CN107750256A - 表皮生长因子受体变体iii‑间皮素融合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于引发受试者中的免疫响应的组合物和方法。具体地，本公开涉及包含表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)多肽和间皮素多肽的融合蛋白以及使用包含编码该融合蛋白的核酸分子的宿主细胞引发免疫响应的方法。在一些实施方式中，所述核酸分子可编码EGFRvIII‑间皮素融合蛋白，该融合蛋白包含与如SEQ ID NO:8中所述的EGFRvIIIx5‑间皮素35‑622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。

Description

表皮生长因子受体变体III-间皮素融合物及其使用方法
相关申请
本申请要求于2015年4月13日提交的美国临时申请第62/146,559号及2015年10月19日提交的美国临时申请第62/243,397号的权益。以上申请的全部教导内容以援引方式并入本文。
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a)文件名：53161000003Sequence.txt；2016年4月8日创建，45KB大小。
技术领域
本文提供用于在受试者中引发免疫响应的组合物和方法。具体地，本公开涉及包含表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)多肽及间皮素多肽的融合蛋白以及使用包含编码所述融合蛋白的核酸分子的宿主细胞引发免疫响应的方法。
背景技术
肺癌为全球头号癌症死亡原因且发病率据估计为每年130万新病例。在美国，其为第二最常诊断出的癌症，每年诊断出超过200,000人患有此疾病且其为癌症相关死亡的主要原因，据估计每年几乎有160,000人死于该疾病。新诊断的肺癌病例的大约80％至85％为非小细胞肺癌(NSCLC)(腺癌、鳞状癌及大细胞癌)且15％至20％为小细胞肺癌。手术切除为最一致且成功的治愈选项，但这要求癌症可完全切除，其对大多数患者而言并不可行，因为70％的患者存在不可切除和/或不可治愈的疾病。
在最近数十年间癌症诊断及治疗的进步已获得结果的显著改良，但一些肿瘤(诸如NSCLC)仍难以在疾病早期诊断出，并且首次呈现为晚期疾病或在初步治疗之后进展的患者的总存活率(OS)仍然不佳。这些患者需要另外的疗法。
发明内容
本文公开了包含表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)多肽与间皮素多肽融合的融合蛋白。在一些实施方式中，该融合蛋白可包含一个或多个EGFRvIII多肽和间皮素多肽，所述EGFRvIII多肽的每一个包含与如SEQ ID NO:9中所述的EGFRvIII具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列；所述间皮素多肽包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
还提供了编码所公开的融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，该核酸分子可包含与如SEQ ID NO:4中所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的一个或多个EGFRvIII多核苷酸以及与如SEQ ID NO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的间皮素多核苷酸。
本文公开了包含所公开的核酸分子的宿主细胞。在一些实施方式中，该宿主细胞可包含如下核酸分子，该核酸分子包含与如SEQ ID NO:4中所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的一个或多个EGFRvIII多核苷酸以及与如SEQ ID NO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的间皮素多核苷酸。
还提供了引发受试者的免疫响应的方法。在一些实施方式中，该方法可包含向该受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子。在一些方面，该核酸分子可包含与如SEQ ID NO:4中所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的一个或多个EGFRvIII多核苷酸以及与如SEQ ID NO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的间皮素多核苷酸。
还公开了增加间皮素多肽的表达的方法，其包含在宿主细胞中表达包含EGFRvIII多核苷酸和编码该间皮素多肽的间皮素多核苷酸的核酸分子。在一些实施方式中，该核酸分子可包含与如SEQ ID NO:4中所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的一个或多个EGFRvIII多核苷酸以及与如SEQ ID NO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的间皮素多核苷酸。
还提供了治疗需要治疗的受试者的癌症的方法。在一些实施方式中，该方法可包含向该受试者施用治疗有效量的包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，该核酸分子可编码如下融合蛋白，该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和间皮素多肽，所述EGFRvIII多肽的每一个包含与如SEQ ID NO:9中所述的EGFRvIII具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列；且所述间皮素多肽包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。在一些方面，该核酸分子可包含与如SEQ ID NO:4中所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的一个或多个EGFRvIII多核苷酸以及与如SEQ ID NO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的间皮素多核苷酸。
附图说明
当结合附图阅读时可进一步理解所述发明内容以及下述具体实施方式。出于说明所公开的组合物和方法的目的，图中展示了组合物和方法的示例性实施方式；然而，组合物和方法不限于所公开的具体实施方式。在附图中：
图1包含图1A和图1B，说明了(A)EGFRvIIIx5-间皮素35-622(在本文中也称为ADU-214)和(B)CRS-207(作为参照显示)的示例性示意图。
图2说明了ADU-214在肉汤培养物中的表达。EGFRvIII-Meso＝ADU-214融合蛋白；Meso＝CRS-207融合蛋白。Lm11用作阴性对照。
图3包含图3A和图3B，说明了在经疫苗接种的小鼠中的抗原特异性T细胞免疫响应。(A)ADU-214在Balb/c小鼠中诱导稳固的间皮素特异性T细胞介导的免疫响应。(B)ADU-214在C3H/HeN小鼠中诱导稳固的EGFRvIII特异性CD8+T细胞免疫响应。
图4说明了针对野生型李斯特菌(Listeria)激发用ADU-214疫苗接种的保护性免疫。
图5说明了采用ADU-214的治疗性疫苗接种。HBSS和空平台菌株用作对照。
具体实施方式
参照与附图结合的以下具体实施方式可更易于理解所公开的组合物和方法，以下具体实施方式形成本发明的一部分。应该理解，所公开的组合物和方法不限于本文中所描述和/或展示的特定组合物和方法，且本文所用的术语仅用于借助实施例来描述特定实施方式的目的，而并非意欲限制所要求的组合物和方法。
除非另外具体指出，否则任何关于可能机制或作用模式或改良原因的描述仅意为说明性的，且所公开的组合物和方法不受任何这类所提出的机制或作用模式或改良原因的正确性或不正确性的限制。
在本文通篇中，描述涉及组合物及使用该组合物的方法。当本公开描述或要求与组合物相关联的特征或实施方式时，所述特征或实施方式同样适用于使用该组合物的方法。类似地，当本公开描述或要求与使用组合物的方法相关联的特征或实施方式时，所述特征或实施方式同样适用于该组合物。
应了解，所公开的组合物和方法为了清楚起见在本文中在不同实施方式的背景下描述的某些特征也可组合提供于单个实施方式中。相反地，所公开的组合物和方法为了简洁起见在单个形式的背景下描述的各种特征也可单独或以任何子组合形式提供。
如本文所用，单数形式“一个(a/an)”和“该(the)”包括复数形式。
在本公开通篇使用以下缩写：EGFRvIII(表皮生长因子受体变体III新抗原接合区)；EGFRvIIIx5(EGFRvIII的5个拷贝)；Meso(间皮素)；ADU-214(EGFRvIIIx5-间皮素35-622)；Lm(单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes))；LADD(双重缺失的单核细胞增生李斯特菌)。
Δ符号(Δ或“.DELTA.”)是指缺失。举例而言，“Δ actA”(或“.DELTA.actA”)意指全部或部分actA基因缺失。
术语“约”在用于提及数值范围、截留值或特定值时用于指示所记载的值可与列出值相差至多高达10％。因此，术语“约”用于涵盖规定值的±10％或10％以下的差异、±5％或5％以下的差异、±1％或1％以下的差异、±0.5％或0.5％以下的差异或±0.1％或0.1％以下的差异。
如本文所用，术语“受试者”是指人类或非人类生物体。因此，本文所述的方法及组合物适用于人类及兽医学疾病。在某些实施方式中，受试者为“患者”，即正接受疾病或病况的医疗护理的活人。这包括正接受病理学指征研究的患有不确定疾病的人员。优选为患有表达EGFRvIII和间皮素中的一或多种(优选每一种)的恶性病的受试者。在某些实施方式中，受试者罹患肺癌且优选晚期(第IIIb期)或转移性(第IV期)非小细胞肺癌(NSCLC)腺癌。
如本文所用，术语“同一性百分比”、“序列同一性”和“百分比同一性”是指两个或两个以上多肽之间相同(即，同一)的氨基酸的百分比。两个或两个以上多肽之间的序列同一性可通过比对多肽的氨基酸序列且对经比对多肽中含有相同氨基酸残基的位置数目进行评分并比较经比对多肽中不同的位置数目来测定。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或通过缺乏氨基酸(一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同氨基酸残基的位置数目除以多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同氨基酸残基的位置数目除以多肽中氨基酸残基的总数并乘以100来计算百分比同一性。
“其免疫原性片段”包括能够引发受试者的免疫原性响应的融合蛋白部分。在一些方面，免疫原性片段包含EGFRvIII-间皮素、由EGFRvIII-间皮素组成或基本上由EGFRvIII-间皮素组成。在其他方面，免疫原性片段包含信号序列-EGFRvIII-间皮素、由信号序列-EGFRvIII-间皮素组成或基本上由信号序列-EGFRvIII-间皮素组成。
如本文所用，“融合蛋白”是指由两个或两个以上多肽接合而制成的蛋白质。可通过以化学方式结合多肽来产生融合蛋白。优选地，通过基因融合产生融合蛋白，其中编码个体多肽的核酸分子在框架内接合，使得该核酸分子的转录及翻译产生包含所述个体多肽的单个蛋白质。所公开的融合蛋白可在多肽之间具有一个或多个连接子残基。
如本文所用，“信号序列”是指具有驱动融合蛋白的分泌的功能的多肽序列及编码其的核苷酸序列。信号序列可操作地连接于包含融合蛋白的多肽，且为具有包含融合蛋白的多肽的翻译阅读框。“信号序列”也可称为“分泌信号序列”。
如本文所用，“可操作地连接”是指控制序列(诸如启动子核糖体结合位点)以维持组件正常功能的方式的并置。“控制序列”典型地指可操作地连接的编码序列在宿主生物体中的表达所必需的DNA序列。控制序列可包括启动子、核糖体结合位点以及可选的夏因/达尔加诺序列(Shine/Dalgarno sequence)。因此，编码序列“可操作地连接”于经编码信号序列是指下述构象，其中编码序列以使得信号肽经宿主细胞加工且分泌经加工的蛋白的方式接合至信号序列。必要时，可操作地连接于启动子的信号序列以使得分泌信号序列的转录及翻译由启动子、核糖体结合位点及必要时的夏因/达尔加诺序列控制的方式接合至启动子。
如本文所用，“i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性”涵盖了与参照物(例如，生物序列)具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性。
对于EGFRvIII多肽及含有其的免疫原性融合蛋白，本文所述的任何序列变异性必须存在于SEQ ID NO:9的氨基酸残基7至14(EEKKGNYV)之外。换言之，序列变异性可存在于SEQ ID NO:9的氨基酸残基1至6(PASRAL)或含有其的免疫原性融合蛋白和/或SEQ ID NO:9的氨基酸残基15至21(VTDHGSC)或含有其的免疫原性融合蛋白中。举例而言，包含与SEQ IDNO:9具有至少90％同一性的氨基酸序列的EGFRvIII多肽涵盖与SEQ ID NO:9具有90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列，其中变异性存在于SEQ ID NO:9的氨基酸残基1至6或15至21中。因此，各EGFRvIII多肽及含有其的免疫原性融合蛋白将含有SEQ ID NO:9的氨基酸残基7至14(EEKKGNYV)。
可调节EGFRvIII多肽的长度以包括SEQ ID NO:9的较短部分。举例而言，在一些实施方式中，EGFRvIII多肽可包含与SEQ ID NO:9的氨基酸残基6至18具有至少90％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。在一些实施方式中，EGFRvIII多肽的一个或多个拷贝可包含与SEQ ID NO:9的氨基酸残基6至14具有至少90％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。如上所述，这些较短多肽中的变异性将存在于SEQ ID NO:9的氨基酸残基1至6或15至21中。因此，对于与SEQ ID NO:9的氨基酸残基6至18具有至少90％同一性的氨基酸序列，变异性可存在于SEQID NO:9的氨基酸残基6或15至18中。对于与SEQ ID NO:9的氨基酸残基6至14具有至少90％同一性的氨基酸序列，变异性可存在于氨基酸残基6。
所公开的融合蛋白可包含EGFRvIII抗原及间皮素抗原、由EGFRvIII抗原及间皮素抗原组成或基本上由EGFRvIII抗原及间皮素抗原组成。本文所述的抗原可包括作为来自全长蛋白序列的MHC I类表位或MHC II类表位的序列。在一个实施方式中，所述EGFRvIII多核苷酸包含编码至少一个MHC I类表位或至少一个MHC II类表位的序列。类似地，本文所述的EGFRvIII多肽包括至少一个MHC I类表位或至少一个MHC II类表位。在一个实施方式中，所述间皮素多核苷酸包含编码至少一个MHC I类表位或至少一个MHC II类表位的序列。类似地，本文所述的间皮素多肽包括至少一个MHC I类表位或至少一个MHC II类表位。
EGFR为对细胞生长及存活至关重要的受体酪氨酸激酶。EGFR基因常常在人类癌症中过表达或突变，包括头颈癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌及恶性神经胶质瘤。EGFR受体变体III(EGFRvIII)由外显子2至7的267氨基酸缺失以及外显子1与外显子8的融合产生，从而产生在接合点处具有新的甘氨酸的肿瘤特异性肽。EGFRvIII呈现组成性、非配体依赖性信号传导。
间皮素为存在于胸膜、腹膜及心包膜内衬的正常间皮细胞上的糖基化磷脂酰肌醇连接的细胞表面糖蛋白。间皮素也是由数种人类肿瘤(包括胰腺癌、间皮瘤、NSCLC及卵巢癌)高度表达的肿瘤相关抗原。
预测算法“BIMAS”根据肽/HLA复合物的预测半衰期解离将可能的HLA结合表位排序。“SYFPEITHI”算法根据说明存在一级及二级HLA结合锚定残基的评分来将肽排序。两种计算机化算法基于给定蛋白质内与先前公开的HLA结合表位具有类似结合基序的氨基酸序列来对候选表位进行评分。其他算法也可用于鉴别候选物以用于其他生物学测试。
融合蛋白及该融合蛋白的抗原部分的示例性核苷酸及氨基酸序列以及编码其的核酸分子提供于表2中。
融合蛋白
本文公开了包含与间皮素多肽融合的表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)多肽的融合蛋白(EGFRvIII-间皮素融合蛋白)。
融合蛋白可包含EGFRvIII多肽的一个或多个拷贝。在一些实施方式中，融合蛋白可包含一个EGFRvIII多肽。在其他实施方式中，融合蛋白可包含多个EGFRvIII多肽。EGFRvIII多肽的适合拷贝数包括(但不限于)2个、3个、4个、5个或更多个拷贝。在一些实施方式中，融合蛋白可包含EGFRvIII多肽的一个拷贝(EGFRvIIIx1)。在一些实施方式中，融合蛋白可包含EGFRvIII多肽的两个拷贝(EGFRvIIIx2)。在一些实施方式中，融合蛋白可包含EGFRvIII多肽的三个拷贝(EGFRvIIIx3)。在一些实施方式中，融合蛋白可包含EGFRvIII多肽的四个拷贝(EGFRvIIIx4)。在一些实施方式中，融合蛋白可包含EGFRvIII多肽的五个拷贝(EGFRvIIIx5)。
在一些方面，EGFRvIII多肽的一个或多个拷贝中的每一个可包含与SEQ ID NO:9具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，举例而言，EGFRvIII多肽可包含与SEQ ID NO:9具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。在其他实施方式中，EGFRvIII多肽可包含EGFRvIII多肽的2个、3个、4个、5个或更多个拷贝，各拷贝具有与SEQ ID NO:9具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些方面，EGFRvIII多肽的一个或多个拷贝中的每一个可由与SEQ ID NO:9具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列组成。在一些方面，EGFRvIII多肽的一个或多个拷贝中的每一个可基本上由与SEQ ID NO:9具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，EGFRvIII多肽的一个或多个拷贝可包含与SEQ ID NO:9的氨基酸残基6至18具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。在一些实施方式中，EGFRvIII多肽的一个或多个拷贝可包含与SEQ ID NO:9的氨基酸残基6至14具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。
EGFRvIII多肽可在EGFRvIII多肽的N端、C端或N端及C端处由一个或多个切割序列侧接。切割序列构造为被受试者中存在的蛋白酶加工。当EGFRvIII多肽包含EGFRvIII多肽的2个以上拷贝时，切割序列可存在于EGFRvIII多肽的个别拷贝之间。举例而言且不意欲限制，SEQ ID NO:10含有EGFRvIII多肽的5个拷贝(SEQ ID NO:9所述的EGFRvIII多肽的各拷贝)及切割序列(ASKVL/ADGSVKTS(SEQ ID NO:26)、ASKVA/GDGSIK(SEQ ID NO:27)、LSKVL/ADGSVK(SEQ ID NO:28)、ASKVA/GDGSIK(SEQ ID NO:29)及LSKVL/ADGSVK(SEQ ID NO:30)；其中“/”表示EGFRvIII多肽)。这些切割序列实际上仅为示例性的。适合的切割序列描述于美国专利申请第13/988,076号(美国专利公开第2014/037662号)；Toes等人,J.Exp.Med.(2001)194:1-12；Lauer等人,Infect.Immun.(2008)76:3742-53；及Sinnathamby等人,J.Immunother.(2009)32:856-69中，其各自以其整体通过援引并入本文中。
EGFRvIII多肽可为间皮素多肽的N端或C端。在一些实施方式中，EGFRvIII多肽可为间皮素多肽的N端。
适合的间皮素多肽包括具有与间皮素的氨基酸35-622(在本文中称为“间皮素35-622”)具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列的间皮素多肽。
在一些方面，间皮素多肽可包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。因此，在一些实施方式中，间皮素多肽可包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。在一些方面，间皮素多肽可由与如SEQ IDNO:11中所述的间皮素35-622具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列组成。在一些方面，间皮素多肽可基本上由与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列组成。
