KR20180002640A

KR20180002640A - 표피 성장 인자 수용체 변형 iii-메소텔린 융합체 및 이를 이용하는 방법

Info

Publication number: KR20180002640A
Application number: KR1020177031486A
Authority: KR
Inventors: 피터 엠. 로르; 윌리엄 쥐. 핸슨
Original assignee: 아두로 바이오테크, 인코포레이티드
Priority date: 2015-04-13
Filing date: 2016-04-12
Publication date: 2018-01-08
Also published as: UY36616A; CN107750256A; JP6782253B2; AU2016247887A1; SV2017005545A; HK1250730A1; BR112017022076A2; US10105427B2; EP3283509A1; ECSP17075380A; US20160346369A1; TW201710285A; CA2982533A1; SG11201708360TA; MA44379A; CO2017011431A2; JP2018512166A; IL254957A0; WO2016168198A1; PH12017502080A1

Abstract

대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 특히, 본 개시는 표피 성장 인자 수용체 변형 III(EGFRvIII) 폴리펩티드 및 메소텔린(mesothelin) 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질, 및 상기 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 이용하여 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:8에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린_35-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩할 수 있다.

Description

표피 성장 인자 수용체 변형 III-메소텔린 융합체 및 이를 이용하는 방법

관련 출원

본 출원은 2015년 4월 13일에 출원된 미국 가출원 번호 62/146,559호 및 2015년 10월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 62/243,397호의 이익을 주장한다. 상기 출원의 전체 교시내용은 참조로서 본원에 포함된다.

ASCII 텍스트 파일 자료의 참조로서의 통합

본 출원은 본원과 동시에 제출되는 하기 ASCII 텍스트 파일에 함유된 서열 목록을 참조로서 포함한다:

a) 파일명: 53161000003Sequence.txt; 2016년 4월 8일에 생성됨, 45 KB 크기.

기술 분야

대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 특히, 본 개시는 표피 성장 인자 수용체 변형 III(EGFRvIII) 폴리펩티드 및 메소텔린(mesothelin) 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질, 및 상기 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 이용하여 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

폐암은 전세계적으로 암 사망의 제1 원인이며, 매년 130만 건의 새로운 사례의 예측 발생률을 갖는다. 미국에서 이는 두번째로 가장 흔하게 진단되는 암으로, 매년 200,000명이 넘는 사람들이 상기 질병을 갖는 것으로 진단되며, 암-관련 사망의 주요 원인이고, 매년 거의 160,000명의 사람들이 상기 질병으로 사망하는 것으로 추산된다. 새로 진단되는 폐암 사례의 약 80% 내지 85%는 비소세포폐암(NSCLC)(샘암종, 편평세포 암종 및 대세포 암종)이고, 15% 내지 20%는 소세포폐암이다. 외과적 절제가 치료를 위한 가장 일관되고 성공적인 선택이나, 완전히 절제 가능한 암을 필요로 하며, 이는 대부분의 환자에 대해 실행가능하지 않은데, 이는 환자의 70%가 절제 불가능하고/하거나 치료 불가능한 질병을 갖기 때문이다.

지난 수십년 동안 암 진단 및 치료에서의 진전은 결과에서의 상당한 진전을 제공하였으나, NSCLC와 같은 일부 종양은 여전히 초기 질병 단계에서 진단하기 어려우며, 전체 생존(OS)은 진행된 질병을 처음 나타내거나 초기 치료 후에 진행되는 환자에 대해 지속적으로 나쁘다. 이들 환자에 대해 추가 요법이 필요하다.

메소텔린 폴리펩티드에 융합된 표피 성장 인자 수용체 변형 III(EGFRvIII) 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이 본원에 개시된다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 각각이 SEQ ID NO:9에 기재된 바와 같은 EGFRvIII와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 EGFRvIII 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

개시된 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 또한 제공된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:4에 기재된 바와 같은 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 하나 이상의 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 메소텔린 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

개시된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포가 본원에 개시된다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 SEQ ID NO:4에 기재된 바와 같은 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 하나 이상의 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 메소텔린 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.

대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 또한 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:4에 기재된 바와 같은 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 하나 이상의 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린_35-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 메소텔린 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

EGFRvIII 폴리뉴클레오티드 및 메소텔린 폴리펩티드를 인코딩하는 메소텔린 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 방법이 또한 개시된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:4에 기재된 바와 같은 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 하나 이상의 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 메소텔린 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 또한 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 치료적 유효량의 숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 각각이 SEQ ID NO:9에 기재된 바와 같은 EGFRvIII와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 EGFRvIII 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 인코딩할 수 있다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:4에 기재된 바와 같은 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 하나 이상의 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 메소텔린 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

첨부된 도면과 함께 읽는 경우 개요 뿐만 아니라 하기 상세한 설명이 추가로 이해된다. 개시된 조성물 및 방법을 예시하기 위한 목적으로, 도면에서 조성물 및 방법의 예시적 구체예가 제시되나, 조성물 및 방법은 개시된 특정 구체예로 제한되지 않는다. 도면에서:
도 1은 (A) EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622 (본원에서 ADU-214로도 언급됨) 및 (B) CRS-207(참조를 위해 제시됨)의 예시적 개략도를 예시하는 도 1a 및 도 1b를 포함한다.
도 2는 브로쓰(broth) 배양에서의 ADU-214의 발현을 예시한다. EGFRvIII-Meso = ADU-214 융합 단백질; Meso = CRS-207 융합 단백질. Lm11이 음성 대조군으로 사용되었다.
도 3은 예방접종된 마우스에서의 항원-특이적 T 세포 면역 반응을 예시하는 도 3a 및 도 3b를 포함한다. (A) ADU-214는 Balb/c 마우스에서 강한 메소텔린-특이적 T 세포 매개 면역 반응을 유도하였다. (B) ADU-214는 C3H/HeN 마우스에서 강한 EGFRvIII-특이적 CD8+ T 세포 면역 반응을 유도하였다.
도 4는 야생형 리스테리아 공격에 대한 ADU-214에 의한 예방접종의 보호 면역을 예시한다.
도 5는 ADU-214에 의한 치료적 예방접종을 예시한다. HBSS 및 빈 플랫폼 균주가 대조군으로 사용되었다.

개시된 조성물 및 방법은 본 개시의 일부를 형성하는 수반되는 도면과 관련하여 취해진 하기 상세한 설명을 참조로 하여 더욱 용이하게 이해될 수 있다. 개시된 조성물 및 방법이 본원에 기재되고/되거나 제시된 특정 조성물 및 방법에 제한되지 않고, 본원에서 사용된 용어는 특정 구체예를 단지 예로서 설명하기 위한 것으로, 청구된 조성물 및 방법을 제한하고자 하는 것이 아님이 이해되어야 한다.

달리 명시하지 않는 한, 가능한 메커니즘 또는 작용 방식 또는 개선을 위한 이유에 대한 임의의 설명은 단지 예시임을 의미하고, 개시된 조성물 및 방법은 임의의 상기 제안된 메커니즘 또는 작용 방식 또는 개선을 위한 이유의 정확성 또는 부정확성에 의해 제약되지 않는다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 기재는 조성물 및 상기 조성물을 이용하는 방법을 언급한다. 개시가 조성물과 관련된 특징 또는 구체예를 기재하거나 청구하는 경우, 상기 특징 또는 구체예는 상기 조성물을 이용하는 방법에 동등하게 적용 가능하다. 마찬가지로, 개시가 조성물을 이용하는 방법과 관련된 특징 또는 구체예를 기재하거나 청구하는 경우, 상기 특징 또는 구체예는 조성물에 동등하게 적용 가능하다.

명확성을 위해 별도의 구체예의 상황으로 본원에 기재되는 개시된 조성물 및 방법의 특정한 특징은 또한 단일 구체예에서 조합하여 제공될 수 있음이 인지되어야 한다. 반대로, 간략화를 위해 단일 구체예의 상황으로 기재되는 개시된 조성물 및 방법의 다양한 특징이 또한 별도로 또는 임의의 하위조합으로 제공될 수 있다.

본원에서 사용되는 단수형태는 복수형을 포함한다.

다음과 같은 약어가 본 개시 전체에 걸쳐 사용된다: EGFRvIII(표피 성장 인자 수용체 변형 III 신생항원 접합 영역); EGFRvIIIx5(5 카피의 EGFRvIII); Meso(메소텔린); ADU-214(EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622); Lm(리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)); LADD(이중-결실 리스테리아 모노사이토게네스).

델타 기호(Δ 또는 ".DELTA.")는 결실을 나타낸다. 예를 들어, "Δ actA"(또는 ".DELTA.actA")는 actA 유전자의 전부 또는 일부가 결실된 것을 의미한다.

숫자 범위, 컷오프, 또는 특정 값과 관련하여 사용되는 경우 용어 "약"은 열거된 값이 나열된 값에서 최대 10%까지 달라질 수 있음을 나타내기 위해 사용된다. 따라서, 용어 "약"은 특정된 값으로부터 ± 10% 이하의 변동, ± 5% 이하의 변동, ± 1% 이하의 변동, ± 0.5% 이하의 변동, 또는 0.1% 이하의 변동을 포함하도록 사용된다.

본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 인간 또는 비-인간 유기체를 나타낸다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 인간 및 수의학 질병 둘 모두에 적용 가능하다. 특정 구체예에서, 대상체는 "환자", 즉, 질병 또는 질환에 대한 의학적 관리를 받고 있는 살아 있는 인간이다. 이는 병리 징후에 대해 조사 중인 규정된 질환을 갖지 않는 사람을 포함한다. 하나 이상의 EGFRvIII, 바람직하게는 EGFRvIII 각각 및 메소텔린을 발현하는 악성종양을 갖는 대상체가 바람직하다. 특정 구체예에서, 대상체는 폐암, 바람직하게는 진행성(단계 IIIb) 또는 전이성(단계 IV) 비소세포폐암(NSCLC) 샘암종을 앓고 있다.

본원에서 사용되는 용어 "동일한 퍼센트", "서열 동일성" 및 "동일성 퍼센트"는 2개 이상의 폴리펩티드 사이에 같은(즉, 동일한) 아미노산의 퍼센트를 나타낸다. 2개 이상의 폴리펩티드 사이의 서열 동일성은 폴리펩티드의 아미노산 서열을 정렬시키고, 동일한 아미노산 잔기를 함유하는 정렬된 폴리펩티드 내의 위치의 수를 스코어링하고, 이를 상이한 정렬된 폴리펩티드 내의 위치의 수와 비교함으로써 결정될 수 있다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 상이한 아미노산을 함유(즉, 치환 또는 돌연변이)하거나, 아미노산이 결핍(즉, 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 모두에서의 아미노산 삽입 또는 아미노산 결실)됨으로써 어떤 위치에서 상이할 수 있다. 서열 동일성은 동일한 아미노산 잔기를 함유하는 위치의 수를 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기의 전체 수로 나눔으로써 계산될 수 있다. 동일성 퍼센트는, 예를 들어, 동일한 아미노산 잔기를 함유하는 위치의 수를 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기의 전체 수로 나누고, 100을 곱함으로써 계산될 수 있다.

"이의 면역원성 단편"은 대상체에서 면역원성 반응을 유도할 수 있는 융합 단백질의 부분을 포함한다. 일부 양태에서, 면역원성 단편은 EGFRvIII-메소텔린을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이를 필수적으로 포함한다. 다른 양태에서, 면역원성 단편은 신호 서열(들)-EGFRvIII-메소텔린을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이를 필수적으로 포함한다.

본원에서 사용되는 "융합 단백질"은 2개 이상의 폴리펩티드를 연결시킴으로써 제조된 단백질을 나타낸다. 융합 단백질은 폴리펩티드를 화학적으로 컨쥬게이션시킴으로써 발생될 수 있다. 바람직하게는, 융합 단백질은 개별적 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자가 인-프레임(in-frame)으로 연결되어, 핵산 분자의 전사 및 번역이 개별적 폴리펩티드를 포함하는 단일 단백질을 발생시키는 유전적 융합에 의해 생성된다. 개시된 융합 단백질은 폴리펩티드 사이에 하나 이상의 링커 잔기를 가질 수 있다.

본원에서 사용되는 "신호 서열"은 융합 단백질의 분비를 유도하는 기능을 하는 폴리펩티드 서열, 및 이를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 신호 서열은 융합 단백질을 포함하는 폴리펩티드(들)에 작동 가능하게 연결되고, 융합 단백질을 포함하는 폴리펩티드(들)과 함께 번역 판독 프레임에 존재한다. "신호 서열"은 또한 "분비 신호 서열"로 언급될 수 있다.

