu Tyr Val
20 25 30
Leu Ala Leu Ile Tyr Phe Leu Phe Phe Ser Glu Glu Tyr Gly Arg Val
35 40 45
Ala Met Glu Glu Arg Glu Tyr Arg Tyr Asn Leu Ile Pro Phe Val Glu
50 55 60
Ile Arg Arg Phe Trp Val Tyr Arg Lys Gln Leu Gly Phe Leu Ala Val
65 70 75 80
Cys Thr Asn Leu Phe Gly Asn Val Ile Gly Phe Leu Pro Phe Gly Phe
85 90 95
Ile Leu Pro Val Ile Leu Glu Arg Met Arg Ser Gly Trp Leu Ile Ile
100 105 110
Leu Ala Gly Phe Gly Leu Ser Val Thr Val Glu Val Ile Gln Leu Ile
115 120 125
Thr Lys Val Gly Cys Phe Asp Val Asp Asp Met Ile Leu Asn Thr Ala
130 135 140
Gly Ala Ala Leu Gly Tyr Leu Leu Phe Phe Ile Cys Asn His Leu Arg
145 150 155 160
Arg Lys Ile Tyr Gly Lys Lys Ile
165
<210> 152
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 152
Ala Phe Leu Ile Asn Thr Val Gly Asn Val Val Cys Phe Met Pro Phe
1 5 10 15
Gly Phe Ile Leu Pro Ile Ile Thr Glu Phe Gly Lys Arg Trp Tyr Asn
20 25 30
Thr Phe Leu Leu Ser Phe Leu Met Thr Phe Thr Ile Glu Thr Ile Gln
35 40 45
Leu Val Phe Lys Val Gly Ser Phe Asp Val Asp Asp Met Phe Leu Asn
50 55 60
Thr Val Gly Gly Val Ala Gly Tyr Ile Leu Val Val Ile Cys Lys Val
65 70 75 80
Ile Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Pro Glu Thr
85 90
<210> 153
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 153
Met Trp Lys Arg Thr Lys Thr His Gln Lys Val Cys Trp Val Leu Phe
1 5 10 15
Ile Gly Tyr Leu Leu Met Leu Thr Tyr Phe Met Phe Phe Ser Asp Gly
20 25 30
Phe Ser Arg Ser Glu Tyr Thr Glu Tyr His Tyr Asn Ile Thr Leu Phe
35 40 45
Lys Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Thr Tyr Arg Glu Leu Leu Gly Met Lys
50 55 60
Ala Phe Leu Ile Asn Thr Val Gly Asn Val Val Cys Phe Met Pro Phe
65 70 75 80
Gly Phe Ile Leu Pro Ile Ile Thr Glu Leu Gly Lys Arg Trp Tyr Asn
85 90 95
Thr Phe Leu Leu Ser Phe Leu Met Thr Phe Thr Ile Glu Thr Ile Gln
100 105 110
Leu Val Phe Lys Val Gly Ser Phe Asp Val Asp Asp Met Phe Leu Asn
115 120 125
Thr Val Gly Gly Ile Ala Gly Tyr Ile Leu Val Ile Ile Cys Lys Ala
130 135 140
Met Arg Arg Val Phe Tyr Asp Ser Glu Thr
145 150
<210> 154
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 154
Met Trp Lys Lys Glu Lys Thr His Gln Lys Ile Cys Trp Ile Leu Phe
1 5 10 15
Phe Ser Tyr Leu Leu Met Leu Thr Tyr Phe Met Phe Phe Ser Asp Gly
20 25 30
Phe Gly Arg Ser Glu Tyr Thr Glu Tyr His Tyr Asn Leu Thr Leu Phe
35 40 45
Lys Glu Ile Arg Arg Phe Tyr Thr Tyr Arg Glu Leu Val Gly Thr Lys
50 55 60
Ala Phe Leu Leu Asn Ile Val Gly Asn Val Val Cys Phe Met Pro Phe
65 70 75 80
Gly Phe Ile Leu Pro Ile Ile Thr Arg Leu Gly Glu Arg Trp Leu Asn
85 90 95
Thr Leu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Thr Leu Ser Ile Glu Thr Ile Gln
100 105 110
Leu Val Phe Arg Val Gly Ser Phe Asp Val Asp Asp Met Phe Leu Asn
115 120 125
Thr Val Gly Gly Ala Ala Gly Tyr Val Ser Val Thr Met Leu Lys Trp
130 135 140
