CN102713629A - 用于检测结核分枝杆菌感染的方法 - Google Patents

Abstract

公开了用于检测受试者中Mtb感染的方法。所述方法包括检测可特异性识别Mtb多肽的CD8⁺T细胞的存在情况。所述方法包括用于检测生物样本中CD8⁺T细胞存在情况的体外测定，和检测迟发型超敏反应的体内测定。所述方法还包括检测Mtb多肽和多核苷酸。

Description

用于检测结核分枝杆菌感染的方法

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2009年11月20日提交的美国临时申请No.61/263,206的优先权，所述临时申请在此以全文引用方式纳入本文。

技术领域

本申请涉及免疫学领域，具体来说涉及用于检测受试者中结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）(Mtb)感染的方法。

政府资助的陈述

本发明在国立卫生研究院（National Institutes of Health）授予的基金No.HSSN266200400081C的美国政府支助下完成。美国政府在本发明中享有某些权利。

背景技术

分枝杆菌是好氧的细胞内细菌生物类属，其在感染宿主后存活在单核细胞和巨噬细胞的内体区室（endosomal compartment）中。人类分枝杆菌疾病包括结核病（由结核分枝杆菌（M.tuberculosis）引起）、麻疯病（由麻疯分枝杆菌（M.leprae）引起）、Bairnsdale溃疡病(由溃疡分枝杆菌（M.ulcerans）引起)和由海分枝杆菌（M.marinum）、堪萨斯分枝杆菌（M.kansasii）、瘰疬分枝杆菌（M.scrofulaceum）、苏尔加分枝杆菌（M.szulgai）、蟾蜍分枝杆菌（M.xenopi）、偶发分枝杆菌（M.fortuitum）、龟分枝杆菌（M.chelonae）、嗜血分枝杆菌（M.haemophilum）和胞内分枝杆菌（M.intracellulare）引起的多种感染(参见Wolinsky,E.,Chapter 37in Microbiology:IncludingImmunology and Molecular Genetics,3rd Ed.,Harper&Row,Philadelphia,1980)。

世界人口的三分之一带有结核分枝杆菌，处于患结核病（TB）的风险中。在免疫应答受损的患者中，结核病几乎以对数速率增加，并且出现了多重耐药菌株。另外，以前被认为是非病原性菌株的分枝杆菌菌株（例如鸟分枝杆菌（M.avium））现在已变成免疫抑制的AIDS患者的主要杀手。此外，目前的分枝杆菌疫苗不够好（例如用于结核分枝杆菌的BCG疫苗）或尚不存在（例如对于麻疯分枝杆菌）(Kaufmann,S.，Microbiol.Sci.4:324-328,1987;美国国会技术评估办公室（U.S.Congress,Office of Technology Assessment）,TheContinuing Challenge of Tuberculosis,pp.62-67,OTA-H-574,美国政府印刷办公室（U.S.Government Printing Office）,Washington,D.C.,1993)。

抑制结核病的传播需要有效的免疫接种和准确、早期诊断该疾病。目前，使用活细菌的免疫接种是诱导保护性免疫的最有效的办法。用于该目的的最常用分枝杆菌是卡介苗（BCG），这是牛型分枝杆菌（Mycobacterium bovis）的无致病性菌株。但是，BCG的安全性和功效存在争议，并且某些国家例如美国不对普通公众预防接种。

结核分枝杆菌(Mtb)特异性的CD4⁺和CD8⁺T细胞对于有效控制Mtb感染是关键性的。在小鼠模型中，将CD4⁺T细胞被动转移至亚致死剂量辐照的动物体内使得它们对Mtb感染的敏感性降低(Orme,J.Immunol.140:3589–3593,1988)。CD4(CD4^-/-)基因或II类MHC分子被破坏的小鼠或不含CD4⁺T细胞的野生型小鼠显示出对Mtb感染的敏感性增加(Flory et al.,J.Leukoc.Biol.51:225–229,1992)。在人体内，人免疫缺陷病毒感染的个体暴露至Mtb后特别容易发生结核病，这显示了CD4⁺T细胞的重要作用(Hirschet at al,J.Infect.Dis.180:2069–2073,1999)。CD8⁺T细胞对T细胞免疫也有重要作用(见Lazarevic and Flynn,Am.J.Respir.Crit.Care Med.166:1116–1121,2002)。在人体内，已经在Mtb感染个体中鉴定了Mtb特异性CD8⁺T细胞，并且包括经典的HLA-Ia限定的CD8⁺T细胞(见，例如Lewinsohn et al.,J.Immunol.165:925–930,2000)和非经典的HLA-Ib分子HLA-E限定的CD8⁺T细胞(Lewinsohn et al.,J.Exp.Med.187:1633–1640,1998)。但是，没有能够有效诱导对Mtb免疫应答例如CD8应答的疫苗或治疗对策。

结核病的诊断通常用皮试实现，其涉及对结核菌素PPD（蛋白纯化衍生物）的皮内暴露。在注射后48至72小时，抗原特异性的T细胞应答在注射位点处产生可测量的硬结，其表示暴露于分枝杆菌抗原。但是，该测试的灵敏度和特异性不理想；用BCG免疫接种的个体不能与被感染的个体区分开。此外，它非常难以诊断儿童TB，因为在大多数情况下来自儿童的Mtb不能被培养。在儿童和成年人中，延迟和错误诊断均会导致发病率和死亡率增加。

发明内容

因此，本领域需要改进的检测结核病的诊断方法。

本文公开了诊断Mtb感染的方法。所述方法包括检测特异性结合目标Mtb多肽的CD8⁺T细胞和/或CD4⁺T细胞。所述方法还包括检测受试者中迟发型超敏反应和/或检测特异性Mtb多肽和多核苷酸。公开的测定法可以单独使用或组合使用。所述Mtb感染可以是潜伏性或活动性感染。

在几个实施方案中，提供了检测受试者中结核分枝杆菌的方法。所述方法包括使含有T细胞例如CD8⁺T细胞和/或CD4⁺T细胞的来自受试者的生物样本与一种或多种分枝杆菌多肽或者呈递所述一种或多种分枝杆菌多肽的抗原呈递细胞(APC)接触。所述一种或多种分枝杆菌多肽包括下列所显示的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所显示的氨基酸序列之一，或(b)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所显示的氨基酸序列的至少一个的至少9至20个连续的氨基酸，其中所述9至20个连续的氨基酸特异性结合I类主要组织相容性复合物(MHC)。然后确定所述T细胞是否可特异性识别所述分枝杆菌多肽。

在其他实施方案中，提供了检测受试者中结核分枝杆菌的方法，其中所述方法包括将有效量的分枝杆菌多肽给药至受试者皮肤、皮下或皮内。所述分枝杆菌多肽包括下列所显示的氨基酸序列：(a)SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所显示的氨基酸序列之一；或(b)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所显示的氨基酸序列的至少一个的至少9至20个连续的氨基酸，其中所述9至20个氨基酸特异结合到I类主要组织相容性复合物(MHC)。在一些实例中，所述多肽包括所述多肽的保守的变体(例如，一个或多个保守的氨基酸置换)。然后在所述受试者中检测特异性识别所述分枝杆菌多肽的T细胞的存在情况。

在另外的实施方案中，公开了检测受试者中结核分枝杆菌感染的方法，其中所述方法包括检测来自受试者的样本中分枝杆菌多肽或编码所述多肽的多核苷酸的存在情况。所述分枝杆菌多肽包括下列所显示的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所显示的氨基酸序列之一。

此外，描述了用于检测受试者中分枝杆菌感染的试剂。

从下面参考附图进行的详细描述中，上述以及其他特点将变得更加明显。

附图说明

图1A是显示具有潜伏性或活动性TB的个体中所示出抗原的ELISPOT测定中阳性样本百分比的两幅柱形图。

图1B是显示所述ELISPOT测定中每种抗原的斑点形成单位(SFU)的两幅图。所述抗原见表2。

图2A是显示具有潜伏性或活动性TB个体中通过CD8ELISPOT测定得到的所选5种抗原的阳性样本百分比的柱形图。

图2B是显示通过ELISPOT分析得到的SFU/250,000CD4/CD56耗尽的PBMC的图。对于每种抗原，“L”代表具有潜伏性TB感染的个体，“A”代表具有活动性TB感染的个体。

图3是显示ELISPOT测定中每种抗原的SFU的图。

图4是显示覆盖Rv3136中氨基酸137-151的肽的SFU的图。

序列表

本文及所附的序列表中列出的核酸和氨基酸序列用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的单字母编码来显示。每个核酸序列只显示了一条链，但是应该理解任何提及所显示的链均包含了互补链。

所述序列表是以序列表.txt文件名的形式作为ASCII文本文件提交的，该文件于2010年10月29日创建，文件大小为117kb，其在此以引用方式纳入本文。

SEQ ID NO:1-18是Mtb多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:19-36是编码Mtb多肽的多核苷酸的核酸序列。

具体实施方式

本文公开了用于检测受试者中Mtb感染的方法。所述方法包括检测T细胞，例如但不限于特异性识别Mtb多肽的CD8⁺T细胞，的存在情况。所述方法包括用于检测生物样本中CD8⁺T细胞存在情况的体外测定法，并且包括检测迟发型超敏反应的体内测定法。所述方法还可以包括检测Mtb多肽和多核苷酸的方法。还公开了用于检测Mtb感染的试剂。

I.缩略词

APC:抗原呈递细胞

BCG:卡介苗

DC:树突状细胞

HLA:人白细胞抗原

IFN-γ:γ干扰素

MHC:主要组织相容性复合体

Mtb:结核分枝杆菌

TB:结核病

II.术语

除非另有说明，否则技术术语按照常规用法使用。分子生物学常见术语的定义可见于Benjamin Lewin,Genes V，published by OxfordUniversity Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by BlackwellScience Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)和Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。

为了便于阅览本公开的各种实施方案，提供了下列具体术语的解释：

扩增：增加样本中核酸分子(例如DNA或RNA分子)拷贝数的技术的应用。扩增的实例是聚合酶链式反应，其中将从受试者中收集的生物样本与寡核苷酸引物对在允许引物与样本中的核酸模板杂交的条件下相接触。引物在适合的条件下延伸、与模板解离、然后再次退火、延伸和解离，以扩增核酸的拷贝数。扩增的产物可以使用标准技术通过电泳、限制性内切酶切割模式、寡核苷酸杂交或连接、和/或核酸测序来表征。扩增的其他实例包括如在美国专利No.5,744,311中公开的链置换扩增、在美国专利No.6,033,881中公开的无转录等温扩增。在WO 90/01069中公开的修复链反应扩增、在EP-A-320308中公开的链接酶链反应扩增、在美国专利No.5,427,930中公开的间隙填补连接酶链反应扩增以及在美国专利No.6,025,134中公开的NASBA^TM RNA无转录扩增。

动物：活的多细胞脊椎生物，该类别包括例如哺乳动物和鸟类。术语哺乳动物包括人和非人哺乳动物两者。类似地，术语“受试者”包括人和兽受试者两者。

抗体：免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有与抗原例如Mtb多肽特异性结合（发生免疫反应）的抗原结合位点的分子。