본원에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된"은 구성요소의 정상 기능이 유지되는 방식의 프로모터 리보솜 결합 부위와 같은 조절 서열의 근접위치를 나타낸다. "조절 서열"은 통상적으로 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 나타낸다. 조절 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 선택적으로 샤인/달가노 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 인코딩되는 신호 서열에 "작동 가능하게 연결된" 코딩 서열은 신호 펩티드가 숙주 세포에 의해 가공되고, 가공된 단백질이 분비되는 방식으로 코딩 서열이 신호 서열에 연결된 입체형태를 나타낸다. 프로모터에 작동 가능하게 연결된 신호 서열은 분비 신호 서열의 전사 및 번역이 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 필요한 경우 샤인/달가노 서열에 의해 조절되는 방식으로 프로모터에 연결된다.

본원에서 사용되는 "i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한"은 참조 항목(예를 들어, 생물학적 서열)과 적어도 90% 동일하거나, 91% 동일하거나, 92% 동일하거나, 93% 동일하거나, 94% 동일하거나, 95% 동일하거나, 96% 동일하거나, 97% 동일하거나, 98% 동일하거나, 99% 동일하거나, 100% 동일한 것을 포함한다.

EGFRvIII 폴리펩티드 및 이를 함유하는 면역원성 융합 단백질에 대해, 본원에 기재된 임의의 서열 변동성은 SEQ ID NO:9의 아미노산 잔기 7 내지 14(EEKKGNYV) 외부에서 발생해야 한다. 달리 말하면, 서열 변동성은 SEQ ID NO:9의 아미노산 잔기 1 내지 6(PASRAL) 또는 이를 함유하는 면역원성 융합 단백질 및/또는 SEQ ID NO:9의 아미노산 잔기 15 내지 21(VTDHGSC) 또는 이를 함유하는 면역원성 융합 단백질에서 발생할 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO:9와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 EGFRvIII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:9와 90% 동일하거나, 91% 동일하거나, 92% 동일하거나, 93% 동일하거나, 94% 동일하거나, 95% 동일하거나, 96% 동일하거나, 97% 동일하거나, 98% 동일하거나, 99% 동일하거나, 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 변동성은 SEQ ID NO:9의 아미노산 잔기 1 내지 6 또는 15에서 발생한다. 따라서, 각각의 EGFRvIII 폴리펩티드 및 이를 함유하는 면역원성 융합 단백질은 SEQ ID NO:9의 아미노산 잔기 7 내지 14(EEKKGNYV)를 함유할 것이다.

EGFRvIII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:9의 더 짧은 부분을 포함하도록 길이가 조정될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, EGFRvIII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:9의 아미노산 잔기 6 내지 18과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이를 필수적으로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, EGFRvIII 폴리펩티드의 하나 이상의 카피는 SEQ ID NO:9의 아미노산 잔기 6 내지 14와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이를 필수적으로 포함할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 이들 더 짧은 폴리펩티드에서의 변동성은 SEQ ID NO:9의 아미노산 잔기 1 내지 6 또는 15 내지 21에서 발생할 것이다. 따라서, SEQ ID NO:9의 아미노산 잔기 6 내지 18과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열에 대해, 변동성은 SEQ ID NO:9의 아미노산 잔기 6 또는 15 내지 18에서 발생할 수 있다. SEQ ID NO:9의 아미노산 잔기 6 내지 14와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열에 대해, 변동성은 아미노산 잔기 6에서 발생할 수 있다.

개시된 융합 단백질은 EGFRvIII 항원 및 메소텔린 항원을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 이들을 필수적으로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 항원은 전장 단백질 서열로부터의 MHC 클래스 I 에피토프 또는 MHC 클래스 II 에피토프인 서열을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 기재된 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 MHC 클래스 I 에피토프 또는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프를 인코딩하는 서열을 포함한다. 유사하게, 본원에 기재된 EGFRvIII 폴리펩티드는 적어도 하나의 MHC 클래스 I 에피토프 또는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프를 포함한다. 한 구체예에서, 기재된 메소텔린 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 MHC 클래스 I 에피토프 또는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프를 인코딩하는 서열을 포함한다. 유사하게, 본원에 기재된 메소텔린 폴리펩티드는 적어도 하나의 MHC 클래스 I 에피토프 또는 적어도 하나의 MHC 클래스 II 에피토프를 포함한다.

EGFR은 세포 성장 및 생존에 중요한 수용체 티로신 키나제이다. EGFR 유전자는 두경부암, 결장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 신장암, 및 악성 신경아교종을 포함하는 인간 암에서 종종 과발현되거나 돌연변이된다. EGFR 수용체 변형 III(EGFRvIII)는 엑손 2 내지 7의 267개의 아미노산 결실 및 엑손 1과 엑손 8의 융합으로부터 발생하며, 이는 접합부에 신규한 글리신을 갖는 종양-특이적 펩티드를 발생시킨다. EGFRvIII는 항시적인 리간드 독립적 신호전달을 나타낸다.

메소텔린은 흉막, 복막, 및 심장막 내면의 정상 중피 세포에 존재하는 글리코실포스파티딜이노시톨-결합 세포 표면 당단백질이다. 메소텔린은 또한 췌장 샘암종, 중피종, NSCLC, 및 난소암을 포함하는 여러 인간 종양에 의해 고도로 발현되는 종양-관련 항원이다.

예측 알고리즘 "BIMAS"는 펩티드/HLA 복합체의 예측 절반-시간 해리에 따라 잠재적 HLA 결합 에피토프의 순위를 지정한다. "SYFPEITHI" 알고리즘은 일차 및 이차 HLA-결합 앵커 잔기의 존재를 설명하는 스코어에 따라 펩티드의 순위를 지정한다. 둘 모두의 전산화 알고리즘은 이전에 공개된 HLA 결합 에피토프와 유사한 결합 모티프를 갖는 제공된 단백질 내의 아미노산 서열을 기초로 하여 후보 에피토프를 스코어링한다. 다른 알고리즘이 또한 추가 생물학적 시험을 위한 후보를 확인하기 위해 사용될 수 있다.

융합 단백질 및 상기 융합 단백질의 항원 부분의 예시적인 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 뿐만 아니라 이를 인코딩하는 핵산 분자가 표 2에 제공된다.

융합 단백질

메소텔린 폴리펩티드에 융합된 표피 성장 인자 수용체 변형 III(EGFRvIII) 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질(EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질)이 본원에 개시된다.

융합 단백질은 EGFRvIII 폴리펩티드의 하나 이상의 카피를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 하나의 EGFRvIII 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 융합 단백질은 복수의 EGFRvIII 폴리펩티드를 포함할 수 있다. EGFRvIII 폴리펩티드의 카피의 적합한 수는 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 초과의 카피를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 EGFRvIII 폴리펩티드의 하나의 카피(EGFRvIIIx1)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 EGFRvIII 폴리펩티드의 2개의 카피(EGFRvIIIx2)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 EGFRvIII 폴리펩티드의 3개의 카피(EGFRvIIIx3)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 EGFRvIII 폴리펩티드의 4개의 카피(EGFRvIIIx4)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 EGFRvIII 폴리펩티드의 5개의 카피(EGFRvIIIx5)를 포함할 수 있다.

일부 양태에서, EGFRvIII 폴리펩티드의 하나 이상의 카피 각각은 SEQ ID NO:9와 적어도 90% 동일하거나, 91% 동일하거나, 92% 동일하거나, 93% 동일하거나, 94% 동일하거나, 95% 동일하거나, 96% 동일하거나, 97% 동일하거나, 98% 동일하거나, 99% 동일하거나, 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 예를 들어, EGFRvIII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:9와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, EGFRvIII 폴리펩티드는 EGFRvIII 폴리펩티드의 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 초과의 카피를 포함할 수 있고, 각각의 카피는 SEQ ID NO:9와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

일부 양태에서, EGFRvIII 폴리펩티드의 하나 이상의 카피 각각은 SEQ ID NO:9와 적어도 90% 동일하거나, 91% 동일하거나, 92% 동일하거나, 93% 동일하거나, 94% 동일하거나, 95% 동일하거나, 96% 동일하거나, 97% 동일하거나, 98% 동일하거나, 99% 동일하거나, 100% 동일한 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 일부 양태에서, EGFRvIII 폴리펩티드의 하나 이상의 카피 각각은 SEQ ID NO:9와 적어도 90% 동일하거나, 91% 동일하거나, 92% 동일하거나, 93% 동일하거나, 94% 동일하거나, 95% 동일하거나, 96% 동일하거나, 97% 동일하거나, 98% 동일하거나, 99% 동일하거나, 100% 동일한 아미노산 서열을 필수적으로 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, EGFRvIII 폴리펩티드의 하나 이상의 카피는 SEQ ID NO:9의 아미노산 잔기 6 내지 18과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이를 필수적으로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, EGFRvIII 폴리펩티드의 하나 이상의 카피는 SEQ ID NO:9의 아미노산 잔기 6 내지 14와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이를 필수적으로 포함할 수 있다.

EGFRvIII 폴리펩티드는 EGFRvIII 폴리펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 둘 모두에서 하나 이상의 절단자(cleaver) 서열이 측접할 수 있다. 절단자 서열은 대상체에 존재하는 프로테아제에 의해 가공되도록 구성된다. EGFRvIII 폴리펩티드가 EGFRvIII 폴리펩티드의 2개 이상의 카피를 포함하는 경우, 절단자 서열은 EGFRvIII 폴리펩티드의 개별적 카피 사이에 존재할 수 있다. 예를 들어, 제한하고자 하는 것은 아니지만, SEQ ID NO:10은 5 카피의 EGFRvIII 폴리펩티드(SEQ ID NO:9에 기재된 EGFRvIII 폴리펩티드의 각각의 카피) 및 절단자 서열(ASKVL/ADGSVKTS(SEQ ID NO:26), ASKVA/GDGSIK(SEQ ID NO:27), LSKVL/ADGSVK(SEQ ID NO:28), ASKVA/GDGSIK(SEQ ID NO:29), 및 LSKVL/ADGSVK(SEQ ID NO:30), 여기서 "/"는 EGFRvIII 폴리펩티드를 나타냄)을 함유한다. 이들 절단자 서열은 사실상 단지 예시적이다. 적합한 절단자 서열은 미국 특허 출원 번호 13/988,076호(미국 특허 공개 번호 2014/037662호); 문헌[Toes, et al., J. Exp. Med. (2001) 194: 1-12; Lauer et al., Infect. Immun. (2008) 76: 3742-53; 및 Sinnathamby et al., J. Immunother. (2009) 32: 856-69]에 기재되어 있으며, 상기 특허 및 문헌 각각은 전체내용이 참조로서 포함된다.

EGFRvIII 폴리펩티드는 메소텔린 폴리펩티드에 대해 N-말단 또는 C-말단에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, EGFRvIII 폴리펩티드는 메소텔린 폴리펩티드에 대해 N-말단에 존재할 수 있다.

적합한 메소텔린 폴리펩티드는 메소텔린의 아미노산 35-622(본원에서 "메소텔린₃₅ _-622"로 언급됨)와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 메소텔린 폴리펩티드를 포함한다.

일부 양태에서, 메소텔린 폴리펩티드는 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 90% 동일하거나, 91% 동일하거나, 92% 동일하거나, 93% 동일하거나, 94% 동일하거나, 95% 동일하거나, 96% 동일하거나, 97% 동일하거나, 98% 동일하거나, 99% 동일하거나, 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 메소텔린 폴리펩티드는 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 메소텔린 폴리펩티드는 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 90% 동일하거나, 91% 동일하거나, 92% 동일하거나, 93% 동일하거나, 94% 동일하거나, 95% 동일하거나, 96% 동일하거나, 97% 동일하거나, 98% 동일하거나, 99% 동일하거나, 100% 동일한 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 일부 양태에서, 메소텔린 폴리펩티드는 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린_35-622와 적어도 90% 동일하거나, 91% 동일하거나, 92% 동일하거나, 93% 동일하거나, 94% 동일하거나, 95% 동일하거나, 96% 동일하거나, 97% 동일하거나, 98% 동일하거나, 99% 동일하거나, 100% 동일한 아미노산 서열을 필수적으로 포함할 수 있다.

