JP2011520436A

JP2011520436A - サービビン由来の新規で強力なｍｈｃクラスｉｉペプチド

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Publication number: JP2011520436A
Application number: JP2011508840A
Authority: JP
Inventors: ステヴァノビク，シュテファン; ゴウッテファンゲス，セシール; ランメンゼー，ハンス‐ゲオルク; ヴァインシェンク，トーニ; レワンドロウスキ，ピーター
Original assignee: イマティクスバイオテクノロジーズゲーエムベーハー
Priority date: 2008-05-14
Filing date: 2009-05-14
Publication date: 2011-07-21
Anticipated expiration: 2029-05-14
Also published as: AU2009248413B2; EP2119726A1; HK1209757A1; NZ588605A; SI2119726T1; EP2119726B2; EP2291395B1; CA2724198C; HRP20150300T1; ES2532896T3; EA019603B1; PL2119726T5; ES2549088T5; US20140086943A1; EP2291395A1; SI2291395T2; WO2009138236A1; NO2119726T3; DK2119726T5; US20140127242A1

Abstract

本発明は、免疫療法で用いられるペプチド、核酸及び細胞に関する。特に、本発明は、がんの免疫療法に関する。本発明はさらに、サービビン由来腫瘍関連障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のペプチドエピトープ単独について、あるいは抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の薬剤有効成分として働く他の腫瘍関連ペプチドとこれらエピトープとの組み合わせに関する。本発明は特に、抗腫瘍免疫応答を誘発するワクチン組成物で使用され得る、ヒト腫瘍細胞のＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ分子に由来する３個の新規ペプチド配列とその変異体に関する。

Description

本発明は、免疫療法で用いられるペプチド、核酸及び細胞に関する。特に、本発明は、癌の免疫療法に関する。本発明はさらに、サービビン由来腫瘍関連障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のペプチドエピトープ単独について、あるいは抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の薬剤有効成分として働く他の腫瘍関連ペプチドとこれらエピトープとの組み合わせに関する。本発明は特に、抗腫瘍免疫応答を誘発するワクチン組成物で使用され得る、ヒト腫瘍細胞のＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ分子に由来する３個の新規ペプチド配列とその変異体に関する。

神経膠腫は神経系の膠細胞由来の脳腫瘍である。膠細胞は、一般に神経膠細胞、または単に膠細胞と呼ばれる非神経細胞であり、神経系において、神経細胞の維持と栄養補給、ホメオスタシスの維持、髄鞘（ミエリン）の構成、神経伝達に関与している。神経膠腫の最も重要な２つのサブグループは、星状膠細胞腫と稀突起膠細胞腫であり、それらが由来する正常な膠細胞種である星状細胞、または稀突起膠細胞よりそれぞれ名前がつけられた。星状膠細胞腫のサブグループに属する多形性神経膠芽細胞腫（以下、神経膠芽細胞腫という）は、成人に最も多い悪性脳腫瘍であり、全悪性脳腫瘍の約４０％、また、神経膠腫の約５０％を占めている（CBTRUS, 2006）。神経膠芽細胞腫は中枢神経系への浸潤が非常に強く、全神経膠腫中で最も高い悪性度（grade IV）に入っている。神経膠腫の治療方法は、神経画像処理や顕微手術の改良、また、テモゾロミドや放射線など多岐にわたる治療が選択できるようになったことで着実に進歩してきているが、神経膠芽細胞腫は未だに不治の病である。この脳腫瘍の致死率は非常に高く、最初に診断されてから平均余命は９〜１２ヶ月である。１９８６年から１９９０年の観察期間中の５年生存率は８．０％であった。今日まで、腫瘍全摘出などの積極的治療法施行後の５年生存率は未だに１０％未満である (ＢｕｒｔｏｎａｎｄＰｒａｄｏｓ，２０００；Ｎｉｅｄｅｒｅｔａｌ．，２０００，Ｎａｐｏｉｔａｎｏｅｔａｌ．，１９９９；Burton and Prados, 2000; Nieder et al., 2000; Napolitano et al., 1999; Ｄａｚｚｉｅｔａｌ．，２０００)。そのため、これに代わりうる効果的な治療方法に対し医療ニーズが高まっている。

神経膠芽細胞腫の腫瘍細胞は、脳腫瘍の中で最も未分化であり、そのため遊走能及び増殖能が高く、また、浸潤性が高く、予後が極めて悪くなる。神経膠芽細胞腫は、脳内で急速に、侵攻的に、さらに浸潤的に発育するため、死につながっている。神経膠芽細胞腫は浸潤性発育型のため、本来摘出不能である。また、神経膠芽細胞腫は、比較的、放射線や化学療法に耐性を持つため術後の再発率が高い。更に、摘出し放射線照射後、全腫瘍細胞を完全に根絶できるほど、これらの腫瘍細胞に対する免疫応答性にはあまり効果がない（ Roth and Weller, 1999; Dix et al., 1999; Sablotzki et al., 2000）

神経膠芽細胞腫は、分化星状膠細胞またはグリア前駆細胞の悪性転換過程での遺伝子メカニズムの違いによって、未神経膠芽細胞腫（新生）と二次性神経膠芽細胞腫に分けられる。二次性神経膠芽細胞腫は、４５歳までの若年層に発症する。二次性神経膠芽細胞腫は、平均して４年から５年の間に軽度の星状細胞腫から未分化星状細胞腫に進展する。。神経膠芽細胞腫は老年層に圧倒的に多く発症し、平均年齢は５５歳である。一般的に、原発性神経膠芽細胞腫は劇症として発症し、臨床的、または病理的に異常のない状態から３ヶ月以内に腫瘍が進行するのが特徴である（Pathology and Genetics of the Nervous Systems. 29-39 (IARC Press, Lyon, France, 2000))。

神経膠芽細胞腫はミリエン化された神経に沿って移動し、中枢神経系内に広範囲に広がる。殆どの場合、外科的治療を行っても維持療法的な限られた効果を示すだけである(Ｎｅｕｒｏｌ．Ｍｅｄ．Ｃｈｉｒ．（Ｔｏｋｙｏ）３４，９１-９４；Ｎｅｕｒｏｌ．Ｍｅｄ．Neurol. Med. Chir. (Tokyo) ３３, ４２５-４５８，１９９３；Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ１７，１８６−１８８，１９９７)（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，２００１；ＰｒａｄｏｓａｎｄＬｅｖｉｎ，２０００）。

悪性神経膠腫細胞は、Ｔ細胞の増殖と免疫を刺激するサイトカインＩＬ−２の分泌の両方を減弱させる免疫抑制物質を生成することにより、宿主の免疫システムからの探知を逃れる (Dix et al., 1999)。

頭蓋内の腫瘍は、脳、髄膜、脳下垂体、頭蓋骨、さらに胚組織の残りなど、中枢神経系に提示されるあらゆる構造や細胞型からも発生しうる。アメリカ合衆国における年間の原発性脳腫瘍の総罹患件数は人口１０万人に対して１４人である。
最も好発する原発性脳腫瘍は髄膜腫及び神経膠芽細胞腫であり、髄膜腫は全原発性脳腫瘍の２７％、神経膠芽細胞腫は２３％を占める（ただし、成人の悪性脳腫瘍では、神経膠芽細胞腫が４０％を占める）。これらの腫瘍の多くは進行性で、Grade が高い。原発性脳腫瘍は小児に最も好発する固形腫瘍で、小児癌では白血病に次いで２番目に多い死因となっている。

神経膠芽細胞腫の患者に対する効果的な治療方法の探究は今日もなお続けられている。これらの腫瘍細胞と戦うため、免疫療法すなわち免疫系の補充による治療法が研究されてきている。最初の有望な研究成果は、ヒト神経膠芽細胞腫の治療に対する免疫学的療法の試験で「DCVax Brain」を用いたNorthwest Therapeuticsによって得られた。その研究では、抗原特異的ＣＴＬ応答を誘発することができ、毒性が最小限な標準療法を適用した場合と比べ、生存期間中央値が延長された（Heimberger et al., 2006)。

大腸癌
米国がん学会によると、大腸癌は米国で３番目に多いがんであり、毎年１７５，０００名を超える患者が罹患している。米国、日本、フランス、ドイツ、イタリア、スペイン、英国では４８０，０００名を超える患者が罹患している。先進国でのがん死亡率の最も一般的な原因の１つである。大腸癌患者の1年及び5年相対生存率はそれぞれ８４％と６４％である。生存率は診断後５年から１０年で５７％まで減少し続ける。大腸癌は早期の限局的病期で発見されれば、５年生存率は９０％であるが、この病期で診断される大腸癌はわずか３９％であり、ほとんどが低率スクリーニングのためである。癌が隣接臓器やリンパ節など局部的に広がると、５年生存率は６８％に落ちる。遠隔転移した患者の５年生存率は１０％である。

大腸癌の発症は遺伝的要因と環境的要因の相互作用の結果であるとを調査が示唆している。殆どの場合、腺腫性ポリープが大腸癌の前駆体として現れるが、癌への移行には多年を要することがある。大腸癌の主なリスク要因は年齢であり、大腸癌と診断される９０％が５０歳を超えている。米国がん学会によると大腸癌の他のリスク要因には、アルコール消費量、脂肪分及び／または赤身肉の高い食事、及び果物野菜の不十分な摂取などが含まれる。大腸癌発生の増加が続いているのは、特に、脂肪や肉の過剰摂取と、線維分摂取の低下につながる西欧諸国の食事を取り入れた日本などの地域によると思われる。しかしながら、スクリーニングの増加やポリープの除去が、ポリープの癌への進行を防いでいると考えられ、発生率の増加は以前ほど速くはない。

殆どの固形癌では、ファーストライン療法は手術であるが、その利点は早期の患者に限られ、大半の患者は進行期で診断されている。進行大腸癌には、フルオロウラシル系の化学療法レジメンが標準療法となっている。これらのレジメンの大半は、ＦＯＦＯＸ（５−ＦＵ点滴／ロイコボリン＋オギザリプラチン）とＦＯＬＦＩＲＩ（イリノテカン、ロイコボリン、５−ＦＵのボーラス投与と持続点滴）と呼ばれるプロトロールである。

イリノテカンやオギザリプラチンのような第３世代の細胞障害性抗がん剤の導入は有意に効能を改善する期待が高まっているが、その進展は比較的遅く、生存率は転移癌では約20ヶ月に留まっており、そのため大腸癌の薬剤開発のニーズはなおも高くなっている。

最近、アバスチン（ベバシズマブ）やエルビタックス（セツキシマブ）のような、分子標的薬といわれる新世代の抗がん剤が市販され、大腸癌の異なる病期に対し現在約４０種の化合物が臨床開発の最終試験に入っている。これらの化合物数種を併用すると、将来期待される治療選択肢の可能性が増える。多大な物質が第２相試験に入っており、これらの化合物が、大腸癌の治験でいずれの標的よりも頻繁に着目しているのがＥＧＦＲであり、それは、約８０％の大腸癌患者でＥＧＦＲの発現がアップレギュレートされているためである。

病期ＩＩ患者を対象とした、最近承認されたモノクロナール抗体（ｍＡｂｓ）（セツキスマブ＋イリノテカンまたはＦＯＬＦＯＸ４、ベバシズマブ単剤またはＦＯＬＦＯＸ４との併用）化学療法の臨床試験が現在実施中である。これらの臨床試験で、４年の観察期間のうち３年間で統計的に有意な結果が期待されている。

一般的に腫瘍学で現在使われているモノクロナール抗体（ｍＡｂｓ）は、有効な免疫療法を妨害しないという点で他を上回る可能性を有している。事実、ＶＥＧＦの枯渇は、ＤＣ仲介のＴ細胞活性化促進に貢献していることを示唆する前臨床結果と臨床成績がある（Osada T, Chong G, Tansik R, Hong T, Spector N, Kumar R, Hurwitz HI, Dev I, Nixon AB, Lyerly HK, Clay T, Morse MA.
The effect of anti-VEGF therapy on immature myeloid cell and dendritic cells in cancer patients. Cancer Immunol Immunother. 2008 Jan 10.)。

前立腺癌およびその他の腫瘍
前立腺癌による死亡は２００７年に２７，０５０名と推定され、男性の癌において主要な死因となっている。白人とアフリカ系米国人では１９９０年初頭より、その死亡率は減少しているが、アフリカ系米国人の死亡率はなおも白人の２倍を超えている。前立腺癌は男性で最も頻繁に診断される癌である。理由は不明であるが、アフリカ系米国男性の発症率は白人男性よりも有意に高い。前立腺癌の発症率はここ２０年でかなり変化している。つまり、１９８８-１９９２年では急増し、１９９２-１９９５年では急減し、１９９５年以降は徐々に増えている。この傾向は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）血液検査による前立腺癌のスクリーニングの増加によるところが大きい。過去１０年間で発症率が徐々に増加している大部分は、６５歳未満の男性間でＰＳＡスクリーニングが広まったことに帰すると思われる。前立腺癌の発症率は６５歳以上ではその増加は横ばいとなる。白人男性での発症率のピークは１９９２年（１０万人中２３７.６人）に、アフリカ系米国男性では１９９３年（１０万人中３４２.８人）に起きている。

前立腺癌の治療として、静観、手術、放射線療法高密度焦点式超音波療法（HIFU）、化学療法、凍結手術、内分泌療法、またはそれらの併用療法が考えられる。どの治療法がベストかは、病期、Gleasonスコア、ＰＳＡレベルによって選択される。他の重要な要因は、男性の年齢、一般的な健康状態、可能な治療法に対する患者の気持、および副作用の可能性などである。治療法はすべて、勃起機能不全や尿失禁など明らかな副作用を有する可能性があるので、治療法を検討する際は、しばしば、治療目標と生活習慣の変化によるリスクとのバランスに焦点が当てられる。

癌が前立腺以外に転移と、治療選択肢はかなり変化し、前立腺癌の殆どの治療医師は、様々なノモグラフを利用して転移の可能性を予測する。静観、HIFU，放射線療法、凍結手術、手術などによる治療法は、一般的に癌が前立腺内に留まっている男性に実施される。内分泌療法と化学療法は、たびたび前立腺以外に転移した場合のためにとっておかれる。しかし、一部の進行性腫瘍に放射線療法を、一部の早期腫瘍に内分泌療法を使用するという例外もある。初期療法が成功せず、癌が進行する場合、凍結療法、内分泌療法、および化学療法が適用されることもある。

癌が臓器内の進行に限定されることが臨床的に推定されたため、前立腺全摘術を施行する患者のかなりの人数に、手術準備用の最も確実な組織化学的な検査で、臓器の境界を越えた局部的に転移した腫瘍がみられる。これらの患者は早期局部再発のリスクが高く、通常、生化学的再発という観点からＰＳＡレベル増大と診断されうる。この状況での療法選択肢は、外部放射線療法とホルモン除去療法があるが、これらの療法の価値は、特に患者の長期生存率を延ばすという点において、実績があるとみなすわけにはいかない。さらに、尿道狭窄（放射線療法）、性欲の喪失やインポテンス、骨粗鬆症に関与する骨カルシウム塩の減少リスク、病理的骨折リスクの顕著な増加（ホルモン除去）の発生など、治療に関連する合併症の可能性を考慮しなければならない。

前立腺癌患者全員の９０％以上が局部的な局所期で発見される。この種の患者の相対５年生存率は、これらの病期では１００％と診断されている。過去２５年間で、全病期を合わせた５年生存率は６９％から９０％近くに増加した。最も最近のデータによれば、相対１０年生存率は９３％であり、１５年生存率は７７％である。生存率の劇的な改善、特に５年生存率の改善は、一部早期発見と治療法の改善に帰する。しかしながら、他の組織や臓器に転移後の生存率は有意に減少する。

肺癌
２００７年米国では、がん診断症例の約１５％にあたる、推定２１０，０００人が新たに肺癌になることが予想されている。発症率は男性では、１９８４年の１０，０００人当たり１０２例から２００３年には７８．５例に有意に減少している。女性では発症率は長期間にわたり増加が続いた後、プラトーに近づいている。肺癌は治療の目的から、臨床的に小細胞（１３％）または非小細胞（８７％）に分類される。

肺癌は男女とも癌において最も多い死因となっている。２００７年には癌の全死亡例の約２９％を占める、推定死亡１６０．３９０例となることが予想されている。１９８７年以降、毎年乳癌によるよりも肺癌により死亡する女性が多くなっている。男性の死亡率は１９９１年から２００３年の間、毎年１．９％づつ有意に減少し続けた。女性の肺癌死亡率は数十年間連続して増加した後、プラトーに近づいている。肺癌死亡率のこれらの傾向は、過去３０年間の喫煙率の低下を反映している。

治療選択肢は癌のタイプ（小細胞か非小細胞のどちらか）と病期によって決定され、手術、放射線療法、化学療法、ベバシズマブ（アバスチン）とエルロチニブ（タルセバ）などの分子標的療法がある。局所癌には通常手術が選択される。最近の試験では、早期非小細胞肺癌の生存率は術後の化学療法により改善されることが示されている。肺癌は発見時に通常転移しているので、放射線療法と化学療法が頻繁に使われ、時々手術に併用される。化学療法のみまたは放射線との併用が小細胞肺癌に選択される治療常法である。このレジメンで、高い割合の患者が、症例によっては長く続く寛解を経験している。

肺癌の相対１年生存率は、１９７５-１９７９年の３７％から２００２年には４２％に僅かながら増加したが、これは手術テクニックと併用療法の改善いよるものである。しかし、５年生存率はすべての病期を合わせてもわずか１６％である。癌が局在しているうちに発見されると生存率は４９％であるが、早期に診断される肺癌はたったの１６％である。

表１：２００７年米国で推定される性差別がん発生症例数と死亡数（米国がん学会、がんの正確な情報２００７年。アトランタ、米国がん学会、２００７年）

それ故、神経膠腫、前立腺腫瘍、乳癌、食道癌、大腸癌、腎明細胞癌、肺癌、中枢神経系癌、卵巣癌、メラノーマ（Tamm et al. 1998）、膵臓癌、扁平上皮癌、白血病、髄芽腫、およびサービビンの過剰発現を示す他の腫瘍に対し、重度な副作用に至る可能性がある化学療法剤や他の薬剤を使用せずに患者の快適な生活を促進させる、有効で安全な新規療法の選択肢の必要性がいまだにある。

その第１の態様において、本発明は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１からＳＥＱＩＤＮｏ．3までのグループか、ＳＥＱＩＤＮｏ．1からＳＥＱＩＤＮｏ．3までと少なくとも８０％相同性であるその変異体か、Ｔ細胞の前記変異体ペプチドとの交差反応を誘発するその変異体から選択された配列を含むペプチドであって、ＰＴＰＲＺ１の完全な長さのポリペプチドではない前記ペプチドに関する。好ましくは、前記ペプチドは表２に従い、HLA-A^*02 or HLA-DRのような特異的なＨＬＡサブタイプを有するペプチドから選択される。

第２の態様において、本発明は、核酸、本発明に従うペプチドのコード化、あるいは前記核酸を発現する能力のある発現ベクターに関する。

第３の態様において、本発明は、本発明に従って核酸または発現ベクターを含む宿主細胞に関連し、ここで前記宿主細胞は好ましくは抗原提示細胞であり、特に樹状細胞すなわち抗原提示細胞である。

本発明の第４の態様は、活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成するin vitro 方法であって、in vitroでＣＴＬを、適当な抗原提示細胞表面上で発現された抗原負荷ヒトクラスＩまたはＩＩＭＨＣ分子と接触させるか、または抗原特異的方法で前記ＣＴＬを活性化するのに十分な期間、抗原提示細胞を模倣する人工構築物と接触させることを含むことに関連し、ここで前記抗原は本発明に従うペプチドである。

本発明に従うペプチド、本発明に従う核酸または発現ベクター、本発明に従う細胞、あるいはがん治療または抗がん剤の製造に関する本発明に従って生成された活性化細胞傷害性Ｔリンパ球の使用において、前記抗がん剤は好ましくはワクチンである。好ましくは、前記がんは、星細胞腫、毛様細胞性星細胞腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、乏突起膠腫、上衣腫、多形神経膠芽腫、混合膠腫、神経膠腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、胚細胞種、奇形腫、神経節膠腫、神経節細胞腫、中枢神経節細胞腫、原始神経外胚葉性腫瘍（PNETすなわち、髄芽腫, 髄上皮腫, 神経芽種, 網膜芽細胞腫, 上衣芽腫など）、松果体組織にでききた腫瘍（松果体細胞腫や松果体芽腫など）、上衣細胞腫、脈絡叢腫瘍、原発不明の神経皮腫瘍（大脳神経膠腫症、星状芽細胞腫など）、神経膠芽腫、前立腺腫瘍、乳癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、腎明細胞癌、肺癌、中枢神経系腫瘍、卵巣癌、メラノーマ、膵臓癌、扁平上皮癌、白血病および髄芽腫、およびサービビンの過剰発現を示す他の腫瘍または癌から選択される。

キットの構成： (a) 本発明に従うペプチド、本発明に従う核酸または発現ベクター、本発明に従う細胞、または本発明に従う活性化細胞傷害性Ｔリンパ球を含有する薬剤成分を溶液または凍結乾燥状態で含む容器；
(b) 任意に、凍結乾燥調製物の希釈剤あるい再構成溶液を含む第２容器；
(c) 任意に、ＳＥＱＩＤＮｏ.４から２４に従うペプチドから成る官能基から選択された１つ以上のペプチド、及び
(d) 任意に、溶液の使用、及び／または凍結乾燥調製物の構成及び/または使用の説明。

ＨＬＡ-制限抗原と複合体を形成しているヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩあるいはＩＩに特異的に結合している組み換え抗体の生成方法は、ＨＬＡ-制限抗原と複合体を形成している溶液状態の前記ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩあるいはＩＩを発現する細胞を含むヒト以外の遺伝子組換えほ乳類の免疫化、
前記ヒト以外のほ乳類の細胞の生成、ｍＲＮＡ分子によりコード化されたタンパク質分子を示すファージディスプレイライブラリーを生成する抗体からｍＲＮＡ分子の単離、
及び、前記ファージディスプレイライブラリーの内の１つ以上のファージ、つまりＨＬＡ-制限抗原と複合体を形成している前記ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩあるいはＩＩに特異的に結合可能な前記抗体を示す1つ以上の前記ファージの単離、からなる方法である。

ＨＬＡ-制限抗原と複合体を形成しているヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩあるいはＩＩに特異的に結合する抗体では、その抗体は好ましくはポリクロナール抗体、モノクロナール抗体及び／またはキメラ抗体である。

「ペプチド」という用語は、本明細書では、隣接したアミノ酸のαアミノ基及びカルボニル基間のペプチド結合によって、通常お互いの間を接続する一連のアミノ酸残基を表すために使用される。ペプチドは、通常９個のアミノ酸残基であるが、最短で８個、最長で16個のアミノ酸残基である。

「オリゴペプチド」という用語は、本明細書では、隣接したアミノ酸のαアミノ基及びカルボニル基間のペプチド結合によって、通常お互いの間を接続する一連のアミノ酸残基を表すために使用される。正しいエピトープの１つあるいは複数がそこに維持される限り、オリゴペプチドの長さは本発明に決定的なものではない。オリゴペプチドの長さは通常、アミノ酸残基約３０個未満で、アミノ酸は約１４個を超える