天然存在的抗体（例如IgG、IgM、IgD）包括四条多肽链，通过二硫键互相连接的两条重链（H）和两条轻链（L）。但是，已经显示，抗体的抗原结合功能可以由天然存在的抗体的片段来执行。因此，这些抗原结合片段也意图被术语“抗体”来命名。术语抗体所涵盖的结合片段的具体的、非限制性的实例包括(i)由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域构成的Fab片段；(ii)由V_H和C_H1结构域构成的F_d片段；(iii)由抗体的单臂的V_L和V_H结构域构成的Fv片段；(iv)由V_H结构域构成的dAb片段(Ward et al.,Nature 341:544-546,1989)；(v)分离的互补性决定区(CDR)；以及(vi)F(ab')₂片段，包含在铰链区由二硫键相连的两个Fab片段的二价片段。

免疫球蛋白及其某些变体是已知的，并有许多已经在重组细胞培养物中制备（参见例如美国专利No.4,745,055和美国专利No.4,444,487；WO 88/03565；EP 256,654；EP 120,694；EP 125,023；Falkneret al.,Nature 298:286,1982;Morrison,J.Immunol.123:793,1979；Morrison et al.,Ann.Rev.Immunol.2:239,1984）。

抗原：能够在动物中刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括注射到或吸收到动物中的组合物。抗原与特异性体液或细胞免疫产物的反应，包括与由异源免疫诱导的产物的反应。术语“抗原”包括了所有的抗原性表位。“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上B和/或T细胞对其应答的位点。在一个实施方案中，当表位与MHC分子一起出现时，T细胞对所述表位应答。表位可以由连续的氨基酸或通过蛋白质的三级折叠而并置的不连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂后通常得以保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理后通常消失。表位通常包含至少3个、更通常至少5个、约9个或约8-10个处于独特空间构象中的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x-射线晶体学和二维核磁共振。

抗原可以是组织特异性抗原或疾病特异性抗原。这些术语不是排他性的，因为组织特异性抗原也可以是疾病特异性抗原。组织特异性抗原在为数有限的组织中表达，例如单一组织。组织特异性抗原可以被多于一种组织表达，例如但不限于在多于一种的生殖组织中例如在前列腺和子宫组织两者中表达的抗原。疾病特异性抗原的表达与疾病过程同步。疾病特异性抗原的具体的非限制性的实例是其表达与结核病相关或预示结核病的抗原。疾病特异性抗原可以是被T细胞或B细胞识别的抗原。

抗原呈递细胞(APC):能够向T细胞呈递抗原以便活化T细胞的细胞。树突状细胞(DC)是参与初次免疫应答的主要抗原呈递细胞。它们的主要功能是获得组织中的抗原、向淋巴器官迁移并呈递抗原，以便活化T细胞。

当接收到适合的成熟指令时，树突状细胞接受信号以经历快速的形态和生理变化，促进免疫应答的启动和发展。其中包括上调参与抗原呈递的分子，产生对于生成Th1应答关键的促炎性细胞因子、包括IL-12；以及分泌帮助驱动周围幼稚Th细胞分化、扩增和迁移的趋化因子。总起来说，这些上调的分子促进了树突状细胞协调最终为宿主提供保护的其他周围淋巴细胞的活化和效应子功能的能力。

cDNA(互补DNA)：一段缺少内部非编码区段（内含子）和决定转录的调控序列的DNA。cDNA在实验室中通过从细胞提取的信使RNA的反转录来合成。

CD4:分化因子簇4，介导与II类MHC分子相互作用的T细胞表面蛋白。在HIV感染期间，CD4也作为HIV在T细胞上的主要受体位点。表达CD4的细胞通常是辅助性T细胞。

CD8:分化因子簇8，介导与I类MHC分子相互作用的T细胞表面蛋白。表达CD8的细胞通常是细胞毒性T细胞。“CD8⁺T细胞介导的免疫应答”是通过向CD8⁺T细胞呈递抗原而实现的免疫应答。

保守变体：氨基酸残基被置换为具有相似生化性质的另外的氨基酸残基。“保守”氨基酸置换是基本上不影响或降低分枝杆菌多肽的活性或抗原性的置换。肽可以包括一个或多个氨基酸置换，例如1-10个保守置换、2-5个保守置换、4-9个保守置换，例如1、2、5或10个保守置换。保守置换的具体的、非限制性的实例包括下述实例（表1）：

表1.示例性保守氨基酸置换

原始氨基酸	保守置换
		Ala	Ser
Arg	Lys
		Asn	Gln,His
Asp	Glu
		Cys	Ser
Gln	Asn

原始氨基酸	保守置换
		Glu	Asp
His	Asn;Gln
		Ile	Leu,Val
Leu	Ile;Val
		Lys	Arg;Gln;Glu
Met	Leu;Ile
		Phe	Met;Leu;Tyr
Ser	Thr
		Thr	Ser
Trp	Tyr
		Tyr	Trp;Phe
Val	Ile;Leu

术语保守变异还包括使用置换的氨基酸代替未置换的亲本氨基酸，条件是针对置换的多肽产生的抗体也与未置换的多肽发生免疫反应，或针对置换的多肽产生的免疫应答与针对未置换多肽例如分枝杆菌抗原的免疫应答相似。因此，在一个实施方案中，非保守置换是降低活性或抗原性的置换。

基本上由……构成/由……构成：对于多肽来说，是指如果没有包含任何其他氨基酸残基的话，所述多肽基本上由指定的氨基酸序列组成。但是，多肽可以包含其他非肽类组分，如标记物（例如荧光、放射活性或固体粒子标记物）、糖类或酯类。由指定氨基酸序列构成的多肽不包含任何其他氨基酸残基，也不包含其他非肽类组分例如酯类、糖类或标记物。

接触：将一种试剂在存在另一种试剂的情况下进行孵育的过程。因此，当细胞与试剂接触时，所述细胞与所述试剂孵育一段足以使所述试剂与所述细胞相互作用的时间。

简并变体：编码Mtb多肽表位的多核苷酸，其包含由于遗传密码的原因简并的序列。存在20种天然的氨基酸，其大部分由一种以上密码子指定。因此，所有简并的核苷酸序列，只要有所述核苷酸序列编码的Mtb多肽的氨基酸序列不变，都包含在本公开中。

树突状细胞(DC):树突状细胞是参与初次免疫应答的主要抗原呈递细胞。树突状细胞包括浆细胞样树突状细胞和髓样树突状细胞。其主要功能是获得组织中的抗原、向淋巴器官迁移、呈递抗原以活化T细胞。未成熟的树突状细胞在骨髓中产生，并作为未成熟细胞驻留在外周。

诊断：鉴定病理状况例如但不限于结核病的存在情况和性质。诊断方法在其灵敏度和特异性方面不同。诊断测定的“灵敏度”是测试为阳性的患病个体的百分率（真阳性的百分率）。诊断测定的“特异性”是1减去假阳性率，其中假阳性率被定义为测试为阳性但未患病的个体的比例。尽管具体的诊断方法可能不会提供病症的决定性诊断，但是如果所述方法提供了有助于诊断的阳性指示就已足够。“预后”是指预测病理状况例如结核病发展（例如严重程度）的可能性。

展示(displaying)：将肽-抗原复合体或肽定位于细胞外表面上的过程，其中所述肽-抗原复合体或肽可以被第二细胞、由第二细胞展示的分子或可溶性因子接近。肽或肽-抗原复合体，当存在于细胞外表面上并可以被第二细胞、由第二细胞展示的分子或可溶性因子接近时，即是被细胞“展示”。

表位：抗原决定簇。它们是具有抗原性例如引发特异性免疫应答的分子上的特定化学基团或肽序列。抗体特异性结合多肽例如分枝杆菌多肽上的具体抗原性表位。

表达控制序列：调控与其可操作连接的异源核酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列控制并调节核酸序列的转录以及在适当情况下的翻译时，表达控制序列与所述核酸序列可操作连接。因此，表达控制序列可以包括合适的启动子、增强子、转录终止子、蛋白编码基因前面的起始密码子(例如ATG)、维持所述基因的正确阅读框以允许mRNA的正确翻译的内含子的剪接信号和终止密码子。术语“控制序列”意图至少包含其存在能够影响表达的组分，并且可以包括其存在有利的其他组分，例如前导序列和融合配偶体序列。表达控制序列可以包括启动子。

启动子是足以指导转录的最小序列。还包括足以使启动子依赖性基因的表达受到细胞类型特异性、组织特异性的控制或可被外部信号或因子诱导的那些启动子元件；这些元件可以位于基因的5'或3'区域中。包括了组成型启动子和诱导性启动子两种(见例如Bitter et al.,Meth.Enzymol.153:516-544,1987)。例如，当克隆到细菌体系中时，可以使用诱导型启动子例如λ噬菌体的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等。在一个实施方案中，当克隆进入哺乳动物细胞体系时，可以使用源自哺乳动物细胞基因组的启动子（例如金属硫蛋白启动子）或源自哺乳动物病毒的启动子（例如反转录病毒长末端重复序列；腺病毒晚期启动子、疫苗病毒7.5K启动子）。也可以通过重组DNA或合成技术产生的启动子来提供核酸序列的转录。在一个实施方案中，所述启动子是巨噬细胞启动子。

功能上等价：产生与本文所述相同结果的序列变化，例如抗原表位中的序列变化。这样的序列变化包括但不限于保守置换、缺失、突变、移码和插入。

异源的：源自不同的遗传来源或物种。与Mtb多肽异源的多肽来自不编码Mtb多肽或另外的Mtb多肽的核酸。在一个具体的、非限制性的实例中，多肽包括来自Mtb多肽的9个连续氨基酸或来自Mtb多肽的最多20个连续氨基酸，并且异源氨基酸序列包括β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、白蛋白、乙型肝炎表面抗原或免疫球蛋白氨基酸序列。一般来说，与目标蛋白特异性结合的抗体将不会与异源蛋白特异性结合。

宿主细胞：载体可以在其中增殖并且其DNA可以在其中表达的细胞。细胞可以是原核或真核的。细胞可以是哺乳动物、例如人的细胞。该术语还包括受试宿主细胞的任何后代。应该理解，可能并不是所有后代都与亲代细胞一致，因为在复制期间可能发生突变。但是，当使用术语“宿主细胞”时也包含这些后代。

人白细胞抗原(HLA):人主要组织相容性复合物（MHC）的遗传学命名。单个基因座由大写字母表示，例如HLA-E，等位基因用数字表示，例如HLA-A*0201。三种主要的I类MHC基因称为HLA-A、HLA-B和HLA-C。但是，有许多基因编码与I类MHC基因连锁的β2微球蛋白相关细胞表面分子。这些基因的表达在组织分布和细胞上的表达量方面是可变的；这些基因被称为IB类MHC基因。

免疫应答：免疫系统的细胞例如B细胞、自然杀伤细胞或T细胞对刺激的应答。在一个实施方案中，应答对具体抗原是特异性的（“抗原特异性应答”）。在一个实施方案中，免疫应答是T细胞应答，例如Th1、Th2或Th3应答。在另一个实施方案中，免疫应答是抑制性T细胞应答。

