CN103834667B - 化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段及其表达、应用 - Google Patents

Abstract

本发明化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段及其表达、应用涉及基因工程技术和诊断试剂领域。本发明是通过计算机分析，筛选出肺炎链球菌PspA蛋白内的强抗原表位，第33个氨基酸至第109个氨基酸，共77个氨基酸，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技术，表达该基因片段、制备肺炎链球菌PspA蛋白强抗原表位片段。表达的蛋白可用于疫苗研发、肺炎链球菌感染抗体的检测及单抗和多抗的制备。

Description

化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段及其表达、 应用

技术领域

本发明化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段及其表达、应用涉及的是一种肺炎链球菌表面蛋白A抗原片段的表达、纯化及应用，通过化学合成肺炎链球菌表面蛋白A(PspA蛋白)全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组蛋白。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位肺炎链球菌PspA蛋白的片段，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于肺炎链球菌感染抗体的检测及单克隆抗体的制备等，本发明涉及基因工程技术和检测试剂领域。

背景技术

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）简称肺炎球菌（pneumococcus）。为革兰染色阳性菌。肺炎链球菌会导致不同种类的疾病，包括有急性鼻窦炎、中耳炎、脑膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心囊炎、蜂窝组织炎及脑脓肿。

目前针对肺炎链球菌感染的主要检测方法有：细菌学分离法，酶联免疫法(ELISA)，DNA探针及PCR技术等。但这些方法或多或少都存在着实验时间长，不适合现场快速检测等缺点。近年来，免疫金标层析技术在生物医学各领域得到了广泛的应用，为肺炎链球菌的检测提供了新的思路。筛选肺炎链球菌外膜特异性抗原，并制备高纯度的特异性抗原，是建立该技术的重要前提。

肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)是肺炎链球菌重要的毒力因子，在所有临床分离的肺炎链球菌中均发现它的存在。PspA主要有五个域组成：一个信号肽，一个α螺旋区，一个脯氨酸富集区，一个胆碱结合区和一个C端尾巴。研究表明，PspA蛋白在不同血清型菌株中有广泛的同源性，但其α螺旋区存在较大的变异性。

发明内容

本发明目的是通过化学合成的截短的PspA蛋白的全新基因片段，利用基因工程技术，制备PspA蛋白高表达片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的PspA蛋白胞外区片段,第33个氨基酸－第109个 氨基酸，共77个氨基酸，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达该基因。表达的蛋白可用于肺炎链球菌感染抗体的检测或单克隆细胞株的制备。

化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段及其表达、应用是采取以下步骤实现的：

1．PspA蛋白抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：

利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析的氨基酸序列，发现PspA蛋白含有较强的抗原决定簇，选择第33个氨基酸－第109个氨基酸作为研究对象。选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5'端增加了BamHI酶切位点（下划线部分），在3'端增加了终止密码子（TAA）和EcoRI酶切位点（下划线部分），使该基因片段易于克隆至质粒pGEX4T-2内的BamHI和EcoRI酶切位点内。

筛选的PspA蛋白片段氨基酸序列（第33个aa － 第109个aa）：

化学合成的PspA基因片段的DNA 序列（246 bp）：

GGATCC GAA GCC CCG GTT GCC AGC CAA TCG AAG GCG GAA AAA GAC TAC GACGCA GCC GTG AAG AAA AGC GAA GCA GCG AAA AAA GCA TAC GAA GAA GCA AAA AAG AAAGCG GAA GAT GCC CAG AAG AAA TAC GAT GAA GAC CAA AAG AAA ACC GAA GAA AAA GCGGAA AAC GAA AAG AAA GCG GCG GCA GAC CTG AAT GAA GCG ACC GAA GTC CAT CAA AAGGCG TAT GTG CGT TAC TAACTCGAG

2．表达PspA蛋白胞外区片段重组质粒的构建:

提取质粒pGEX4T-2,用 Bam HI和EcoR I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段,溶于去离子水内。同样用BamHI和EcoR I双酶切化学合成的PspA基因片段，电泳回收后, 溶于去离子水内。

取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA 连接酶连接，使PspA基因片段插入到载体pGEX4T-2内的BamH I和EcoR I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白。

3．重组质粒的筛选与鉴定:

将重组质粒转化E. coli BL21(DE3)，涂布含氨苄青霉素(100μg／ml)LB平板，置37℃ 过夜。次日随机挑取转化菌落和1个对照菌(质粒pGEX4T-2转化菌)，分别提取质粒 ，以提取的质粒为模板，PCR扩增PspA蛋白胞外区基因片段,含PspA基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长约230 bp 的基因片段。将含有外源基因的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有合成的PspA基因片段，序列完全正确：

GAA GCC CCG GTT GCC AGC CAA TCG AAG GCG GAA AAA GAC TAC GAC GCA GCCGTG AAG AAA AGC GAA GCA GCG AAA AAA GCA TAC GAA GAA GCA AAA AAG AAA GCG GAAGAT GCC CAG AAG AAA TAC GAT GAA GAC CAA AAG AAA ACC GAA GAA AAA GCG GAA AACGAA AAG AAA GCG GCG GCA GAC CTG AAT GAA GCG ACC GAA GTC CAT CAA AAG GCG TATGTG CGT TAC TAA

构建的重组质粒表达PspA蛋白胞外区片段（77个氨基酸），在其N端融合了载体上的226个氨基酸，全长303个氨基酸,其氨基酸序列如下：

4．表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定:

将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含3ml LB培养基(含氨苄青霉素100μg／ml)的试管内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度1.0mmol/L,继续振荡培养诱导4h， 离心收集菌体进行SDS-PAGE检测,重组子表达相对分子量约为32 kDa的PspA蛋白，表达量约为30%，而对照菌pGEX4T-2无此蛋白带。

5．表达PspA蛋白的纯化:

1）表达PspA蛋白工程菌的超声裂解

将诱导表达融合蛋白的工程菌离心(8000 rpm、20 min、4℃)收菌，菌体重悬于原培养液1／10体积的裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH8.0、10 mmol/L EDTA、10 mmol/L DTT)内，冰浴超声破菌10 min，离心(8000 rpm、20 min、4℃) 收集上清，弃沉淀。收集的上清用于下一步的亲和层析纯化。

2）表达PspA蛋白的纯化

上清溶液加已经平衡的Glutathione Sepharose 4B凝胶3ml，室温结合60min,上样，收集穿透液。用十倍柱床体积的1×PBS洗涤柱子，接着用15ml高浓度的GSH洗脱液（50mmol/L Tris-HCL pH8.0 + 10 mmol/L GSH）分三次洗脱目的蛋白,即为纯化的PspA蛋白胞外区片段。

6．纯化的PspA蛋白的ELISA检测:

将初步纯化获得的融合蛋白按1：1000～1：32 000倍比稀释，并将阴性对照以同样浓度倍比稀释，检测表达蛋白的抗原性。

7. 将表达的PspA蛋白片段，用于肺炎链球菌感染抗体的检测及用于免疫制备抗PspA单抗和多抗等。

所述的化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区的基因片段序列，利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。

上述所述的方法制备的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区片段，用于肺炎链球菌感染抗体的检测及单抗和多抗的制备。

本发明与现有技术相比具有的优点

本发明表达的PspA蛋白片段，有较多优点:

1．采用基因优化技术优化目的基因以可溶性表达目的蛋白；

2．根据筛选出的PspA蛋白胞外区片段氨基酸序列，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，该基因适宜在原核细胞内高表达；

3．本发明构建的表达肺炎链球菌PspA蛋白的工程菌，表达量可达菌体蛋白的30%，易于纯化，可大量纯化制备该蛋白。目前未见表达该段蛋白的报道；

4．实验中筛选的PspA蛋白为肺炎链球菌特异性抗原，选取该抗原作为研究对象，可避免其他类似病原体对检测的干扰。

附图说明

以下将结合附图对本发明作进一步说明：

图1是分子生物学软件对PspA蛋白的抗原表位进行分析结果。结果显示，从全长第33个氨基酸到第109个氨基酸，含有强的抗原决定簇。

图2是表达PspA蛋白的重组质粒构建流程图。

图3是用1.0％的Agarose凝胶检测重组子质粒双酶切产物。M: DNA markerDL5000^TM; 1～3：3个转化子均双酶切出230bp左右的目的基因片段。

图4是表达PspA蛋白重组菌的SDS-PAGE分析结果。

M：Marker； 1～3: 1～3号重组菌,3个重组子均表达相对分子量约为32KDa的融合蛋白。

图5是表达的Flic蛋白纯化后的SDS-PAGE分析结果。M:Marker； 1~2:Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化后的的PspA蛋白，纯化获得了分子量约为32kDa的融合蛋白。