「ポリペプチド」という用語は、隣接したアミノ酸のα位のアミノ基及びカルボニル基間のペプチド結合によって、通常お互いの間を接続する一連のアミノ酸残基を表す。正しいエピトープの１つあるいは複数がそこに維持される限り、ポリペプチドの長さは本発明に決定的なものではない。ペプチドやオリゴペプチドという用語に比べ、ポリペプチドという用語は、アミノ酸残基が約３０個を超えるタンパク質分子を示す。

そのような分子をコードするペプチド、オリゴペプチド、タンパク質は、免疫応答を誘発できる場合、「免疫原性」(したがって本発明内の「免疫原」)である。本発明の場合には、免疫原性はＴ細胞が介在する応答を誘発する能力としてより明確に定義される。したがって、「免疫原」は、免疫応答の誘発が可能な分子で、本発明の場合は、Ｔ細胞の応答を誘発できる分子と考えられる。

Ｔ細胞「エピトープ」はクラスＩあるいはＩＩＭＨＣ受容体に結合し、三元複合体（ＭＨＣクラスＩアルファ鎖、β−２−ミクログロブリン、およびペプチド）を形成する短鎖ペプチドを必要とする。この三元複合体は、適度な親和性でＭＨＣ／ペプチド複合体と結合する対応Ｔ細胞受容体を支えているＴ細胞によって認識されうる。ＭＨＣクラスＩ分子と結合するペプチドの長さは通常、8個から１４個のアミノ酸で、最も典型的な長さは９個のアミノ酸である。ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合するＴ細胞エピトープの長さは通常、１２個から３０個のアミノ酸である。ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合するエピトープの場合には、同じペプチと対応するＴ細胞エピトープが共通のコア断片を共有することがあるが、コア配列のアミノ酸末端の上流とカルボキシル末端の下流の各長さが異なる配列に隣接しているため、全体の長さが異なることがある。ＭＨＣクラスＩＩ受容体の立体構造はよりオープンとなり、ＭＨＣクラスＩＩ受容体に結合しているペプチドはしたがって、その分子の末端がＭＨＣクラスＩ分子ペプチド結合クレフトなので、ＭＨＣクラスＩＩ分子ペプチド結合クレフトの構造に完全には埋もれない驚いたことに、ペプチド長さの変化が僅かだと活性は非常に減少するので（以下参照）、これはＳＥＱＩＤ NO.1にしたがうペプチドの場合ではない。

ヒトでは、ＭＨＣクラスＩ分子をコード化する３つの異なる遺伝子座（ヒトＭＨＣ分子はまたヒト白血球抗原（ＨＬＡ）との呼ばれる）、つまりＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃがある。ＨＬＡ−Ａ＊０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２およびＨＬＡ−Ａ＊１１はこれら遺伝子から発現されうる異なるＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の例である。

表２：異なる集団で発現された対立遺伝子上位３０個

ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子に対するヒトゲノム内には、ＨＬＡ−ＤＲ，ＨＬＡ−ＤＱ，ＨＬＡ−ＤＰの３つの異なる遺伝子座がある。ＭＨＣクラスＩＩ受容体は、α鎖とβ鎖からなるヘテロダイマーであり、両鎖とも膜貫通領域を通って細胞膜内に定着する。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４とＨＬＡ−ＥＲＢ１＊０７は、これらの遺伝子座にコード化されることが既知な異なるＭＨＣクラスＩＩβ対立遺伝子の２つの例である。クラスＩＩ対立遺伝子は非常に多型であり、例えば、数百の異なるＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子がすでに説明されている。それ故、治療と診断の目的には、数個の異なるＨＬＡクラスＩＩ受容体に適度な親和性で結合するペプチドが大変望ましい。数個の異なるＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドは無差別バインダーと呼ばれている。

本発明で、ＤＮＡ配列には一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡの両方が含まれる。そのため、特に記載のない限り、特異的配列とは、かかる配列の一本鎖ＤＮＡ、かかる配列の相補鎖との二本鎖（二本鎖ＤＮＡ）、及びかかる配列の相補鎖を示す。「コード領域」という用語は、天然ゲノム環境すなわち、in vivo における遺伝子の天然発現産物のコード領域において、天然にまたは通常に該遺伝子の発現産物をコードする、遺伝子のその部分を示す。

コード領域は、正常で、変異した、または改変された遺伝子であり、また、ＤＮＡ合成の当業者に周知の方法で研究室において完全に合成されたＤＮＡ配列や遺伝子である。

「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボ核酸のヘテロ多量体を示す。

特定のペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は天然に発生することも、合成されることもある。一般的に、本発明のペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質をコード化するＤＮＡセグメントは、ｃＤＮＡフラグメント及び短いオリゴヌクレオチドリンカー、または一連のオリゴヌクレオチドから作成され、微生物またはウイルスオペロン由来の調節エレメントからなる遺伝子組換え転写単位内で発現されうる合成遺伝子を与える。

「発現産物」という用語は、遺伝子コード縮重の結果、同等物をコードし、次いで同一アミノ酸をコードする、遺伝子及びあらゆるヌクレオチド配列から天然に翻訳された産物である、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。

「フラグメント」という用語は、コード配列に関する場合は、完全なコード領域より短いＤＮＡの一部を意味し、その発現産物は、完全なコード領域の発現産物と本質的に同一の生物学的機能または活性を保持する。

「ＤＮＡセグメント」という用語は、分離フラグメントあるいはより大きいＤＮＡ構築物の一組成の形であるＤＮＡポリマーを示し、このポリマーは十分に純粋な、すなわち、内因性物質の混在がない形で、しかも、標準的な生物学的方法たとえばクローニングベクターによりセグメントやその構成ヌクレオチド配列の同定、操作、回収ができる量と濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡから誘導される。そのようなセグメントは、真核生物の遺伝子中で通常提示される内在性非翻訳配列、すなわちイントロンによって中断されないオープンリーンディングフレームの形で供給される。非翻訳ＤＮＡ配列は、オープンリーンディングフレームの下流に存在することがあるが、コード領域の調節や発現を邪魔することはない。

「プライマー」という用語は一本鎖ＤＮＡと対になることができ、ＤＮＡポリメラーゼがデオキシリボ核酸鎖の合成を開始する、遊離3'-OH末端を供給する短い核酸配列を意味する。

「プロモーター」という用語は、転写を開始するＲＮＡポリメラーゼの結合に関わるＤＮＡの一領域を意味する。

「オープンリーディングフレーム(ORF)」という用語は、終止コドンが全くない、一連のアミノ酸トリプレットコード化のことであり、タンパク質に翻訳されうる（可能性のある）配列である。

「単離される」という用語は、物質がその本来の環境（例えば、それが自然に起こるのであれば、自然環境）から取り除かれることを意味する。例えば、生存する動物のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されているとは言えないが、自然界の一部または全ての共存物質から分けられた同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていると言える。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部である可能性があり、及び／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部となる可能性があり、そのようなベクターまたは組成物がその自然環境の一部ではないため、単離されていると言える。

本発明によって開示されているポリヌクレオチド及び、遺伝子組換え体または免疫原性ポリペプチドも、「精製されている」状態である。「精製される」という用語は、完全に精製されることは必要なく、むしろ、相対的な定義を意味し、高純度に精製された調製物または、部分的にのみ精製された調製物も含むが、これらの用語は関連する当業者には理解されている。例えば、ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動的に均一になるように従来法で精製される。出発物質または天然物質の精製では、最低でも有効数字１桁、好ましくは２桁または３桁、より好ましくは４桁または５桁が明確に意図される。さらに、請求項におけるポリペプチドの精製では、重量で、好ましくは９９．９９９％、少なくとも９９．９９％または９９．９％、さらに望ましくとも９９％以上が明確に意図される。

本発明によって開示される核酸及びポリペプチド発現産物、及びそのような核酸及び／またはポリペプチドを含む発現ベクターは「濃縮型」である。本明細書で使われている「濃縮型」と言う用語は、物質の濃度が例えば、それ自身の自然に存在する濃度の少なくとも約２、５、１０、１００、または１０００倍であり、また、重量で０．０１％であれば有利であり、好ましくは少なくとも約０．１％であることを意味する。また、濃縮調製物で期待されるのは、重量で約０．５％、１％、５％、１０％、及び２０％である。本発明における配列、構造物、ベクター、クローン及び他の物質は、濃縮型または単離型であることが有利である。

「活性フラグメント」という用語は、適切なアジュバントと供に、または単独で、動物例えばウサギまたはマウス、及びヒトも含む哺乳動物に投与した際、免疫応答を起こす（すなわち免疫原性活性を有する）フラグメントを意味し、このような免疫応答は、ヒトなどの受容動物内でＣＴＬ応答を刺激する。また、この活性フラグメント灯は in vitroでＴ細胞応答の誘導に使用されることもある。

本明細書では、「一部分」、「セグメント」、「フラグメント」という用語は、ポリペプチドに関して使用される時、アミノ酸残基のような残基の連続的な配列を指し、その配列はより大きな配列のサブセットを形成する。例えば、ポリペプチドがトリプシンまたはキモトリプシンのような一般的なエンドペプチダーゼの処理を受けた場合、そのような処理により得られるオリゴペプチドは、出発ポリペプチドの一部分、セグメントあるいはフラグメントに相当すると思われる。これは、そのようなフラグメントが必然的にアミノ酸配列の一部としてセグメント、フラグメント、あるいは部分を含んでおり、それらが、SEQ ID No.1 からNo.3の配列を持つ自然発生タンパク質、あるいは「親」タンパク質、つまりサービビンに相当する、SEQ ID No.1 からNo.3の配列に、全く同一ではないにせよ実質的に同一であることを意味する。ポリヌクレオチドに関連して使用する時、そのような用語は任意の共通のエンドヌクレアーゼをもつ前記ポリヌクレオチドの処理によって生成された生成物を指す。

本発明に従って、配列に言及する場合、「同一性パーセント」または「同一パーセント」という用語は、比較する配列（「比較配列」）を記載済みまたは請求項の配列（「参照配列」）とアラインメントした後に、ある配列を、記載済みまたは請求項の配列と比較することを意味する。続いて、同一性パーセントは次式により決定される:

同一性パーセント= 100 [I -(C/R)]

Cは、参照配列と比較配列間のアラインメントの長さ上の参照配列と比較配列間とで異なる残基数を示す。ここで、
(i) 比較配列上で相当する整列した塩基やアミノ酸を持たない参照配列の各塩基またはアミノ酸、及び
(ii) 参照配列の各ギャップ、及び
(iii)比較配列の整列した塩基あるいはアミノ酸と異なる参照配列の整列した各塩基あるいはアミノ酸が差の構成要素なっている。つまり、
Rは、塩基またはアミノ酸としても数えられる参照配列で生成する任意のギャップを伴う比較配列とのアラインメントの長さ上の比較配列の塩基またはアミノ酸の数である。

もし、アラインメントが比較配列と参照配列の間に存在し、上記のように計算した同一性パーセントが、指定の最小同一性パーセント以上である場合、たとえ、本明細書で上述した計算した同一性パーセントが指定の同一パーセントより小さいアラインメントが存在する可能性があったとしても、比較配列は参照配列に対し指定の最小同一性パーセントを有する。

。そのような置換は保存的であってもよく、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸に置き換わるように、1個のアミノ酸が類似構造及び特性を持つアミノ酸に置換される。さらにもっと保存的なのは、ロイシンがイソロイシンに置換されるように、サイズ及び化学的性質が同一あるいは類似のアミノ酸の交換にであることが考えられる。自然発生的な同属タンパク質ファミリーにおける配列多様性の研究において、ある種のアミノ酸置換はより頻繁に他より認容性が高く、これらは元のアミノ酸とその置換物の間で、大きさ、電荷、極性、疎水性について頻繁に類似性の相関関係を示す。これが、「保存的置換」の定義の基礎である。

保存的置換は、本明細書では次の５つのグループのうちの１つ以内で交換されると定義される: グループ１−分子量が小さい脂肪族の、非極性またはやや極性残基（Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ）；グループ２−極性、負電荷残基及びそれらのアミド類（Ａｓｐ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ）；グループ３−極性、正電荷残基（Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ）；グループ４−分子量が大きい脂肪族の、非極性残基（Ｍｅｔ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｃｙｓ）；そしてグループ５−分子量が大きい、芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。

より保存性の少ない置換は、イソロイシン残基によるアラニンの置換のように、類似の特性を有するがサイズが多少異なる別の分子によるアミノ酸１個の置換を含む可能性も少しある。非常に非保存的な置換では、酸性アミノ酸の極性、あるいは塩基性アミノ酸との置換を含む可能性も少しある。しかしながら、化学効果が全く予測不可能で、ラジカル置換がその他単純な化学原理から予測不能な予期せぬ良い結果を生じさせるかもしれないので、そのような「ラジカルな」置換を潜在的に効果がないものとして片付けることができない。

もちろん、そのような置換は、共通のL-アミノ酸以外の構造を含むことがある。そのため、Ｄ-アミノ酸は、本発明の抗原ペプチドで一般に見つかるＬ-アミノ酸の代わりに用いられ、依然として開示により本明細書に包含されている。さらに、非標準Ｒ基(すなわち、自然タンパク質の一般的な２０個のアミノ酸以外のＲ基)を所有するアミノ酸も、本発明によって免疫原及び免疫原生ポリペプチドを生産する置換目的に使用されうる。

２つ以上の場所での置換が、以下に定義するように、実質的に同等かまたはより大きな抗原活性を有するペプチドに帰着することがわかる場合、組み合わせた置換がペプチド抗原性への相加効果あるいは相乗効果に帰着するかを判断するために、これらの置換の組み合わせが試験される。最大限でも、ペプチド内のたった４つの位置が同時に置換される。

「Ｔ細胞応答」という用語は、in vitro または in vivo において、ペプチドによって引き起こされるエフェクター機能の特異的増殖及び活性化を意味する。ＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬにおいて、エフェクター機能とはパルスペプチド、パルスペプチド前駆体、または生体内の標的細胞を提示するペプチドの溶解、サイトカイン、好ましくはインターフェロンγ、ＴＮＦα、またはペプチドによって誘発されるＩＬ−２の分泌、エフェクター分子、好ましくはグランザイム、またはペプチドによって誘発されるパーフォリンの分泌、または脱顆粒のこともある。Ｔヘルパー細胞を制御するＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔヘルパー細胞において、エフェクター機能とはサイトカイン、好ましくはインターフェロンガンマ、ＴＮＦα、ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−１０またはＩＬ−２分泌誘発ペプチド、またはペプチド誘発脱顆粒のこともある。ＣＴＬとＴヘルパー細胞に対するエフェクター機能の可能性はこのリストだけに限定されない。

好ましくは、ＳＥＱＩＤ No.1 からNo.3に由来するペプチドに固有のＣＴＬが置換されたペプチドに対して試験される場合、バックグラウンドに関する溶解が最大増加の半分に達する置換ペプチドのペプチド濃度が、わずか約１ｍＭで、好ましくは約１μＭ、さらに好ましくは、約１ｎＭで、それでもさらに好ましくは約１００ｐＭで、約１０ｐＭが最も好ましい。また、置換ペプチドが1つを超えた、少なくとも２つの個体からＣＴＬによって認識されることは好ましく、３つの個体ならさらに好ましい。

よって本発明におけるエピトープは、実質的に同一抗原活性を持つ限り、自然発生の腫瘍関連エピトープまたは腫瘍特異的エピトープと同一であってもよく、または、参照ペプチドと異なる残基が多くとも４個に留まるエピトープを含んでいてもよい。

免疫応答の刺激は、ホストの免疫システムにより異物であると認識された抗原が存在するかに依存する。腫瘍に関係した抗原の存在が発見されたことにより、ホストの免疫システムを利用して、腫瘍細胞表面に発現した標的抗原に特異的な免疫応答で、それにより作用メカニズムが、腫瘍の退化、静止、増殖速度の低下を引き起こすことが出来る、免疫応答を促進できる可能性が，現在でてきた。体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を結びつける様々なメカニズムが、現在、がんの免疫療法において研究されつつある。

細胞性免疫応答の特定の要素は腫瘍細胞を特異的に認識し破壊することができる。細胞傷害性Ｔ細胞(ＣＴＬ)が腫瘍浸潤組織群や抹消血から単離されることから、このような細胞ががんに対する自然免疫反応において重要な働きをしていることが示唆されている(Cheever et al., 1993; Zeh, III et al., 1999)。Galonらは、４１５人名の大腸癌患者の標本を用いた解析の結果、腫瘍組織内の免疫細胞の種類、密度及び位置が、広く使用されている腫瘍のＴＮＭ分類よりも患者の生存率を推定するのに実際に良い指標であることを示した (Galon et al., 2006)。

ＭＨＣクラスＩは、主に内在性のタンパク質の分解により生成するペプチドである、ＤＲＰＩ及びより大きなペプチドを示す。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、主にプロフェッショナル抗原提示細胞(ＡＰＣ)に認められ、エンドサイトーシスの過程でAPCにより取り込まれた後処理される、外因性タンパクまたは膜貫通型タンパクのペプチドを主に与える(Cresswell, 1994)。ペプチドとＭＨＣクラスＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲ（Ｔ細胞レセプター）を持つＣＤ８陽性細胞傷害性T細胞により認識され、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを持つＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞により認識される。ＴＣＲとペプチドとＭＨＣ分子は１:１:１の量比で与えられることが良く知られている。

ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞はＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞による有効な応答を誘導し維持するのに重要な働きをしている (Wang and Livingstone, 2003; Sun and Bevan, 2003; Shedlock and Shen, 2003)。最初に、リンパ節内のＣＴＬのプライミングと拡大は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって支持される（Schoenberger et al., 1998）。その故、単一のメカニズムにより、未処理ＣＤ８＋細胞が機能的ＣＤ４＋Ｔ細胞−ＡＰＣ相互作用の場所に導びかれる可能性も少しはある（Castellino et al., 2006）。最後に、機能的ＣＤ８＋記憶細胞の世代は多くの場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞の支援に依存している（Sun and Bevan, 2003; Janssen et al., 2003）。このことから、腫瘍関連抗原(ＴＡＡ)由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープを同定することは、抗腫瘍性の免疫応答を始動させる薬剤を開発するのに大変重要である( (Kobayashi et al., 2002; Qin et al., 2003; Gnjatic et al., 2003)。腫瘍部位で、Ｔヘルパー細胞はＣＴＬに調和するサイトカイン環境（Qin and Blankenstein, 2000; Mortara et al., 2006）を支持し、ＣＴＬＳ、ＮＫ細胞、マクロファージ、顆粒球などのエフェクター細胞を引き付ける（Marzo et al., 2000; Hwang et al., 2007）

ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は炎症がない場合、主に免疫応答の細胞、特にプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、単核球、単核球由来細胞、マクロファージ、樹状細胞に限られる。がん患者では、腫瘍細胞が驚くほど認められ、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現している (Dengjel et al., 2006)。

マウスなどのモデル哺乳動物において、ＣＴＬエフェクター細胞（すなわちＣＤ８陽性Ｔリンパ球）がなくとも、ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の分泌による血管新生阻害を通じて、腫瘍の発現を阻害するのに十分であることが確認された (Qin and Blankenstein, 2000)。細胞障害性ＣＤ４＋Ｔ細胞がリンホトキシンとグランザイムを通じて腫瘍細胞を直接殺すことも提言されている（Penna et al., 1992; Littaua et al., 1992）。

更に、ＨＬＡクラスＩＩ分子が与える腫瘍関連抗原とペプチドとを認識するＣＤ４陽性Ｔ細胞は、抗体（Ａｂ）応答の誘導を通じて腫瘍の進行に対抗することが確認された(Kennedy et al., 2003)。

ＨＬＡクラスＩ分子に結合する腫瘍関連ペプチドと比較して、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）クラスＩＩリガンドについてはこれまで少数しか説明されていない。

ＨＬＡクラスＩＩ分子の構成的発現は、通常免疫系の細胞に限られているため (Mach et al., 1996)、原発性腫瘍から直接クラスＩＩペプチドを単離することはできないと考えられていた。しかしながらDengjelらは最近、腫瘍から多数のＭＨＣクラスＩＩエピトープを直接単離することに成功した(WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1; (Dengjel et al., 2006)。

腫瘍に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞に認識される抗原、つまり細胞傷害性Ｔ細胞のエピトープは、酵素、レセプター、転写因子などすべての種類のタンパク質から由来した分子であり、それらの分子は発現され、さらに起源が同一で変化していない細胞と比較して、各々の腫瘍細胞内でアップレギュレートされている。

腫瘍に関連する抗原についての分類は、現時点では以下にあげる主要グループからなる (Novellino et al., 2005)。
1. がん-精巣抗原: 最初に同定された、Ｔ細胞が認識できるＴＡＡ (van der Bruggen et al., 1991)は、このクラスに属し、このクラスは、メンバーの発現が、組織学的に異なるヒト腫瘍及び正常組織では、精巣の精母細胞／精原細胞及び時折胎盤でのみ起きていることから、初めはがん-精巣(ＣＴ)抗原と呼ばれていた。精巣の細胞はＣｌａｓｓＩ及びＣｌａｓｓＩＩのＨＬＡ分子を発現しないため、これらの抗原は通常の組織ではＴ細胞によって認識されず、よって免疫学的には腫瘍特異的であると考えられる。ＣＴ抗原として良く知られている例は、ＭＡＧＥファミリーのメンバーまたはＮＹ−ＥＳＯ-1である。
2. 分化抗原：これらのＴＡＡは腫瘍及び腫瘍の発生源となった正常組織間で共有され、多くがメラノーマまたは正常のメラニン細胞内で見出されている。これらのメラニン細胞系列関連のタンパク質の多くはメラニンの生合成に関与しており、それゆえに腫瘍特異的でないにもかかわらずがんの免疫療法に広く使用されている。例として、チロシナーゼやMelan-A/MART-1がメラノーマに、ＰＳＡが前立腺がんに使用されているが、これだけには限定されない。
3. 過剰発現ＴＡＡ: 広く発現しているＴＡＡをコード化している遺伝子は組織学的に異なる型の腫瘍で検出され、また正常組織でも低い発現レベルで検出される。正常細胞により処理され潜在的に提示されるエピトープの多くがＴ細胞に認識される閾値を下回っているが、一方、これらの腫瘍細胞の過剰発現が以前に獲得された耐性を破って抗がん作用を始動させる可能性はありうる。このクラスのＴＡＡの代表例は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，サバイビン、テロメラーゼ及びＷＴ１である。
4. 腫瘍特異的抗原: これらの特有のＴＡＡは正常の遺伝子（例えばβカテニン, ＣＤＫ４など）の突然変異により生じる。これらの分子変化の一部は腫瘍性形質転換と進行の両方又は一方に関与している。腫瘍特異抗原は正常組織に対する自己免疫反応のリスクを持たずに、通常強い免疫応答を始動させることができる。一方、これらのＴＡＡは多くの場合、これらが同定されたまさにその腫瘍のみに関連しており、通常、個々の多数の腫瘍間では共有されない。
5. 異常な翻訳後改変により生ずるＴＡＡ：このようなＴＡＡは、腫瘍内で特異的でもなく過剰発現もされないタンパク質から生ずるにもかかわらず、腫瘍内で主に活性な翻訳後工程に関連する腫瘍となる。このクラスの例として、ＭＵＣ１に関しては腫瘍細胞で新規エピトープに導く、変化したグリコシル化パターンや、腫瘍細胞に特異的または非特異的な、分解過程中のタンパク質スプライシングが挙げられる (Hanada et al., 2004; Vigneron et al., 2004) 。
6. がんウイルスタンパク質：これらのＴＡＡはがん化の過程に重要な働きする可能性のあるウイルスタンパク質で、外来性（ヒト由来ではない）であるため、Ｔ細胞応答を喚起することができる。このようなタンパク質の例として、子宮頸癌で発現されるヒトのパピローマタイプ16ウイルスタンパク質，Ｅ６とＥ７がある。

