CN101607081A - 布鲁氏菌疫苗及疫苗用抗原蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开家畜使用的抗布鲁氏病的疫苗及这种疫苗所用的抗原蛋白的制备方法。本发明的布鲁氏菌疫苗所用的抗原蛋白为布鲁氏菌bcsp31蛋白，特别是布鲁氏菌bcsp31重组蛋白。重组抗原蛋白的制备方法是以从布鲁氏菌提取的细菌总DNA为模板，根据布鲁氏菌bcsp31基因的核苷酸全序列设计一对引物进行聚合酶链反应，克隆获得bcsp31蛋白基因，然后转入酵母表达载体，获得重组表达载体，再将其导入酵母表达细菌中，获得重组毕赤酵母表达菌，增殖并进行诱导表达重组毕赤酵母表达菌，经分离纯化得到所用的抗原蛋白。

Description

布鲁氏菌疫苗及疫苗用抗原蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及家畜使用的抗布鲁氏病的疫苗及这种疫苗所用的抗原蛋白的制备方法。

背景技术

家畜布鲁氏菌病呈世界性分布，在五个洲的200多个国家中有170多个国家和地区存在或爆发该病，尤其在南美洲、非洲、亚洲的许多发展中国家流行严重。布鲁氏菌病主要通过消化道感染，一般只发生于动物-动物、动物-人之间的传染，被国家列为二类传染病。近些年来，我国布鲁氏菌病的疫情明显回升，已波及28个省市、自治区和直辖市；家畜布鲁氏菌病的爆发流行已经给畜牧业造成巨大的经济损失。布鲁氏菌病流行形势十分严峻。人感染布鲁氏菌病，临床主要表现波浪热或马耳他热，关节疼痛，慢性病例长期低烧，严重损伤身体，使之完全或部分丧失工作能力。生物战恐怖分子，历来把培育强毒力布鲁氏菌作为侯选的生物武器之一。

布鲁氏菌是革兰氏阴性、兼性细胞内寄生菌，能够感染多种动物和人。当前确认布鲁氏菌属中有6个种：马耳他布鲁氏菌(Brucella melitensis)、流产布鲁氏菌(Br.abortus)、猪布鲁氏菌(Br.suis)、沙林鼠布鲁氏菌(Br.neotomae)、绵羊布鲁氏菌(Br.ovis)和犬布鲁氏菌(Br.canis)。分类主要根据致病性和对宿主的嗜性差异做出。从遗传发生关系学看，布鲁氏菌属属于根瘤菌群(Rhizobiaceaegroup)。DNA-DNA杂交研究揭示6种布鲁氏菌与最近分离的海洋哺乳动物分离株之间高度一致(＞90％)。

目前，市场上动物用布病疫苗全部为不同菌株的弱毒疫苗，例如，中国发明专利申请200810224820.3公开一种流产布鲁氏菌的重组菌及流产布鲁氏菌的重组疫苗，它是将流产布鲁氏菌(Brucella abortus)中的冷休克蛋白的编码基因灭活得到的菌株。这种菌菌株的毒力比现行疫苗S19小，据该申请文件介绍，无需灭活就可以作为疫苗免疫动物。又如中国发明专利申请200810224819.0公开的羊种布鲁氏菌的重组菌及。本发明提供的羊种布鲁氏菌的重组疫苗菌，是将羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)中的冷休克蛋白的编码基因灭活得到的菌株。与现有的菌株相比，该专利申请的菌株的毒力比现行疫苗M5小，据该申请文件介绍，同样无需灭活就可以作为疫苗免疫动物。中国发明专利申请200810224818.6公开了的带有免疫标记的流产布鲁氏菌的重组菌是将流产布鲁氏菌(Brucella abortus)中的perosamine合成酶的编码基因灭活得到的菌株。与出发菌株相比，该专利申请得到的菌株的毒力更小，无需灭活就可以作为疫苗免疫动物。但弱毒株长期使用有可能毒力返强。另外，布鲁氏菌的培养要求条件高，培养比较困难。另一方面，由于我国现用的血清学检测技术不能区分疫苗免疫抗体与野毒感染抗体。为了不干扰常规检疫，所以现在我国大部分地区的奶牛不接种疫苗，以便避免免疫抗体的干扰，进行布病检疫。