免疫原性组合物：包含有效量的免疫原性Mtb多肽或编码所述免疫原性Mtb多肽的核酸的组合物，其中诱导针对Mtb的可测量的T细胞应答，例如CD8⁺T细胞应答，或诱导可测量的B细胞应答（例如生产特异性结合Mtb多肽的抗体）。对于体外应用来说，免疫原性组合物可以由所述分离的核酸、包含所述核酸的载体/或免疫原性肽组成。对于体内应用来说，免疫原性组合物通常包含在可药用载体中的所述核酸、含有所述核酸的载体和/或免疫原性多肽，和/或其他试剂。免疫原性组合物可以任选包括佐剂、共刺激分子或编码共刺激分子的核酸。可以容易地测试Mtb多肽或编码多肽的核酸诱导CD8⁺T细胞应答的能力。

免疫原性肽：肽包含等位基因特异性基序或其他序列，使得所述肽与MHC分子结合，并诱导针对产生免疫原性肽的抗原的T细胞应答，例如CD8⁺或CD4⁺T细胞应答，或B细胞应答（例如抗体产生）。

在一个实施方案中，免疫原性肽使用序列基序或本领域已知的其他方法例如神经网络或多项式确定来鉴定。典型地，使用算法确定肽的“结合阈值”，以选择出其得分使得它们具有以确定的亲和性结合的高度可能性并将是免疫原性的那些肽。所述算法是基于对MHC与特定位置的特定氨基酸结合的影响、对抗体与特定位置的特定氨基酸结合的影响、或对含有基序的肽中特定置换的结合的影响。在免疫原性肽的情形中，“保守残基”是指在肽中特定位置上出现频率显著高于随机分布预期频率的残基。在一个实施方案中，所述保守残基是MHC结构中可以提供与免疫原性肽接触点的残基。

免疫原性肽也可以通过测量它们与特定MHC蛋白的结合以及通过它们在MHC蛋白存在时刺激CD4和/或CD8的能力进行鉴定。在一个实例中，免疫原性“Mtb肽”是来自Mtb蛋白的一系列连续的氨基酸残基，一般长度在9和20个氨基酸之间，例如长度约为8至11个氨基酸。

一般来说，免疫原性Mtb多肽可以用于在受试者中诱导免疫应答，例如B细胞应答或T细胞应答。在一个实例中，免疫原性Mtb多肽当与I类MHC分子结合时，能够活化针对Mtb的CD8⁺T细胞，例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。使用合成肽诱导CTL以及CTL细胞毒性测定是本领域已知的(见美国专利5,662,907，其以引用的方式纳入本文)。在一个实例中，所述免疫原性肽包括等位基因特异性基序或其他序列，使得所述肽结合MHC分子并诱导针对产生免疫原性肽的抗原的CD8⁺应答。特异性识别Mtb多肽的CD8⁺T细胞被活化、增殖和/或分泌细胞因子，这是针对所述具体多肽，而不是对其他不相关多肽作出的响应。

γ干扰素(IFN-γ):IFN-γ是二聚体蛋白，其亚基具有146个氨基酸。该蛋白在两个位点处被糖基化，pI为8.3-8.5。IFN-γ作为166个氨基酸的前体蛋白被合成，其包含23个氨基酸的分泌信号序列。已经描述了20kDa和25kDa的两种分子形式的生物活性蛋白。它们二者都在25位被糖基化。所述25kDa的分子形式还在97位被糖基化。天然IFN-γ在分子量和电荷方面观察到的差异是由于可变的糖基化模式。在非变性条件下观测到的40-60kDa形式是IFN-γ的二聚体和四聚体。人基因具有约6kb的长度。它包含四个外显子，映射于染色体12q24.1。

IFN-γ可以通过灵敏的免疫测定法检测，例如允许检测产生IFN-γ的个体细胞的ELSA测试。少量的IFN-γ可以通过测量IFN诱导的蛋白例如Mx蛋白间接检测。IP-10合成的诱导也可以用于测量IFN-γ的浓度。此外，生物测定可以用于检测IFN-γ，例如利用在2D9细胞中诱导吲哚胺2,3-双加氧酶活性的测定法。IFN-γ的产生可以用于评估T细胞活化，例如T细胞被分枝杆菌抗原活化。

分离的：“分离的”生物组分（例如核酸分子、蛋白质或细胞器）已经与天然产生该组分的生物体细胞中其他生物组分基本上分离开或纯化出来，所述其他生物组分例如其他的染色体的或染色体外的DNA和RNA、蛋白质和细胞器。已经“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸、蛋白质或其片段。

标记物：与另一个分子直接或间接缀合以便于该分子检测的可检测化合物或组合物。标记物的具体的、非限制性的实例包括荧光标签、酶连接物和放射性同位素。

接头序列：接头序列是共价连接到两个多肽结构域的氨基酸序列。所述接头序列可以包含在本文公开的Mtb表位之间，为所连接的多肽结构域提供旋转的自由度，并由此促进适合的结构域的折叠和向MHC的呈递。例如，在含有两个Mtb结构域的重组多肽中，接头序列可以提供在它们之间，例如含有Mtb多肽-接头-Mtb多肽的多肽。接头序列长度一般介于2和25个氨基酸之间，其在本领域是公知的，包括但不限于Chaudhary et al.,Nature 339:394-397,1989中所述的甘氨酸(4)-丝氨酸间隔物(GGGGS×3)。

淋巴细胞：参与身体免疫防御的一类白细胞。有两种主要类型的淋巴细胞：B细胞和T细胞。

分枝杆菌：好氧的细胞内细菌生物属。在感染宿主后，这些生物体存活在单核细胞和巨噬细胞的内体区室中。人分枝杆菌疾病包括结核病（由结核分枝杆菌（M.tuberculosis）引起）、麻风病（由麻疯分枝杆菌（M.leprae）引起）、Bairnsdale溃疡病（由溃疡分枝杆菌（M.ulcerans）引起）和由海分枝杆菌（M.marinum）、堪萨斯分枝杆菌（M.kansasii）、瘰疬分枝杆菌（M.scrofulaceum）、苏尔加分枝杆菌（M.szulgai）、蟾蜍分枝杆菌（M.xenopi）、偶发分枝杆菌（M.fortuitum）、嗜血分枝杆菌（M.haemophilum）、龟分枝杆菌（M.chelonei）、胞内分枝杆菌（M.intracelluare）引起的其他感染。以前被认为非致病性的分枝杆菌菌株（例如鸟分枝杆菌（M.avium））现在也已知道是免疫抑制的AIDS患者的主要杀手。

针对分枝杆菌的主要应答涉及细胞介导的超敏（DTH）反应，其中T细胞和巨噬细胞在细胞内杀死和隔开（或包入）生物体（肉芽肿形成）中发挥重要作用。主要的T细胞应答涉及识别分枝杆菌热休克蛋白和免疫显性抗原的CD4⁺淋巴细胞。

可操作连接：当第一核酸序列被置于与第二核酸序列在功能上关联时，所述第一核酸序列即与所述第二核酸序列可操作连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录和表达，则启动子与编码序列是可操作连接。一般来说，可操作连接的DNA序列是连续的，在需要连接两个蛋白编码区的情况下开放阅读框是对齐的。

ORF（开放阅读框）:不含有任何终止密码子的编码氨基酸的一系列核苷酸三联体（密码子）。这些序列通常可以翻译成多肽。

肽修饰：分枝杆菌多肽包括本文所述的肽的合成实施方案。此外，在本文所述的方法中可以利用这些蛋白的类似物（非肽有机分子）、衍生物（从所公开的肽序列开始，获得的化学功能化的肽分子）和变体（同源物）。本发明的每个多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸可以是天然存在或非天然存在的L-氨基酸和/或D-氨基酸。

肽可以通过多种化学技术进行修饰，以产生具有与未修饰肽基本上相同的活性并任选具有其他所需性质的衍生物。例如，蛋白的羧酸基团，不论是羧基末端还是侧链上的，都可以以可药用阳离子盐的形式提供，或者酯化形成C₁-C₁₆酯，或者转化成式NR₁R₂的酰胺，其中R₁和R₂分别独立地是H或C₁-C₁₆烷，或组合成杂环例如5元环或6元环。肽的氨基基团，不论是氨基末端还是侧链上的，都可以采用可药用酸加成盐的形式，例如盐酸盐、溴酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、甲苯磺酸盐、马来酸盐、酒石酸盐和其他有机酸的盐，或者可以修饰成C₁-C₁₆烷基或二烷基氨基或进一步转化成酰胺。

肽侧链的羟基可以使用公知的技术转化成C₁-C₁₆烷氧基或C₁-C₁₆酯。肽侧链的苯环和酚环可以用一个或多个卤素原子例如氟、氯、溴、碘或用C₁-C₁₆烷基、C₁-C₁₆烷氧基、羧酸及其酯或这些羧酸的酰胺取代。肽侧链的亚甲基可以延长成同源的C₂-C₄亚烷基。硫醇可以用多种公知的保护基团中的任一种例如乙酰胺基团进行保护。本领域技术人员还将知道用于将环状结构导入本发明的肽中的方法，以便为结构选择和提供多构象限制，产生增加的稳定性。

设想了肽模拟物和有机模拟物的实施方案，由此使这些肽模拟物和有机模拟物的化学组成组分的三维排列模拟骨架和组分氨基酸侧链的三维排列，导致分枝杆菌多肽的这些肽模拟物和有机模拟物具有可测量到的或增强的产生免疫应答的能力。对于计算机模拟应用来说，药效团是理想化的对生物活性的结构要求的三维定义。可以使用现有的计算机模拟软件（使用计算机辅助药物设计或CADD），将肽模拟物和有机模拟物设计成适合每个药效团。对于在CADD中所用技术的描述，参见Walters,“Computer-Assisted Modeling of Drugs,”inKlegerman&Groves,eds.,1993,Pharmaceutical Biotechnology,Interpharm Press,Buffalo Grove,IL,pp.165-174和Principles ofPharmacology Munson(ed.)1995,第102章。还包括了使用这些技术制备的模拟物。

多核苷酸：线性核苷酸序列，其包括长度超过100个核苷酸碱基的序列。

多肽：任何氨基酸链，无关长度或翻译后修饰（例如糖基化或磷酸化）。“肽”是长度小于100个氨基酸的氨基酸链。在一个实施方案中，“肽”是多肽的一部分，例如长度超过100个氨基酸的多肽中的约8-11、9-12或约10、20、30、40、50或100个连续的氨基酸。

探针和引物：核酸探针和引物可以在本发明提供的核酸的基础上很容易地制备。探针包含与可检测标记物或报告分子相连的分离核酸。典型的标记物包括放射性同位素、配体、化学发光剂和酶。用于标记的方法和选择适合于多种目的的标记物的指导，在例如Sambrook et al.(1989)和Ausubel et al.(1987)中进行了讨论。