タンパク質が腫瘍特異抗原または腫瘍関連抗原として細胞傷害性Ｔリンパ球に認識され、さらに、治療に使用されるには、特定の条件を満たしていなければならない。この抗原は主に腫瘍細胞から発現されるものであり、正常で健康な組織において比較的少量で発現されるものではない。個々の抗原はあるタイプの腫瘍細胞に存在するだけでなく、濃度（１細胞につき各々のペプチドのコピー数）が高いことがさらに好ましい。腫瘍特異抗原及び腫瘍関連抗原は、例えば細胞周期調節やアポトーシス抑制のような機能を原因とする、正常細胞から腫瘍細胞への転換に直接関わるタンパク質から生ずる。更に、転換の直接原因となるタンパク質の下流ターゲットはアップレギュレートされるため、腫瘍には間接的に関連している可能性がある。このような間接的腫瘍関連抗原は、ワクチン療法のターゲットにもなることがある (Singh-Jasuja et al., 2004)。両方の場合とも、エピトープが抗原のアミノ酸配列に存在することが不可欠である。というのは、このような腫瘍関連抗原由来のペプチド（"免疫学的ペプチド"）が、in vitroまたは in vivo でＴ細胞応答を引き起こすはずだからである。

基本的に、ＭＨＣ分子に結合できるいずれのペプチドも、Ｔ細胞エピトープとして機能しうる。in viro またはin vivo においてＴ細胞応答を誘発するには、対応するＴＣＲを有するＴ細胞の存在と、さらにこの固有エピトープに対する免疫学的耐性の欠損が必須条件である。

そのため、ＴＡＡは腫瘍ワクチンの開発における出発点である。ＴＡＡを同定、及び特性を示す方法は、患者または健康な被験者から単離できるＣＴＬを使用することに基づくか、または腫瘍と正常組織の間の異なる転写プロファイルまたは異なるペプチド発現パターンの生成に基づいている (Lemmel et al., 2004; Weinschenk et al., 2002)。

しかしながら、腫瘍組織またはヒト腫瘍細胞株に過剰発現しているか、選択的にそのような組織や細胞株に発現している遺伝子の同定では、免疫療法でこれらの遺伝子から転写中の抗原を利用することに関して正確な情報は得られない。これは、対応するＴＣＲを持つＴ細胞の存在が必要であり、また、この特定エピトープに対する免疫耐性の欠損、または最小化が必要であることから、これらの抗原エピトープの個々の亜集団のみがそのような用途に適しているからである。それゆえ、機能的Ｔ細胞が認められるＭＨＣ分子と結合した状態で存在する、過剰発現または選択的に発現しているタンパクから生ペプチドのみを選択することが重要となる。そのような機能的Ｔ細胞は、特異抗原の刺激によって、クローンを増やし、エフェクター機能を行使できるＴ細胞として定義される（「エフェクターＴ細胞」）。

ヘルパーＴ細胞は、抗腫瘍免疫性において、ＣＴＬのエフェクター機能を統合する際に重要な役割を果たす。ＴＨ１タイプのヘルパーＴ細胞応答を始動させるヘルパーＴ細胞エピトープは、腫瘍関連ペプチド／ＭＨＣ複合体を細胞表面に有している腫瘍細胞に対する傷害機能など、ＣＤ８陽性キラーＴ細胞のエフェクター機能をサポートしている。このようにして、腫瘍関連ヘルパーＴ細胞ペプチドのエピトープは、単独または他の主要関連ペプチドと共に、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の薬剤有効成分として働く。

ＣＤ８及びＣＤ４依存型の2つの免疫応答タイプは共に、連携し相乗して抗腫瘍効果に寄与しているため、ＣＤ８陽性ＣＴＬ（リガンド：ＭＨＣクラスＩ分子＋ペプチドエピトープ）またはＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩＩ分子＋ペプチドエピトープ）のいずれかを利用した腫瘍関連抗原の同定、及び特徴づけは腫瘍ワクチンの開発に重要である。

重度な副作用とがん治療における予後と診断に関連する費用を考慮することは必要不可欠である。それ故、がん、特に神経膠芽細胞腫に対するバイオマーカーを代表する他の要因を同定する必要がある。さらに、がん特に神経膠芽細胞腫で使用されうる要因を同定することも必要である。

さらに、前立腺全摘術後、局所進行性がんの増殖があり、腫瘍の原発部位での残存が通常原因である生化学的な再発を伴う、前立腺がん患者に対する治療デザインは確立されていない。現在使用で治療方法に比べ、治療の有効性は匹敵しているが死亡率が低い新たな治療方法が望ましいのである。

本発明は神経膠芽細胞腫、前立腺癌、サービビンを過剰発現させる他の腫瘍の治療に結うようであるペプチドを提供する。これらのペプチドは、ヒト初代神経膠芽細胞腫サンプル上でＨＬＡ分子によって（例１及び図１）、あるいはＳＹＦＰＥＩＴＨＩ予想アルゴリズム（ Rammensee et al., 1995）に従うと、ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子であるＤＬＡ−ＤＲＢ^＊０１、ＤＲＢ１^＊０３，ＤＲＢ１^＊０４、ＤＲＢ１^＊１１、ＤＲＢ１^＊１５への無差別バイダーであることが予測される（添付文書を参照）、ＳＥＱＩＤ No.1 と No.2 の場合に、天然に提示されることが質量分析法により直接示されたこのデータとこれらの頻繁に発生するＤＲＢ１対立遺伝子の頻度に基づき（ Mori et al., 1995; Chanock et al., 2004）、Ａ^＊０２陽性白人の９２％は、これらのペチド（SEQ ID NO:1 から SEQ ID NO:3）に結合するＤＲＢ１の少なくとも１つを発現することが推定できる。ＳＥＱＩＤ No.2はＳＥＱＩＤ NO.1と同一のコア配列を含み、天然サービビン配列の２つの末端アミノ酸により伸長されており、その結果サービビンから既述のクラスＩＴ細胞エピトープを含むことになる（Schmitz et al., 2000）。ＳＥＱＩＤ No.3はＳＥＱＩＤ No.1と同一配列を含み、そこで最後のＣ−末端アミノ酸はアスパラギン（Ｎ）からアスパラギン酸（Ｄ）まで改変される。

ＳＥＱＩＤ No.1からNo.3が誘導されるソース遺伝子は、正常組織に比べて、神経膠芽細胞腫、前立腺腫瘍、乳癌、食道癌、大腸癌、腎明細胞癌、肺癌、中枢神経系癌、卵巣癌、メラノーマ（Tamm et al.1998）、膵臓癌、扁平上皮細胞癌、白血球および髄芽腫で高く過剰発現されることが示され（実施例２と図２参照）、そのペプチドの腫瘍への関与が高いことを明示しており、例としてこれらのペプチドは腫瘍組織で多いに認められるが正常組織では見られないことが挙げれる。

免疫系、とくにＴリンパ球／Ｔ細胞は、ＨＬＡと結合したペプチドを認識できる。Ｔ細胞は、例えばサービビンの由来のＳＥＱＩＤ NO.1 から No.3 を提示している神経膠芽細胞腫の腫瘍細胞など、認識されうるＨＬＡ/ペプチド複合体を提示する細胞を破壊できる。サービビン由来ペプチドにより活性化されたＴヘルパー細胞は、腫瘍の脈管化を阻害でき、免疫系のエフェクター細胞を引きつけることができ、ＣＴＬプライミング、増殖、ＣＤ＋８Ｔ細胞応答の維持を容易にさせる。

本発明のうち、すべてのペプチドについてＴ細胞応答の促進能力が示されている（例３及び図３を参照）。したがってこれらのペプチドは、患者の腫瘍細胞を破壊できる免疫応答を起こすことができるため有用である。上記のペプチド、または適当な前駆体（例えば伸張ペプチド、タンパク質またはこれらのペプチドをコード化する核酸）を、理想的には免疫原性を促進する薬剤（例えばアジュバントなど）とともに直接患者に投与して、患者の免疫応答は誘発できる。本発明の標的ペプチドは、正常組織では同程度のコピー数で提示されず、患者の正常細胞に対する不要な自己免疫反応を抑制できるため、このような治療的ワクチンの接種で誘導された免疫反応は、腫瘍細胞に極めて特異的であることが期待できる。

製薬組成物は、遊離型のペプチドあるいは薬剤的に認容可能な塩型のペプチドのいずれかを含む。

ここに使用されるような「薬剤的に認容可能な塩」は、開示されたペプチドの派生物を言い、作用薬の酸または塩基の塩類を調製することにより、ペプチドが改質される。例えば、酸性塩は、適切な酸との反応に関与する遊離塩基(通常、中性型の薬剤は中性 NH2グループを持つ)から調製される。酸性塩の調製に適当な酸は、無機酸(例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸リン酸、同様なもの)と同様に、有機酸(例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、pトルエンスルホン酸、サリチル酸など)の両方を含む。反対に、ペプチドに存在する酸部分の塩基性塩の調製は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミンのような薬剤的に認容可能な塩基を使用して調製される。

特に好ましい実施態様では、製薬組成物は酢酸(酢酸塩)あるいは塩酸(塩化物)の塩類としてペプチドを含む。

本発明のペプチドはがんの治療に有効であるのに加えて、診断にも有効である。本発明のペプチドは神経膠芽細胞腫から発生し、しかも正常組織には提示されないことから、腫瘍の有無を診断するのに使用できる。

請求項のペプチドが組織生検に存在することを、病理学者の腫瘍診断に役立てることができる。病理学者は、抗体、マススペクトロメトリー、または当該分野で既知の他の方法を用いてペプチドを検出し、その組織が悪性または炎症性、あるいは病変組織であるかを判断できる。ペプチドのグループが存在すれば、病変組織の分類または下位分類ができる。

特に、Ｔリンパ球が既知で、またはＴリンパ球が作用機序に関わっていると予想される場合は、病変組織標本でペプチドを検出することにより、免疫学的療法の有効性を決定できる。ＭＨＣの発現欠失が、感染した悪性腫瘍細胞が免疫学的監視から逃れる機序を良く示している。したがって、ペプチドの存在は、この機序が分析した細胞により使用されていないことを示している。

ペプチドを使用して、ペプチドまたはＭＨＣ分子に結合したペプチドに対するＴ細胞応答や抗体応答のような、リンパ球応答を分析することもたまにある。これらのリンパ球応答は、それ以上の治療段階を決定する際、予後マーカーとして使用できる。これらの応答は、タンパク質ワクチン、核酸、自己物質、リンパ球養子免疫療法など異なる方法を使った、リンパ球応答の誘発を目的とした免疫療法的アプローチにおいて、代理マーカーとしても使用できる。遺伝療法において、副作用を評価する際、ペプチドに対するリンパ球応答を考慮できる。また、リンパ球応答を監視することで、移植片対宿主病を検出するなど、移植治療のフォローアップに有効なこともたまにある。

ペプチドは、ＭＨＣ／ペプチド複合体の特異的抗体を生成/開発するのに利用できる。これらは毒物や放射性物質を、病変組織に対する標的として治療に利用できる。これらの抗体の別な用途として、ＰＥＴなどの画像を得るために、放射線核種を病変組織対して標的とすることができる。これによって、小さな転移の検出、サイズの測定、病変組織の正確な場所の決定などができる。

更に、生検サンプルに基に病理学者が腫瘍診断を検証するのにこれらを利用できる。

表３は、本発明に従うペプチド、各々のＳＥＱ識別番号、ペプチド結合に対するＨＬＡ対立遺伝子、ペプチド由来タンパク質を示すものである。特に関心があるのは、ＳＥＱＩＤ NO.2に従うペプチドがＨＬＡ−Ａ^＊０２と同様にＨＬＡ−ＤＲに結合し、２つの異なる応答を引き出すという事実である。

表３：本発明のペプチド

アポトーシスタンパク質阻害剤（ＩＡＰ）メンバーである、ＢＩＲＣ５（サービビン）の発現は、成人の正常分化組織で、特に増殖指数が低い場合は非常に低下すると共に、致死的組織と様々なヒトの癌組織内では上昇する。サービビンは、細胞増殖とアポトーシス細胞死の両方の調節が可能に思われる。

サービビンは通常細胞質領域に存在し、癌の予後の悪化に関与しているが、核転座つまり良好な予後の指標であるとも報告されている（O'Driscoll et al., 2003）。サービビン自身とそれを介する調節はいくつかのメカニズムによって説明されている。サービビンは分子シャペロンＨｓｐ６０に関与しているようにみえる。 In vivoで、Ｈｓｐ６０は、対応する正常組織に比べと、ヒト原発性腫瘍内に多量に発現される。小さい妨害ＲＮＡによるＨｓｐ６０の急性除去は、サービビンのミトコンドリアプールを不安定化させ、ミトコンゴリアの機能障害を誘発させ、カスパーゼ依存アポトーシスを活性化させる（Ghosh et al., 2008）。さらに、Ｒａｓの阻害によって、アポトーシス上でのサービビンの「ブレーキ」は放され、ミトコンドリアアポトーシス経路が活性化される。特に、神経膠芽細胞腫では、アポトーシスへの抵抗はサービビンを標的とするＲａｓ阻害剤によって無効となる（Blum et al., 2006）。神経膠腫内のＮＦ−ｋａｐｐａＢ過剰活性とＮＦ−ｋａｐｐａＢ標的遺伝子の1つであるサービビンの過剰発現との間に相関があるようにもみえる。そのため、ＮＦ−ｋａｐｐａＢ活性抗アポトーシス遺伝子は腫瘍サンプル中で過剰発現される。特に神経膠芽腫では、非常に高レベルのサービビンの発現が検知できる (Angileri et al., 2008)。脳神経膠腫中のサービビン過剰発現が悪性増殖、抗アポプトーシス及び血管形成に重要な役割を果たす可能性があることが示唆される (Zhen et al., 2005; Liu et al., 2006)。サービビン発現と神経膠芽腫内での生存への影響を試験するために、いくつかの分析が実施された。要するに、サービビン発現、特に星状細胞腫瘍内の核と細胞質での同時発現は、サービビン陰性腫瘍患者に比べて、悪性グレード（神経膠芽腫でのサービビン発現が最も高い）および生存期間の短縮に有意に関与していた（Kajiwara et al., 2003; Saito et al., 2007; Uematsu et al., 2005; Mellai et al., 2008; Grunda et al., 2006; Xie et al., 2006; Sasaki et al., 2002; Chakravarti et al., 2002）。

サービビン過剰発現は他の腫瘍の存在に対しても説明されている。乳癌ではサービビン発現は高いグレードと無病生存期間の短縮に関与している（Yamashita et al., 2007; Al-Joudi et al., 2007; Span et al., 2004）。食道癌の細胞株でサービビンのプロモーター活性は正常組織の２８．５倍高いことが示されている（Sato et al., 2006）。大腸癌では、サービビン発現は病理学的グレードとリンパ節転移にも関与している（Tan et al., 2005）腎明細胞癌の進行度はサービビン発現が関与していることが示されている。さらに、サービビン発現はがんに限った生存率と逆相関している（Kosari et al., 2005）サービビン発現はケラチノサイト腫瘍と過剰増殖皮膚病変のパネルで検出できるが、正常の皮膚では検出されない（Bowen et al., 2004）。膵臓癌の細胞株では、サービビンは試験した細胞株の５８％で増幅された（Mahlamaki et al., 2002）。扁平上皮細胞癌では、サービビン発現はより高悪性で浸潤性の高い臨床表現型を伴う症例を同定するのに役立てることができる（Lo et al., 2001）。

サービビンはがん療法で期待できる標的であり、サービビン由来ペプチドを用いた研究では、サービビンはＣＤ８＋Ｔ細胞介在応答を引き出すことによりがん患者で免疫原性であることを示している。さらに、サービビンは同一患者の末梢血リンパ球でＣＤ４＋Ｔ細胞の反応性を特異的に刺激した（ Casati et al., 2003; Piesche et al., 2007）。

サービビン（ＳＶＮ，ＢＩＲＣ）はがんが多数存在しても過剰発現される。そのため、サービビンの過剰発現は全生存率が短く悪性グレードが高いことに、関与していると考えられている。

Piesche (2006) は、自身の研究の一部（Piesche et al., 2007も参照）で、コンピュータプログラムＴＥＰＩＴＯＰＥ（Bian and Hammer, 2004）を用いて決定されたサービビン（ＳＶＮ）とプロテイナーゼ−３（ＰＲ３）内にＭＨＣクラスＩＩとＨＬＡクラスＩＩ限定エピトープ候補を発見した。ＴＥＰＩＴＯＰＥ解析により、ＳＶＮに対し6つのエピトープ候補が、様々なＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子との結合確率が高いＰＲ３に対して１１個のピトープ候補が得られた。これらの１７個のペプチドは合成しクラマトグラフによる生成後のＴ細胞免疫学的実験で使用された。ペプチドの様々な長さは、１つのペプチド内に集まっていると見なされた、エピトープの重複の結果である（表４）

表４：２００６年Ｐｉｅｓｃｈｅにより発見された合成ＳＶＮペプチドの名前、ＡＡ位置、およびＡＡ配列

（注： S₈₈ は実際はS₉₈, であるので、Ｐｉｅｓｃｈｅらは、このエピトープの位置決定を誤った可能性がある。

対応ペプチドの滴定実験がＰｉｅｓｃｈｅによって実施され、ペプチドＨＬＡの親和性またはペプチドＨＬＡ／ＴＣＲ結合活性が評価された。ペプチド濃度が低ければ低いほど、ペプチドエピドープのＭＨＣ分子への結合親和性はより高くなる。これはタンパク質抗原の細胞内工程での「本物」Ｔ細胞エピトープの自然の提示には重要な前提条件である。ペプチド特異的Ｔ細胞クローンの測定された増殖活性の最大半量値は、 S₁₀は＜５０ｎＭ、 S₄₀ は４００−７００ｎＭ、 S₈₈ は２０００ - ３０００ｎＭ、 P₅₈ は１００ - ３００ｎＭであった。Ｐｉｅｓｈｃｅはさらに、組み換えＳＶＮタンパク質による曝露中にＳＶＮペプチド S₁₀は特異的なＴ細胞増殖を誘発することを発見した。このことは異なるドナーからの３つの S₁₀特異Ｔ細胞クローン中で示された。Ｐｉｅｓｃｈｅらは、ペプチド特異的Ｔ細胞クローンをＳＶＮタンパク質パルスＤＣで共培養することにより、天然抗原からＳＶＮペプチドエピトープの工程と提示を検討した。ＳＶＮペプチド S₁₀ のみが、組み換えＳＶＮタンパク質による曝露中に特異的Ｔ細胞増殖を起こすことが可能であった。このことは異なるドナーからの３つの S₁₀特異的Ｔ細胞クローン中で示された。天然抗原に応答する特異的増殖は、 PR₃特異的Ｔ細胞クローンには検出されなかった。

さらに、アポトーシス細胞または壊死腫瘍細胞の腫瘍抗原は、in vivoでＡＰＣにより内部移行され、ＭＨＣＩＩと独立処理され、ＣＤ４＋Ｔ細胞に提示された。本物 S10 Ｔ細胞エピトープに対して、様々なＳＶＮ陽性腫瘍細胞株から得た腫瘍細胞溶解物を伴うＤＣがパルスされた。 S₁₀ エピトープに対して、腫瘍細胞株Ｋａｒｐａｓ−４２２，Ｊｕｒｋａｔ，ＨＬ−６０から得た溶解物パルスＤＣのin vitro での直接認識が検出された。これは異なるドナーから得た少なくとも３つの S₁₀特異Ｔ細胞クローン中で示された。

エピトープ S₁₀ ががん患者の免疫応答を誘発できることを示すには、がん患者の血中に対応するＣＤ４＋Ｔリンパ球が存在することを確認しなければならなかった。様々な患者のＰＢＭＣは単離され S₁₀ ペプチドにより刺激された。この目的のためにＰＢＭＣサンプルが、治療開始前と細胞障害性静電療法の開始後に患者から採取され、ＰＢＭＣ分画に含まれる単球とＢ細胞が抗原−ペプチド提示細胞として使用された。１週間培養後、細胞は[³H]-チミジン取り込み法によってその細胞のペプチド特異的増殖について分析された。試験した１３名の患者のうち、３名はin vitroで検出可能な増殖応答を持っていた。

免疫療法でのペプチドエピトープ使用の可能性は基本的には、ペプチド特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球が対応抗原に応答するかに依存する。「本物」または「真の」エピトープの型で天然に処理されたタンパク質抗原の認識は、原則的に様々な要因に影響される。

Piescheはタンパク質の認識はＳＶＮエピトープＳ１０についてのみ検出可能であることを示した。他の同定されたペプチド（ＳＶＮ：S₄₀、S₈₈、PR₃、P₅₈、P₂₁₆、P₂₃₅、 P₂₃₉）について、タンパク質認識は検出されなかった。 Piescheらは、エンドゾームのタンパク質分解中に提示配列モチーフが、「隠れた」エピトープの場合のように、分解されないことが重要であることを述べている。ＭＨＣクラスＩ制限エピトープと比較して、ＭＨＣＩＩ分子は色々な長さ（１２−２８）のペプチドを取り上げることができるので、ペプチドエピトープを設定長さに分解開裂する必要はない。

驚いたことに、 S88より短いが重複しているサービビン由来の別のエピトープ、ＳＥＱＩＤ No.1が、in vivoで１９名の患者のうち１６名が強い免疫応答を誘発したことを、本発明者らは示した。ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子座の多型性が高いことから、免疫応答がＨＬＡ分子に結合したペプチドによって喚起のみされうるとき、この現象は予測通りペプチドＳＥＱＩＤ No.1の無差別性が高い結合の証拠にもなる。

文献に説明された、癌の存在の重要性に対するサービビンの過剰発現は表２に記載されている。サービビンの過剰発現を共通に特徴とするがんの兆候により、２００７年に４１５，０００人が死亡に至っている（表１）。

