CN101107007A

CN101107007A - 对脑膜炎奈瑟球菌所致疾病具有广谱保护作用的gna1870囊泡疫苗

Info

Publication number: CN101107007A
Application number: CNA2006800029319A
Authority: CN
Inventors: D·M·格拉诺夫; V·侯
Original assignee: Children S Hospital & Res Ct A
Current assignee: Children S Hospital & Res Ct A; Childrens Hospital Oakland Research Center
Priority date: 2005-01-27
Filing date: 2006-01-23
Publication date: 2008-01-16
Anticipated expiration: 2026-01-23
Also published as: EP1855715B1; US20210308247A1; CA2590974A1; AU2006208208A1; BRPI0607374B1; EP2682126B1; JP4993750B2; US20170065699A1; CA2590974C; US9452208B2; MX2007008785A; JP2008528597A; US20120093867A1; US9034345B2; NZ555937A; BRPI0607374B8; BRPI0607374A2; AU2006208208B2; US20180369356A1; SI2682126T1

Abstract

本发明总体上提供在对象中引发抗奈瑟球菌属细菌，具体地说抗脑膜炎奈瑟球菌B血清群菌株的免疫应答的方法和组合物。

Description

对脑膜炎奈瑟球菌所致疾病具有广谱保护作用的GNA1870囊泡疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求2005年1月27日提交的美国临时申请系列号60/647,911的优先权，该申请全文纳入本文作为参考。

关于联邦政府资助研究的声明

本发明在政府国家卫生研究院的National Institute of Allergy and InfectiousDiseases(过敏和感染疾病国家研究院)的公共健康服务基金号RO1 AI46464、R21AI061533和国家卫生研究院的National Heart，Lung and Blood Institute(国家心脏、肺和血液研究院)的T32-HL007951基金的支持下作出。政府对本发明享有一定权利。

发明领域

本发明涉及预防脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)所致疾病的广谱疫苗。

发明背景

脑膜炎奈瑟球菌是寄居在人上呼吸道中的革兰阴性细菌，最值得注意的是其导致脑膜炎和脓毒症在世界范围零星和周期性流行爆发。2岁以下儿童中发病和死亡率最高。与其它革兰阴性细菌相同，脑膜炎奈瑟球菌通常具有细胞质膜、肽聚糖层、与荚膜多糖一起构成细菌细胞壁的外膜和突出在外环境中的菌毛。脑膜炎奈瑟球菌的有被膜菌株是儿童和年轻人细菌性脑膜炎和败血症的主要病因(Rosenstein等，J Infect Dis 1999；180：1894-901)。

人是脑膜炎奈瑟球菌属的已知唯一贮存宿主(reservoir)。因此，奈瑟球菌演化出各种高度有效的策略来逃避人免疫系统。这些策略包括表达结构上与宿主聚唾液酸相同的荚膜多糖(即，血清群B)和抗原性高易变的免疫优势非荚膜表位，即较大量存在于表面、抗生素易于接近和能引发强烈抗体应答的抗原表位。

侵袭性脑膜炎奈瑟球菌感染的流行和经济上的重要性促使研究能赋予对各血清型，特别是B群血清型或血清亚型免疫力的有效疫苗。然而，开发广谱疫苗的许多工作受阻于奈瑟球菌可逃避人免疫系统的各种高度有效的策略。

现有的荚膜疫苗可预防A、C、Y和W-135群菌株所致疾病(综述见Granoff等，Meningococcal Vaccines(脑膜炎球菌疫苗)，刊于Plotkin SA，Orenstein WA编，Vaccines(《疫苗》)，第四版，Philadelphia：W.B.Saunders Company，2003)。然而，美国或欧洲尚未批准使用预防B群菌株所致疾病的疫苗，B群菌株所致疾病在北美占该疾病的约30％(Lingappa等，Vaccine 2001；19：4566-75；Raghunathan等，Annu Rev Med 2004，55：333-5)，在欧洲病例超过三分之二(Cartwright等，Vaccine 2001，19：4347-56；Trotter等，Lancet 2004，364：365-7)。缺乏B群荚膜疫苗的原因之一是B群荚膜能在人体中引发自身抗体应答(Finne等，Lancet1983，2：355-7)，其多糖即使与载体蛋白缀合后其免疫原性亦很弱(Jennings等，J Immunol 1981，127：1011-8)。能引发自身反应性抗B群荚膜抗体的B群荚膜疫苗也有潜在的安全问题。因此，近年来B群脑膜炎球菌疫苗的研究集中在利用非荚膜抗原。

已证实外膜囊泡(OMV)疫苗能诱导人产生抗B群脑膜炎球菌疾病的保护性免疫力(综述见Jodar等，Lancet 2002，359：1499-1508)。近年来，为响应公共健康干预，新西兰许可并引入OMV疫苗来阻止已流行10年以上的B群(细菌)(Thomas等，N Z Med J 2004，117：U1016；Desmond等，Nurs N Z 2004，10：2；Baker等，J Paediatr Child Health 2001，37：S13-9)。免疫接种其它囊泡的方法已有描述(参见，例如Cartwright K等，1999，Vaccine，17：2612-2619；de Kleinjn等，2000，Vaccine，18：1456-1466；Rouupe van der Voort ER，2000，Vaccine，18：1334-1343；Tappero等，1999，JAMA 281：1520；Rouupe van der Voort ER，2000，Vaccine，18：1334-1343；US 2002/0110569；WO 02/09643)。

儿童和成年人免疫接种脑膜炎球菌外膜囊泡(OMV)疫苗能诱导血清杀菌抗体，产生抵御疾病的血清学相关保护作用(Goldschneider等，1969，J.Exp.Med.129：1307)。采用随机化前瞻性临床试验和追溯性病例-对照研究，在年纪较大儿童和成年人中直接证实了OMV疫苗有预防脑膜炎球菌B疾病的效力。因此，外膜囊泡疫苗的临床效力毋庸置疑。新西兰已许可这种疫苗应用于儿童，在挪威即将许可应用于年纪较大的儿童和成人，在其它欧洲国家处于后期临床开发许可中。古巴的Finley Institute(芬利研究院)制备的OMV疫苗已可商品化购得，已给予南美洲的数百万儿童。

然而，针对OMV疫苗的血清杀菌抗体应答有菌株特异性倾向(Tappero等，1999，JAMA 281：1520；Rouupe van der Voort ER，2000，Vaccine，18：1334-1343)。此外，目前可用的OMV疫苗也受限于其杀菌抗体应答主要定向针对其主要通道蛋白，PorA的表面暴露环(Tappero等，JAMA 1999，281：1520-7)，该蛋白的抗原性可发生变异(Sacchi等，J Infect Dis 2000，182：1169-76)。由于PorA的免疫优势，所诱导的特异性免疫力主要针对获得膜囊泡的菌株(Tappero等，1999，JAMA 281：1520；Martin SL等，2000，Vaccine，18：2476-2481)。因此，OMV疫苗可用于预防流行区中由一种PorA血清亚型的优势脑膜炎球菌菌株，例如新西兰的P1.4流行菌株所致疾病(Baker等，2001，同上)。然而，导致流行病的菌株，例如在美国发现的菌株中PorA有极大多样性(Sacchi等，2000，同上)。此外，即使很少的氨基酸多态性也可能降低菌株对PorA抗体杀菌活性的敏感性(Martin等，Vaccine 2000，18：2476-81)。

几种脑膜炎奈瑟球菌菌株基因组测序项目的完成提供了所有潜在的脑膜炎球菌蛋白抗原的目录信息。联用生物信息学、微阵列技术、蛋白质组学和免疫筛选已鉴定了大量候选的新脑膜炎球菌疫苗(Pizza等，Science 2000，287：1816-20；DeGroot等，Expert Rev Vaccines 2004，3：59-76)。这些大量候选对象中有源自基因组的奈瑟球菌抗原1870(GNA1870)。GNA1870也称为NMB 1870(WO2004/048404)或LP2086(参见，例如Fletcher等，Infect Immun 200472：2088-2100)，它是在所测试的所有脑膜炎球菌菌株均表达的约27 kDa的脂蛋白(Masignani等，J Exp Med 2003，197：789-99；Giuliani等，Infect.Immun 2005，73：1151-60；Welsch等，J Immunol 2004，172：5606-15)。

根据氨基酸序列的变异和免疫学交叉反应性可将脑膜炎奈瑟球菌菌株亚分类为三种GNA1870变体群(v.1、v.2和v.3)(Masignani等，J Exp Med 2003，197：789-99)。变体1菌株占致病性B群分离株的约60％(Masignani等，2003，同上)。在各变体群中，氨基酸序列保守性达约92％或更高。

用重组GNA1870免疫的小鼠对表达同源变体群GNA1870蛋白的菌株产生了高度血清杀菌抗体应答(Masignani等，2003，同上；Welsch等，2004，同上)。然而，表达各GNA1870蛋白亚变体的许多菌株对抗-GNA1870补体介导的溶菌作用耐受。虽然此现象的原因未知，据信可能是因为GNA1870的少量多态性或细菌表面上GNA1870的关键性表位的可接近性存在菌株差异从而导致抗-GNA1870抗体的结合和/或补体激活降低。以上免疫原性研究中所用的重组GNA1870蛋白疫苗是在大肠杆菌中表达的缺乏前导肽的His-标签蛋白。该重组蛋白也缺乏翻译后脂质化所需的基序，可能会降低其免疫原性(Fletcher等，Infect Immun 2004，72：2088-100)。

研究了重组PorA和重组GNA1870混合疫苗的潜力(Fletcher等，Infect Immun2004，72：2088-1200)。将该混合疫苗给予小鼠时，对两种抗原的抗体应答没有明显干扰。然而，该重组混合物需要恢复PorA表位的构象，这是引发抗-PorA杀菌抗体所需(参见，例如Christodoulides等，Microbiology，1998，144：3027-37和Muttilainen等，Microb Pathog 1995，18：423-36)。该混合重组疫苗也未显示能提高针对表达疫苗所用GNA1870蛋白亚变体的脑膜炎奈瑟球菌菌株的抗-GNA1870杀菌抗体。

O′Dwyer等(Infect Immun 2004，72：6511-80)描述了共生黄色奈瑟球菌(N.flavescens)菌株的外膜囊泡(OMV)疫苗制品，该菌株经遗传改造能表达奈瑟菌表面蛋白A(NspA)，该制品是一种黄色奈瑟球菌天然不表达的高度保守脑膜炎球菌膜蛋白候选疫苗。免疫的小鼠产生了NspA-特异性血清调理吞噬(opsonophagocytic)活性。另外，抗体经OMV吸附后，残留的抗-NspA抗体也能赋予用被囊脑膜炎奈瑟球菌菌株致死攻击的小鼠被动保护作用。然而，在此项研究中，修饰的黄色奈瑟球菌OMV疫苗引发的抗体保护作用显示不优于不表达该异源抗原的黄色奈瑟球菌引发的保护作用。修饰的黄色奈瑟球菌OMV也未引发血清杀菌抗体应答，而在以前的研究中，用大肠杆菌囊泡中表达(Moe等，Infect Immun 1999，67：5664-75；Moe等，Infect Immun 2001，69：3762-71)或在脂质体中重建(Martin等，刊于：Thirteenth International Pathogenic NeisseriaConference(第13届国际病原性奈瑟球菌大会)，Oslo：Nordberg AksidenstrykkeriAS，2002)的重组NspA免疫的小鼠产生了血清杀菌抗体。PCT公布号WO02/09746和美国公布号US 20040126389也描述了由经工程改造而过量表达奈瑟球菌抗原的菌株制备的OMV，这种抗原的具体例子是NspA、Omp85、菌毛(PiIQ、PiIC)、PorA、PorB、Opa、Tbp2、TbpA、TbpB、Hsf、PldA、HasR、FrpA/C、FrpB、Hap、LbpA/LbpB、FhaB、Iipo02、MltA和ctrAi。

本发明克服了该疫苗现有技术方法的缺点，可引发抗广谱脑膜炎奈瑟球菌菌株，特别是(但不限于)包括属于血清群B菌株的保护性免疫力。

参考文献

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发明概述

总体上，本发明提供能在对象中引发抵御奈瑟球菌属细菌，特别是抵御脑膜炎奈瑟球菌血清群B菌株的免疫应答的方法和组合物。

一方面，本发明的特征在于含有由第一种奈瑟球菌制备的抗原性囊泡和药学上可接受的载体的组合物，其中所述奈瑟球菌产生的GNA1870多肽水平足够用于制备给予对象时能引发抗-GNA1870抗体的囊泡产品。所述囊泡可以是外膜囊泡(OMV)、微囊泡(MV)或OMV和MV的混合物。奈瑟球菌可以是天然产生的细菌或其GNA1870多肽的产生经遗传改造(例如，由异源启动子表达GNA1870多肽，表达外源性GNA1870多肽等)。对于宿主细胞，该GNA1870多肽可以是内源性的。在一些实施方式中，遗传修饰该奈瑟菌种细菌以破坏其内源性GNA1870多肽的产生并遗传修饰产生该宿主细胞的外源性核酸(编码)的GNA1870多肽。在其它实施方式中，遗传修饰该奈瑟球菌以产生至少两种不同的GNA1870多肽(例如，不同变体群(v.1、v.2和v.3)的GNA1870多肽)。在其它相关的实施方式中，该奈瑟球菌不产生荚膜多糖。

在一个实施方式中，所述组合物还含有由第二种奈瑟球菌制备的抗原性囊泡，其中所述第二种奈瑟球菌菌种细菌产生的GNA1870多肽水平足够用于制备给予对象时能引发抗-GNA1870抗体的囊泡产品，其中第二种奈瑟球菌在遗传学上不同于所述第一种奈瑟球菌(例如，所述第一和第二种细菌所属的血清群、血清型或血清亚型中至少有一个不同)。在其它相关的实施方式中，所述第二种奈瑟球菌的GNA1870多肽不同于所述第一种奈瑟球菌的GNA1870多肽。

在另一实施方式中，所述组合物还含有由第三种奈瑟球菌制备的抗原性囊泡，其中所述第二种奈瑟球菌产生的GNA1870多肽水平足够用于制备给予对象时能引发抗-GNA1870抗体的囊泡产品，其中所述第三种奈瑟球菌在遗传学上不同于所述第一种奈瑟球菌(例如，所属血清群、血清型或血清亚型中至少有一个不同)。在其它相关的实施方式中，所述第一、第二和第三种奈瑟球菌的GNA1870多肽不同。

在一特别感兴趣的实施方式中，所述组合物含有由经遗传修饰而过量表达GNA1870多肽的第一种脑膜炎奈瑟球菌细菌制备的第一抗原性囊泡；由经遗传修饰而过量表达GNA1870多肽的第二种脑膜炎奈瑟球菌细菌制备的第二抗原性囊泡；和药学上可接受的载体；其中所述第一和第二种细菌的GNA1870多肽属于不同的GNA1870多肽变体群，所述第一和第二种细菌可产生不同的PorA多肽。在一相关实施方式中，所述组合物还含有由经遗传修饰而过量表达GNA1870多肽的第三种脑膜炎奈瑟球菌细菌制备的第三抗原性囊泡，其中所述第三种细菌的GNA1870多肽属于不同于所述第一和第二种细菌的GNA1870多肽变体群，其中所述第三种细菌产生的PorA多肽不同于所述第一和第二细菌产生的PorA多肽。在其它相关实施方式中，不利用洗涤剂制备所述囊泡。

在另一方面，本发明的另一特征在于通过培养能产生GNA1870多肽的奈瑟球菌来制备抗原性组合物的方法，其中产生的GNA1870多肽水平足够用于制备给予对象时能引发抗-GNA1870抗体的囊泡产品；制备培养细菌的囊泡；混合该囊泡与药学上可接受的载体来制备适合给予对象的抗原性组合物。所述第一和第二囊泡各自可以是外膜囊泡(OMV)或微囊泡(MV)。所述奈瑟球菌可以是天然产生的细菌，从而能表达内源性GNA1870，或是在GNA1870多肽的产生经遗传改造(例如，由异源启动子表达GNA1870多肽，表达外源性GNA1870多肽等)的细菌。对于宿主细胞，该GNA1870多肽可以是内源性的。在一些实施方式中，遗传修饰奈瑟菌种细菌以破坏其内源性GNA1870多肽的产生。在其它实施方式中，遗传修饰奈瑟球菌以产生至少两种不同的GNA1870多肽(例如，不同变体群(v.1、v.2和v.3)的GNA1870多肽)。在其它实施方式中，遗传修饰奈瑟菌种细菌以破坏内源性全长GNA1870多肽的产生并由该宿主细胞的外源性核酸产生GNA1870多肽。在其它相关的实施方式中，所述奈瑟球菌不产生荚膜多糖。

在另一方面，本发明的特征在于通过给予哺乳动物免疫有效量的含第一抗原制品的组合物来引发抗奈瑟球菌的免疫应答的方法，所述制品含有由第一奈瑟球菌制备的囊泡，其中所述奈瑟球菌产生的GNA1870多肽水平足够用于制备给予对象时能引发抗-GNA1870抗体的囊泡产品；其中所述给予足以引发针对囊泡中存在的GNA1870多肽的免疫应答。所述囊泡各自可以是外膜囊泡(OMV)、微囊泡(MV)或OMV和MV的混合物。所述奈瑟球菌可以是天然产生的细菌，从而能表达内源性GNA1870，或者是在GNA1870多肽产生中经遗传改造(例如，由异源启动子表达GNA 1870多肽，表达外源性GNA 1870多肽等)的细菌。对于宿主细胞，GNA1870多肽可以是内源性的。在一些实施方式中，遗传修饰奈瑟菌种细菌以破坏其内源性GNA1870多肽的产生。在其它实施方式中，工程改造奈瑟球菌以过量表达GNA1870。在还有其它实施方式中，GNA1870多肽是嵌合型蛋白质(融合蛋白)，其中所述嵌合型蛋白含有GNA1870以囊泡(例如，OMV、MV)形式呈递至少一个抗原性部分。在其它相关的实施方式中，所述奈瑟球菌不产生荚膜多糖。

在其它实施方式中，遗传修饰奈瑟球菌产生至少两种不同的GNA1870多肽(例如，不同变体群(v.1、v.2和v.3)的GNA1870多肽)。在其它实施方式中，遗传修饰奈瑟菌种细菌以破坏内源性全长GNA1870多肽的产生并由宿主细胞的外源性核酸产生GNA1870多肽。

在相关实施方式中，所述方法给予的组合物含有免疫有效量的第二抗原制品，所述制品含有由第二种奈瑟球菌制备的囊泡，其中所述第二种奈瑟球菌产生的GNA1870多肽水平足够用于制备给予对象时能引发抗-GNA1870抗体的囊泡，其中所述第二种奈瑟球菌与所述第一种奈瑟球菌在遗传学上不同(例如，所述第一和第二种细菌属于不同的血清群、血清型或血清亚型)。所述第二种奈瑟球菌的GNA1870多肽不同于所述第一奈瑟球菌的GNA1870多肽。

在其它相关的实施方式中，所述组合物还含有第三分离的抗原制品，所述制品含有由第三种奈瑟球菌制备的囊泡，其中所述第二种奈瑟球菌产生的GNA1870多肽水平足够用于制备给予对象时能引发抗-GNA1870抗体的囊泡，其中所述第三种奈瑟球菌与所述第一或第二种奈瑟球菌在遗传学上不同(例如，所述第一、第二和第三种奈瑟球菌至少属于不同的血清群、血清型或血清亚型之一)。所述第一、第二和第三种奈瑟球菌的GNA1870多肽可以不同。