引物是短的核酸，优选长度为15个核苷酸或更长的DNA寡核苷酸。引物可以通过核酸杂交与互补的靶DNA链退火，以在引物与靶DNA之间形成杂交体，然后由DNA聚合酶沿着靶DNA延伸。通过例如聚合酶链式反应（PCR）或其他本领域已知的核酸扩增方法，可以使用引物对扩增核酸序列。

用于制备和使用探针和引物的方法，在例如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第二版,vol.1-3,ed.Sambrook et al.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989和CurrentProtocols in Molecular Biology,ed.Ausubel et al.,Greene Publishingand Wiley-Interscience,New York,1987(定期更新)中有所描述。PCR引物对可以来自已知的序列，例如通过使用用于此目的的计算机程序，例如Primer3(0.4.0版,Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,MA)。

启动子：启动子是指指导核酸转录的一系列核酸控制序列。启动子包括靠近转录起始点的必需核酸序列，例如对于II型聚合酶启动子所述必需核酸序列是TATA元件。启动子还任选包括远处的增强子或遏制子(repressor)元件，其可以位于距离转录起始点多达几千碱基对的位置。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。启动子的具体的、非限制性的实例是HCMV IE启动子。

纯化的：术语纯化的不需要绝对纯，而是意图用作相对的术语。因此，例如纯化的抗原制备物是其中所述抗原比该蛋白在细胞中其原始环境下的纯度更高的制备物。抗原制备物通常被纯化，以使抗原占所述制备物中总蛋白含量的至少50%。但是，在一些应用中可能需要更高度纯化的制备物。例如，对于这样的应用来说，可以使用其中抗原占总蛋白含量的至少75%或至少90%的制备物。

重组的：重组的核酸或多肽是指具有非天然存在的序列或通过对两个或多个原本分离的序列片段进行人工组合制造的序列的核酸或多肽。所述人工组合通常通过化学合成或更常见通过对分离的核酸区段进行人工操作例如通过遗传工程技术实现。

序列同一性：氨基酸序列之间的相似性根据序列之间的相似性表示，也被称为序列同一性。序列同一性通常根据百分比同一性（或相似性或同源性）来度量；百分比越高，两个序列越相似。当用标准方法进行比对时，抗原多肽的变体将具有相对高的序列同一性。

比对序列以进行比较的方法是本领域公知的。Altschul等(1994)提出了对序列比对方法和同源性计算详细的考虑。NCBI的基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul et al.,1990)可以从几个来源获得，包括国家生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD)和互联网上，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。它可以在NCBI网站上访问。对于如何应用该程序确定序列同一性的描述可从NCBI网站获得，缺省参数也是如此。

使用NCBI Blast 2.0，带间隙的blastp设置为缺省参数时，抗原性多肽例如分枝杆菌多肽的变体的典型特点为与天然抗原序列的氨基酸序列的全长比对范围内，具有至少50%的序列同一性。当使用该方法进行评估时，与参比序列具有甚至更高相似性的蛋白将显示出增加的百分比同一性，例如至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性。当对少于整个序列进行序列同一性比较时，变体一般在10-20个氨基酸的短窗口内具有至少75%序列同一性，并且取决于它们与参比序列的相似性，可能具有至少85%、或至少90%或95%的序列同一性。用于确定这种短窗口的序列同一性的方法在NCBI网站上有描述。

转导和转化：当病毒或载体将核酸转移到细胞中时，它“转导”细胞。当通过将核酸整合进入细胞基因组或通过游离型复制使DNA变得在细胞中稳定地复制时，细胞被转导到该细胞中的核酸“转化”。在本文中使用时，术语转化包含所有可以将核酸分子导入这种细胞的技术，包括病毒载体转染、用质粒载体转化、和通过电穿孔、脂转染和粒子枪加速来导入裸露的DNA。

结核病(TB):一般由通常感染肺部的结核分枝杆菌引起的疾病。但是，其他“非典型”分枝杆菌例如堪萨斯分枝杆菌（M.kansasii）可能产生疾病的类似临床和病理表现。

结核分枝杆菌的传播通过在通风不良的封闭区域中的空气途径进行。在超过90%的病例中，结核分枝杆菌感染后，免疫系统阻止通常被称为活动性结核病的由结核分枝杆菌引起的疾病的发展。但是，不是所有的结核分枝杆菌都被杀死，并进而形成小而硬的囊。“原发性结核病”是在最初感染后发生的疾病，常见于儿童。感染的初始病灶是胸膜下的小肉芽肿，伴有肉芽肿性肺门淋巴结感染。这些合在一起构成了Ghon综合征。在几乎所有的病例中，这些肉芽肿消解，感染没有进一步扩散。“继发性结核病”主要见于成年人中，作为以前感染的重新激活（或再次感染），特别是在健康状态减退时。肉芽肿炎症发展的更加充分和广泛。一般地，上肺叶受感染最多，并可能形成空洞。结核病传播到肺外可以导致出现大量具有特征性模式的不常见结果，包括骨结核、生殖道结核、尿道结核、中枢神经系统(CNS)结核、胃肠道结核、肾上腺结核、淋巴结核和心脏结核。“潜伏性”结核病是在个体中的Mtb感染可以通过诊断测定例如但不限于结核菌素皮试(TST)检测，其中感染在该个体中不产生症状。“活动性”结核病是受试者中有症状的Mtb感染。

在显微镜下，TB感染产生的炎症是肉芽肿性的，具有上皮样巨噬细胞和郎罕氏（Langhans）巨细胞以及淋巴细胞、浆细胞、可能还具有少量多形核细胞、带有胶原的成纤维细胞，并且在中心具有特征性干酪样坏死。炎症反应由IV型超敏反应介导，皮试就是基于该反应。在一些实例中，结核病可以通过皮试、酸快速染色、金胺染色或其组合来诊断。最常用的筛查样本是痰液，但是也可以对组织或其他体液进行组织学染色。

TB是HIV感染的常见并发症。在感染了人类免疫缺陷病毒（HIV）的受试者中，TB感染可以容易地传播并快速发展成活动性疾病。由Mtb感染引起的肺部疾病具体症状包括慢性咳嗽和咳血。TB疾病的其他症状包括疲劳、食欲不振、体重减轻、发烧和夜间盗汗。

载体：被导入宿主细胞并由此产生转化的宿主细胞的核酸分子。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制原点。载体还可以包括一个或多个选择性标记标记基因和本领域已知的其他遗传元件。载体包括质粒载体，包括用于在革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌细胞中表达的质粒。示例性载体包括在大肠杆菌（E.coli）和沙门氏菌（Salmonella）中表达的载体。载体还包括病毒载体，例如但不限于反转录病毒、正痘病毒、鸟痘病毒、禽痘病毒、羊痘病毒、猪痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、α-病毒、杆状病毒、辛德比斯病毒、牛痘病毒和脊髓灰质炎病毒载体。载体还包括用于在酵母细胞中表达的载体。

除非另有解释，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员的通常理解相同的意义。除非上下文中另有明确指明，否则单数形式的术语“a”、“an”和“the”意图包括复数形式。类似地，除非上下文中另有指明，否则单词“或”意指包括“和”。需要进一步理解的是，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有的分子量都是近似值，仅供描述。虽然与本发文所述类似或等价的方法和材料可以用于本公开的实践或试验，但下面描述了适合的方法和材料。术语“包含”意味着“包括”。本文中提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以全文引用方式纳入本文。如果出现冲突，以本说明书（包括对术语的解释）为准。此外，所述的材料、方法和实例仅用于说明，而不意图是限制性的。

III.分枝杆菌多肽。

本文公开了几种分枝杆菌多肽，所述多肽可以用于诊断测定以鉴定感染分枝杆菌例如Mtb的受试者。在几个实施方案中，所述多肽包含下列显示的氨基酸序列或由其组成：

VPHPWDTGDHERNWQGYFIPAMSVLRNRVGARTHAELRDAENDLVEARVIELREDPNLLGDRTDLAYLRAIHRQLFQDIYVWAGDLRTVGIEKEDESFCAPGGISRPMEHVAAEIYQLDRLRAVGEGDLAGQVAYRYDYVNYAHPFREGNGRSTREFFDLLLSERGSGLDWGKTDLEELHGACHVARANSDLTGLVAMFKGILDAEPTYDF(SEQ ID NO：1；还参见TUBERCULIST No.Rv3641c，2009年6月8日公开，以引用方式纳入本文，被称为fic)。

MDFALLPPEVNSARMYTGPGAGSLLAAAGGWDSLAAELATTAEAYGSVLSGLAALHWRGPAAESMAVTAAPYIGWLYTTAEKTQQTAIQARAAALAFEQAYAMTLPPPVVAANRIQLLALIATNFFGQNTAAIAATEAQYAEMWAQDAAAMYGYATASAAAALLTPFSPPRQTTNPAGLTAQAAAVSQATDPLSLLIETVTQALQALTIPSFIPEDFTFLDAIFAGYATVGVTQDVESFVAGTIGAESNLGLLNVGDENPAEVTPGDFGIGELVSATSPGGGVSASGAGGAASVGNTVLASVGRANSIGQLSVPPSWAAPSTRPVSALSPAGLTTLPGTDVAEHGMPGVPGVPVAAGRASGVLPRYGVRLTVMAHPPAAG (SEQ ID NO：2；还参见TUBERCULIST No.Rv3136，2009年6月8日公开，以引用方式纳入本文，被称为PPE51或PPE)。

MTEPRPVFAVVISAGLSAIPMVGGPLQTVFDAIEERTRHRAETTTREICESVGGADTVLSRIDKNPELEPLLSQAIEAATRTSMEAKRRLLAQAAAAALEDDQKVEPASLIVATLSQLEPVHIHALVRLAKAAKSSPDQDEIQRREVMRAASKVEPVPVLAALIQTGVAIATTTVWHGNGTGTPAEESGHILIHDVSDFGHRLLAYLRAADAGAELLILPSGGSAPTGDHPTPHPSTSR (SEQ ID NO：3；还参见TUBERCULIST No.Rv0394c，2009年6月8日公开，以引用方式纳入本文)。

MADFLTLSPEVNSARMYAGGGPGSLSAAAAAWDELAAELWLAAASFESVCSGLADRWWQGPSSRMMAAQAARHTGWLAAAATQA EGAASQAQTMALAYEAAFAATVHPALVAANRALVAWLAGSNVFGQNTPAIAAAEAIYEQMWAQDVVAMLNYHAVASAVGARLRPWQQLLHELPRRLGGEHSDSTNTELANPSSTTTRITVPGASPVHAATLLPFIGRLLAARYAELNTAIGTNWFPGTTPEVVSYPATIGVLSGSLGAVDANQSIAIGQQMLHNEILAATASGQPVTVAGLSMGSMVIDRELAYLAIDPNAPPSSALTFVELAGPERGLAQTYLPVGTTIPIAGYTVGNAPESQYNTSVV YSQYDIWADPPDRPWNLLAGANALMGAAYFHDLTAYAAPQQGIEIAAVTSSLGGTTTTYMIPSPTLPLLLPLKQIGVPDWIVGGLNNVLKPLVDAGYSQYAPTAGPYFSHGNLVW (SEQ ID NO：4；还参见TUBERCULIST No.Rv3539，2009年6月8日公开，以引用方式纳入本文，被称为PPE63或PPE)。