具体实施方式

本发明实施方式的详细说明：

肺炎链球菌表面蛋白A抗原抗原表位的分析、基因合成及表达

通过计算机分析肺炎链球菌PspA蛋白的全部氨基酸序列，筛选出PspA蛋白内的强抗原表位,选用细菌偏爱的密码子，化学合成PspA蛋白强抗原表位的全新基因片段。将基因片段克隆至质粒pGEX4T-2内的BamHI／EcoRI位点，与载体上的起始密码子的翻译框架一致，可表达一个融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选获得了高效表达PspA蛋白的工程菌，表达的PspA蛋白约占菌体蛋白总量的30%左右。

材料与方法

1. 菌种与质粒: E. coli BL21（DE3）及表达载体pGEX4T-2为本实验室保存。

2. 分子生物学试剂:限制性内切酶BamHI、EcoRI、及T4 DNA连接酶为TaKaRa公司产品。质粒纯化试剂盒及从琼脂糖凝胶内回收DNA片段的试剂盒为TaKaRa公司产品。DTT及IPTG为Promega公司产品。其它试剂为进口或国产分析纯试剂。

3. 基因片段的合成: 由大连TaKaRa公司帮助合成。

4. 基因克隆方法: DNA的酶切、连接、电泳；质粒的提取、转化； 蛋白的SDS-PAGE分析等一般分子克隆方法按常规方法进行。其它试剂盒按说明书进行操作。

5. DNA序列分析：用TAKARA公司质粒纯化试剂盒纯化质粒，用DNA全自动测序仪测序。

结果

1.肺炎链球菌PspA蛋白抗原表位筛选及基因片段的合成：

利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析肺炎链球菌PspA蛋白的全部氨基酸序列，筛选出肺炎链球菌PspA蛋白内的强抗原表位（图1）,即从第33个氨基酸到第109个氨基酸，其氨基酸序列如下：

根据筛选的肺炎链球菌PspA蛋白内的抗原表位氨基酸序列，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5'端增加了BamHI酶切位点（下划线部分），在3'端增加了终止密码子（TGA）和EcoRI酶切位点（下划线部分），使该基因片段易于克隆至质粒pGEX4T-2内的BamHI和EcoRI酶切位点内。化学合成的含肺炎链球菌PspA蛋白抗原表位基因的DNA 序列（246 bp）如下：

GGATCC GAA GCC CCG GTT GCC AGC CAA TCG AAG GCG GAA AAA GAC TAC GACGCA GCC GTG AAG AAA AGC GAA GCA GCG AAA AAA GCA TAC GAA GAA GCA AAA AAG AAAGCG GAA GAT GCC CAG AAG AAA TAC GAT GAA GAC CAA AAG AAA ACC GAA GAA AAA GCGGAA AAC GAA AAG AAA GCG GCG GCA GAC CTG AAT GAA GCG ACC GAA GTC CAT CAA AAGGCG TAT GTG CGT TAC TAACTCGAG

2．表达PspA蛋白胞外区片段重组质粒的构建:

提取质粒pGEX4T-2，用 Bam HI和EcoR I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段,溶于去离子水内。同样用BamHI和EcoR I双酶切化学合成的Flic蛋白胞外区基因片段，电泳回收后, 溶于去离子水内。

取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA 连接酶连接，使PspA蛋白胞外区基因片段插入到载体pGEX4T-2内的BamH I和EcoR I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白(构建流程见图2)。

3．重组质粒的筛选与鉴定:

将上步连接的重组质粒转化到E. coli BL21(DE3),将转化产物涂布含氨苄青霉素（100µg／ml）的固体LB培养基上，置37℃培养过夜。次日随机挑选2个转化子菌落（分别标记为1－2号），分别接种到含3 ml液体LB培养基（含氨苄青霉素100µg／ml）的试管内，置37℃振荡培养5h,取菌液1ml，离心收菌。使用TAKARA公司的质粒提取试剂盒提取质粒，1.0％的Agarose凝胶检测质粒提取成功后,使用限制性内切酶BamHI和XhoI在37℃水浴下双酶切质粒4h。取双酶切产物用1.0％的Agarose凝胶检测，结果，3个转化子均酶切出约230bp的目的基因片段，初步证实这3个转化子均含有PspA基因片段(见图3)。