Ile Arg Arg Ala Phe His Gly Ser Lys Asn Glu Lys Asp Phe Ile His
145 150 155 160
<210> 155
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 155
Met Ala Lys His Ser Thr Arg Asn Gln Arg Leu Gly Trp Val Leu Phe
1 5 10 15
Val Leu Tyr Leu Gly Ala Leu Phe Tyr Leu Met Phe Phe Ala Asp Met
20 25 30
Ala Glu Arg Gly Leu Gly Val Lys Glu Asn Tyr Thr Tyr Asn Leu Lys
35 40 45
Pro Phe Val Glu Ile Arg Arg Tyr Leu Phe Cys Ala Ser Gln Ile Gly
50 55 60
Phe Arg Gly Val Phe Leu Asn Leu Tyr Gly Asn Ile Leu Gly Phe Met
65 70 75 80
Pro Phe Gly Phe Ile Leu Gly Val Ile Ser Ser Arg Cys Arg Lys Tyr
85 90 95
Trp Tyr Asp Ala Val Ile Cys Thr Tyr Leu Leu Ser Tyr Ser Ile Glu
100 105 110
Met Ile Gln Leu Phe Phe Arg Ala Gly Ser Cys Asp Val Asp Asp Ile
115 120 125
Ile Leu Asn Thr Leu Gly Gly Thr Leu Gly Tyr Ile Ala Phe His Ile
130 135 140
Val Gln His Glu Arg Ile Arg Arg Tyr Phe Leu Lys His Pro Lys Lys
145 150 155 160
Lys Arg Pro Gln Gln
165
<210> 156
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 156
Met Glu Asn Ser Gly Ala Val Leu Arg Asp Gly Cys Leu Leu Ile Asp
1 5 10 15
Gly Glu Asn Met Ile Lys Lys Thr Arg Met His Gln Lys Ile Cys Trp
20 25 30
Val Leu Phe Ile Ser Tyr Leu Val Val Leu Thr Tyr Phe Met Phe Phe
35 40 45
Ser Asp Gly Phe Gly Arg Ser Gly His Glu Glu Tyr Ala Tyr Asn Leu
50 55 60
Ile Leu Phe Lys Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Lys Tyr Arg Glu Leu Leu
65 70 75 80
Gly Met Arg Ser Phe Leu Leu Asn Thr Val Gly Asn Val Ile Cys Phe
85 90 95
Met Pro Phe Gly Phe Ile Leu Pro Ile Ile Ser Arg Arg Gly Lys Lys
100 105 110
Trp Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Ser Phe Leu Met Ser Phe Gly Ile Glu
115 120 125
Thr Ile Gln Leu Ile Phe Lys Val Gly Ser Phe Asp Val Asp Asp Met
130 135 140
Phe Leu Asn Thr Leu Gly Gly Ile Ala Gly Tyr Ile Cys Val Cys Met
145 150 155 160
Ala Lys Gly Val Arg Arg Met Ala Ser Gly Ala Ser Asp Arg
165 170
<210> 157
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细菌蛋白
<400> 157
Leu Cys Lys Ile Val Ala Ser Asn Phe Ser Ser Arg Ile Arg Phe Phe
1 5 10 15
Met Leu Gln Asn Ile Val Lys Asn Leu Glu Lys Val Lys Trp Leu Glu
20 25 30
Asp Ser Ser Ser Arg Phe Ser Arg Leu Lys Met
35 40
<210> 158
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 158
Phe Met Pro Phe Gly Phe Ile Leu Gly Val
1 5 10
<210> 159
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> UCP2 肽
<400> 159
Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His
1 5 10 15
<210> 160
<211> 9
<212> PRT
<213> 小白鼠
<400> 160
Val Ser Ser Val Phe Leu Leu Thr Leu
1 5
<210> 161
<211> 9
<212> PRT
<213> 小白鼠
<400> 161
Ile Asn Met Leu Val Gly Ala Ile Met
1 5
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 162
Lys Pro Ser Val Phe Leu Leu Thr Leu
1 5
<210> 163
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列变体
<400> 163
Gly Ala Met Leu Val Gly Ala Val Leu
1 5
<210> 164