MTLDVPVNQGHVPPGSVACCLVGVTAVADGIAGHSLSNFGALPPEINSGRMYSGPGSGPLMAAAAAWDGLAAELSSAATGYGAAISELTNMRWWSGPASDSMVAAVLPFVGWLSTTATLAEQAAMQARAAAAAFEAAFAMTVPPPAIAANRTLLMTLVDTNWFGQNTPAIATTESQYAEMWAQDAAAMYGYASAAAPATVLTPFAPPPQTTNATGLVGHATAVAALRGQHSWAAAIPWSDIQKYWMMFLGALATAEGFIYDSGGLTLNALQFVGGMLWSTALAEAGAAEAAAGAGGAAGWSAWSQLGAGPVAASATLAAKIGPMSVPPGWSAPPATPQAQTVARSIPGIRSAAEAAETSVLLRGAPTPGRSRAAHMGRRYGRRLTVMADRPNVG(SEQ ID NO:5；还参见TUBERCULIST No.Rv1706c，2009年6月8日公开，以引用方式纳入本文，被称为PPE23或PPE)。

MDFGALPPEINSARMYAGAGAGPMMAAGAAWNGLAAELGTTAASYESVITRLTTESWMGPASMAMVAAAQPYLAWLTYTAEAAAHAGSQAMASAAAYEAAYAMTVPPEVVAANRALLAALVATNVLGINTPAIMATEALYAEMWAQDALAMYGYAAASGAAGMLQPLSPPSQTTNPGGLAAQSAAVGSAAATAAVNQVSVADLISSLPNAVSGLASPVTSVLDSTGLSGIIADIDALLATPFVANIINSAVNTAAWYVNAAIPTAIFLANALNSGAPVAIAEGAIEAAEGAASAAAAGLADSVTPAGLGASLGEATLVGRLSVPAAWSTAAPATTAGATALEGSGWTVAAEEAGPVTGMMPGMASAAKGTGAYAGPRYGFKPTVMPKQVVV(SEQ ID NO:6；还参见TUBERCULIST No.Rv1039c，2009年6月8日公开，以引用方式纳入本文，被称为PPE15或PPE)。

MAHFSVLPPEINSLRMYLGAGSAPMLQAAAAWDGLAAELGTAASSFSSVTTGLTGQAWQGPASAAMAAAAAPYAGFLTTASAQAQLAAGQAKAVASVFEAAKAAIVPPAAVAANREAFLALIRSNWLGLNAPWIAAVESLYEEYWAADVAAMTGYHAGASQAAAQLPLPAGLQQFLNTLPNLGIGNQGNANLGGGNTGSGNIGNGNKGSSNLGGGNIGNNNIGSGNRGSDNFGAGNVGTGNIGFGNQGPIDVNLLATPGQNNVGLGNIGNNNMGFGNTGDANTGGGNTGNGNIGGGNTGNNNFGFGNTGNNNIGIGLTGNNQMGINLAGLLNSGSGNIGIGNSGTNNIGLFNSGSGNIGVFNTGANTLVPGDLNNLGVGNSGNANIGFGNAGVLNTGFGNASILNTGLGNAGELNTGFGNAGFVNTGFDNSGNVNTGNGNSGNINTGSWNAGNVNTGFGIITDSGLTNSGFGNTGTDVSGFFNTPTGPLAVDVSGFFNTASGGTVINGQTS GIGNIGVPGTLFGSVRSGLNTGLFNMGTAISGLFNLRQLLG(SEQ ID NO:7；还参见TUBERCULIST No.Rv3558，2009年6月8日公开，以引用方式纳入本文，被称为PPE64或PPE)。

MEYLIAAQDVLVAAAADLEGIGSALAAANRAAEAPTTGLLAAGADEVSAAIASLFSGNAQAYQALSAQAAAFHQQFVRALSSAAGSYAAAEAANASPMQAVLDVVNGPTQLLLGRPLIGDGANGGPGQNGGDGGLLYGNGGNGGSSSTPGQPGGRGGAAGLIGNGGAGGAGGPGANGGAGGNGGWLYGNGGLGGNGGAATQIGGNGGNGGHGGNAGLWGNGGAGGAGAAGAAGANGQNPVSHQVTHATDGADGTTGPDGNGTDAGSGSNAVNPGVGGGAGGIGGDGTNLGQTDVSGGAGGDGGDGANFASGGAGGNGGAAQSGFGDAVGGNGGAGGNGGAGGGGGLGGAGGSANVANAGNSIGGNGGAGGNGGIGAPGGAGGAGGNANQDNPPGGNSTGGNGGAGGDGGVGASADVGGAGGFGGSGGRGGLLLGTGGAGGDGGVGGDGGIGAQGGSGGNGGNGGIGADGMANQDGDGGDGGNGGDGGAGGAGGVGGNGGTGGAGGLFGQSGSPGSGAAGGLGGAGGNGGAGGGGGTGFNPGAPGDPGTQGATGANGQHGLN(SEQ ID NO：8；还参见TUBERCULIST No.Rv1243c，2009年10月6日公开，以引用方式纳入本文，被称为PE_PGRS23)。

MVMSLMVAPELVAAAAADLTGIGQAISAANAAAAGPTTQVLAAAGDEVSAAIAALFGTHAQEYQALSARVATFHEQFVRSLTAAGSAYATAEAANASPLQALEQQVLGAINAPTQLWLGRPLIGDGVHGAPGTGQPGGAGGLLWGNGGNGGSGAAGQVGGPGGAAGLFGNGGSGGSGGAGAAGGVGGSGGWLNGNGGAGGAGGTGANGGAGGNAWLFGAGGSGGAGTNGGVGGSGGFVYGNGGAGGIGGIGGIGGNGGDAGLFGNGGAGGAGAAGLPGAAGLNGGDGSDGGNGGTGGNGGRGGLLVGNGGAGGAGGVGGDGGKGGAGDPSFAVNNGAGGNGGHGGNPGVGGAGGAGGLLAGAHGAAGATPTSGGNGGDGGIGATANSPLQAGGAGGNGGHGGLVGNGGTGGAGGAGHAGSTGATGTALQPTGGNGTNGGAGGHGGNGGNGGAQHGDGGVGGKGGAGGSGGAGGNGFDAATLGSPGADGGMGGNGGKGGDGGKAGDGGAGAAGDVTLAVNQGAGGDGGNGGEVGVGGKGGAGGVSANPALNGSAGANGTAPTSGGNGGNGGAGATPTVAGENGGAGGNGGHGGSVGNGGAGGAGGNGVAGTGLALNGGNGGNGGIGGNGGSAAGTGGDGGKGGNGGAGANGQDFSASANGANGGQGGNGGNGGIGGKGGDAFATFAKAGNGGAGGNGGNVGVAGQGGAGGKGAIPAMKGATGADGTAPTSGGDGGNGGNGASPTVAGGNGGDGGKGGSGGNVGNGGNGGAGGNGAAGQAGTPGPTSGDSGTSGTDGGAGGNGGAGGAGGTLAGHGGNGGKGGNGGQGGIGGAGERGADGAGPNANGANGENGGSGGNGGDGGAGGNGGAGGKAQAAGYTDGATGTGGDGGNGGDGGKAGDGGAGENGLNSGAMLPGGGTVGNPGTGGNGGNGGNAGVGGTGGKAGTGSLTGLDGTDGITPNGGNGGNGGNGGKGGTAGNGSGAAGGNGGNGGSGLNGGDAGNGGNGGGALNQAGFFGTGGKGGNGGNGGAGMINGGLGGFGGAGGGGAVDVAATTGGAGGNGGAGGFASTGLGGPGGAGGPGGAGDFAS GVGGVGGAGGDGGAGGVGGFGGQGGIGGEGRTGGNGGSGGDGGGGISLGGNGGLGGNGGVSETGFGGAGGNGGYGGPGGPEGNGGLGGNGGAGGNGGVSTTGGDGGAGGKGGNGGDGGNVGLGGDAGSGGAGGNGGIGTDAGGAGGAGGAGGNGGSSKSTTTGNAGSGGAGGNGGTGLNGAGGAGGAGGNAGVAGVSFGNAVGGDGGNGGNGGHGGDGTTGGAGGKGGNGSSGAASGSGVVNVTAGHGGNGGNGGNGGNGSAGAGGQGGAGGSAGNGGHGGGATGGDGGNGGNGGNSGNSTGVAGLAGGAAGAGGNGGGTSSAAGHGGSGGSGGSGTTGGAGAAGGNGGAGAGGGSLSTGQSGGPRRQRWCRWQRRRWLGRQRRRRWCRWQRRCRRQRWRWRCRQRRLRRQWRQGRRRCRPWLHRRRGRQGRRWRQRRFQQRQRSRWQRR(SEQ ID NO:9；还参见TUBERCULIST No.Rv3345c，2009年10月6日公开，以引用方式纳入本文，被称为PE_PGRS50)。

VIQTCEVELRWRASQLTLAIATCAGVALAAAVVAGRWQLIAFAAPLLGVLCSISWQRPVPVIQVHGDPDSQRCFENEHVRVTVWVTTESVDAAVELTVSALAGMQFEALESVSRRTTTVSAVAQRWGRYPIRARVAVVARGGLLMGAGTVDAAEIVVFPLTPPQSTPLPQTELLDRLGAHLTRHVGPGVEYADIRPYVPGDQLRAVNWVVSARRGRLHVTRRLTDRAADVVVLIDMYRQPAGPATEATERVVRGAAQVVQTALRNGDRAGIVALGGNRPRWLGADIGQRQFYRVLDTVLGAGEGFENTTGTLAPRAAVPAGAVVIAFSTLLDTEFALALIDLRKRGHVVVAVDVLDSCPLQDQLDPLVVRMWALQRSAMYRDMATIGVDVLSWPADHSLQQSMGALPNRRRRGRGRASRARLP(SEQ ID NO：10；还参见TUBERCULISTNo.Rv3163c，2009年10月6日公开，以引用方式纳入本文)。

VNRRILTLMVALVPIVVFGVLLAVVTVPFVALGPGPTFDTLGEIDGKQVVQIVGTQTYPTSGHLNMTTVSQRDGLTLGEALALWLSGQEQLMPRDLVYPPGKSREEIENDNAADFKRSEAAAEYAALGYLKYPKAVTVASVMDPGPSVDKLQAGDAIDAVDGTPVGNLDQFTALLKNTKPGQEVTIDFRRKNEPPGIAQITLGKNKDRDQGVLGIEVVDAPWAPFAVDFHLANVGGPSAGLMFSLAVVDKLTSGHLVGSTFVAGTGTIAVDGKVGQIGGITHKMAAARAAGATVFLVPAKNCYEASSDSPPGLKLVKVETLSQAVDALHAMTSGSPTPSC (SEQ ID NO：11；还参见TUBERCULIST No.Rv3194c，2009年10月6日公开，以引用方式纳入本文)。