融合蛋白可包含以下各物、由以下各物组成或基本上由以下各物组成：一个或多个EGFRvIII多肽，其中的每一个包含与如SEQ ID NO:9中所述的EGFRvIII具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列；和间皮素多肽，其包含与如SEQID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。融合蛋白可包含以下各物、由以下各物组成或基本上由以下各物组成：EGFRvIIIx5多肽，其包含与如SEQ ID NO:10中所述的EGFRvIIIx5具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列；和间皮素多肽，其包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:8的氨基酸残基89至840中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。举例而言，在一些方面，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:8的氨基酸残基89至840中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，融合蛋白可由与如SEQ ID NO:8的氨基酸残基89至840中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列组成。在一些方面，融合蛋白可基本上由与如SEQ ID NO:8的氨基酸残基89至840中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少90％同一性、91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性或100％同一性的氨基酸序列组成。
所公开的融合蛋白可另外包含信号序列。在一些实施方式中，融合蛋白可另外包含信号序列，其中该信号序列与EGFRvIII多肽及间皮素多肽一起位于翻译阅读框中。适合的信号序列包括例如ActAN100(如SEQ ID NO:32中所述)、ActAN100*(如SEQ ID NO:12中所述)、LLO441(如SEQ ID NO:20中所述)、LLO441ΔPEST(如SEQ ID NO:22中所述)和LLO441Δ26(如SEQ ID NO:24中所述)。在一些实施方式中，信号序列可包含与如SEQ ID NO:32中所述的ActAN100具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，融合蛋白可另外包含信号序列，其中该信号序列包含与如SEQ ID NO:12中所述的ActAN100*信号序列具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。因此，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:8中所述的ActAN100*-EGFRvIIIx5-间皮素35-622或其免疫原性片段具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。在其他方面，融合蛋白可由与如SEQ ID NO:8中所述的ActAN100*-EGFRvIIIx5-间皮素35-622或其免疫原性片段具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列组成。在其他方面，融合蛋白可基本上由与如SEQ ID NO:8中所述的ActAN100*-EGFRvIIIx5-间皮素35-622或其免疫原性片段具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列组成。
所公开的融合蛋白可在如本文其它部分所公开的许多适合的宿主细胞中表达。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可在细菌中表达，诸如单核细胞增生李斯特菌或其经遗传修饰的形式。
所公开的融合蛋白可用作免疫原性多肽以在接受融合蛋白的受试者中引发体液响应和/或抗原特异性T细胞响应(CD4+和/或CD8+)。
核酸分子
本文公开编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子。所公开的核酸分子可编码本文所公开的EGFRvIII-间皮素融合蛋白中的任一个。
在整个公开中，描述了包含一个或多个EGFRvIII多肽的EGFRvIII-间皮素融合蛋白以及编码包含一个或多个EGFRvIII多肽的该融合蛋白的核酸。EGFRvIII多肽可由表1中所提供的EGFRvIII核苷酸序列中的任一个编码。因此，在整个公开中，当EGFRvIII多核苷酸被称为“与SEQ ID NO:4(表1中的共同序列)具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性”时，其意欲包括：与SEQ ID NO:13具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性；与SEQ ID NO:14具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性；与SEQ ID NO:15至少90％同一性；与SEQ ID NO:16至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性；和/或与SEQ ID NO:17具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性。类似地，编码各种免疫原性融合蛋白的核苷酸序列可包含SEQ ID NO:13～17中的任一个。因此，本文所提供的各EGFRvIII-间皮素融合蛋白可由核酸分子编码，其中该核酸分子包含与SEQ ID NO:13具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性、与SEQ ID NO:14具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性、与SEQ ID NO:15至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性、与SEQ ID NO:16至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性和/或与SEQ ID NO:17具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的一个或多个多核苷酸。
表1
核酸分子可编码具有一个或多个EGFRvIII多肽的EGFRvIII-间皮素融合蛋白。在一些实施方式中，核酸分子可编码具有一个EGFRvIII多肽(EGFRvIIIx1)的EGFRvIII-间皮素融合蛋白。在其他实施方式中，核酸分子可编码具有多个EGFRvIII多肽的EGFRvIII-间皮素融合蛋白。由所公开的核酸分子编码的EGFRvIII多肽的适合数目包括(但不限于)2个、3个、4个、5个或更多个拷贝。在一些实施方式中，核酸分子可编码具有EGFRvIII多肽的2个拷贝(EGFRvIIIx2)的EGFRvIII-间皮素融合蛋白。在一些实施方式中，核酸分子可编码具有EGFRvIII多肽的3个拷贝(EGFRvIIIx3)的EGFRvIII-间皮素融合蛋白。在一些实施方式中，核酸分子可编码具有EGFRvIII多肽的4个拷贝(EGFRvIIIx4)的EGFRvIII-间皮素融合蛋白。在一些实施方式中，核酸分子可编码具有EGFRvIII多肽的5个拷贝(EGFRvIIIx5)的EGFRvIII-间皮素融合蛋白。
编码EGFRvIII多肽的EGFRvIII多核苷酸的示例性核酸序列如SEQ ID NO:4中所述。在一些实施方式中，所公开的核酸分子可包含与如SEQ ID NO:4中所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的一个或多个EGFRvIII多核苷酸。编码EGFRvIIIx5多肽的EGFRvIIIx5多核苷酸的示例性核酸序列如SEQ ID NO:5中所述。在一些实施方式中，所公开的核酸分子可包含与如SEQ ID NO:5中所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的EGFRvIIIx5多核苷酸。
由核酸分子编码的适合的间皮素多肽包括间皮素35-622。间皮素35-622的核酸序列如SEQ ID NO:6中所述。因此，所公开的核酸分子可编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白，其中间皮素多肽由与如SEQ ID NO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸编码。
在一些实施方式中，核酸分子可包含与如SEQ ID NO:4中所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的一个或多个EGFRvIII多核苷酸以及与如SEQ ID NO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的间皮素多核苷酸。在一些实施方式中，核酸分子可包含与如SEQID NO:5中所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸以及与如SEQ ID NO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸。在一些实施方式中，核酸分子可包含与SEQ ID NO:7具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的EGFRvIIIx5-间皮素35-622多核苷酸。
所公开的核酸分子可另外包含启动子和/或信号序列。信号序列可用于引导所编码的融合蛋白从宿主细胞分泌。适合的启动子包括例如actA(如SEQ ID NO:2中所述)或hly(如SEQ ID NO:18中所述)。在一些实施方式中，核酸分子可另外包含启动子，其中该启动子包含与如SEQ ID NO:2中所述的actA启动子具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，核酸分子可另外包含启动子，其中该启动子包含与如SEQ ID NO:18中所述的hly启动子具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，核酸分子可另外包含与编码EGFRvIII多肽的核苷酸序列及编码间皮素多肽的核苷酸序列一起位于翻译框中的信号序列。信号序列可用于引导所编码的融合蛋白从宿主细胞分泌。适合的信号序列包括例如ActAN100(如SEQ ID NO:31中所述)、ActAN100*(如SEQID NO:3中所述)、LLO441(如SEQ ID NO:19中所述)、LLO441ΔPEST(如SEQ ID NO:21中所述)及LLO441Δ26(如SEQ ID NO:23中所述)。在一些实施方式中，核酸分子可另外包含信号序列，其中该信号序列可包含与如SEQ ID NO:31中所述的ActAN100信号序列具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，核酸分子可另外包含信号序列，其中该信号序列可包含与如SEQ ID NO:3中所述的ActAN100*信号序列具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，核酸分子可另外包含信号序列，其中该信号序列可包含与如SEQ ID NO:19中所述的LLO441信号序列具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，核酸分子可另外包含信号序列，其中该信号序列可包含与如SEQ IDNO:21中所述的LLO441ΔPEST信号序列具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，核酸分子可另外包含信号序列，其中该信号序列可包含与如SEQ ID NO:23中所述的LLO441Δ26信号序列具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。因此，在一些实施方式中，核酸分子可包含与如SEQ ID NO:1中所述的碱基对actAp-ActAN100*-EFGRvIIIx5-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸、由该多核苷酸组成或基本上由该多核苷酸组成。
在一些实施方式中，核酸分子可编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白，其中该融合蛋白包含：一个或多个EGFRvIII多肽，其中的每一个包含与如SEQ ID NO:9中所述的EGFRvIII具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列；和间皮素多肽，其包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，核酸分子可编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白，其中该融合蛋白包含：EGFRvIIIx5多肽，其包含与如SEQ ID NO:10中所述的EGFRvIIIx5具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列；和间皮素多肽，其包含与如SEQ IDNO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，核酸分子编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白，其中该EGFRvIII-间皮素融合蛋白包含与如SEQ ID NO:8的氨基酸残基89至840中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。
核酸分子还可包含其他核酸序列，包括(但不限于)限制性核酸内切酶切割位点(克隆连接子)。核酸分子可使用多种适合的限制性核酸内切酶产生，其中核酸内切酶切割位点可保持于最终核酸分子中。SEQ ID NO:1包括BamHI克隆连接子(GGATCC)及MfeI克隆连接子(CAATTG)。本领域技术人员应知晓，其他克隆连接子可代替BamHI和/或MfeI使用。
核酸分子中可包括的其他核酸序列包括“切割序列”(如本文别处所述)，其侧接个体EGFRvIII多核苷酸。
核酸分子可为表达盒的一部分。表达盒可包含启动子、包含所公开的核酸分子的开放阅读框及3'非翻译区。表达盒可用于引导宿主细胞的机构产生所公开的融合蛋白。
还提供了包含所公开的核酸分子的载体。适合的载体包括例如细菌载体、病毒载体、裸DNA载体及裸RNA载体。
宿主细胞
还提供了包含本文所公开的核酸分子中的任一个的宿主细胞。
适合的宿主细胞包括例如细菌。宿主细胞可为减毒、共生和/或杀死的，但具有代谢活性。在一示例性实施方式中，宿主细胞可为减毒、共生和/或杀死的但具有代谢活性的细菌。适合的细菌包括(但不限于)单核细胞增生李斯特菌、弗氏志贺菌(Shigellaflexneri)、大肠杆菌(Escherichia coli)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)或分枝杆菌属物种(mycobacterium species)，或其经修饰的形式。在一些实施方式中，举例而言，宿主细胞可为单核细胞增生李斯特菌或其经修饰的形式。修饰包括突变、改变及其他遗传变化/变异，以及热处理或化学修饰，其降低宿主细胞对受试者的毒性。细菌可经修饰例如以减少与受试者内的细胞的结合、减少在受试者内从一个细胞到另一个细胞的传播、减少在受试者中的细胞外生长或减少在受试者中的细胞内生长。
适合作为宿主细胞的细菌菌株包括美国专利申请第13/988,076号(美国专利公开第2014/037662号)中所述的细菌菌株，该申请通过援引以其整体并入本文中。举例而言，宿主细胞可为单核细胞增生李斯特菌的活减毒菌株，其经遗传修饰以在actA和/或inlB中包含减毒突变，且优选缺失actA及inlB的全部或一部分(在本文中称为“LmΔactA/ΔinlB”)，且含有编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌可为actA缺失(ΔactA)突变体、actA插入突变体、inlB缺失(ΔinlB)突变体、inlB插入突变体或其组合。举例而言，单核细胞增生李斯特菌可为ΔactA/ΔinlB突变体。
宿主细胞可包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子整合至宿主细胞基因组中。核酸分子可整合至actA基因座、inlB基因座或tRNAArg基因座中。在一些实施方式中，核酸分子可整合至actA基因座中。在一些实施方式中，核酸分子可整合至inlB基因座中。在一些实施方式中，核酸分子可整合至tRNAArg基因座中。此类宿主细胞含有受宿主细胞表达序列控制的核酸且因此无需真核转录或翻译组件。
宿主细胞可包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子以染色体外的方式位于宿主细胞内。举例而言，编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子可插入至宿主细胞内的附加型质粒(episomal plasmid)上的表达盒中。
本文提供了经修饰以包含所公开的核酸分子中的任一个的重组李斯特菌。核酸分子可以染色体外的方式存在于李斯特菌中，或可整合至细菌基因组中。在一些实施方式中，举例而言，宿主细胞可为具有编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子整合至tRNAArg基因座中的单核细胞增生李斯特菌ΔactA/ΔinlB突变体。李斯特菌可用作表达平台以用于表达对宿主细胞而言为异源性的所公开的融合蛋白。此类表达可引起例如针对含有宿主细胞的受试者中的异源融合蛋白的免疫响应。
ADU-214为经工程改造以表达EGFRvIII和间皮素的Lm的活减毒菌株(LmΔactA/ΔinlB)。EGFRvIII-hMeso的表达由Lm actA启动子驱动，该启动子在Lm已感染宿主细胞时具有高度诱导性。actA基因存在于PrfA调节子中，PrfA调节子为表达受PrfA控制及诱导的一系列Lm毒性基因，PrfA为在经感染宿主细胞的情形下诱导的转录活化因子蛋白。ADU-214中的EGFRvIII-间皮素表达盒排他地利用Lm转录、翻译及分泌机构且其不含有任何哺乳动物表达元件(诸如哺乳动物表达系统的启动子或终止子区特征)。因此，与必须利用哺乳动物宿主细胞机构表达指定目的基因的基于质粒DNA或病毒的载体不同，且根据定义，当基因转移是基因表达的前提条件时，Lm为“自含型(self-contained)”自由活生物体。在经疫苗接种的宿主的经感染细胞内，排他地采用ADU-214的原核表达机构在细菌内合成EGFRvIII-间皮素融合蛋白，其随后分泌至宿主细胞细胞质中用于抗原加工和呈递。
宿主细胞可与药学上可接受的赋形剂组合。
本文还提供了包含所公开的宿主细胞及药学上可接受的赋形剂的疫苗。疫苗可以以足以引发如本文所公开的适当免疫响应的量施用于受试者。
引发免疫响应的方法
本文还公开了引发受试者中的免疫响应的方法，其包括向该受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子。
所公开的方法可使用包含任何所公开的核酸分子的宿主细胞来进行。在一些实施方式中，该方法可包括向受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子，该核酸分子包含与如SEQ ID NO:1中所述的actAp-ActAN100*-EGFRvIII-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，该方法可包括向受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含与如SEQ ID NO:4中所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的一个或多个EGFRvIII多核苷酸以及与如SEQ IDNO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的间皮素多核苷酸。在一些实施方式中，该方法可包括向受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含与如SEQ ID NO:5中所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸以及与如SEQ ID NO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸。在一些实施方式中，该方法可包括向受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含与SEQ ID NO:7具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的EGFRvIIIx5-间皮素35-622多核苷酸。