所述方法能在对象中引发抵御多种奈瑟球菌菌株，特别是脑膜炎奈瑟球菌，更具体说是血清群B脑膜炎奈瑟球菌的保护性免疫应答。

本文所述的抗原性组合物能引发最佳的抗GNA1870、抗-PorA和/或抗-OpC杀菌抗体应答组合，从而赋予抵御脑膜炎球菌疾病的广泛保护作用。

由本文所述过量表达GNA1870的菌株制备的疫苗能引发对以下奈瑟球菌菌株的杀菌抗体应答：与制备囊泡的菌株共享GNA1870变体和/或PorA的奈瑟球菌菌株，以及具有GNA1870亚变体和相对于囊泡产生菌株为异源的PorA的奈瑟球菌菌株。

由过量表达GNA1870的菌株制备的疫苗也能降低(对象)群中选择和出现PorA表达减少的致病脑膜炎奈瑟球菌菌株的可能性。如果在(对象)群中广泛应用常规OMV疫苗，应特别关注这些突变株。因为PorA的表达是阶段可变的(van der Ende等，J.Bacteriology 1995，177：2475-2480)，不表达PorA的突变株较常见，不难用抗-PorA抗体和补体杀伤脑膜炎奈瑟球菌来选择。不表达PorA的菌株也有毒性，能致病。

与制备包含重组多肽的疫苗，或与掺有需要复性构象表位才能引发杀菌抗体的多种单一抗原或重组蛋白(例如PorA)的组合疫苗制剂相比，本文也提供易于制备的有效疫苗组合物的优选方法。

阅读本文内容后，本领域普通技术人员不难明白本发明的各方面、特征和优点。

附图简述

图1A显示了通过间接荧光流式细胞术检测抗-GNA1870抗体与有被囊脑膜炎奈瑟球菌菌株RM1090和RM1090突变体的活细胞表面结合的实验结果。行A.RM1090ΔGNA1870菌株。行B.RM1090野生型菌株。行C.用含GNA1870基因的穿梭载体pFP12转化的RM1090菌株。列1.单用磷酸铝免疫的小鼠的阴性对照血清(1∶10稀释液)。列2.阳性对照抗-C群多糖mAb(10μg/ml)。列3.阳性对照抗-PorA mAb(抗-P1.2，1∶500稀释液)。列4.抗-GNA1870(v.1)mAb(2μg/ml)。列5.制备的抗v.1、2和3重组蛋白的多克隆抗-GNA1870抗血清(1∶10稀释液)。列6.与列5相同，但血清稀释1∶250。

图1B显示了通过间接荧光流式细胞术检测抗体与B群脑膜炎奈瑟球菌活细胞表面的结合。行1.野生型H44/76菌株(灰色区域)；过量表达GNA1870的H44/76突变体(黑色区域)。行2.H44/76ΔGNA1870。图A，抗佐剂阴性对照抗血清，1∶10稀释液；图B，抗-PorA mAb(P1.16)，1∶500稀释液；图C，抗荚膜mAb 10μg/ml；图D，抗-rGNA1870 mAb JAR3，10μg/ml；图E，抗-rGNA1870多克隆抗血清，1∶10稀释液；图F，与图E相同，1∶250稀释液。

图2A提供了OMV的SDS PAGE和Western印迹分析结果。图A是考马斯染色SDS PAGE的照片。泳道1-5，OMV制品(各泳道加入约5μg蛋白，但泳道5加入10μg)。泳道1，野生型(WT)菌株RM1090；泳道2，用不含GNA1870基因的穿梭载体pFP12转化的WT菌株；泳道3.RM1090ΔGNA1870敲除(KO)；泳道4，用不含GNA1870基因的pFP12转化的RM1090ΔGNA1870 KO；泳道5，用含GNA1870基因的穿梭载体pFP12-GNA1870转化的RM1090ΔGNA1870 KO；泳道6，rGNA 1870(约1μg)。图B和C是利用变体1、2和3rGNA1870蛋白免疫小鼠的多克隆抗-GNA1870血清的Western印迹照片。图B：与变体1重组GNA1870蛋白(v.1)相比，检测到该抗血清的灵敏度对于变体2(v.2)重组GNA1870蛋白略高。图C：泳道1，重组GNA1870 v.1；泳道2，WT RM1090的OMV；泳道3，RM1090ΔGNA1870的OMV；泳道4，用含GNA1870基因的pFP12穿梭载体转化的RM1090的OMV。用pFP12穿梭载体转化的RM1090ΔGNA1870菌株中GNA1870 v.1的过量表达高于野生型菌株中GNA1870的天然表达水平(泳道2)。

图2B提供了用抗-rGNA1870多克隆抗体检测OMV疫苗的Western印迹分析结果。野生型，从野生型H44/76菌株制备的OMV；ΔGNA1870，从编码GNA1870的基因已灭活的突变型H44/76制备的OMV；OE GNA1870，经工程改造而过量表达GNA1870的H44/76突变体的OMV；rGNA1870，大肠杆菌表达的纯化的His-标签GNA1870。

图3A显示检测到的对以下四种代表性有被囊脑膜炎奈瑟球菌菌株的小鼠血清杀菌(抗体)滴度：Cu385、M6190、Z1092和NZ98/254。疫苗组是：柱1，单用磷酸铝佐剂；柱2，RM1090野生型的OMV疫苗；柱3，RM1090ΔGNA1870的OMV疫苗；柱4，RM1090ΔGNA1870的OMV疫苗+重组GNA1870蛋白的混合物；柱5，过量表达GNA1870的RM1090的OMV疫苗；柱6，重组GNA1870蛋白。显示几何平均值有95％可信限的柱代表检验了其中9-10只动物个体的血清的各疫苗组。有星号(^*)的柱代表各疫苗组的两种混合血清(各为4-5只不同小鼠的血清混合物)的检验结果几何平均值。

图3B显示用H44/76 OMV疫苗免疫小鼠血清的血清杀菌活性(1/GMT±SD)。如图3A中所述制备混合血清。各组小鼠用：(1)佐剂，(2)rGNA1870，(3)H44/76野生型，(4)H44/76ΔGNA1870，(5)H44/76 OE GNA1870免疫。虽然未在图上显示，但用补体+阳性对照抗荚膜和/或抗-PorA单克隆抗体可杀伤所有菌株。

图4A的一系列图显示通过间接荧光流式细胞术测定到活化的人C3b和iC3b补体沉积在有被囊脑膜炎奈瑟球菌活细胞表面。行A.菌株NZ98/254。行B.菌株M1390。列1，补体+阳性对照B群抗荚膜MAb，25μg/ml(开放区域)或单用磷酸铝免疫的阴性对照小鼠混合血清1∶40稀释液(封闭区域)。列2，补体+抗-GNA1870 MAb JAR3，1μg/ml(开放区域)或热灭活的补体+抗-GNA1870 MAb，5μg/ml(封闭区域)。列3、4和5，补体+列3(rGNA1870疫苗)、列4(RM1090 WT菌株的OMV疫苗)或列5(rGNA1870疫苗和菌株RM1090ΔGNA1870的OMV疫苗的混合物)免疫小鼠混合血清的1∶100稀释液。列6，补体+用过量表达GNA1870菌株RM1090的OMV疫苗免疫小鼠混合血清稀释液(开放区域是1∶100稀释液，灰色区域是1∶400稀释液)。为进行比较，列6的图也显示了补体+用菌株RM1090ΔGNA1870的OMV疫苗免疫小鼠混合血清的1∶100稀释液的数据(封闭区域)。

图4B的一系列图显示通过间接荧光流式细胞术测定到活化的人C3b和iC3b补体沉积在有被囊脑膜炎奈瑟球菌活细胞表面。菌株NZ 98/254、BZ198、Z1092和M6190。图A，开放区域：补体+抗荚膜mAb(B群菌株NZ98/254、BZ198和M61903为25μg/ml，A群菌株Z1092为1μg/ml)；填充区域：补体+抗佐剂抗血清的1∶100稀释液。图B，开放区域：补体+抗-rGNA1870 mAb JAR325μg/ml；填充区域：补体+多克隆抗rGNA1870抗血清的1∶100稀释液。图C，补体+抗野生型H44/76的OMV的抗血清1∶100稀释液；图D，开放区域：补体+已用阴性对照柱(只有Ni-NTA)吸附的过量表达GNA1870的制备的抗OMV抗血清1∶100稀释液；填充区域：补体+用固相GNA1870柱吸附的过量表达GNA1870制备的抗OMV抗血清1∶25稀释液。

图5是显示通过ELISA(GMT±SD)检测血清抗-GNA1870抗体应答的柱状图。平板上的抗原是rGNA1870变体1。第二抗体是碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG+A+M。这些柱代表用：(1)佐剂；(2)rGNA1870；(3)H44/76野生型OMV；(4)H44/76ΔGNA1870 OMV；(5)H44/76 OE GNA1870 OMV免疫的各组小鼠两份抗混合血清(各为4-5只小鼠的混合物)的各自几何平均滴度。

图6提供的图显示了对乳大鼠脑膜炎球菌菌血症模型被动保护力分析的结果。在0时，用免疫小鼠的混合血清(N＝每份混合物9-10只小鼠)稀释液腹膜内处理乳大鼠，两小时后用B群菌株NZ98/294攻击(腹膜内给予约60,000 CFU/大鼠)。细菌攻击4-6小时后获得定量的血液培养物。图A：1∶15血清稀释液。图B：1∶60血清稀释液。柱1：单用磷酸铝免疫小鼠的血清；柱2：抗荚膜mAb(10μg/大鼠)；柱3：抗-GNA1870mAb(10μg/大鼠)；柱4：用RM1090ΔGNA1870的OMV疫苗免疫小鼠的血清；柱5：用RM1090ΔGNA的OMV疫苗+重组GNA1870蛋白疫苗混合物免疫小鼠的血清；柱6：用过量表达GNA1870的RM1090的OMV疫苗免疫小鼠的血清；柱7：用重组GNA 1870蛋白免疫小鼠的血清。

图7分别是脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58、951-5945和M1239的GNA1870变体1、2和3的示范性氨基酸序列的比对。“1”表明成熟蛋白质的第一个氨基酸，负数表示的氨基酸是前导序列的一部分。灰色和黑色背景分别表示保守和相同的氨基酸残基。

图8A-8H提供本发明所用示范性GNA1870多肽的氨基酸序列，包括选出的示范性GNA1870多肽的氨基酸比对(图8H)。

图9提供示范性PorA VR1家族原型(图A)的氨基酸序列和示范性PorA VR2家族原型(图B)的氨基酸序列的比对。

在描述本发明和具体的示范性实施方式之前，应理解本发明不限于所述的具体实施方式，因为这些实施方式当然可变。既然本发明的范围仅受附加的权利要求书限制，则文中使用的术语也应理解仅是为了描述具体的实施方式而非限制。

除非文中另有明确指出，在提供数值范围之处应理解为本发明包括该范围上下限之间的各中间值至下限单位的十分之一，或者也包括该范围中其它任何所述或中间值。这些较小范围的上下限可独立包括在也属于本发明所述范围内排除端点的任何具体较小范围内。当所述范围包括一边或两边界限时，排除一边或两边界限的范围也属于本发明。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可用任何相似或等价于文中所述的方法和材料来实施或测试本发明，但优选方法和材料是本文所述的。文中提及的所有出版物均纳入本文作为参考来公开和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。

必须注意，除非文中另有明确指出，文中和附加的权利要求书所用的单数形式“一种”、“和”与“该”包括其复数形式。因此，例如，“一种抗原”包括多个这种抗原，“该囊泡”包括本领域技术人员已知的一种或多种囊泡及其等价物，等等。

提供本文所述的出版物仅是因为其在本申请提交日期之前公开。本文没什么可解释为承认由于在先发明而使本发明不具资格早于该出版物。此外，提供出版物的发表日期可能不同于实际发表日期，这些日期可能需要独立证实。

发明详述

本发明的依据是发现与重组GNA1870(rGNA1870)蛋白疫苗，或由天然产生菌株制备的OMV或重组蛋白疫苗与OMV混合疫苗相比，用经工程改造而过量表达GNA1870的突变型脑膜炎奈瑟球菌菌株制备的OMV疫苗能在小鼠中引发更广泛的杀菌抗体应答。

OMV疫苗已安全地给予数百万人，并证明能有效抵御脑膜炎球菌疾病。如引言部分所述，它们的主要局限性在于引发的是菌株特异性杀菌抗体应答。如果OMV疫苗广泛用于(对象)群，也应关注免疫应答可能选择脑膜炎奈瑟球菌菌株“逃逸突变体”(即，PorA的表面可接近环氨基酸序列中发生突变或PorA表达减少的菌株)。简言之，通过选择流行的PorA血清亚型和制备过量表达GNA1870的突变株，本发明可制备能引发最佳抗GNA1870和抗-PorA杀菌抗体应答组合的囊泡疫苗(例如，OMV、MV)，从而赋予抵御脑膜炎球菌疾病的广泛保护作用。对于选择(对象)群中致病的PorA缺陷突变株，使用这种疫苗的风险也低于常规OMV疫苗。

此外，与用GNA1870表达水平较低的菌株制备的囊泡相比，过量表达GNA1870的菌株制备的囊泡的蛋白分布概况有所改变。如实施例中详述的，与由野生型疫苗RM1090菌株或RM1090ΔGNA1870敲除菌株制备的OMV相比，由过量表达GNA1870的菌株制备的OMV显示许多其它包膜蛋白表达减少。虽然用过量表达GNA1870(菌株)的OMV免疫小鼠的抗血清能引发针对菌株Cu385的杀菌抗体，或活化C3b沉积在菌株NZ98/294上是GNA1870引发的抗体所致，但这些其它细胞外包膜蛋白减少可进一步提高由过量表达GNA1870菌株制备的囊泡的免疫原性和引发的保护性免疫应答(例如，因为“暴露”了囊泡中的其它抗原)。

本发明提供的实施例说明了由过量表达(例如，经遗传工程改造而过量表达)GNA1870的脑膜炎奈瑟球菌菌株制备的OMV疫苗免疫所引发的保护作用幅度。过量表达GNA1870的OMV疫苗所引发的抗-GNA1870抗体功能活性高于重组GNA1870疫苗或重组GNA1870与野生型菌株制备的OMV的混合疫苗所引发的抗体。例如，虽然ELISA检测到抗-GNA1870抗体应答的数量级较低(表2)，但用经工程改造而过量表达GNA1870的菌株制备的OMV疫苗免疫的小鼠血清显示对菌株Z1092的杀菌活性高于用重组蛋白GNA1870疫苗，用野生型或GNA1870敲除RM1090菌株制备的OMV疫苗或用混合的重组GNA1870蛋白疫苗和OMV疫苗免疫的小鼠血清(图3)。

此外，即使没有强杀菌活性，与其它疫苗产生的抗体相比，过量表达GNA1870(菌株制备)的OMV疫苗所引发的抗体能使更多的C3b沉积在菌株NZ98/254或M1390表面(图4A，列6)，后者在用菌株NZ98/254攻击的乳大鼠时能赋予对菌血症更强的被动保护作用(图6，图A-B)。抗-GNA1870抗体经吸收后，活化C3b沉积到菌株NZ98/254上的能力丧失(表3)。简言之，修饰的OMV疫苗比GNA1870重组蛋白或野生型疫苗菌株的OMV疫苗能赋予更广泛的保护作用，因为修饰的OMV疫苗能引发的血清亚型特异性杀菌活性而抵御能表达与该疫苗菌株同源的PorA分子的菌株，同时与重组GNA1870疫苗所引发的抗体相比，所引发的抗-GNA1870抗体抵御表达GNA1870变体1蛋白亚变体的菌株的功能活性更强。

对于抵御表达变体1 GNA1870蛋白的亚变体和/或表达同源性PorA血清亚型的菌株，由过量表达GNA1870菌株制备的修饰OMV疫苗优于重组GNA1870(疫苗)。有趣的是，与用编码NspA的基因已灭活菌株RM1090制备的对照囊泡疫苗免疫的对照小鼠相比，用经工程改造而过量表达NspA的脑膜炎奈瑟球菌菌株(RM1090)制备的囊泡疫苗免疫的小鼠的ELISA抗-NspA抗体滴度高10倍，但对一些脑膜炎奈瑟球菌菌株，例如Cu385或Z1092的血清杀菌滴度较低(表5)。O′Dwyer等也观察到用经工程改造而过量表达NspA的黄色奈瑟球菌菌株制备的OMV疫苗免疫接种的小鼠血清缺乏杀菌活性(Infect.Innun.2004，72：6511-80)。因此，发现对过量表达GNA1870(的菌株制备)的OMV疫苗的杀菌和保护性抗体应答提高是意外的。

与由H44/76野生型菌株制备的OMV中天然GNA1870含量较高相比，菌株H44/76中GNA1870 v.1过量表达导致OMV中GNA1870增加约3倍。与我们以前用野生型菌株RM1090的OMV免疫小鼠研究相反，ELISA检测到用野生型H44/76制备的OMV免疫小鼠产生了抗-GNA1870抗体(图5)。然而，给予过量表达GNA1870菌株的OMV的小鼠组(抗体)滴度约高10倍。ELISA检测的滴度与抗体功能活性不良好相关。例如，用重组GNA1870疫苗免疫的小鼠具有最高的血清抗-GNA1870滴度，但用重组蛋白免疫的小鼠血清杀菌活性和C3b沉积活性限于对菌株H44/76。预计该菌株(对该抗体)敏感，是因为实际上具有ET5遗传谱系的所有脑膜炎奈瑟球菌菌株都高度表达典型的GNA1870 v.1蛋白(与MC58的氨基酸序列相同)，故这些菌株对抗-GNA1870抗体的补体介导杀菌活性高度敏感(Masignani等，2003，同上；Welsch等，2004，同上)。我们研究的其余五种脑膜炎奈瑟球菌测试菌株表达的GNA1870含量低于菌株H44/76，相应的蛋白质是GNA1870 v.1的亚变体。这5种菌株也具有对H44/76疫苗菌株而言为异源性的PorA分子。这5种菌株对重组GNA1870疫苗所引发抗体或OMV疫苗所引发的抗-ProA抗体导致的杀菌活性和补体活化耐受。相反，这5种菌株的4种对用过量表达GNA1870的H44/76 OMV疫苗免疫的小鼠血清的杀菌活性和/或补体沉积活性敏感。C3b在活细菌表面活化引起对乳大鼠产生预计的抵御脑膜炎球菌菌血症的被动保护力(Welsch等，J Infect Dis 2003，188：1730-40；Welsch等，J Immunol 2004，172：5606-15；Hou等，J Infect Dis 2005，192：580-90；Moe等，Infect Immun 2002，70：6021-31)。含过量表达GNA1870的OMV疫苗由复杂的抗原混合物构成，预计能引发针对许多靶抗原的抗体。然而，在吸收实验中，抵御这些菌株的抗体功能活性针对对照GNA1870的(表3)。

与用选择的GNA1870表达较高的野生型菌株制备的OMV疫苗相比，用GNA1870水平只有适度增加的突变型菌株制备的OMV疫苗引发了更高且更广的GNA1870-特异性杀菌抗体应答和/或更多的C3沉积。因此，OMV疫苗制品中GNA1870与总蛋白的比例即使只有少许变化看来也能决定对GNA1870是否会产生抗体应答。此外，含过量表达的GNA1870的OMV疫苗所引发抗体的质量优于重组GNA1870疫苗所引发的抗体。例如，该重组疫苗引发的ELISA抗体结合滴度高于含过量表达GNA1870的OMV疫苗引发的，但抗该重组蛋白(所引发)抗体的杀菌和补体活化活性较低。要确定经修饰的GNA1870-OMV疫苗通过何种机制引发比重组蛋白或对照OMV疫苗更广泛功能活性的抗体需要进一步研究。