Piesche et al.(2006) は、重複するＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を伴う４つのドナーのうち３つにペプチドＳ８８に適切な前駆体が存在することをin vitroで示した。得られた結果は２つの異なるＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子（例、ＤＲ３とＤＲ１１、ＤＲ１とＤＲ３，またはＤＲ１とＤＲ４）への結合によって説明される可能性もあるので、ここで示した主な証拠は、S₈₈ のHU値への無差別結合を推定するには不十分である。さらに、ＰＢＭＣの全培養物から全く特異的でない増殖分析（[³H]-チミジン取り込み）によって得た刺激指数は、かなり低く、陽性コントロール（例、よくキャクタリゼーションされており、免疫原性が強いウイルスペプチド）が欠けており、適切な陰性コントロール（関連のないコントロールペプチドによる増殖分析中の刺激）も欠けている。前駆体頻度のデータは２番目のタイプの分析では確認されなかった。

他の文献の中で、ＷＯ２００７／０３６６３８（Wang et al）では、以下のアミノ酸配列のサービビンペプチドを開示している。
96-110 (LTLGEFLKLDRERAK; SEQ ID No 25);
99-113 (LTLGEFLKLDRERAK; SEQ ID No 26);
102-116 (LTLGEFLKLDRERAK; SEQ ID No 27);
領域８４から１１３は、「十分な」親和性(IC₅₀＜1000nM)でＭＨＣクラスＩＩのＨＬＡ分子と結合している領域であると説明されている。それにもかかわらず、Wang et al.が実験したペプチドは、異なるＨＬＡ−ＤＲ分子に向かう結合により非常に広いスペクトルを示しており、これらのペプチドが１つまたは２つのアミノ酸ごとにその配列がシフトしている場合、前記結合は説明したように前記領域内では全く異なってさえいる。

ＳＥＱＩＤ No.3（TLGEFLKLDRERAKD；"ＢＩＲ−００２ａ"ペプチド）に関する本発明のペプチドは、前記ペプチドのＣ−末端がアスパラギン（Ｎ）に代わってアスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸で終了していること以外は、ＳＥＱＩＤ No.1に関する本発明のＢＩＲ−００２ペプチドの配列を含む。このペプチドは、最後の３つのアミノ酸ＮＫＩを含む、Piescheによるペプチド S₈₈ と重複する。上述したように、 S₈₈ ペプチドは特異的Ｔ細胞の増殖分析で、組み換えＳＶＮタンパク質の曝露中は不活性であった。これに比べ、ＢＩＲ−００２ペプチドは強いＭＨＣＩＩ関連免疫応答を示した。理論通りの結合が欠けていなければ、アスパラギンからアスパラギン酸への酵素的変換がin vivoで起こり、そのためＣ末端アミノ酸が改変される（そしてペプチドが活性化および／またはさらに活性化される）と推定される。Ｐｉｅｓｃｈｅによるペプチド S₈₈ のＣ末端であるアスパラギンは２つのアミノ酸によってブロックされているので、前記ペプチドは不活性である（さらにこのペプチドの活性には単一アミノ酸の変化が重要であることを示している）。

さらに、Ｃ末端アスパラギンを含む他のペプチドの免疫応答と活性（例、ＳＥＱＩＤ No.1など）は、Ｃ末端の酸性アミノ酸、特にアスパラギン酸への変換にも依存している可能性がある。そのため、本発明の１つの態様では、ＳＥＱＩＤ No.1に従うペプチドは、酵素的変換後にＳＥＱＩＤ No.3に従う活性ペプチドを提供する、ＳＥＱＩＤ No.3の「プロドラッグ」のように見える。本発明はまたアミノ酸、特にアスパラギンの化学的変換と、水１分子の損失による自発的脱アミド化も包含している。

さらに、ＳＥＱＩＤ No.1に従うペプチドの活性を示す例は、ＳＥＱＩＤ No.3に従う改変ペプチドの活性も支持する。

ＢＩＲ−００２ペプチドの範囲（領域８４から１１３）にあるペプチドの溶解性は非常に類似したペプチドとは全く異なることが、本発明の状況において見い出せる可能性もある。ＢＩＲ−００２ペプチドに近い領域のWangらによるペプチドは実際不溶性であり、結合試験は実施できなかったことに留意する必要がある。

溶解性は以下のように決定された。
２２−３６（ＳＥＱＩＤ No.1）：＜３２．９ｍｇ／ｍＬ（酢酸塩）
ＢＩＲ−００２ａ（ＳＥＱＩＤ No.3）（Ｃ末端はＮの代わりにＤ）：＜２３．５ｍｇ／ｍＬ
ＢＩＲ−０１４（Ｗａｎｇ，ＳＥＱＩＤ No.25 に相当するペプチド）＜９９．５ｍｇ／ｍＬ

さらに本発明の別の態様は、ＨＬＡ制限抗原と複合体を形成しているヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩあるいはＩＩに特異的に結合している抗体に関する（以後「複合体特異的抗体」と呼ぶ）。さらに、本発明の別な態様は続いて、ＨＬＡ制限抗原と複合体を形成しているヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩあるいはＩＩに特異的に結合している前記抗体の生成方法に関する。その方法には、ＨＬＡ制限抗原と複合体を形成している前記ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩあるいはＩＩの溶解型前記ＭＨＣを発現する細胞を含む遺伝子組換え非ヒトほ乳類の免疫化方法、前記非ヒトほ乳類の細胞を生成する抗体からのｍＲＮＡ分子の単離方法、前記ｍＲＮＡ分子によりコード化されたタンパク質分子を表示するファージディスプレイライブラリーの生成方法、および前記ファージディスプレイライブラリーの１つ以上のファージ、つまりＨＬＡ制限抗原と複合体を形成しているヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩあるいはＩＩに特異的に結合している前記抗体を表示する１つ以上の前記ファージの単離方法が,含まれる。該抗体と単鎖クラスＩ主要組織適合複合体の各生成方法と、これらの抗体の他の生成ツールは、WO 03/068201、WO 2004/084798、WO 01/72768、WO 03/070752、およびCohen CJ, Denkberg G, Lev A, Epel M, Reiter Y. Recombinant antibodies with MHC-restricted, peptide-specific, T-cell receptor-like specificity:new tools to study antigen presentation and TCR-peptide-MHC interactions. J Mol Recognit. 2003 Sep-Oct;16(5):324-32.、Denkberg G, Lev A, Eisenbach L, Benhar I, Reiter Y. Selective targeting of melanoma and APCs using a recombinant antibody with TCR-like specificity directed toward a melanoma differentiation antigen. J Immunol. 2003 Sep 1;171(5):2197-207、および Cohen CJ, Sarig O, Yamano Y, Tomaru U, Jacobson S, Reiter Y. Direct phenotypic analysis of human MHC class I antigen presentation:visualization, quantitation, and in situ detection of human viral epitopes using peptide-specific, MHC-restricted human recombinant antibodies. J Immunol. 2003 Apr 15;170(8):4349-61に開示されており、これらは本発明の目的のため、その全体が参考文献として引用されている。

抗体は、本発明の状況で「特異的」と見なされる複合体と２０ｎＭ、好ましくは１０ｎＭ未満の結合親和性で結合していることが好ましい。

「抗体」という用語は、ここでは広い意味で使われており、ポリクロナールおよびモノクロナール抗体の両方を含む。「抗体」という用語には、完全免疫グロブリン分子に加え、これらの免疫グロブリン分子およびヒト型免疫グロブリン分子のフラグメントまたはポリマーも、本明細書で記載されている何らかの望ましい性質（例、上述の複合体特異的抗体である、増大したレベルでがんマーカーを発現するがん細胞にトキシンを送達する、および／またはサービビンなど、がんマーカーポリペプチド活性を阻害する）を表す限り含まれる

可能な限り、本発明の抗体は市販品を購入する。本発明の抗体はよく知られた方法でも生成してもよい。熟練した当業者は本発明の抗体生成に、がんマーカーの完全なポリペプチドまたはそのフラグメントのどちらを使用してもかまわない。本発明の抗体生成に使用されるポリペプチドは、天然物から部分的にあるいは完全に生成しても、あるいは組み換えＤＮＡ技法により生成してもよい。例えば、サービビンポリペプチドまたはそのフラグメントをコード化するｃＤＮＡは、原核生物（例、細菌）または真核生物（例、酵母、昆虫、ほ乳類細胞）中で発現され、その後、組み換えタンパク質が精製され、抗体生成用がんマーカーポリペプチドと特異的に結合するモノクロナールまたはポリクロナール抗体製剤を生成するのに使用される。複合体特異的抗体は通常、上述のように生成される。

モノクロナールまたはポリクロナール抗体の２つ以上の異なるセットを生成すると、目的とする用途（例、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、in vivo画像、イムノトキシン療法）に必要な特異性と親和性を有する抗体を得る可能性が最大となることを、当業者は知ることになる。使用される目的（例、ＥＬＩＳＡ，免疫組織化学、免疫療法など、抗体の生成と試験についての詳細な手引きの例として、Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988を参照）に応じて、その抗体が望ましい活性を有しているか既知方法で試験される。例えば、抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタンブロット、ホルマリン固定がんサンプルまたは冷凍組織切片の免疫組織化学染色法で試験される。最初のin vitroキャラクタリゼーション後、治療または体内診断を使用目的とした抗体は、既知の臨床検査方法に従って試験される。

本明細書で使われている「モノクノナール抗体」という用語は、十分均質な集団から得られる抗体を意味し、つまり集団に含まれる個々の抗体は少量で提示される自然発生変異の可能性以外は、同一である。本明細書のモノクロナール抗体は具体的にはキメラ抗体であり、その中の重鎖およびまたは軽鎖部分は、特定種由来の抗体あるいは抗体の特定クラスまたはサブクラスに属する抗体に対応する配列と同一かまたは相同であり、一方、望ましい拮抗作用を表す限り、鎖の残基は別種由来の抗体あるいは抗体の別のクラスまたはサブクラスに属する抗体、およびその抗体のフラグメントに対応する配列と同一または相同である（米国特許Ｎｏ．４，８１６，５６７）。

本発明のモノクロナール抗体はハイブリドーマ法によって調製される。ハイブリドーマ法では、通常マウスまたは他の適切な宿主動物が免疫製剤で免疫化され、免疫製剤に特異的に結合する抗体を生成するか、生成能力有するリンパ球を誘発する。代わりに、リンパ球をin vitroで免疫化してもよい。

モノクロナール抗体は米国特許Ｎｏ．４、８１６、５６７記載の方法など、組み換えＤＮＡ法によっても生成してもよい。本発明のモノクルナール抗体をコード化するＤＮＡは、従来手順（例、マウス抗体の重鎖と軽鎖をコード化する遺伝子に特異的に結合する能力があるオリゴヌクレオチドプローブを用いる）によって容易に単離し配列決定されうる。

In vitroの方法も一価の抗体調製には適している。フラグメント特に、Ｆａｂフラグメントを生成する抗体の消化は、当該分野で決まっている既知技術によって達成できる。例えば、消化はパパインによって達成される。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２発行ＷＯ９４／２９３４８と米国特許Ｎｏ．４，３４２，５６６に記載されている。抗体のパパイン消化により、通常Ｆａｂフラグメントと呼ばれる同一抗原に結合している２つのフラグメント（各々が単一抗原結合部位と残留Ｆｅフラグメントを有する）が生成される。ペプシン処理により、２つの抗原が結合する部位をもち、しかも架橋結合抗原能力を有するフラグメントが得られる。

他の配列に繋がっているか否かにかかわらず、抗体フラグメントは、その活性が非改変抗体または抗体フラグメントに比べて有意に変化あるいは減弱されていなければ、特定領域または特定アミノ酸残基の挿入、削除、置換、または他の選択的改変も含む。これらの改変は、ジスルフィド結合能力のあるアミノ酸の削除／追加、生物的寿命の延長、分泌特性の変更など、いくつかの別の特性を提供しうる。いずれの場合も、抗体フラブメントは、結合活性、結合ドメインにおける結合調節などの生物活性の特質を所有していなければならない。抗体の機能領域すなわち活性領域は、タンパク質の特定領域の変異原性、続いて発現と発現ポリペプチドの試験によって同定される。該方法は、当該分野の実施者には容易に明らかであり、抗体フラグメントをコード化する核酸の部位特異的変異原性を含みうる。

本発明の抗体は、さらにヒト化抗体またはヒト抗体を含む。非ヒト抗体（例、マウス）のヒト化型は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラブメント（Ｆｖ，Ｆａｂ，ＦＡｂ'または抗体の他の抗原結合配列など）であり、それらは非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含んでいる。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（受容抗体）を含み、その中で受容体の補体決定領域（ＣＤＲ）からの残基は、マウス、ラット、ウサギなど望ましい特異性、親和性と容量を持つ非ヒト種（ドナー抗体）ＣＤＲからの残基によって置換される。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基で置換される。ヒト化抗体はまた、受容抗体内でも、取り込まれたＣＤＲまたはフレームワーク配列内のいずれでも検出されない残基も含む。ヒト化抗体は、１つの通常は２つの可変ドメインのすべてを十分に含み、その中で、ＣＤＲ領域のすべて、またはその大半が非ヒト免疫グロブリンのものに対応しており、ＦＲのすべて、またはその大半がヒト免疫グロブリンに一致する配列のものに対応している。ヒト化抗体は最適には、少なくとも免疫グロブリン一定領域（Ｆｃ）の一部を、通常はヒト免疫グロブリンの一部を含むことである。

非ヒト抗体のヒト化方法は当該分野ではよく知られている。ヒト化抗体は非ヒト源から導入された1つ以上のアミノ酸残基を有している。これらの非ヒトアミノ酸残基は、頻繁に「取り込み」残基と呼ばれ、通常「取り込み」可変ドメインから取り込まれる。ヒト化は基本的には、げっ歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に代用することで達成されうる。従って、該「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６５，５６７）、そこでは、完全ヒト可変ドメインよりもかなり少ないドメインが非ヒト種の対応する配列で置換される。実際には、ヒト化抗体は通常、一部のＣＤＲ残基および可能なら一部のＦＲ残基が、げっ歯動物抗体のアナログ部位の残基で置換されたヒト抗体である。

免疫化時点で、内在性免疫グロブリン産生なしに、ヒト抗体の完全なレバートリーを産生できる遺伝子組換え動物（例、マウス）を採用できる。例えば、キメラまたは生殖系列変異マウスで、領域遺伝子に加わる抗体重鎖のホモ接合体が欠損する結果、内在性抗体産生が完全に阻害される。そのような生殖系変異マイスにおいてヒト生殖系免疫グロブリンの遺伝子アレイが転移するとその結果、抗原刺激時にヒト抗体が産生される。ヒト抗体は、例えば、複合体特異的抗体に対して上述したように、ファージディスプレイライブラリーでも生成されうる。

本発明の抗体は、好ましくは薬剤的に認容される担体に混ぜて被験者に投与される。通常、適切な量の薬剤学的に認容性のある塩が、製剤を等張状態にさせるために製剤中に使われる。薬剤学的に認容性のある担体例には生理食塩液、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が含まれる。溶液のｐＨは、好ましくは５から８までであり、さらに好ましくは約７から約７．５までである。さらに単体は抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスのような徐放性製剤を含み、そのマトリクスは成形品の剤型、例えばフィルム、リポソーム、または微粒子などである。特定の担体は、例えば、投与経路や投与される抗体濃度次第でさらに好ましくなることは、当業者には明確である。

抗体は注射（静注、腹腔内注、皮下注、筋注）によって、または効果的な剤型で確実に血流に送達させる注入など他の方法によって、被験者、患者または細胞に投与されうる。抗体は、局所と全身治療効果を与えるために、腫瘍内または腫瘍周辺経路によっても投与可能である。局注または静注が好ましい。

抗体の有効な用量と投与スケジュールは経験的に決定され、そのような決定は当該分野の技術範囲内である。当業者は、抗体の投与すべき用量が例えば、抗体を受け取る被験者、投与経路、使用抗体の特定タイプ、および他の投与薬などに依存して変化することを理解することになる（Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al, eds. Raven Press, New York (1977) pp. 365-389.）。抗体単独使用での典型的な１日用量は、上述した要因に依存して、１日約１ μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重以上の範囲であるかもしれない。がんの治療に抗体を投与後、治療用抗体の効能は熟練医師によく知られた様々な方法で評価されうる。例えば、その治療を受ける被験者のがんのサイズ、数、および／または分布が標準的な腫瘍画像技法によってモニターされる。腫瘍の成長を止めるために投与する治療用抗体は、抗体の非投与時に起こる疾病経過に比べ、腫瘍を縮小させ、および／または新たな腫瘍発現を防止し、がん治療に有効な抗体である。

抗体はまた体内診断分析法としても使用できる。抗体は放射性ヌクレオチド（ ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³1I, ³H, ³²P または ³⁵S）で標識化され、免疫シンチグラフィーによって腫瘍の場所が突き止められる。１つの実施形態では、抗体またはそのフラグメントは２つ以上のがん標的細胞の細胞外マトリックスに結合し、その親和性値（Ｋｄ）は１ｘ１０μＭ未満である。

診断用抗体は様々な画像法による検出に適したプローブで標識化される。プローブの検出方法には、蛍光、光、共焦点電子顕微鏡、磁気共鳴画像スペクトロスコピー、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、およびポジトロンＣＴなどが含まれるが、これだけに限定されない。
適切なプローブには、フルオレセイン、ローダミン、エオシンおよび他の蛍光色素分子、放射性同位体、金、ガドリニウムおよび他のランタン系元素、常磁性鉄、フッ素−１８、および他のポジトロン放出放射性核種が含まれるが、これだけに限定されない。さらに、プローブは２つあるいは複数機能を有し、上述した方法２つ以上で検出される。これらの抗体は前記プローブで直接または間接的に標識化される。抗体へのプローブの結合には、プローブの共有結合、抗体内へのプローブの取り込み、プローブ結合へのキレート化合物の共有結合を含み、当業者にはよく認められている。免疫組織化学では、疾病組織サンプルは新鮮か冷凍されるか、またはパラフィンで埋め込まれホルマリンのような保存剤で固定される。固定あるいは埋め込まれたセクションには、標識化された一次抗体と二次抗体と接触しているサンプルが含まれ、ここで抗体はＮＣＡＮタンパク質の発現をそのままの状態（in situ）で検出するのに使われる。

そこで本発明では、前記ペプチドとＴ細胞の交差反応を引き起こす、ＳＥＱＩＤ No.1 から No.3 グループまたはその変異体に８０％相同である、好ましくは９５％相同であるところの、ＳＥＱＩＤ No.１から No.3 グループまたはその変異体を含むペプチドを提供する。

腎細胞癌の治療の好ましい実施形態では、ＳＥＱＩＤ No.1および／またはＳＥＱＩＤ No.2および／またはＳＥＱＩＤ No.3のペプチドが、ＳＥＱＩＤ No.4からＳＥＱＩＤ No.13までとＳＥＱＩＤ No.24を有する２つ以上のペプチドと組み合わせて使用される。ＳＥＱＩＤ No.1からＳＥＱＩＤ No.3までのペプチドは従って、別々にまたは１つの製剤中でその他のペプチドと一緒に投与される。

上記のペプチドと抗原の詳細な説明はWO２００７／０２８５７３に開示されている。

大腸癌の治療に対する好ましい実施形態では、ＳＥＱＩＤ No.1からＳＥＱＩＤ No.3までのペプチドがＳＥＱＩＤ No.15からNo.24まで、No.４、８、１１、または１２のうちの２つ以上のペプチドと組み合わせて使用される。ＳＥＱＩＤ No.1からＳＥＱＩＤ No.3までのペプチドは従って、別々にまたは１つの製剤中でその他のペプチドと一緒に投与される。

上記のペプチドと抗原の詳細な説明は欧州特許０７０１４７９６および米国特許６０／９５３，１６１に開示されている。

本発明のペプチドは、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子への結合能力を有する。

本発明において、「相同性」という用語は、２つのアミノ酸配列、すなわちペプチドまたはポリペプチド配列などの配列間の同一性の程度を示す。前述の「相同性」とは、至適条件で整列させた２つの配列を、比較される配列と比べることで決定される。ここでいう比較される配列は、２つの配列の最適アラインメントにおいて、追加、または欠失（例、ギャップなど）していてもよい。そのようは配列の相同性は、ClustalWアルゴリズムなどのアラインメントを作ることで計算できる(Nucleic Acid Res., 22(22): 4673 4680 (1994))。一般的に入手可能な配列解析ソフトウェア、より具体的には Vector NTI、GENETYXすなわち解析ツールが公開データベースとして提供されている。

当業者は、特定のペプチド変異体で誘導されたＴ細胞とペプチド自体との交差反応が可能かについて評価できることになる (Fong et al., 2001); (Zaremba et al., 1997; Colombetti et al., 2006; Appay et al., 2006).。

発明者によれば、特定のアミノ酸配列の「変異体」とは、側鎖、例えば１個または２個のアミノ酸残基が修正され、（例えば、このアミノ酸残基の側鎖を他の天然発生的なアミノ酸残基の側鎖または他の側鎖で置き換えることにより）その結果、このペプチドが置換後も、ＳＥＱＩＤ No.1 から No.24 における特定アミノ酸配列から成るペプチドと実質上同じようにＨＬＡ分子に結合できることを、意味するものである。例えば、ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２やＨＬＡ−ＤＲなどの適当なＭＨＣ分子の結合溝と相互作用したり、結合したりする能力を、改善しないまでも少なくとも維持するように改変され、そのようにして、ペプチドは活性化ＣＴＬのＴＣＲとの結合能力を改善しないまでも少なくとも維持する。これらのＣＴＬは、実質上細胞と交差反応ができ、本発明の態様で定義されているように同族ペプチドの、天然のアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している細胞を殺傷できる。科学文献 (Rammensee et al., 1997)や、データベース (Rammensee et al., 1999)から得られるように、ＨＬＡ結合ペプチドの特定な位置は、ＨＬＡ受容体の結合モチーフに結合できるコア配列を持つアンカー残基であり、一般的に結合溝を構成するポリペプチド鎖のイオン性、電気物理性、疎水性、空間性といった性質により特徴づけられる。こうして、当業者は、既存のアンカー残基を保持しながらＳＥＱＩＤ No.1から２４のアミノ酸配列を修飾できるようになり、また、そのような変異体のＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子への結合能力を保持するかについて決定できることになる。本発明の変異体は、活性化ＴＣＬへのＴＣＲとの結合能力を維持しており、実質的に交差反応が可能であり、また、本発明の態様で定義しているように、同族ペプチドの体内アミノ酸配列を含んだポリペプチドを発現する細胞を殺傷できる。

実質上Ｔ細胞受容体と相互作用できないこれらのアミノ酸残基は、Ｔ細胞受容体との結合が実質上Ｔ細胞活性に影響せず、また関連するＭＨＣとの結合を壊さない、他のアミノ酸との置換によって修飾できる。こうして本発明のペプチドは、所定の条件とは別に、アミノ酸配列または、その一部分または変異体を含んだいずれかのペプチド（オリゴペプチドまたはポリペプチドを含む）である。