本文所公开的任何宿主细胞适用于所公开的方法。举例而言，宿主细胞可为单核细胞增生李斯特菌的活减毒菌株，其经遗传修饰以在actA和/或inlB中包含减毒突变，且优选缺失actA及inlB的全部或一部分(在本文中称为“LmΔactA/ΔinlB”)，且含有编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌可为actA缺失突变体、actA插入突变体、inlB缺失突变体、inlB插入突变体或其组合。举例而言，单核细胞增生李斯特菌可为ΔactA/ΔinlB突变体。
施用于受试者的宿主细胞可包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子整合至宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，核酸分子可整合至actA基因座中。在一些实施方式中，核酸分子可整合至inlB基因座中。在一些实施方式中，核酸分子可整合至tRNAArg基因座中。施用于受试者的宿主细胞可包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子以染色体外的方式位于宿主细胞内。
向受试者施用宿主细胞的适合模式包括(但不限于)静脉内、口服、皮下、皮内、肌肉内、腹膜内、经粘膜、经鼻施用或其任意组合。在一些实施方式中，施用步骤在静脉内进行。
宿主细胞可用作表达平台以在受试者内表达所公开的融合蛋白，由此引发针对含有宿主细胞的受试者中的异源融合蛋白的免疫响应。举例而言，融合蛋白可由受试者内经感染细胞的胞浆中的宿主细胞表达及分泌。经感染细胞包括受试者内可吸收宿主细胞的任何细胞。在一些实施方式中，经感染细胞可为抗原呈递细胞。抗原呈递细胞(APC)为用于向T细胞呈递抗原的免疫系统的细胞。APC包括树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、边缘区库普弗细胞(marginal zone Kupffer cell)、小胶质细胞、朗格罕氏细胞(Langerhans cell)、T细胞和B细胞。在一些实施方式中，融合蛋白可在受试者的一种或多种细胞中表达。
任何所公开的融合蛋白可用作免疫原性多肽以引发受试者中的免疫响应。在一些实施方式中，举例而言，该方法可包含向受试者施用包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子的宿主细胞，其中该融合蛋白包含与如SEQ ID NO:8中所述的ActAN100*-EGFRvIIIx5-间皮素35-622或其免疫原性片段具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，该方法可包含向受试者施用包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子的宿主细胞，其中该融合蛋白包含与如SEQ ID NO:8的氨基酸残基89至840中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，该方法可包含向受试者施用包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子的宿主细胞，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和间皮素多肽，其中所述一个或多个EGFRvIII多肽的每一个包含与如SEQ ID NO:9中所述的EGFRvIII具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列，所述间皮素多肽包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，举例而言，该方法可包含向受试者施用包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子的宿主细胞，其中该融合蛋白包含EGFRvIIIx5多肽和间皮素多肽，其中所述EGFRvIIIx5多肽包含与如SEQ ID NO:10中所述的EGFRvIIIx5具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列，所述间皮素多肽包含与如SEQ IDNO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
所公开的方法可用于引发间皮素免疫响应、EGFRvIII免疫响应、针对李斯特菌的免疫或其任意组合。因此，提供了引发受试者中的间皮素免疫响应的方法，其包含向该受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子。还提供了引发受试者的EGFRvIII免疫响应的方法，其包含向该受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子。另外提供了引发受试者的针对李斯特菌的免疫性的方法，其包含向该受试者施用包含单核细胞增生李斯特菌的组合物，其中该宿主细胞包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子。
所公开的方法可引发体液响应和/或抗原特异性T细胞响应(CD4+和/或CD8+)。举例而言，在ADU-214进入经感染真核宿主细胞的胞浆后，EGFRvIII-间皮素融合蛋白可由宿主细胞表达并分泌，且随后由经感染细胞的蛋白酶体机构加工。在MHC I类及II类分子的情况下，EGFRvIII-间皮素融合蛋白的蛋白质片段可呈递在APC表面上，其可导致对全身性EGFRvIII特异性及间皮素特异性CD4+及CD8+T细胞免疫的诱导。此外，在IV施用之后，ADU-214的主要靶细胞据信为肝脏和脾脏中的吞噬细胞。这些细胞的感染可导致诱导由I型干扰素早期生产引发的促炎性细胞因子级联。重要的是，当ADU-214表达并分泌经编码的EGFRvIII-间皮素抗原(除了其他细菌产物之外)时，ADU-214自吞噬溶菌体离开进入经感染宿主细胞的胞浆中。由于免疫刺激性环境和宿主细胞表达EGFRvIII-间皮素抗原，ADU-214随后能够激活全身性EGFRvIII-间皮素特异性T细胞免疫。
增加间皮素多肽的表达的方法
本文公开了增加间皮素多肽的表达的方法，其包含在宿主细胞中表达包含EGFRvIII多核苷酸和编码间皮素多肽的间皮素多核苷酸的核酸分子。
所公开的方法可在支持或可经配置以支持所公开的核酸分子的转录及间皮素多肽的表达的任何宿主细胞中进行，包括(但不限于)细菌细胞、病毒细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。表达步骤可通过将核酸分子引入至宿主细胞中且使宿主细胞机构产生间皮素多肽来进行。作为另选，表达步骤可通过向感兴趣的细胞施用宿主细胞来进行，其中间皮素多肽在该感兴趣的细胞内产生。在一些实施方式中，表达步骤可通过用宿主细胞感染感兴趣的细胞来进行，其中间皮素多肽在感兴趣的细胞内产生。在一些实施方式中，表达步骤可通过向受试者施用宿主细胞来进行，其中间皮素多肽在受试者内产生。
因此，所公开的方法可用于增加受试者中的间皮素的表达。该方法可包含在受试者中表达包含EGFRvIII多核苷酸和编码间皮素多肽的间皮素多核苷酸的核酸分子。
增加受试者中的间皮素的表达可通过向该受试者施用包含编码间皮素多肽的核酸的宿主细胞来进行。本文所公开的任何宿主细胞可与所公开的方法一起使用。举例而言，宿主细胞可为活减毒菌株，诸如单核细胞增生李斯特菌。单核细胞增生李斯特菌可经遗传修饰以在actA和/或inlB中包含减毒突变，且优选缺失actA及inlB的全部或一部分(在本文中称为“LmΔactA/ΔinlB”)，且含有编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌可为actA缺失突变体、actA插入突变体、inlB缺失突变体、inlB插入突变体或其组合。举例而言，单核细胞增生李斯特菌可为ΔactA/ΔinlB突变体。
宿主细胞可包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子整合至宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，核酸分子可整合至actA基因座中。在一些实施方式中，核酸分子可整合至inlB基因座中。在一些实施方式中，核酸分子可整合至tRNAArg基因座中。宿主细胞可包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子以染色体外的方式位于宿主细胞内。
用于所公开的方法的适合核酸分子包括本文别处所公开的那些核酸分子。核酸分子可包含EGFRvIII多核苷酸的单个拷贝或EGFRvIII多核苷酸的一个或多个拷贝，其中该EGFRvIII多核苷酸包含与SEQ ID NO:4具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。EGFRvIII多核苷酸的适合拷贝数包括(但不限于)2个、3个、4个、5个或更多个拷贝。EGFRvIII多核苷酸可由编码切割序列的一个或多个核苷酸序列侧接。
在一些实施方式中，增加间皮素多肽的表达的方法可包括在宿主细胞中表达如下核酸分子，该核酸分子包含与如SEQ ID NO:1中所述的actAp-ActAN100*-EGFRvIII-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，增加间皮素多肽的表达的方法可包含在宿主细胞中表达如下核酸分子，该核酸分子包含与如SEQ ID NO:4中所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的一个或多个EGFRvIII多核苷酸以及与如SEQ ID NO:6中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的间皮素多核苷酸。在一些实施方式中，增加间皮素多肽的表达的方法可包含在宿主细胞中表达如下核酸分子，该核酸分子包含与如SEQ ID NO:5中所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸以及与如SEQ ID NO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸。在一些实施方式中，增加间皮素多肽的表达的方法可包含在宿主细胞中表达如下核酸分子，该核酸分子包含与SEQ ID NO:7具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的EGFRvIIIx5-间皮素35-622多核苷酸。
间皮素多核苷酸可编码间皮素35-622多肽。在一些实施方式中，间皮素多肽可包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。因此，所公开的方法可用于增加间皮素35-622的表达水平。
核酸分子可另外包含信号序列和/或启动子。在一些实施方式中，核酸分子可另外包含信号序列，其中该信号序列包含与如SEQ ID NO:3中所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，核酸分子可另外包含启动子，其中该启动子包含与如SEQ ID NO:2中所述的actA启动子具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，核酸分子可另外包含信号序列和启动子，其中该信号序列包含与如SEQ ID NO:3中所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列，且该启动子包含与如SEQ ID NO:2中所述的actA启动子具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。
治疗受试者中的癌症的方法
癌症疫苗的治疗概念涵盖意欲诱导及增强针对恶性肿瘤细胞的特异性适应性免疫响应的广泛范围的平台技术。最初在相关非临床癌症模型中开发的多种疫苗技术已进入现患有疾病或作为在治愈性肿瘤移除之后的辅助治疗的患者群体的临床测试中。令人遗憾的是，在全世界癌症相关死亡的主要原因NSCLC中，使用疫苗的活性免疫治疗干预尚未实现通过展现关于肿瘤响应、肿瘤复发或进展的延迟及最终总存活率(OS)的延长的显著益处的临床概念验证。据信此临床功效的缺乏主要归因于特异性抗性机制，其使得NSCLC细胞能够避开免疫识别及避免由治疗性癌症疫苗接种之后诱导和活化的抗原定向T淋巴细胞的细胞毒性破坏。所公开的方法解决了这些及其他问题。
本文公开了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包含向该受试者施用治疗有效量的包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子。
EGFRvIII为仅在包括NSCLC的肿瘤细胞中发现且在体内正常细胞中未发现的独特突变。引发有效及长期EGFRvIII特异性T细胞及抗体响应可消除表达EGFRvIII的细胞并且发挥施加有利于不表达EGFRvIII的那些细胞的免疫选择压力，这潜在地有助于用现有靶向疗法治疗残余肿瘤。所公开的方法仅特异性靶向肿瘤细胞中通过缺失EGFR的外显子2至7所表达的EGFRvIII新抗原区，而非正常功能细胞群体中信号转导所需的天然EGFR。因此，预期EGFRvIII特异性免疫响应局限于表达此EGFR变体的患者群体。另外，EGFRvIII可增强间皮素的表达，间皮素为在正常组织表面上有限表达但由包括NSCLC的数种人类肿瘤高度表达的肿瘤相关抗原。通过用所公开的组合物免疫诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)经特定设计以识别并选择性破坏经宿主细胞感染的细胞和过表达EGFRvIII及间皮素的肿瘤细胞。举例而言，由于免疫刺激性环境和宿主细胞表达EGFRvIII和间皮素，故而EGFRvIII-间皮素融合蛋白(诸如ADU-214)随后能够激活全身性EGFRvIII特异性和间皮素特异性T细胞免疫，由此局部限制表达抗原的肿瘤的生长。因此，可用所公开的方法治疗的适合的癌症包括表达间皮素的癌症和/或表达EGFRvIII的癌症。在一些实施方式中，癌症可为表达间皮素的癌症。在一些方面，举例而言，癌症可具有高水平的间皮素表达。如本文所用，“高水平的间皮素表达”是指与非癌性组织中间皮素表达水平相比，癌性组织中间皮素蛋白的过表达。在一些实施方式中，癌症可为表达EGFRvIII的癌症。在一些实施方式中，癌症可为表达间皮素的癌症和表达EGFRvIII的癌症。
优选地，表达间皮素的癌症、表达EGFRvIII的癌症或表达间皮素的癌症及表达EGFRvIII的癌症为肺癌。肺癌包括非小细胞肺癌(NSCLC)及小细胞肺癌。在一个优选方面，可对患有NSCLC的受试者执行所公开的方法。NSCLC包括NSCLC腺癌、NSCLC鳞状细胞癌、大细胞癌或其任意组合。在一些实施方式中，癌症可为NSCLC腺癌。在一些实施方式中，癌症可为NSCLC鳞状细胞癌。在一些实施方式中，癌症可为大细胞癌。在一些实施方式中，癌症可为NSCLC腺癌、NSCLC鳞状细胞癌和大细胞癌的任意组合。
所公开的方法可用于治疗患有晚期(第IIIb期)或转移性(第IV期)NSCLC腺癌且标准疗法已失败和/或正在进行的受试者。在一些实施方式中，肺癌可为晚期NSCLC腺癌。在其他实施方式中，肺癌可为转移性NSCLC腺癌。NSCLC的标准疗法包括(但不限于)手术、放射、化学疗法或其任意组合。因此，在一些方面，所公开的方法可用于治疗经受手术的受试者。在其他方面，所公开的方法可用于治疗经受放射的受试者。在其他方面，所公开的方法可用于治疗经受化学疗法的受试者。在其他方面，所公开的方法可用于治疗经受先前手术、放射及化学疗法的任意组合的受试者。
任何本文所公开的宿主细胞适用于所公开的方法。举例而言，宿主细胞可为单核细胞增生李斯特菌。在一优选方面，宿主细胞可为单核细胞增生李斯特菌的活减毒菌株，其经遗传修饰以在actA和/或inlB中包含减毒突变，且优选缺失actA及inlB的全部或一部分(在本文中称为“LmΔactA/ΔinlB”)，且含有编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌可为actA缺失(ΔactA)突变体、actA插入突变体、inlB缺失(ΔinlB)突变体、inlB插入突变体或其组合。举例而言，单核细胞增生李斯特菌可为ΔactA/ΔinlB突变体。
施用于受试者的宿主细胞可包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子整合至宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，核酸分子可整合至tRNAArg基因座中。施用于受试者的宿主细胞可包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子，其中该核酸分子以染色体外的方式位于宿主细胞内。
宿主细胞可用作表达平台以在受试者内表达EGFRvIII-间皮素融合蛋白，由此引发针对表达EGFRvIII的肿瘤细胞、表达间皮素的肿瘤细胞或者表达EGFRvIII的肿瘤细胞和表达间皮素的肿瘤细胞二者的抗肿瘤响应。融合蛋白可由受试者内经感染细胞的胞浆中的宿主细胞表达并分泌。经感染细胞包括受试者内可吸收宿主细胞的任何细胞。在一些实施方式中，经感染细胞可为抗原呈递细胞。
任何所公开的融合蛋白可用作免疫原性多肽以引发受试者中的抗肿瘤响应。举例而言，融合蛋白可包含一个或多个EGFRvIII多肽。在一些实施方式中，融合蛋白可包含一个EGFRvIII多肽。在其他实施方式中，融合蛋白可包含多个EGFRvIII多肽。EGFRvIII多肽的适合拷贝数包括(但不限于)2个、3个、4个、5个或更多个拷贝。在一些实施方式中，举例而言，融合蛋白可包含EGFRvIII多肽的2个、3个、4个、5个或更多个拷贝。EGFRvIII-间皮素融合蛋白可包含一个或多个EGFRvIII多肽，其具有与SEQ ID NO:9具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
适合的间皮素多肽包括具有与间皮素的氨基酸35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列的间皮素多肽。举例而言，EGFRvIII-间皮素融合蛋白可包含具有与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列的间皮素多肽。
在一些实施方式中，该方法可包含向受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子，其中该融合蛋白包含与如SEQID NO:8的氨基酸残基89至840中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。在一些方面，融合蛋白可包含与如SEQ ID NO:8的氨基酸残基89至840中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。在其他方面，融合蛋白可由与如SEQ ID NO:8的氨基酸残基89至840中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列组成。在其他方面，融合蛋白可基本上由与如SEQ ID NO:8的氨基酸残基89至840中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，该方法可包含向受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子，其中该融合蛋白包含以下各物、由以下各物组成或基本上由以下各物组成：一个或多个EGFRvIII多肽，其中的每一个包含与如SEQ ID NO:9中所述的EGFRvIII具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列；和间皮素多肽，其包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，该方法可包含向受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子，其中该融合蛋白包含以下各物、由以下各物组成或基本上由以下各物组成：EGFRvIIIx5多肽，其包含与如SEQ ID NO:10中所述的EGFRvIIIx5具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列；和间皮素多肽，其包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
所公开的融合蛋白可另外包含信号序列。因此，在一些实施方式中，该方法可包含向受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子，其中该EGFRvIII-间皮素融合蛋白包含与如SEQ ID NO:8中所述的ActAN100*-EGFRvIIIx5-间皮素35-622或其免疫原性片段具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列、由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。