因此，本发明提供引发能与各种致病性脑膜炎奈瑟球菌菌株起广泛反应的免疫应答的方法和组合物。本发明通过提高对疫苗菌株中GNA1870和其它可能的共同抗原的抗体应答克服了囊泡或PorA疫苗中PorA抗原可变结构域所具有的免疫优势问题。重要的是，本发明方法引发的血清杀菌抗体能抵御表达该疫苗制品中未使用的血清亚型表位的奈瑟球菌菌株，唯一经证实的血清学与人体保护作用的相关性(Goldschneider等，1969，同上)。此外，所述方法引发的血清杀菌抗体能抵御针对保守性蛋白(例如奈瑟球菌表面蛋白A，一种候选脑膜炎球菌疫苗)(Martin等，2000.J.Biotechnol.83：27-31；Moe等，1999 Infect.Immun.67：5664；Moe等，Infect Immun.2001 69：3762)的抗体无法杀伤的菌株。不希望受理论的束缚，本发明疫苗和免疫接种方案的优点是通过引发保守和非保守抗原的特异性抗体来提供出乎意料的广谱保护性免疫力。

定义

术语“保护性免疫力”表示给予哺乳动物的疫苗或免疫接种方案能诱导预防、延迟脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的发生或减轻其严重程度或降低或完全消除其症状的免疫应答。

短语“脑膜炎奈瑟球菌血清群B菌株所致疾病”包括存在脑膜炎奈瑟球菌血清群B某成员感染所致的任何临床症状或临床症状组合。这些症状包括但不限于：脑膜炎奈瑟球菌血清群B病原菌株寄居上呼吸道(例如，鼻咽和扁桃体粘膜)，细菌穿过进入粘膜和粘膜下血管床，败血症、脓毒性休克、炎症、出血性皮肤病损、激活血纤蛋白溶解和血液凝结，器官功能失调，例如肾、肺和心力衰竭，肾上腺出血和肌肉梗死，毛细血管渗漏，水肿，外周肢体缺血(peripheral limb ischaemia)，呼吸窘迫综合征，心包炎和脑膜炎。

短语“广谱保护性免疫力”表示疫苗或免疫方案引发了针对至少一种或多种(或针对至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、针对至少8种或至少针对8种以上)脑膜炎奈瑟球菌菌株的“保护性免疫力”，其中所述各菌株属于与制备疫苗所用菌株不同的血清亚型。本发明专门考虑并包括能抵御脑膜炎奈瑟球菌血清群B某成员所致疾病，也抵御其它血清群，特别是血清群A、C、Y和W-135保护力的疫苗或疫苗接种方案。

当短语“与某抗体特异性结合”或“特异性免疫反应”指某抗原，例如多糖、磷脂、蛋白质或肽时，表示根据样品中存在的抗原和/或检验其存在的结合反应，所述样品也可以是包含其它分子的异质群体。因此，在指定的免疫测定条件下，所述一种或多种特异性抗体能与样品中的一种或多种特定抗原结合，而不与样品中存在的显著含量的其它分子结合。在这种条件下某抗体的特异性结合可能需要选用对一种或多种特定抗原具有特异性的抗体或抗血清。

短语“用量足以引发针对所述制品中存在表位的免疫应答”表示在给予特定抗原制品前后检测到的免疫应答指示物之间存在可检测的差异。免疫应答指示物包括但不限于通过例如以下试验检测的抗体滴度或特异性：酶联免疫测定(ELISA)、杀菌试验、流式细胞术、免疫沉淀、Ouchter-Lowny免疫扩散、例如斑点、Western印迹或抗原阵列的结合检测试验、细胞毒性试验等。

“表面抗原”是存在于脑膜炎奈瑟球菌的表面结构(例如，外膜、内膜、周质间隙、荚膜、菌毛等)中的抗原。

在脑膜炎奈瑟球菌遗传学多样性菌株的说明中所用的短语“遗传学多样性”指至少一种、通常至少两种、更常见至少三种多肽，特别是抗原性多肽的氨基酸序列彼此不同的菌株。可通过选择至少一种或以上、优选至少两种或以上血清群、血清型或血清亚型不同的菌株(例如，选自外膜、PorA和PorB蛋白的至少一种蛋白不同的两种菌株称为彼此遗传学不同)而实现菌株的遗传多样性。也可通过，例如多个基因座序列分型和/或多个基因座酶分型(参见，例如Maiden等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci USA 95：3140；Pizza等，2000 Science 287：1816)、多个基因座酶电泳和本领域已知的其它方法确定遗传学多样性。

本文所用的“血清群”指依靠荚膜多糖免疫学可检测的差异进行脑膜炎奈瑟球菌分类。已知约有12种血清群：A、B、C、X、Y、Z、29-E、W-135、H、I、K和L。任何一种血清群可包括多种血清型和多种血清亚型。

本文所用的“血清型”指根据单克隆抗体确定的外膜通道蛋白B的抗原差异进行脑膜炎奈瑟球菌菌株分类。一种血清型可见于多种血清群和多种血清亚型中。

本文所用的“血清亚型”指根据用抗体确定的称为通道蛋白A的外膜蛋白的抗原性差异，或根据DNA测序推导的氨基酸序列的VR分型(Sacchi等，2000，J.Infect.Dis.182：1169；也可参见Multi Locus Sequence Typing(多基因座序列分型)网站)进行脑膜炎奈瑟球菌菌株分类。PorA蛋白之间的大多数变异发生在8种推定的表面暴露环中的两个(环I和IV)。可变环I和IV分别命名为VR1和VR2。一种血清亚型可见于多种血清群和多种血清亚型中。

“富集的”表示经实验人员或临床医师操作，某抗原组合物中的某抗原与获得该抗原组合物的菌株中该抗原的浓度相比，其浓度以总重量计高至少三倍、通常至少五倍、更优选至少十倍、更常见是至少一百倍。因此，如果某特定抗原的浓度是1微克/克细菌总制品(或细菌总蛋白)，则富集制品含有至少3微克/克细菌总制品(或细菌总蛋白)。

术语“异源”指自然界中发现不在一起的两种生物学组分。所述组分可以是宿主细胞、基因或调节区，例如启动子。虽然自然界中发现异源组分不在一起，它们可共同起作用，例如当某基因的异源启动子与之操作性相连时。另一例子是某奈瑟球菌序列对不同菌株的奈瑟球菌宿主为异源。本文在两种不同细菌菌株表达的蛋白质，例如“异源PorA”或“异源GNA1870”的说明中使用“异源”表明所述二蛋白质的氨基酸序列不同。例如，表达PorA 1.5-2，10的第一种奈瑟球菌菌株对表达PorA 7-2，4的第二种奈瑟球菌菌株而言称为具有“异源PorA蛋白”或是“PorA异源”。

术语“对于脑膜炎奈瑟球菌为免疫原初是”表示从未接触过脑膜炎奈瑟球菌(通过感染或给予)或衍生自脑膜炎奈瑟球菌的抗原组合物(其含量足以引发保护性免疫力)，或者如果接触过，未能引起保护性免疫应答的个体(例如，哺乳动物，如人患者)。(后一情况的例子是接触时太年幼而未产生保护性免疫应答的个体。Molages等，1994，Infect.Immun.62：4419-4424)。还需要(但不一定)包括“免疫学原初的”个体也未接触过除脑膜炎奈瑟球菌以外的奈瑟球菌种(或用某奈瑟球菌种制备的抗原组合物)，特别是未接触过奈瑟球菌种的交叉反应性菌株(或抗原组合物)。已接触过奈瑟球菌种(通过感染或给予)或衍生自该奈瑟球菌种的抗原组合物(其含量足以引发针对该种细菌所显示表位的免疫应答)的个体是“致敏的”，从而能对该种细菌所显示的表位起免疫反应。

表达用于制备囊泡的GNA1870的奈瑟球菌菌株

本发明总体上包括由天然产生的或遗传修饰的奈瑟球菌种制备囊泡(微囊泡或外膜囊泡)，其中所述奈瑟球菌种产生的GNA1870蛋白水平足够用于制备给予对象时能引发血清抗-GNA1870抗体的囊泡。所产生的抗-GNA1870抗体有助于提供抵御1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种奈瑟球菌菌株的免疫保护作用，对于例如血清群、血清型、血清亚型(如PorA蛋白所测定的)、序列类型、电泳类型、GNA1870变体和/或GNA1870亚变体，这些菌株可以存在遗传学多样性(或“异源的”)。

本发明方法可利用能产生或经修饰能产生GNA1870，和任选能产生或经修饰能产生感兴趣的其它抗原，例如PorA的各种奈瑟球菌属菌株。适合于产生GNA1870的菌株特征详述于下文。

特别感兴趣的是病原性奈瑟球菌属或源自病原性奈瑟球菌属的菌株，特别是人的病原性或源自人的病原性或共栖菌株。示范性奈瑟球菌属包括脑膜炎奈瑟球菌、黄色奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)、乳糖奈瑟球菌(N.lactamica)、多糖奈瑟球菌(N.polysaccharea)、灰色奈瑟球菌(N.cinerea)、粘液奈瑟球菌(N.mucosa)、微黄奈瑟球菌(N.subflava)、干燥奈瑟球菌(N.sicca)、长奈瑟球菌(N.elongata)等。细菌菌株说明中的“源自”表示通过亲代菌株的体内传代或体外培养获得某菌株和/或是通过修饰亲代菌株获得的重组细胞。

本发明特别感兴趣的脑膜炎奈瑟球菌菌株。可根据能与不同表面抗原相互反应的多克隆(Frasch，C.E.和Chapman，1973，J.Infect.Dis.127：149-154)或单克隆抗体将脑膜炎奈瑟球菌菌株分为血清群、血清型和亚型。根据荚膜多糖中免疫学可检测的变异进行血清分群(serogrouping)。已知有约12种血清群(A、B、C、X、Y、Z、29-E和W-135)。血清群A、B、C、Y和W-135的菌株可导致几乎所有的脑膜炎球菌疾病。

可根据单克隆抗体确定的称为通道蛋白B(PorB)的外膜蛋白的抗原性差异区分血清型。目前已知约有21种抗体确定的血清型(Sacchi等，1998，Clin.Diag.Lab.Immunol.5：348)。可根据抗体确定的称为通道蛋白A(PorA)的外膜蛋白的抗原性差异区分血清亚型(serosubtyping)。目前已知约有18种抗体确定的血清亚型。在免疫力可能是血清亚型特异性时区分脑膜炎奈瑟球菌菌株血清亚型尤其重要。PorA蛋白之间的大多数变异发生在8个推定的表面暴露环中的两个(环I和IV)中。可变环I和IV分别命名为VR1和VR2。由于存在用特异性抗体不能确定的多个PorAVR1和VR2序列变体，有人根据从DNA序列推定的氨基酸序列的VR分型提出了替代术语(Sacchi等，2000，J Infect.Dis.182：1169；也参见Multi Locus SequenceTyping(多基因座序列分型)网站)。脂多糖也可用作分型抗原，从而得到所谓的免疫型：L1、L2等。

也可采用能直接或间接特征鉴定细菌基因组的各种技术将脑膜炎奈瑟球菌分为克隆组或亚组。这些技术包括根据酶的电泳迁移率不同的多基因座酶电泳法(MLEE)，其变化能反映特定遗传基因座的潜在多态性。通过特征鉴定许多这种蛋白质的变体，可从错配比例推断两菌株间的遗传“距离”。类似地，如果两种分离物的多个基因座具有相同的电泳变化模式，则可推断该二分离物之间具有克隆性(clonality)。近年来，多基因座序列分型(MLST)替代了MLEE作为特征鉴定微生物选用的方法。采用MLST，可从脑膜炎奈瑟球菌菌株11种持家基因的DNA序列的错配比例推断两种分离物之间的遗传距离或克隆性(Maiden等，1998，Proc.NatlAcad.Sci USA 95：3140)。

可根据许多不同的所需特征选择用于产生囊泡的菌株。例如，除了根据GNA1870的产量水平来选择外，可根据以下特征选择菌株：所需的PorA类型(如上述的“血清亚型”)、血清群、血清型等；荚膜多糖产量低等。

例如，生产菌株应能产生任何所需的PorA多肽，可表达一种或多种PorA多肽(天然的或经遗传改造的)。示范性菌株包括产生以下PorA多肽的那些菌株：能赋予血清亚型P1.7，16；P1.19，15；P1.7，1；P 1.5，2；P1.22a，14；P1.14；P1.5，10；P1.7，4；P1.12，13的PorA多肽；以及保留或未保留与区分血清亚型所用常规血清学试剂反应性的这种PorA多肽变体。

根据PorA可变区(VR)分型特征鉴定的PorA多肽也是感兴趣的多肽(参见，例如Russell等，Emerging Infect Dis 2004 10：674-678；Sacchi CT等，Clin Diagn LabImmunol 1998，5：845-55；Sacchi等，J.Infect Dis 2000，182：1169-1176)。已鉴定了许多不同的VR型，这些型可分为VR1和VR2家族“原型”。描述此术语及其与以前分型方案的关系的网络数据库见neisseria.org/nm/typing/pora。Russell等(Emerging Infect Dis 200410：674-678)提供了示范性PorA VR1和VR2型的比对，为方便读者起见图9提供了这种比对。

通过PorA血清亚型特征鉴定的示范性PorA多肽包括：P1.5，2；P1.5a，2a；P1.5a，2c；P1.5a，2c；P1.5a，2c；P1.5b，10；P1.5b，10；P1.5b，C；P1.7，16；P1.7d，1；P1.7d，1；P1.7d，1；P1.7d，1；P1.7b，3；P1.7b，4；P 1.7b，4；P1.12，16；P 1.12a，13a；P1.22，9；P1.23，14；P1.23，14；P1.19，15；P1，B，1；P1.C，1；P1.E，A；P1.E，A；P1.E，A；；P1.5，2；P1.5，2；P1.5a，10a；P1.5b，10；P1.5b，10；P1.5b，10b；P1.7，16；P1.7，16；P1.7b，1；P1.7b，13e；P1.7b，4； P1.7b，4；P1.7d，1；P 1.7d，1；P1.7b，13a；P1.23，3；P1.23，3；P1.23，3；P1.19，15；P1.19，1；P1.19，15；P1.19，15；P1.19，15；P1.19，15；P1.19，15；P1.19，15；P1.19，15；P1，E，A；P1，E，A；P1.E，16a；P1.E，4a；P1.E，4a；P1.Ea，3；P1.Eb，9；P1.Eb，9；P1.Eb，9；P1.Eb，9；P1.Eb，9；P1.F，16；P1.7a，1；P1.7b，3；P1.7d，1；P1.Ea，3；P1.5b，10；P1.5b，10；P1.5b，10；P1.5b，10；P1.5b，10；P1.5b，10；P1.5b，10b；P1.5b，10；P1.22，14a；；P1.F，16；P1.D，2d；P1.D，2；P1.D，2d；P1.19c，2c；P1D，10f；P1A，10e；P1A，10g；P1A，10；P1.19，15；P1.19，15；P1.19，15；P1.19，15；P1.7b，16；P1.7，16b；P1.7，16；P1.19，15；P1.Eb，9；P1.5，2e；P1，E，A；P1.7b，13d；P1.Ea，3；P 1.7，16b；P1，Ec，1；P1.7b，4； P1.7b，4；P1.7，9；P1.19，15；P1.19，15；P1.19，15；P1.19，15a；P1.19a，15b；P1.19，1 5；P1.5b，16；P1.19b，13a；P1.5，16；P1.5，2；P1.5，2b；P1.7b，16；P1.7，16b；P1.7b，3；P1.Ea，3；P1.5a，2c；P1.F，16；P1.5a，9；P1.7c，10c；P1.7b，13a；P1.7，13a；P1.7a，10；P1.20，9；P1.22，B；P1.5b，de1；P 1.5b，10；P1.7，13a；P1.12a，13f；P1.12a，13；P1.12a，13a；P1.12a，13a；P1.12a，13；P1.12a，13；P1.E，13b；P1.7b，13a；P1.7b，13；P1.5，2；P1.5，2；P1.Ea，3；P1.22，9；P1.5，2；P1.5，2；P1.19，15；P1.5，2；P1.12b，13a；P1.5c，10a；P1.7e，16e；P1.B，16d；P1.F，16e；P1.F，16e；P1.7b，13e；P1.B，16d；P1.7e，16e；P1.7b，13g；P1.B，16f；；P1.7，16c；P1.22，14b；P1.22，14c；P1.7，14；P1.7，14和P1.23，14。

示范性PorA多肽的氨基酸序列见GenBank登录号：X57182、X57180、U92941、U92944、U92927、U92931、U92917、U92922、X52995、X57184、U92938、U92920、U92921、U92929、U92925、U92916、X57178、AF051542、X57181、U92919、U92926、X57177、X57179、U92947、U92928、U92915、X57183、U92943、U92942、U92939、U92918、U92946、U92496、U97260、U97259、AF042541、U92923、AF051539、AF051538、U92934、AF029088、U92933、U97263、U97261、U97262、U92945、AF042540、U92935、U92936、U92924、AF029086、AF020983、U94958、U97258、U92940、AF029084、U92930、U94959、U92948、AF016863、AF029089、U92937、AF029087、U92932、AF029090、AF029085、AF051540、AF051536、AF052743、AF054269、U92495、U92497、U92498、U92499、U92500、U92501、U92502、U92503、AF051541、X12899、Z48493、Z48489、Z48485、Z48494、Z48487、Z48488、Z48495、Z48490、Z48486、Z48491、Z48492、X66478、X66479、X66477、X66480、X81110、X79056、X78467、X81111、X78802、Z14281/82、Z14273/74、Z14275/76、Z14261/62、Z14265/66、Z14277/78、Z14283/84、Z14271/72、Z14269/70、Z14263/64、Z14259/60、Z14257/58、Z14293/94、Z14291/92、Z14279/80、Z14289/90、Z14287/88、Z14267/68、Z14285/86、L02929、X77423、X77424、X77433、X77426、X77428、X77430、X77427、X77429、X77425、X77432、X77431、X77422、Z48024/25、Z48032/33、Z48020/21、Z48022/23、Z48028/29、Z48016/17、Z48012/13、Z48014/15、Z48018/19、Z48026/27、U31060、U31061、U31062、U31063、U31064、U31065、U31066、U31067、U93898、U93899、U93900、U93901、U93902、U93903、U93904、U93905、U93906、U93907和U93908。

或者，生产菌株可以是荚膜缺陷型菌株。荚膜缺陷型菌株提供的囊泡疫苗给予对象时能降低引发显著自身抗体应答的风险(例如，因为产生了能与宿主细胞表面的唾液酸交叉反应的抗体)。本文所用的“荚膜缺陷”或“缺乏荚膜多糖”表示细菌表面荚膜多糖水平低于天然产生的菌株，或者菌株经遗传修饰时，细菌表面荚膜多糖水平低于衍生该荚膜缺陷型菌株的亲代菌株。荚膜缺陷型菌株包括表面荚膜多糖产生降低至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％或以上的菌株，也包括细菌表面荚膜多糖不可检测(例如，利用抗荚膜多糖抗体的全细胞ELISA)的菌株。

荚膜缺陷型菌株包括因天然产生的或重组产生的经遗传修饰而缺乏荚膜的那些菌株。本领域已知天然产生的荚膜缺陷型菌株(参见，例如Dolan-Livengood等，J.Infect.Dis.(2003)187(10)：1616-28)以及鉴定和/或产生荚膜缺陷型菌株的方法(参见，例如Fisseha等，(2005)Infect.Immun.73(7)：4070-4080；Stephens等，(1991)Infect Immun 59(11)：4097-102；Frosch等，(1990)Mol Microbiol.19904(7)：1215-1218)。