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OVA 323-339 肽
<400> 164
Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly
1 5 10 15
Arg

Claims (58)

1.一种鉴定肿瘤相关抗原表位序列的小型生物群序列变体的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)选择感兴趣的肿瘤相关抗原，
(ii)鉴定选自步骤(i)中的所述肿瘤相关抗原中包括的至少一个表位并确定其序列，和
(iii)鉴定步骤(ii)中鉴定的表位序列的至少一种小型生物群序列变体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(iii)包括
—比较步骤(ii)中选择的表位序列与一个或多个小型生物群序列，和
—鉴定所述一个或多个小型生物群序列是否包含所述表位序列的一个或多个小型生物群序列变体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述小型生物群序列变体与肿瘤相关抗原表位序列共享至少50％的序列同一性。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述小型生物群序列变体为人小型生物群序列变体，并且其中所述肿瘤相关抗原为人肿瘤相关抗原。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述小型生物群序列变体选自细菌序列变体、古细菌序列变体、原生生物序列变体、真菌序列变体和病毒序列变体。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述小型生物群序列变体是细菌序列变体或古细菌序列变体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述小型生物群序列变体是肠道的小型生物群序列变体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述小型生物群序列变体是肠道细菌序列变体。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述小型生物群序列变体是肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述肽具有8-12个氨基酸，优选地8-10个氨基酸，最优选地9或10个氨基酸的长度。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述小型生物群序列变体与肿瘤相关抗原表位序列共享至少70％，优选地至少75％的序列同一性。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中所述小型生物群序列变体的核心序列与所述肿瘤相关抗原表位序列的核心序列同一，其中所述核心序列由除了三个最N-末端和三个最C-末端氨基酸以外的所有氨基酸组成。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中鉴定的所述肿瘤相关抗原表位可结合MHC I。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中的所述小型生物群序列变体基于小型生物群数据库鉴定。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述小型生物群数据库包括多个个体的小型生物群数据。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述小型生物群数据库包括单个个体的小型生物群数据，而不是多个个体的小型生物群数据。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中步骤(iii)包括下面的子步骤：
(iii-a)任选地，从(a)单个个体或多个个体的样品中鉴定小型生物群蛋白质序列或核酸序列，
(iii-b)编译包含单个个体或多个个体的小型生物群蛋白质序列或核酸序列的数据库，和
(iii-c)鉴定在步骤(iii-b)中编译的数据库中在步骤(ii)中鉴定的表位序列的至少一种小型生物群序列变体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(iii-a)中的所述样品是粪便样品。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
(iv)测试至少一种小型生物群序列变体与MHC分子，特别是MHC I分子的结合，并获得结合亲和力。
20.根据权利要求19所述的方法，其中步骤(iv)进一步包括测试所述(各自的参考)表位与MHC分子，特别是MHC I分子的结合，并获得结合亲和力。
21.根据权利要求20所述的方法，其中步骤(iv)进一步包括比较小型生物群序列变体和各自的参考表位获得的结合亲和力，并且选择与它们各自的参考表位相比，具有与MHC更高的结合亲和力的小型生物群序列变体。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
(v)确定包含小型生物群序列变体的小型生物群蛋白质的细胞定位。
23.根据权利要求22所述的方法，其中步骤(v)进一步包括鉴定含有小型生物群序列变体的小型生物群蛋白的序列，优选在确定细胞定位之前。
24.根据权利要求19-23中任一项所述的方法，其中所述方法包括步骤(iv)和步骤(v)。
25.根据权利要求24所述的方法，其中步骤(v)在步骤(iv)之后，或其中步骤(iv)在步骤(v)之后。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
(vi)测试所述小型生物群序列变体的免疫原性。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
(vii)测试所述小型生物群序列变体的细胞毒性。
28.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述肿瘤相关抗原表位序列是SEQID NO：1-5、55-65和126-131中任一个所陈述的序列。