用于该方法的适合核酸分子包括任何本文所公开的核酸分子。示例性核酸分子为如SEQ ID NO:7中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622多核苷酸。在一些实施方式中，举例而言，核酸分子可包含与如SEQ ID NO:7中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，核酸分子可由与如SEQ ID NO:7中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列组成。在一些实施方式中，核酸分子可基本上由与如SEQID NO:7中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列组成。
在一些实施方式中，核酸分子可包含以下各物、由以下各物组成或基本上由以下各物组成：与如SEQ ID NO:4中所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的一个或多个EGFRvIII多核苷酸以及与如SEQ ID NO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的间皮素多核苷酸。在一些实施方式中，核酸分子可包含以下各物、由以下各物组成或基本上由以下各物组成：与如SEQ ID NO:5中所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸以及与如SEQ ID NO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸。
适合的核酸分子可另外包含编码启动子和/或信号序列的核苷酸序列。举例而言，在一些实施方式中，核酸分子可包含与如SEQ ID NO:1中所述的actAp-ActAN100*-EGFRvIII-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列、由该核苷酸序列组成或基本上由该核苷酸序列组成。在其他实施方式中，核酸分子可由与SEQ ID NO:1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列组成。在其他实施方式中，核酸分子可基本上由与SEQ ID NO:1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列组成。
所公开的方法可另外包含在施用组合物之前，在来自受试者的生物样品中测定间皮素水平和/或检测EGFRvIII。在来自受试者的生物样品中测定间皮素水平和/或检测EGFRvIII的存在的方法包括(但不限于)免疫组织化学(IHC)、蛋白印迹法、显微法、免疫沉淀、BCA分析、分光光度法或其任意组合。可在包括(但不限于)血液、淋巴液、骨髓、实体肿瘤样品或其任意组合的生物样品中检测间皮素水平和/或EGFRvIII。
组合物可另外包含药学上可接受的赋形剂。举例而言，宿主细胞可与任何适合的缓冲液组合，包括(但不限于)磷酸盐缓冲盐水(PBS)和甘油。在示例性实施方式中，组合物可调配于Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)和甘油中，在施用前冷冻储存(处于或低于-60℃)，且在氯化钠中通过静脉内(IV)输注经适合的时间段施用。本领域技术人员应知晓，施用组合物的时间段部分地取决于癌症类型、癌症的严重程度以及受试者的年龄、体重等。优选地，组合物可经数小时时段施用。举例而言，组合物可经1至2小时时段施用。在其他实施方式中，组合物可在小于1至2小时内施用。在其他实施方式中，组合物可在大于1至2小时内施用。
治疗可包括单剂量组合物或多剂量组合物。因此，所公开的方法可包含向受试者施用一次或多次剂量的包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子。可决定剂量次数的因素包括例如癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合。不意欲为限制性，剂量次数可基于癌症的进程或降低进程失败、癌症症状的严重程度增加或严重程度无变化、癌症症状的频率增加或频率无变化、肿瘤尺寸增加或尺寸无变化或其任意组合来增加。举例而言，可对受试者施用1次至100次剂量或更多次剂量的组合物。
可决定宿主细胞的剂量的因素包括例如癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合。在一些实施方式中，组合物可包含约1×108至约1×109个菌落形成单位(CFU)的宿主细胞。在一些方面，组合物可包含约1×108个CFU的宿主细胞。在一些方面，组合物可包含约1×109个CFU的宿主细胞。
组合物可约每7天施用一次、约每14天施用一次、约每21天施用一次、约每28天施用一次、约每35天施用一次、约每42天施用一次、约每49天施用一次、约每56天施用一次、约每63天施用一次、约每70天施用一次、约每77天施用一次、约每84天施用一次或约每91天施用一次。
基于前述内容，本领域技术人员应理解，可通过施用所述剂量的任何本文所述的组合物来治疗受试者的癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药以所述规则间隔重复。因此，在一个实施方式中，组合物可以约1×108至约1×109个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每7天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×108至约1×109个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每14天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×108至约1×109个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每21天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×108至约1×109个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每35天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×108至约1×109个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每45天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×108至约1×109个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每60天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×108至约1×109个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每90天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×108个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每7天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×108个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每14天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×108个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每21天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×108个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每35天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×108个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每45天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×108个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每60天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×108个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每90天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×109个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每7天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×109个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每14天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×109个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每21天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×109个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每35天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×109个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每45天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×109个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每60天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。在一个实施方式中，组合物可以约1×109个CFU的剂量施用于受试者以治疗癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合，其中给药约每90天重复一次。此外，本文所述的组合物可以适于此类剂量以此方式施用的医药制剂形式制备。
优选地，治疗可在剂量之间包括不向受试者施用组合物的时间段。举例而言，该方法可包括：向受试者施用第一剂量的包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子；监测第一剂量的功效；且若第一剂量无效，则向受试者施用一次或多次剂量的所述组合物。可决定组合物的功效的因素包括例如癌症的进程、癌症症状的严重程度、癌症症状的频率、肿瘤尺寸或其任意组合。不意欲为限制性，癌症的进程或降低进程失败、癌症症状的严重程度增加或严重程度无变化、癌症症状的频率增加或频率无变化、肿瘤尺寸增加或尺寸无变化或其任意组合可为第一剂量的组合物无效的指征。在剂量之间的适合时间段包括数天、数周或数月。在一些实施方式中，在剂量之间的时间段可为约1天至约90天、约5天至约80天、约10天至约70天、约15天至约60天、约20天至约50天或约25天至约40天。举例而言，在剂量之间的时间段可为约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约14天、约21天、约28天、约35天、约42天、约49天、约56天、约60天、约65天、约70天、约80天、约85天或约90天。
向受试者施用组合物的适合模式包括(但不限于)静脉内、口服、皮下、皮内、肌肉内、腹膜内、经粘膜、经鼻施用或其任意组合。在一些实施方式中，可静脉内进行施用步骤。
治疗可另外包含在施用组合物之后，向受试者施用抗生素。举例而言，一旦向患者施用最后一剂的组合物且在适合的间隔时间之后，可给予患者抗生素。因此，在一优选方面，在最后一剂的组合物之后施用抗生素。在对青霉素过敏的受试者中，适合的抗生素包括(但不限于)阿莫西林或甲氧苄啶(trimethoprim)/磺胺甲基异噁唑(sulfamethoxazole)。本领域技术人员将能够确定向受试者施用抗生素的足够的剂量和给药方案。
提供以下实施例以进一步描述一些本文所公开的实施方式。所述实施例意在说明而非限制所公开的实施方式。
实施例
方法
细菌菌株
所公开的研究中所用的细菌菌株在表2中列出。
表2
菌株 别名 抗原盒
Lm11 LmΔactAΔinlB 无
CRS-207 hMeso38 间皮素35-622
ADU-214 PL1304 EGFRvIIIx5-间皮素35-622
ADU-214的分子构建
将221个碱基对(bp)actA启动子和258bp经修饰的信号序列ActAN100*克隆至pPL2整合载体的衍生物中作为KpnI-BamHI片段。将486bp的编码EGFRvIII新抗原接合区的5个拷贝(EGFRvIIIx5)的序列克隆于具有ActAN100*的框架中作为BamHI-MfeI片段。框内克隆1767bp的编码人类间皮素的氨基酸35-622(间皮素35-622)的序列作为MfeI-EagI片段。如以援引方式并入本文中的Lauer,P.等人,Construction,Characterization and Use of TwoListeria monocytogenes site-specific phage integration vectors.J.Bacteriology(2002)184(15):4177-4186)中所述，将整个表达盒插入在LADD平台菌株(Lm11，也称为LmΔactAΔinlB)的tRNAArg基因座，且移除载体骨架序列。
ADU-214和CRS-207的示意图分别示出在图1A及图1B中。
肉汤培养生长细胞的蛋白印迹和细胞内感染
对于肉汤培养生长蛋白印迹，使李斯特菌菌株在酵母培养基中生长至OD600为2.0。通过离心移除细菌且上清液在冰上进行TCA沉淀。离心上清液，沉淀用丙酮洗涤且再悬浮于还原性LDS缓冲液(Invitrogen)中。将样品加热至95℃持续10分钟，且在4％～12％聚丙烯酰胺凝胶上操作等效量并转移至硝化纤维素膜以用于蛋白印迹分析。用针对ActA蛋白的成熟N端培养的多株抗体探测印迹。用Licor Odyssey IR检测系统对检测进行可视化和定量。
对于细胞内蛋白印迹，DC2.4细胞以10倍感染倍率(MOI)用各Lm菌株接种1小时，且细胞用PBS和补充有50μg/mL庆大霉素的DMEM培养基洗涤3次。在感染后7小时收集细胞。细胞用SDS样品缓冲液溶解，收集且在4％～12％聚丙烯酰胺凝胶上操作并转移至硝化纤维素膜以用于蛋白印迹分析。细胞内蛋白印迹采用针对ActA蛋白的成熟N端培养的多株抗体且用抗p60单克隆抗体归一化至p60表达(无关Lm蛋白)。用Licor Odyssey IR检测系统对抗原检测进行可视化和定量。
经疫苗接种的小鼠中的抗原特异性免疫响应
对于间皮素特异性免疫原性，Balb/c小鼠(n＝5)用2×106cfu ADU-214静脉内(IV)疫苗接种。在七天之后，收集脾脏且通过IFNγELIspot分析，使用间皮素的重叠肽库(153个由11个氨基酸重叠的15聚肽)或未刺激的培养基对照测定免疫响应。对于EGFRvIII特异性免疫原性，C3H/HeN小鼠(n＝4)用5×106cfu ADU-214静脉内疫苗接种。在七天之后，收集脾脏且通过IFNγELIspot分析，使用EGFRvIII26-33(Kk结合肽EEKKGNYV)测定免疫响应。
针对野生型李斯特菌激发的保护性免疫
Balb/c小鼠用2×106cfu各Lm菌株静脉内疫苗接种一次。四十天后，小鼠用5×104cfu(2倍LD50剂量)野生型(WT)Lm菌株DP-L4056静脉内激发(描述于Lauer,P.等人,Construction,Characterization and Use of Two Listeria monocytogenes site-specific phage integration vectors.J.Bacteriology(2002)184(15):4177-4186)，其以援引方式并入本文中)。三天后，收集脾脏且均质化。将稀释液涂覆于含有200μg/mL链霉素的BHI盘上以测定每个器官的cfu。此分析中的检出限(LOD)为50CFU。
肿瘤研究
将CT26肿瘤细胞用表达人类间皮素的DNA质粒转染以产生稳定细胞系CT26-hMeso克隆体3。在即将植入之前，使等分试样的冷冻肿瘤细胞解冻且在T细胞培养基中生长至汇合。当汇合时，收集细胞且再悬浮于HBSS中达到1×106个细胞/毫升的浓度以植入每只小鼠每200μL剂量2×105个细胞。在第0天，Balb/c小鼠(每组10只小鼠)用2×105CT26-hMeso细胞静脉内(IV)植入。在肿瘤植入后第3天，静脉内给予小鼠：HBSS；5×106cfu、1×105cfu或5×103cfu的ADU-214；或5×106cfu Lm11(空平台菌株)。监测小鼠的存活率。
癌症的治疗
在标准疗法已失败和在筛选时正在进行标准疗法的患有晚期(第IIIb期)或转移性(第IV期)NSCLC(腺癌)的受试者中进行首次应用于人类(FiH)的1期开放标记多中心研究(2部分研究)，以评估单一药剂ADU-214的安全性、确定推荐的2期剂量(RP2D)并测定初步临床功效及免疫响应。施行治疗直至放射照相的疾病进程得以确认、毒性不可接受、知情同意书被撤回、研究者决定停止治疗、开始后续抗癌疗法或资助者终止研究。
第1部分(剂量升级)：经设计以基于安全性及药代动力学评估来确定RP2D。依次施用两种剂量的ADU-214(剂量群组1-A：1×108个菌落形成单位(CFU)和剂量群组1-B：1×109CFU)，应用经修改的毒性概率区间(mTPI)设计。在各剂量群组中的最后一名受试者已在DLT观察期完成治疗之后，研究评估队(SET)评估所有安全性资料且作出第二组待治疗受试者是否升级(escalate)、保持在当前剂量或降级(de-escalate)剂量群组的决定。
第2部分(剂量扩展)：第2部分经设计以在ADU-214的RP2D确定之后评估两个扩展群组。在第2部分征募大约30名受试者(群组2-A [n＝20]及群组2B[n＝10])且以RP2D加以治疗。所存档的用于间皮素的集中免疫组织化学评定的肿瘤材料可用于第2部分的所有受试者。仅具有过表达间皮素的肿瘤且具有可经受肿瘤核心活组织检查的原发性肿瘤或转移性病灶的受试者被征募至群组2B中。群组2B中的受试者同意治疗前及治疗后进行活组织检查。虽然转移性病灶的治疗前及治疗后活组织检查对于群组1A和1B以及群组2A而言是任选的，但强烈需要转移性病灶的治疗前及治疗后活组织检查以进一步理解研究的分子活性。使用CT或PET CT成像进行活组织检查程序。
在开放标记治疗时段期间，每21天静脉内施用ADU-214一次。经1小时时段静脉内施用ADU-214，必要时视情况增加输注持续时间。施行治疗直至放射照相的疾病进程得以确认、毒性不可接受、知情同意书被撤回、研究者决定停止治疗、开始后续抗癌疗法或资助者终止研究。评估安全性和功效。
研究群体：如下的≥18岁的受试者被征募进行第1部分和第2部分的合并研究：所述受试者患有组织学或细胞学记录的NSCLC腺癌；第III b或IV期疾病；基于计算机断层摄影(CT)成像记录的肿瘤进程；至少1个可测量的疾病部位(仅第2部分)和东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group；ECOG)表现状态评分为0或1。受试者必须已接受至少2次前线美国食品与药物管理局(FDA)批准的全身性疗法，其中一种疗法必须为含铂方案(例外情形：在一线含铂化学疗法之后拒绝二线方案的受试者)。
功效评估：研究者根据实体瘤响应评估准则(V1.1；Eur.J.Cancer 45:228,2009)和免疫相关响应准则(Clin.Cancer Res.15:7412,2009)来评估功效评定。使用具有颈部、胸部、腹部及骨盆的采用IV对比剂的CT扫描评定疾病响应。不耐受IV CT对比剂的受试者用口服对比剂进行CT扫描。可使用磁共振成像(MRI)评估无法使用CT充分成像的疾病部位。仅当临床上指定时才需要脑部MRI。视需要通过放射成像、身体检查或其他程序在该部位进行所有功效评估(包括其他疾病部位)。在整个研究中，在各时间点使用与用于在基线评定疾病的相同评定方法进行这些评定。也在后续抗癌疗法及治疗后随访期的整个存活期中收集数据。
结果
ADU-214在肉汤培养物中的表达
如图2中所说明，EGFRvIII与间皮素35-622融合导致肉汤培养物中的蛋白比CRS-207增加大致50倍。ADU-214融合蛋白经预测为大致88kDa(标记为EGFRvIII-Meso)。CRS-207蛋白经预测为大致72kDa(标记为Meso)。未检测到阴性对照平台菌株Lm11的条带。
ADU-214在经感染细胞中的表达
如图2中所说明，EGFRvIII与间皮素35-622融合导致蛋白的细胞内表达比CRS-207增加大致42倍。ADU-214融合蛋白经预测为大致88kDa。CRS-207蛋白经预测为大致72kDa。p60为与经感染细胞中的细菌数目相关的组成性Lm蛋白，且大致为60kDa。上图示出用ActA多株抗体检测融合蛋白的表达。下图示出用单克隆抗体检测的p60表达。未检测到阴性对照平台菌株Lm11的条带。