修饰奈瑟球菌宿主细胞以降低荚膜多糖产生可包括修饰参与荚膜合成的一个或多个基因，与修饰前的亲代细胞相比，修饰基因能降低荚膜多糖的水平。这种遗传修饰包括改变一个或多个荚膜生物合成基因的核苷酸和/或氨基酸序列，使得该菌株缺乏荚膜(例如，因为一个或多个荚膜生物合成基因中有一个或多个(核苷酸)插入、缺失、取代等)。荚膜缺陷型菌株可缺乏一个或多个荚膜基因或所述基因无功能。

特别感兴趣的是唾液酸生物合成有缺陷的菌株。这种菌株产生的囊泡可降低产生引发与人唾液酸抗原起交叉反应的抗-唾液酸抗体的风险，还可改进生产安全性。唾液酸生物合成缺陷(因天然产生的修饰或工程改造的修饰)菌株可以是唾液酸生物合成途径的许多不同基因有缺陷。特别感兴趣的是N-乙酰葡糖胺-6-磷酸2-差向异构酶基因(称为synX AAF40537.1或siaA AAA20475)编码的基因产物有缺陷的菌株，尤其感兴趣该基因灭活的菌株。例如，一个实施方式通过破坏功能性synX基因产物的产生来获得荚膜缺陷型菌株(参见，例如Swartley等，(1994)J Bacteriol.176(5)：1530-4)。

也可采用非重组技术从天然产生的菌株获得荚膜缺陷型菌株，例如用杀菌性抗-荚膜抗体来选择荚膜多糖减少的菌株。

当本发明涉及采用两种以上菌株时(例如，如下文详述的那样，为产生不同菌株囊泡的抗原性组合物)，例如，可选择特征不同的一种或多种菌株来提供PorA类型不同和/或GNA1870变体群的囊泡。

奈瑟球菌宿主细胞中GNA1870的产量

如上所述，通常可按照本发明利用天然产生或经修饰的非天然奈瑟球菌菌株制备囊泡，所述囊泡含有足够的GNA1870蛋白，当给予对象时能产生抗-GNA1870抗体。

在一个实施方式中，与表达检测不到或低水平GNA1870的菌株相比，用于制备本发明囊泡的奈瑟球菌菌株可以是表达较高水平GNA1870的天然菌株。RM1090是产生低水平GNA1870菌株的实例。特别感兴趣的天然菌株是其产生的GNA1870水平比低GNA1870产生菌株，例如RM1090的GNA1870产量高1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍或更高的菌株。表达高水平GNA1870的天然菌株的实例包括ET-5菌株，例如H44/76、Cu385和MC58。表达低水平或检测不到水平GNA1870、中间水平GNA1870或高水平GNA1870的菌株的讨论可参见Masignani等，2003，J Exp Med 197：789-199。在具体实施方式中，所述菌株产生的GNA1870水平高于RM1090产生的，比RM1090产生的至少高1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍或更高。

在另一实施方式中，通过重组或非重组技术修饰奈瑟球菌菌株来提供足够高水平的GNA1870产生。与未修饰的亲代细胞的GNA1870产量或菌株RM1090的GNA1870产量相比，这种修饰的菌株通常能提高GNA1870产量1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍或更高。该实施方式可利用任何合适的菌株，包括修饰前GNA1870产量低或水平检测不到的菌株，和与GNA1870检测不到或水平低的菌株相比，能天然产生高水平GNA1870的菌株。

可通过非重组技术，例如接触化学物质、辐射或其它DNA修饰或破坏试剂等产生修饰的菌株。可通过筛选能产生所需GNA1870水平(例如，与未修饰的亲代菌株或GNA1870产量低的细菌(如RM1090)相比，GNA1870水平高，或其水平类似于产生可接受高水平GNA1870的菌株的水平)的菌株来鉴定具有所需蛋白质表达水平，特别是GNA1870产量的修饰菌株。

或者，更常是采用重组技术，一般通过引入编码GNA1870多肽的核酸或操纵内源性GNA1870基因来提高内源性GNA1870表达从而产生修饰的菌株。

本领域已知测定GNA1870产量水平的方法。这种方法包括，例如利用抗-GNA1870抗体的Western印迹(任选与光密度扫描辅助的分析联用)、流式细胞术(例如，FACS)分析、检测GNA1870 RNA水平等。本文有时将无论天然或经遗传修饰导致GNA1870产量水平较高的菌株称为GNA1870“过量表达菌株”或称为“过量表达”GNA1870。

遗传修饰的奈瑟球菌菌株的产量

如上所述，通过引入编码GNA1870多肽的核酸或操纵内源性GNA1870基因来提高内源性GNA1870表达。

遗传修饰奈瑟球菌宿主细胞来提高内源性GNA1870的表达

可通过原位改变控制GNA1870表达的调控区来提高内源性GNA1870表达。本领域已知提高内源性奈瑟球菌基因表达的方法(参见，例如WO02/09746)。此外，已知编码基因组GNA1870变体和亚变体的基因核酸序列，从而不难应用这些方法来上调内源性GNA1870表达。

内源性GNA1870可以是GNA1870的任何所需变体组(例如，v.1、v.2、v.3等)或亚变体。对菌株MC58的“标准”v.1 GNA1870多肽特别感兴趣。对菌株NZ98/294的亚变体GNA1870多肽和菌株2996的v.2 GNA1870多肽也感兴趣。

修饰奈瑟球菌宿主细胞来提高内源性GNA1870产量可包括部分或完全取代控制GNA1870表达的所有或部分内源性基因，与未修饰的亲代菌株相比，这种修饰能提高转录活性。可利用内源性控制区域中的变异(点突变、缺失和/或插入)和天然产生或修饰的异源启动子或二者组合来提高转录活性。遗传修饰一般能使转录活性高于未修饰的内源性转录活性(例如，通过引入强启动子)，从而提高GNA1870表达。

可用于提高GNA1870转录产量的典型强启动子可包括，例如porA、porB、lbpB、tbpB、p110、hpuAB、lgtF、Opa、p110、lst和hpuAB启动子。作为组成型强启动子，PorA、RMp和PorB是特别感兴趣的。PorB启动子的活性包含在对应于porB起始密码子上游的核苷酸-1到-250片段中。

本领域可采用各种方法将启动子引入宿主细胞基因组中，使启动子与内源性GNA1870编码核酸操作性相连。例如，(可采用)双跨越同源重组技术将某启动子引入编码序列的上游区域，例如引入GNA1870编码核酸的起始ATG密码子上游(5’)约1000bp、约30-970bp、约200-600bp、约300-500bp或约400bp，从而上调(转录)。可通过本领域可用的常规方法来确定最佳取代的启动子。

例如，在靶基因上游引入高活性启动子(如PorA、PorB或Rmp启动子)。例如，按照van der Ende等，Infect Immun 2000，68：6685-90所述可优化PorA启动子用于表达。可通过以下方法插入启动子，例如PCR扩增GNA1870靶基因上游区段、将该上游区段克隆入载体中以及在PCR扩增期间插入合适的限制性位点，或利用天然的限制性位点插入PorA启动子区段。例如，可克隆GNA1870基因的约700bp上游区段。利用位于该克隆区段内GNA1870启动子上游适当距离(例如，约400bp)的天然限制性酶切位点插入PorA启动子区段。可将抗生素(例如，红霉素)抗性盒插入PorA启动子再上游的区段内，通过同源重组用该构建物替代野生型上游GNA1870区段。

另一方法包括将编码GNA1870多肽的序列引入在宿主细胞基因组中显示强转录活性的内源性启动子的下游。例如，可用GNA1870多肽的编码序列取代Rmp基因的编码区。该方法的优点是利用高活性的组成型Rmp启动子来驱动表达。

遗传修饰奈瑟球菌宿主细胞来表达内源性GNA1870

可通过将编码GNA1870多肽的构建物引入奈瑟球菌宿主细胞中来遗传修饰奈瑟球菌菌株，从而过量表达GNA1870。本文将为表达而引入的GNA1870称为“外源性”GNA1870。宿主细胞产生内源性GNA1870，与该内源性GNA1870相比，外源性GNA1870可具有相同或不同的氨基酸序列。

在该实施方式中用作宿主细胞的菌株能产生任何水平的GNA1870(例如，高水平、中间水平或低水平GNA1870产量)。特别感兴趣的是利用选择的GNA1870产量低水平或检测不到的菌株，或经修饰而GNA1870产量检测不到或水平低的菌株。例如，可遗传修饰宿主细胞以破坏其内源性GNA1870基因，从而使细胞被膜中不产生GNA1870或不存在(因此，从这种修饰的细胞制备的囊泡中不存在可检测水平)。在其它实施方式中，所述宿主细胞能产生中间水平或高水平的GNA1870(例如，与如RM1090产生的GNA1870水平相比)。

GNA1870多肽

可遗传修饰宿主细胞来表达任何合适的GNA1870多肽，包括GNA1870变体或亚变体。如下文所详述的那样，已知许多GNA1870多肽的氨基酸序列；这些序列比对指出变体中的保守残基，从而能指导对氨基酸的修饰(例如，取代、插入、缺失)。

因此，本文所用的“GNA1870多肽”包括天然产生与合成(非天然产生)的多肽，所述合成多肽与天然产生的GNA1870多肽在核苷酸或氨基酸水平有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的序列相同性，其引发的抗体能特异性结合奈瑟球菌细菌全细胞上存在的天然GNA1870多肽。“GNA1870多肽”也包括融合蛋白，例如在N-和/或C-末端连有异源多肽的GNA1870多肽。

可遗传修饰宿主细胞以表达至少1种GNA1870多肽，可修饰宿主菌从而在同一宿主细胞中表达2种、3种、4种或更多种GNA1870多肽。例如，可遗传修饰一种宿主细胞来表达至少一种GNA1870多肽变体1、至少一种GNA1870多肽变体2和至少一种GNA1870多肽变体3。

当表达多种GNA1870多肽因对宿主细胞的毒性而遇到困难时，可从不同启动子表达不同的GNA1870多肽，从而能进行一系列表达。例如，改变PorA启动子的-10到-35之间区域的碱基组成和碱基数目应能拓宽表达所需重组蛋白的范围(van der Ende等，Infect Immun 2000，68：6685-90)。

本领域已知编码本发明所用GNA1870多肽的核酸。合适的GNA1870多肽描述于，例如WO 2004/048404；Masignani等，2003 J Exp Med 197：789-799；Fletcher等，Infect Immun 2004 2088-2100；Welsch等，J Immunol 2004172：5606-5615；和WO 99/57280。GNA1870变体和亚变体的核酸(及氨基酸序列)在GenBank中也有提供，登录号为：NC_003112，GeneID：904318(NCBI Ref.NP_274866)(脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58)；AY548371(AAT01290.1)(脑膜炎奈瑟球菌菌株CU385)；AY548370(AAT01289.1)(脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76)；AY548377(AAS56920.1)(脑膜炎奈瑟球菌菌株M4105)；AY548376(AAS56919.1)(脑膜炎奈瑟球菌菌株M1390)；AY548375(AAS56918.1)(脑膜炎奈瑟球菌菌株N98/254)；AY548374(AAS56917.1)(脑膜炎奈瑟球菌菌株M6190)；AY548373(AAS56916.1)(脑膜炎奈瑟球菌菌株4243)；和AY548372(AAS56915.1)(脑膜炎奈瑟球菌菌株BZ83)。

图7分别是脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58、951-5945和M1239的GNA1870变体1、2和3的示范性氨基酸序列的比对(WO 2004/048404)。不成熟的GNA1870蛋白包含约19个残基的前导序列，各变体通常含有共价连接于脂质部分的N-末端半胱氨酸。在天然成熟的蛋白质中该半胱氨酸残基常脂质化。“1”表明成熟蛋白质的第一个氨基酸，负数表示的氨基酸是前导序列的一部分。灰色和黑色背景分别表示保守和相同的氨基酸残基。GNA1870多肽，包括非天然产生的变体的其它氨基酸序列见图8A-8H和9。

GNA1870可以是脂质化或非脂质化的。通常优选GNA1870是脂质化的，从而能将该多肽安装在膜中。可通过表达具有N-末端信号肽的GNA1870多肽(该信号肽可通过二酰基甘油基转移酶直接脂质化)，然后利用脂蛋白特异性(II型)信号肽酶切割来制备脂质化的GNA1870。

本发明所用的GNA1870多肽包括氨基酸序列与天然GNA1870多肽不同的非天然产生(人工或突变型)的GNA1870多肽，但这些多肽存在于奈瑟球菌宿主细胞的膜中，因而由该宿主制备的囊泡含有的GNA1870能呈递感兴趣的表位，最好是杀菌表位并能提供抗-GNA1870抗体应答。在一个实施方式中，GNA1870多肽是变体1(v.1)或变体2(v.2)或变体3(v.3)GNA1870多肽，包含感兴趣的v.1、v.2和v.3的亚变体，包括v.1的亚变体(参见，例如Welsch等，J Immunol2004 172：5606-5615)。在一个实施方式中，GNA1870含有需要疫苗接种(对象)群所在地菌株中最流行的GNA1870的氨基酸序列。

本发明所用的GNA1870多肽也包括融合蛋白，所述融合蛋白包含在N-末端或C-末端连有融合伴侣的GNA1870多肽。感兴趣的融合伴侣包括，例如谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、His-标签等以及其它蛋白质，特别是脂蛋白的前导肽(例如，可用感兴趣的另一前导肽替代N-末端半胱氨酸前的氨基酸序列)。

可采用本领域熟知的技术鉴定其它GNA1870多肽编码核酸，其中可根据与已知GNA1870多肽的氨基酸序列相似性来鉴定GNA1870多肽。这些GNA1870多肽通常在核苷酸或氨基酸水平具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的序列相同性。可采用本领域熟知的核酸或氨基酸序列比对和比较方法来测定序列相同性。比较较长的序列可能需要更精密的方法来最佳比对两条序列。为对齐比较窗口，可通过以下算法进行序列的最佳比对：Smith和Waterman((1981)Adv.Appl.Math.2：482)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch((1970)J.MoL Biol.48：443)的同源性比对算法，Pearson和Lipman((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：2444)的相似性方法检索，这些算法的计算机化执行仪器(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.，Madison，WI)或通过目测，选择各种方法得到的最佳比对(即，导致比较窗口内序列相似性百分比最高)。

两条或更多条核酸或多肽序列的说明中所用的术语“相同”或“相同性”百分比指当采用以下序列比较算法之一或通过目测检测来比较和比对两条或更多条序列或子序列的最大一致性时，所述序列相同或有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同。当采用以下序列比较算法之一或通过目测检测来比较和比对最大一致性时，感兴趣的多肽包括至少有60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的核苷酸或氨基酸残基相同的多肽。具有序列相同性的区域最好为序列长度至少约10、20、30、40、50、60、70、80或100个连续残基的区域。在一最优选的实施方式中，通过参比多肽编码区全长序列的比较来测定序列相同性。

对于序列比较，通常将一条序列用作与测试序列比较的参比序列(例如，天然产生的GNA1870多肽序列)。当采用序列比较算法时，将测试和参比序列输入计算机，设定子序列坐标(如果需要)，和设定序列算法程序参数。然后序列比较算法根据设定的程序参数计算测试序列与参比序列的序列相同性百分比。

为比较，可采用例如以下算法进行序列的最佳比对：Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2：482，(1981))的局部同源性算法，Needleman和Wunsch(J.MoLBiol.48：443，(1970))的同源性比对算法，Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：2444，(1988))的相似性方法检索，这些算法的计算机化执行仪器(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通过目测(通常可参见Current Protocols in Molecular Biology(《分子生物学最新方法》)，F.M.Ausubel等编，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley&Sons，Inc.的合资公司，(1995增刊)(Ausubel))。

适用于测定序列相同性和序列相似性百分比的算法实例是分别描述于Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschuel等，(1977)NucleicAcids Res.25：3389-3402的BLAST和BLAST 2.0算法。公众可通过生物技术信息国家中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得进行BLAST分析的软件。该算法包括：首先通过在查询序列中鉴定长度为W的短字符来鉴定高评分序列配对(HSP)，将这些字串与数据库序列中相同长度的字符比对时符合或满足某些正阈值评分T。T称为近邻字符评分阈值(Altschul等，同上)。

这些原始近邻字符命中(word hit)作为启动检索的种子来找寻含有它们的较长HSP。然后使这些字符命中沿着各序列双向延伸，以使累积比对评分增加。对于核苷酸序列，用参数M(一对匹配残基的奖励评分；恒大于0)和N(错配残基的罚分；恒小于0)计算累积评分。对于氨基酸序列，用评分矩阵来计算累积评分。当出现以下情况时各方向的字符选中延伸停止：累积比对评分从其达到的最高值下降X；因累积了比对的一个或多个负评分残基导致累积评分降至0或0以下；或者到达二列之一的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序(用于核苷酸序列)默认字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4，并进行双链比较。对于氨基酸序列，BLAST程序默认字长(W)为3、期望值(E)为10并采用BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915，(1989))。

除计算序列相同性百分比外，BLAST算法也可对两条序列间的相似性进行统计学分析(参见，例如Karlin和Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA，90：5873-5787，(1993))。BLAST算法提供的相似性测量值之一是最小总概率(P(N))，其指示两条核苷酸或氨基酸序列间发生随机匹配的概率。例如，如果在测试核酸与参比核酸的比较中最小总概率小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则可认为该核酸与参比核酸相似。

如下所述，两条核酸序列或多肽具有序列相同性的另一表现是第一核酸编码的多肽与第二核酸编码的多肽能发生免疫学交叉反应。因此，例如当两条多肽仅因保守性取代而不同时，一条多肽通常与第二条多肽具有序列相同性。两条核酸序列具有序列相同性的另一表现是该两分子在在严谨条件下能彼此杂交。可按照本领域的标准方法(参见，例如Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，第二版，(1989)，冷泉港，纽约)选择一组具体的杂交条件。严谨性杂交条件的实例是在50℃或更高，用0.1×SSC(15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠)杂交。严谨杂交条件的另一实例是42℃在含50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt溶液，10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性的剪切鲑鱼精子DNA的溶液中培育过夜，然后在65℃用0.1×SSC洗涤滤膜。严谨性杂交条件是严谨性至少与以上代表性条件相同的杂交条件，其中如果所述条件是至少约80％，通常是至少约90％严谨，则可认为这些条件至少与上述的具体严谨性条件同样严谨。也可采用本领域已知的其它严谨性杂交条件来鉴定本发明该具体实施方式的核酸。

不同的残基位置最好是因保守性氨基酸取代而不同。保守性氨基酸取代指具有相似侧链的残基的互换。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含巯基侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代分组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。

将遗传物质引入奈瑟球菌宿主细胞的载体和方法

本领域已知不难采纳用于提供奈瑟球菌宿主细胞的遗传修饰来表达外源性GNA1870多肽的方法和组合物。示范性方法和载体见WO 02/09746和O′Dwyer等，Infect Immun 2004，72：6511-80。

将遗传物质转移入奈瑟球菌宿主的方法包括，例如缀合、转化、电穿孔、磷酸钙方法等。转移方法应能稳定表达引入的GNA1870编码核酸。GNA1870编码核酸可作为可遗传附加型元件(例如，质粒)提供，或可整合入基因组。