MSFVVTAPPVLASAASDLGGIASMISEANAMAAVRTTALAPAAADEVSAAIAALFSSYARDYQTLSVQVTAFHVQFAQTLTNAGQLYAVVDVGNGVLLKTEQQVLGVINAPTQTLVGRPLIGDGTHGAPGTGQNGGAGGILWGNGGNGGSGAPGQPGGRGGDAGLFGHGGHGGVGGPGIAGAAGTAGLPGGNGANGGSGGIGGAGGAGGNGGLLFGNGGAGGQGGSGGLGGSGGTGGAGMAAGPAGGTGGIGGIGGIGGAGGVGGHGSALFGHGGINGDGGTGGMGGQGGAGGNGWAAEGITVGIGEQGGQGGDGGAGGAGGIGGSAGGIGGSQGAGGHGGDGGQGGAGGSGGVGGGGAGAGGDGGAGGIGGTGGNGSIGGAAGNGGNGGRGGAGGMATAGSDGGNGGGGGNGGVGVGSAGGAGGTGGDGGAAGAGGAPGHGYFQQPAPQGLPIGTGGTGGEGGAGGAGGDGGQGDIGFDGGRGGDGGPGGGGGAGGDGSGTFNAQANNGGDGGAGGVGGAGGTGGTGGVGADGGRGGDSGRGGDGGNAGHGGAAQFSGRGAYGGEGGSGGAGGNAGGAGTGGTAGSGGAGGFGGNGADGGNGGNGGNGGFGGINGTFGTNGAGGTGGLGTLLGGHNGNIGLNGATGGIGSTTLTNATVPLQLVNTTEPVVFISLNGGQMVPVLLDTGSTGLVMDSQFLTQNFGPVIGTGTAGYAGGLTYNYNTYSTTVDFGNGLLTLPTSVNVVTSSSPGTLGNFLSRSGAVGVLGIGPNNGFPGTSSIVTAMPGLLNNGVLIDESAGILQFGPNTLTGGITISGAPISTVAVQIDNGPLQQAPVMFDSGGINGTIPSALASLPSGGFVPAGTTISVYTSDGQTLLYSYTTTATNTPFVTSGGVMNTGHVPFAQQPIYVSYSPTAIGTTTFN(SEQ ID NO：12；还参见TUBERCULIST No.Rv0977，2009年10月6日公开，以引用方式纳入本文)。

MTHDHAHSRGVPAMIKEIFAPHSHDAADSVDDTLESTAAGIRTVKISLLVLGLTALIQIVIVVMSGSVALAADTIHNFADALTAVPLWIAFALGAKPATRRYTYGFGRVEDLAGSFVVAMITMSAIIAGYEAIARLIHPQQIEHVGWVALAGLVGFIGNEWVALYRIRVGHRIGSAALIADGLHARTDGFTSLAVLCSAGGVALGFPLADPIVGLLITAAILAVLRTAARDVFRRLLDGVDPAMVDAAEQALAARPGVQAVRSVRMRWIGHRLHADAELDVDPALDLAQAHRIAHDAEHELTHTVPKLTTALIHAYPAEHGSSIPDRGRTVE(SEQ ID NO：13；还参见TUBERCULISTNo.Rv2025c，2009年10月6日公开，以引用方式纳入本文)。

VVNFSVLPPEINSGRMFFGAGSGPMLAAAAAWDGLAAELGLAAESFGLVTSGLAGGSGQAWQGAAAAAMVVAAAPYAGWLAAAAARAGGAAVQAKAVAGAFEAARAAMVDPVVVAANRSAFVQLVLSNVFGQNAPAIAAAEATYEQMWAADVAAMVGYHGGASAAAAALAPWQQAVPGLSGLLGGAANAPAAAAQGAAQGLAELTLNLGVGNIGSLNLGSGNIGGTNVGSGNVGGTNLGSGNYGSLNWGSGNTGTGNAGSGNTGDYNPGSGNFGSGNFGSGNIGSLNVGS GNFGTLNLANGNNGDVNFGGGNTGDFNFGGGNNGTLNFGFGNTGSGNFGFGNTGNNNIGIGLTGDGQIGIGGLNSGTGNIGFGNSGNNNIGFFNSGDGNIGFFNSGDGNTGFGNAGNINTGFWNAGNLNTGFGSAGNGNVGIFDGGNSNSGSFNVGFQNTGFGNSGAGNTGFFNAGDSNTGFANAGNVNTGFFNGGDINTGGFNGGNVNTGFGSALTQAGANSGFGNLGTGNS GWGNSDPSGTGNSGFFNTGNGNSGFSNAGPAMLPGFNSGFANIGSFNAGIANSGNNLAGISNSGDDSSGAVNSGSQNSGAFNAGVGLSGFFR(SEQ ID NO：14；还参见TUBERCULIST No.Rv2356c，2009年10月6日公开，以引用方式纳入本文，被称为PPE40)。

MNYSVLPPEINSLRMFTGAGSAPMLAASVAWDRLAAELAVAASSFGSVTSGLAGQSWQGAAAAAMAAAAAPYAGWLAAAAARAAGASAQAKAVASAFEAARAATVHPMLVAANRNAFVQLVLSNLFGQNAPAIAAAEAMYEQMWAADVAAMVGYHGGASAAAAQLSSWSIGLQQALPAAPSALAAAIGLGNIGVGNLGGGNTGDYNLGSGNSGNANVGSGNSGNANVGSGNDGATNLGSGNIGNTNLGSGNVGNVNLGSGNRGFGNLGNGNFGSGNLGSGNTGSTNFGGGNLGSFNLGSGNIGSSNIGFGNNGDNNLGLGNNGNNNIGFGLTGDNLVGIGALNSGIGNLGFGNSGNNNIGFFNSGNNNVGFFNSGNNNFGFGNAGDINTGFGNAGDTNTGFGNAGFFNMGIGNAGNEDMGVGNGGSFNVGVGNAGNQSVGFGNAGTLNVGFANAGSINTGFANSGSINTGGFDSGDRNTGFGSSVDQSVSSSGFGNTGMNSSGFFNTGNVSAGYGNNGDVQSGINNTNSGGFNVGFYNSGAGTVGIANSGLQTTGIANSGTLNTGVANTGDHSSGGFNQGSDQSGFFGQP(SEQ ID NO:15；还参见TUBERCULIST No.Rv3159c，2009年10月6日公开，以引用方式纳入本文，被称为PPE53)。

MSFVFAAPEALAAAAADMAGIGSTLNAANVVAAVPTTGVLAAAADEVSTQVAALLSAHAQGYQQLSRQMMTAFHDQFVQALRASADAYATAEASAAQTMVNAVNAPARALLGHPLISADASTGGGSNALSRVQSMFLGTGGSSALGGSAAANAAASGALQLQPTGGASGLSAVGALLPRAGAAAAAALPALAAESIGNAIKNLYNAVEPWVQYGFNLTAWAVGWLPYIGILAPQINFFYYLGEPIVQAVLFNAIDFVDGTVTFSQALTNIETATAASINQFINTEINWIRGFLPPLPPISPPGFPSLP(SEQ ID NO：16；还参见TUBERCULIST No.Rv1172c，2009年10月6日公开，以引用方式纳入本文，被称为PE12)。

MDYAFLPPEINSARMYSGPGPNSMLVAAASWDALAAELASAAENYGSVIARLTGMHWWGPASTSMLAMSAPYVEWLERTAAQTKQTATQARAAAAAFEQAHAMTVPPALVTGIRGAIVVETASASNTAGTPP(SEQ ID NO：17；还参见TUBERCULIST No.Rv3135，2009年6月8日公开，以引用方式纳入本文，被称为PPE50或PPE)。

LSASVSATTAHHGLPAHEVVLLLESDPYHGLSDGEAAQRLERFGPNTLAVVTRASLLARILRQFHHPLIYVLLVAGTITAGLKEFVDAAVIFGVVVINAIVGFIQESKAEAALQGLRSMVHTHAKVVREGHEHTMPSEELVPGDLVLLAAGDKVPADLRLVRQTGLSVNESALTGESTPVHKDEVALPEGTPVADRRNIAYSGTLVTAGHGAGIVVATGAETELGEIHRLVGAAEVVATPLTAKLAWFSKFLTIAILGLAALTFGVGLLRRQDAVETFTAAIALAVGAIPEGLPTAVTITLAIGMARMAKRRAVIRRLPAVETLGSTTVICADKTGTLTENQMTVQSIWTPHGEIRATGTGYAPDVLLCDTDDAPVPVNANAALRWSLLAGACSNDAALVRDGTRWQIVGDPTEGAMLVVAAKAGFNPERLATTLPQVAAIPFSSERQYMATLHRDGTDHVVLAKGAVERMLDLCGTEMGADGALRPLDRATVLRATEMLTSRGLRVLATGMGAGAGTPDDFDENVIPGSLALTGLQAMSDPPRAAAASAVAACHSAGIAVKMITGDHAGTATAIATEVGLLDNTEPAAGSVLTGAELAALSADQYPEAVDTASVFARVSPEQKLRLVQALQARGHVVAMTGDGVNDAPALRQANIGVAMGRGGTEVAKDAADMVLTDDDFATIEAAVEEGRGVFDNLTKFITWTLPTNLGEGLVILAAIAVGVALPILPTQILWINMTTAIALGLMLAFEPKEAGIMTRPPRDPDQPLLTGWLVRRTLLVSTLLVASAWWLFAWELDNGAGLHEARTAALNLFVVVEAFYLFSCRSLTRSAWRLGMFANRWIILGVSAQAIAQFAITYLPAMNMVFDTAPIDIGVWVRIFAVATAITIVVATDTLLPRIRAQPP(SEQ ID NO:18；还参见TUBERCULIST No.Rv1997，2009年6月8日公开，以引用方式纳入本文，被称为ctpF)。

在第二个实施方案中，在本文公开的方法中使用的Mtb多肽具有与SEQ ID NO:1-18之一显示的氨基酸序列具有至少75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性的序列。例如，所述多肽可以具有与SEQ ID NO:1-18显示的氨基酸序列之一至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性的氨基酸序列。示例性序列可以使用互联网上容易获得的计算机程序和本文示出的氨基酸序列获得。在一个实例中，所述多肽保留了Mtb蛋白的功能，例如与特异性结合Mtb表位的抗体结合的功能。

对Mtb多肽的一级氨基酸序列进行少量修饰可以产生与本文所述的未修饰的对应多肽相比具有基本上相等活性的肽。这种修饰可以是如通过位点定向诱变那样有意设计的，或者可以是自发的。本文包括含了通过这些修饰产生的所有多肽。因此，Mtb多肽的具体的、非限定性的实例是Mtb多肽的保守变体（例如单个保守氨基酸的置换，例如一个或多个保守氨基酸的置换，例如1-10个保守置换、2-5个保守置换、4-9个保守置换，例如1、2、5或10个保守置换)。本文中提供了保守置换的表格。可以依据该表格对SEQ ID NO:1-18中显示的氨基酸序列进行置换。