융합 단백질은 각각이 SEQ ID NO:9에 기재된 바와 같은 EGFRvIII와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 EGFRvIII 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 이들을 필수적으로 포함할 수 있다. 융합 단백질은 SEQ ID NO:10에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 EGFRvIIIx5 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 이들을 필수적으로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 89 내지 840으로 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이를 필수적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 89 내지 840으로 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 90% 동일하거나, 91% 동일하거나, 92% 동일하거나, 93% 동일하거나, 94% 동일하거나, 95% 동일하거나, 96% 동일하거나, 97% 동일하거나, 98% 동일하거나, 99% 동일하거나, 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 89 내지 840으로 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 90% 동일하거나, 91% 동일하거나, 92% 동일하거나, 93% 동일하거나, 94% 동일하거나, 95% 동일하거나, 96% 동일하거나, 97% 동일하거나, 98% 동일하거나, 99% 동일하거나, 100% 동일한 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 일부 양태에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 89 내지 840으로 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 90% 동일하거나, 91% 동일하거나, 92% 동일하거나, 93% 동일하거나, 94% 동일하거나, 95% 동일하거나, 96% 동일하거나, 97% 동일하거나, 98% 동일하거나, 99% 동일하거나, 100% 동일한 아미노산 서열을 필수적으로 포함할 수 있다.

개시된 융합 단백질은 신호 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 신호 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 신호 서열은 EGFRvIII 폴리펩티드 및 메소텔린 폴리펩티드와 함께 번역 판독 프레임에 존재한다. 적합한 신호 서열은, 예를 들어, ActAN100(SEQ ID NO:32에 기재된 바와 같음), ActAN100*(SEQ ID NO:12에 기재된 바와 같음), LLO441(SEQ ID NO:20에 기재된 바와 같음), LLO441ΔPEST(SEQ ID NO:22에 기재된 바와 같음), 및 LLO441Δ26(SEQ ID NO:24에 기재된 바와 같음)을 포함한다. 일부 구체예에서, 신호 서열은 SEQ ID NO:32에 기재된 바와 같은 ActAN100과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 신호 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 신호 서열은 SEQ ID NO:12에 기재된 바와 같은 ActAN100* 신호 서열과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 융합 단백질은 SEQ ID NO:8에 기재된 바와 같은 ActAN100*-EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO:8에 기재된 바와 같은 ActAN100*-EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편으로 구성될 수 있다. 또 다른 양태에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO:8에 기재된 바와 같은 ActAN100*-EGFRvIIIx5-메소텔린_35-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 필수적으로 포함할 수 있다.

개시된 융합 단백질은 본원의 다른 곳에 개시된 바와 같이 다수의 적합한 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 융합 단백질은 박테리아, 예를 들어, 리스테리아 모노사이토게네스 또는 이의 유전적으로 변형된 형태에서 발현될 수 있다.

개시된 융합 단백질은 융합 단백질을 투여받은 대상체에서 체액성 반응, 항원-특이적 T 세포 반응(CD4+ 및/또는 CD8+) 또는 둘 모두를 유도하기 위한 면역원성 폴리펩티드로 사용될 수 있다.

핵산 분자

EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 본원에 개시된다. 개시된 핵산 분자는 본원에 개시된 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질 중 임의의 것을 인코딩할 수 있다.

본 개시 전체에 걸쳐, 하나 이상의 EGFRvIII 폴리펩티드를 포함하는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질, 및 하나 이상의 EGFRvIII 폴리펩티드를 포함하는 상기 융합 단백질을 인코딩하는 핵산이 기재된다. EGFRvIII 폴리펩티드는 표 1에 제공된 EGFRvIII 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 의해 인코딩될 수 있다. 따라서, 본 개시 전체에 걸쳐, EGFRvIII 폴리뉴클레오티드가 "SEQ ID NO:4(표 1의 컨센서스 서열)와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일"한 것으로 언급되는 경우, 이는 SEQ ID NO:13과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하고/하거나; SEQ ID NO:14와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하고/하거나; SEQ ID NO:15와 적어도 90% 동일하고/하거나; SEQ ID NO:16과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하고/하거나; SEQ ID NO:17과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 것을 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 다양한 면역원성 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:13-17 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 각각의 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질은 핵산 분자에 의해 인코딩될 수 있으며, 핵산 분자는 SEQ ID NO:13과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하고/하거나, SEQ ID NO:14와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하고/하거나, SEQ ID NO:15와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하고/하거나, SEQ ID NO:16과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하고/하거나, SEQ ID NO:17과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

표 1

핵산 분자는 하나 이상의 EGFRvIII 폴리펩티드를 갖는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 하나의 EGFRvIII 폴리펩티드(EGFRvIIIx1)를 갖는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩할 수 있다. 다른 구체예에서, 핵산 분자는 복수의 EGFRvIII 폴리펩티드를 갖는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩할 수 있다. 개시된 핵산 분자에 의해 인코딩되는 EGFRvIII 폴리펩티드의 적합한 수는 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 초과의 카피를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 2 카피의 EGFRvIII 폴리펩티드(EGFRvIIIx2)를 갖는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 3 카피의 EGFRvIII 폴리펩티드(EGFRvIIIx3)를 갖는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 4 카피의 EGFRvIII 폴리펩티드(EGFRvIIIx4)를 갖는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 5 카피의 EGFRvIII 폴리펩티드(EGFRvIIIx5)를 갖는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩할 수 있다.

EGFRvIII 폴리펩티드를 인코딩하는 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드의 예시적 핵산 서열이 SEQ ID NO:4에 기재되어 있다. 일부 구체예에서, 개시된 핵산 분자는 SEQ ID NO:4에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 하나 이상의 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. EGFRvIIIx5 폴리펩티드를 인코딩하는 EGFRvIIIx5 폴리뉴클레오티드의 예시적 핵산 서열이 SEQ ID NO:5에 기재되어 있다. 일부 구체예에서, 개시된 핵산 분자는 SEQ ID NO:5에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 EGFRvIIIx5 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

핵산 분자에 의해 인코딩되는 적합한 메소텔린 폴리펩티드는 메소텔린₃₅ _-622를 포함한다. 메소텔린₃₅ _-622의 핵산 서열은 SEQ ID NO:6에 기재되어 있다. 따라서, 개시된 핵산 분자는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩할 수 있으며, 메소텔린 폴리펩티드는 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.

일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:4에 기재된 바와 같은 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 하나 이상의 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린_35-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 메소텔린 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:5에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:7과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

개시된 핵산 분자는 프로모터, 신호 서열, 또는 둘 모두를 추가로 포함할 수 있다. 신호 서열은 숙주 세포로부터 인코딩된 융합 단백질의 분비를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 프로모터는, 예를 들어, actA(SEQ ID NO:2에 기재된 바와 같음) 또는 hly(SEQ ID NO:18에 기재된 바와 같음)를 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 프로모터를 추가로 포함할 수 있으며, 프로모터는 SEQ ID NO:2에 기재된 바와 같은 actA 프로모터와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 프로모터를 추가로 포함할 수 있으며, 프로모터는 SEQ ID NO:18에 기재된 바와 같은 hly 프로모터와 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 EGFRvIII 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 메소텔린 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 번역 프레임에 존재하는 신호 서열을 추가로 포함할 수 있다. 신호 서열은 숙주 세포로부터 인코딩된 융합 단백질의 분비를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 신호 서열은, 예를 들어, ActAN100(SEQ ID NO:31에 기재된 바와 같음), ActAN100*(SEQ ID NO:3에 기재된 바와 같음), LLO441(SEQ ID NO:19에 기재된 바와 같음), LLO441ΔPEST(SEQ ID NO:21에 기재된 바와 같음), 및 LLO441Δ26(SEQ ID NO:23에 기재된 바와 같음)을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 신호 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 신호 서열은 SEQ ID NO:31에 기재된 바와 같은 ActAN100 신호 서열과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 신호 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 신호 서열은 SEQ ID NO:3에 기재된 바와 같은 ActAN100* 신호 서열과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 신호 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 신호 서열은 SEQ ID NO:19에 기재된 바와 같은 LLO441 신호 서열과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 신호 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 신호 서열은 SEQ ID NO:21에 기재된 바와 같은 LLO441ΔPEST 신호 서열과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 신호 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 신호 서열은 SEQ ID NO:23에 기재된 바와 같은 LLO441Δ26 신호 서열과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:1에 기재된 바와 같은 염기쌍 actAp-ActAN100*-EFGRvIIIx5-메소텔린_35-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 구성되거나, 이를 필수적으로 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 핵산 분자는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩할 수 있으며, 융합 단백질은 각각이 SEQ ID NO:9에 기재된 바와 같은 EGFRvIII와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 EGFRvIII 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린_35-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함한다.

일부 구체예에서, 핵산 분자는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩할 수 있으며, 융합 단백질은 SEQ ID NO:10에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 EGFRvIIIx5 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함한다.

일부 구체예에서, 핵산 분자는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하며, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질은 SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 89 내지 840에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이를 필수적으로 포함한다.

핵산 분자는 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위(클로닝 링커)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 추가 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 핵산 분자는 다수의 적합한 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 생성될 수 있으며, 엔도뉴클레아제 절단 부위(들)은 최종 핵산 분자에 남아있을 수 있다. SEQ ID NO:1은 BamHI 클로닝 링커(GGATCC) 및 MfeI 클로닝 링커(CAATTG)를 포함한다. 당업자는 BamHI 및/또는 MfeI 대신에 다른 클로닝 링커가 사용될 수 있음을 인지할 것이다.

핵산 분자에 포함될 수 있는 추가 핵산 서열은 개별적 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드에 측접한 "절단자 서열"(본원의 다른 곳에 기재된 바와 같음)을 포함한다.

핵산 분자는 발현 카세트의 일부일 수 있다. 발현 카세트는 프로모터, 개시된 핵산 분자를 포함하는 오픈 리딩 프레임, 및 3' 비번역 영역을 포함할 수 있다. 발현 카세트는 숙주 세포의 기구가 개시된 융합 단백질을 생성하도록 유도하는데 사용될 수 있다.

개시된 핵산 분자를 포함하는 벡터가 또한 제공된다. 적합한 벡터는, 예를 들어, 박테리아 벡터, 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 벡터, 및 네이키드 RNA 벡터를 포함한다.

숙주 세포

본원에 개시된 핵산 분자 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다.

적합한 숙주 세포는, 예를 들어, 박테리아를 포함한다. 숙주 세포는 약독화 숙주 세포, 공생 숙주 세포, 및/또는 사멸되었으나 대사적으로 활성인 숙주 세포일 수 있다. 예시적 구체예에서, 숙주 세포는 약독화되고/되거나, 공생이고/이거나, 사멸되었으나 대사적으로 활성인 박테리아일 수 있다. 적합한 박테리아는 리스테리아 모노사이토게네스, 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 또는 미코박테리움(mycobacterium) 종, 또는 이들의 변형된 형태를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 숙주 세포는 리스테리아 모노사이토게네스 또는 이의 변형된 형태일 수 있다. 변형은 대상체에 대한 숙주 세포의 독성을 감소시키는 돌연변이, 변경, 및 기타 유전적 변화/변형뿐만 아니라 열-처리 또는 화학적 변형을 포함한다. 박테리아는, 예를 들어, 대상체 내의 세포에 대한 결합을 감소시키거나, 대상체 내에서 한 세포로부터 또 다른 세포로의 확산을 감소시키거나, 대상체에서 세포외 성장을 감소시키거나, 대상체에서 세포내 성장을 감소시키도록 변형될 수 있다.

숙주 세포로서 적합한 박테리아 균주는 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 출원 번호 13/988,076호(미국 특허 공개 번호 2014/037662호)에 기재된 것을 포함한다. 예를 들어, 숙주 세포는 actA 및/또는 inlB에서 약독화 돌연변이, 바람직하게는 actA 및 inlB의 전부 또는 일부의 결실(본원에서 "Lm ΔactA/ΔinlB"로 언급됨)을 포함하고, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 함유하도록 유전적으로 변형된 L. 모노사이토게네스의 살아 있는 약독화된 균주일 수 있다. 일부 구체예에서, 리스테리아 모노사이토게네스는 actA 결실(ΔactA) 돌연변이체, actA 삽입 돌연변이체, inlB 결실(ΔinlB) 돌연변이체, inlB 삽입 돌연변이체, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 예를 들어, 리스테리아 모노사이토게네스는 ΔactA/ΔinlB 돌연변이체일 수 있다.

숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 핵산 분자는 숙주 세포 유전체에 통합된다. 핵산 분자는 actA 유전자좌, inlB 유전자좌 또는 tRNA^Arg 유전자좌로 통합될 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 actA 유전자좌로 통합될 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 inlB 유전자좌로 통합될 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 tRNA^Arg 유전자좌로 통합될 수 있다. 상기 숙주 세포는 숙주 세포 발현 서열의 조절 하에 있고, 이에 의해 진핵생물 전사 또는 번역 요소를 필요로 하지 않는 핵산을 함유한다.

숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 핵산 분자는 염색체외적으로 숙주 세포 내에 존재한다. 예를 들어, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 숙주 세포 내의 에피솜 플라스미드 상의 발현 카세트에 삽입될 수 있다.

개시된 핵산 분자 중 임의의 것을 포함하도록 변형된 재조합 리스테리아 박테리아가 본원에 제공된다. 핵산 분자는 염색체외적으로 리스트리아 내에 존재할 수 있거나, 박테리아 유전체로 통합될 수 있다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 숙주 세포는 tRNA^Arg 유전자좌로 통합되는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 갖는 리스테리아 모노사이토게네스 ΔactA/ΔinlB 돌연변이체일 수 있다. 리스테리아는 숙주 세포에 이종성인 개시된 융합 단백질을 발현시키기 위한 발현 플랫폼으로 사용될 수 있다. 상기 발현은, 예를 들어, 숙주 세포를 함유하는 대상체에서 이종성 융합 단백질에 대한 면역 반응을 발생시킬 수 있다.

ADU-214는 EGFRvIII 및 메소텔린을 발현하도록 공학처리된 Lm의 살아 있는 약독화된 균주(Lm ΔactA/ΔinlB)이다. EGFRvIII-hMeso의 발현은 Lm actA 프로모터로부터 유래되며, 이는 Lm이 숙주 세포를 감염시켰을때 고도로 유도된다. actA 유전자는 감염된 숙주 세포의 상황에서 유도되는 전사 활성인자 단백질인 PrfA에 의해 발현이 조절되고 유도되는 일련의 Lm 독력 유전자인 PrfA 레귤론(regulon)에 존재한다. ADU-214의 EGFRvIII-메소텔린 발현 카세트는 Lm 전사, 번역 및 분비 기구만 이용하며, 이는 임의의 포유동물 발현 요소(예를 들어, 포유동물 발현 시스템에 특징적인 프로모터 또는 종료자 영역)를 함유하지 않는다. 따라서, 관심 지정 유전자를 발현시키기 위해 포유동물 숙주 세포 기구를 이용해야 하는 플라스미드 DNA-기반 또는 바이러스-기반 벡터와 달리, 정의에 따르면, 유전자 전달이 유전자 발현에 전제 조건인 경우, Lm은 "자급식(self-contained)"의 자유롭게 사는 유기체이다. 예방접종된 숙주의 감염된 세포 내에서, ADU-214의 원핵생물 발현 기구는 박테리아 내에서 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 합성하는데만 사용되며, 이는 이후에 항원 가공 및 제시를 위해 숙주 세포 세포질로 분비된다.

숙주 세포는 약학적으로 허용되는 부형제와 조합될 수 있다.

개시된 숙주 세포 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 백신이 또한 본원에 제공된다. 백신은 본원에 개시된 바와 같은 적절한 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 대상체에 투여될 수 있다.

면역 반응을 유도하는 방법

숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 또한 본원에 개시되며, 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

개시된 방법은 개시된 핵산 분자 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포를 이용하여 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 핵산 분자는 SEQ ID NO:1에 기재된 바와 같은 actAp-ActAN100*-EGFRvIII-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 숙주 세포는 SEQ ID NO:4에 기재된 바와 같은 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 하나 이상의 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 메소텔린 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 숙주 세포는 SEQ ID NO:5에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 숙주 세포는 SEQ ID NO:7과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본원에 개시된 숙주 세포 중 임의의 것이 개시된 방법에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 숙주 세포는 actA 및/또는 inlB에서 약독화 돌연변이, 바람직하게는 actA 및 inlB의 전부 또는 일부의 결실(본원에서 "Lm ΔactA/ΔinlB"로 언급됨)을 포함하고, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 함유하도록 유전적으로 변형된 L. 모노사이토게네스의 살아 있는 약독화된 균주일 수 있다. 일부 구체예에서, 리스테리아 모노사이토게네스는 actA 결실 돌연변이체, actA 삽입 돌연변이체, inlB 결실 돌연변이체, inlB 삽입 돌연변이체, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 예를 들어, 리스테리아 모노사이토게네스는 ΔactA/ΔinlB 돌연변이체일 수 있다.

대상체에 투여되는 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 핵산 분자는 숙주 세포 유전체에 통합된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 actA 유전자좌로 통합될 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 inlB 유전자좌로 통합될 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 tRNA^Arg 유전자좌로 통합될 수 있다. 대상체에 투여되는 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 핵산 분자는 염색체외적으로 숙주 세포 내에 존재한다.

대상체에 숙주 세포를 투여하기에 적합한 방식은 정맥내, 경구, 피하, 피내, 근내, 복막내, 경점막, 비내 투여, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 투여 단계는 정맥내 수행된다.

숙주 세포는 대상체 내에서 개시된 융합 단백질을 발현시키기 위한 발현 플랫폼으로 사용될 수 있으며, 따라서 숙주 세포를 함유하는 대상체에서 이종성 융합 단백질에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 대상체 내에서 감염된 세포의 세포질에서 숙주 세포로부터 발현되고 분비될 수 있다. 감염된 세포는 숙주 세포를 받아들일 수 있는 대상체 내의 임의의 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 감염된 세포는 항원 제시 세포일 수 있다. 항원 제시 세포(APC)는 T 세포에 항원을 제시하기 위해 사용되는 면역계의 세포이다. APC는 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 가장자리 구역 쿠퍼 세포, 미세아교세포, 랑게르한스 세포, T 세포, 및 B 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 대상체의 하나 이상의 세포에서 발현될 수 있다.

개시된 융합 단백질 중 임의의 것이 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 폴리펩티드로 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 상기 방법은 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 융합 단백질은 SEQ ID NO:8에 기재된 바와 같은 ActAN100*-EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 융합 단백질은 SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 89 내지 840으로 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 융합 단백질은 각각이 SEQ ID NO:9에 기재된 바와 같은 EGFRvIII와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 EGFRvIII 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함한다.

일부 구체예에서, 예를 들어, 상기 방법은 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 융합 단백질은 SEQ ID NO:10에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 EGFRvIIIx5 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함한다.

개시된 방법은 메소텔린 면역 반응, EGFRvIII 면역 반응, 리스테리아에 대한 면역 또는 이들의 임의의 조합을 유도하는데 사용될 수 있다. 따라서, 숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 메소텔린 면역 반응을 유도하는 방법이 제공되며, 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 EGFRvIII 면역 반응을 유도하는 방법이 또한 제공되며, 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 리스테리아 모노사이토게네스를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 리스테리아에 대한 면역을 유도하는 방법이 추가로 제공되며, 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

개시된 방법은 체액성 반응, 항원-특이적 T 세포 반응(CD4+ 및/또는 CD8+) 또는 둘 모두를 유도할 수 있다. 예를 들어, 감염된 진핵생물 숙주 세포의 세포질로의 ADU-214의 진입시, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질은 숙주 세포에 의해 발현되고 분비될 수 있으며, 이후 감염된 세포의 프로테아솜 기구에 의해 가공될 수 있다. EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질의 단백질 단편은 APC의 표면 상에서 MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자와 관련하여 제시될 수 있으며, 이는 전신 EGFRvIII- 및 메소텔린-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 면역의 유도를 발생시킬 수 있다. 또한, IV 투여 후, ADU-214에 대한 일차 표적 세포는 간 및 비장의 포식 세포인 것으로 생각된다. 이들 세포의 감염은 타입 I 인터페론의 초기 생성에 의해 개시되는 염증유발성 사이토카인 캐스케이드의 유도를 발생시킬 수 있다. 중요하게는, ADU-214는 포식리소좀으로부터 감염된 숙주 세포의 세포질로 빠져 나가고, 여기서 ADU-214는 인코딩된 EGFRvIII-메소텔린 항원(다른 박테리아 생성물에 더하여)을 발현하고 분비한다. 면역자극 환경 및 숙주 세포에 의한 EGFRvIII-메소텔린 항원의 발현의 결과로서, ADU-214는 이후 전신 EGFRvIII-메소텔린 특이적 T 세포 면역의 프라이밍을 가능하게 한다.

메소텔린 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 방법

EGFRvIII 폴리뉴클레오티드 및 메소텔린 폴리펩티드를 인코딩하는 메소텔린 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 방법이 본원에 개시된다.

개시된 방법은 박테리아 세포, 바이러스 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 개시된 핵산 분자의 전사 및 메소텔린 폴리펩티드의 발현을 지지하거나, 지지하도록 구성될 수 있는 임의의 숙주 세포에서 수행될 수 있다. 발현 단계는 핵산 분자를 숙주 세포로 도입시키고, 숙주 세포 기구가 메소텔린 폴리펩티드를 생성시키도록 함으로써 수행될 수 있다. 대안적으로, 발현 단계는 숙주 세포를 관심 세포로 투여함으로써 수행될 수 있으며, 메소텔린 폴리펩티드는 상기 관심 세포 내에서 생성된다. 일부 구체예에서, 발현 단계는 관심 세포를 숙주 세포로 감염시킴으로써 수행될 수 있고, 메소텔린 폴리펩티드는 관심 세포 내에서 생성된다. 일부 구체예에서, 발현 단계는 숙주 세포를 대상체로 투여함으로써 수행될 수 있으며, 메소텔린 폴리펩티드는 대상체 내에서 생성된다.

따라서, 개시된 방법은 대상체에서 메소텔린의 발현을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드 및 메소텔린 폴리펩티드를 인코딩하는 메소텔린 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 대상체에서 발현시키는 것을 포함할 수 있다.

대상체에서 메소텔린의 발현을 증가시키는 것은 메소텔린 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 대상체에 투여함으로써 수행될 수 있다. 본원에 개시된 임의의 숙주 세포는 개시된 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 살아 있는 약독화된 박테리아 균주, 예를 들어, L. 모노사이토게네스일 수 있다. L. 모노사이토게네스는 actA 및/또는 inlB에서 약독화 돌연변이, 바람직하게는 actA 및 inlB의 전부 또는 일부의 결실(본원에서 "Lm ΔactA/ΔinlB"로 언급됨)을 포함하고, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 함유하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 리스테리아 모노사이토게네스는 actA 결실 돌연변이체, actA 삽입 돌연변이체, inlB 결실 돌연변이체, inlB 삽입 돌연변이체, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 예를 들어, 리스테리아 모노사이토게네스는 ΔactA/ΔinlB 돌연변이체일 수 있다.

숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 핵산 분자는 숙주 세포 유전체에 통합된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 actA 유전자좌로 통합될 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 inlB 유전자좌로 통합될 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 tRNA^Arg 유전자좌로 통합될 수 있다. 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 핵산 분자는 염색체외적으로 숙주 세포 내에 존재한다.

개시된 방법에서 사용하기에 적합한 핵산 분자는 본원의 다른 곳에 개시된 핵산 분자를 포함한다. 핵산 분자는 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드의 하나의 카피 또는 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 포함할 수 있으며, EGFRvIII 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:4와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. EGFRvIII 폴리뉴클레오티드의 카피의 적합한 수는 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 초과의 카피를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. EGFRvIII 폴리뉴클레오티드(들)은 절단자 서열을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열이 측접할 수 있다.

일부 구체예에서, 메소텔린 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 방법은 SEQ ID NO:1에 기재된 바와 같은 actAp-ActAN100*-EGFRvIII-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 메소텔린 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 방법은 SEQ ID NO:4에 기재된 바와 같은 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 하나 이상의 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 메소텔린 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 메소텔린 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 방법은 SEQ ID NO:5에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린_35-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 메소텔린 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 방법은 SEQ ID NO:7과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함할 수 있다.