表５：変異体とＳＥＱＩＤ No.24 に従うペプチドの変異体とモチーフ

ＭＨＣクラスＩＩ提示ペプチドは、特定のＨＬＡ対立遺伝子の特異的モチーフに適合したアミノ酸配列を持つ「コア配列」と、任意選択として、Ｎ末端及び／またはコア配列の機能を阻害しないＣ末端伸長アミノ酸配列（すなわちこのペプチド、及び天然カンターパートを認識するＴ細胞クローンの全てあるいはサブセットとの相互作用とは無関係とみなされる）から構成されることはよく知られている。Ｎ末端及び／またはＣ末端伸長は、それぞれ例えばアミノ酸１から１０残基の長さである。これらのペプチドは直接使用され、ＭＨＣクラスＩＩ分子に負荷でき、また以下に示す方法で、この配列がベクターにクローン化できる。これらのペプチドは、細胞内で、より大きなペプチドが加工された最終産物であるため、より長いペプチドも、同様に利用できる。本発明のペプチドは、いずれのサイズでもよいが、一般的には分子量は１００、０００未満、好ましくは５０、０００未満、より好ましくは１０、０００未満であり、また通常は約５、０００である。本発明のペプチドのアミノ酸残基数は１、０００残基未満であり、好ましくは５００残基未満であり、より好ましく１００残基未満であり、最も好ましくは８から３０残基である。更に、本発明でペプチド及び変異体を提供するが、前記ペプチドまたは変異体は、全長のアミノ酸残基が８から１００残基、好ましくは８から３０残基であり、最も好ましくは８から１６残基、すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６残基である。

ＭＨＣクラスＩＩ限定ペプチドに対し、同一コア配列を持つ数種の異なるペプチドがＭＨＣ分子内に提示される。. 認識Ｔ（ヘルパー）細胞との相互作用は、９から１１個のアミノ酸のコア配列により決定されるので、長さの異なる数種の変異体が同一Ｔ（ヘルパー）細胞クローンによって認識される。そのため、コア結合配列を有する長さの異なる数種の変異体は、Ｎ−またはＣ−末端で処理やトリミングを必要とせずに、ＭＨＣクラスＩＩ分子を直接負荷するのに使用される。したがって、本発明のペプチドとのＴ細胞交差反応を誘発する天然発生変異体あるいは人工的変異体は、しばしは長さが異なる変異体である。

約１２アミノ酸残基より長いペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子の結合に直接使用われる場合、コアＨＬＡ結合部位に隣接するアミノ酸残基は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝への特異的結合あるいは、Ｔ（ヘルパー）細胞にペプチドを提示するペプチド能力に実質上影響しない残基であることが好ましい。しかし、上記に記載されたとおり、より大きなペプチドは適当な抗体提示細胞によって断片化されるため、ポリペプチドによってコード化される場合など、このようなより大きなペプチドが利用可能であることが理解される。しかし、同じ例であっても、領域に隣接するコア配列は同一コア配列の参照ペプチドに比較して、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドに影響するか、あるいは、ＭＨＣ−ペプチド二量体のＴＣＲとの両方向での相互作用に影響することが示されている。ペプチド分子内の三次構造（例、ループ形成）は普通は、ＭＨＣまたはＴＣＲへの親和性を減少させる。ペプチド結合の溝以外にも、ＭＨＣまたはＴＣＲの一部に隣接する領域の分子内相互作用がその作用を安定化させる。これらの親和性の変化が、ＭＨＣクラスＩＩペプチドによるＴ（ヘルパー）細胞応答誘発の可能性に大きく影響を与えうる。

また、通常８から１０アミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープは、実際のエピトープを含んだより長いペプチド、またはタンパク質から処理されたペプチドから生成される。実際のエピトープの態様に位置する残基は、実際のエピトープを処理中に曝露するのに必要なタンパク質開裂に、実質的に影響しないものであることが好ましい。

更に本発明は、ＭＨＣクラスＩエピトープのペプチド及び変異体も提供し、このペプチドまたは変異体の全長は、８から１００アミノ酸残基であり、好ましくは８から３０残基であり、最も好ましくは８から１６残基、すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６残基である。

当然のことながら、本発明のペプチドまたは変異体は、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩあるいはＩＩ分子に結合する能力を持つ。ペプチドまたは変異体のＭＨＣ分子への結合は、異なるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に関する文献(例 Vogt et al., 1994; Malcherek et al., 1994; Manici et al., 1999; Hammer et al., 1995; Tompkins et al., 1993; Boyton et al., 1998)に記載されているように、当該分野で知られる方法でテストされる。

本発明の特に好ましい実施形態において、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮｏ．１からＳＥＱＩＤＮｏ．３に示されたアミノ酸配列から構成されるか、または基本的に構成される。

本発明に従うペプチドはＳＥＱＩＤＮｏ．１からＮｏ．３までに描かれるような一続き（伸長）のアミノ酸から構成されることもでき、ここで、前記伸長とは、コア配列が前記ペプチド内に存在している限り、８個以上のアミノ酸を持つ前記配列の一部を示し、本明細書で説明しているような免疫応答の誘発機能をペプチドに与えている。

「基本的に構成される」とは、本発明に従うペプチドが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１からＳＥＱＩＤＮｏ．３のいずれかの配列あるいはその変異体に加え、さらにＭＨＣ分子エピトープに対しエピトープとして機能するペプチドの形成に不要な部分である、アミノ酸伸長に位置する別のＮ末端及び／またはＣ末端を含むことを意味する。

いずれにせよこれらの伸長は、本発明に従うペプチドを細胞内に効率的に導入するのに重要である。本発明の一実施形態において、ペプチドは、ＮＣＢＩ、すなわちGenBank Accession-number X00497由来ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連変異体鎖（ｐ３３、"Ｉｉ"に続く）の８０Ｎ末端アミノ酸からなる融合タンパク質である(Strubin, M. et al 1984)。

より好ましいペプチド例は、特異的ＨＬＡサブタイプを持ち、Ｄ８細胞の刺激が可能なペプチド含み、ここで前記ペプチドは、次表６に示された特異なアンカーアミノ酸モチーフを有する。

表６：ＳＥＱＩＤ No.24に従う好ましいペプチドのＨＬＡサブタイプとアンカーモチーフ

更に、ペプチドまたは変異体は、より強い免疫応答を引き起こすため、ＭＨＣ分子に対する安定性及び／または結合性をより向上できるように修飾される。そのようなペプチド配列の最適化の方法は、当該分野では良く知られており、逆方向ペプチド結合または非ペプチド結合の導入などがある。

逆方向ペプチド結合において、アミノ酸残基はペプチド連鎖（−ＣＯ−ＮＨ−）ではなく、逆向きに結合している。このようなレトロインバーソ（retro-inverso）型ペプチド模倣物は、参照文献として引用されるMeziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237に記載のように、当該分野で知られている方法で作成される。この方法では、骨格の変化はあるが側鎖方向は変化させずに擬ペプチドを作成する。Meziere ら(1997)は、これらの擬ペプチドが、ＭＨＣ結合とヘルパーＴ細胞応答に有効であることを示した。ＣＯ−ＮＨ結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含むレトロインバーソペプチドは、タンパク質分解にかなり耐性がある。

非ペプチド結合とは、-CH₂-NH, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH-, -COCH₂-, -CH(OH)CH₂-, また、 -CH₂SO-.のことである。米国特許４，８９７，４４５では、標準方法で合成したポリペプチドを含むポリペプチド鎖内の非ペプチド結合と、 NaCNBH₃存在下アミノアルデヒドとアミノ酸を反応させ合成した非ペプチド結合（-CH₂-NH）の固相合成法が提供されている。

上述の配列を持つペプチドは、アミノ末端及び／またはカルボキシ末端にある別の化学基とともに合成され、安定性、バイオアベイラビリティ、及び／またはペプチドへの親和性を促進する。例えば、カルボベンゾキシル基、デンシル基、またはｔ−ブチルオキシカルボニル基などの疎水基は、ペプチドのアミノ末端に付加される。同様に、アセチル基または９−フルオレニルメトキシカルボニル基をペプチドのアミノ末端に付加される。更に、疎水基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、またはアミノ基が、ペプチドのカルボキシ末端に付加される。

更に、本発明のペプチドは、その立体配置が変化するように合成される。例えば、通常のＬ異性体の代わりに、１個またはそれ以上のアミノ酸残基のＤ異性体を使用する。更に、本発明のペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基を、既知の合成アミノ酸残基に置換してもよい。このような置換は、本発明のペプチドの安定性、バイオアベイラビリティ、及び／または結合反応を促進することもある。

同様に、本発明のペプチドまたは変異体は、ペプチド合成の前後において、特定のアミノ酸と反応して化学的に修飾される。このような改変は、当該分野では良く知られており、本明細書で参考文献として引用した、R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3^rd ed. CRC Press, 2005などに要約されている。アミノ酸の化学的改変としては、アシル化、アミジン化、リジンのピリドキシル化、還元的アルキル化、２，３，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化、カルボキシル基のアミド改変、及びシステインからシステイン酸への過ギ酸酸化によるスルフィドリル改変、水銀誘導体形成、他のチオール化合物とジスルフィドとの混合体形成、マレイミド反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドとのカルボキシメチル化、及びアルカリ性ｐＨ下でのシアン酸塩とのカルバモイル化が挙げられるが、これだけに限定されない。これに関して、当業者は、より広義なタンパク質の化学改変方法論について、"Current Protocols In Protein Science", Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000)の１５章を参照されたい。

タンパク質のアルギニル残基などの改変は、簡単に言えば、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、及び１，２−シクロヘキサンジオンなど隣接のジカルボニル化合物との反応に基づくことが頻繁であり、付加化合物を形成する。別の例は、メチルグリオキサルのアルギニン残基との反応である。システインは、リジン及びヒスチジンなど他の求核部位で付随する修飾がなくとも改変できる。その結果、多数の試薬がシステインの修飾に使用できる。Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com)などのウエブサイトで特定な試薬の情報が得られる。

タンパク質におけるジスルフィド結合の選択的還元も一般的である。ジスルフィド結合は生物製剤の熱処理中に形成され、酸化される。

ウッドワード試薬Ｋを特定のグルタミン酸残基を修飾するのに使ってもよい。Ｎ−（（３−ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミドはリジン残基及びグルタミン酸残基との分子内架橋を形成するのに使われる。

例えばジエチルピロカルボネートは、タンパク質のヒスチジル残基を修飾する試薬である。ヒスチジンも４−ヒドロキシ−２−ノネナールで修飾できる。

リジン残基と他のα−アミノ基の反応は、ペプチドの表面への結合またはタンパク質/ペプチドの架橋などに有用である。リジンは、ポリ（エチレン）グリコールの接続部位であり、また、タンパク質糖化における主な修飾部位である。タンパク質のメチオニン残基は、ヨードアセトミド、臭化エチルアミン、及びクロラミンＴなどで修飾できる。
テトラニトロメタンとＮ−アセチルイミダゾールは、チロシン残基の修飾に使われる。ジチロシンの形成を介して起こる架橋には、過酸化水素あるいは銅イオンが使われる。

トリプトファン修飾に関する最近の研究においては、Ｎ−ブロモサクシンイミド、２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジル臭化物もしくは３−ブロモ−３−メチル２−（２−ニトロフェニルメルカプト）−３Ｈインドール（BPNS-スカトール）が使われている。

治療用のタンパク質及びペプチドをＰＥＧによりうまく修飾できると、しばしば循環半減期の延長につながり、一方、グルタルアルデヒト、ポリエチレングリコールジアクリレートによるタンパク質の架橋は、ハイドロゲルの調製用として使われる。免疫療法に対するアレルゲンの化学的修飾は、しばしばシアン酸カリウムとのカルバミル化によって達成される。

ペプチドまたは変異体、ここでペプチドは修飾されるか非ペプチド結合を含むが、本発明の好ましい実施形態である。一般的に、ペプチド及び変異体（少なくともアミノ酸残基間にペプチド連鎖を持つ）は、Lu ら(1981)及び参考文献で公表されているように、固相ペプチド合成のFmoc-ポリアミドモードによって合成される。一時的なＮ−末基の保護には９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基が使われる。塩基に非常に不安定なこの保護基の反復性開裂は、２０％ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液で実施される。側鎖の官能性は、ブチルエーテル（セリンスレオニンとチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸とアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リジンとヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、そして４−メトキシー２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護される。グルタミンまたはアスパラギンがC末端残基の場合、官能性側鎖アミドの官能性の保護に４、４'−ジメトキシベンズヒドリル基を用いたものもある。固相の支持体は、ジメチルアクリルアミド(骨格モノマー)、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）及びアクリロイルサルコシンメチルエステル（官能基化剤）の３つのモノマーから成るポリジメチルアクリルアミドポリマーに基づいている。ペプチド−樹脂の開裂可能な連結剤には、酸に不安定な４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体を使う。全てのアミノ酸誘導体は予め作られた対称の無水物誘導体として付加されるが、アスパラギン及びグルタミンは例外であり、これらはN、N-ジシクロヘキシル−カルボジイミド/１−ヒドロキシベンゾトリアゾールで仲介される非対称性カップリング反応により付加される。全てのカップリングと脱保護反応はニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸もしくはイソチン（isotin）テストで測定される。合成が終了すると、ペプチドは、５０％捕捉剤を含む９５％トリフルオロ酢酸の処理による側鎖保護基の除去と同時に樹脂支持体から開裂する捕捉剤には一般的にエタンジチオール、フェノール、アニソール及び水が使われるが、適格な選択は合成されるペプチドの構成アミノ酸に依存する。また、ペプチド合成では固相法及び溶液相法の組み合わせも可能である（Bruckdorfer et al. 2004及び本明細書の参考文献などを参照）。

真空で蒸発しトリフルオロ酢酸を除去し、続いてジエチルエーテルで粉末とし、粗ペプチドを得る。捕捉剤はすべて単純な抽出作業で除去され、液相の凍結乾燥で捕捉剤不含の粗ペプチドが得られる。ペプチド合成の試薬はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＵＫ）Ｌｔｄ（ＮｏｔｔｉｎｇｈａｍＮＧ７，ＵＫ）などで入手できる。

精製は、再結晶、分子篩クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び（通常）アセトニトリル/水の勾配分離などによる逆相高速液体クロマトグラフィーの１つあるいは組み合わせて実施する。

ペプチド解析は、薄相クロマトグラフィー、電気泳動、特にキャピラリー電気泳動、固相抽出（ＣＳＰＥ）、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析及び、高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析法そしてＭＡＬＤＩ及びＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析法にて行われる。

本発明の別な一態様では、ペプチドもしくは変異体をコード化する核酸（例、ポリヌクレオチド）を提供する。捕捉剤不含のポリヌクレオチドはＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＡＮ、ＲＮＡもしくはその組み合わせなどであり、一本鎖及び／または二本鎖、天然型または安定型であり、例えばホスホロチオエート結合骨格を有するポリヌクレオチドなどであり、また、ポリペプチドをコードしている限り、イントロン含有または不含どちらの場合であってもよい。当然のことながら、そのポリペプチドはポリヌクレオチドでコード化が可能な天然発生のペプチド結合によって連結される、天然発生のアミノ酸残基を含むペプチドのみである。更に、本発明の別な一態様では、本発明に従うポリペプチドを発現できる発現ベクターを提供する。

ポリヌクレオチド、特にＤＮＡをベクターに例えば、相補的に結合力のある末端を介して連結させる様々な方法が開発されている。例えば、相補的ホモポリマーの束がDNAセグメントに付加され、ベクターDNAに挿入される。そして、ベクターとＤＮＡセグメントは、相補的ホモポリマーの尾部間で水素結合し、組み換えDNA分子を形成する

合成リンカーは１個以上の制限部位を含み、DNAセグメントとベクターが連結する代替方法を提供する。様々な制限エンドヌクレアーゼ部位を持つ合成リンカーはＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．(ＮＥＷＨａｖｅｎＣＮ，ＵＳＡ)などの多くの企業から市販されている。

本発明のポリペプチドをコード化するＤＮＡ修飾には、Saiki et al (1988) によって開示されているポリメラーゼ鎖反応を用いることが望ましい。例えば適切な制限部位中で設計することにより、ＤＮＡを適切なベクターに導入する際、または、当該分野で既知の他の有用な方法でＤＮＡを修飾する際、この方法が使用される。ウイルス性ベクターを使用する場合は、ポックスベクターあるいはアデノウイルスベクターが好ましい。

続いてＤＮＡ（レトロウイルスベクターの場合、ＲＮＡ）を適切な宿主にて発現し、本発明のペプチドもしくは変異体からなるポリペプチドを生成してもよい。こうして、本発明のペプチドまたは変異体をコード化するDNAを、本明細書に記載の指導的見解で改変した既存技術を使用し、発現ベクターを構築し、続いてその発現ベクターを使い、本発明のポリペプチドの発現と生産するのに適切な宿主細胞に導入する。該技術には、米国特許Ｎｏ．４，４４０，８５９，４，５３０，９０１，４，５８２，８００，４，６７７，０６３，４，６７８，７５１，４，７０４，３６２，４，７１０，４６３，４，７５７，００３，４，７６６，０７５，および４，８１０，６４８で開示されたものが含まれる。

本発明の化合物を構成するポリペプチドをコード化するＤＮＡ（レトロウイルスベクターの場合、ＲＮＡ）は、適切な宿主の導入のために、他の各種配列と連結される。随伴ＤＮＡは、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入方法、及びエピソームの維持または組み込みの要求によって決まる。

一般的に、ＤＮＡは、発現の適切な配向と正確なリーディングフレームで、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要に応じて、ＤＮＡは、目的とする宿主に認識される適切な転写及び翻訳の調節制御核酸の配列に連結されるが、そのような制御は発現ベクターで行われる。続いてベクターは、標準的な技術で宿主に導入される。一般的には、全ての宿主がベクターによって形質転換されるわけではない。それ故、形質転換する宿主細胞を選択する必要となる。選択技術の１つに、全ての必要な制御エレメントとともに、抗体耐性のような形質転換細胞内で選択可能な形質をコードする、発現ベクターのＤＮＡ配列に組み込む方法がある

代わりに、このような選択的形質に対する遺伝子は、別のベクター上に存在できるため、そのベクターを使って目的の宿主細胞を同時に形質転換することもできる。本発明の組み換えDNAによって形質転換された宿主細胞は、続いて本明細書に開示されている指導的見解で当業者に既知の適切な条件下で、十分時間培養され、ポリペプチドの発現を可能にし、次いで回収される。

バクテリア（大腸菌、枯草菌など）、酵母（出芽酵母など）、糸状菌類（アスペルギルス属など）、植物細胞、動物細胞、及び昆虫細胞など、多数の発現系が知られている。発現系は、ATCC Cell Biology Collection で入手可能なCHO細胞など哺乳動物細胞であることが好ましい。

構成的発現用の哺乳動物細胞の典型的なベクタープラスミドは、適切なポリＡ尾部とネオマイシンなどの耐性マーカーを伴ったＣＭＶもしくはＳＶ４０プロモーターを含む。１例は、Pharmacia (Piscataway, NJ, USA) で入手可能なｐＳＶＬである。哺乳動物の誘導発現ベクターの１例は、ｐＭＳＧであり、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手できる。有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３−４０６とｐRS４１３−４１６であり、Stratagene Cloning Systems, (La Jolla, CA 92037, USA)で入手可能である。プラスミドｐRS４０３、ｐRS４０４、ｐRS４０５、ｐRS４０６は酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２及びＵＲＡ３が組み込まれている。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母動原体プラスミド（Ｙｃｐｓ）である。ＣＭＶプロモーターベクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどで入手可）は、一時的な発現もしくは安定した発現、細胞質発現もしくは分泌、また、FLAG、３ｘＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃあるいはＭＡＴの様々な組み合わせにおけるＮ末端またはＣ末端の標識化を提供する。これらの融合タンパクによって組み換えタンパクの検出、精製及び分析が可能である。二重標識融合により検出に柔軟性を与えている。

強力なヒトサイトメガロウイルスのプロモーター調節領域は、ＣＯＳ細胞中のタンパク質発現レベルを１ｍｇ／Lと高く推進する。作用が弱い細胞株では、典型的なタンパク質レベルは約０．１ｍｇ／Lである。ＳＶ４０の複製開始点が存在すると、ＳＶ４０の複製が許容されるＣＯＳ細胞においてＤＮＡ複製レベルが高くなる。例えばＣＭＶベクターは、バクテリア細胞の複製開始点であるｐＭＢ１（ｐＢＲBR３２２誘導体）、バクテリアのアンピリシン耐性を選択するｂ-ラクタマーゼ遺伝子、ｈＧＨポリＡ、及びｆ１開始点を含むことができる。プレプロトリプシンリーダー（ＰＰＴ）の配列を含むベクターは、ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ抗体、樹脂及びプレートを使って、ＦＬＡＧ融合タンパクの培地への分泌を命ずることができる。他のベクターや発現系が、様々な宿主細胞を使う当該分野においてよく知られている。

本発明は、本発明のポリヌクレオチドベクター構築物により形質転換した宿主細胞を提供する。宿主細胞は原核生物細胞または真核生物細胞であってもよい。一部の状況では細菌細胞が好ましい原核生物の宿主細胞であり、典型的なものは、例えばＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．，（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）から譲渡可能なDH5株、または米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から譲渡可能なＲＲ１などの大腸菌の菌株である。真核生物の好ましい宿主細胞は、酵母、昆虫及び哺乳動物の細胞であり、好ましくはマウスやラット、サル、ヒトの繊維芽細胞や大腸細胞株など脊椎動物由来の細胞である。酵母の宿主には、Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, USA) から入手可能なＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００、ＹＰＨ５０１がある。哺乳動物細胞の宿主として好ましいものは、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手可能な、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手可能なＮＩＨスイスマウス胎児由来細胞ＮＩＨ/３Ｔ３、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５０として入手可能なサル腎臓由来ＣＯＳ−１細胞、及びヒト胎児由来腎臓細胞である２９３細胞である。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターを導入可能なＳｆ９細胞である。発現に適した宿主細胞の選択方法についての概要は、Paulina Balbas and Argelia Lorence "Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols," Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9などの教科書や、当業者に知られている他の文献に記述されている。

本発明におけるＤＮＡ構築物の適切な宿主細胞への形質転換は周知の方法で実施され、それは使用されるベクターの種類により異なる。原核生物細胞の形質転換については、例えば Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110やSambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYなどの文献を参照する。酵母の形質転換については、Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NYに説明されている。また、 Beggs (1978) Nature 275,104-109 に記述された方法も有用である。脊椎動物細胞では、形質移入（形質移入）については、例えばリン酸カルシウムやＤＥＡＥＤデキストラン、またはリポソーム製剤などの細胞を形質移入するのに有用な試薬は、Stratagene Cloning Systems, or Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USAから入手可能である。電気穿孔法も細胞の形質転換及び/または形質移入に有用であり、酵母や細菌、昆虫細胞、脊椎動物細胞の転換は当該分野では良く知られている。

形質転換に成功した細胞、すなわち本発明のＤＮＡ構築物を有する細胞は、ＰＣＲなどの周知の技術で同定できる。代わりに抗体を使って、上清中にタンパク質の存在を検出できる。

本発明における特定な宿主細胞、例えば細菌、酵母、昆虫細胞などが、本発明のペプチドの調製に有用であることは理解される。しかしながら、特定な治療方法においては他の宿主細胞も有用なこともある。例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞は、ペプチドが適切なMHC分子に負荷されるように、本発明のペプチドを発現させるのに有用に使用されることもある。したがって現行の本発明は、本発明に従う核酸または発現ベクターを有する宿主細胞も提供する。