本文中公开了可用于诱导对Mtb免疫应答的Mtb多肽。这些肽包含至少9个氨基酸或由至少9个氨基酸构成，例如上述的Mtb多肽中9到20个氨基酸的连续氨基酸。在具体的、非限制性的实例中，所述Mtb多肽包括MDFALLPPEVNSARM(SEQ ID NO:2中第1-15位氨基酸)或AEMWAQDAA(SEQ ID NO:2中第141-149位氨基酸)或由其构成。具体的、非限制性的实例是上述Mtb多肽之一中的15、14、13、12、11、10或9个连续的氨基酸。在这些实例中，所述Mtb多肽不包括SEQID NO:1-18显示的全长氨基酸序列。

在几个实施方案中，分离的Mtb多肽被包含在融合蛋白中。因此，所述融合蛋白可以包括Mtb多肽(参见上文)和与Mtb多肽共价连接第二异源部分，例如myc蛋白、酶或载体（例如肝炎载体蛋白或牛血清白蛋白）。在几个实例中，由SEQ ID NO:1-18显示的氨基酸序列之一中的9至12个氨基酸组成的结合I类MHC的多肽，与载体共价相连。在另外的实例中，由SEQ ID NO:1-18之一显示的一个氨基酸序列组成的多肽与载体共价连接。

在其他实例中，所述多肽可以是融合蛋白，或者也可以包含Mtb的异源序列。因此，在几个具体的非限制性实例中，所述免疫原性肽是融合多肽，例如所述多肽包含6个连续的组氨酸残基、β-半乳糖苷酶氨基酸序列或免疫球蛋白氨基酸序列。所述多肽也可以与载体共价连接。在其他实施方案中，所述蛋白由Mtb多肽组成。

所述多肽可以任选包含本文中公开的一个或多个Mtb多肽的重复。在一个具体的、非限制性实例中，所述多肽包括上述Mtb多肽之一的2、3、4、5或多达10个重复。或者，在融合多肽中可以包含超过一种多肽。因此，在几个实例中，所述多肽可以包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种SEQ ID NO:1-18显示的氨基酸序列或者SEQ ID NO:1-18显示的氨基酸序列之一的9至20个氨基酸以及这些序列的重复。在所述Mtb多肽之间可任选包含接头序列。

本文公开的Mtb多肽可以通过标准方法化学合成，或者可以重组产生。用于多肽产生的示例性方法描述在Lu et al.,FEBS Lett.429:31-35,1998中。它们也可以通过包括制备型色谱和免疫分离在内的方法进行分离。所述多肽也可以使用分子遗传技术产生，例如通过将编码Mtb或其表位的核酸插入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞，并分离所述多肽（见下文）。

在本文提供的具体实施方案中，一种或多种公开的Mtb多肽(或其片段)可以连接到基质或固态支持物上，例如平板或阵列。在一个实例中，所述平板或阵列包括SEQ ID NO:1-18或其片段的至少一个（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17个或全部），或基本上由其组成或由其组成。在一些实例中，所述平板或阵列也包括一种或多种控制多肽。选择适合的基质和构建平板或阵列的方法是本领域技术人员公知的(见，例如美国专利No.5,143,854；美国专利No.5,405,783；美国专利No.5,445,934和美国专利No.5,744,305；全部以引用方式纳入本文)。

还提供了编码本文公开的Mtb多肽的多核苷酸。示例性的核酸序列显示为SEQ ID NO:19-36。这些多核苷酸包括编码目的多肽的DNA、cDNA和RNA。编码序列中的沉默突变源自遗传密码的简并性(即冗余性)，从而一个以上的密码子能编码同样的氨基酸残基。显示标准遗传密码的表格可以在多种不同来源中找到(例如L.Stryer，1988，《生物化学》第三版，Biochemistry,3^rd Edition,W.H.5Freeman and Co.,NY)。

编码Mtb多肽的核酸可以通过体外方法克隆或扩增，例如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、自动维持的序列复制系统(3SR)和Qβ复制酶扩增系统(QB)。例如，编码所述蛋白的多核苷酸可以通过使用基于所述分子的DNA序列的引物进行cDNA的聚合酶链反应来分离。各种各样的克隆和体外扩增方法对于本领域技术人员来说是熟知的。PCR方法在例如美国专利No.4,683,195；Mullis等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263,1987；以及Erlich主编的《PCR技术》(PCR Technology，Stockton Press,NY,1989)中有描述。多核苷酸还能够通过选自所需多核苷酸序列的探针，在严紧的杂交条件下筛选基因组文库或cDNA文库来分离。

编码Mtb多肽的多核苷酸包括整合到载体、到自主复制的质粒或病毒、或到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或作为独立于其他序列的分离的分子(例如cDNA)存在。本发明的核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或修饰形式的两种核苷酸之一。该术语包括单链和双链形式的DNA。

在一个实施方案中，载体被用于在酵母例如酿酒酵母(S.cerevisiae)或乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)中表达。已知有几种启动子用于酵母表达系统，例如组成型启动子质膜H⁺-ATPase(PMA1)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK1)、乙醇脱氢酶-1ADDH1)、和多重药物抗性泵(PDR5)。此外，也可以使用诱导型启动子，例如GAL1-10(由半乳糖诱导)、PHO5(由低的细胞外无机磷酸盐诱导)和串联的热休克HSE元件(由温度升高到37°C诱导)。对可滴定的诱导物作出反应指导可变表达的启动子包括甲硫氨酸响应性MET3和MET25启动子以及铜依赖性的CUP1启动子。任何这些启动子都可以克隆到多拷贝(2μ)或单拷贝(CEN)质粒中，提供对表达水平的附加水平的控制。质粒可以包含用于在酵母中筛选的营养标记(例如URA3、ADE3、HIS1等)，以及用于在细菌中繁殖的抗生素抗性(例如AMP)。在乳酸克鲁维斯酵母中表达的质粒是已知的，例如pKLAC1。因此，在一个实例中，在细菌中扩增后，可以通过与细菌转化类似的方法将质粒导入相应的酵母营养缺陷体中。

Mtb多肽可以在多种酵母菌株中表达。例如，7种多重药物抗性转运蛋白YOR1、SNQ2、PDR5、YCF1、PDR10、PDR11和PDR15与它们的活化转录因子PDR1和PDR3一起，已经同时从酵母宿主细胞中缺失了，使得产生的菌株对药物敏感。还可以使用质膜的脂类组成改变的酵母菌株，例如在麦角甾醇生物合成缺陷的erg6突变株。对于蛋白水解高度敏感的蛋白，可以在缺乏控制其他液泡水解酶活化的主要液泡内肽酶Pep4的酵母中表达。如果相应的无效突变体不能存活，可以采用在带有基因的温度敏感性(ts)等位基因的菌株中进行异源表达。

还可以制备编码本文公开的Mtb多肽的病毒载体。已经构建了许多病毒载体，例如多形瘤SV40(Madzak等，1992,J.Gen.Virol.,73:1533-1536)、腺病毒(Berkner,1992,Cur.Top.Microbiol.Immunol.,158:39-6；Berliner等，1988,Bio Techniques,6:616-629；Gorziglia等，1992,J.Virol.,66:4407-4412；Quantin等，1992,Proc.Nad.Acad.Sci.USA,89:2581-2584；Rosenfeld等，1992,Cell,68:143-155；Wilkinson等，1992,Nucl.Acids Res.,20:2233-2239；Stratford-Perricaudet等，1990,Hum.Gene Ther.,1:241-256)、牛痘病毒(Mackett等，1992,Biotechnology，24:495-499)、腺相关病毒(Muzyczka,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:91-123；On等，1990,Gene,89:279-282)、疱疹病毒包括HSV和EBV(Margolskee,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:67-90；Johnson等，1992,J.Virol.,66:2952-2965；Fink等，1992,Hum.Gene Ther.3:11-19；Breakfield等，1987,Mol.Neurobiol.,1:337-371；Fresse等，1990,Biochem.Pharmacol.,40:2189-2199)、辛德比斯病毒(Herweijer等，1995,Hum.Gene Ther.6:1161-1167；美国专利No.5,091,309和美国专利No.5,2217,879)、α-病毒(Schlesinger,1993,TrendsBiotechnol.11:18-22；Frolov等，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11371-11377)和鸟类的逆转录病毒(Brandyopadhyay等，1984,Mol.CellBiol.,4:749-754；Petropouplos等，1992,J.Virol.,66:3391-3397)、鼠的逆转录病毒(Miller,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:1-24；Miller等，1985,Mol.Cell Biol.,5:431-437；Sorge等，1984,Mol.Cell Biol.,4:1730-1737；Mann等，1985,J.Virol.,54:401-407)以及人类来源的逆转录病毒(Page等，1990,J.Virol.,64:5370-5276；Buchschalcher等，1992,J.Virol.,66:2731-2739)。杆状病毒(苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多核型多角体病毒；AcMNPV)载体在本领域中也是已知的，并有市售(例如PharMingen,San Diego,Calif.；Protein Sciences Corp.,Meriden,Conn.；Stratagene,La Jolla,Calif,)。

因此，在一个实施方案中，编码Mtb多肽的多核苷酸包含在病毒载体中。适合的载体包括逆转录病毒载体、正痘病毒载体、鸟痘病毒载体、禽痘病毒载体、羊痘病毒载体、猪痘病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、α-病毒载体、杆状病毒载体、辛德比斯病毒载体、牛痘病毒载体和脊髓灰质炎病毒载体。具体的示例载体是痘病毒载体例如牛痘病毒、禽痘病毒和高度减毒的牛痘病毒(MVA)、腺病毒、杆状病毒等。

用于实践本发明方法的痘病毒包括正痘病毒、猪痘病毒、鸟痘病毒和羊痘病毒。正痘病毒包括痘苗病毒、鼠痘病毒和浣熊痘病毒。使用的正痘病毒的一个实例是痘苗病毒。鸟痘病毒包括禽痘病毒、金丝雀痘病毒和鸽痘病毒。羊痘病毒包括山羊痘病毒和绵羊痘病毒。在一个实例中，猪痘病毒是家猪痘病毒。用于表达的痘病毒载体的实例描述在例如美国专利No.6,165,460中，其以引用方式纳入本文。其他可以使用的病毒载体包括其他DNA病毒例如疱疹病毒和腺病毒，以及RNA病毒例如逆转录病毒和脊髓灰质炎病毒。

牛痘病毒的基因组在本领域中是已知的。它由HIND F13L区、TK区和HA区构成。重组的牛痘病毒已经被用于整合外源基因以表达外源基因产物(参见，例如，Perkus等，Science 229:981-984,1985；Kaufman等，Int.J.Cancer 48:900-907,1991；Moss,Science 252:1662,1991)。编码目的抗原例如免疫原性Mtb多肽的基因，可以被整合到重组牛痘病毒载体的HIND F13L区中，或整合到TK区中(或牛痘病毒基因组的其他非必需区中)。Baxby和Paoletti(Vaccine 10:8-9,1992)公开了非复制性的痘病毒，包括金丝雀痘病毒、禽痘病毒和其他鸟病毒物种，作为载体的构建和使用。Sutter和Moss(Proc.Nat′l.Acad Sci U.S.A.89:10847-10851,1992)和Sutter等(Virology 1994)公开了非复制性的重组安哥拉病毒(MVA，修饰的安哥拉牛痘病毒)作为载体的构建和使用。