寻找一种可长期使用而不产生毒力返强，培养生产更为容易的布鲁氏菌疫苗对维护国家安全，促进养殖业可持续性发展，保证食品安全、环境安全，保护人民身体健康和维护社会稳定具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种不存毒力返强，使用更加安全的，供家畜用的抗布鲁氏菌病的疫苗，以及这种疫苗用抗原蛋白的的，制备方法，特别是一种可以大量工程化生产的方法。

本发明的布鲁氏菌疫苗所用的抗原蛋白为布鲁氏菌bcsp31蛋白，特别是布鲁氏菌bcsp31重组蛋白。

本发明的疫苗所用的用重组抗原蛋白的制备方法是以从布鲁氏菌提取的细菌总DNA为模板，根据布鲁氏菌bcsp31基因的核苷酸全序列设计一对引物进行聚合酶链反应，克隆获得bcsp31蛋白基因，然后转入酵母表达载体中，获得重组表达载体，将重组表达载体导入酵母表达细菌中，获得重组毕赤酵母表达菌，增殖并进行诱导表达重组毕赤酵母表达菌，由于本发明所表达的蛋白为分泌蛋白，存在于液体培养基中且基本没有其他蛋白带，纯度可以达到要求，只需要离心将细胞于液体分离即可得到所用的抗原蛋白。

本发明的制备方法中，其特征是所用的引物序列为：

P1：5’-cgcgaattcaccccacaggccagaacatttttccg-3’(含EcoR I酶切位点)

R1：5’-gctgcggccgctttcagcacgcccgc-3’(含Not I酶切位点)。

研究表明，布鲁氏菌BCSP31(Brucella Cell Surfacial Protein 31)存在于该菌细胞表面，BCSP31可溶于水，能够盐析，推测可能是一种周质蛋白，分子量为31kDa，是一个抗体耐受性标记基因，研究表还表明该蛋白具有免疫作用，在感染时能诱发免疫反应，由于BCSP31能产生抗原反应，但却并不具有致病性，因此采用BCSP31为亚单位疫苗可以完全克服现有技术的不足，其使用较现有技术更为安全。

本发明的蛋白采用PCR进行克隆，再经酵母表达的重组菌，使用其具备大规模工业化生产的条件。

本发明进行PCR反应所采用的引物在酶切位点后对应的密码子编码的蛋白包括了首个和最末端氨基酸，也就是说在2酶切位点之间包括了除信号肽以外的所有蛋白序列，所表达蛋白是一完整的蛋白，在次原则下，无论引物后面序列的后面增加或减少几个碱基都不影响蛋白的完整性；此外试验设计时，在5’引入了acccca编码的两个氨基酸，能形成环形结构，从而防止了酶对表达蛋白的降解，使蛋白保存时间更长。

本发明还有如下优点：

1.本发明生产的疫苗抗原是免疫基因的表达产物，而不是活的布鲁氏菌全菌体，因此在生产过程中完全避免了人为的制毒、散毒等安全隐患。

2.本发明生产的疫苗与传统弱毒疫苗相比，抗原成分单一，在免疫家畜体内只产生单一的特异性抗体，因此可以用血清学方法有效地鉴别区分疫苗免疫家畜和自然感染家畜。因此采用本发明的疫苗可克服现阶段存在的无法区分疫苗免疫抗体与野毒感染抗体的问题，为国家实施家畜布鲁氏菌病根除计划，提供有力的技术支持。

3.本发明涉及的疫苗用抗原是蛋白质，与其他新型疫苗(如活载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗)相比不会发生可能出现基因重组问题，因此本发明不存在生物安全性问题。

4.本发明以酵母作为目的蛋白的表达载体，培养简单，可以用发酵罐规模化生产，可以实现质量控制，保证所生产的疫苗安全有效。

5、本发明以酵母作为目的蛋白的表达载体，与大肠杆菌原核表达相比，表达量要高，且以可溶性存在，其活性要远高于包涵体蛋白。

6、本发明所表达的目的蛋白，能与布鲁氏菌病阳性血清发生反应，故该重组蛋白可作为目的抗原检测检测布鲁氏菌病感染的血清，如ELISA方法等。

7、本发明所表达的目的蛋白，可直接用于制备布鲁氏菌病BCSP31单克隆抗体的抗原。

8、本发明的方法相对现有的疫苗技术而言要简单。

附图说明

图1为pPIC9K-bcsp31酵母表达产物的电泳图，其中：M是蛋白Marker；1是空载体对照；2是96小时的产物；3是72小时的产物；4是48小时的产物；5是24小时的产物。图2为pPIC9K-bcsp31酵母表达Western-blot分析图，其中M是蛋白Marker；1是表达物Western-blot；2是去糖基化产物Western-blot。