根据所进行的重组操作的类型，组合物中合适的载体可以不同。整合性载体可以是条件复制型或自杀性质粒、细菌噬菌体、转座子或通过限制性水解或PCR扩增获得的线形DNA片段。可通过可选择性遗传标记，例如赋予对抗生素(例如，卡那霉素、红霉素、氯霉素或庆大霉素)抗性的基因、赋予对重金属和/或毒性化合物抗性的基因或补充营养缺陷型突变的基因(例如，pur、leu、met、aro)来选择重组体。

在一个实施方式中，载体是以能在大肠杆菌和脑膜炎奈瑟球菌中自发复制的含可选择药物抗性标记的附加型质粒为基础的表达载体。这种“穿梭载体”的一个实例是质粒pFP10(Pagotto等，Gene 2000 244：13-19)。

制备脑膜炎奈瑟球菌囊泡

本发明所用的抗原性组合物通常包含由天然或因遗传修饰(例如，因表达重组GNA1870)而能表达可接受水平GNA1870的奈瑟球菌细胞制备的囊泡。本文所用的“囊泡”包括外膜囊泡以及微囊泡(也称为细胞泡(bleb))。

在一实施方式中，所述抗原性组合物包含由脑膜炎奈瑟球菌属培养菌株的外膜制备的外膜囊泡(OMV)。可通过以下步骤获得OMV：将脑膜炎奈瑟球菌培养在肉汤或固体培养基中，最好通过分离细菌细胞与培养基(例如，通过过滤或低速离心来沉淀细胞等)，裂解细胞(例如，通过加入洗涤剂、渗透休克、超声波处理、空腔化、匀浆等)，分离外膜组分与细胞质分子(例如，通过过滤；或通过差别性沉淀或使外膜和/或外膜囊泡凝聚；或通过利用能特异性识别外膜分子的配体的亲和分离方法；或通过高速离心来沉淀外膜和/或外膜囊泡等)，利用外膜组分制备OMV。

在另一实施方式中，所述抗原性组合物含有在所述脑膜炎奈瑟球菌属细菌的培养期间释放的微囊泡(MV)或细胞泡。可通过以下步骤获得MV：将脑膜炎奈瑟球菌培养在肉汤培养基中，分离完整的细胞与肉汤培养基(例如，通过过滤或低速离心从而只沉淀细胞但不沉淀较小的细胞泡等)、然后收集不含细胞培养基的MV(例如，通过过滤，差别性沉淀或使MV凝聚，或通过高速离心来沉淀细胞泡等)。通常可以根据培养基中产生的细胞泡含量来选择用于制备MV的菌株(例如，可培养数量合理的细菌来制备适合于本文所述方法中分离和给予的细胞泡)。能产生高水平细胞泡的示范性菌株描述于PCT公布号WO 01/34642。除了根据细胞泡产量，也可根据NspA产量选择用于MV制备的菌株，优选能产生较高水平NspA的菌株(具有不同NspA产量水平的脑膜炎奈瑟球菌的实例可参见，例如Moe等，1999，Infect.Immun.，67：5664)。

在另一实施方式中，所述抗原性组合物含有一种菌株，或2、3、4、5或更多种菌株的囊泡，对于GNA1870或PorA之一或二者，这些菌株彼此可以是同源的或异源的，通常是异源的。一个实施方式用表达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种GNA1870蛋白的菌株制备所述囊泡，这些蛋白可以是不同的变体(v.1、v.2、v.3)或亚变体(例如，v.1、v.2或v.3的亚变体)。在另一实施方式中，所述抗原性组合物包含相同或不同菌株的OMV和MV混合物。在这种实施方式中，可将不同菌株的囊泡作为混合物给予。此外，可将相同或不同菌株的OMV和MV作为混合物给予。除囊泡(OMV和/或MV)外，本发明抗原性组合物中可包含分离的抗原或抗原的特定组合。

降低脂质毒性

需要时(例如，用于产生囊泡的菌株伴有内毒素或特别高水平的内毒素)，可任选处理这种囊泡以减少内毒素，例如降低给药后的毒性。如下文所述，虽然不理想，但可用合适的洗涤剂(例如，BRIJ-96、脱氧胆酸钠、月桂酰肌氨酸钠(sodium lauoylsarcosinate)、Empigen BB、Triton X-100、吐温20(聚氧乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯(sorbitan monolaurate polyoxyethylene))、吐温80，浓度0.1-10％，优选0.5-2％和SDS)萃取来减少内毒素。利用洗涤剂萃取时，最好利用除脱氧胆酸盐以外的洗涤剂。在一些实施方式中，不利用洗涤剂制备囊泡，例如不用脱氧胆酸盐或其它洗涤剂。

在特别感兴趣的实施方式中，不用洗涤剂制备抗原性组合物的囊泡。虽然可用洗涤剂处理除去内毒素活性，但在囊泡制备期间萃取可能消除天然GNA1870脂蛋白。因此，采用无需洗涤剂的技术降低内毒素活性特别理想。一个方法是利用内毒素(脂多糖，LPS)产生较少的菌株，从而无需在用于人体前从最终制品中除去内毒素。例如，可以用脂寡糖或在疫苗中可能有害的其它抗原(例如，Rmp)减少或消除的奈瑟球菌突变株来制备囊泡。

例如，可用经遗传修饰而使脂质A的毒性活性降低或检测不到的脑膜炎奈瑟球菌菌株制备囊泡。例如，可遗传修饰这种菌株的脂质A生物合成(Steeghs等，Infect Immun 1999，67：4988-93；van der Ley等，Infect Immun 2001，69：5981-90；Steeghs等，J Endotoxin Res 2004，10：113-9)。突变负责最终修饰步骤的基因导致温度敏感(htrB)或容许的(msbB)表型。造成这些基因表达降低(或这些基因的产物减少或无活性)的突变可导致脂质A毒性改变。非月桂酰化(htrB突变体)或非肉豆蔻酰化(msbB突变体)的脂质A毒性低于野生型脂质A。脂质A4’-激酶编码基因(lpxK)的突变也能降低脂质A的毒性活性。

也可通过在参与多粘菌素B耐受(这种耐受与脂质A的4’磷酸基上加入氨基阿拉伯糖有关)的基因/基因座中引入突变来改变LPS的毒性活性。这些基因/基因座可以是编码UDP-葡萄糖脱氢酶的pmrE，或参与氨基阿拉伯糖合成和转移的许多肠细菌共有的抗菌肽耐受基因的某区域。存在于该区域的基因pmrF编码多萜醇-流速酯甘露糖基(dolicol-phosphate manosyl)转移酶(Gunn J.S.，Kheng，B.L.，Krueger J.，Kim K.，Guo L.，Hackett M.，Miller S.I.，1998.MoI.Microbiol.27：1171-1182)。

PhoP-PhoQ调节系统中的突变可导致在4’磷酸上加入氨基阿拉伯糖和2-羟基肉豆蔻替代肉豆蔻(肉豆蔻羟基化)，所述系统是磷酸中继两组分调节系统(例如，PhoP组成型表型，PhoP^o)或低Mg⁺⁺环境或培养条件(该条件k激活PhoP-PhoQ调节系统)。该修饰的脂质A显示刺激人内皮细胞表达E-选凝素和人单核细胞分泌TNF-α的能力降低。

多粘菌素B耐受菌株也适用于本发明，因为这些菌株显示LPS毒活性降低(参见，例如van der Ley等，1994，刊于Proceedings of the ninth internationalpathogenic Neisseria conference(第9届致病性奈瑟球菌大会论文集)，TheGuildhall，Winchester，英格兰)。或者，可将能模拟多粘菌素B结合活性的合成肽加入所述抗原性组合物以降低LPS毒性活性(参见，例如Rustici等，1993，Science 259：361-365；Porro等，Prog Clin Biol Res.，1998，397：315-25)。

也可通过选择培养条件来减少内毒素。例如，将菌株培养在每升含0.1mg-100mg氨基阿拉伯糖的生长培养基中来降低脂质毒性(参见，例如WO02/097646)。

制剂

用作疫苗的免疫原性组合物含有免疫有效量的抗原，特别是免疫有效量的GNA1870以及任何其它相容组分(如果需要)。“免疫有效量”表示将该用量以单一剂量或连续剂量的一部分给予个体时能有效引发治疗作用或预防作用。该用量根据待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类学组(例如，非人灵长类、灵长类、人等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗制剂、主治医师对医学状况的评估和其它相关因素而不同。预计该用量范围较宽，能通过常规试验测定。

剂量方案可以是单剂量方案或在不同时间给予单位剂型的抗原性组合物的多剂量方案(例如，包括加强剂量)。本文所用的术语“单位剂型”指适合人和动物对象的单位剂量的物理上不连续的单位，各单位含有足以产生所需效果的预定含量的本发明抗原性组合物，提供的组合物可与药学上可接受的赋形剂(例如，药学上可接受的稀释剂、载体或运载体)结合。该疫苗可与其它免疫调节剂联合给予。

用药学上可接受的稀释剂(例如水溶液，往往是盐水溶液)、半固体形式(例如，凝胶)或粉末形式配制来提供待给予的抗原性组合物。这种稀释剂可以是惰性的，虽然本发明组合物也可包含佐剂。可用于人体的已知合适佐剂的实例包括但不一定限于：明矾、磷酸铝、氢氧化铝、MF59(4.3％w/v角鲨烯、0.5％w/v吐温80、0.5％w/v司盘85)、含CpG的核酸(其中胞嘧啶未甲基化)、QS21、MPL、3DMPL、Aquilla提取物、ISCOMS、LT/CT突变体、聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、Quil A、白介素等。对于实验动物，可利用弗氏(佐剂)、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为正-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)和用2％角鲨烯/吐温80乳液配制的RIBI，其含有提取自细菌的三种组分：单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。可通过检测针对免疫原性抗原的抗体量来测定佐剂的效力。

能提高该组合物效力的其它示范性佐剂包括但不限于：(1)水包油乳剂(含或不含其它特异性免疫刺激剂，例如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁组分)，例如(a)含5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85(任选含有MTP-PE)的MF59^TM(WO90/14837；Vaccine design：the subunit and adjuvant approach(《疫苗设计：亚单位和佐剂方法》)第10章，Powell和Newman编，Plenum Press 1995)，利用微流化仪配制为亚微米颗粒，(b)含10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％普朗尼克嵌段聚合物L 121和thr-MDP的SAF，利用微流化仪配制为亚微米乳液或旋振产生粒径较大的乳液，和(c)含2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，例如单磷脂酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DETOX^TM)的RIBI^TM佐剂系统(RAS)，(RibiImmunochem，Hamilton，MT)；(2)皂苷佐剂，例如可利用QS21或STIMULON^TM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或由其产生的颗粒，如ISCOM(免疫刺激复合物)，所述ISCOM可不含其它洗涤剂，例如见WO00/07621；(3)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(4)细胞因子，例如白介素(如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO99/44636)等)、干扰素(如干扰素γ)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰脂质A(MPL)或3-O-脱酰基MPL(3dMPL)，例如见GB-2220221、EP-A-0689454，当与肺炎球菌糖联用时任选基本上不含明矾，例如WO00/56358；(6)3dMPL与，例如QS21和/或水包油乳液的混合物，如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231；(7)含有CpG基序的寡核苷酸[Krieg；Vaccine 2000，19，618-622；Krieg；Curr opin Mol Ther 20013：15-24；Roman等，Nat.Med，1997，3，849-854；Weiner等，PNAS USA，1997，94，10833-10837；Davis等，J.Immunol，1998，160，870-876；Chu等，J.Exp.Med，1997，186，1623-1631；Lipford等，Ear.J.Immunol，1997，27，2340-2344；Moldoveami等，Vaccine，1988，16，1216-1224；Krieg等，Nature，1995，374，546-549；Klinman等，PNAS USA，1996，93，2879-2883；Ballas等，J.Immunol，1996，157，1840-1845；Cowdery等，J.Immunol，1996，156，4570-4575；Halpern等，Cell Immunol，1996，167，72-78；Yamamoto等，Jpn.J.Cancer Res.，1988，79，866-873；Stacey等，J.Immunol，1996，157，2116-2122；Messina等，J.Immunol，1991，147，1759-1764；Yi等，J.Immunol，1996，157，4918-4925；Yi等，J.Immunol，1996，157，5394-5402；Yi等，J.Immunol，1998，160，4755-4761；和Yi等，J.Immunol，1998，160，5898-5906；国际专利申请WO96/02555、W098/16247、WO98/18810、WO98/40100、WO98/55495、WO98/37919和WO98/52581]，即含有至少一个CG二核苷酸，其中胞嘧啶未甲基化；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯，例如见WO99/52549；(9)聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂与辛苯聚醇的混合物(WO01/21207)或聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种其它非离子表面活性剂，例如辛苯聚醇的混合物(WO01/21152)；(10)皂苷和免疫刺激性寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)(WO00/62800)；(11)免疫刺激剂和金属盐颗粒，例如见WO00/23105；(12)皂苷和水包油乳剂，例如见WO99/11241；(13)皂苷(例如，QS21)+3dMPL+IM2(任选+类固醇)，例如见WO98/57659；(14)用作免疫刺激剂来提高所述组合物效力的其它物质。胞壁酰肽包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(正-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MIP-PE)等。

抗原性组合物可与常规药学上可接受的赋形剂，例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等混合。如果需要，该组合物可含有药学上可接受的辅助物质来模拟生理条件，例如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中抗原的浓度变化很大，基本上按照所选择的具体给药方式和患者的需要根据液体体积、粘度、体重等来选择。得到的组合物可以是溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、凝胶、乳膏、洗剂、软膏、气溶胶等形式。

该药物制剂中本发明抗原性组合物的蛋白质浓度变化很大，即以体重计，从小于约0.1％，通常是或至少是约2％到多达20％-50％或更高，基本上按照所选择的具体给药方式，根据液体体积、粘度等来选择。

免疫接种

总体上，本发明提供将一种或多种本发明抗原性组合物给予哺乳动物对象(例如，人)，从而引发抗奈瑟球菌种细菌多种菌株的保护性免疫应答，进而引发抵御这种细菌所致疾病的保护作用的方法。具体地说，本发明方法能提供抵御1、2、3、4或更多种脑膜炎奈瑟球菌种菌株的免疫保护性免疫应答，所述菌株在血清群、血清型、血清亚型或GNA1870多肽的至少一种中有差异(例如，不同的GNA1870变体和/或亚变体)。特别感兴趣的是诱导抵御血清群B脑膜炎奈瑟球菌多种菌株的保护性免疫应答，特别是所述菌株在血清亚型上有差异(例如，含有异源PorA)。就PorA和/或GNA1870而言，诱导抵御彼此异源的菌株的保护性免疫应答也是特别感兴趣的。

本发明抗原性组合物可含或不含添加的赋形剂，通过口服、鼻部、鼻咽部、胃肠外、肠道、胃部、局部、透皮、皮下、肌肉内，以片剂、固体、粉末、液体、气溶胶形式局部或全身性给予。本领域技术人员已知或明白的制备可胃肠外给药的组合物的实际方法更详细地描述于例如Remington′s PharmaceuticalScience(《雷明顿药物科学》)，第15版，Mack Publishing Company，Easton，宾夕法尼亚，(1980)的出版物。

口服给药可能需要保护组合物以避免(被)消化是公认的。一般通过将组合物与可使其耐受酸和酶水解的物质结合或将其包装在适当的耐受载体中来实现。本领域熟知避免消化的保护方法。

将该组合物给予处于患奈瑟球菌疾病风险的哺乳动物来预防或至少使该疾病的发生及其并发症部分停止。足以实现此目的的用量定义为“治疗有效量”。治疗有效量取决于，例如抗原性组合物、给药的方式、患者的体重和总体健康状况和处方医师的判断。给予单一剂量还是多剂量该抗原组合物取决于患者所需和可能耐受的剂量和频率以及给药途径。

本文所述抗原性组合物可含有囊泡(例如，OMV和MV)的混合物，所述囊泡可以来自相同或不同菌株。在另一实施方式中，所述抗原性组合物可包含来自2、3、4、5或更多种菌株的囊泡混合物，所述囊泡可以是OMV、MV或二者。

给予有效量的抗原性组合物以在宿主中引发免疫应答，特别是体液免疫应答。所述混合物的免疫接种用量通常为约0.001mg-约1.0mg/70公斤患者，更常见约0.001mg-约0.2mg/70公斤患者。可用的剂量是0.001至约10mg/患者/天，特别是当抗原给予至封闭部位并不进入血流时，例如不进入体腔或不进入器官内腔。口服、鼻部或局部给药基本上可采用较高剂量(例如，10-100mg或更高)。初次给予混合物后可用相同或不同的混合物进行加强免疫，优选至少加强一次，更常见加强两次。

在一个实施方式中，用含有变体免疫优势抗原(用已受奈瑟球菌感染的不同宿主动物的抗血清常规检测到的主要抗原；代表性例子包括通道蛋白A、通道蛋白B、菌毛蛋白、NspA、磷脂、多糖、脂多糖、菌毛蛋白、OmpA、Opa、Opc等)和/或变体GNA1870蛋白的奈瑟球菌菌株制备用于初免和加强免疫的抗原性组合物。这些菌株的荚膜分子也不同，如它们的血清群所反映的那样。

目前可通过检测已知能特异性识别通道蛋白分子的一组已知单克隆(抗体)中的哪一种能与未知菌株结合来检测区分血清型和血清亚型(Sacchi等，1998，Clin.Diag.Lab.Immunol.5：348)。也可能将来会鉴定到其它这样的单克隆。本发明特别考虑了采用任何新单克隆(抗体)测定到任何新的血清型和血清亚型(菌株)的应用。此外，不仅可通过与单克隆抗体相互作用，还可通过缺乏和/或存在所定义的肽残基和肽表位从结构上定义血清型和血清亚型(Sacchi等，2000，J.Infect.Dis.182：1169)。本发明特别包括根据通道蛋白(已知的或以后发现的)的结构特征区分血清型和血清亚型。

在另一实施方式中，所给予的抗原性组合物由2、3、4、5或更多种菌株制备，就GNA1870或PorA之一或二者而言，所述菌株彼此可以是同源或异源，通常是异源的。在一个实施方式中，由表达不同GNA1870蛋白的菌株制备囊泡，所述GNA1870蛋白可以是不同变体(v.1、v.2、v.3)或亚变体(例如，v.1、v.2或v.3的亚变体)产生的。在另一实施方式中，就PorA而言，由彼此异源的菌株制备囊泡。

在特别感兴趣的实施方式中，由在遗传学上彼此不同的奈瑟球菌菌株(例如，所述菌株属于不同血清型和/或血清亚型；表达不同的PorA蛋白；表达不同的GNA1870变体或亚变体；和/或也任选属于不同的荚膜血清群)制备囊泡。可利用这种囊泡将抗原性组合物制备为至少2、3、4或更多种遗传学多样性菌株的囊泡混合物。例如，用于制备和给予抗原性组合物的第二种奈瑟球菌菌株的GNA1870蛋白质和/或PorA不同于用于产生该囊泡的第一种菌株。

可任选由与第二种菌株遗传学不同的奈瑟球菌菌株(例如，所述菌株属于不同血清型和/或血清亚型；表达不同的GNA1870变体或亚变体；表达不同的PorA蛋白；和/或属于不同的荚膜血清群)制备第二、第三和其它给予的抗原性组合物。例如，用于制备第三抗原性组合物的第三种菌株可以与用于制备第一和第二抗原性组合物的第一和第二种菌株在遗传学上不同，但是在一些实施方式中，不必与第一菌株在遗传学上不同。