提取1号重组子的质粒， 测定质粒内的PspA蛋白基因序列，DNA序列分析证实，重组质粒含有合成的肺炎链球菌PspA蛋白基因片段，序列完全正确：

GAA GCC CCG GTT GCC AGC CAA TCG AAG GCG GAA AAA GAC TAC GAC GCA GCCGTG AAG AAA AGC GAA GCA GCG AAA AAA GCA TAC GAA GAA GCA AAA AAG AAA GCG GAAGAT GCC CAG AAG AAA TAC GAT GAA GAC CAA AAG AAA ACC GAA GAA AAA GCG GAA AACGAA AAG AAA GCG GCG GCA GAC CTG AAT GAA GCG ACC GAA GTC CAT CAA AAG GCG TATGTG CGT TAC TAA

构建的重组质粒表达肺炎链球菌PspA蛋白片段（77个氨基酸），在其N端融合了载体上的226个氨基酸，全长303个氨基酸,其氨基酸序列如下：

4．表达PspA蛋白工程菌的筛选鉴定:

将含有重组质粒的5个阳性转化子和1个对照菌(质粒pGEX4T-2转化菌)，接种至含3ml LB培养基(含氨苄青霉素100µg／ml)的试管内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度1.0mmol/L,继续振荡培养诱4h, 离心收集菌体进行SDS-PAGE检测,重组子表达相对分子量约为32 kDa的PspA蛋白，表达量约为30%（见图4）。

表达PspA蛋白的纯化

根据表达肺炎链球菌PspA蛋白氨基酸序列，分析其理化特性，确定适当的纯化方法。我们所表达的PspA蛋白融合有载体上的GST蛋白, 表达的GST融合蛋白可很方便用GSH琼脂糖凝胶FF分离，因此我们决定采用亲和层析法，用Glutathione Sepharose 4B凝胶进行纯化。纯化获得了高纯度的PspA蛋白，具体步骤如下：

材料和方法

1.主要试剂:

Glutathione Sepharose 4B凝胶为GE Heathcare公司产品，IPTG、DTT为Promega公司产品。其它试剂为国产或进口分析纯试剂。

2.表达PspA蛋白的超声裂解:

将培养的表达PspA蛋白的工程菌离心(8000rpm,20mins,4℃),弃上清，菌体重悬于原培养液1／10体积的裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0、10mmol/L EDTA、10mmol/LDTT)内，冰浴超声破菌10mins，离心(8000rpm、20mins,4℃) 收集上清，弃沉淀。收集的上清用于下一步的亲和层析纯化。

3.表达PspA蛋白的纯化:

上清溶液加已经平衡的Glutathione Sepharose 4B凝胶3ml室温结合60min,上样，收集穿透液。用十倍柱床体积的1×PBS洗涤柱子，接着用15ml高浓度的GSH洗脱液（50mmol/L Tris-HCl pH8.0 + 10 mmol/L GSH）分三次洗脱目的蛋白,即为纯化的PspA蛋白胞外区片段。

结果

将从Glutathione Sepharose 4B 凝胶柱上洗脱的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果显示(见图5)，经诱导明显表达出PspA/GST融合蛋白,表达产物主要存在于上清液中。SDS-PAGE显示表达产物约32kDa。

蛋白免疫多抗血清的制备及纯化

纯化获得的PsaA蛋白可用于多抗血清的制备。我们使用抗原通过与佐剂联合免疫新西兰大耳白兔的方式，制备并纯化获得大量的兔抗血清，间接ELISA法检测抗体滴度。具体步骤如下：

材料和方法

1.主要试剂:

DEAE Sepharose^TMFast Flow 为GE Heathcare公司产品，完全弗式佐剂和不完全弗氏佐剂为SIGMA公司产品。其它试剂为国产或进口分析纯试剂。

2.免疫原及免疫程序

使用PsaA蛋白做为免疫原，免疫5只新西兰大耳白兔，每只白兔每次免疫100µg抗原，免疫方式为背部多点免疫。第一次免疫使用完全弗式佐剂与抗原混合，第二、三次免疫使用不完全佐剂。

3.间接ELISA法测抗血清效价

每次免疫后2周，从兔耳缘静脉取血，3000rpm离心10min获得抗血清。包被PsaA抗原，每孔1µg，4℃过夜，20%小牛血清封闭，37℃，2h，将离心获得的抗血清梯度稀释作为一抗，37℃，2h后，加二抗，1:5000稀释羊抗兔IgG，加A,B液显色并读数。