具体实施方式

本发明的具体实施方式说明如下：

本发明使用的主要材料

菌株：流产布鲁氏菌2型CVCC12株，购自中国兽医药品监察所。

表达菌：GS115为目的基因表达的酵母菌，用于质粒转化时须经山梨醇处理使其具有感受性，成为感受态细胞，该菌株可以从Invitrogen公司购买得到。

pPIC9K载体：为酵母表达载体，购自Invitrogen公司。

布鲁氏菌阳性牛血清：用于表达蛋白的定性检测，购自中国兽医药品监察所。

辣根过氧化物酶标记兔抗牛IgG：用于表达蛋白的定性检测，购自北京拜尔迪生物技术公司。

引物：所有基因扩增和改造用的引物均由大连宝生物有限公司合成。

酶和试剂：EcoRI、NotI、Taq酶、T4DNA连接酶均购自Promega公司；IPTG、SDS(十二烷基磺酸钠)、蛋白酶K、Rnase、溶菌酶、核酸Marker、Agarose DNAextraction kit、DNA快速纯化同收试剂盒、质粒快速提取试剂盒均购自大连宝生物工程公司；酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液产自美国，琼脂糖产自西班牙，均由上海生工生物工程技术服务有限公司进口分装；单核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP，购自TaKaRa公司。中分子量标准蛋白marker为MBI公司产品；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、Triton X-100为华美生物工程公司产品；山梨醇、甲醇等生化试剂均为国产分析纯。

具体操作如下：

1.从选择的流产布鲁氏菌2型CVCC12株提取总DNA

CVCC12是我国保存的标准菌株(请提供菌种保藏号及保藏地)。

将流产布鲁氏菌接种布鲁氏菌培养用胰蛋白胨琼脂平板，在5％CO₂环境中，37℃培养24-48小时，通过形态学和生化鉴定，确定其为布鲁氏菌，然后进行增菌培养；取2mL增菌液于微量离心管，6000rpm离心5min收集沉淀；每管加入500μl NET Buffer置于80℃水浴15min；从水浴锅取出离心管，室温放置2min，而后加入12μl溶菌酶，37℃消化4hr；从水浴锅取出离心管，室温放置2min，加入蛋白酶K、Rnase酶过夜消化；在离心管中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提2次；用无水乙醇洗涤2次得布鲁氏菌基因组总DNA，放入温箱中使离心管内壁干燥；加入50μl无核酸酶TE Buffer溶解，贮存于-20℃备用。)

本实施例中选用流产布鲁氏菌2型CVCC12株，从中提取细菌总DNA，以该总DNA为模板，进行聚合酶链反应(PCR)，所用引物对为：

P1：5’-cgcgaattcaccccacaggccagaacatttttccg-3’

R1：5’-gctgcggccgctttcagcacgcccgc-3’

扩增片段包括bcsp31基因的阅读框(除去了信号肽)。

2.目的基因的克隆

首先将前述PCR产物和pPIC9K载体分别用EcoR I和Not I双酶切，然后在连接酶的作用下使两产物连接，从而构建成pPIC9K-Bcsp31表达载体。通过PCR鉴定和酶切鉴定予以确认。鉴定肯定阳性质粒pPIC9K-Bcsp31为带有完整bcsp31基因的重组质粒。测序结果表明，阳性质粒pPIC9K-Bcsp31含有流产布鲁氏菌外膜蛋白基因bcsp31的阅读框架。

2.1试剂的配制

10×YNB：称取13.4g YNB(YNB为无氨基酸酵母氮源，酵母培养基组成成分)溶于100ml去离子水，加热至YNB完全溶解，过滤除菌，4℃保存，可放1年。

500×B：20mg生物素溶于100ml去离子水，过滤除菌，4℃保存，可放1年。

10×D：200g葡萄糖溶于1000ml去离子水，高压(121℃，0.105PKa)15min或过滤除菌，4℃保存，可放1年。

10×M：5ml甲醇溶于100ml去离子水，过滤除菌，4℃保存，可保存2月。

10×GY：10ml甘油溶于90ml去离子水，高压(121℃，0.105PKa)20min灭菌，4℃保存，可放1年以上。

1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)：1M K2HPO4132ml，1M KH2PO4868ml，H3PO4调至pH6.0，高压灭菌(121℃，0.105PKa)，，4℃保存。