本发明也考虑了可从奈瑟球菌，特别是脑膜炎奈瑟球菌的一种或多种菌株获得的抗原性组合物，所述菌株通过已知方法(参见，例如美国专利号6,013,267)经遗传工程改造能表达编码GNA1870的一种或多种核酸。宿主细胞可表达内源性GNA1870多肽，或可(经)修饰或选择，从而不表达任何可检测的内源性GNA1870多肽。通过重组技术在宿主细胞中表达的GNA1870多肽(即，外源性GNA1870多肽)可以是与内源性GNA1870多肽相同或不同变体类型。

可进一步修饰宿主细胞使其表达感兴趣的其它抗原，例如通道蛋白A、通道蛋白B、NspA、菌毛蛋白或其它奈瑟球菌蛋白。此外，本发明抗原性组合物可含有其它奈瑟球菌抗原，例如PCT公布号WO 99/24578、WO 99/36544、WO99/57280、WO 00/22430和WO 00/66791所例举的以及这种蛋白的抗原性片段。

所述抗原性组合物通常给予未接触过奈瑟球菌，特别是脑膜炎奈瑟球菌的免疫学原初哺乳动物。在一具体实施方式中，所述哺乳动物是约5岁或更小的人类儿童，优选约两岁或更小，所述抗原组合物在一个或多个以下时间给予：出生后两周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个月，或1年或15、18或21个月，或在2岁、3岁、4岁或5岁时。

一般最好在疾病症状的首次体征出现前，或在可能或实际接触奈瑟球菌首次出现体征时给予任何哺乳动物。

被动免疫力

本发明也考虑了免疫接种本发明抗原性组合物产生的免疫保护性抗体及其应用方法。可将这种抗体给予个体(例如，人患者)来提供抵御奈瑟球菌疾病的被动免疫力，预防感染或疾病发生，或作为改善已患疾病患者的临床结局(例如，降低并发症，例如休克的发生率，降低死亡率或降低发病率，例如耳聋)的治疗剂。

给予除产生抗体的物种以外物种的对象的抗体往往具有免疫原性。因此，例如将鼠源或猪源抗体给予人往往会诱导针对该抗体的免疫应答。可通过将该抗体的一部分或全部改变为人类特征性序列而分别产生嵌合型或人抗体可降低该抗体的免疫原性。

嵌合型抗体是含有人和非人部分的免疫球蛋白分子。更具体地说，人源化嵌合抗体的抗原结合区(或可变区)得自非人来源(例如，鼠)，嵌合型抗体的恒定区(赋予免疫球蛋白生物学效应物功能)得自人源。嵌合型抗体应具有非人抗体分子的抗原结合特异性和人抗体分子赋予的效应物功能。本领域技术人员熟知可产生嵌合型抗体的许多方法(参见，例如美国专利号5,502,167；5,500,362；5,491,088；5,482,856；5,472,693；5,354,847；5,292,867；5,231,026；5,204,244；5,202,238；5,169,939；5,081,235；5,075,431和4,975,369)。另一方法是通过重组DNA技术连接非人抗体的CDR区与人(抗体)恒定区来产生人源化抗体。参见Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)和WO 90/07861。

在一个实施方式中，用重组DNA载体转染细胞系来产生抗本发明肽的抗体。新的重组DNA载体含有替代该细胞系中编码免疫球蛋白恒定区的全部或一部分基因(例如，替代基因可编码人免疫球蛋白的全部或一部分恒定区，或编码特定的免疫球蛋白类型)的“替代基因”，以及可与抗体产生细胞的免疫球蛋白序列靶向同源重组的“靶序列”。

在另一实施方式中，用重组DNA载体转染细胞系来产生具有所需效应物功能的抗体(例如，人免疫球蛋白的恒定区)，在此情况中，该重组载体中所含的替代基因可编码抗体某区域的全部或一部分，该重组载体中所含的靶序列能在抗体产生细胞内进行同源重组和靶向基因修饰。在任一实施方式中，当只替代可变区或恒定区的一部分时，得到的嵌合型抗体可针对相同的抗原和/或具有相同的效应物功能，但所述功能得到改变或改善，从而使得该嵌合型抗体显示的抗原特异性更高、亲和结合常数更大、效应物功能提高或转染的抗体产生细胞系的(抗体)分泌和产量增加等。

在另一实施方式中，本发明提供完全的人抗体。人抗体完全由特征性人多肽序列构成。可通过各种方法(参见，例如Larrick等，美国专利号5,001,065)产生本发明的人抗体。在一个实施方式中，首先在三重杂交瘤(trioma)细胞(从三种细胞，两种人和一种小鼠细胞传下)中产生本发明的人抗体。然后克隆编码这些抗体的基因和在其它细胞，特别是非人哺乳动物细胞中表达。通过三重杂交瘤技术产生人抗体的通用方法描述于Ostberg，(1983)，Hybridoma 2：361-367；Ostberg，美国专利号4,634,664和Engelman等，美国专利号4,634,666。已发现三重杂交瘤产生的抗体比从人细胞制备的常规杂交瘤(产生的抗体)更稳定。

本领域熟知制备和配制适合给予对象(例如，人对象)的抗体的方法。例如，可以在含有有效量的抗体和药物赋形剂(例如，盐水)的药物组合物中提供抗体。所述药物组合物可任选包含其它添加剂(例如，缓冲剂、稳定剂、防腐剂等)。抗体的有效量通常是能在所需时间内(例如至少约2天-10天或1个月-2个月)有效提供抵御奈瑟球菌疾病或症状的保护作用的用量。

诊断试验

本发明的抗原性组合物或给予这种组合物所产生的抗体也可应用于诊断目的。例如，可利用所述抗原组合物筛选免疫前和免疫血清来确保疫苗接种有效。也可将这些抗体应用于免疫测定来检测奈瑟球菌疾病有关的特定抗原分子是否存在。

实施例

应该知道本文所述的实施例和实施方式只是为说明目的，本领域技术人员鉴于这些实施例和实施方式可提出各种改进或变化，这些改进和变化应包括在本申请的构思和权限以及附加的权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的全文纳入本文作为参考。

材料与方法

以下方法和材料用于下文实施例中。

细菌菌株.表1列出了本项研究所用的9种脑膜炎奈瑟球菌菌株(6种是荚膜血清群B、一种是荚膜血清群A、两种是荚膜血清群C)。这些菌株是在25年期间从古巴、荷兰、德国、新西兰或美国的住院患者中收集的。根据电泳簇分析和/或测序分型，这些菌株具有遗传学多样性。

表1.脑膜炎奈瑟球菌菌株小结
表1.脑膜炎奈瑟球菌菌株小结							菌株	来源国家	血清学分类	PorA VR序列类型^a	电泳类型(ET)簇(序列类型，ST)^b	GNA1870变体组(氨基酸相同性％)^c	血清抗-rGNA1870杀菌滴度^d
Z1092	德国	A：4，21：P1.10	1.5-2，10	ST-1复合物/亚群I/II	1(96)	1∶10	菌株	来源国家	血清学分类	PorA VR序列类型^a	电泳类型(ET)簇(序列类型，ST)^b	GNA1870变体组(氨基酸相同性％)^c	血清抗-rGNA1870杀菌滴度^d
Z1092	德国	A：4，21：P1.10	1.5-2，10	ST-1复合物/亚群I/II	1(96)	1∶10	BZ198	荷兰	B：NST：P1.4	7-2，4	ET154	1(92)	＜1∶10

CU385	古巴	B：4，7：P1.19，15	19，15	ET5复合物(33)	1(100)	1∶2500
CU385	古巴	B：4，7：P1.19，15	19，15	ET5复合物(33)	1(100)	1∶2500	M1390	美国	B15：P1.7，4	ND	谱系3(41)	1(92)	＜1∶10
M6190	美国	B2a：P1.5，2	ND	ET37复合物(1988)	1(94)	＜1∶10	M1390	美国	B15：P1.7，4	ND	谱系3(41)	1(92)	＜1∶10
M6190	美国	B2a：P1.5，2	ND	ET37复合物(1988)	1(94)	＜1∶10	NZ98/254	新西兰	B：4：P1.4	1.7-2，4	谱系3(42)	1(92)	＜1∶10
RM1090	美国	C：2a：P1.5，2	5-1，2	ND	2(70)	ND	NZ98/254	新西兰	B：4：P1.4	1.7-2，4	谱系3(42)	1(92)	＜1∶10
RM1090	美国	C：2a：P1.5，2	5-1，2	ND	2(70)	ND	4243	美国	C：2a：P1.5，2	ND	ET37复合物(11)	1(95)	＜1∶10
H44/76	挪威	B：15：P1.7，16	1.7，16	ET5复合物(32)	1(100)	1∶900	4243	美国	C：2a：P1.5，2	ND	ET37复合物(11)	1(95)	＜1∶10
H44/76	挪威	B：15：P1.7，16	1.7，16	ET5复合物(32)	1(100)	1∶900	H44/76	挪威	NT；P1.7，16	1.7，16	ET5复合物(32)	1(100)	ND
^a根据Russell等，Emerg Infect Dis 2004，10：674-8提出的PorA VR类型命名的术语b如(www.mlst.net)所述以多基因座测序进行ST分型；NT＝不可分型；血清学未检测到荚膜c与菌株MC58的序列相比，氨基酸的相同性百分比d如Welsch等，J Immunol 2004，172：5606-15，Hou等，J.Infect Dis.(2005年8月15日)192(4)：580-90(电子版2005年7月15日)所报道的用人补体检测的滴度；也参见图3A和3B。ND，未测定。菌株用作过量表达GNA1870和制备疫苗的宿主							H44/76	挪威	NT；P1.7，16	1.7，16	ET5复合物(32)	1(100)	ND

利用C群菌株RM1090(C：2a5-1，2)和下文所述得自该菌株的突变体，B群菌株H44/76和下文所述得自该菌株的突变体制备外膜囊泡(OMV)疫苗。菌株RM1090天然表达低水平的GNA1870变体2蛋白。利用GNA1870基因已灭活的RM1090菌株(下文所述的RM1090ΔGNA1870)过量表达GNA1870变体1。菌株H44/76表达较高水平的GNA1870变体1。其余7种菌株天然表达GNA1870变体1蛋白的亚变体，选择这些菌株作为测试微生物来测定疫苗诱导的抗-GNA1870变体1保护性免疫力的广度。如电泳类型和/或多基因座测序类型所测定的，这些菌株在遗传学上具有多样性，它们也表达几种不同类型的PorA VR序列。选择变体1菌株是因为它们约占致病B群分离物的60％(Masignani等，J Exp Med 2003，197：789-99)。

菌株Cu385和菌株H44/76表达GNA1870变体1，其氨基酸序列与菌株MC58相同(Welsch等，J Immunol 2004，172：5606-15)，用该基因在大肠杆菌中表达重组GNA1870变体1蛋白，也用于穿梭载体在脑膜炎奈瑟球菌疫苗菌株RM1090中过量表达GNA1870(见下文)。其余7种菌株表达GNA1870变体1的亚变体，其序列与菌株MC58基因编码的GNA1870蛋白相比略有变异(Masignani等，2003，同上)。在以前的研究中，菌株Cu385在用重组GNA1870蛋白疫苗免疫的小鼠中对所引发抗体的补体介导杀菌活性高度敏感(表1)。相反，选择脑膜炎奈瑟球菌BZ198、M1390、M6190和NZ98/294是因为它们可耐受重组GNA1870疫苗制备的抗血清杀菌活性(杀菌滴度＜1∶10)。

pFP12-GNA1870穿梭载体的构建物.利用穿梭载体FP12实现了在脑膜炎奈瑟球菌中过量表达GNA1870，所述载体含有在淋病奈瑟球菌中天然产生质粒的复制起点，显示能稳定转化大肠杆菌和脑膜炎奈瑟球菌(Pagotto等，Gene2000，244：13-9)。利用以下引物通过PCR从基因组DNA扩增包含脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58的推定FUR盒启动子的变体1GNA1870基因：GNA1870FURSphIF 5′，5″-ATCGGCATGCGCCGTTCGGACGACATTTG-3″和GNA1870FURStUIR 3′5″-AAGAAGGCCTTTATTGCTTGGCGGCAAGGC-3″。然后用Sphl和Stul限制性内切核酸酶消化PCR产物，连接入用Sphl和Stul消化除去了GFP基因的pFP12质粒中。用得到的质粒pFP12-GNA1870转化大肠杆菌菌株TOP10感受态细胞(Invitrogen)并增殖，该细胞于37℃氯霉素选择(压力)(50μg/ml)下培养在Luria-Bertani培养基中。

转化脑膜炎奈瑟球菌.利用红霉素选择(5μg/ml)，用质粒pBSUDGNA1870ERM转化，通过同源重组制备其中GNA1870基因已灭活的RM1090菌株(RM1090ΔGNA1870)。为制备能过量表达GNA1870的突变株，从培养过夜的巧克力琼脂平板上选择RM1090ΔGNA1870敲除菌株的3-4个菌落。将细菌菌落在20μl EB缓冲液(Qiagen)中与3μg质粒pFP12-GNA1870混合，接种到巧克力琼脂平板上，在37℃培养5小时。在含有氯霉素(5μg/ml)的巧克力琼脂平板上再培养该细菌的连续稀释液。培养平板在37℃培育过夜，利用小鼠多克隆抗-rGNA1870抗体通过菌落印迹试验筛选菌落的GNA1870表达情况。选出各阳性克隆，在含有氯霉素的巧克力琼脂平板上再培养。在2％脱脂奶(重量/体积)中冷冻脑膜炎球菌细菌细胞，-80℃保存。

采用类似方法转化菌株H44/76及其过量表达GNA1870的突变株。用pBSUDgna1870erm转化灭活菌株H44/76中的染色体gna1870(Hou等，InfectImmun 2003，71：6844-49)。然后用编码菌株MC58的GNA1870变体1的质粒pFP12-GNA1870转化该突变株(H44/76Δgna1870)。在含有氯霉素(5μg/ml)的巧克力琼脂平板上选择转化株。

膜制品.在巧克力琼脂平板(Remel，Laztakas，Kans.)上从冷冻储备物中传代培养脑膜炎奈瑟球菌。37℃，5％CO₂培养过夜后，选出几个菌落，在含5％CO₂的气氛中，用含0.25％葡萄糖和0.02mM CMP-NANA的约6ml Mueller-Hinton肉汤培育至620nm光密度(OD₆₂₀)为0.1。在5μg/ml氯霉素存在下培养含有引入的pFP12-GNA1870穿梭载体的所有菌株。37℃和5％CO₂振荡培养接种的肉汤直至OD₆₂₀达到0.6-0.7(2-3小时)。利用6份6-ml初始培养液接种1LMueller-Hinton肉汤。较多的培养液在37℃剧烈振荡培养至OD₆₂₀为0.8-1.0。加入苯酚(0.5％重量/体积)，肉汤在4℃静置过夜以杀死细菌。4℃离心(10,000×g)30分钟沉淀细菌细胞，冷冻并保存于-20℃直至用于制备外膜囊泡疫苗。

对于含菌株H44/76及其突变株的培养液，利用6份7ml初始培养液。将细胞转移至未添加氯霉素的1 L Mueller-Hinton肉汤中，剧烈振荡培养至OD₆₂₀达到0.8-1.0。加入苯酚(0.5％重量/体积)，培养液在37℃静置2小时，4℃培育过夜以杀死细菌。4℃离心(11,000×g)30分钟沉淀细胞。

如上所述制备用于OMV的脑膜炎奈瑟球菌膜组分，不用洗涤剂以免萃取出GNA1870脂蛋白(Moe等，2002，同上)。简言之，将冷冻的细菌细胞悬浮在40ml PBS中，在冰上用装配了微针头(microtip)的超声波仪(Branson，Danbury，Conn)进行4次15秒超声处理，该处理足以释放膜细胞泡，但不导致细菌完全裂解。各次超声处理之间用冰冷却细菌悬浮液。5,000×g离心15分钟除去细胞碎片，4℃以100,000×g超离心1小时获得保持在上清液中的膜组分，将其重悬在5ml PBS中。这些制品称为OMV。或者，如上所述(Moe等，2002，同上)可用细菌释放入上清液中的细胞泡获得的MV；也可参见WO 02/09643。

对于H44/76(及其突变株)，将冷冻的细菌细胞重悬在20ml PBS缓冲液中，进行4次15秒超声处理。4℃(16,000×g)离心30分钟除去细胞碎片，离心(100,000×g)2小时收集可溶性组分中富含外膜蛋白的细胞膜。

疫苗的特征鉴定.采用DC蛋白质试验(Bio-Rad，Richmond，加利福尼亚.)和BCA蛋白质试验试剂盒(Pierce，Rockford，IL)测定蛋白质浓度。如Laemmli(Nature 1970，227：680-5)所述，利用Mini-Protean II电泳装置(Bio-Rad)和Western印迹通过15％SDS-PAGE(H44/76制品用12.5％SDS-PAGE)分析OMV制品。将样品悬浮于样品缓冲液中(0.06 M Tris·HCl，pH 6.8，10％(v/v)甘油，2％(w/v)SDS，5％(v/v)2-巯基乙醇，10μg/ml溴酚蓝)，加热至100℃，5分钟，然后直接加样到凝胶上。

对于Western印迹，凝胶用缓冲液(48mM Tris·HCl，39mM甘氨酸[pH 9.0]20％(v/v)甲醇)平衡，利用Trans-Blot^TM(Bio-Rad)半干式电泳转移小室将凝胶转移至硝酸纤维素膜(Bio-Rad)。用PBS配制的2％(w/v)脱脂奶封闭硝酸纤维素膜，使其与用含1％(w/v)BSA和1％(w/v)吐温-20的PBS配制的抗rGNA1870-抗血清的1∶20,000稀释液反应。利用家兔抗小鼠IgG+A+M-偶联了辣根过氧化物酶的多克隆抗体(Zymed，South San Francisco，加利福尼亚)和“WesternLightning”化学发光试剂(PerkinElmer Life Sciences，Inc.，波士顿，马里兰)检测结合的抗体。检测用抗-GNA1870抗血清得自依次注射一剂量重组GNA1870v.1(脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58的基因)，然后一剂量重组v.3蛋白(菌株M1239的基因)，再一剂量重组v.2蛋白(菌株2996的基因)各10μg的免疫小鼠，各次注射间隔3-4周。

免疫接种.如上所述利用编码6个COOH-末端组氨酸(His标签)以及不含编码推定的前导肽的N-末端序列的GNA1870 DNA序列在大肠杆菌中表达该重组蛋白质疫苗(Welsch等，J Immunol 2004，172：5606-15)。利用该非脂质化的His标签GNA1870蛋白是因为它比重组脂蛋白更易于制备，早先研究的数据表明与弗氏完全和不完全佐剂一起给予的非脂质化抗原能在小鼠中引发针对大多数测试菌株的强烈杀菌抗体应答。

用PBS稀释OMV制品或重组GNA1870蛋白，用与培育用PBS缓冲液等体积的磷酸铝佐剂(1％Alhydrogel终浓度[重量/体积；Superfos Biosector，Frederikssund，Denmark])吸附。腹膜内(IP)免疫接种各组4-6周龄的雌性CD1小鼠(Charles River Breeding Laboratories，Raleigh，NC)(N＝10/组)。各小鼠接受含有5μg总蛋白的剂量(对于混合组，OMV和rGNA1870各2.5μg)。共注射三次，每次间隔3周。给予第三次剂量两周后，通过心脏穿刺采血处死小鼠。分离血清，-20℃冻存。

对于H44/76制品，各小鼠接受的剂量为OMV中含有1.25μg总蛋白和170μg磷酸铝。三次注射间隔3周。给予第三次剂量三周后，通过心脏穿刺采血。离心分离血清，-70℃冻存待用。