经疫苗接种的小鼠中的抗原特异性T细胞免疫响应
ADU-214在Balb/c小鼠中诱导稳固的间皮素特异性T细胞介导的免疫响应(图4A)。ADU-214在C3H/HeN小鼠中诱导稳固的EGFRvIII特异性CD8+T细胞免疫响应(图3A及图3B)。
用ADU-214疫苗接种诱导针对WT李斯特菌激发的保护性免疫
用ADU-214的单一疫苗接种诱导了针对WT李斯特菌激发的完全保护性长期免疫，达到与疫苗平台菌株Lm11相当的程度(图4)。用ADU-214疫苗接种导致在WT-Lm激发之后cfu减少大于6-log。功能性免疫为抗原特异性免疫响应的幅度与免疫响应保护免受未来激发的能力的组合。在此情况下，用完全毒力野生型李斯特菌激发测试功能性。
用ADU-214的治疗性疫苗接种产生剂量依赖性抗肿瘤响应
在治疗性CT26-hMeso肺癌转移模型中，在Balb/c小鼠中测定ADU-214的抗肿瘤功效(图5)。小鼠用不同剂量的ADU-214、空LmΔactAΔinlB平台菌株(ANZ-100)或汉克氏平衡盐溶液(Hank's balanced salt solution；HBSS)静脉内疫苗接种。与疫苗的强力免疫原性一致的是，接受ADU-214的动物与接受ANZ-100(称为Lm11)或HBSS的动物相比具有提高的存活率。在ADU-214施用后延长的存活期具有剂量依赖性，其中在接受最高剂量(5×106CFU)的组中长期存活者为70％，在中间剂量(1×105CFU)组中的长期存活者为60％且在最低剂量(5×103CFU)组中的长期存活者为20％。
本领域技术人员应了解，可对本文所公开的优选实施方式进行许多变化及修改，且此类变化及修改可在不背离本发明的主旨的情况下进行。因此，所附权利要求意在涵盖所有此类等效变化作为落入所公开的组合物和方法的真正主旨和范围内。
此文件中所引用或所描述的各专利、专利申请及公开的公开内容在此以援引方式整体并入本文中。
actAp-ActAN100*-EGFRvIIIx5-间皮素35-622-终止子(SEQ ID NO:1)的组件为：actA启动子(小写)；ActAN100*(大写)；BamHI克隆连接子(第一下划线)；EGFRvIIIx5(斜体)；MfeI克隆连接子(第二下划线)；间皮素35-622(粗体)；终止密码子(taa)。
ADU-214融合蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:8)的组件为：ActAN100*(正常文字)；GS:BamHI克隆连接子(双下划线)；QL:MfeI克隆连接子(虚线下划线)；EGFRvIIIx5(斜体)；间皮素35-622(粗体)。
在一些实施方式中，本发明提供一种融合蛋白，其包含与间皮素多肽融合的表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)多肽。
在一些实施方式中，该EGFRvIII多肽包含与SEQ ID NO:9具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，该融合蛋白包含多个EGFRvIII多肽。在一个实施方式中，该融合蛋白包含EGFRvIII多肽的五个拷贝。
在一些实施方式中，该EGFRvIII多肽由一个或多个切割序列侧接。在一些实施方式中，EGFRvIII多肽为间皮素多肽的N端。
在一些实施方式中，间皮素多肽包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和间皮素多肽，所述一个或多个EGFRvIII多肽的每一个包含与如SEQ ID NO:9中所述的EGFRvIII具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列，且所述间皮素多肽包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，融合蛋白包含EGFRvIIIx5多肽和间皮素多肽，所述EGFRvIIIx5多肽包含与如SEQ ID NO:10中所述的EGFRvIIIx5具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列，且所述间皮素多肽包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，融合蛋白包含与如SEQ ID NO:8的氨基酸残基89至840中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，融合蛋白另外包含信号序列，其中该信号序列与EGFRvIII多肽及间皮素多肽一起位于翻译阅读框中。在一些实施方式中，信号序列与如SEQ ID NO:12中所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性。
在一些实施方式中，任何前述实施方式的融合蛋白包含与SEQ ID NO:8具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，该融合蛋白在细菌中表达。在一个实施方式中，该细菌为单核细胞增生李斯特菌。
在一些实施方式中，本发明提供一种编码任何前述实施方式的融合蛋白的核酸分子。
在一些实施方式中，核酸分子包含与如SEQ ID NO:4中所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的一个或多个EGFRvIII多核苷酸以及与如SEQ ID NO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的间皮素多核苷酸。
在一些实施方式中，核酸分子包含与如SEQ ID NO:5中所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸以及与如SEQ IDNO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸。
在一些实施方式中，该核酸分子为表达盒的一部分。
在一些实施方式中，本发明提供一种宿主细胞，其包含前述实施方式中任一项所述的核酸分子。在一些实施方式中，该宿主细胞为细菌。在一个实施方式中，该细菌为单核细胞增生李斯特菌。在一些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为actA缺失突变体、actA插入突变体、inlB缺失突变体、inlB插入突变体或其组合。在某些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为ΔactA/ΔinlB突变体。
在某些实施方式中，核酸分子整合至宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，核酸分子整合至tRNAArg基因座中。
在一些实施方式中，本发明提供一种载体，其包含前述实施方式中任一项所述的核酸分子。
在一些实施方式中，本发明提供一种编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子，其中该融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和间皮素多肽，所述一个或多个EGFRvIII多肽的每一个包含与如SEQ ID NO:9中所述的EGFRvIII具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列，且所述间皮素多肽包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，EGFR-间皮素融合蛋白包含EGFRvIIIx5多肽和间皮素多肽，所述EGFRvIIIx5多肽包含与如SEQ ID NO:10中所述的EGFRvIIIx5具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列，且所述间皮素多肽包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，EGFR-间皮素融合蛋白包含与如SEQ ID NO:8的氨基酸残基89至840中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，核酸另外包含信号序列，其中该信号序列与编码EGFRvIII多肽的核苷酸序列及编码间皮素多肽的核苷酸序列一起位于翻译框架中。在某些实施方式中，信号序列与如SEQ ID NO:3中所述的ActAN100*具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性。在一些实施方式中，核酸另外包含启动子。在各种实施方式中，启动子与如SEQ ID NO:2中所述的actA启动子具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性。在一些实施方式中，启动子与如SEQ ID NO:18中所述的hly启动子具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性。
在一些实施方式中，前述实施方式中任一项所述的核酸分子包含与SEQ ID NO:1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供一种宿主细胞，其包含前述实施方式中任一项所述的核酸分子。在某些实施方式中，该宿主细胞为细菌。在一个实施方式中，该细菌为单核细胞增生李斯特菌。在各种实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为actA缺失突变体、actA插入突变体、inlB缺失突变体、inlB插入突变体或其组合。在某些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为ΔactA/ΔinlB突变体。在一些实施方式中，核酸分子整合至宿主细胞基因组中。举例而言，核酸分子整合至tRNAArg基因座中。
在一些实施方式中，宿主细胞与药学上可接受的赋形剂组合。
在一些实施方式中，本发明提供一种疫苗，其包含前述实施方式中任一项所述的宿主细胞和药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方式中，本发明提供一种载体，其编码前述实施方式中任一项所述的核酸分子。
在一些实施方式中，本发明提供一种引发受试者中的免疫响应的方法，其包含向该受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子。
在一些实施方式中，核酸分子包含与如SEQ ID NO:4中所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的一个或多个EGFRvIII多核苷酸以及与如SEQ ID NO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的间皮素多核苷酸。
在一些实施方式中，核酸分子包含与如SEQ ID NO:5中所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸以及与如SEQ IDNO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸。
在各种实施方式中，核酸分子包含与SEQ ID NO:1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方式中，核酸分子整合至该宿主细胞的基因组中。举例而言，核酸分子整合至tRNAArg基因座中。
在前述方法中任一项所述的一些实施方式中，宿主细胞为单核细胞增生李斯特菌。在某些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为actA缺失突变体、actA插入突变体、inlB缺失突变体、inlB插入突变体或其组合。在一个实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为ΔactA/ΔinlB突变体。
在前述方法中任一项所述的一些实施方式中，施用步骤于静脉内进行。在某些实施方式中，融合蛋白由受试者内经感染细胞的胞浆中的宿主细胞表达及分泌。在一个实施方式中，经感染细胞为抗原呈递细胞。
在前述方法中任一项所述的一些实施方式中，EGFRvIII-间皮素融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和间皮素多肽，所述一个或多个EGFRvIII多肽的每一个包含与如SEQ ID NO:9中所述的EGFRvIII具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列，且所述间皮素多肽包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在前述方法中任一项所述的一些实施方式中，EGFRvIII-间皮素融合蛋白包含EGFRvIIIx5多肽和间皮素多肽，所述EGFRvIIIx5多肽包含与如SEQ ID NO:10中所述的EGFRvIIIx5具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列，且所述间皮素多肽包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在前述方法中任一项所述的一些实施方式中，EGFRvIII-间皮素融合蛋白包含与如SEQ ID NO:8的氨基酸残基89至840中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本发明提供一种增加间皮素多肽的表达的方法，其包含在宿主细胞中表达包含EGFRvIII多核苷酸及编码间皮素多肽的间皮素多核苷酸的核酸分子。
在一些实施方式中，EGFRvIII多核苷酸与SEQ ID NO:4具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性。
在某些实施方式中，核酸分子包含多个EGFRvIII多核苷酸，其中各EGFRvIII多核苷酸包含与SEQ ID NO:4具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，核酸分子包含EGFRvIII多核苷酸的五个拷贝，其中该EGFRvIII多核苷酸与SEQ ID NO:5具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性。
在各种实施方式中，间皮素多肽包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，核酸分子包含与如SEQ ID NO:4中所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％相同的一个或多个EGFRvIII多核苷酸以及与如SEQ ID NO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的间皮素多核苷酸。在一些实施方式中，核酸分子包含与如SEQ ID NO:5中所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸及与如SEQ IDNO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸。
在某些实施方式中，核酸分子另外包含信号序列和/或启动子，其中所述启动子和/或信号序列可操作地与编码EGFRvIII多肽的核苷酸序列和编码间皮素多肽的核苷酸序列连接。
在一些实施方式中，核酸分子包含与SEQ ID NO:1具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。在前述方法中任一项所述的一些实施方式中，宿主细胞为单核细胞增生李斯特菌。
在前述方法中任一项所述的一些实施方式中，该表达步骤包含用宿主细胞感染感兴趣的细胞。在一些实施方式中，该表达步骤包含向受试者施用宿主细胞。
在一些实施方式中，本发明提供一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的包含宿主细胞的组合物，其中该宿主细胞包含编码EGFRvIII-间皮素融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中，癌症为表达间皮素的癌症和/或表达EGFRvIII的癌症。在一些实施方式中，癌症具有高水平的间皮素表达。在某些实施方式中，癌症为肺癌。在各种实施方式中，肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)腺癌、NSCLC鳞状细胞癌、大细胞癌或其任意组合。在一些实施方式中，肺癌为晚期NSCLC腺癌或转移性NSCLC腺癌。在一个实施方式中，受试者的标准疗法失败。在一些实施方式中，受试者经受手术、放射、化学疗法或其任意组合。
在一些实施方式中，EGFRvIII-间皮素融合蛋白包含具有与SEQ ID NO:9具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列的EGFRvIII多肽。在某些实施方式中，融合蛋白包含多个EGFRvIII多肽。在一个实施方式中，融合蛋白包含EGFRvIII多肽的五个拷贝。
在某些实施方式中，EGFRvIII-间皮素融合蛋白包含具有与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列的间皮素多肽。
在一些实施方式中，EGFRvIII-间皮素融合蛋白包含一个或多个EGFRvIII多肽和间皮素多肽，所述一个或多个EGFRvIII多肽的每一个包含与如SEQ ID NO:9中所述的EGFRvIII具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列，且所述间皮素多肽包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，EGFRvIII-间皮素融合蛋白包含与如SEQ ID NO:10中所述的EGFRvIIIx5具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列及包含与如SEQ ID NO:11中所述的间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列的间皮素多肽。
在一些实施方式中，融合蛋白包含与如SEQ ID NO:8的氨基酸残基89至840中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，EGFRvIII-间皮素融合蛋白包含与如SEQ ID NO:8中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，核酸分子包含与如SEQ ID NO:4中所述的EGFRvIII多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的一个或多个EGFRvIII多核苷酸以及与如SEQ ID NO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的间皮素多核苷酸。
在一些实施方式中，核酸分子包含与如SEQ ID NO:5中所述的EGFRvIIIx5多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸以及与如SEQ IDNO:6中所述的间皮素35-622多核苷酸具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的多核苷酸。
在一些实施方式中，核酸分子包含与如SEQ ID NO:1中所述的actAp-ActAN100*-EGFRvIII-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方式中，核酸分子包含与如SEQ ID NO:7中所述的EGFRvIIIx5-间皮素35-622具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，该核酸分子整合至宿主细胞基因组中。在一个实施方式中，该核酸分子整合至tRNAArg基因座中。在某些实施方式中，宿主细胞为单核细胞增生李斯特菌。在某些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为actA缺失(ΔactA)突变体、actA插入突变体、inlB缺失(ΔinlB)突变体、inlB插入突变体或其组合。在一些实施方式中，单核细胞增生李斯特菌为ΔactA/ΔinlB突变体。
在各种实施方式中，融合蛋白由受试者内经感染细胞的胞浆中的宿主细胞表达及分泌。在一些实施方式中，经感染细胞为抗原呈递细胞。在一些实施方式中，所述方法还包括在施用组合物之前，在来自受试者的生物样品中测定间皮素水平和/或检测EGFRvIII。
在前述方法中任一项所述的一些实施方式中，组合物还包含药学上可接受的赋形剂。在某些实施方式中，药学上可接受的赋形剂包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)和甘油。在某些实施方式中，在静脉内进行施用步骤。在一些实施方式中，所述方法另外包含在施用组合物之后，向受试者施用抗生素。在一些实施方式中，抗生素在最后剂量的组合物之后施用。在某些实施方式中，抗生素为阿莫西林或甲氧苄啶/磺胺甲基异恶唑。
在某些实施方式中，前述实施方式中任一项所述的宿主细胞的核酸分子插入至宿主细胞内的附加型质粒上的表达盒中。