29.根据权利要求29所述的方法，其中所述肿瘤相关抗原表位序列是SEQ ID NO：1中所陈述的序列。
30.一种肿瘤相关抗原表位序列的小型生物群序列变体，其优选地通过根据权利要求1-29所述的方法可获得。
31.根据权利要求30所述的小型生物群序列变体，其中所述小型生物群序列变体是(细菌)肽，其优选地具有8-12个氨基酸，更优选地8-10个氨基酸，最优选地9或10个氨基酸的长度。
32.根据权利要求31所述的小型生物群序列变体，其中所述小型生物群序列变体与所述肿瘤相关抗原表位序列共享至少70％，优选地至少75％的序列同一性，和/或其中所述小型生物群序列变体的核心序列与所述肿瘤相关抗原表位序列的核心序列同一，其中所述核心序列由除了3个最N-末端和3个最C-末端氨基酸以外的所有氨基酸组成。
33.根据权利要求31或32所述的小型生物群序列变体，其中所述小型生物群序列变体包括根据SEQ ID NO：6-18中任一个的氨基酸序列或由其组成，优选地所述小型生物群序列变体包括根据SEQ ID NO：6或18的氨基酸序列或由其组成，更优选地所述小型生物群序列变体包括根据SEQ ID NO：18的氨基酸序列或由其组成。
34.根据权利要求31或32所述的小型生物群序列变体，其中所述小型生物群序列变体包括根据SEQ ID NO 66-84和126中任一个的氨基酸序列或由其组成，优选地所述小型生物群序列变体包括根据SEQ ID NO：75的氨基酸序列或由其组成。
35.根据权利要求31或32所述的小型生物群序列变体，其中所述小型生物群序列变体包括根据SEQ ID NO 132-141和158中任一个的氨基酸序列或由其组成，优选地所述小型生物群序列变体包括根据SEQ ID NO：139的氨基酸序列或由其组成。
36.一种制备药物，优选地用于预防和/或治疗癌症的方法，其包括以下步骤：
(a)根据权利要求1-29中任一项所述的方法鉴定肿瘤相关抗原表位序列的小型生物群序列变体；
(b)制备包括所述小型生物群序列变体的药物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述药物是疫苗。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中步骤(b)包括用所述小型生物群序列变体负载纳米颗粒。
39.根据权利要求38所述的方法，其中步骤(b)进一步包括用佐剂负载所述纳米颗粒。
40.根据权利要求36或37所述的方法，其中步骤(b)包括用所述小型生物群序列变体负载细菌细胞。
41.根据权利要求40所述的方法，其中步骤(b)包括用所述小型生物群序列变体(包含/编码小型生物群序列变体的核酸分子)转化细菌细胞的步骤。
42.根据权利要求36-41中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括制备药物组合物，所述药物组合物包括：
(i)所述小型生物群序列变体；
(ii)包括所述小型生物群序列变体的重组蛋白；
(iii)包括所述小型生物群序列变体的免疫原性化合物；
(iv)负载有所述小型生物群序列变体的纳米颗粒；
(v)负载有所述小型生物群序列变体的抗原呈递细胞；
(vi)表达所述小型生物群序列变体的宿主细胞；或
(vii)编码所述小型生物群序列变体的核酸分子；
和，任选地，药学上可接受的载体和/或佐剂。
43.包括根据权利要求30-35中任一项所述的小型生物群序列变体的药物，其优选地通过根据权利要求36-42中任一项所述的方法获得。
44.根据权利要求43所述的药物，其包括负载有根据权利要求30-35中任一项所述的小型生物群序列变体的纳米颗粒。
45.根据权利要求44所述的药物，其中所述纳米颗粒进一步负载有佐剂。
46.根据权利要求43所述的药物，其包括表达根据权利要求30-35中任一项所述的小型生物群序列变体的细菌细胞。
47.根据权利要求43所述的药物，其包括：
(i)所述小型生物群序列变体；
(ii)包括所述小型生物群序列变体的重组蛋白；
(iii)包括所述小型生物群序列变体的免疫原性化合物；
(iv)负载有所述小型生物群序列变体的纳米颗粒；
(v)负载有所述小型生物群序列变体的抗原呈递细胞；
(vi)表达所述小型生物群序列变体的宿主细胞；或
(vii)编码所述小型生物群序列变体的核酸分子；
和，任选地，药学上可接受的载体和/或佐剂。
48.根据权利要求43-47中任一项所述的药物，其中所述药物是疫苗。
49.根据权利要求43-48中任一项所述的药物，其中所述药物用于预防和/或治疗癌症。
50.根据权利要求49所述的药物，其中所述药物与抗癌剂组合施用，优选与免疫检查点调节剂组合施用。
51.一种在有需要的受试者中预防和/或治疗癌症或启动、增强或延长抗肿瘤应答的方法，其包括给受试者施用根据权利要求43-48中任一项所述的药物。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述药物与抗癌剂组合施用，优选与免疫检查点调节剂组合施用。
53.用于确定根据权利要求30-35中任一项所述的肿瘤相关抗原表位序列的小型生物群序列变体是否存在于个体中的(体外)方法，其包括确定根据权利要求30-35中任一项的肿瘤相关抗原表位序列的小型生物群序列变体是否存在于个体的(分离的)样品中的步骤。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述(分离的)样品是粪便样品或血液样品。
55.根据权利要求53或权利要求54所述的方法，其中肿瘤相关抗原表位序列的所述小型生物群序列变体通过根据权利要求1-29中任一项所述的方法获得。
56.根据权利要求51或52所述的预防和/或治疗癌症或启动、增强或延长抗肿瘤应答的方法，进一步包括：
—优选地根据权利要求53-55中任一项所述的方法确定由待施用于受试者的药物组成的肿瘤相关抗原表位序列的小型生物群序列变体是否存在于所述受试者内的步骤。
57.根据权利要求51或52所述的预防和/或治疗癌症或启动、增强或延长抗肿瘤应答的方法，其中由待施用的药物组成的肿瘤相关抗原表位序列的所述小型生物群序列变体存在于所述受试者内。
58.根据权利要求51或52所述的预防和/或治疗癌症或启动、增强或延长抗肿瘤应答的方法，其中由待施用的药物组成的肿瘤相关抗原表位序列的所述小型生物群序列变体不存在于所述受试者内。
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