메소텔린 폴리뉴클레오티드는 메소텔린₃₅ _-622 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 일부 구체예에서, 메소텔린 폴리펩티드는 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이를 필수적으로 포함할 수 있다. 따라서, 개시된 방법은 메소텔린₃₅ _-622의 발현 수준을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

핵산 분자는 신호 서열, 프로모터 또는 둘 모두를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 신호 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 신호 서열은 SEQ ID NO:3에 기재된 바와 같은 ActAN100*와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 프로모터를 추가로 포함할 수 있으며, 프로모터는 SEQ ID NO:2에 기재된 바와 같은 actA 프로모터와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 신호 서열 및 프로모터를 추가로 포함할 수 있으며, 신호 서열은 SEQ ID NO:3에 기재된 바와 같은 ActAN100*와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 프로모터는 SEQ ID NO:2에 기재된 바와 같은 actA 프로모터와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

대상체에서 암을 치료하는 방법

암 백신의 치료 개념은 악성 종양 세포에 대한 특이적인 적응 면역 반응을 유도하고 향상시키기 위한 광범위한 플랫폼 기술을 포함한다. 관련 비임상 암 모델에서 처음 개발된 다중 백신 기술은 기존 질병이 있거나 치료적 종양 제거 후 보조 치료를 받는 환자 집단에서 임상 시험에 들어갔다. 불행히도, 전 세계적으로 암-관련 사망의 주요 원인인 NSCLC에서, 백신을 이용한 능동 면역요법 개입은 종양 반응, 종양 재발 또는 진행의 지연, 및 궁극적으로 전체 생존(OS)의 연장과 관련하여 유의한 이점을 입증함에 의한 임상적 개념 증명(proof-of-concept)을 아직 달성하지 못했다. 이러한 임상 효능의 결핍은 주로 NSCLC 세포가 면역 인식을 회피하고, 치료적 암 예방접종 후에 유도되고 활성화되는 항원-유도 T 림프구에 의한 세포독성 파괴를 피하는 것을 가능하게 하는 특정 내성 메커니즘으로 인한 것으로 생각된다. 개시된 방법은 이들 문제 및 기타 문제를 다룬다.

치료적 유효량의 숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 암을 치료할 필요가 있는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 개시되며, 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

EGFRvIII는 NSCLC를 포함하는 종양 세포에서만 발견되며, 신체의 정상 세포에서는 발견되지 않는 독특한 돌연변이이다. 효능 있고 수명이 긴 EGFRvIII 특이적 T 세포 및 항체 반응을 유도하는 것은 EGFRvIII-발현 세포를 제거하고, EGFRvIII를 발현하지 않는 세포에 대한 면역선택압을 가할 수 있어, 기존의 표적화된 치료제를 이용한 나머지 종양의 치료를 잠재적으로 촉진할 수 있다. 개시된 방법은 정상 기능하는 세포 집단에서 신호 전달에 필요한 천연 EGFR이 아닌 종양 세포에서 EGFR의 엑손 2 내지 7의 결실에 의해 발현된 EGFRvIII 신생항원 영역만 특이적으로 표적화한다. 따라서, EGFRvIII-특이적 면역 반응은 이러한 EGFR 변형을 발현하는 환자 집단으로 제한되는 것이 예상된다. 또한, EGFRvIII는 정상 조직의 표면에서 제한된 발현을 갖지만, NSCLC를 포함하는 여러 인간 종양에 의해 고도로 발현되는 종양-관련 항원인 메소텔린의 발현을 향상시킬 수 있다. 개시된 조성물을 이용한 면역화에 의해 유도된 세포독성 T 림프구(CTL)는 EGFRvIII 및 메소텔린을 과발현하는 숙주 세포 감염 세포 및 종양 세포 둘 모두를 인지하고 선택적으로 파괴하도록 특별히 설계된다. 예를 들어, 면역자극 환경 및 숙주 세포에 의한 EGFRvIII 및 메소텔린의 발현의 결과로서, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질, 예를 들어, ADU-214는 이후 전신 EGFRvIII-특이적 및 메소텔린-특이적 T 세포 면역의 프라이밍을 가능하게 하고, 이에 의해 항원-발현 종양의 성장을 국소적으로 제한한다. 따라서, 개시된 방법으로 치료될 수 있는 적합한 암은 메소텔린-발현 암, EGFRvIII-발현 암, 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 메소텔린-발현 암일 수 있다. 일부 양태에서, 예를 들어, 암은 높은 수준의 메소텔린 발현을 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 "높은 수준의 메소텔린 발현"은 비-암성 조직에서의 메소텔린 발현의 수준에 비한 암성 조직에서의 메소텔린 단백질의 과발현을 나타낸다. 일부 구체예에서, 암은 EGFRvIII-발현 암일 수 있다. 일부 구체예에서, 암은 메소텔린-발현 암 및 EGFRvIII-발현 암일 수 있다.

바람직하게는, 메소텔린-발현 암, EGFRvIII-발현 암, 또는 메소텔린-발현 암 및 EGFRvIII-발현 암은 폐암이다. 폐암은 비소세포폐암(NSCLC) 및 소세포폐암 둘 모두를 포함한다. 바람직한 양태에서, 개시된 방법은 NSCLC를 갖는 대상체에 대해 수행될 수 있다. NSCLC는 NSCLC 샘암종, NSCLC 편평 세포 암종, 대세포 암종, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 NSCLC 샘암종일 수 있다. 일부 구체예에서, 암은 NSCLC 편평 세포 암종일 수 있다. 일부 구체예에서, 암은 대세포 암종일 수 있다. 일부 구체예에서, 암은 NSCLC 샘암종, NSCLC 편평 세포 암종, 및 대세포 암종의 임의의 조합일 수 있다.

개시된 방법은 진행성(단계 IIIb) 또는 전이성(단계 IV) NSCLC 샘암종을 갖고, 표준 요법에 실패하고/하거나 진행 중인 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 폐암은 진행성 NSCLC 샘암종일 수 있다. 다른 구체예에서, 폐암은 전이성 NSCLC 샘암종일 수 있다. NSCLC에 대한 표준 요법은 수술, 방사선 요법, 화학요법, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 일부 양태에서, 개시된 방법은 수술을 받은 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 개시된 방법은 방사선 요법을 받은 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 개시된 방법은 화학요법을 받은 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 개시된 방법은 이전 수술, 방사선 요법, 및 화학요법의 임의의 조합을 받은 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다.

본원에 개시된 숙주 세포 중 임의의 것이 개시된 방법에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 숙주 세포는 리스테리아 모노사이토게네스일 수 있다. 바람직한 양태에서, 숙주 세포는 actA 및/또는 inlB에서 약독화 돌연변이, 바람직하게는 actA 및 inlB의 전부 또는 일부의 결실(본원에서 "Lm ΔactA/ΔinlB"로 언급됨)을 포함하고, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 함유하도록 유전적으로 변형된 리스테리아 모노사이토게네스의 살아 있는 약독화된 균주일 수 있다. 일부 구체예에서, 리스테리아 모노사이토게네스는 actA 결실(ΔactA) 돌연변이체, actA 삽입 돌연변이체, inlB 결실(ΔinlB) 돌연변이체, inlB 삽입 돌연변이체, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 예를 들어, 리스테리아 모노사이토게네스는 ΔactA/ΔinlB 돌연변이체일 수 있다.

대상체에 투여되는 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 핵산 분자는 숙주 세포 유전체에 통합된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 tRNA^Arg 유전자좌로 통합될 수 있다. 대상체에 투여되는 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 핵산 분자는 염색체외적으로 숙주 세포 내에 존재한다.

숙주 세포는 대상체 내에서 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 발현시키고, 이에 따라 EGFRvIII-발현 종양 세포, 메소텔린-발현 종양 세포, 또는 EGFRvIII-발현 및 메소텔린-발현 종양 세포 둘 모두에 대한 항-종양 반응을 유도하기 위한 발현 플랫폼으로 사용될 수 있다. 융합 단백질은 대상체 내에서 감염된 세포의 세포질에서 숙주 세포로부터 발현되고 분비될 수 있다. 감염된 세포는 숙주 세포를 받아들일 수 있는 대상체 내의 임의의 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 감염된 세포는 항원 제시 세포일 수 있다.

개시된 융합 단백질 중 임의의 것이 대상체에서 항-종양 반응을 유도하기 위한 면역원성 폴리펩티드로 사용될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 하나 이상의 EGFRvIII 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 하나의 EGFRvIII 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 융합 단백질은 복수의 EGFRvIII 폴리펩티드를 포함할 수 있다. EGFRvIII 폴리펩티드의 카피의 적합한 수는 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 초과의 카피를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 융합 단백질은 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 초과의 카피의 EGFRvIII 폴리펩티드를 포함할 수 있다. EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질은 SEQ ID NO:9와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 EGFRvIII 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

적합한 메소텔린 폴리펩티드는 메소텔린의 아미노산 35-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 메소텔린 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질은 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 메소텔린 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 융합 단백질은 SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 89 내지 840으로 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이를 필수적으로 포함한다. 일부 양태에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 89 내지 840으로 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 89 내지 840으로 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 또 다른 양태에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 89 내지 840으로 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 필수적으로 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 융합 단백질은 각각이 SEQ ID NO:9에 기재된 바와 같은 EGFRvIII와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 EGFRvIII 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 이들을 필수적으로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 융합 단백질은 SEQ ID NO:10에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 EGFRvIIIx5 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 이들을 필수적으로 포함한다.

개시된 융합 단백질은 신호 서열을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 방법은 숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질은 SEQ ID NO:8에 기재된 바와 같은 ActAN100*-EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이를 필수적으로 포함한다.

상기 방법에서 사용하기에 적합한 핵산 분자는 본원에 개시된 것 중 임의의 것을 포함한다. 예시적 핵산 분자는 SEQ ID NO:7에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린_35-622 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 핵산 분자는 SEQ ID NO:7에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:7에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린_35-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열로 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:7에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 필수적으로 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:4에 기재된 바와 같은 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 하나 이상의 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린_35-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 메소텔린 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 이들을 필수적으로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:5에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 이들을 필수적으로 포함할 수 있다.

적합한 핵산 분자는 프로모터, 신호 서열, 또는 둘 모두를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:1에 기재된 바와 같은 actAp-ActAN100*-EGFRvIII-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이를 필수적으로 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:1과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열로 구성될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:1과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 필수적으로 포함할 수 있다.

개시된 방법은 조성물을 투여하기 전에 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 메소텔린 수준을 측정하거나, EGFRvIII를 검출하거나, 둘 모두를 수행하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 메소텔린 수준을 측정하고/하거나 EGFRvIII의 존재를 검출하기 위한 방법은 면역조직화학(IHC), 웨스턴 블로팅, 현미경검사, 면역침전, BCA 검정, 분광광도법, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 메소텔린 수준 및/또는 EGFRvIII는 혈액, 림프액, 골수, 고형 종양 샘플, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 생물학적 샘플에서 검출될 수 있다.

조성물은 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 인산염 완충 염수(PBS) 및 글리세롤을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 완충액과 조합될 수 있다. 예시적 구체예에서, 조성물은 둘베코(Dulbecco) 인산염 완충 염수(PBS) 및 글리세롤에서 제형화될 수 있고, 투여 때까지 동결 보관(-60℃ 이하)될 수 있고, 적합한 기간에 걸쳐 염화나트륨 중에서의 정맥내(IV) 주입에 의해 투여될 수 있다. 당업자는 조성물을 투여하기 위한 기간이 암의 유형, 암의 중증도, 및 대상체의 연령, 체중 등에 부분적으로 좌우되는 것을 알 것이다. 바람직하게는, 조성물은 수시간의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 1-2시간 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 조성물은 1-2시간 미만으로 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 1-2시간 초과로 투여될 수 있다.

치료는 단일 용량의 조성물 또는 다중 용량의 조성물을 포함할 수 있다. 따라서, 개시된 방법은 숙주 세포를 포함하는 조성물의 하나 이상의 용량을 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 용량의 수를 결정할 수 있는 요인은, 예를 들어, 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 제한하고자 하는 의도는 아니지만, 용량의 수는 암의 진행 또는 진행을 감소시키는 것에 대한 실패, 암 증상의 중증도에서의 증가된 중증도 또는 변화 없음, 암 증상의 빈도에서의 증가된 빈도 또는 변화 없음, 종양의 크기에서의 증가된 크기 또는 변화 없음, 또는 이들의 임의의 조합을 기초로 하여 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 대상체는 1 내지 100회 용량 또는 그 초과의 조성물이 투여될 수 있다.