YPD和YPD平板：1g酵母提取物，2g蛋白胨，溶于90ml去离子水，高压灭菌(121℃，0.105PKa)，冷却后加入10ml10×D，制板加1.5g琼脂粉。

MD和MD平板：80ml水高压灭菌(制板加1.5g琼脂粉)，冷却至50℃左右，加入10ml 10×YNB，0.2ml 500×B，10ml 10×D。

BMGY：1g酵母提取物，2g蛋白胨，溶于70ml去离子水，高压灭菌(121℃，0.105PKa)，冷却后加入10ml 1M磷酸盐缓冲液，10ml 10×YNB，0.2ml 500×B，10ml 10×GY。

BMMY：1g酵母提取物，2g蛋白胨，溶于70ml去离子水，高压灭菌(121℃，0.105PKa)，冷却后加入10ml 1M磷酸盐缓冲液，10ml 10×YNB，0.2ml 500×B，10ml 10×M。

2.2将pPIC9K-Bcsp31表达载体碱裂解法小量提取质粒。

2.3对重组质粒pPIC9K-Bcsp31的鉴定

鉴定包括以下方面：

(1)重组质粒pPIC9K-Bcsp31琼脂糖凝胶电泳鉴定；

(2)重组质粒pPIC9K-Bcsp31的PCR扩增；即用含有如下两个酶切位点的P1、R1引物对重组质粒进行PCR扩增鉴定；

(3)重组质粒pPIC9K-Bcsp31的酶切鉴定；即用EcoR I和Not I双酶切鉴定；

(4)重组质粒pPIC9K-Bcsp31的测序确证；

(5)用DNAstar软件对序列进行分析，并与已发表的序列进行同源性比较。

经以上的鉴定证明获得的正确目的基因已准确的连接到表达载体上，并成功的构建了pPIC9K-Bcsp31重组表达载体。

2.4毕赤酵母感受态细胞的制备、转化和筛选

(1)将划线培养的毕赤酵母GS115单菌落接种于3mlYPD培养基中，28℃，250rpm摇荡培养24～28h。

(2)取培养基100μl转接与20mlYPD培养基中，28℃，250rpm振荡培养过夜，OD600＝1.3～1.5时，4℃1500g离心5min收获细胞。

(3)细胞依次用100ml、50ml冰预冷水和20ml冰预冷的1M山梨醇洗涤，4℃1500g离心5min，最后用0.8ml冰预冷的1M山梨醇悬浮菌体，置冰浴。

(4)取Sal I线形化的重组载体10μl(100μg)与80μl毕赤酵母感受态细胞混匀，然后转入到冰预冷的0.2cm的电转移杯中，冰上放置5min。

(5)将电转移杯放在电穿孔仪上用脉冲电流电击一次，电转条件：电压1500V，电容25F，电阻200Ω，时间5ms，温度0℃。

(6)电击结束，立即加入1ml冰预冷的1M山梨醇，混匀，取250μl转化物涂营养缺陷型MD培养基平皿，置28℃恒温培养2～4天，能在MD培养基上生长的菌落为His+转化子。

(7)将MD培养基平皿中长出的His+转化自用影印法依次接种到含G418浓度梯度为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mg/ml的培养基中，28℃培养逐级筛选G418高抗性菌株，获得目的基因高拷贝重组菌株。

3.流产布鲁氏菌bcsp31基因在酵母表达菌中的表达

从YPD-G418平皿上挑取筛选高拷贝菌落接种于20mlBMGY培养基中，28℃～30℃振荡培养16～18h，当OD600＝2～6时，室温1500g离心10min收集细胞，将收集的细胞用30mlBMMY培养基悬浮于250ml的三角瓶中，三层无菌纱布扎口，保证良好的通气性，28℃振荡培养诱导表达，每24h向培养基中补加甲醇浓度至1％，并且24h取样一次，取样量1ml以保证持续诱导表达。