在一些实施方式中，前述实施方式中任一项所述的融合蛋白另外包含信号序列，其中该信号序列与EGFRvIII多肽和间皮素多肽一起位于翻译阅读框中：该信号序列与如SEQ ID NO:20中所述的LLO441信号序列具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性、与如SEQ ID NO:22中所述的LLO441ΔPEST信号序列具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性、或与如SEQ ID NO:24中所述的LLO441Δ26信号序列至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性。
在一些实施方式中，前述实施方式中任一项所述的核酸另外包含信号序列，其中该信号序列与编码EGFRvIII多肽的核苷酸序列和编码间皮素多肽的核苷酸序列一起位于翻译框架中：该信号序列与如SEQ ID NO:20中所述的LLO441信号序列具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性、与如SEQ ID NO:22中所述的LLO441ΔPEST信号序列具有至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性、或与如SEQ ID NO:24中所述的LLO441Δ26信号序列至少i)90％同一性、ii)95％同一性或iii)99％同一性。
本文中所引用的所有专利、公开申请及参考文献的教导以援引方式整体并入本文中。
尽管本发明已参照其示例性实施方式进行了具体展示和描述，但本领域技术人员应了解，在不背离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围的情况下，可在其中做出形式和细节上的各种改变。
SEQUENCE LISTING
<110> 艾杜罗生物科技公司
<120> 表皮生长因子受体变体III-间皮素融合物及其使用方法
<130> 5316.1000-003
<150> 62/146,559
<151> 2015-04-13
<150> 62/243,397
<151> 2015-10-19
<160> 32
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 2744
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合物(fusion)
<400> 1
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tattcttaaa ataattcatg aatatttttt cttatattag ctaattaaga agataattaa 120
ctgctaatcc aatttttaac ggaataaatt agtgaaaatg aaggccgaat tttccttgtt 180
ctaaaaaggt tgtattagcg tatcacgagg agggagtata agtgggatta aatagattta 240
tgcgtgcgat gatggtagtt ttcattactg ccaactgcat tacgattaac cccgacataa 300
tatttgcagc gacagatagc gaagattcca gtctaaacac agatgaatgg gaagaagaat 360
acgaaactgc acgtgaagta agttcacgtg atattgagga actagaaaaa tcgaataaag 420
tgaaaaatac gaacaaagca gaccaagata ataaacgtaa agcaaaagca gagaaaggtg 480
gatccgcaag caaagtattg ccagctagtc gtgcattaga ggagaaaaag gggaattacg 540
tggtgacgga tcatggatcg tgtgccgatg gctcagtaaa gactagtgcg agcaaagtgg 600
cccctgcatc acgagcactt gaagagaaaa aaggaaacta tgttgtgacc gatcatggta 660
gctgcggaga tggttcaatt aaattatcaa aagtcttacc agcatctaga gctttagagg 720
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gtgcgctaga agagaagaaa ggaaattacg tagttacaga ccacggctct tgcgcggatg 960
gttccgttaa acaattgcgt acattagcag gtgaaacagg tcaagaagca gcaccacttg 1020
acggtgtatt aacgaatcca ccaaatatat caagtttaag tccacgtcaa ttattaggtt 1080
ttccatgtgc agaagtttca ggtttaagta cagaacgtgt ccgtgagtta gcagttgcat 1140
tagcacaaaa aaacgttaaa ttatctacag aacagttacg ttgtttagcc catagattaa 1200
gcgaaccacc agaagactta gatgcacttc ctttagacct tcttttattc ttaaatccag 1260
atgcattttc aggaccacaa gcatgtacac gtttttttag tcgaattaca aaagccaatg 1320
ttgatttatt acctcgtggg gctcctgaaa gacaacgttt attacctgct gcattagcat 1380
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 启动子(promoter)
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 融合物(fusion)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 片段
<400> 6
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caaatggatc gtgttaatgc tattccattc acatatgaac aattagatgt tttaaagcat 960
aaattagacg aattatatcc acaaggttat ccagaatcag ttattcaaca tttaggttac 1020
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attgatagat tcgttaaagg ccgtggtcaa ttagataaag atactttaga tacattaaca 1200
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acagttgcag aagttcaaaa attattaggt ccacacgtag aaggattaaa agcagaagaa 1560
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 片段
<400> 7
gcaagcaaag tattgccagc tagtcgtgca ttagaggaga aaaaggggaa ttacgtggtg 60
acggatcatg gatcgtgtgc cgatggctca gtaaagacta gtgcgagcaa agtggcccct 120
gcatcacgag cacttgaaga gaaaaaagga aactatgttg tgaccgatca tggtagctgc 180
ggagatggtt caattaaatt atcaaaagtc ttaccagcat ctagagcttt agaggaaaag 240
aagggtaact atgtcgtaac agatcatgga agttgtgctg acggaagtgt taaagcgtcg 300
aaagtagctc cagcttctcg cgcattagaa gaaaagaaag gcaattatgt tgtaacagac 360
catggtagtt gtggtgatgg ctcgatcaaa ttgtcaaaag ttctaccggc ttctcgtgcg 420
ctagaagaga agaaaggaaa ttacgtagtt acagaccacg gctcttgcgc ggatggttcc 480
gttaaacaat tgcgtacatt agcaggtgaa acaggtcaag aagcagcacc acttgacggt 540
gtattaacga atccaccaaa tatatcaagt ttaagtccac gtcaattatt aggttttcca 600
tgtgcagaag tttcaggttt aagtacagaa cgtgtccgtg agttagcagt tgcattagca 660
caaaaaaacg ttaaattatc tacagaacag ttacgttgtt tagcccatag attaagcgaa 720
ccaccagaag acttagatgc acttccttta gaccttcttt tattcttaaa tccagatgca 780
ttttcaggac cacaagcatg tacacgtttt tttagtcgaa ttacaaaagc caatgttgat 840
ttattacctc gtggggctcc tgaaagacaa cgtttattac ctgctgcatt agcatgctgg 900
ggtgttcgcg gtagcttatt aagtgaagcc gatgttcgtg ctttaggggg tttagcatgt 960
gatttacctg gtcgtttcgt tgcagaatca gcagaagtgt tattaccgag attagtttca 1020
tgcccaggac ctttagatca agatcaacaa gaggcagcta gagcagctct tcaaggagga 1080
ggcccaccat atggcccacc aagtacatgg agtgtttcta caatggatgc gttaagaggt 1140
ttattaccgg ttttaggaca accaattatt cgtagtattc cacaaggcat tgtagcagca 1200
tggcgtcaac gtagttctcg tgatccgtct tggcgacaac cagaacgtac aattctacgt 1260
ccaagatttc gtagagaagt agaaaaaacg gcgtgtccta gtggcaaaaa agcacgtgaa 1320
attgatgaaa gtttaatttt ttataaaaaa tgggaattag aagcatgtgt cgatgcagca 1380
ttactagcta cacaaatgga tcgtgttaat gctattccat tcacatatga acaattagat 1440
gttttaaagc ataaattaga cgaattatat ccacaaggtt atccagaatc agttattcaa 1500
catttaggtt acttattttt aaaaatgagt ccagaagaca tacgcaaatg gaatgttaca 1560
agtttagaaa cattaaaagc gcttttagaa gttaacaaag gtcatgaaat gagtccacaa 1620
gttgctacgt taattgatag attcgttaaa ggccgtggtc aattagataa agatacttta 1680
gatacattaa cagcatttta tcctggctac ttatgcagtt tatcaccaga agaattaagt 1740
tccgttccac cgagtagtat ctgggcagtt cgtccgcaag atttagatac atgcgaccca 1800
cgtcaattag atgttttata tccaaaagca agattagctt tccaaaatat gaacggtagt 1860
gaatatttcg taaaaattca atccttttta ggtggtgcac caactgaaga tctaaaagca 1920
ttaagccaac aaaatgtaag tatggattta gctacgttta tgaaattacg tacagatgca 1980
gttctaccat taacagttgc agaagttcaa aaattattag gtccacacgt agaaggatta 2040
aaagcagaag aacgtcaccg tccagttcgc gattggattt tacgtcaacg tcaagatgat 2100
ttagatacat taggtttagg tttacaaggc ggtattccga atggatattt agtgttagat 2160
ttatcggttc aagaagcatt aagtggtaca ccgtgtttat taggtccagg tccagtttta 2220
acagtgttag cattattatt agccagtaca ttagct 2256
<210> 8
<211> 840
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合物(fusion)
<400> 8
Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr
1 5 10 15
Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp
20 25 30
Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Tyr Glu
35 40 45
Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser
50 55 60
Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Gln Asp Asn Lys Arg Lys
65 70 75 80
Ala Lys Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ala Ser Lys Val Leu Pro Ala Ser
85 90 95
Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly
100 105 110
Ser Cys Ala Asp Gly Ser Val Lys Thr Ser Ala Ser Lys Val Ala Pro
115 120 125
Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp
130 135 140
His Gly Ser Cys Gly Asp Gly Ser Ile Lys Leu Ser Lys Val Leu Pro
145 150 155 160
Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp
165 170 175
His Gly Ser Cys Ala Asp Gly Ser Val Lys Ala Ser Lys Val Ala Pro
180 185 190
Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp
195 200 205
His Gly Ser Cys Gly Asp Gly Ser Ile Lys Leu Ser Lys Val Leu Pro
210 215 220
Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp
225 230 235 240
His Gly Ser Cys Ala Asp Gly Ser Val Lys Gln Leu Arg Thr Leu Ala
245 250 255
Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu Thr Asn
260 265 270
Pro Pro Asn Ile Ser Ser Leu Ser Pro Arg Gln Leu Leu Gly Phe Pro
275 280 285
Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu Ser Thr Glu Arg Val Arg Glu Leu Ala
290 295 300
Val Ala Leu Ala Gln Lys Asn Val Lys Leu Ser Thr Glu Gln Leu Arg
305 310 315 320
Cys Leu Ala His Arg Leu Ser Glu Pro Pro Glu Asp Leu Asp Ala Leu
325 330 335
Pro Leu Asp Leu Leu Leu Phe Leu Asn Pro Asp Ala Phe Ser Gly Pro
340 345 350
Gln Ala Cys Thr Arg Phe Phe Ser Arg Ile Thr Lys Ala Asn Val Asp
355 360 365
Leu Leu Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg Gln Arg Leu Leu Pro Ala Ala
370 375 380
Leu Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser Leu Leu Ser Glu Ala Asp Val
385 390 395 400
Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu Pro Gly Arg Phe Val Ala
405 410 415
Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg Leu Val Ser Cys Pro Gly Pro
420 425 430
Leu Asp Gln Asp Gln Gln Glu Ala Ala Arg Ala Ala Leu Gln Gly Gly
435 440 445
Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp Ser Val Ser Thr Met Asp
450 455 460
Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu Gly Gln Pro Ile Ile Arg Ser
465 470 475 480
Ile Pro Gln Gly Ile Val Ala Ala Trp Arg Gln Arg Ser Ser Arg Asp
485 490 495
Pro Ser Trp Arg Gln Pro Glu Arg Thr Ile Leu Arg Pro Arg Phe Arg
500 505 510
Arg Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser Gly Lys Lys Ala Arg Glu
515 520 525
Ile Asp Glu Ser Leu Ile Phe Tyr Lys Lys Trp Glu Leu Glu Ala Cys
530 535 540
Val Asp Ala Ala Leu Leu Ala Thr Gln Met Asp Arg Val Asn Ala Ile
545 550 555 560
Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val Leu Lys His Lys Leu Asp Glu
565 570 575
Leu Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Val Ile Gln His Leu Gly Tyr
580 585 590
Leu Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile Arg Lys Trp Asn Val Thr
595 600 605
Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu Val Asn Lys Gly His Glu
610 615 620
Met Ser Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp Arg Phe Val Lys Gly Arg
625 630 635 640
Gly Gln Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr Leu Thr Ala Phe Tyr Pro
645 650 655
Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro
660 665 670
Ser Ser Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro
675 680 685