숙주 세포의 용량을 결정할 수 있는 요인은, 예를 들어, 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 1 x 10⁸ 내지 약 1 x 10⁹ 콜로니 형성 단위(CFU)의 숙주 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 약 1 x 10⁸ CFU의 숙주 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 약 1 x 10⁹ CFU의 숙주 세포를 포함할 수 있다.

조성물은 7일마다 약 1회, 약 14일마다 약 1회, 21일마다 약 1회, 28일마다 약 1회, 35일마다 약 1회, 42일마다 약 1회, 49일마다 약 1회, 56일마다 약 1회, 63일마다 약 1회, 70일마다 약 1회, 77일마다 약 1회, 84일마다 약 1회, 또는 91일마다 약 1회 투여될 수 있다.

상기를 기초로 하여, 당업자는 본원에 기재된 조성물 중 어느 하나의 기재된 용량을 투여함으로써 대상체가 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합에 대해 치료될 수 있음을 이해할 것이며, 투여는 기재된 바와 같이 일정한 간격으로 반복된다. 따라서, 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁸ 내지 약 1 x 10⁹ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 7일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁸ 내지 약 1 x 10⁹ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 14일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁸ 내지 약 1 x 10⁹ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 21일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁸ 내지 약 1 x 10⁹ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 35일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁸ 내지 약 1 x 10⁹ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 45일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁸ 내지 약 1 x 10⁹ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 60일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁸ 내지 약 1 x 10⁹ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 90일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁸ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 7일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁸ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 14일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁸ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 21일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁸ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 35일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁸ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 45일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁸ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 60일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁸ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 90일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁹ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 7일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁹ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 14일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁹ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 21일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁹ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 35일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁹ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 45일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁹ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 60일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 치료하기 위해 약 1 x 10⁹ CFU의 용량으로 대상체에 투여될 수 있으며, 투여는 90일마다 약 1회 반복된다. 또한, 본원에 기재된 조성물은 상기 방식으로 투여되는 상기 용량에 적합한 약학적 제제로 제조될 수 있다.

바람직하게는, 치료는 조성물이 대상체에 투여되지 않는 용량 사이의 기간을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 숙주 세포를 포함하는 조성물의 제1 용량을 대상체에 투여하고, 제1 용량의 효능을 모니터하고, 제1 용량이 효능이 없는 경우, 조성물의 1회 이상의 용량을 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 조성물의 효능을 결정할 수 있는 요인은, 예를 들어, 암의 진행, 암 증상의 중증도, 암 증상의 빈도, 종양 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 제한하고자 하는 의도는 아니지만, 암의 진행 또는 진행을 감소시키는 것에 대한 실패, 암 증상의 중증도에서의 증가된 중증도 또는 변화 없음, 암 증상의 빈도에서의 증가된 빈도 또는 변화 없음, 종양의 크기에서의 증가된 크기 또는 변화 없음, 또는 이들의 임의의 조합이 조성물의 제1 용량이 효능이 없음을 나타내는 것일 수 있다. 용량 사이의 적합한 기간은 수일, 수주, 또는 수개월을 포함한다. 일부 구체예에서, 용량 사이의 기간은 약 1일 내지 약 90일, 약 5일 내지 약 80일, 약 10일 내지 약 70일, 약 15일 내지 약 60일, 약 20일 내지 약 50일, 또는 약 25일 내지 약 40일일 수 있다. 예를 들어, 용량 사이의 기간은 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 14일, 약 21일, 약 28일, 약 35일, 약 42일, 약 49일, 약 56일, 약 60일, 약 65일, 약 70일, 약 80일, 약 85일, 또는 약 90일일 수 있다.

대상체에 조성물을 투여하기에 적합한 방식은 정맥내, 경구, 피하, 피내, 근내, 복막내, 경점막, 비내 투여, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 투여 단계는 정맥내 수행될 수 있다.

치료는 조성물을 투여한 후에 대상체에 항생제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물의 최종 용량이 환자에 투여되고, 적합한 시간 간격 후, 환자에게 항생제가 제공될 수 있다. 따라서, 바람직한 양태에서, 조성물의 마지막 용량 후에 항생제가 투여된다. 적합한 항생제는 페니실린에 알레르기가 있는 대상체에서 아목시실린(amoxicillin) 또는 트리메토프림/설파메톡사졸(trimethoprim/sulfamethoxazole)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 당업자는 대상체에 항생제를 투여하기 위한 충분한 투여량 및 투여 스케줄을 결정할 수 있을 것이다.

하기 실시예는 본원에 개시된 구체예의 일부를 추가로 기재하기 위해 제공된다. 실시예는 개시된 구체예를 예시하기 위한 것으로, 이를 제한하고자 하는 것이 아니다.

실시예

방법

박테리아 균주

개시된 연구에서 사용된 박테리아 균주는 표 2에 나열되어 있다.

표 2

ADU-214의 분자 작제

221개의 염기쌍(bp)의 actA 프로모터 및 258 bp의 변형된 신호 서열 ActAN100*을 KpnI-BamHI 단편으로서 pPL2 통합 벡터의 유도체로 클로닝하였다. 5 카피의 EGFRvIII 신생항원 접합 영역(EGFRvIIIx5)을 인코딩하는 486 bp 서열을 BamHI-MfeI 단편으로서 ActAN100*과 함께 인 프레임(in frame)으로 클로닝하였다. 인간 메소텔린의 아미노산 35-622(메소텔린₃₅ _- ₆₂₂)를 인코딩하는 1767 bp의 서열을 MfeI-EagI 단편으로서 인-프레임으로 클로닝하였다. 전체 발현 카세트를 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Lauer, P. et al., Construction, Characterization and Use of Two Listeria monocytogenes site-specific phage integration vectors. J. Bacteriology (2002) 184(15): 4177-4186]에 기재된 바와 같이 LADD 플랫폼 균주(Lm11, Lm ΔactA ΔinlB로도 언급됨)의 tRNA^Arg 유전자좌에 삽입하고, 벡터 백본 서열을 제거하였다.

ADU-214 및 CRS-207의 개략도가 도 1a 및 도 1b에 각각 예시되어 있다.

브로쓰 배양 성장 세포 및 세포내 감염으로부터의 웨스턴 블롯

브로쓰 배양 성장 웨스턴 블롯을 위해, 리스테리아 균주를 효모 배지에서 2.0의 OD600까지 성장시켰다. 박테리아를 원심분리에 의해 제거하고, 상층액을 얼음 상에서 TCA 침전시켰다. 상층액을 원심분리하고, 펠렛을 아세톤 세척하고, 환원 LDS 완충액(Invitrogen)에 재현탁시켰다. 샘플을 10분 동안 95℃로 가열하고, 동일량을 4-12% 폴리아크릴아미드 젤에서 영동시키고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 블롯을 ActA 단백질의 성숙 N-말단에 대해 발생된 폴리클로날 항체로 탐지시켰다. 검출을 Licor Odyssey IR 검출 시스템으로 시각화시키고, 정량하였다.

세포내 웨스턴 블롯을 위해, DC2.4 세포를 1시간 동안 10의 감염다중도(MOI)로 각각의 Lm 균주로 접종시키고, 세포를 PBS 및 50 μg/mL 젠타마이신이 보충된 DMEM 배지로 3회 세척하였다. 세포를 감염 7시간 후에 수거하였다. 세포를 SDS 샘플 완충액으로 용해시키고, 수거하고, 4-12% 폴리아크릴아미드 젤에서 영동시키고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 세포내 웨스턴 블롯은 ActA 단백질의 성숙 N-말단에 대해 발생된 폴리클로날 항체를 사용하였고, 항-p60 모노클로날 항체를 이용한 p60 발현(관련되지 않은 Lm 단백질)로 표준화시켰다. 항원 검출을 Licor Odyssey IR 검출 시스템으로 시각화시키고, 정량하였다.

예방접종된 마우스에서의 항원-특이적 면역 반응

메소텔린 특이적 면역원성을 위해, Balb/c 마우스(n=5)를 2×10⁶ cfu의 ADU-214로 정맥내(IV)로 예방접종하였다. 7일 후, 비장을 수거하고, 면역 반응을 메소텔린에 대한 중첩 펩티드 라이브러리(11개 아미노산에 의해 중첩되는 153개의 15mer 펩티드) 또는 자극되지 않은 배지 대조군을 이용한 IFNγ ELIspot 검정에 의해 측정하였다. EGFRvIII-특이적 면역원성을 위해, C3H/HeN 마우스(n=4)를 5×10⁶ cfu의 ADU-214로 IV로 예방접종하였다. 7일 후, 비장을 수거하고, 면역 반응을 EGFRvIII_26-33 - K^k 결합 펩티드 EEKKGNYV 이용한 IFNγ ELIspot 검정에 의해 측정하였다.

야생형 리스테리아 공격에 대한 보호 면역

Balb/c 마우스를 2×10⁶ cfu의 각각의 Lm 균주로 1회 IV로 예방접종하였다. 40일 후, 마우스를 5x10⁴ cfu(2배 LD₅₀ 용량)의 야생형(WT) Lm 균주 DP-L4056으로 IV로 공격하였다(참조로서 본원에 포함되는 문헌[Lauer, P. et al., Construction, Characterization and Use of Two Listeria monocytogenes site-specific phage integration vectors. J. Bacteriology (2002) 184(15): 4177-4186)]에 기재됨). 3일 후, 비장을 수거하고, 균질화시켰다. 희석액을 200 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 BHI 플레이트에 두어 cfu/기관을 결정하였다. 본 검정에서의 검출 한계(LOD)는 50 CFU이다.

종양 연구

CT26 종양 세포를 인간 메소텔린을 발현하는 DNA 플라스미드로 형질감염시켜 안정적인 세포주 CT26-hMeso 클론 3을 생성시켰다. 이식 직전에, 동결된 종양 세포의 분취량을 해동시키고, T 세포 배지에서 컨플루언스까지 성장시켰다. 컨플루언스인 경우, 세포를 수거하고, 2×10⁵ 세포/200 μL 용량/마우스의 이식을 위해 HBSS 중에 1×10⁶ 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 0일에, Balb/c 마우스(그룹 당 10마리의 마우스)에 2×10⁵개의 CT26-hMeso 세포를 정맥내(IV) 이식하였다. 종양 이식 후 3일째에, HBSS; 5×10⁶ cfu, 1×10⁵ cfu, 또는 5×10³ cfu의 ADU-214; 또는 5×10⁶ cfu의 Lm11(빈 플랫폼 균주)을 IV에 의해 마우스에 제공하였다. 마우스를 생존에 대해 모니터하였다.

암의 치료

표준 요법에 실패하고, 스크리닝시에 진행중인 진행성(단계 IIIb) 또는 전이성(단계 IV) NSCLC(샘암종)을 갖는 대상체에서 단일 작용제 ADU-214의 안전성을 평가하고, 권장 2상 용량(RP2D)을 확립하고, 예비 임상 효능 및 면역학적 반응을 결정하기 위해 인간 최초(FiH), 1상, 개방-표지, 다기관 연구, 2부 연구를 수행하였다. 치료는 확인된 방사선 촬영 질병 진행, 허용되지 않는 독성, 동의 철회, 치료를 중단하는 연구자 결정, 후속 항암 요법의 시작, 또는 후원자의 연구 종료 때까지 제공된다.

1부(용량 점증): 이는 안전성 및 약역학 평가를 기초로 하여 RP2D를 결정하도록 설계된다. 변형된 독성 확률 간격(mTPI) 설계를 적용하여 2개 용량의 ADU-214(용량 코호트 1-A: 1×10⁸ 콜로니 형성 단위(CFU) 및 용량 코호트 1-B: 1×10⁹ CFU)를 순차적으로 투여한다. 각 용량 코호트의 마지막 대상체가 DLT 관찰 기간 내에 치료를 완료한 후, 연구 평가팀(SET)은 모든 안전성 데이터를 평가하고, 치료되는 두번째 대상체 그룹에서 용량 코호트를 증가시키거나, 현재 용량에서 유지시키거나, 축소시키는지의 여부를 결정한다.

2부(용량 확장): 2부는 ADU-214에 대한 RP2D가 결정된 후 2개의 확장 코호트를 평가하도록 설계된다. 약 30명의 대상체(코호트 2-A [n=20] 및 코호트 2B [n=10])를 등록시키고, 2부에서 RP2D로 처리한다. 메소텔린의 집중된 면역조직화학 평가를 위한 보관된 종양 물질은 2부의 모든 대상체에 대해 이용 가능하다. 메소텔린을 과발현하는 종양을 갖고, 종양 코어 생검을 받을 수 있는 일차 종양 또는 전이성 병변(들)을 갖는 대상체만 코호트 2B에 등록시킨다. 코호트 2B의 대상체는 치료전 및 치료후 생검에 동의한다. 코호트 1A 및 1B, 및 코호트 2A에 대해 선택적이지만, 전이성 병변(들)의 치료전 및 치료후 생검은 연구 약물의 분자 활성을 추가로 이해하는 것이 강력히 요구된다. 생검 절차는 CT 또는 PET CT 영상화를 이용하여 수행된다.