吸附抗-GNA1870抗体.为测试抗-GNA1870抗体对抗体功能活性的贡献，我们吸附合并血清以除去抗-GNA1870抗体。简言之，将用含10mM咪唑的PBS缓冲液作1∶2稀释的100μl合并血清加入装有250μl Ni-NTA琼脂糖(Qiagen，Valencia，加利福尼亚)的柱中，所述琼脂糖与200μg重组GNA1870-His标签蛋白或作为阴性对照的重组NadA-His标签蛋白络合(Comanducci等，J Exp Med2002，195：1445-54；Hou等，2005，同上)。4℃培育该柱过夜，用含10mM咪唑的500μl PBS缓冲液洗涤。合并流出柱的5组份(每份100μl)，通过膜过滤(Microcon YM-10，10,000 MWCO，Millipore Corp.，Bedford，MA)浓缩至原先的50μl血清体积。根据ELISA结果，GNA1870柱除去了98-99％以上的抗-GNA1870抗体。

抗-GNA1870抗体.如前所述(Welsch等，J Immunol 2004，172：5606-1)采用ELISA检测针对GNA1870的血清抗体滴度。固相抗原由rGNA1870 v.1或v.2蛋白构成。第二抗体是偶联碱性磷酸酶的家兔抗-小鼠IgM+G+A(Zymed)的1∶2000稀释液。血清滴度定义为与底物培育30分钟后OD₄₀₅为0.5时的稀释度。

补体介导的杀菌抗体活性.如前所述(Moe等，2002，同上)利用在补加了0.25％葡萄糖的Mueller Hinton肉汤中培养至对数生长中期的细菌进行杀菌试验。最终的反应混合物含有不同稀释度的测试血清、20％(v/v)人补体和含1％BSA的Gey缓冲液。补体来源是检测不到固有杀菌活性的健康成年人血清(Granoff等，J Immunol 1998，160：5028-36；Welsch等，2003，同上)。血清杀菌滴度定义为细菌在反应混合物中培育60分钟后，与0时的对照CFU/ml相比，造成CFU/ml降低50％时的血清稀释度。用阴性对照抗体和补体培育的细菌通常显示培育60分钟期间CFU/ml增加150-200％。

抗体与有被囊的活脑膜炎奈瑟球菌表面结合.如前所述(Granoff等，JImmunol 2001，167：3487-3496)，通过流式细胞术间接荧光试验测定抗-GNA1870抗体与活的脑膜炎奈瑟球菌表面结合的能力。阳性对照包括对C群荚膜多糖(1076.1(Garcia-Ojeda等，Infect Immun 2000，68：239-46))、PorA P 1.2(Granoff等，J Immunol 2001，167：3487-3496)、GNA1870变体1(JAR3)(Welsch等，JImmunol 2004，172：5606-15)特异性小鼠单克隆抗体和FITC偶联的山羊抗-小鼠(Fab′)2 IgG(H+L)的1∶300稀释液(Jackson Immuno Research Laboratories，WestGrove，PA)。

激活人补体沉积在有被囊的活脑膜炎球菌表面.如前所述(Welsch等，JInfect Dis 2003，188：1730-40)，通过流式细胞术测定C3b或iC3b抗-GNA1870抗体依赖性沉积到活脑膜炎奈瑟球菌细菌表面。在含5％(v/v)人补体和用veranol缓冲液配制的合适血清稀释液的反应混合物中培育经洗涤的对数生长期细菌。利用能与C3b和iC3b反应的FITC-偶联绵羊抗-人补体C3c(BioDesignIntl.，Saco，ME)检测补体沉积。补体来源于上述杀菌试验的同一人血清。

乳大鼠中的被动保护作用.在用B群菌株NZ98/254腹膜内攻击的乳大鼠中测试抗血清赋予抵御脑膜炎奈瑟球菌B群菌血症的被动保护作用的能力(Welsch等，2003，同上；Moe等，Infect Immun 1999，67：5664-75；Moe等，Infect Immun 2001，69：3762-71)。简言之，将远交Wistar大鼠的同窝后代4天乳大鼠随机分配给哺乳母鼠。在0时，将用含1％BSA的PBS稀释的抗血清或抗体腹膜内给予各组的8只大鼠。两小时后，用在补加0.25％葡萄糖和10mMCMP-NANA的Mueller-Hinton肉汤(Sigma，St.Louis，MO)中培养的约6×10⁴CFU个经洗涤的对数生长期细菌腹膜内攻击大鼠。细菌攻击后4-6小时，通过心脏穿刺获得血液样品，将1、10和100μl等份血液接种到巧克力琼脂平板上以确定CFU/ml。

实施例1：脑膜炎奈瑟球菌菌株RM1090上GNA1870的表面可接近性

为测定用pFP12-GNA1870转化RM1090菌株所表达的GNA1870蛋白是否是外膜的整合部分并暴露在细胞表面上，为测定菌株H44/76中过量表达的GNA1870是否锚定在外膜且表面可接近，通过流式细胞术检测抗-GNA1870和对照抗体与有被囊活细菌细胞的结合情况(图1)。

如图1A所示，C群荚膜多糖(列2)或PorA(抗-P1.2，列3)特异性的阳性对照mAb显示能与亲代RM1090菌株(行B)和以下两个RM1090突变型菌株强烈结合：用不含GNA1870基因的穿梭载体转化的GNA1870敲除(菌株)(行A)和用编码GNA1870变体1蛋白质的穿梭载体转化的敲除(菌株)(行C)。所有3种菌株均不与单用磷酸铝免疫小鼠的阴性对照合并血清1∶10稀释液显著结合(列1)。抗-GNA1870单克隆或多克隆抗体与GNA1870敲除菌株也不显著结合(分别是行A、列5和6)。天然表达低水平GNA1870 v.2蛋白的野生型RM1090菌株与v.1蛋白的特异性抗-GNA1870mAb没检测到结合(行B，列4)，其显示结合略超过制备的抗重组v.1、2和3 GNA1870蛋白(见下文)多克隆小鼠抗血清的背景结合(列5和6)。相反，用编码GNA1870(变体1)的穿梭载体转化的菌株显示能与多克隆和单克隆抗-GNA1870抗体强烈结合。因此，GNA1870暴露于用pFP12-GNA1870穿梭载体转化的RM1090菌株表面上。

如图1B所示，阳性对照抗荚膜和抗-PorA(P1.16)单克隆抗体能与H44/76野生型菌株和过量表达GNA1870菌株H44/76的突变株结合(均显示于行1)。阳性对照抗体也能与H44/76ΔGNA1870结合(示于行2)。与估计的一样，抗-GNA1870单克隆或多克隆抗体与编码GNA1870的基因已灭活的突变型菌株H44/76不结合(列D-F)。野生型菌株与抗-GNA1870抗体培育显示结合良好，该结果反映菌株H4476中天然GNA1870表达水平较高。免疫荧光向右稍许偏移证明与经工程改造而过量表达GNA1870的突变型菌株的结合有适度增加。因此，GNA1870过量表达导致外膜中该蛋白含量稍许增加，而所述蛋白暴露于表面。

实施例2.OMV疫苗的分析

通过SDS-PAGE分离菌株RM1090及各突变株OMV制品中的主要蛋白质，用考马斯蓝染色目测观察(图2A，A图)。与用脑膜炎奈瑟球菌制备的典型OMV一样，在表观质量介于29kDa(Opa/Opc)和43kDa(PorA)之间可分辨的主要蛋白数量有限。野生型菌株(泳道1)和GNA1870敲除菌株(泳道3)制备的OMV显示这些蛋白每种的各自含量相似。相反，用不含GNA1870编码基因的pFp12穿梭载体转化的菌株的OMV(分别是泳道2和4)显示迁移至表观质量介于38-43kDa之间的三种蛋白的相对表达降低。该结果可能部分反映了因生长培养基中存在5μg/ml氯霉素的抗生素选择(压力)降低了通道蛋白的表达(Tommassen等，Infect Immun 1990，58：1355-9)。泳道5显示了用编码GNA1870的穿梭载体转化菌株RM1090制备的OMV。为更好地目测观察蛋白质，该泳道加载的蛋白质是泳道1-4的两倍以上(约10μg)。与其它OMV制品相比，用含GNA1870基因的穿梭载体转化菌株制备的OMV显示29-32kDa之间可分辨的蛋白质表达降低。采用SDS PAGE，在包含过量表达GNA1870的突变型菌株制备的OMV的任何OMV制品中均不易观察到GNA1870(为比较，泳道6显示了1μg重组GNA1870变体蛋白)。

在图2A中，采用抗v.1、2和3 GNA1870重组蛋白多克隆抗血清进行Western印迹来评估不同疫苗制品中GNA1870的表达。如B图所示，与v.1重组蛋白相比，该抗血清与rGNA1870 v.2蛋白的反应性略强。即使有这种偏差，Western印迹(检测到)与从天然表达v.2蛋白的野生型RM1090菌株制备的OMV相比，用pFP12-GNA1870转化RM1090制备的OMV显示反应性提高(图2A，C图)。相反，GNA1870敲除突变株(RM1090ΔGNA1870)的阴性对照OMV检测不到反应活性。光密度测量结果表明在用穿梭载体转化的菌株中v.1GNA1870蛋白的表达比野生型亲代RM1090菌株天然表达的v.2蛋白约高10倍。

利用抗GNA1870多克隆抗血清通过Western印迹分析了H44/76 OMV制品(图2B)。根据该制品的总蛋白含量标准化加载到凝胶上的OMV量。与估计的一样，在野生型菌株的膜制品中有GNA1870表达，其在经工程改造而能过量表达该蛋白的突变株相应制品中表达增加。然而，GNA1870的增加适中(约3倍)。

实施例3：血清抗体应答的分析

表2和图5总结了通过ELISA检测的不同组小鼠的血清抗-GNA1870抗体应答。表2显示对变体1蛋白的最高抗体应答是在单用重组GNA1870v.1疫苗或用含OMV疫苗的重组GNA1870 v.1混合疫苗免疫的小鼠中产生(抗变体1蛋白的滴度分别是1∶120,000和1∶300,000)。用过量表达变体1 GNA1870的菌株RM1090制备的OMV免疫的小鼠抗-GNA1870滴度(1∶32,000)低4-10倍。令人感兴趣的是，用变体1或2蛋白检测以野生型RM1090菌株制备的OMV免疫的小鼠，抗-GNA1870抗体应答检测不到或可忽略。该结果提示不过量表达的话，野生型菌株的OMV中GNA1870的免疫原性不佳。

用与磷酸铝一起给予的H44/76 OMV(1.25μg总蛋白)或5μg rGNA1870免疫各组小鼠。第三次剂量三周后获得血清样品，合并(每个疫苗组2份合并物，4-5只小鼠制备一份合并物)。如图5所示，单用铝佐剂免疫的对照小鼠没有可检测的抗-GNA1870抗体(GMT＜1∶10，柱1)，而用rGNA1870免疫的小鼠显示最高的应答(GMT 1∶23,500，柱2)。用过量表达GNA1870的H44/76制备的OMV免疫小鼠的抗-GNA1870抗体应答比用野生型菌株OMV免疫的各组约高10倍(比较柱5和3)。用H44/76ΔGNA1870制备的OMV免疫小鼠的抗体应答可忽略(GMT＜1∶10，柱4)。

表2.ELISA检测到的小鼠抗-GNA1870抗体应答
表2.ELISA检测到的小鼠抗-GNA1870抗体应答			疫苗^a	1/抗体滴度^b
rGNA1870变体1	rGNA1870变体2			1/抗体滴度^b
rGNA1870变体1	rGNA1870变体2	单用Al₂(PO₄)₃rGNA1870(v.1)rGNA1870(v.2)		＜50120,000ND	＜5032001,600,000
RM1090 OMV野生型ΔGNA1870过量表达GNA1870ΔGNA1870+rGNA1870 v.1	55＜5032,000300,000	单用Al₂(PO₄)₃rGNA1870(v.1)rGNA1870(v.2)	＜50＜5012004000	＜50120,000ND	＜5032001,600,000
RM1090 OMV野生型ΔGNA1870过量表达GNA1870ΔGNA1870+rGNA1870 v.1	55＜5032,000300,000	a疫苗由吸附到Al₂(PO₄)₃上的5μg总蛋白构成。OMV+rGNA1870疫苗由2.5μg OMV和2.5μg rGNA1870(v.1)的混合物构成。b与底物培育30分钟后，在ELISA中OD为0.5的血清稀释液。所示的数据是在各疫苗组的两份合并血清中检测到的滴度各自的几何平均值。各合并血清含有4-5只免疫小鼠的等体积血清。

图3A总结了对4株测试菌检测到的不同组小鼠的血清杀菌抗体应答。单用重组GNA1870蛋白疫苗、或联用重组GNA1870疫苗和OMV疫苗，或用过量表达GNA1870的OMV免疫的小鼠产生了彼此差异不显著的抗菌株Cu385高杀菌滴度(比较上图的柱4、5和6)。相反，用野生型RM1090或GNA1870敲除菌株制备的OMV疫苗免疫的对照小鼠血清中未检测到抗菌株Cu385的杀菌活性。(分别是柱2和3；滴度＜1∶10)。注意菌株Cu385表达典型的GNA1870v.1蛋白(与菌株MC58的氨基酸序列相同，用该基因表达重组GNA1870蛋白)，我们以前的研究已知该菌株对重组GNA1870疫苗所引发的小鼠抗体的杀菌活性高度敏感(表1)。另外，Cu385具有对疫苗菌株RM1090的PorA血清亚型(P1.5，2)为异源的PorA血清亚型(P1.19，15)，因此估计菌株Cu385能耐受不过量表达GNA1870变体1的对照OMV疫苗所产生抗体的杀菌活性(Tappero等，JAMA 1999，281：1520-7；Moe等，2002，同上)。

图3A也显示与工程改造的疫苗菌株的血清杀菌滴度相比，两侧到对表达v.1 GNA1870蛋白亚变体菌株M6190(从上往下第二幅图)的相应血清杀菌滴度。在用重组GNA1870变体1蛋白免疫的小鼠血清中未检测到杀菌活性(柱6，几何平均滴度＜1∶10)，该结果与我们以前研究的结果(表1)一致。然而，由于菌株M6190的PorA血清亚型(P1.5，2)与RM1090疫苗菌株的同源，用任何含OMV疫苗免疫的小鼠血清有高度杀菌活性(柱2、3、4或5)。

图3A(从上往下第三和第四幅图)分别显示了抗菌株Z1092和NZ98/254的相应杀菌应答。这两种菌株均表达对RM1090疫苗菌株的PorA分子为异源的PorA分子(表1)，用RM1090野生型或GNA1870敲除菌株制备的OMV疫苗免疫的小鼠血清不能杀伤二者(柱2和3，几何平均滴度＜1∶10)。然而，用过量表达GNA1870的菌株RM1090制备的OMV疫苗免疫的小鼠(柱5)抗菌株Z1092的几何平均血清杀菌抗体滴度明显高于用重组GNA1870(柱6，P＜0.02)或用重组GNA1870蛋白和OMV混合疫苗(柱4，P＜0.04)免疫的小鼠。分别观察到菌株NZ98/254(下图)或对菌株BZ198和M1390(数据未显示)有血清杀菌应答的类似倾向。然而，对于后三种菌株，用过量表达GNA1870的OMV疫苗免疫的小鼠血清杀菌应答的强度低于检测到的对菌株Z1092的应答。与其它疫苗接种组小鼠的各几何平均滴度相比，用过量表达GNA1870的OMV免疫小鼠的抗菌株NZ98/294、BZ198和M1390的几何平均血清杀菌滴度没有统计学显著差异(P＞0.10)。

图3B总结了抵御制备OMV疫苗所用的6种菌株(包括H44/76)的血清杀菌抗体应答。6种菌株中5种的PorA血清亚型对H44/76的PorA为异源性。菌株H44/76表达的GNA1870变体1蛋白序列也与菌株MC58相同，该菌株含有用于克隆和表达重组GNA1870蛋白疫苗的基因。当用H44/76疫苗菌株检测时，除阴性对照铝佐剂外，所有疫苗制品均引发高血清杀菌抗体应答(图3B，图A)。相反，当用异源菌株4243(图B)，Z1092、NZ98/254和BZ198(图C)或M6190(图D)检测时，用rGNA1870疫苗或H44/76野生型或H4476ΔGNA1870菌株制备的OMV疫苗免疫的小鼠血清杀菌滴度低或检测不到(分别见柱2、3和4)。用过量表达GNA1870的OMV疫苗免疫小鼠抗菌株4243的杀菌抗体应答高，抗NZ98/254、BZ198和Z1092菌株的杀菌应答低但可检测，抗M6190的杀菌活性检测不到(滴度＜1∶10)。虽然未在图3B上显示，但是用补体和分别针对PorA和/或多糖荚膜的阳性对照抗体不难杀死所有菌株。

实施例4：激活的C3b补体沉积在有被囊脑膜炎奈瑟球菌活细胞表面

在以前的研究中，我们发现缺乏杀菌活性的某些小鼠抗脑膜炎球菌抗体没有杀菌活性但能赋予抵御脑膜炎球菌性菌血症的被动保护作用(Welsch等，JImmunol 2004，172：5606-15；Welsch等，2003，同上)。通过流式细胞术检测到这种保护作用与这些抗体激活C3补体组分沉积到有被囊活脑膜炎球菌表面上的能力相关。存在C3b为调理作用提供配体，该作用是没有杀菌活性但能赋予保护作用最可能的机制。因此，研究了用不同OMV疫苗免疫的小鼠抗血清能否激活人C3b沉积(图4)。这些实验利用了两种测试的脑膜炎奈瑟球菌菌株NZ98/254(图4A，行A)和M1390(图4A，含B)，及四种测试的脑膜炎奈瑟球菌菌株NZ98/254、BZ198、Z1092和M6190(图4B)。对于这些菌株，用过量表达GNA1870的OMV疫苗免疫的小鼠抗血清显示杀菌滴度不高于其它疫苗菌株没有统计学意义。

当将两种测试菌株的细菌细胞与人源补体以及单用磷酸铝免疫小鼠的阴性对照合并血清的1∶40稀释液一起培育时，未见补体沉积的证据(图4A中的封闭区域，列1)。类似地，热灭活补体加上5μg/ml抗GNA1870的小鼠单克隆抗体(JAR3)没检测到C3b沉积(图4A中的封闭区，列2)。相反，用能识别C3b和iC3bi二者的抗-C3c抗体(检测)显示强免疫荧光的细菌百分比增加证明，在25μg/ml阳性对照B群单克隆抗荚膜抗体中(图4A中的开放区，列1)，或1μg/ml抗-GNA1870单克隆抗体中(图4A中的开放区，列2)加入活化补体引发C3b强烈沉积在两种测试菌株的细菌表面。

图4A列3-6中的图显示了将补体加入用不同疫苗免疫小鼠组所获得的合并血清稀释液后的作用。将补体加入用重组GNA1870(列3)、或用RM1090野生型菌株制备的OMV(列4)或重组GNA1870与OMV(列5)化合物疫苗免疫的小鼠血清1∶100稀释液中未能激活C3b沉积在各测试菌株上。相反，用过量表达GNA1870菌株RM1090制备的OMV免疫小鼠的合并血清1∶100或1∶400稀释液激发C3b强烈沉积在两种测试菌株表面(列6)。