4.抗血清的获取

间接ELISA法测抗血清效价达到一定高度后，从兔颈动脉取血，4℃过夜后，3000rpm，离心10min，获得抗血清，过滤除菌，﹣20℃冻存。

5.抗血清的纯化

等体积饱和(NH₄)₂SO₄溶液与血清混匀，4℃静置1h，3000rpm离心10min，弃上清，使用0.07M Na₃PO₄溶液溶解沉淀，透析后上柱，DEAE Sepharose^TM Fast Flow 阴离子交换层析法纯化多抗。

结果

最后一次免疫后2周，采用兔颈动脉取血法取得血液80ml，4℃放置过夜后分离血清，DEAE Sepharose^TM Fast Flow 阴离子交换层析法纯化多抗作为ELISA检测中的一抗，结果显示1:250000为血清有效稀释梯度，即血清效价，如图6, 说明纯化获得的PsaA蛋白有较强的免疫原性和抗原性。

化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段序列表见附件文档：核苷酸或氨基酸序列表计算机可读载体。

Claims (4)

1.一种化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白的胞外区基因片段，该基因片段编码含强抗原表位肺炎链球菌PspA蛋白胞外区，即第33个氨基酸至第109个 氨基酸，共77个氨基酸，在该基因片段的5'端增加了BamHI酶切位点，在3'端增加了终止密码子TGA和EcoRI酶切位点，化学合成的基因序列全长246bp，序列如下：

GGATCC GAA GCC CCG GTT GCC AGC CAA TCG AAG GCG GAA AAA GAC TAC GAC GCAGCC GTG AAG AAA AGC GAA GCA GCG AAA AAA GCA TAC GAA GAA GCA AAA AAG AAA GCGGAA GAT GCC CAG AAG AAA TAC GAT GAA GAC CAA AAG AAA ACC GAA GAA AAA GCG GAAAAC GAA AAG AAA GCG GCG GCA GAC CTG AAT GAA GCG ACC GAA GTC CAT CAA AAG GCGTAT GTG CGT TAC TAACTCGAG。

2.一种制备权利要求1所述的肺炎链球菌PspA蛋白的胞外区片段方法，包括采用基因工程技术表达该基因片段，并纯化其表达的蛋白，具体步骤如下：

表达肺炎链球菌PspA蛋白胞外区基因片段重组质粒的构建:

用 Bam HI和EcoR I双酶切质粒pGEX4T-2和权利要求1所述的化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白的胞外区基因片段，电泳回收后，用T4 DNA 连接酶连接，使权利要求1所述的肺炎链球菌PspA蛋白的胞外区基因片段插入到载体pGEX4T-2内的BamH I和EcoR I位点之间，与载体上的GST蛋白的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白，全长303个氨基酸,该融合蛋白N端是载体上226个氨基酸的GST蛋白，C端是肺炎链球菌PspA蛋白的第33~109个氨基酸，融合蛋白氨基酸序列如下：

表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定:

将重组质粒转化E. coli BL21(DE3)，涂布含100μg／ml氨苄青霉素的LB平板，置37℃过夜，次日随机挑取转化菌落和含质粒pGEX4T-2的对照菌，提取质粒 ，用限制性内切酶BamHI和XhoI对质粒双酶切，1.0％的Agarose凝胶检测双酶切产物应切下约220bp的基因片段；

将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含氨苄青霉素100μg／mL 的LB培养基内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5 ～1.0 mmol/L,继续振荡培养诱导4～6h， 离心收集菌体进行SDS-PAGE检测,重组子表达相对分子量约为32kD的肺炎链球菌PspA蛋白，表达量约为30%，而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带；

表达肺炎链球菌PspA蛋白的纯化:

将诱导表达融合蛋白的工程菌离心收菌，菌体重悬于裂解液内，裂解液为50 mmol/LTris-HCl pH8.0、10 mmol/L EDTA、10 mmol/L　DTT，超声破菌10 min，离心收集上清，上清溶液加已经平衡的Glutathione Sepharose 4B凝胶3ml,室温结合60min,上样，收集穿透液；用十倍柱床体积的1×PBS洗涤柱子，接着用15ml高浓度的GSH洗脱液分三次洗脱目的蛋白,洗脱液为50 mmol/L Tris-HCl pH8.0+10 mmol/L GSH，洗脱的目的蛋白即为纯化的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区片段。

3.一种化学合成的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区的片段，其由权利要求1所述的基因片段，采用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备得到。

4.权利要求1或权利要求2所述的肺炎链球菌PspA蛋白胞外区片段用于肺炎链球菌感染抗体的检测试剂、及单抗和多抗的制备。