好ましい実施形態において、宿主細胞は抗原提示細胞、特に樹状細胞または抗原提示細胞である。前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）含有組換え融合タンパク質で負荷されたAPCは、現在前立腺癌(Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅ−Ｔ)治療に向けて研究中である。

本発明の別な一態様では、ペプチドまたはその変異体の生成方法、宿主細胞を培養し、ペプチドを宿主細胞あるいはその培養液から単離する方法を提供する。

別の実施形態では、本発明のペプチド、核酸または発現ベクター薬剤として使用される。例えば、ペプチドまたはその変異体を、静脈内注射(ｉ．ｖ．)、皮下注射（ｓ．ｃ．), 皮内注射(ｉ．ｄ．)、腹腔内注射(ｉ．ｐ．)または筋肉内注射として調製してもよい。ペプチド好ましい注射方法は、 s.c.、i.d.、i.p.、i.m.と i.v. である。ＤＮＡの好ましい注射方法は、i.d.、i.m.、s.c.、i.p. と i.v.である。ペプチドまたはＤＮＡの投与量は、例えば５０μｇ〜１．５ｍｇであり、好ましくは１２５ μｇ〜５００μｇであり、投与量は各ペプチドやＤＮＡにより異なる。この範囲の投与量は以前行われた臨床試験で使用され成功したものである(Brunsvig et al 2006; Staehler et al 2007)。

本発明の別な一態様は、活性化T細胞の in vitro での生成方法、つまり抗原特異的方法でT細胞を活性化させるのに充分な時間をかけて、適切な抗原提示細胞の表面に発現した、抗原負荷ヒトＭＨＣＩ及びＩＩ分子を、生体外でＴ細胞と接触させる方法である。充分な量の抗原を抗原提示細胞とともに使用するのが好ましい。

ＭＨＣクラスＩＩエピトープが抗原として使われている場合、Ｔ細胞はＣＤ４陽性ヘルパー細胞であり、好ましくはTH1タイプである。ＭＨＣクラスＩＩ分子はあらゆる適切な細胞表面に発現される。（MHCクラスII分子を発現させるために細胞を形質移入する場合）当該細胞は天然でMHCクラスII分子を発現していないのが好ましい。代わりに、細胞が天然でＭＨＣクラスＩＩ分子を発現している場合は、抗原の処理または抗原提示の経路が欠けていることが好ましい。この場合、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現細胞が、Ｔ細胞を活性化する前に、選択されたペプチド抗原で完全に負荷されることが可能となる。

抗原提示細胞（または活性化細胞）は、典型的にはその表面にＭＨＣクラスＩＩ分子を有し、前記ＭＨＣクラスＩＩ分子を選択した抗原で負荷される能力を、それ自体実質的に持たないことが好ましい。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、選択した抗原と in vitro で直ちに負荷される。

好ましくは、哺乳動物細胞が、ＴＡＰペプチドトランスポーターを欠いているか、その発現または機能が低下していることである。ＴＡＰペプチドトランスポーターを欠いた適切な細胞は、Ｔ２、ＲＭＡ−Ｓやショウジョウバエの細胞である。ＴＡＰはTransporter associated with Antigen Processing（抗原プロセシング関連輸送体）のことである。

ヒトペプチド負荷欠損細胞株Ｔ２は、米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA)からカタログ番号CRL1992として、また、ショウジョウバエのSchneider line 2は、同じく米国培養細胞系統保存機関からカタログ番号CRL19863として入手可能であり、またマウスのRMA-S株についてはKarreら(1985)の文献に記述されている。

便宜上、形質移入する前記宿主細胞は、実質的にＭＨＣクラスI分子を発現していないとする。また、刺激細胞が、B7.1, B7.2, ICAM-1やLFA 3のいずれかのように、Ｔ細胞同時刺激シグナルを与えるのに重要な分子を発現しているのが好ましい。多数のＭＨＣクラスＩＩ分子や同時刺激分子の核酸配列は、GenBankとEMBLのデーターベースから入手可能である

同様に、ＭＨＣクラスＩエピトープが抗原として使われる場合、Ｔ細胞はＣＤ８陽性ＣＴＬである。

抗原提示細胞がこのようなエピトープを発現させるために形質移入された場合、好ましくは前記細胞が、ＳＥＱＩＤ No.1 からＳＥＱＩＤ No.3 のペプチドまたはその変異体アミノ酸配列を発現可能な発現ベクターを有することである。

他の方法を in vitro でのＣＴＬの生成に多数使用してもよい。例えば、Peoples ら(1995)及びKawakami ら(1992)の論文に記載の方法では、CTLの作成に自己腫瘍浸潤リンパ球を用いている。Plebanski ら(1995)は自己末梢血リンパ球(ＰＬＢ)をＣＴＬの調製に使用している。Jochmus ら(1997)は、ペプチドまたはポリペプチドで鼓動させるか、または組換えウイルスの感染を通じて、自己CTLを生成する方法について記述している。 Hill ら(1995)とJerome ら(1993)は、Ｂ細胞を自己ＣＴＬの生成に使用している。更に、ペプチドまたはポリペプチドで鼓動させたか、または組換えウイルスで感染させたマクロファージを用いて、自己ＣＴＬを調製してもよい。S. Walter ら(2003)は、人工抗原提示細胞(aAPC)を用いた、Ｔ細胞のin vitro でのプライミング（初回抗原刺激）について説明しており、これは、選択したペプチドに対するＴ細胞の作成方法としても適している。この研究では、aＡＰＣを、ビオチン-ストレプトアビジン生化学手法により、ポリスチレン粒子（微小粒子）の表面に機能したＭＨＣ:ペプチド複合体をカップリングさせて作成した。本システムは、aAPC上のMHC密度を正確に制御できるため、血液試料から高い効率で、抗原特異性が高いあるいは低いT細胞応答を選択的に引き出すことができる。aAPCは、MHC:ペプチド複合体とは離れて、その表面にカップリングした同時刺激活性様抗CD28抗体と共に他のタンパク質をその表面に運ぶ必要がある。更に、このようなａＡＰＣに基づくシステムは、しばしばインターロイキン１２様サイトカインなどの適切な可溶性因子の添加が必要である。

同種細胞をT細胞の調製に使ってもよく、詳しい方法は本明細書の参考文献として引用しているＷＯ９７／２６３２８に記載されている。例えば、ショウジョウバエ細胞とＴ２細胞に加え、他の細胞を使用して、ＣＨＯ細胞やバキュロウイルスに感染した昆虫細胞、細菌、酵母、ワクチンに感染した標的細胞などの抗原を提示してもよい。さらに、植物ウイルスを使用してもよく(例; Porta et al (1994)参照)、そこでは外来ペプチドの提示のための高収率システムとして、ササゲモザイクウイルスの開発について説明している。

本発明のペプチドに注目した活性化T細胞は治療に有用であるしたがって、本発明の別な一態様では、本発明の前述の方法で得られる活性化T細胞を提供する。上記の方法で生産された活性化T細胞は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１からＳＥＱＩＤＮｏ．１１のアミノ酸配列を含んだポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する

好ましくは、Ｔ細胞がそのＴＣＲとＨＬＡ/ペプチド複合体の相互作用（例とえば結合）により細胞を認識することである。このようなＴ細胞は、本発明のアミノ酸配列を含んだポリペプチドを異常に発現する標的細胞を持つ患者で、標的細胞を殺す方法には有用であり、ここで、患者には効果的な数の活性化T細胞が投与される。患者に投与するT細胞は、その患者に由来し上記の方法で活性化されたものであってもよい（すなわち、これらは自己Ｔ細胞である）。代わりに、Ｔ細胞は患者に由来せず、他の個人に由来してもよい。もちろん、個人は健康であることが好ましいここでいう「健康な個人」とは、健康状態にあり、好ましくは十分な免疫系を持ち、さらに好ましくは、容易に検査/検出できるいかなる疾患にも患っていない個人を意味する。

In vivoで、本発明に従うＣＤ４陽性T細胞の標的細胞は、腫瘍細胞（ＭＨＣクラスＩＩ分子を時に発現する）及び／または腫瘍（腫瘍細胞）をとりまく間質細胞（ＭＨＣクラスＩＩ分子を時に発現 (Dengjel et al., 2006) ）であってもよい。

本発明のＴ細胞は治療組成物の有効成分として使用される。従って本発明は、本発明のアミノ酸配列を含んだポリペプチドを異常に発現する標的細胞を持つ患者で、標的細胞を殺す方法、つまり上記に記載したとおり、患者に効果的な数の活性化T細胞を投与する方法も提供する。

ここでいう「異常に発現する」とは、ポリペプチドが正常レベルに比べ過剰発現していること、または、腫瘍が由来する組織においては発現していないが腫瘍では発現していることを意味する。また、ここでいう「過剰発現」とは、ポリペプチドが、正常な組織と比較して少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも２倍、さらに好ましくは少なくとも５倍または１０倍発現していることを意味している。

Ｔ細胞は、上述のような当該分野で既知の方法で得てもよい。この、いわゆるＴ細胞の養子細胞移植のプロトコールは、当該分野では周知であり、文献（ Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1988; Dudley et al., 2002; Yee et al., 2002; Dudley et al., 2005)や総説 (Gattinoni et al., 2006) および (Morgan et al., 2006)に記載されている。

ペプチドや核酸、発現ベクター、細胞、活性化ＣＴＬ、Ｔ細胞レセプターやこれをコード化する核酸など、本研究のいずれの分子も、細胞が免疫応答から逃れる特徴を持つ疾患の治療に有用である。それ故、本発明のすべての分子を、薬剤として、または薬剤の製造において使用される。これらの分子を単独で、または本発明における他の分子や既知の分子と組合せて使用してもよい

本発明の薬剤はワクチンが好ましい。本ワクチンは患者に直接、または影響を受けた器官に、または i.d.、i.m.、s.c.または i.v. により全身に投与するか、また、その後患者に投与される、患者またはヒト細胞株に由来の細胞をｅｘｖｉｖｏで適用するか、あるいはｉｎｖｉｖｏで使用して、その後患者に投与される、患者由来の免疫細胞のサブ集団を選択する。細胞に in vitro で核酸を投与する場合は、インターロイキン２などの免疫刺激サイトカインを同時発現できるように核酸を形質移入することが、細胞にとって有用である。ペプチドは本質的に純粋であるか、免疫刺激アジュバントと併用されるか、または免疫刺激的サイトカインと併用される、あるいはリポソームなど適当な送達システムとして投与される。ペプチドはまた、キーホール無脊椎ヘモシアニン（ＨＬＨ）またはマンナンなどにペプチドを接合させることも有用である（ＷＯ９５／１８１４５および Longenecker et al (1993)参照）。ペプチドはまた標識化され、あるいは融合タンパク質であるか、ハイブリッド分子である。その配列が本発明で与えられるペプチドは、ＣＤ４陽性ＣＤ８Ｔ細胞を刺激することが期待される。しかしながら、ＣＤ４Ｔ−ヘルパー細胞により提供される助けの存在で、ＣＤ８ＣＴＬの刺激はより効率的になる。したがって、CD8CTLを刺激するMHCクラスIエピトープに対し、融合パートナーまたはハイブリッド分子のセクションは、CD4陽性T細胞を刺激するエピトープを適切に提供する。ＣＤ４及びＣＤ８刺激性エピトープは、当該分野で良く知られており、本発明により同定されたエピトープを含む。

本発明の一形態において、ワクチンは、ＳＥＱＩＤ No.1、2、3と少なくとも１つの追加ペプチドで示されたアミノ酸配列を有する１種以上のペプチド、好ましくは２から５０種、より好ましくはNo.２から２５種、さらに好ましくは２から１５種、最も好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１、１２、または１３種のペプチドを含む。これらのペプチドは１つまたは複数の特定なＴＡＡに由来し、ＭＨＣクラスＩ分子とクラスＩＩ分子の一方またはその両方に結合してもよい。好ましくは、少なくとも１つの追加ペプチドはＳＥＱＩＤＮｏ．４から２４で示されるアミノ酸配列を有する。

ポリヌクレオチドは実質的に純粋であり、適切なベクターまたは送達系に含まれる。核酸はＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＡＮ、ＲＮＡまたはこれらの組合せである。このような核酸の設計や導入方法は、当該分野では良く知られている。概要は、 Pascolo S. 2006; Stan R. 2006, or A Mahdavi 2006などに記述されている。ポリヌクレオチドワクチンは簡単に調製できるが、これらのベクターが免疫応答を誘発する作用様式については完全には解明されていない。適切なベクターと送達系は、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルスや、複数のウイルスのエレメントを含む複合体などを基にした、ウイルスＤＮＡやウイルスＲＮＡの一方またはその両方である。ウイルスなしの送達系は、陽イオン性脂質や陽イオン性ポリマーなどで、ＤＮＡ送達に関する技術分野で良く知られている。 "遺伝子銃"などの、物理的な送達法も使用される。核酸でコード化されたペプチドまたは複数のペプチドは、例えば、上述した各々の反対側のＣＤＲに対しＴ細胞を刺激するエピトープとの融合タンパク質である。

本発明の薬剤は、１個または複数のアジュバントを含む。アジュバントは、免疫応答(例えば抗原に対するＣＴＬ及びヘルパーＴ(Ｔ_H)細胞介在による免疫応答)を非特異的に増強または促進するので、そのために本発明の薬剤に役立つと考えられる物質である。適切なアジュバントには、1018 ISS、アルミニウム塩、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893, CpG7909、CyaA、dSLIM, フラジェリンもしくはフラジェリン由来のTLR5リガンド、FLT3リガンド、GM-CSF、IC30、IC31、イミキモド(ALDARA)、レジミキモド、ImuFact IMP321、インターロイキン（IL-2、IL-13、IL-21）、インターフェロン?、インターフェロン?、またはＰＥＧ誘導体、 IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOMs、JuvImmune、LipoVac、MALP2、MF59、モノホスホリル脂質A、モンタニドIMS 1312、モンタニドISA 206、モンタニドISA 50V、モンタニドISA-51、油中水乳剤、水中油乳剤、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、PepTelR ベクターシステム、PLG及びデキストラン微小粒子、レシキモド、SRL172、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、YF-17D、VEGF トラップ、R848、?グルカン、Pam3Cys、Aquila's QS21 stimulon (サポニン、マイコバクテリア抽出物及び合成バクテリア細胞壁模倣体から誘導される)、及びRibi's Detox、Quil、あるいはSuperfosなどのその他の適当なアジュバントが含まれが、それだけに限定されるものではない。フロイントもしくは GM-CSFなどのアジュバントなども好ましい。樹状細胞に特異ないくつかの免疫アジュバント(ＭＦ５９など)及びその調製は前述されている(Dupuis M et al 1998; Allison 1998)。またサイトカインを使用してもよい。いくつかのサイトカインは、リンパ系組織(例えばＴＮＦ−α)への樹状細胞の移動に対する影響、Ｔリンパ球(例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−４)のために効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟の加速に(米国特許５、８４９、５８９、その全体を本明細書の参考文献として明確に引用している)、さらに免疫アジュバント(例えばＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β)としての作用などに、直接関連がある (Gabrilovich et al 1996)。

免疫活性化ＣｐＧオリゴヌクレオチドも、ワクチンの設定におけるアジュバントの影響を増強することが報告されている。理論に拘束されずに、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、トール様受容体（ＴＬＲ）、主としてＴＬＲ９によって生来の(適応できない)免疫系を活性化することで作用する。ＴＬＲ９活性化に誘発されたＣｐＧは、ペプチドもしくはタンパク抗原、生ウイルスもしくは死滅ウイルス、樹状細胞ワクチン、自己由来の細胞ワクチン、及び予防/治療ワクチン両方の多糖類接合体を含む、種々様々の抗原に対する抗原特異性の体液細胞反応を増強する。更に重要なことには、そのＣｐＧは、ＣＤ４ T細胞の助けがない状態でさえ、樹状細胞の成熟及び分化を増強し、TH1細胞の活性化の増強、及び強力な細胞傷害性リンパ球(ＣＴＬ)生成をもたらす。ＴＬＲ９刺激により誘発されたTH1バイアスは、通常、TH2バイアスを促進するミョウバンもしくは不完全なフロイントのアジュバント(ＩＦＡ)のようなワクチンアジュバントが存在する状態でさえ維持される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、他のアジュバントと処方された場合もしくは併用して投与された場合、または微粒子、ナノ粒子、脂肪乳剤などの調製物もしくは同様の調製物の場合、さらに大きなアジュバントの活性を呈するが、それは抗原が比較的弱い場合に、強い応答を誘発するために特に必要である。いくつかの実験において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドはさらに、免疫応答を加速し、ＣｐＧなしの十分量のワクチンに対し同程度の抗体反応を伴いながら、抗原用量を約２桁低減し得る (Krieg et al 2006)。米国特許６，４０４，７０５Ｂ１は、抗原特異性免疫応答を誘発するためにＣｐＧオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバント及び抗原を組み合わせた使用について記述している。CpG TLR9拮抗薬は、本発明の薬剤組成物の好ましい成分であるMologen(ベルリン、ドイツ)によるdSLIM(ダブルステムループ免疫賦活剤)である。ＲＮＡ結合ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及び/またはＴＬＲ９などの分子と結合する他のＴＬＲが使用される。

他の有用なアジュバントの例には、化学的に修正されたCpGs (例えば、CpR、Idera)、dsRNA類似化合物（ Poly(I:C)やAmpliGen）、非CpGバクテリアDNA もしくはRNAの他にも、免疫活性小分子及び抗体（シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレブレックス、NCX-4016、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ、テモゾロマイド、テムシロリムス、XL-999、CP-547632、パゾパニブ、VEGFトラップ、ZD2171、AZD2171、抗CTLA4及びSC58175）が上げられ、これらは治療として及び/またはアジュバントとして作用し得るが、それらだけに限定されるものではない。本発明の状況において有用なアジュバント及び添加物の量及び濃度は、必要以上に実験を重ねなくても熟練した当業者により容易に決定され得る。好ましいアジュバントは、ｄＳＬＩＭ、インターフェロンα及びβ、ＣｐＧ７９０９、ＩＣ３１、ＡＬＤＡＲＡ（イミキモド）、ＰｅｖｉＴｅｒ、ＲＮＡ、タダラフィル、テモゾロミド、及びＪｕｖＩｍｍｕｎｅである。

本発明は、がん、特に神経膠腫と脳腫瘍、乳癌、前立腺癌、食道癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、皮膚の扁平上皮細胞癌とケラチノサイト腫瘍、白血病、肺癌、卵巣癌、およびメラノーマの薬剤を提供する。

本発明は、次の事項から成るキットを含む:つまり、(a) 上述の薬剤組成物（溶液または凍結乾燥物）を含む容器; (b)任意に、希釈剤もしくは、該凍結乾燥製剤用の再構成溶液を含む第二の容器、及び(c)任意に、(i)溶液の使用方法あるいは(ii)再構成方法、及び/または、該凍結乾燥製剤の使用である。

キットはさらに、(i)緩衝液、(ii)希釈剤、(iii)フィルタ、(iv)針もしくは(v)注射器を1つまたは複数を含むことがある。容器は、好ましくはバイアル、ガラス瓶、注射器もしくは試験管で、容器は多重使用容器であってよい。薬剤組成物は、好ましくは凍結乾燥される。

本発明のキットには、好ましくは適切な容器中に本発明の凍結乾燥調製物及び再構成及び/または使用の説明書が含まれる。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル(例えば、二腔バイアル)、注射器(二腔注射器など)及び試験管を含む。容器はガラスもしくはプラスチックのような様々な材料から形成される。好ましくは、キット及び/または容器は、再構成及び/または使用の方法を示す、容器あるいはその容器に関連する使用説明書を含む。例えば、ラベルは、凍結乾燥調製物が上述のペプチド濃度に再構成されることを表示してもよい。ラベルはさらに、調製物が有用であるか、あるいは皮下投与を意図するものであることを表示する。

調製物を含む容器は複数回使用バイアルであってもよい。それは再構成調製物の繰り替えし投与（例えば２〜６回投与）を許容する。キットはさらに、適切な希釈剤(例えば重炭酸ナトリウム溶液)を含む、第2容器を含んでもよい。

希釈剤と凍結乾燥調製物の混合によって、再構築調製物中のペプチドの終濃度は好ましくは少なくとも０．１５ｍｇ/ｍｌ/ペプチド(=75μg)であり、好ましくは3 mg/mL/ペプチド (=1500μg)を超えない。キットはさらに、他のバッファ、賦形剤、フィルタ、針、注射器及び使用方法の添付文書を含む、商業上及び使用者の観点から見て望ましい他の材料を含む。

本発明のキットは、他のコンポーネント(例えば、他の化合物あるいはこれらの他の化合物の薬剤組成物の有無に関わらず、本発明による薬剤組成物の調製物を含む単一容器、あるいは各コンポーネントの別個の容器を含む。

好ましくは、本発明のキットは、第2化合物の併用を組み合わせた使用に包装された本発明の製剤(例えば、GM-CSF、化学療法剤、天然産物、ホルモンもしくは拮抗薬、抗血管形成作用薬もしくは阻害剤、アポトーシス誘導作用薬もしくはキレート化剤)、または薬剤組成物それ自体を含む。キットのコンポーネントは、あらかじめ複合体を形成するか、または各コンポーネントが患者に投与する前に個別の容器内にある。キットのコンポーネントは、1つまたはそれ以上の溶液中に、好ましくは水溶液、さらに好ましくは無菌液剤中に提供される。キットのコンポーネントはまた、固体として提供され得、好ましくは他の別個の容器で提供され、適切な溶剤を添加することで液体に変換されてもよい。

治療キットの容器は、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器もしくは固体か液体を入れるその他の手段にもなる。通常、一つ以上の要素があるとき、該キットは第２のバイアル又は他の容器を含み、それは分別投与を可能にする。キットはまた、薬剤的に認容可能な液体用の別の容器を含んでもよい。好ましくは、治療キットは装置(例えば、1本またはそれ以上の針、注射器、点眼びん、ピペットなど)を含み、それは、現在のキットのコンポーネントである、本発明の薬剤の投与を可能にする。

本発明の調製物は経口、経鼻、経眼、経皮下、経皮内、経筋肉内、経静脈内、又は経皮の投与に適している。好ましくは、投与は皮下注射で、最も好ましくは輸液ポンプによる皮内注射である。

本発明は、ここで、以下の実施例の記述により、その好ましい実施形態を説明するが、この実施例だけに限られるものではない。本発明の目的のため、本明細書で引用されている全ての参考文献が、その全体の参照として組み込まれている。