ADU-214는 개방-표지 치료 기간 동안 21일마다 1회 정맥내 투여된다. ADU-214는 필요시 주입 기간을 증가시키는 것을 선택적으로 하여 1시간의 기간에 걸쳐 정맥내 투여된다. 치료는 확인된 방사선 촬영 질병 진행, 허용되지 않는 독성, 동의 철회, 치료를 중단하는 연구자 결정, 후속 항암 요법의 시작, 또는 후원자의 연구 종료 때까지 제공된다. 안전성 및 효능을 평가한다.

연구 집단 - 조직학적 또는 세포학적으로 문서화된 NSCLC 샘암종; 단계 III b 또는 IV 질병; 전산화 단층촬영술(CT) 영상화를 기초로 하여 문서화된 종양 진행; 적어도 1개의 측정 가능한 질병 부위(2부만) 및 0 또는 1의 미국 동부 종양학 협동 그룹(Eastern Cooperative Oncology Group; ECOG) 수행 상태 스코어를 갖는 18세 이상 연령의 대상체를 조합된 1부 및 2부에 대한 본 연구에 등록시킨다. 대상체는 적어도 2회의 이전 라인(line)의 미국 식품의약국(FDA)-승인된 전신 요법을 받아야 하며, 이 중 한 요법은 백금-함유 요법이어야 한다(예외: 첫번째 라인의 백금-함유 화학요법 후 두번째 라인의 요법을 거부한 대상체).

효능 평가 - 효능 평가를 고형 종양의 반응 평가 기준(V1.1; Eur. J. Cancer 45: 228, 2009) 및 면역-관련 반응 기준(Clin. Cancer Res. 15:7412, 2009)에 따라 연구자에 의해 평가한다. 질병 반응을 목, 가슴, 복부 및 골반의 IV 대조로 CT 스캔을 이용하여 평가한다. IV CT 조영제에 불내성인 대상체는 경구 대조로 CT 스캔을 수행한다. CT를 이용하여 적절하게 영상화될 수 없는 질병 부위를 평가하기 위해 자기 공명 영상화(MRI)가 사용될 수 있다. 뇌 MRI는 임상적으로 지시된 경우에만 요구된다. 방사선학적 영상화, 물리적 검사, 또는 필요한 다른 절차에 의한 다른 질병 부위를 포함하는 모든 효능 평가를 상기 부위에서 수행한다. 이들 평가를 기준선에서 질병을 평가하기 위해 사용되는 동일한 평가 방법을 이용하여 각 시점에서 연구 전체에 걸쳐 수행한다. 데이터를 또한 후속 항암 요법 및 치료후 추적 검사 기간 내의 전체 생존에 대해 수집한다.

결과

브로쓰 배양에서의 ADU-214의 발현.

도 2에 예시된 바와 같이, 메소텔린₃₅ _-622에 대한 EGFRvIII의 융합은 브로쓰 배양에서 CRS-207보다 약 50배 더 많은 단백질의 증가를 발생시켰다. ADU-214 융합 단백질은 약 88 kDa(EGFRvIII-Meso로 표지됨)인 것으로 예측된다. CRS-207 단백질은 약 72 kDa(Meso로 표지됨)인 것으로 예측된다. 음성 대조군 플랫폼 균주인 Lm11에 대해 밴드가 검출되지 않았다.

감염된 세포에서의 ADU-214의 발현

도 2에 예시된 바와 같이, 메소텔린₃₅ _-622에 대한 EGFRvIII의 융합은 CRS-207보다 약 42배 더 많은 단백질의 세포내 발현의 증가를 발생시켰다. ADU-214 융합 단백질은 약 88 kDa인 것으로 예측된다. CRS-207 단백질은 약 72 kDa인 것으로 예측된다. p60은 감염된 세포에서의 박테리아 수와 관련이 있고, 약 60 kDa인 구성적 Lm 단백질이다. 상부 패널은 ActA 폴리클로날 항체로 검출된 융합 단백질의 발현을 제시한다. 하부 패널은 모노클로날 항체로 검출된 p60 발현을 제시한다. 음성 대조군 플랫폼 균주인 Lm11에 대해 밴드가 검출되지 않았다.

예방접종된 마우스에서의 항원-특이적 T 세포 면역 반응

ADU-214는 Balb/c 마우스에서 강한 메소텔린-특이적 T 세포 매개 면역 반응을 유도하였다(도 4a). ADU-214는 C3H/HeN 마우스에서 강한 EGFRvIII-특이적 CD8+ T 세포 면역 반응을 유도하였다(도 3a 및 도 3b).

ADU-214를 이용한 예방접종은 WT 리스테리아 공격에 대한 보호 면역을 유도한다.

ADU-214를 이용한 단일 예방접종은 백신 플롯폼 균주 Lm11과 동등한 수준으로 WT 리스테리아 공격에 대한 완전한 보호의 장기간 면역을 유도하였다(도 4). ADU-214를 이용한 예방접종은 WT-Lm 공격 후에 cfu에서 6-log 초과의 감소를 발생시켰다. 기능 면역은 항원-특이적 면역 반응의 크기와 이후 공격으로부터 보호하는 면역 반응의 능력의 조합이다. 이러한 경우, 기능성을 완전한 독성의 야생형 리스테리아 공격으로 시험하였다.

ADU-214를 이용한 치료 예방접종은 용량-의존성 항-종양 반응을 발생시킨다.

치료적 CT26-hMeso 폐 전이 모델에서, ADU-214의 항-종양 효능을 BALB/c 마우스에서 결정하였다(도 5). 마우스를 다양한 용량의 ADU-214, 빈 Lm ΔactAΔinlB 플랫폼 균주(ANZ-100) 또는 행크 평형 염 용액(HBSS)으로 IV 예방접종하였다. 백신의 효능 있는 면역원성과 일치하게, ADU-214를 투여한 동물은 ANZ-100(Lm11로 언급됨) 또는 HBSS를 투여한 동물에 비해 개선된 생존을 가졌다. ADU-214 투여 후 연장된 생존은 가장 높은 용량(5×10⁶ CFU)이 투여된 그룹에서 70%, 중간 용량(1×10⁵ CFU)에서 60%, 가장 낮은 용량(5×10³ CFU)에서 20%의 장기 생존자에 따라 용량 의존적이었다.

당업자는 본원에 개시된 바람직한 구체예에 대해 다수의 변화 및 변형이 이루어질 수 있고, 이러한 변화 및 변형이 본 발명의 사상으로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 개시된 조성물 및 방법의 진정한 사상 및 범위 내에 속하는 모든 상기 동등한 변형을 포함하는 것으로 의도된다.

본 명세서에 인용되거나 기재된 각각의 특허, 특허 출원 및 간행물의 개시내용은 이의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.

actAp-ActAN100*-EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622-정지(SEQ ID NO:1)의 구성요소는 actA 프로모터(소문자); ActAN100*(대문자); BamHI 클로닝 링커(첫번째 밑줄); EGFRvIIIx5(이탤릭체); MfeI 클로닝 링커(두번째 밑줄); 메소텔린₃₅ _-622(굵은 글씨); 정지 코돈(taa)이다.

ADU-214 융합 단백질 아미노산 서열(SEQ ID NO:8)의 구성요소는 ActAN100*(일반 텍스트); GS: BamHI 클로닝 링커(이중 밑줄); QL: MfeI 클로닝 링커(점선 밑줄); EGFRvIIIx5(이탤릭체); 메소텔린_35-622(굵은 글씨)이다.

일부 구체예에서, 본 발명은 메소텔린 폴리펩티드에 융합된 표피 성장 인자 수용체 변형 III(EGFRvIII) 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

일부 구체예에서, 상기 EGFRvIII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:9와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 융합 단백질은 복수의 EGFRvIII 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 융합 단백질은 5 카피의 EGFRvIII 폴리펩티드를 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 EGFRvIII 폴리펩티드는 하나 이상의 절단자 서열이 측접한다. 일부 구체예에서, EGFRvIII 폴리펩티드는 메소텔린 폴리펩티드에 대해 N-말단에 존재한다.

일부 구체예에서, 메소텔린 폴리펩티드는 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린_35-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, 융합 단백질은 각각이 SEQ ID NO:9에 기재된 바와 같은 EGFRvIII와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 EGFRvIII 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함한다.

일부 구체예에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO:10에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 EGFRvIIIx5 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함한다.

일부 구체예에서, 융합 단백질은 SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 89 내지 840으로 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, 융합 단백질은 신호 서열을 추가로 포함하며, 신호 서열은 EGFRvIII 폴리펩티드 및 메소텔린 폴리펩티드와 함께 번역 판독 프레임에 존재한다. 일부 구체예에서, 신호 서열은 SEQ ID NO:12에 기재된 바와 같은 ActAN100*과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하다.

일부 구체예에서, 상기 구체예 중 임의의 구체예의 융합 단백질은 SEQ ID NO:8과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 융합 단백질은 박테리아에서 발현된다. 한 구체예에서, 박테리아는 리스테리아 모노사이토게네스이다.

일부 구체예에서, 본 발명은 상기 구체예 중 임의의 구체예의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:4에 기재된 바와 같은 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 하나 이상의 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린_35-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 메소텔린 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:5에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린_35-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일부 구체예에서, 상기 핵산 분자는 발현 카세트의 일부이다.

일부 구체예에서, 본 발명은 상기 구체예 중 임의의 구체예의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 박테리아이다. 한 구체예에서, 박테리아는 리스테리아 모노사이토게네스이다. 일부 구체예에서, 리스테리아 모노사이토게네스는 actA 결실 돌연변이체, actA 삽입 돌연변이체, inlB 결실 돌연변이체, inlB 삽입 돌연변이체, 또는 이들의 조합물이다. 특정 구체예에서, 리스테리아 모노사이토게네스는 ΔactA/ΔinlB 돌연변이체이다.

특정 구체예에서, 핵산 분자는 숙주 세포 유전체로 통합된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 tRNA^Arg 유전자좌로 통합된다.

일부 구체예에서, 본 발명은 상기 구체예 중 임의의 구체예의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 융합 단백질은 각각이 SEQ ID NO:9에 기재된 바와 같은 EGFRvIII와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 EGFRvIII 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함한다.

특정 구체예에서, EGFR-메소텔린 융합 단백질은 SEQ ID NO:10에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 EGFRvIIIx5 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함한다.

특정 구체예에서, EGFR-메소텔린 융합 단백질은 SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 89 내지 840에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, 핵산은 신호 서열을 추가로 포함하며, 신호 서열은 EGFRvIII 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 메소텔린 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 번역 프레임에 존재한다. 특정 구체예에서, 신호 서열은 SEQ ID NO:3에 기재된 바와 같은 ActAN100*과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하다. 일부 구체예에서, 핵산은 프로모터를 추가로 포함한다. 다양한 구체예에서, 프로모터는 SEQ ID NO:2에 기재된 바와 같은 actA 프로모터와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하다. 일부 구체예에서, 프로모터는 SEQ ID NO:18에 기재된 바와 같은 hly 프로모터와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하다.

일부 구체예에서, 상기 구체예 중 임의의 구체예의 핵산 분자는 SEQ ID NO:1과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 상기 구체예 중 임의의 구체예의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 숙주 세포는 박테리아이다. 한 구체예에서, 상기 박테리아는 리스테리아 모노사이토게네스이다. 다양한 구체예에서, 리스테리아 모노사이토게네스는 actA 결실 돌연변이체, actA 삽입 돌연변이체, inlB 결실 돌연변이체, inlB 삽입 돌연변이체, 또는 이들의 조합물이다. 특정 구체예에서, 리스테리아 모노사이토게네스는 ΔactA/ΔinlB 돌연변이체이다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 숙주 세포 유전체로 통합된다. 예를 들어, 핵산 분자는 tRNA^Arg 유전자좌로 통합된다.

일부 구체예에서, 숙주 세포는 약학적으로 허용되는 부형제와 조합된다.