Arg Gln Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn
690 695 700
Met Asn Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly
705 710 715 720
Ala Pro Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser Gln Gln Asn Val Ser Met
725 730 735
Asp Leu Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu
740 745 750
Thr Val Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu
755 760 765
Lys Ala Glu Glu Arg His Arg Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln
770 775 780
Arg Gln Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile
785 790 795 800
Pro Asn Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu Ser Val Gln Glu Ala Leu Ser
805 810 815
Gly Thr Pro Cys Leu Leu Gly Pro Gly Pro Val Leu Thr Val Leu Ala
820 825 830
Leu Leu Leu Ala Ser Thr Leu Ala
835 840
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 片段
<400> 9
Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr
1 5 10 15
Asp His Gly Ser Cys
20
<210> 10
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 片段
<400> 10
Ala Ser Lys Val Leu Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly
1 5 10 15
Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Ala Asp Gly Ser Val Lys
20 25 30
Thr Ser Ala Ser Lys Val Ala Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys
35 40 45
Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Gly Asp Gly Ser
50 55 60
Ile Lys Leu Ser Lys Val Leu Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys
65 70 75 80
Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Ala Asp Gly Ser
85 90 95
Val Lys Ala Ser Lys Val Ala Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys
100 105 110
Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Gly Asp Gly Ser
115 120 125
Ile Lys Leu Ser Lys Val Leu Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys
130 135 140
Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Ala Asp Gly Ser
145 150 155 160
Val Lys
<210> 11
<211> 588
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 片段
<400> 11
Arg Thr Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly
1 5 10 15
Val Leu Thr Asn Pro Pro Asn Ile Ser Ser Leu Ser Pro Arg Gln Leu
20 25 30
Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu Ser Thr Glu Arg Val
35 40 45
Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys Asn Val Lys Leu Ser Thr
50 55 60
Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His Arg Leu Ser Glu Pro Pro Glu Asp
65 70 75 80
Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Leu Phe Leu Asn Pro Asp Ala
85 90 95
Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys Thr Arg Phe Phe Ser Arg Ile Thr Lys
100 105 110
Ala Asn Val Asp Leu Leu Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg Gln Arg Leu
115 120 125
Leu Pro Ala Ala Leu Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser Leu Leu Ser
130 135 140
Glu Ala Asp Val Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg Leu Val Ser
165 170 175
Cys Pro Gly Pro Leu Asp Gln Asp Gln Gln Glu Ala Ala Arg Ala Ala
180 185 190
Leu Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp Ser Val
195 200 205
Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu Gly Gln Pro
210 215 220
Ile Ile Arg Ser Ile Pro Gln Gly Ile Val Ala Ala Trp Arg Gln Arg
225 230 235 240
Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gln Pro Glu Arg Thr Ile Leu Arg
245 250 255
Pro Arg Phe Arg Arg Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser Gly Lys
260 265 270
Lys Ala Arg Glu Ile Asp Glu Ser Leu Ile Phe Tyr Lys Lys Trp Glu
275 280 285
Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala Leu Leu Ala Thr Gln Met Asp Arg
290 295 300
Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val Leu Lys His
305 310 315 320
Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Val Ile Gln
325 330 335
His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile Arg Lys
340 345 350
Trp Asn Val Thr Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu Val Asn
355 360 365
Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp Arg Phe
370 375 380
Val Lys Gly Arg Gly Gln Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr Leu Thr
385 390 395 400
Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser
405 410 415
Ser Val Pro Pro Ser Ser Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp Leu Asp
420 425 430
Thr Cys Asp Pro Arg Gln Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu
435 440 445
Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile Gln Ser
450 455 460
Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser Gln Gln
465 470 475 480
Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg Thr Asp Ala
485 490 495
Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu Gly Pro His
500 505 510
Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg His Arg Pro Val Arg Asp Trp
515 520 525
Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly Leu Gly Leu
530 535 540
Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu Ser Val Gln
545 550 555 560
Glu Ala Leu Ser Gly Thr Pro Cys Leu Leu Gly Pro Gly Pro Val Leu
565 570 575
Thr Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala Ser Thr Leu Ala
580 585
<210> 12
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合物(fusion)
<400> 12
Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr
1 5 10 15
Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp
20 25 30
Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Tyr Glu
35 40 45
Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser
50 55 60
Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Gln Asp Asn Lys Arg Lys
65 70 75 80
Ala Lys Ala Glu Lys Gly Gly Ser
85
<210> 13
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 片段
<400> 13
ccagctagtc gtgcattaga ggagaaaaag gggaattacg tggtgacgga tcatggatcg 60
tgt 63
<210> 14
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 片段
<400> 14
cctgcatcac gagcacttga agagaaaaaa ggaaactatg ttgtgaccga tcatggtagc 60
tgc 63
<210> 15
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 片段
<400> 15
ccagcatcta gagctttaga ggaaaagaag ggtaactatg tcgtaacaga tcatggaagt 60
tgt 63
<210> 16
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 片段
<400> 16
ccagcttctc gcgcattaga agaaaagaaa ggcaattatg ttgtaacaga ccatggtagt 60
tgt 63
<210> 17
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 片段
<400> 17
ccggcttctc gtgcgctaga agagaagaaa ggaaattacg tagttacaga ccacggctct 60
tgc 63
<210> 18
<211> 231
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 启动子(promoter)
<400> 18
tcctttgatt agtatattcc tatcttaaag ttacttttat gtggaggcat taacatttgt 60
taatgacgtc aaaaggatag caagactaga ataaagctat aaagcaagca tataatattg 120
cgtttcatct ttagaagcga atttcgccaa tattataatt atcaaaagag aggggtggca 180
aacggtattt ggcattatta ggttaaaaaa tgtagaagga gagtgaaacc c 231
<210> 19
<211> 1323
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LLO441 sequence
<400> 19
atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60
caaactgaag caaaggatgc atctgcattc aataaagaaa attcaatttc atccatggca 120
ccaccagcat ctccgcctgc aagtcctaag acgccaatcg aaaagaaaca cgcggatgaa 180
atcgataagt atatacaagg attggattac aataaaaaca atgtattagt ataccacgga 240
gatgcagtga caaatgtgcc gccaagaaaa ggttacaaag atggaaatga atatattgtt 300
gtggagaaaa agaagaaatc catcaatcaa aataatgcag acattcaagt tgtgaatgca 360
atttcgagcc taacctatcc aggtgctctc gtaaaagcga attcggaatt agtagaaaat 420
caaccagatg ttctccctgt aaaacgtgat tcattaacac tcagcattga tttgccaggt 480
atgactaatc aagacaataa aatagttgta aaaaatgcca ctaaatcaaa cgttaacaac 540
gcagtaaata cattagtgga aagatggaat gaaaaatatg ctcaagctta tccaaatgta 600
agtgcaaaaa ttgattatga tgacgaaatg gcttacagtg aatcacaatt aattgcgaaa 660
tttggtacag catttaaagc tgtaaataat agcttgaatg taaacttcgg cgcaatcagt 720
gaagggaaaa tgcaagaaga agtcattagt tttaaacaaa tttactataa cgtgaatgtt 780
aatgaaccta caagaccttc cagatttttc ggcaaagctg ttactaaaga gcagttgcaa 840
gcgcttggag tgaatgcaga aaatcctcct gcatatatct caagtgtggc gtatggccgt 900
caagtttatt tgaaattatc aactaattcc catagtacta aagtaaaagc tgcttttgat 960
gctgccgtaa gcggaaaatc tgtctcaggt gatgtagaac taacaaatat catcaaaaat 1020
tcttccttca aagccgtaat ttacggaggt tccgcaaaag atgaagttca aatcatcgac 1080
ggcaacctcg gagacttacg cgatattttg aaaaaaggcg ctacttttaa tcgagaaaca 1140
ccaggagttc ccattgctta tacaacaaac ttcctaaaag acaatgaatt agctgttatt 1200
aaaaacaact cagaatatat tgaaacaact tcaaaagctt atacagatgg aaaaattaac 1260
atcgatcact ctggaggata cgttgctcaa ttcaacattt cttgggatga agtaaattat 1320
gat 1323
<210> 20
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LLO441 sequence
<400> 20
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp
435 440
<210> 21
<211> 1266
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 片段
<400> 21
atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60
caaactgaag caaaggatgc atctgcattc aatacgccaa tcgaaaagaa acacgcggat 120
gaaatcgata agtatataca aggattggat tacaataaaa acaatgtatt agtataccac 180
ggagatgcag tgacaaatgt gccgccaaga aaaggttaca aagatggaaa tgaatatatt 240
gttgtggaga aaaagaagaa atccatcaat caaaataatg cagacattca agttgtgaat 300
gcaatttcga gcctaaccta tccaggtgct ctcgtaaaag cgaattcgga attagtagaa 360
aatcaaccag atgttctccc tgtaaaacgt gattcattaa cactcagcat tgatttgcca 420
ggtatgacta atcaagacaa taaaatagtt gtaaaaaatg ccactaaatc aaacgttaac 480
aacgcagtaa atacattagt ggaaagatgg aatgaaaaat atgctcaagc ttatccaaat 540
gtaagtgcaa aaattgatta tgatgacgaa atggcttaca gtgaatcaca attaattgcg 600
aaatttggta cagcatttaa agctgtaaat aatagcttga atgtaaactt cggcgcaatc 660
agtgaaggga aaatgcaaga agaagtcatt agttttaaac aaatttacta taacgtgaat 720
gttaatgaac ctacaagacc ttccagattt ttcggcaaag ctgttactaa agagcagttg 780
caagcgcttg gagtgaatgc agaaaatcct cctgcatata tctcaagtgt ggcgtatggc 840