如图4B所示，阳性对照抗荚膜mAb引发补体沉积在每种菌株上(列A的开放区)，而单用铝佐剂免疫小鼠的阴性对照抗血清1∶100稀释液为阴性(列A的封闭区)。用rGNA1870疫苗(列B中的封闭区)、或用野生型菌株H44/76制备的OMV疫苗(列C中的封闭区)免疫的小鼠血清1∶100稀释液也未引发补体明显沉积到任何菌株上。相反，抗-rGNA1870mAb能引发补体沉积到菌株NZ98/254、BZ198和Z1092上，但不沉积到菌株M6190上(列B的开放区)。类似地，用含过量表达GNA1870的H44/76疫苗免疫的小鼠抗血清1∶100稀释液激活C3沉积到菌株Z1092、NZ98/254和BZ198上(列D的开放区)，但不沉积到菌株M6190上。

实施例5.确定能杀菌或激活C3b沉积到异源菌株上的抗体的靶抗原

利用加载了His-标签重组GNA1870的Ni-NTA亲和柱来吸附用H44/76OMV(含过量表达的GNA1870)免疫小鼠制备的合并血清中的抗-GNA1870抗体。如表3所示，与用只含Ni-NTA基质的阴性对照柱吸附血清中的抗体相比，ELISA(检测到)该柱除去了98％的抗-GNA1870抗体。吸附到阴性对照柱上后，抗菌株4243的杀菌活性与原先未吸附的合并血清的杀菌活性相似，而抗-GNA1870抗体被吸附导致杀菌活性完全丧失。

利用菌株Z1092、NZ98/254、BZ198和M6190分析了吸附抗-GNA1870抗体后对C3沉积的作用(表3和图4B，行4)。如图4B，列D所示，用H44/76OMV(含过量表达的GNA1870)免疫的小鼠血清中除去抗-GNA1870抗体后导致抗血清在对iC3b/c3b激活和沉积敏感的三种菌株中完全丧失激活补体沉积的能力(图4B的封闭区)。以上总结的这些结果以及吸附后血清的杀菌数据表明对于所含PorA蛋白对H44/76疫苗菌株是异源蛋白的菌株，用H44/76 OMV(含过量表达的GNA1870)制备的抗血清激活C3沉积和杀菌活性受抗-GNA1870抗体所介导。

表3：含过量表达GNA1870的OMV免疫的小鼠抗血清经抗-GNA1870抗体吸附后的活性

	1/抗体滴度
	1/抗体滴度			试验，菌株	未吸附的血清	用阴性对照柱吸附后的血清	用rGNA1870柱吸附后的血清
抗-GNA1870ELISA	14000	8300	138	试验，菌株	未吸附的血清	用阴性对照柱吸附后的血清	用rGNA1870柱吸附后的血清
抗-GNA1870ELISA	14000	8300	138	杀菌4243	50	45	＜10
C3补体沉积				杀菌4243	50	45	＜10
C3补体沉积				NZ98/294	≥100	≥100	＜25

BZ198	≥100	≥100	＜25
BZ198	≥100	≥100	＜25	Z1092	≥100	≥100	＜25

用H44/76 OMV(含过量表达的GNA1870)免疫制备的的小鼠合并血清吸附到含Ni-NTA基质(Qiagen)的柱上，该基质与50μg/ml重组His-标签GNA1870培育过夜。收集流出液，浓缩至初始体积。对照柱含有Ni-NTA，但不含His-标签蛋白。

实施例6.抗-GNA1870抗体的功能活性作用

与用野生型疫苗RM1090菌株或RM1090ΔGNA1870敲除菌株制备的OMV中各蛋白质相比(图2A，A图)，经工程改造而过量表达GNA1870的RM1090脑膜炎奈瑟球菌菌株制备的OMV疫苗显示其它几种细胞包膜蛋白的表达降低。因此，除GNA1870以外的抗原所引发的抗体可能导致用过量表达GNA1870的OMV免疫的小鼠抗血清的功能活性较高。为研究这种可能性，利用抗-GNA1870亲和柱吸附用过量表达GNA1870的RM1090 OMV免疫的小鼠合并血清。ELISA(检测到)除去了99％的抗-GNA1870抗体。得到的吸附后抗血清也丧失了激活人C3b沉积到脑膜炎奈瑟球菌菌株NZ98/294上的所有能力(表4)。相反，用作为阴性对照的抗-NadA亲和柱吸附合并血清对C3b沉积没有作用(表4)。

表4.用过量表达GNA1870的OMV免疫的小鼠抗血清消除抗-GNA1870抗体后的功能活性^a
表4.用过量表达GNA1870的OMV免疫的小鼠抗血清消除抗-GNA1870抗体后的功能活性^a				试验	1/抗体滴度
未经吸附的血清	用GNA1870吸附后的血清	用NadA吸附后的血清			1/抗体滴度
未经吸附的血清	用GNA1870吸附后的血清	用NadA吸附后的血清	抗-GNA1870ELISA		40,000	400	30,000
C3b补体沉积(流式细胞术)^b	≥400	＜25	抗-GNA1870ELISA	≥400	40,000	400	30,000
C3b补体沉积(流式细胞术)^b	≥400	＜25	杀菌活性菌株Cu385菌株M6190	≥400	25001000	＜10600	3000600

^a用菌株RM1090(经工程改造而过量表达GNA1870)的OMV疫苗免疫的5只小鼠制备的合并血清。抗血清经重组GNA1870亲和柱或作为阴性对照的含重组NadA的亲和柱吸附(参见方法)。合并流出组分，通过膜过滤浓缩至它们初始的血清体积(参见方法)。^b与阴性对照血清相比，流式细胞术补体激活试验中能引发免疫荧光增加10倍的血清稀释度(参见图4)。

表4也总结了用菌株Cu385和M6190检测的经吸附合并血清的杀菌滴度。抗-GNA1870抗体吸附后完全消除了抗菌株Cu385的杀菌活性，但对菌株M6190的滴度没有明显作用。此后一结果估计是因为菌株M6190表达的PorA与RM1090疫苗菌株表达的PorA为同源血清亚型，故GNA1870或NadA亲和柱未除去杀菌的抗-PorA抗体。

实施例8.乳大鼠脑膜炎球菌菌血症模型中的被动保护作用

用不同组小鼠的合并血清预先处理乳大鼠，2小时后用脑膜炎奈瑟球菌菌株NZ98/254攻击。图6显示攻击4-6小时后获得的血液中CFU/ml的几何平均值。单用磷酸铝免疫的阴性对照小鼠合并血清的1∶15稀释液处理的所有10只大鼠患上菌血症，CFU/ml的几何平均值约为10⁵(A图，柱1)。相反，用10μg/大鼠的阳性对照B群抗荚膜抗体(柱2)或抗-GNA1870单克隆抗体(柱3)预处理导致CFU/ml几何平均值降低3-4-log(P＜0.0001)。与用阴性对照血清处理的动物相比，用RM1090ΔGNA1870敲除菌株制备的OMV疫苗(柱4)或用重组GNA1870与OMV的混合疫苗(柱5)免疫的小鼠合并血清没有明显的被动保护作用。相反，用过量表达GNA1870的OMV疫苗(柱6)免疫的小鼠合并血清能赋予保护作用(CFU/ml几何平均值降低4-log，P＜0.0001))。单用重组GNA1870疫苗免疫的小鼠合并血清(柱7)能赋予适中的保护作用(降低约2log，P＜0.0001)，但其保护活性低于用过量表达GNA1870的OMV免疫的小鼠合并血清(P＜0.0001，比较CFU/ml的各几何平均值)。

图6，B图显示了用合并血清的1∶60稀释液预处理大鼠的相应CFU/ml几何平均值。在此较高稀释度，用过量表达GNA1870的OMV疫苗免疫的小鼠合并血清(柱6)能赋予保护作用(P＜0.0002，与用阴性对照血清的1∶15稀释液处理大鼠的几何平均值相比)，但用测试的其它3种疫苗组免疫的小鼠合并血清，包括重组GNA1870疫苗免疫的小鼠血清(柱7，P＞0.10)在此较高稀释度时没有明显的保护活性。

实施例9.用过量表达奈瑟球菌表面蛋白A(NspA)的菌株RM1090制备的囊泡疫苗免疫小鼠与血清杀菌抗体应答提高无关

测定用经工程改造而过量表达GNA1870的RM1090菌株制备的囊泡疫苗能诱导保护作用提高是GNA1870特异性的，还是用经工程改造而过量表达另一种疫苗靶标的菌株制备的囊泡疫苗也可能如此令人感兴趣。因此，由野生型菌株的NspA基因已灭活的菌株RM1090制备微囊泡疫苗。用穿梭载体pFP12(含有菌株8047的NspA基因)转化RM1090 NspA-敲除菌株制备第二囊泡疫苗。SDS PAGE(显示)，与RM1090野生型菌株相比，用该穿梭载体转化菌株得到的囊泡所含NspA蛋白的表达增加10倍(数据未显示)。

用3次剂量的囊泡疫苗和磷酸铝一起免疫各组小鼠，最后一次免疫3周后收集血清。ELISA检测到过量表达NspA的疫苗能引发滴度高抗-NspA抗体(与用NspA敲除菌株制备的囊泡疫苗免疫的小鼠1∶700滴度和单用磷酸铝免疫小鼠＜1∶50滴度相比，滴度是1∶19,000)。表5总结了用4种测试菌株BZ198、NZ98/254、Cu385和Z1090检测的血清杀菌抗体应答。

表5.用经遗传工程改造而过量表达奈瑟球菌表面蛋白A(NspA)的突变型菌株RM1090制备的囊泡疫苗免疫小鼠
表5.用经遗传工程改造而过量表达奈瑟球菌表面蛋白A(NspA)的突变型菌株RM1090制备的囊泡疫苗免疫小鼠						脑膜炎奈瑟球菌菌株	VR序列类型(PorA)	抗荚膜MAb(BC₅₀)^bμg/ml	用磷酸铝免疫的阴性对照小鼠(1/滴度)^c	用脑膜炎奈瑟球菌菌株RM1090的囊泡免疫小鼠^a
过量表达的NspA^d(1/滴度)^c	NspA敲除(1/滴度)^c									用脑膜炎奈瑟球菌菌株RM1090的囊泡免疫小鼠^a
过量表达的NspA^d(1/滴度)^c	NspA敲除(1/滴度)^c	BZ198	(7，4)	＜6	＜1∶10					1∶16	＜1∶4
NZ98/254	(7-2，4)	BZ198	(7，4)	＜6	＜1∶10	8	＜1∶10	＜1∶4	＜1∶4	1∶16	＜1∶4
NZ98/254	(7-2，4)	Cu385	(19，15)	10	＜1∶10	8	＜1∶10	＜1∶4	＜1∶4	＜1∶4	1∶12
Z1092	(5-2，10)	Cu385	(19，15)	10	＜1∶10	＜1	＜1∶10	1∶12	1∶250	＜1∶4	1∶12

^a如Moe等(Infection Immunity 2002，70：6021-6031)所述，用穿梭载体pFP12(含有菌株8047的NspA基因)转化NspA-敲除菌株制备微囊泡疫苗。注射三次来免疫小鼠，最后一次注射约3周后放血。所示的滴度是各疫苗组9-10只小鼠的合并血清。ELISA检测的各抗-NspA抗体滴度是＜1∶50(磷酸铝组)、1∶700(RM1090 NspA敲除菌株的囊泡)和1∶19,000(过量表达NspA的RM1090菌株的囊泡)。

^b与人补体培育1小时后杀伤50％细菌的最低浓度。

^c与人补体培育1小时后杀伤50％细菌的血清最高稀释度。

^d在NspA敲除背景中表达的。

与疫苗菌株RM1090的PorA相比，所有4种菌株表达异源PorA。以前的数据显示了对大肠杆菌囊泡中表达的重组NspA制备的抗-NspA抗血清杀菌活性高度敏感(Moe等，Infection and Irnmunity 1999，67：5664-5675)，根据该数据选择菌株BZ198用于本实验来测试杀菌活性，有证据表明用源自过量表达NspA的菌株囊泡疫苗免疫的小鼠抗血清杀菌活性提高。然而，对于菌株NZ298/254，杀菌活性没提高，对于菌株Cu385和Z1090，有证据表明用过量表达NspA的囊泡疫苗免疫诱导的血清杀菌抗体应答比用相应的NspA敲除菌株制备的对照囊泡疫苗诱导的低3-10倍。因此，与过量表达GNA1870的囊泡疫苗相反，过量表达NspA的囊泡疫苗未能始终如一地提高杀菌抗体应答，而且看来抑制了对某些菌株的杀菌抗体应答。

Claims

1.一种组合物，所示组合物包含：

由第一种奈瑟球菌制备的分离的抗原性囊泡，其中所述奈瑟球菌产生的GNA1870多肽的水平足够制备给予对象时引发抗-GNA1870抗体的囊泡；和

药学上可接受的载体。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述囊泡是外膜囊泡(OMV)、微囊泡(MV)或OMV与MV的混合物。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述奈瑟球菌是天然产生的。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述GNA1870多肽对所述奈瑟球菌是内源性的。

5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述奈瑟球菌就GNA1870多肽的产生进行了遗传修饰。

6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述奈瑟球菌经遗传修饰而由异源启动子表达GNA1870多肽。

7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述奈瑟球菌经遗传修饰而含有编码外源性GNA1870多肽的核酸。

8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述奈瑟球菌经遗传修饰而破坏了内源性GNA1870多肽的产生。

9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述奈瑟球菌缺乏荚膜多糖。

10.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含：

由第二种奈瑟球菌制备的分离的抗原性囊泡，其中所述第二种奈瑟球菌产生的GNA1870多肽水平足够制备给予对象时引发抗-GNA1870抗体的囊泡，其中所述第二种奈瑟球菌与所述第一种奈瑟球菌在遗传学上不同。

11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述第一和第二种奈瑟球菌遗传学上不同在于它们所属的血清群、血清型或血清亚型中至少有一个不同。

12.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述第二种奈瑟球菌的GNA1870多肽不同于所述第一种奈瑟球菌的GNA1870多肽。

13.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含：

由第三种奈瑟球菌制备的分离的抗原性囊泡，其中所述第二种奈瑟球菌产生的GNA1870多肽水平足够制备给予对象时引发抗-GNA1870抗体的囊泡，其中所述第三种奈瑟球菌与所述第一种奈瑟球菌在遗传学上不同。

14.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述第一、第二和第三种奈瑟球菌遗传学上不同在于它们所属的血清群、血清型或血清亚型中至少有一个不同。

15.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述第一、第二和第三种奈瑟球菌的GNA1870多肽不相同。

16.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一种奈瑟球菌经遗传修饰而产生至少两种不同的GNA1870多肽。

17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述GNA1870多肽属于不同的GNA1870多肽变体组，其中所述变体组是v.1、v.2和v.3。

18.一种产生抗原性组合物的方法，所述方法包括：

培养产生GNA1870多肽的奈瑟球菌，其中所述GNA1870多肽产生的水平足够制备给予对象时引发抗-GNA1870抗体的囊泡；

从培养的细菌制备囊泡；和

混合所述囊泡与药学上可接受的载体来产生适合给予对象的抗原性组合物。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述囊泡是外膜囊泡(OMV)或微囊泡(MV)。

20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌是天然产生的。

21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述GNA1870多肽对所述奈瑟球菌是内源性的。

22.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌就GNA1870多肽的产生进行了遗传修饰。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌经遗传修饰而由异源启动子表达GNA1870多肽。

24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌经遗传修饰而含有编码外源性GNA1870多肽的核酸。

25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌经遗传修饰而破坏了内源性全长GNA1870多肽的产生。

26.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌经遗传修饰而产生至少两种不同的GNA1870多肽。

27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述GNA1870多肽属于不同的GNA1870多肽变体组，其中所述变体组是v.1、v.2和v.3。

28.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌缺乏荚膜多糖。

29.一种引发抗奈瑟球菌的免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：

给予哺乳动物免疫有效量的含第一抗原性制品的组合物来引发抗GNA1870抗体，所述制品含有由第一种奈瑟球菌制备的囊泡，其中所述奈瑟球菌产生的GNA1870多肽水平足够用于制备给予对象时引发抗-GNA1870抗体的囊泡；

其中所述给予足以引发针对囊泡中存在的GNA1870多肽的免疫应答。

30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述囊泡是外膜囊泡(OMV)、微囊泡(MV)或OMV与MV的混合物。

31.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌是天然产生的或对GNA1870多肽的产生进行了遗传修饰。

32.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述GNA1870多肽对所述奈瑟球菌是内源性的。

33.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌经遗传修饰而由异源启动子表达GNA1870多肽。

34.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌经遗传修饰而含有编码外源性GNA1870多肽的核酸。

35.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌经遗传修饰而破坏了内源性GNA1870多肽的产生。

36.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述组合物还包含免疫有效量的第二抗原性制品，所述制品含有由第二种奈瑟球菌制备的囊泡，其中所述第二种奈瑟球菌产生的GNA1870多肽水平足够用于制备给予对象时引发抗-GNA1870抗体的囊泡，其中所述第二种奈瑟球菌与所述第一种奈瑟球菌在遗传学上不同。

37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述第二种奈瑟球菌的GNA1870多肽不同于所述第一种奈瑟球菌的GNA1870多肽。

38.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述组合物还包含由第三种奈瑟球菌制备的分离的抗原性制品，其中所述第二种奈瑟球菌产生的GNA1870多肽水平足够用于制备给予对象时引发抗-GNA1870抗体的囊泡，其中所述第三种奈瑟球菌在遗传学上不同于所述第一或第二种奈瑟球菌。

39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述第一、第二和第三种奈瑟球菌的遗传学上不同在于它们所属的血清群、血清型或血清亚型中至少有一个不同。

40.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述第一、第二和第三种奈瑟球菌的GNA1870多肽不相同。

41.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述第一种奈瑟球菌经遗传修饰而产生至少两种不同的GNA1870多肽。

42.如权利要求41所述的组合物，其特征在于，所述GNA1870多肽属于不同的GNA1870多肽变体组，其中所述变体组是v.1、v.2和v.3。

43.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述给予在对象中引发抗脑膜炎奈瑟球菌多种菌株的保护性免疫应答。

44.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌是B群脑膜炎奈瑟球菌。

45.一种引发抗奈瑟球菌免疫应答的方法，所述方法包括给予哺乳动物免疫有效量的含制品的组合物，所述制品含有由天然表达高含量GNA1870或经工程改造而过量表达GNA1870的奈瑟球菌的菌株制备的囊泡；

46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述囊泡是外膜囊泡(OMV)、微囊泡(MV)或OMV与MV的混合物。

47.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌的菌株是H44/76。

48.一种组合物，所述组合物包含由天然表达高含量GNA1870或经工程改造而过量表达GNA1870的奈瑟球菌的菌株制备的抗原性囊泡；和药学上可接受的载体。

49.如权利要求48所述的组合物，其特征在于，所述奈瑟球菌的菌株是H44/76。

50.一种组合物，其包含：

由经遗传修饰而过量表达GNA1870多肽的第一种脑膜炎奈瑟球菌细菌制备的第一抗原性囊泡；

由经遗传修饰而过量表达GNA1870多肽的第二种脑膜炎奈瑟球菌细菌制备的第二抗原性囊泡；和

药学上可接受的载体；

其中所述第一和第二种细菌的GNA1870多肽是不同的GNA1870变体组，所述第一和第二种细菌产生不同的PorA多肽。

51.如权利要求50所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含由经遗传修饰而过量表达GNA1870多肽的第三种脑膜炎奈瑟球菌细菌制备的第三抗原性囊泡，其中所述第三种细菌的GNA1870多肽的GNA1870变体组不同于所述第一和第二种细菌的，其中所述第三种细菌产生的PorA多肽不同所述第一和第二种细菌的PorA多肽。

52.如权利要求50所述的组合物，其特征在于，不用洗涤剂制备所述第一和第二抗原性囊泡。