4.重组蛋白pPIC9K-Bcsp31电泳检测

(I)SDS-PAGE溶液的配制：

Tris-甘氨酸缓冲液：25mmol/L Tris、250mmol/L甘氨酸(pH 8.0)、0.1％SDS。

2×SDS上样buffer：100m mol/L Tris.C1(pH8.0)、200m mol/L巯基乙醇、4％SDS、0.2％溴酚蓝、20％甘油。

氨基黑染色液(100ml)：0.5g氨基黑10B溶于60ml水、30ml乙醇、10ml冰乙酸中。

封闭液：10ml PBST+0.3g BSA。

底物溶液(30ml)：30ml PBST中溶解15mg的DAB(二氨基联苯胺)，9mgCoCl₂·6H₂O，加入10μl 30％H₂O₂混匀后立即使用。

5×核酸上样缓冲液：50％甘油(v/v)、50mmol/L EDTApH8.0、0.125％溴酚蓝(w/v)、0.125％二甲苯氰(w/v)。

考马斯亮蓝染色液：45ml甲醇、45ml水、10ml冰醋酸中溶解0.25g考马斯亮蓝R250。

脱色液：30％甲醇、10％冰乙酸，蒸馏水补体积至100ml。

PBST溶液：5.8g Na₂HPO₄·12H₂O、0.4g KCl、0.4g KH₂PO₄、16g NaCl、1ml吐温-20，蒸馏水补体积至2000ml。

(II)SDS-PAGE

(1)洗净玻璃板，固定在电泳槽上，用2.0％琼脂糖封边。按分子克隆的配方配制15％的分离胶20ml，迅速注入两玻璃板之间，胶顶覆盖1ml双蒸水。待分离胶凝固后倾出覆盖层液体，用去离子水冲洗凝胶顶部数次，倒置空干液体，加入2ml 5％的积层胶溶液，插上梳子，垂直放置电泳槽使其凝固。

(2)小心移去梳子，在电泳装置上、下槽间加入Tris-甘氨酸缓冲液，用注射器冲洗加样孔数次，将电源负极与上槽相连。

(3)收集的菌液12000rpm离心3min，用100μl pH7.4的PBS悬浮，超声波裂解到菌液呈半透明，加入等体积的2×SDS上样buffer，混匀，水浴煮沸5min，用微量进样器上样20μl，打开电源，用80V电压电泳至溴酚蓝进入分离胶，把电压提高到120V，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。

(4)染色：取下凝胶用蒸馏水冲洗，用5倍凝胶体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，放在脱色摇床上室温染色3h。

(5)脱色：用30％甲醇、10％冰乙酸的混合液，在脱色摇床上脱色过夜，其间更换染色液3～4次。待蓝色背景完全脱净后，将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色。

5.重组蛋白pPIC9K-Bcsp31免疫活性的检测

(I)Western-blot分析溶液的配制：

洗涤液溶液：150mmol/L NaCl

50mmol/L Tris-HCl pH7.5

转移缓冲液：39mmol/L甘氨酸

48mmol/L Tris碱

0.037％SDS

20％甲醇

氨基黑染色液(100mL)：0.5g氨基黑10B溶于40mL双蒸水、50mL甲醇、10mL冰乙酸中。

封闭液：10mL PBST+0.3g BSA

底物溶液(30mL)：在30mL PBST中加入15mg的DAB(二氨基联苯胺)和9mg CoCl2·6H2O使其溶解，加入10μl 30％H2O2混匀后立即使用。

(II)ELISA试剂配制：

(1)包被液0.05mol/L碳酸盐缓冲液

Na2CO3(无水碳酸钠) 1.6g

NaHCO3(碳酸氢钠) 2.9g

加无离子水至1000mL

(2)洗涤液pH9.2碳酸盐缓冲液-吐温20

Na2HPO4·12H2O 2.9g

KCl 0.2g

KH₂PO₄ 0.2g

NaCl 18g

吐温20 0.5mL

加无离子水至1000mL

(3)甲液0.1mol/L柠檬酸4.2g/200mL

乙液0.2mol/L Na₂HPO₄·12H₂O 14.3g/200mL

取甲液24.3mL与乙液25.7mL混合，临用前加20mg邻苯二胺(OPD)加过氧化氢(H₂O₂)0.02mL。

(4)终止液2mol/L H₂SO₄溶液

取分析纯浓硫酸11.8mL，加无离子水至100mL。

(III)重组表达蛋白的Western-blot分析

(1).转印：剪8块滤纸与1块硝酸纤维素膜(NC)，大小与凝胶相等，在转移缓冲液中浸泡3min，在正极板上按四层滤纸、NC膜、SDS-PAGE电泳凝胶、四层滤纸的顺序叠放整齐，确定无气泡后盖上负极板，110mA转移1hr。

(2).封闭：转移完成后，取下NC膜，切下标准分子量Marker，置氨基黑染色液中浸染5min，取出后用漂洗脱色，直至背景蓝色脱尽。其余NC膜用PBS冲洗，加入10mL封闭液，室温轻轻振摇1-2hr。