cgtcaagttt atttgaaatt atcaactaat tcccatagta ctaaagtaaa agctgctttt 900
gatgctgccg taagcggaaa atctgtctca ggtgatgtag aactaacaaa tatcatcaaa 960
aattcttcct tcaaagccgt aatttacgga ggttccgcaa aagatgaagt tcaaatcatc 1020
gacggcaacc tcggagactt acgcgatatt ttgaaaaaag gcgctacttt taatcgagaa 1080
acaccaggag ttcccattgc ttatacaaca aacttcctaa aagacaatga attagctgtt 1140
attaaaaaca actcagaata tattgaaaca acttcaaaag cttatacaga tggaaaaatt 1200
aacatcgatc actctggagg atacgttgct caattcaaca tttcttggga tgaagtaaat 1260
tatgat 1266
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<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 片段
<400> 22
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Thr
20 25 30
Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr Ile Gln Gly
35 40 45
Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly Asp Ala Val
50 55 60
Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn Glu Tyr Ile
65 70 75 80
Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn Ala Asp Ile
85 90 95
Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly Ala Leu Val
100 105 110
Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val Leu Pro Val
115 120 125
Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly Met Thr Asn
130 135 140
Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser Asn Val Asn
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Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys Tyr Ala Gln
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Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp Glu Met Ala
180 185 190
Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala Phe Lys Ala
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Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser Glu Gly Lys
210 215 220
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225 230 235 240
Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys Ala Val Thr
245 250 255
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Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu Ser
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Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn Ile Ile Lys
305 310 315 320
Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala Lys Asp Glu
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Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp Ile Leu Lys
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Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro Ile Ala Tyr
355 360 365
Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile Lys Asn Asn
370 375 380
Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Lys Ile
385 390 395 400
Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn Ile Ser Trp
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Asp Glu Val Asn Tyr Asp
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 片段
<400> 23
atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60
caaactgaag caaaggatgc atctgcattc aataaagaag aaatcgataa gtatatacaa 120
ggattggatt acaataaaaa caatgtatta gtataccacg gagatgcagt gacaaatgtg 180
ccgccaagaa aaggttacaa agatggaaat gaatatattg ttgtggagaa aaagaagaaa 240
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ccaggtgctc tcgtaaaagc gaattcggaa ttagtagaaa atcaaccaga tgttctccct 360
gtaaaacgtg attcattaac actcagcatt gatttgccag gtatgactaa tcaagacaat 420
aaaatagttg taaaaaatgc cactaaatca aacgttaaca acgcagtaaa tacattagtg 480
gaaagatgga atgaaaaata tgctcaagct tatccaaatg taagtgcaaa aattgattat 540
gatgacgaaa tggcttacag tgaatcacaa ttaattgcga aatttggtac agcatttaaa 600
gctgtaaata atagcttgaa tgtaaacttc ggcgcaatca gtgaagggaa aatgcaagaa 660
gaagtcatta gttttaaaca aatttactat aacgtgaatg ttaatgaacc tacaagacct 720
tccagatttt tcggcaaagc tgttactaaa gagcagttgc aagcgcttgg agtgaatgca 780
gaaaatcctc ctgcatatat ctcaagtgtg gcgtatggcc gtcaagttta tttgaaatta 840
tcaactaatt cccatagtac taaagtaaaa gctgcttttg atgctgccgt aagcggaaaa 900
tctgtctcag gtgatgtaga actaacaaat atcatcaaaa attcttcctt caaagccgta 960
atttacggag gttccgcaaa agatgaagtt caaatcatcg acggcaacct cggagactta 1020
cgcgatattt tgaaaaaagg cgctactttt aatcgagaaa caccaggagt tcccattgct 1080
tatacaacaa acttcctaaa agacaatgaa ttagctgtta ttaaaaacaa ctcagaatat 1140
attgaaacaa cttcaaaagc ttatacagat ggaaaaatta acatcgatca ctctggagga 1200
tacgttgctc aattcaacat ttcttgggat gaagtaaatt atgat 1245
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 片段
<400> 24
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Glu Ile Asp Lys Tyr Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn
35 40 45
Val Leu Val Tyr His Gly Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys
50 55 60
Gly Tyr Lys Asp Gly Asn Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys
65 70 75 80
Ser Ile Asn Gln Asn Asn Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Thr Tyr Pro Gly Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val
100 105 110
Glu Asn Gln Pro Asp Val Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu
115 120 125
Ser Ile Asp Leu Pro Gly Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val
130 135 140
Lys Asn Ala Thr Lys Ser Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val
145 150 155 160
Glu Arg Trp Asn Glu Lys Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala
165 170 175
Lys Ile Asp Tyr Asp Asp Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile
180 185 190
Ala Lys Phe Gly Thr Ala Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val
195 200 205
Asn Phe Gly Ala Ile Ser Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser
210 215 220
Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro
225 230 235 240
Ser Arg Phe Phe Gly Lys Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu
245 250 255
Gly Val Asn Ala Glu Asn Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr
260 265 270
Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys
275 280 285
Val Lys Ala Ala Phe Asp Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly
290 295 300
Asp Val Glu Leu Thr Asn Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val
305 310 315 320
Ile Tyr Gly Gly Ser Ala Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn
325 330 335
Leu Gly Asp Leu Arg Asp Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg
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Glu Thr Pro Gly Val Pro Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp
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Ser Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 片段
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Pro Ala Ser Arg Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp
1 5 10 15
His Gly Ser Cys
20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 片段
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Leu Ser Lys Val Leu Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly
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<220>
<223> 片段
<400> 29
Ala Ser Lys Val Ala Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly
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Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Gly Asp Gly Ser Ile Lys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 片段
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Leu Ser Lys Val Leu Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly
1 5 10 15
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<223> ActAN100
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gtgggattaa atagatttat gcgtgcgatg atggtagttt tcattactgc caactgcatt 60
acgattaacc ccgacataat atttgcagcg acagatagcg aagattccag tctaaacaca 120
gatgaatggg aagaagaaaa aacagaagag cagccaagcg aggtaaatac gggaccaaga 180
tacgaaactg cacgtgaagt aagttcacgt gatattgagg aactagaaaa atcgaataaa 240
gtgaaaaata cgaacaaagc agacctaata gcaatgttga aagcaaaagc agagaaaggt 300
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<212> PRT
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<223> ActAN100
<400> 32
Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr
1 5 10 15
Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp
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Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala
50 55 60
Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys
65 70 75 80
Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys
85 90 95
Ala Glu Lys Gly
100

Claims (18)

1.一种融合蛋白多肽，其包含与间皮素多肽融合的表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)多肽，其中所述融合蛋白多肽包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白由细菌表达。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其中所述细菌为单核细胞增生李斯特菌。
4.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的融合蛋白。
5.如权利要求4所述的核酸分子，所述核酸分子是表达盒的一部分。
6.一种宿主细胞，其包含权利要求5所述的核酸分子。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其中所述单核细胞增生李斯特菌是ΔactA/ΔinlB突变体。
8.一种载体，其包含权利要求5所述的核酸分子。
9.一种疫苗，其包含权利要求6所述的宿主细胞和药学上可接受的赋形剂。
10.一种引发受试者中的免疫响应的方法，所述方法包括对所述受试者施用包含宿主细胞的组合物，其中所述宿主细胞包含编码SEQ ID NO:8的多肽的核酸分子。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述宿主细胞是单核细胞增生李斯特菌ΔactA/ΔinlB突变体。
12.一种增加间皮素多肽的表达的方法，该方法包括在宿主细胞中表达编码包含SEQID NO:8的序列的多肽的核酸分子。
13.一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的包含宿主细胞的组合物，其中所述宿主细胞包含编码包含SEQ ID NO:8的多肽的核酸分子。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述癌症是表达间皮素的癌症和/或表达EGFRvIII的癌症。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述癌症具有高水平的间皮素表达。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述癌症是肺癌。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)腺癌、NSCLC鳞状细胞癌、大细胞癌或其任意组合。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述肺癌是晚期NSCLC腺癌或转移性NSCLC腺癌。
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