일부 구체예에서, 본 발명은 상기 구체예 중 임의의 구체예의 숙주 세포 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 백신을 제공한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 상기 구체예 중 임의의 구체예의 핵산 분자를 인코딩하는 벡터를 제공한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

다양한 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:1과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, 핵산 분자는 상기 숙주 세포의 유전체로 통합된다. 예를 들어, 핵산 분자는 tRNA^Arg 유전자좌로 통합된다.

상기 방법 중 임의의 방법의 일부 구체예에서, 숙주 세포는 리스테리아 모노사이토게네스이다. 특정 구체예에서, 리스테리아 모노사이토게네스는 actA 결실 돌연변이체, actA 삽입 돌연변이체, inlB 결실 돌연변이체, inlB 삽입 돌연변이체, 또는 이들의 조합물이다. 한 구체예에서, 리스테리아 모노사이토게네스는 ΔactA/ΔinlB 돌연변이체이다.

상기 방법 중 임의의 방법의 일부 구체예에서, 투여 단계는 정맥내 수행된다. 특정 구체예에서, 융합 단백질은 대상체 내에서 감염된 세포의 세포질에서 숙주 세포로부터 발현되고 분비된다. 한 구체예에서, 감염된 세포는 항원 제시 세포이다.

상기 방법 중 임의의 방법의 일부 구체예에서, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질은 각각이 SEQ ID NO:9에 기재된 바와 같은 EGFRvIII와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 EGFRvIII 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함한다.

상기 방법 중 임의의 방법의 일부 구체예에서, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질은 SEQ ID NO:10에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 EGFRvIIIx5 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함한다.

상기 방법 중 임의의 방법의 일부 구체예에서, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질은 SEQ ID NO:8의 아미노산 잔기 89 내지 840에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

특정 구체예에서, 본 발명은 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드 및 메소텔린 폴리펩티드를 인코딩하는 메소텔린 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.

일부 구체예에서, EGFRvIII 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:4와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하다.

특정 구체예에서, 핵산 분자는 복수의 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 각각의 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:4와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 5 카피의 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드를 포함하며, EGFRvIII 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:5와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하다.

다양한 구체예에서, 메소텔린 폴리펩티드는 SEQ ID NO:11에 기재된 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:4에 기재된 바와 같은 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 하나 이상의 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 메소텔린 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:5에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

특정 구체예에서, 핵산 분자는 신호 서열, 프로모터 또는 둘 모두를 추가로 포함하며, 프로모터, 신호 서열 또는 둘 모두는 EGFRvIII 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 메소텔린 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된다.

일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:1과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 방법 중 임의의 방법의 일부 구체예에서, 숙주 세포는 리스테리아 모노사이토게네스이다.

상기 방법 중 임의의 방법의 일부 구체예에서, 상기 발현 단계는 숙주 세포로 관심 세포를 감염시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 발현 단계는 대상체에 숙주 세포를 투여하는 것을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 암을 치료할 필요가 있는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 숙주 세포는 EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 메소텔린-발현 암, EGFRvIII-발현 암 또는 둘 모두이다. 일부 구체예에서, 암은 높은 수준의 메소텔린 발현을 갖는다. 특정 구체예에서, 암은 폐암이다. 다양한 구체예에서, 폐암은 비소세포폐암(NSCLC) 샘암종, NSCLC 편평 세포 암종, 대세포 암종, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 구체예에서, 폐암은 진행성 NSCLC 샘암종 또는 전이성 NSCLC 샘암종이다. 한 구체예에서, 대상체는 표준 요법에 실패한 대상체이다. 일부 구체예에서, 대상체는 수술, 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 임의의 조합을 받은 대상체이다.

일부 구체예에서, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질은 SEQ ID NO:9와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 EGFRvIII 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구체예에서, 융합 단백질은 복수의 EGFRvIII 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 융합 단백질은 5 카피의 EGFRvIII 폴리펩티드를 포함한다.

특정 구체예에서, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질은 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 메소텔린 폴리펩티드를 포함한다.

일부 구체예에서, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질은 각각이 SEQ ID NO:9에 기재된 바와 같은 EGFRvIII와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 EGFRvIII 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함한다.

일부 구체예에서, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질은 SEQ ID NO:10에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:11에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드를 포함한다.

일부 구체예에서, EGFRvIII-메소텔린 융합 단백질은 SEQ ID NO:8에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린₃₅ _-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

특정한 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:4에 기재된 바와 같은 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 하나 이상의 EGFRvIII 폴리뉴클레오티드, 및 SEQ ID NO:6에 기재된 바와 같은 메소텔린₃₅ _-622 폴리뉴클레오티드와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 메소텔린 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:1에 기재된 바와 같은 actAp-ActAN100*-EGFRvIII-메소텔린35-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

일부 구체예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO:7에 기재된 바와 같은 EGFRvIIIx5-메소텔린_35-622와 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

특정 구체예에서, 상기 핵산 분자는 숙주 세포 유전체로 통합된다. 한 구체예에서, 핵산 분자는 tRNA^Arg 유전자좌로 통합된다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 리스테리아 모노사이토게네스이다. 특정 구체예에서, 리스테리아 모노사이토게네스는 actA 결실(ΔactA) 돌연변이체, actA 삽입 돌연변이체, inlB 결실(ΔinlB) 돌연변이체, inlB 삽입 돌연변이체, 또는 이들의 조합물이다. 일부 구체예에서, 리스테리아 모노사이토게네스는 ΔactA/ΔinlB 돌연변이체이다.

다양한 구체예에서, 융합 단백질은 대상체 내에서 감염된 세포의 세포질에서 숙주 세포로부터 발현되고 분비된다. 일부 구체예에서, 감염된 세포는 항원 제시 세포이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 조성물을 투여하기 전에 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 메소텔린 수준을 측정하거나, EGFRvIII를 검출하거나, 둘 모두를 수행하는 것을 추가로 포함한다.

상기 방법 중 임의의 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 약학적으로 허용되는 부형제는 인산염 완충 염수(PBS) 및 글리세롤을 포함한다. 특정 구체예에서, 투여 단계는 정맥내 수행된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 조성물을 투여한 후에 대상체에 항생제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물의 마지막 용량 후에 항생제가 투여된다. 특정 구체예에서, 항생제는 아목시실린 또는 트리메토프림/설파메톡사졸이다.

특정 구체예에서, 상기 구체예 중 임의의 구체예의 숙주 세포의 핵산 분자는 숙주 세포 내의 에피솜 플라스미드 상의 발현 카세트에 삽입된다.

일부 구체예에서, 상기 구체예 중 임의의 구체예의 융합 단백질은 신호 서열을 추가로 포함하며, 신호 서열은 EGFRvIII 폴리펩티드 및 메소텔린 폴리펩티드와 함께 번역 판독 프레임에 존재하고, 신호 서열은 SEQ ID NO:20에 기재된 바와 같은 LLO441 신호 서열과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하거나, SEQ ID NO:22에 기재된 바와 같은 LLO441ΔPEST 신호 서열과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하거나, SEQ ID NO:24에 기재된 바와 같은 LLO441Δ26 신호 서열과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하다.

일부 구체예에서, 상기 구체예 중 임의의 구체예의 핵산은 신호 서열을 추가로 포함하며, 신호 서열은 EGFRvIII 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 메소텔린 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 함께 번역 프레임에 존재하고, 신호 서열은 SEQ ID NO:20에 기재된 바와 같은 LLO441 신호 서열과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하거나, SEQ ID NO:22에 기재된 바와 같은 LLO441ΔPEST 신호 서열과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하거나, SEQ ID NO:24에 기재된 바와 같은 LLO441Δ26 신호 서열과 적어도 i) 90% 동일하거나, ii) 95% 동일하거나, iii) 99% 동일하다.

본원에 인용된 모든 특허, 공개된 간행물 및 참고문헌의 교시내용은 이들의 전체내용이 참조로서 포함된다.

본 발명은 특히 이의 예시적 구체예를 참조로 하여 제시되고 기재되었으나, 첨부된 청구항에 의해 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 형태 및 세부사항에 있어서의 다양한 변화가 그 안에서 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Aduro Biotech, Inc. <120> EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR VARIANT III-MESOTHELIN FUSIONS AND METHODS OF USING THE SAME <130> 5316.1000-003 <150> 62/146,559 <151> 2015-04-13 <150> 62/243,397 <151> 2015-10-19 <160> 32 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion <400> 1 gggaagcagt tggggttaac tgattaacaa atgttagaga aaaattaatt ctccaagtga 60 tattcttaaa ataattcatg aatatttttt cttatattag ctaattaaga agataattaa 120 ctgctaatcc aatttttaac ggaataaatt agtgaaaatg aaggccgaat tttccttgtt 180 ctaaaaaggt tgtattagcg tatcacgagg agggagtata agtgggatta aatagattta 240 tgcgtgcgat gatggtagtt ttcattactg ccaactgcat tacgattaac cccgacataa 300 tatttgcagc gacagatagc gaagattcca gtctaaacac agatgaatgg gaagaagaat 360 acgaaactgc acgtgaagta agttcacgtg atattgagga actagaaaaa tcgaataaag 420 tgaaaaatac gaacaaagca gaccaagata ataaacgtaa agcaaaagca gagaaaggtg 480 gatccgcaag caaagtattg ccagctagtc gtgcattaga ggagaaaaag gggaattacg 540 tggtgacgga 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ttattaagtg aagccgatgt tcgtgcttta gggggtttag 1440 catgtgattt acctggtcgt ttcgttgcag aatcagcaga agtgttatta ccgagattag 1500 tttcatgccc aggaccttta gatcaagatc aacaagaggc agctagagca gctcttcaag 1560 gaggaggccc accatatggc ccaccaagta catggagtgt ttctacaatg gatgcgttaa 1620 gaggtttatt accggtttta ggacaaccaa ttattcgtag tattccacaa ggcattgtag 1680 cagcatggcg tcaacgtagt tctcgtgatc cgtcttggcg acaaccagaa cgtacaattc 1740 tacgtccaag atttcgtaga gaagtagaaa aaacggcgtg tcctagtggc aaaaaagcac 1800 gtgaaattga tgaaagttta attttttata aaaaatggga attagaagca tgtgtcgatg 1860 cagcattact agctacacaa atggatcgtg ttaatgctat tccattcaca tatgaacaat 1920 tagatgtttt aaagcataaa ttagacgaat tatatccaca aggttatcca gaatcagtta 1980 ttcaacattt aggttactta tttttaaaaa tgagtccaga agacatacgc aaatggaatg 2040 ttacaagttt agaaacatta aaagcgcttt tagaagttaa caaaggtcat gaaatgagtc 2100 cacaagttgc tacgttaatt gatagattcg ttaaaggccg tggtcaatta gataaagata 2160 ctttagatac attaacagca ttttatcctg gctacttatg cagtttatca ccagaagaat 2220 taagttccgt tccaccgagt 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Claims

메소텔린(mesothelin) 폴리펩티드에 융합된 표피 성장 인자 수용체 변형 III(EGFRvIII) 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 폴리펩티드로서, SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 박테리아에 의해 발현되는 융합 단백질.
제2항에 있어서, 박테리아가 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)인 융합 단백질.
제1항의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자.
제4항에 있어서, 상기 핵산 분자가 발현 카세트의 일부인 핵산 분자.
제5항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
제6항에 있어서, 리스테리아 모노사이토게네스가 ΔactA/ΔinlB 돌연변이체인 숙주 세포.
제5항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제6항의 숙주 세포 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 백신.
숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 숙주 세포가 SEQ ID NO:8의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 방법.
제10항에 있어서, 숙주 세포가 리스테리아 모노사이토게네스 ΔactA/ΔinlB 돌연변이체인 방법.
SEQ ID NO:8의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함하는 메소텔린 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 방법.
치료적 유효량의 숙주 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 암을 치료할 필요가 있는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 숙주 세포가 SEQ ID NO:8을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 방법.
제13항에 있어서, 암이 메소텔린-발현 암, EGFRvIII-발현 암 또는 둘 모두인 방법.
제13항에 있어서, 암이 높은 수준의 메소텔린 발현을 갖는 방법.
제 13항에 있어서, 암이 폐암인 방법.
제16항에 있어서, 폐암이 비소세포폐암(NSCLC) 샘암종, NSCLC 편평 세포 암종, 대세포 암종, 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
제17항에 있어서, 폐암이 진행성 NSCLC 샘암종 또는 전이성 NSCLC 샘암종인 방법.