(3).与抗体的结合：封闭结束后，用PBS冲冼NC膜4-5次，加入PBST 1∶50倍稀释的布鲁氏菌阳性牛血清10mL，37℃结合1.5hr，用PBST冲洗4-5次，每次在摇床缓慢摇动。加入1∶400倍稀释的兔抗牛IgG(二抗)，室温下轻摇孵育1hr，取出用PBST冲洗3-4次，每次10min。

(4).底物显色：将NC膜转移到10mL底物溶液中，室温避光轻摇3min观察显色情况，等出现条带时，立即转入PBST缓冲液中，室温保存。

(V)重组表达蛋白的ELISA检测

(1)重组表达蛋白的纯化：将大量制备的含重组表达蛋白的重组菌菌体裂解上清进行SDS-PAGE电泳，经染色后，参照Marker的大小，切下所需的51ku的特异蛋白条带，将其冻干后研成粉末与1×PBS等体积混合。

(2)ELISA检测：按常规方法进行，将纯化的目的蛋白10倍稀释后包被酶标板，用购自中国兽医药品监察所的布鲁氏菌阳性牛血清1∶100稀释作为一抗，辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG 1∶200稀释作为二抗。同时用标准阴性和标准阳性血清作对照。

(3)操作过程：用微量移液器向每个孔内加0.1mL包被液稀释的蛋白样品，置湿盒内于37℃恒温培养箱中1h，然后于4℃冰箱中包被过夜。次日，用洗涤液洗涤三次，甩去洗涤液，倒置在纱布上轻轻拍扣使孔内的液体充分流出，每次间隔3min。向孔内分别加入用稀释液稀释好的1∶100阳性血清、阴性血清0.1mL，置湿盒内于37℃恒温箱中反应1hr后，甩去血清，用同法洗涤3次，再加入稀释好的1∶200酶标记兔抗牛IgG 0.1mL，置于湿盒内于37℃恒温箱静置1hr，甩去残留的酶标记物溶液，以同法洗涤三次。加入底物溶液0.1mL，置湿盒内于37℃恒温箱中静置30min，取出后立即向孔内加入0.02mL终止液，终止反应。

(4)结果判定：将培养板放入分光光度计读取450吸收波的OD值。

5重组表达蛋白免疫鉴定结果

(I)重组表达蛋白的Western-blot分析

重组pPIC9K-Bcsp31表达产物经SDS-PAGE后转移至PVDF膜上进行免疫印迹试验，结果在31ku和55ku左右出现明显的阳性反应带，说明表达产物能被流产布鲁氏菌阳性牛血清所识别，具有免疫性。

(II)ELISA结果

用纯化的pPIC9K-Bcsp31融合蛋白作为包被抗原，进行ELISA检测。ELISA结果如表1，检测说明表达产物pPIC9K-Bcsp31具有免疫学活性。

表1pPIC9K-Bcsp31的ELISA试验结果

以上述3项试验均说明表达的bcsp31蛋白可与牛布鲁氏菌阳性血清发生很好的抗原-抗体反应，bcsp31蛋白具有免疫活性，完全可以作为流产布鲁氏菌疫苗抗原蛋白。

附：基因序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>布鲁氏菌疫苗及疫苗用抗原蛋白的制备方法

<160>2

<210>1

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cgcgaattca ccccacaggc cagaacattt ttccg         35

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gctgcggccg ctttcagcac gcccgc                   26

Claims (4)

1、布鲁氏菌疫苗，其特征在于疫苗所用的抗原蛋白为布鲁氏菌bcsp31蛋白。

2、根据权利要求1所述布鲁氏菌疫苗，其特征是疫苗所用的抗原蛋白为布鲁氏菌bcsp31重组蛋白。

3、权利要求2所述疫苗用重组抗原蛋白的制备方法，其特征是以从布鲁氏菌提取的细菌总DNA为模板，根据布鲁氏菌bcsp31基因的核苷酸全序列设计一对引物进行聚合酶链反应，克隆获得bcsp31蛋白基因，然后转入酵母表达载体中，获得重组表达载体，将重组表达载体导入酵母表达细菌中，获得重组毕赤酵母表达菌，增殖并进行诱导表达重组毕赤酵母表达菌，经分离纯化得到所用的抗原蛋白。

4、根据权利要求3所述的疫苗用重组抗原蛋白的制备方法，其特征是所用的引物序列为：

P1：5’-cgcgaattcaccccacaggccagaacatttttccg-3’(含EcoR I酶切位点)

R1：5’-gctgcggccgctttcagcacgcccgc-3’(含Not I酶切位点)。

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