図１は神経膠芽腫例ＧＢ１００６の腫瘍関連ペプチドＮＣＡＮ−００１を同定するＥＳＩ液体クロマトグラフィー質量スペクトルを示すものである。図２はペプチドＮＣＡＮ−００１関連神経膠芽細胞腫をコード化する遺伝子ＮＣＡＮのｍＲＮＡ発現プロフィールを示すものである。この遺伝子の発現は、正常組織では起こらないか、起きても非常に低く、一方、神経膠芽細胞腫サンプル（ＧＢ１００６ＴからＧＢ１０１１Ｔ；ＮＣＨ３５９Ｔ及びＮＣＨ３６１Ｔ）において強く発現する。図３は、遺伝子ＢＩＲＣ５の相対ｍＲＮＡ発現プロフィールを描いたものである。この遺伝子の発現は、正常組織では存在しないか非常に低いが、一方腫瘍サンプルでは強く増大する。図４ａと４ｂはＩＦＮγ−ＥｌｉＳｐｏｔにより決定された、ワクチン接種患者の異なる時点における末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＰＳＭＡとサービビン特異的ＩＦＮγ−分泌ＣＤ４+Ｔ細胞の存在を示すものである。時点：ワクチン接種前（ａ）と、ワクチン接種後３（ｂ）、６（ｃ）、７（ｄ）、８（ｅ）、９（ｆ）、１０（ｇ）、１１（ｈ）．同上図５はＩＣＳアッセイにより決定された、ワクチン接種患者の３つの異なる時点でのＰＢＭＣ中のサービビン特異的ＩＦＮγ−、ＩＬ−５，ＩＬ−１０，ＴＮＦα分泌ＣＤ４+Ｔ細胞を示すものである。時点：ワクチン接種後１（a）、３（ｂ）、７（ｃ）。図６は、患者８と１０の生化学的反応を示すものであり、ベースラインＰＳＡから１０％上回る上昇はなくＰＳＡ安定性を示している。図７は、患者１１と１６の生化学的反応示すものであり、ＰＳＡ安定性がない状態でＰＳＡＤＴの増加を示している。図８は、患者５と１６の生化学的反応示すものであり、ＰＳＡ安定性がない状態でＰＳＡＤＴの増加を示している。図９は、患者１，４，１０，１２，１３の生化学的反応示すものであり、ワクチン接種中にＰＳＡＤＴの変化がないことを示している。図１０は、患者２、６、９、１４、１８、１９の生化学的反応示すものであり、ワクチン接種中にＰＳＡＤＴの変化がないことを示している。図１１は、患者７，１５，１７の生化学的反応示すものであり、 PSA 中間値の減少またはＤＴ減少後のＤＴの増加を示している。図１２は、前立腺癌ワクチン接種の研究で、ＢＩＲ−００２ペプチド特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンが、ＢＩＲ−００２に応答するＩＦＮγ生成に関する能力がある数名のワクチン接種癌患者から確立できることを、示したものである。 Wang et al., 2008 は、ワクチン接種により患者にＴ細胞が誘発可能である一方、in vitroのプライミングと刺激を数回行った後の健常なドナーから得たＴ細胞クローンのみについて説明している。ＰＭＡ／イオノマイシン = 抗原独立非特異的活性化、サービビン（ＩＩ）：ＢＩＲ−００２刺激：ＰＳＭＡ（ＩＩ）：関連性のないペプチドによる刺激すべての反応細胞はＣＤ４＋である。図１３は、ＢＩＲ−００２が樹状細胞によって天然に存在することを示すものである。組み換えサービビンタンパク質でインキューベートした未成熟樹状細胞は、細胞内サイトカイン染色で示されるように、ワクチン接種患者のＢＩＲ−００２特異的Ｔ細胞によって認識される。これらの結果は、ＢＩＲ−００２が樹状細胞内のプロテイナーゼによって天然に処理され、ＢＩＲ−００２エピトープは処理によって破壊されないことを示唆している。さらに、これらのＣＤ４＋Ｔ細胞は、サイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ２を分泌し、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）の表面発現を有し、ＤＣ１０７ａの表面発現で示されるように脱顆粒するので、多機能性である。Ｔ細胞が、関連性のないタンパク質ＲＡＰ８０またはＨＩＶ００１ペプチドでインキュベートした樹状細胞によって活性化されるので、上記に記載のＴ細胞応答は、抗原特異的である。図１４は、ＢＩＲ−００２ワクチン接種前立腺癌患者に由来のＢＩＲ−００２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の高い分画が、有益なサイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ２を発現する一方、免疫調節サイトカインＩＬ１０とＩＬ１７はこの範囲まで発現されないことを、示したものである。ＢＩＲ−００２特異的Ｔ細胞または２つの制御クラスＩＩ制限ペプチドの細胞内サイトカイン染色による主なデータと要約データを示している。図１５は、異なるＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現する数個の腫瘍細胞株が、患者由来のＰＢＭＣ（患者Ｐｒｏ２６とＰｒｏ１５について示す）によって認識されることを示したものである。. それ故、 1. 患者はＢＩＲ−００２のワクチン接種後マルチクロナールＴ細胞の応答を発現する； 2. ＢＩＲ−００２は、数個のＨＬＡ−ＡクラスＩＩ対立遺伝子、ＤＲ１（Wang et alを参照）、ＤＱ５（ Wang et alにより試験されていない）、ＤＲ１１（ Wang et alも参照）またはＤＲＢ３（Wang et al., 2008表１と対照的）と結合する無差別性を示す；3. ＢＩＲ−００２の機能提示は、いくつかのＨＬＡクラスＩＩ分子（ＴＮＦα生成）の状況から可能である。原理的にはＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ）に関しても、３つの異なる遺伝子座が細胞表面の機能的クラスＩＩ分子、つまりＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＲを発現するＨＬＡクラスＩＩに認められる。クラスＩ分子は、３つすべての遺伝子内で一定である、重鎖（-A, -B, -C）とβ２−ミクログロブリンから成る。それにもかかわらず、クラスＩＩ分子は、各々変動する２つの鎖（αとβ）から成っている。そのため、高度な遺伝子タイピングは常にクラスＩＩでは複雑になります。表では、抗体結合に基づいて、いわゆる血清学的タイプが与えられている。そのため、たとえば"ＤＱ３"は、一般的に一緒に見出され特定抗体と反応するＨＬＡ−ＤＱαの別な対立遺伝子を含んでいる。それらの細胞を表中に示す。

ＳＥＱＩＤＮｏ．１からＳＥＱＩＤＮｏ．3まではサービビン由来の本発明腫瘍関連ペプチドの配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮｏ．４からＳＥＱＩＤＮｏ．１３およびＮｏ．２４までは本発明で使用される他の腫瘍関連ペプチドの配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮｏ．１４はＨＢＶペプチドの配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮｏ．１５からＳＥＱＩＤＮｏ．２３までは本発明で使用される他の腫瘍関連ペプチドの配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮｏ．２５からＳＥＱＩＤＮｏ．２７まではWang et al. (WO 2007/036638)の関連ペプチドの配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮｏ．２８からＳＥＱＩＤＮｏ．３３までは、Piescheの腫瘍関連ペプチドの配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮｏ．３４からＳＥＱＩＤＮｏ．６３までは、実施例３でデザインしたペプチドの配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮｏ．６４からＳＥＱＩＤＮｏ．６５までは、実施例4でデザインしたペプチドの配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮｏ．６６からＳＥＱＩＤＮｏ．７２までは、実施例5でデザインしたペプチドの配列を示す。

細胞表面に提示される癌関連ペプチドの同定
組織サンプル
患者の腫瘍及び健常組織は、Hopital Cantonal Universitaire de Geneve （腫瘍免疫学癌治療研究室）とNeurochirurgische Universitats-Klinik Heidelberg（Molekularbiologisches Labor）から提供された。手術前にすべての患者から書面でインフォームドコンセントを得た。組織は、術後直ちに液体窒素で衝撃冷凍し、ペプチドを単離するまで−８０℃で保存した。

組織サンプルからのHLAの単離
衝撃冷凍した組織サンプルのＨＬＡペプチドプールは、わずかに改変したプロトコール（Falk, K. et al 1991;Seeger, F.H. et al.T 1999）に従い、 HLA-A*02特異抗体ＢＢ７．２またはＨＬＡ−Ａ，−Ｂ，−Ｃ特異抗体Ｗ６／３２、ＣＮＢｒ活性化セファロース、酸処理、及び限外ろ過により、固体組織から免疫沈降によって得た。

方法２：
得られたＨＬＡペプチドプールをその疎水性に従い逆相クロマトグラフィー（ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｔｅｒｓ）により分離し、溶出するペプチドは、ＥＳＩ源付きLTQオービトラハイブリッド質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）で分析した。ペプチドプールを１．７μｍＣ１８逆相充填剤（Waters）が詰まった分析用溶融シリカミクロキャピラリーカラム（７５μｍｘ２５０ｍｍ）に、流速４００μＬ／ｎＬで直接装填した。その後ペプチドを，流速３００μＬ／分で１０％から３３％まで，２段階の１８０分バイナリ勾配をかけて分離した.．勾配は，溶媒Ａ（０．１％蟻酸水溶液）と溶媒Ｂ（０．１％蟻酸アセトニトリル溶液）から成る．金被覆ガラスキャピラリー（PicoTip, New Objective）を微少ESI源の導入に使った。ＬＴＱ−オービトラ質量分析計をＴＯＰ５戦略でデータ依存モードで操作した．手短に，オービトラップで（Ｒ＝３００００），高い質量精度の全スキャンを用いてスキャンサイクルを開始し，続いて，以前に選択したイオンを動的排除した5つの最も豊富な前駆体イオン上で，オービトラップ内で（Ｒ＝７５００）ＭＳ／ＭＳスキャンを実施した．タンデム質量スペクトルは，SEQUESTと別な手動コントロールで解釈された．同定したペプチド配列は、発生した天然ペプチドの断片化パターンを、合成配列の同一参照ペプチドの断片化パターンと比較して確認した。図１は、ＭＨＣクラスＩ関連ペプチドＮＣＡＮ−００１に対する腫瘍組織から得た代表的なスペクトルを示す。

本発明のペプチドをコード化する遺伝子発現プロフィール
ＭＨＣ分子による腫瘍細胞表面に提示されて同定されたペプチドすべてが、免疫療法に適しているとはいえない。その理由は、多くのペプチドが多数の細胞タイプにより発現された正常の細胞タンパク質に由来しているからである。これらのペプチドのほんの僅かだけが、腫瘍に関連しており、由来する腫瘍を認識するのに高い特異性を有するＴ細胞を誘発できる傾向を有している。このようなペプチドを同定し、ワクチン接種により誘発される自己免疫のリスクを最小限にするため、本発明者は多数の正常組織と比較して、腫瘍細胞で過剰発現されるタンパク質に由来するこれらのペプチドに焦点を当てた。

理想的なペプチドは、腫瘍に特異的で他の組織には提示されないタンパク質に由来することである。理想的なペプチドに近い発現プロフィールを有する遺伝子に由来するペプチドを同定するために、同定したペプチドを、それらが由来するタンパク質と遺伝子にそれぞれ割り当て、これらの発現プロフィールを生成した。

ＲＮＡ源と予備調製
手術で取り除いた組織標本は、各患者から書面でインフォームドコンセントを得た後、２ヶ所の別な臨床施設（実施例１を参照）から提供された。腫瘍組織標本は、術後直ちに液体窒素でスナップ冷凍し、その後液体窒素下で乳鉢と乳棒を使い均質化した。ＲＮＡは，ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてこれらのサンプルから調製し，続いてＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でクリーンアップした．両方法とも製造業者プロトコールに従って実施した．

ヒト健常組織の総ＲＮＡは、市販で得た（Ambion, Huntingdon, UK; Clontech, Heidelberg, Germany; Stratagene, Amsterdam, Netherlands; BioChain, Hayward, CA, USA）。数名の個人（２名から１２３名の間）から得たＲＮＡを混合して、個々のＲＮＡを等しく加重した。白血球は４名の健常ボランティアの血液サンプルから単離した。

すべてのＲＮＡサンプルの質と量は、RNA 6000 Pico LabChip Kit (Agilent).を用いてAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Germany) で測定した。

マイクロアレイ実験
腫瘍及び正常組織のＲＮＡサンプルすべての遺伝子発現解析は、Affymetrix Human Genome (HG) U133A または HG-U133 Plus 2.0 オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Affymetrix, Santa Clara, CA, USA）で実施した。 All steps were carried out according to the Affymetrix manual.簡単にいうと、二本鎖cDNAは、取扱説明書の記載通り、SuperScript RTII (Invitrogen) と oligo-dT-T7 primer (MWG Biotech, Ebersberg, Germany) を用いて、合計5-8 μg のRNAから合成した。in vitro転写は、U133A アレイにはBioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, USA)で、U133 Plus 2.0 アレイにはGeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix)で実施し、続いて cRNA のハイブリダイゼーション、及び染色は、ストレプタビジン−フィコエリスリンとビオチン化抗ストレプタビジン抗体を用いて実施した。画像はAgilent 2500A 遺伝子アレイスキャナー (U133A)またはAffymetrix 遺伝子チップスキャナー 3000 (U133 Plus 2.0) でスキャンし、データは全パラメータの初期設定値を用いて GCOSソフトウェア（Affymetrix）で解析した。正規化は、Affymetrixにより提供された１００個のハウスキーピング遺伝子を使った相対的発現値は、ソフトウェアで得たシングルログ比から計算した、正常サンプルは適宜１．０に設定した。

本発明のペプチドＮＣＡＮ−００１であるソ―ス遺伝子ＮＣＡＮの発現プロフィールは、遺伝子が正常組織中で非常に低いレベルで発現されるか否かには関係なく、神経膠芽細胞腫の腫瘍細胞中で高く発現することを示している（図２）。

サービビン由来ＨＬＡ−ＤＲモチーフペプチド（swissprot:O15392）
エピトープ予測：ＨＬＡ−ＤＲリガンドの可能性の予測は、www データベースSYFPEITHIを使って実施された。簡単に、サービビン配列は、各々のＨＬＡ−ＤＲモチーフに適合する１５merペプチドの９量体コア配列内のアミノ酸すべてを評価する、マトリックスパターンに対してスクリーニングされた。ペプチド内の特定部位に対するアミノ酸の優先傾向を反映しながら、アンカー残基は最大１０、他の残基は最大３まで与えられる候補ペプチドの理論的最大スコアは、２８から４３まで様々であり、多数の天然リガンドのスコアは通常20を超えている。

TLGEFLKLDRERAKN （SEQ ID No. 1）（または欠失型）は、６回の予測のうち５回まで最高スコアのペプチド間に現れる。

DRB1*01 （理論的最大スコア４３）
58FFCFKELEGWEPDDD (SEQ ID No. 34)36
98LGEFLKLDRERAKNK (SEQ ID No. 35)28
22FKNWPFLEGCACTPE (SEQ ID No. 36)28

DRB1*03（理論的最大スコア 40）
99GEFLKLDRERAKNKI (SEQ ID No. 37)29
10WQPFLKDHRISTFKN (SEQ ID No. 38)26
3APTLPPAWQPFLKDH (SEQ ID No. 39)25

DRB1*04（理論的最大スコア 28）
98LGEFLKLDRERAKNK (SEQ ID No. 40)28
10WQPFLKDHRISTFKN (SEQ ID No. 41)28
3APTLPPAWQPFLKDH (SEQ ID No. 42)26

DRB1*07（理論的最大スコア 34）
121KKEFEETAEKVRRAI (SEQ ID No. 43)24
128AEKVRRAIEQLAAMD (SEQ ID No. 44)24
3APTLPPAWQPFLKDH (SEQ ID No. 45)22
16DHRISTFKNWPFLEG (SEQ ID No. 46)20
28LEGCACTPERMAEAG (SEQ ID No. 47)18
40EAGFIHCPTENEPDL (SEQ ID No. 48)18
93FEELTLGEFLKLDRE (SEQ ID No. 49)16
103KLDRERAKNKIAKET (SEQ ID No. 50)16

DRB1*011（理論的最大スコア 38）
98LGEFLKLDRERAKNK (SEQ ID No. 51)32
83GCAFLSVKKQFEELT (SEQ ID No. 52)24
58FFCFKELEGWEPDDD (SEQ ID No. 53)22

DRB1*15（理論的最大スコア 34）
95ELTLGEFLKLDRERA (SEQ ID No. 54)30
19ISTFKNWPFLEGCAC (SEQ ID No. 55)28
55AQCFFCFKELEGWEP (SEQ ID No. 56)28

配列決定に導くステップ
1. 各ペプチドにおいて、9mer コア配列はＨＬＡ−ＤＲ結合に必要である。予測されるコア配列は以下の通りである。
DRB1*01 FLKLDRERA (SEQ ID No. 57)
DRB1*03 LKLDRERAK (SEQ ID No. 58)
DRB1*04 FLKLDRERA (SEQ ID No. 59)
DRB1*11 FLKLDRERA (SEQ ID No. 60)
DRB1*15 LGEFLKLDR (SEQ ID No. 61)

2. コア配列を組み合わせて以下のような１つの乱雑なコア配列を得る。
組み合わせ配列： LGEFLKLDRERAK (SEQ ID No. 62)

3. 隣接配列を最終長である１５アミノ酸に追加する。
最終配列： LGEFLKLDRERAK (SEQ ID No. 63)

ＳＥＱＩＤＮｏ．１ペプチドの免疫原性を確認するために、臨床試験を実施した。
試験の主な目的は、明白な転移病変が検出されずに根治的前立腺切除術の施行後、生化学的に再発した患者を対象とした、前立腺特異的ペプチドパネル（ワクチン接種療法）の皮下注投与に対するＰＳＡ（前立腺特異抗原）に基づく奏効を検討することであった。

試験の２番目の目的は、Ｔ細胞応答の免疫学的挙動について特別な考慮を持つ前立腺癌患者を対象とした、ワクチン接種療法投与の忍容性と実現性を検討することであった。

試験は、"明白な転移病変を検出することなく根治的前立腺切除術を施行後生化学的に再発"の徴候に対するプロスペクティブランダム化第I/II相試験としてデザインされた。

試験集団
この第I/II相試験の一部として、根治的前立腺切除術後に生化学的再発した HLA-A^*02⁺患者において、前立腺特異的ペプチドパネルのワクチン接種による腫瘍増殖停止の指標として、患者PSA退縮を誘発させる試みが行われた。前立腺特異的ペプチドの組み合わせが皮下投与され、抗原性構造の様々な投与形態の状況で各免疫応答が評価された。.

以前のワクチン接種試験に比べ、計画された試験では、画像診断では検出不可能なほど少い腫瘍量を持つ患者の治療を目標とした。患者は全員、既知の前立腺特異的抗原性構造を使った同一の方法で免疫化され、悪性に形質転換した細胞への免疫応答を強化した。１９名の患者治療された。

表７：試験集団

治療スケジュール
事前の根治的前立腺切除術後にＰＳＡ再発が検出された（14日間以上の間隔で２回測定し、PSA が 50% 上昇した）患者に、ＣＴと骨シンチグラフィーにより明白な転移病変を排除した後、前立腺特異的ペプチドワクチンが異なる投与形態で皮下投与された。ワクチンは０，７，１４，２８，４２，５６日目に８倍投与された（ペプチド注射１回につき約１００ｍｇ）。各ワクチン接種後と７０日目の再接種後にＰＳＡを測定し、治療の奏効を評価した。

腫瘍の応答（完全寛解 [ＰＳＡ−ＣＲ]、部分寛解 [ＰＳＡ−ＰＲ]、または安定な臨床経過[変化なし、[ＰＳＡ−ＮＣ])）が検出される場合、患者は、選択した投与形態で維持療法として毎月１回ワクチンを接種した。ワクチン接種に対する患者の奏効は以下のように詳細に評価された。

完全寛解（ＰＳＡ−ＣＲ）：初期に上昇したＰＳＡレベルの正常化が、少なくとも４週間隔後の測定で確認される。正常化はＰＳＡ最低値が＜０．２ｎｇ／ｍｌと定義され、全腫瘍または全前立腺の根治的切除術後に得られることが期待される。

部分寛解： a) ＰＳＡ−ＰＲ≦８０％（初期に上昇したＰＳＡ値の８０％減少が、少なくとも４週間隔後に確認される、b) ＰＳＡ−ＰＲ≦５０％（初期に上昇したＰＳＡ値の５０％減少が、少なくとも４週間隔後に確認される）。

病態安定（ＰＳＡ−ＳＤ）：４週間以上にわたち有意な変化がない。これには、安定化および５０％未満の減少および１０％未満の上昇が、少なくとも４週間隔後の測定で確認されることが含まれる。

病態進行（ＰＳＡ−ＰＤ）：ＰＳＡレベルが１０％を超えて上昇する。ＰＳＡの進行が起きた場合は試験を中止する。

患者の本試験への登録後、エピトープ特異的ワクチンを使用し、前立腺扁平上皮細胞（例、ＰＳＭＡ／ＰＳＣＡ）に特異的に発現するタンパク質を考慮した。ＰＳＡのモニタリングにより評価される残存腫瘍画分の増殖モニリングに関連した、投与ワクチンの有効性を検討するのに加え、本試験では免疫系の効果的な調節に関連した、様々なワクチン接種法の効果も検討した。本発明だけに従うペプチドの単純な皮下投与に加え、色々なアジュバントの併用も使用した。ワクチンは、ＰＳＡ，ＰＳＣＡ，ＰＳＭＡ．サービビン、ＴＲＰ−Ｐ８およびＰｒｏｓｔｅｉｎ由来ペプチドの６つ以上の組み合わせを含んでいる。インフルエンザＭＰ由来ペプチドを陽性コントロールとして使用した。ＰＳＭＡとサービビン由来ペプチドをＴヘルバーのエピトープに使用した。特に、最近非常に好評である、 Montanide （ヒトに適した従来の不完全フロイドアジュバント製剤）のペプチドワクチンに対するデポーおよびアジュバント活性を使用した。この目的では、ペプチド溶液５００μｌをMontanide ５００μｌに混合して投与した。これにより、油中水滴エマルジョンが形成され、水相に含まれる抗体が数週間かけてゆっくり放出される。このエマルジョンの物理的安定性は非常に高く、４℃で、明らかな相分離をせずに３ヶ月を超えて保存できる。 Montanide のデポー製剤としての機能は、数件のワクチン接種臨床試験で良い結果を得て開発された（Oka et al., 2004）。

試験の１群では、増殖因子ＧＭ−ＣＳＦの製剤である LeukineR 溶液注射により、免疫系の同時刺激中にワクチン接種の効能を検討した。ＧＭ−ＣＳＦはペプチドワクチン接種の臨床試験で非常に一般的に使用されるアジュバントであり、その臨床的なＴ細胞応答の強化が数件報告されている。最初に、ＧＭ−ＣＳＦはワクチン注入部位で樹状細胞数を高めると考えられる、樹状細胞の補充／分化因子である。ＧＭ−ＣＳＦはそれ自身では、樹状細胞とマクロファージとして細胞を提示する抗原を活性しないが、in vivoでの間接的活性化が報告されている（Molenkamp et al., 2005）。

別の試験群では、イミキモドの経皮投与による樹状細胞の同時活性化中のワクチン接種の有効性を検討した。イミキモドは５％軟膏（Aldara）として投与した。イミキモドはＴＬＲ７陽性細胞（例、形質細胞腫ＤＣ、ランゲルハンス細胞、皮膚ＤＣ）への作用を通じて強い免疫刺激作用を有し、Ｍｙｄ８８依存経路を活性化する。活性化ＡＰＣはＴ細胞刺激と炎症性サイトカインを遊離し、共刺激をアップグレードし、流入領域リンパ節まで移動する。抗原を軟膏内に混合するか、抗原の経皮注または皮下注部位にAldaraを塗布することによりペプチド誘発ＣＴＬ応答を高めるという、イニキモドの可能性が動物実験で示された。

別の試験群では、樹状細胞をムチン−１をコード化するプロタミン安定化ｍＲＮＡと混合してＴＬＲ７／８を活性化することにより、樹状細胞の同時活性化中のワクチン接種の有効性を検討した。製剤中に多塩基タンパク質プロタミンが存在すると、ｍＲＮＡの半減期が増大し、デポー形成の可能性のある粒子形成を誘発する。そのためこのアジュバントはデポー形成とＡＰ活性化の性質を兼ね備えていることがある。

要約すると、ワクチンの投与形態には以下の方法が含まれる。
a) Montanide中で乳化されたペプチドワクチンの皮下投与；
b) 増殖因子の同時投与によりより強力な免疫応答を得る目的でＧＭ−ＣＳＦ２２５μｌの局所投与を併用した、Montanide ５００μｌ中で乳化したペプチドワクチンの皮下投与；
c) 熱で誘発されるより強力な免疫応答を得る目的で後に与えられる、局所温熱療法と併用した、Montanide ５００μｌ中で乳化したペプチドワクチンの皮下投与；
ｄ）ＴＬＲ７を介して樹状細胞を活性化するためにイミキモド経皮投与を併用した、Montanide ５００μｌ中で乳化したペプチドワクチンの皮下投与；
e) ＴＬＲ７／８によって樹状細胞を活性化するためにムチン１ｍＲＮＡ／プロタミン５５μｌとともに、Montanide ５００μｌ中で乳化したペプチドワクチンの皮下投与。

スケジュール
全試験期間は３年であった。前立腺特異的ペプチドワクチンは０，７，１４，２８．４２，５６日目に患者に投与された。
病態安定または目的とする腫瘍応答（ＰＳＡ−ＣＲ、またはＰＳＡ−ＰＲ）を持つ患者は、検出可能な進行が起こるまで毎月１回皮内注でワクチン接種を受けたこれまで得られる経験に基づいて、ペプチド注射は有意な有害反応なしで忍容されている。ワクチン接種療法への奏効は、ＰＳＡ測定に基づき血清学的にのみに評価されるので、検査は臨床試験の開始時に実施され、臨床奏効をシミュレートできる可能性があるin vitroのＰＳＡ測定を投与ワクチンが妨害するか否かを決定する。０，７，１４，２８，４２，５６，７０日目に、臨床検査、ＰＳＡレベル、白血球百分率、ＦＡＣＳ分析およびサイトカイン測定用に血液サンプルを採取した。治療を７０日目を過ぎて継続する場合、時宜な方法で治療失敗を見つけるために、６週間のＰＳＡモニタリングが実施された。

ＰＳＡ上昇が継続するという点からみて疾病の進行が確認されれば、治療は終了された。

８４日目で開始した免疫療法は、病態進行が確認までまたは最大４２０日間（１５ヶ月間）まで、４週間隔で継続された。本試験外に治療（成功例）を継続する決定は症例毎に基づいてなされた。予想外の有害反応は本試験では発生しなかった。

臨床検査では、血液凝固、電解質、ＬＤＨ，β２Ｍ、ＣＫ，肝酵素、ビリルビン、クレアチニン、尿酸、総タンパク質、血液凝固、ＣＲＰ，塗抹による白血球百分率、ＰＳＡレベル、サイトカイン、ＦＡＣＳ，Elispotを測定した。

確認された細菌および真菌抗原に対する皮膚反応の分析は（投与４８−７２時間後の遅延型過敏症（ＤＴＨ）と介入Ｔ細胞）、試験開始前の患者の細胞免疫系分析として役立つ。

試験に必要なペプチド（ノナペプチド：9個のアミノ酸からなるペプチド）は、 Prof. H.-G. Rammenseeの学部のPD Dr. Stefan Stevanovic研究室で製造された。
これらのペプチドはＨＰＬＣで精製し、質量分析計で分析された。ペプチドの純度はＨＰＬＣ，質量分析計、Ｅｄｍａｎ配列決定により確認することもできる。これらの方法により、最大９８％までの純度が確認できる（現状の方法で最大とみなされる値のはずである）。合成ペプチドはＤＭＳＯ（CryoSure, WAK Chemie Medical GmbH；１０ｍｇ/ｍｌ）に溶解させ、Ampuwa（Fresenius Kabi）で１：１０に希釈し、滅菌状況下で分取した。

臨床奏効
患者2名に継続的なデジタル直腸検査によって局所腫瘍が発見された後に，ＰＥＴ−ＣＴスキャンで局所再発を発見できた。残る17名の患者では、疾病活性の場所を試験終了時には確認できなかった。

白血球百分率または広範な臨床検査の評価を繰り返しても試験期間中にいかなる異常も変化も発見されなかった。

19名の患者のうち16名がＳＥＱＩＤＮo.１に従うサービビンＩＩペプチド（IFN-g ELISPOT, +/- ICS）に反応した。これらのうち12名がワクチン接種で抗サービビンＴ細胞応答の誘導を有し、2名は事前に抗サービビンＴ細胞が存在し、2名は事前に抗サービビンＴ細胞が豊富に存在したどうかは確認されなかった。

生化学的奏効
完全奏功とは、ＰＳＡの初期上昇後共同作業している検査室での検出可能最小値に従い、ＰＳＡが検出不能と考慮された場合である。測定は4週間以上の間隔後に確認されなければならなかった。従って、> 80% と > 50% の部分奏効（ＰＲ）は、4週間後に再評価されなければならなかった。少なくとも4週間後にＰＳＡが５０％未満の低下または１０％未満の上昇範囲内と確認されれば、病態安定を示した。病態進行は、治療開始時にＰＳＡの上昇が１０％を超えた場合とした。

試験を中止した患者の生化学的奏効は、局所放射線照射または内分泌療法の追加療法を受けるまで追跡された。 19名が試験の参加に同意し、データが最長約3．75年継続するフォローアップにより解析された。

ＰＳＡ安定性とＤＴの増加
患者2名（１０．２％）のＰＳＡ値は上述した生化学的奏効基準に従う安定を呈し、治療開始時に１０％を超えていたＰＳＡ値の上昇は試験終了時には発生しなかったことをはっきり示した（図６，表８，９，１０）。最後のワクチンを投与後、これらの2症例のフォローアップは14ヶ月と16ヶ月実施された。病態安定の平均期間は、平均１８ヶ月（１４と２０ヶ月）のワクチン接種でカットオフしたデータで２４ヶ月（２８と３１ヶ月）であった。

これら２名の患者1名は、９ヶ月間に部分奏効＞５０％を示し、その後ゆっくりとしたＰＳＡの上昇期間が続き、倍加時間はワクチン接種前の9．8ヶ月に比べ20．5ヶ月となった。最初のＰＳＡ再発はpT2pN0 Gleason 5 腫瘍の手術後18ヶ月で始まった。

データ解析では、患者８はワクチン接種プログラム開始２８ヶ月前から病態安定を呈した。この患者は１０ヶ月後１４回目のワクチン接種後、アレルギー反応のため投与を中止した。この患者は前立腺切除後ＰＳＡ最低値が０．６ｎｇ／ｍｌ以上でpT3b Gleason 3＋４という好ましくない状況となり、術後早期には低下したがすぐにPSA進行となった。倍加時間は6．6ヶ月から１４８ヶ月まで延びた

これら2名の患者は、各ペプチドのワクチン接種の注入部位の皮膚にイミキモドを塗布した（図９，図１０，図１１，表１３）。

PSA 安定性がないPSA DT の増加
患者１１のPSA DTは試験6ヶ月の試験期間中に1．5ヶ月から10．1ヶ月に延びた。この患者は、PSA１０．８ｎｇ／ｍｌ開始し、１７．８ｎｇ／ｍｌまで悪化したので試験を中止し、PET-CTでは視覚的に悪性病変はなく抗アンドロゲン単剤療法を受けた。そして、アジュバントとしてAldara が投与された。

患者１６は、倍加時間６．１ヶ月であり、ワクチン投与とムチン１−ｍRNA／プロタミンの併用で開始した。ＰＳＡの速度は5ヶ月間で半減期2．7ヶ月まで低下し、続いてＰＳＡＤＴ上昇の統計的計算値14．4ヶ月となり、それは治療開始後16ヶ月間続くことになる。この患者の初期ＰＳＡ値は０．２９ｎｇ／ｍｌであり、試験治療開始5ヶ月間で０．１９ｎｇ／ｍｌに低下し、次の8ヶ月で０．４ｎｇ／ｍｌまで上昇し、治療開始１９ヶ月後プロトコール値が０．４１ｎｇ／ｍｌであるため試験を中止した（図７，表８と１０）。

ＰＳＡ進行
患者５は、ワクチン接種前に推定ＰＳＡ倍加時間から判断して試験中に病態が進行した。しかし、この患者は、データカットオフで10ヶ月の継続期間に、治療終了後半減期20．2ヶ月というＰＳＡ低下を体験した。この患者はワクチン接種終了後２回目の治療をうけなかった。ただのアジュバントとしてMontanideでワクチン接種を受けた（図８、表１３）。

表８：毎月のＰＳＡ倍加時間

表９：ベースラインＰＳＡの１０％を上回るほどの上昇しないＰＳＡ安定性

表１０：ワクチン接種中のＰＳＡＤＴの恒久的増加

表１１：ワクチン接種中ＰＳＡＤＴ(月）は変化なしただしその後低下

表１２：ＰＳＡＤＴ中間値の低下／安定性（月）その後急上昇

表１３：アジュバントと患者の奏効

合成
ペプチドはＡｂｉｍｎｅｄ製ＥＰＳ２２１型完全自動ペプチド合成機で合成された。合成プログラムはメーカーの標準プロトコールに従う。各ペプチドに対する試薬バッチ数を可能なだけ多く登録する。

粗ペプチドの処理
粗ペプチドの処理は、合成樹脂で分離し、ＴＦＡ／フェノール／エタンジチオール／水（各々の容量パーセントは９０／３．７５／１．２５／２．５／２．５）により、１〜3時間側鎖保護基を遊離させて行った（アルギニンを伴うペプチド）。粗ペプチドをメチル-tert-ブチルエーテルで沈殿させ、メチル-tert-ブチルエーテルで1回ジエチルエーテルで2回洗浄し、乾燥させ、酢酸中でペプチドペレットを溶解させた。ジエチルエーテルで再度沈殿させ、乾燥させ、水で再懸濁させ、凍結乾燥させた。

ＨＰＬＣの準備
２５０ｘ１０ｍｍＣ１８μｍ（Ｚｉｅｍｅｒ製）カラムのＶａｒｉａｎ製ＳｔａｒクロマトグラフィーＨＰＬＣシステムを使用した。移動溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、移動溶媒Ｂ：０．０８％ＴＦＡアセトニトリル溶液。分離勾配はペプチドの疎水性に基づく。分離したペプチドは凍結乾燥される。

分析
各ペプチドを、ＨＰＬＣクロマトグラムとＭＡＬＤＩ質量スペクトルを記録し、その同定（質量スペクトルの分子量により）と純度（ＨＰＬＣクロマトグラムのピーク領域から）を証明した。

合成ペプチドと刺激
刺激と機能検査に使用する合成ペプチドは、ＨＩＶ由来エピトープ（HIV gag 164-181:YVDRFYKTLRAEQASQEV (SEQ ID No:65)、陰性コントロール）、PSMA 459-473:NYTLRVDCTPLMYSL （SEQ ID No:64）およびサービビン97-111TLGEFLKLDRERAKN (SEQ ID No:1)である。ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（SEB, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany）を、インターロイキンγＥＬＩＳＰＯＴ中のＣＤ４＋Ｔ細胞の陽性コントロールの刺激として使用した。

特異的Ｔ細胞のin vitro増幅
前立腺癌患者の末梢血単核細胞は、ワクチン接種中の異なる時間に取得し、９０％仔牛胎児血清と１０％ＤＭＳＯの液体窒素中で低温保存した。解凍後、約５ｘ１０^６個の細胞を、３７℃、７．５％ＣＯ_２で、 50U/ml ペニシリン、 50 g/ml ストレプトマイシン（すべて Biowhittaker、Verviers、ベルギー)、10% 熱不活性型ヒト血清(c.c. pro、Neustadt、ドイツ) および50 M βメルカプトエタノールで栄養補給されたＩＭＤＭ溶媒中で培養した（Greiner Bio-One, Frickenhausen, ドイツ製24ウェル細胞溶媒プレート）。プールされた合成ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを、各５ g/ml で１日目に加え、培養物に組み換えヒトＩＬ−２（r-hIL2、R&D Systems GmbH、Wiesbaden, ドイツ）を、Ｔ細胞を刺激する２，５，７、９日目に補給した。

酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）法
拡大したＴ細胞の機能を、ＣＩＭＴモニタリングパネル（www.c-imt.org）の勧告に従って標準のインターフェロンγＥＬＩＳＰＯＴ法で試験した。簡単に、細胞を１２日間培養後に、ＥＬＩＳＰＯＴプレート（Millipore、Schwalbach、ドイツ）培養溶媒中で収穫し、洗浄し、計測し、播種した。０．１５と０．２５ｘ１０^６細胞を、合成ペプチド２．５μｇ／ｍｌあるいはＳＥＢ１μｇ／ｍｌの共存下で２回または３回試験した。ＩＦＮγの生成を、３７°Ｃ、５％ＣＯ_２で２６時間インキュベートした後、１対の特異的モノクロナール抗体（1D1-k および 7-B6-1、Mabtech、Nacka Strand、スウェーデン）で検出した。過剰のAvidinアルカリホスファダーゼおよび BCIP/NBT 基質（いずれもSigma-Aldrich）をそれぞれ１時間後と１０分後に加えた。 ELISPOT 分析をImmunoSpot リーダー（シリーズ 3A と5、Cellular Technology Ltd、 Aalen、ドイツ)によって実施した。

細胞内サイトカイン染色
ELISPOT から回収した細胞を、2 ng/ml r-hIL2 共存下でさらに９日間培養した。この再刺激期間後、メーカーの指示に従って、Golgi-STOP (BD Biosciences, Heidelberg, Germany) 共存下でペプチド 5 g/mまたは PMAおよびイオノマイシンによる標準的アッセイで、エフェクターを収穫し、洗浄し、刺激した。６時間のインキュベート後、細胞を PBS 1%FCS 0.02% NaN₃で洗浄し、モノクロナール抗体、(MoAb) CD4-APC-Cy7 (BD Biosciences) と CD8-PE-Cy7 (Beckman Coulter) で暗室で 4°C 、 20 分間染色した。洗浄後、細胞をCytofix/Cytoperm reagent （BD Biosciences）で20分間透過させた後、細胞内サイトカインを30分間染色した。使用したMoAb は、 IFN- -FITC、IL-10-PE （いずれも BD Biosciences）、IL-5-APC （Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, ドイツ）および TNF- -Pacific Blue （Biolegend、San Diego、CA）である。細胞の捕獲はソフトウェア Diva と、 FlowJo （BD Biosciences）による分析によって Cytometer Canto II 上で実施した。

BIR-11、BIR-12および BIR-13のHLA-A*0211への結合
この分析目的は、BIR-004 （ELTLGEFLKLDRERAKN (SEQ ID No:2)) C末端ペプチドの HLA-A^*0211 対立遺伝子によりコード化されたMHC 分子への親和性を、ペプチドをC末端アスパラギン残基と結合させる能力（報告ずみ）を有する対立遺伝子として、評価することであった。 C末端にＮを有するMHC リガンドは、非常に多くはなく、C末端にＮを有するペプチド66個のみ試験した。大半がバインダーではないが、以下のような少数の例外がある。 RLYNFSFLN （SEQ ID No:66）はA*0211 と強く結合し、 YADGGQWYN (SEQ ID No:67) も "A^*0211…"と結合する）。

HLA-A^*0211 への結合は、 BIR-11 （C末端単量体:KLDRERAKN (SEQ ID No:68)）と BIR-13 （C末端10量体:LKLDRERAKN (SEQ ID No:69)）で高濃度に見られるが、BIR-12（C末端8量体:LDRERAKN (SEQ ID No:70)）では見られないことを試験は明確に示した。陽性コントロールペプチド（配列：FLPSDYFPSV (SEQ ID No:71)）は明かに結合特徴を示した。

試験の原理
アッセイは以下のように設定された。安定なＨＬＡ／ペプチド複合体は、ＨＬＡ重鎖、β２ミクログロブリン（b2m）、及びペプチド性リガンドの３つの分子から構成される。変性組み換えHLA-A^*0211 重鎖分子単独の活性は、その重鎖分子に「空の HLA-A^*0211分子」と同等な機能を与えながら維持することができる。これらの分子は、ｂ２ｍと適切なペプチドを含んだ水溶液バッファで希釈すると、完全にペプチド依存様式で迅速に効率よく折り重なる。これらの分子の利用性はＥＬＩＳＡに基づくアッセイで使用され、ペプチドとＨＬＡクラスＩ分子間の相互作用の親和性を測定する（Sylvester-Hvid et al., 2002）。

精製された組み換えHLA-A^*0211 は、ｂ２ｍと共にインキュベートされ、関心のあるペプチドの用量に分けられた。新規折りたたみＨＬＡ／ペプチド複合体量は、定量的ＥＬＩＳＡ法で測定された。解離定数（KD 値）は、較正物質であるＨＬＡ／ペプチド複合物の解離数から得た標準曲線を用いて計算された。測定の逸脱が多すぎて信頼性のある KD 値を与えることができなかった。しかし、BIR13 の KD は陽性コントロールの範囲内にあるが、BIR-11 の KD はその範囲より高いといえる。 KD が低いとHLA-A^*0211への親和性は高くなる。

いくつかの対立遺伝子に対する9量体 BIR-11と９量体 BIR-11a のSYFPEITHIによる結合スコアを以下に示す。

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Claims

SEQ ID No. 1 からSEQ ID No. 3 までのグループか、SEQ ID No. 1 からSEQ ID No. 3 までと少なくとも 95% 相同性であるその変異体か、T 細胞の前記変異体ペプチドとの交差反応を誘発するその変異体から選択された配列を含むペプチドであって、ヒトサービビンの完全な長さのポリペプチドではない前記ペプチド。
請求項１記載のペプチドあるいはその変異体において、前記ペプチドまたはその変異体は、ヒト主要組織適合複合体（MHC）クラス I あるいは II 分子に結合する能力を維持しており、さらに前記ペプチドは CD4 または CD8T 細胞を刺激する能力を有するものである。
請求項１または２において、前記ペプチドは HLA-DR とHLA-A*02のグループから選択された特異的 HLAサブタイプであり、さらに前記ペプチドは好ましくは特異なアンカーアミノ酸モチーフを含むものである。
請求項１から請求項３いずれかに記載のペプチドにおいて、前記ペプチドまたはその変異体の全長は 8〜100 残基を有し、好ましくは 8〜30 残基であり、さらに好ましくは 8〜16 残基、最も好ましくはペプチドがSEQ ID No. 1 から SEQ ID No. 3に従うアミノ酸配列から構成されるか本質的に構成されるものである。
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドにおいて、前記ペプチドは、融合タンパク質であり、特に、HLA-DR 抗原関連変異体鎖（Ii）のN-末端アミノ酸を有するものである。
請求項１から５のいずれかに記載のペプチドをコード化する核酸または前記核酸を発現可能な発現ベクター
請求項１〜５のいずれか 1 つに記載のペプチド、請求項６に記載の核酸または薬剤に使用する発現ベクター。
請求項６に記載の核酸または発現ベクターを含む宿主細胞において、前記宿主細胞は好ましくは抗原提示細胞であり、特に樹状細胞または抗原提示細胞である。
請求項１から７のいずれか 1 つに記載のペプチドを生成する方法であって、請求項８に記載の核酸を発現する請求項１１記載の宿主細胞または請求項９記載の発現ベクターを培養すること、及び該宿主細胞またはその培地から該ペプチドを単離することからなる方法。
活性化細胞傷害性 T リンパ球（CTL）を生成する in vitro 方法であって、in vitroで CTL を、適当な抗原提示細胞表面上で発現された抗原負荷ヒトクラスIまたは II MHC 分子と接触させるか、または抗原特異的方法で前記ＣＴＬを活性化するのに十分な期間、抗原提示細胞を模倣する人工構築物と接触させることを含む方法において、前記抗原は請求項１から５のいずれか１つに記載のペプチドである方法。
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチド、請求項６に記載の核酸または発現ベクター、請求項８に記載の細胞、あるいはがん治療または抗がん剤の製造に関する請求項１０に記載の生成された活性化細胞傷害性Ｔリンパ球の使用において、前記抗がん剤が好ましくはワクチンである。
請求項１１に記載の使用において、前記がんは、星細胞腫、毛様細胞性星細胞腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、乏突起膠腫、上衣腫、多形神経膠芽腫、混合膠腫、神経膠腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、胚細胞種、奇形腫、神経節膠腫、神経節細胞腫、中枢神経節細胞腫、原始神経外胚葉性腫瘍（PNETすなわち、髄芽腫, 髄上皮腫, 神経芽種, 網膜芽細胞腫, 上衣芽腫など）、松果体組織にでききた腫瘍（松果体細胞腫や松果体芽腫など）、上衣細胞腫、脈絡叢腫瘍、原発不明の神経皮腫瘍（大脳神経膠腫症、星状芽細胞腫など）、神経膠芽腫、前立腺腫瘍、乳癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、腎明細胞癌、肺癌、中枢神経系腫瘍、卵巣癌、メラノーマ、膵臓癌、扁平上皮癌、白血病および髄芽腫、およびサービビンの過剰発現を示す他の腫瘍またはがんから選択される。
請求項１１または１２に記載のペプチドの、腎癌治療に対しSEQ ID 4 から 13 と 24に従うペプチドから構成されるグループから選択された１つ以上のペプチドとの併用、または大腸癌治療に対しSEQ ID 4、8、11、12および15 から 24 に従うペプチドから構成されるグループから選択された１つ以上のペプチドとの併用、または大腸癌の抗ガン剤の製造、における使用。
キットの構成であって
(a) 請求項１から５のいずれか 1 つのペプチド、請求項６に記載の核酸または発現ベクター、請求項８に記載の細胞、または請求項１０に記載の活性化細胞傷害性 T リンパ球を含有する薬剤成分を溶液または凍結乾燥状態で含む容器；
(b) 任意に、凍結乾燥調整物の希釈剤あるい再構成溶液を含む第２容器；
(c) 任意に、SEQ IDs 4 to 24に従うペプチドから成る官能基から選択された１つ以上のペプチド、及び
(d) 任意に、溶液の使用、及び／または凍結乾燥調整物の構成及び/または使用の説明を含んでなる、上記キット構成。
各々のHLA分子と複合体形成時に、SEQ ID 1 から 24のいずれかに従うペプチドに特異的である抗体であって、好ましくはポリクロナール抗体、モノクロナール抗体、および／またはキメラ抗体である、上記抗体。