适合的载体被公开在例如美国专利No.6,998,252中，其以引用方式纳入本文。在一个实例中，通过插入嵌合基因，对重组的痘病毒例如重组的牛痘病毒进行了合成修饰，所述嵌合基因含有牛痘调控序列或功能上与其等价的DNA序列，并且其侧翼带有的DNA序列在天然状态下与侧翼的编码Mtb多肽的牛痘病毒调控DNA序列是不相邻的。含有这样的嵌合基因的重组病毒有效地表达Mtb多肽。在一个实例中，牛痘病毒载体含有(A)包含(i)编码Mtb多肽的第一DNA序列和(ii)痘病毒启动子的片段，其中所述痘病毒启动子与编码Mtb多肽的DNA序列相邻并对它进行转录控制；并在该片段侧翼，(B)来自痘病毒基因组的非必需区的DNA。所述病毒载体可以编码选择性标记物。在一个实例中，所述痘病毒包括例如胸腺嘧啶激酶基因(参见美国专利No.6,998,252，其以引用方式纳入本文)。

编码Mtb多肽的病毒载体，例如痘病毒载体，含有至少一个与编码所述Mtb多肽的核酸序列可操作连接的表达控制元件。表达控制元件被插入到病毒载体中以控制和调节所述核酸序列的表达。用于这些载体的表达控制元件的实例包括但不限于lac系统、λ噬菌体的操纵子和启动子区、酵母启动子和源自多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒或SV40的启动子。其他的操纵元件包括但不限于前导序列、终止密码子、多聚腺苷化信号以及对于在宿主系统中适当转录和后续翻译编码Mtb多肽的核酸序列的所必需的任何其他序列。表达载体可以含有对于在宿主系统中转移和后续复制含有核酸序列的表达载体所必需的其他元件。这样的元件的实例包括但不限于复制起点和选择性标记物。本领域技术人员将进一步理解，这样的载体易于使用常规方法构建(Ausubel等，(1987)，《分子生物学现代方法》，"Current Protocols in Molecular Biology,"John Wiley andSons,New York,N.Y.)，并且有市售。

制备含有编码一个或多个Mtb多肽的异源DNA序列的重组DNA病毒的基本方法在本领域中是已知的。这些技术包括，例如，在供体质粒中的DNA序列侧翼的病毒DNA序列和亲本病毒中存在的同源序列之间进行同源重组(Mackett等，1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:7415-7419)。具体来说，重组病毒载体例如痘病毒载体可以用于递送所述基因。所述载体可以通过例如本领域中已知的步骤来构建，例如与美国专利No.5,093,258中描述的创建禽痘病毒的合成重组体的方法类似的步骤，该专利以引用方式纳入本文。其他的技术包括使用天然存在或人工插入到亲本病毒载体中的独特的限制性内切酶位点来插入异源DNA。

一般来说，DNA供体载体包含下列元件：(i)原核的复制起点，使得所述载体可以在原核宿主中扩增；(ii)编码标记物的基因，它允许筛选含有所述载体的原核宿主细胞(例如编码抗生素抗性的基因)；(iii)至少一种编码一个或多个Mtb多肽的DNA序列，位于能够指导所述序列表达的转录启动子附近；以及(iv)在元件(iii)的结构侧翼、与亲本病毒基因组中将要插入外源基因的区域同源的DNA序列。构建将多个外源基因导入痘病毒的供体质粒的方法在PCT公布No.WO 91/19803中有描述，其以引用方式纳入本文。

一般来说，用于构建供体载体的DNA片段，包括含有转录启动子的片段和含有与亲本病毒基因组中将要插入外源DNA序列的区域同源的序列的片段，可以从基因组DNA或克隆的DNA片段中获得。供体质粒可以是单价、二价或多价的(例如，可以含有一个或多个插入的外源DNA序列)。供体载体可以含有编码标记物的附加基因，其将允许鉴定含有插入的外源DNA的重组病毒。可以使用几种类型的标记基因以允许重组病毒的鉴定和分离。这些包括编码抗生素或化学抗性的基因(例如，参见Spyropoulos等，1988,J.Virol.62:1046；Falkner和Moss,1988,J.Virol.62:1849；Franke等，1985,Mol.Cell.Biol.5:1918)，以及基因例如大肠杆菌lacZ基因，其允许通过比色测定鉴定重组病毒噬斑(Panicali等，1986,Gene 47:193-199)。

要插入到所述病毒中的DNA基因序列可以被放置在供体质粒例如大肠杆菌或沙门氏菌质粒构建体中，其中与DNA片段，例如痘病毒中将要插入DNA的插入位点的DNA片段，同源的DNA已经被插入。将要插入的DNA基因序列单独与启动子连接。将启动子-基因连接物放置在质粒构建体中，使所述启动子-基因连接物两端上侧翼的DNA具有与侧翼带有作为预期插入区域的痘病毒DNA区域的DNA序列同源。对于亲本痘病毒载体来说，使用痘启动子。然后将得到的质粒构建体通过在大肠杆菌细菌中生长进行扩增并分离。接下来，将含有待插入的DNA基因序列的分离质粒与亲本病毒例如痘病毒一起转染到细胞培养物中，例如鸡胚成纤维细胞。质粒和病毒基因组中同源痘DNA之间的重组相应地产生了重组痘病毒，其在不影响病毒存活性的位点上，被其基因组中存在的启动子-基因构建体所修饰。

正如前面所述，DNA序列被插入到病毒中不影响所产生的重组病毒的病毒存活性的区域(插入区)中。本领域技术人员通过例如随机地测试病毒DNA中的片段以寻找允许重组体形成而不严重影响重组体的病毒存活性的区域，能够容易地鉴定这样的区域。可以容易使用并存在于许多病毒中的一个区域是胸腺嘧啶激酶(TK)基因。TK基因在所有被检查的痘病毒基因组中均可找到，包括兔痘病毒(Upton等，1986,J.Virology 60:920)；肖普(shope)纤维瘤病毒；山羊痘病毒(Gershon等，1989,J.Gen.Virol.70:525)；肯尼亚绵羊-1；正痘病毒(Weir等，1983,J.Virol.46:530)；牛痘病毒(Esposito等，1984,Virology 135:561)；猴痘病毒和天花病毒(Hruby等，1983,PNAS 80:3411)；牛痘病毒(Kilpatrick等，1985,Virology143:399)；亚巴猴肿瘤病毒；鸟痘病毒(Binns等，1988,J.Gen.Virol.69:1275)；禽痘病毒(Boyle等，1987,Virology 156:355;Schnitzlein等,1988,J.Virol.Meth.20:341)；和昆虫痘病毒(Lytvyn等，1992,J.Gen.Virol.73:3235-3240)。在牛痘病毒中，除了TK区之外，其他的插入区包括例如HindIII M片段。在禽痘病毒中，除了TK区之外，其他的插入区包括例如在EPO申请No.0308220A1中提出的BamHI J片段(Jenkins等，1991,AIDS Research and Human Retroviruses 7:991-998)、EcoRI-HindIII片段、EcoRV-HindIII片段、BamHI片段和HindIII片段(也参见C alvert等，1993,J.Virol.67:3069-3076；Taylor等，1988,Vaccine 6:497-503；Spehner等，1990，J.Virol.64:527-533；Boursnell等，1990,J.Gen.Virol.71:621-628)。

在家猪痘病毒中，插入位点包括胸腺嘧啶激酶基因区。除了需要将基因插入到插入区中之外，插入的基因被修饰的痘病毒成功表达还需要存在与所需基因可操作地连接的启动子。一般来说，启动子被放置在位于将被表达的基因的上游。启动子在本领域中是众所周知的，可以根据需要作为靶的宿主和细胞的类型容易地选择。在一个实例中，在痘病毒中使用痘病毒启动子例如牛痘病毒7.5K、40K或禽痘启动子例如FPV C1A。也可以组合使用增强子元件以增加表达的水平。此外，可以使用诱导型启动子。

在感染的细胞中供体质粒DNA与病毒DNA之间的同源重组可以导致整合了所需元件的重组病毒的形成。进行体内重组的适合宿主细胞一般来说是能够被病毒感染并被质粒载体转染的真核细胞。适合与痘病毒一起使用的这类细胞的实例是鸡胚成纤维细胞、HuTK143(人类)细胞以及CV-1和BSC-40(都是猴肾)细胞。细胞被痘病毒的感染和这些细胞用质粒载体的转染通过本领域中标准的技术来完成(参见美国专利No.4,603,112和PCT公布No.WO 89/03429)。

体内重组之后，可以通过几种技术之一来鉴定重组的病毒后代。例如，如果DNA供体载体被设计成将外源基因插入到亲本病毒胸腺嘧啶激酶(TK)基因中，则含有整合的DNA的病毒将是TK^-的，并且可以在此基础上选择(Mackett等，1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:7415)。或者，将编码标记物的基因或指示基因与上面描述的目的外源基因进行共整合，可以用于鉴定重组后代。一个具体的非限制性的指示基因的实例是大肠杆菌lacZ基因。表达β-半乳糖苷酶的重组病毒可以使用该酶的生色底物进行筛选(Panicali等，1986,Gene 47:193)。一旦重组病毒被鉴定，可以使用多种不同的公知方法来测定由插入的DNA片段编码的Mtb序列的表达。这些方法包括黑噬斑测定(在病毒噬斑上进行的原位酶免疫测定)、Western印迹分析、放射免疫沉淀(RIPA)和酶免疫测定(EIA)。

编码Mtb多肽的DNA序列可以通过将DNA转移到适合的宿主细胞中进行体外表达。细胞可以是原核的或真核的。该术语也包括了受试者宿主细胞的任何后代。应该理解，不是所有的后代都与亲本细胞相同，因为在复制过程中可能发生突变。稳定转移，其意义为外源DNA被持续维持在宿主中，的方法在本领域中是已知的。

正如前面提到的那样，编码Mtb多肽的多核苷酸序列可以与表达控制序列可操作地连接。表达控制序列与编码序列的可操作地连接是在与表达控制序列相容的条件下能够使编码序列表达的连接。表达控制序列包括但不限于适合的启动子、增强子、转录终止子、蛋白编码基因前方的起始密码子(即ATG)、维持基因的正确阅读框架使得mRNA正确翻译的内含子剪接信号、以及终止密码子。

宿主细胞可以包括微生物、酵母、昆虫和哺乳动物宿主细胞。在原核生物中表达含有真核或病毒序列的DNA序列的方法在本领域中是众所周知的。适合的宿主细胞的非限制性的实例包括细菌、古菌(archea)、昆虫、真菌(例如酵母)、分枝杆菌(例如耻垢分枝杆菌(M.smegmatis))、植物和动物细胞(例如哺乳动物细胞，例如人类)。示例的可用细胞包括大肠杆菌(E.co)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、SF9细胞、C 129细胞、293细胞、脉孢菌(Neurospora)、以及永生化的哺乳动物骨髓样和淋巴样细胞系。在培养物中繁殖哺乳动物细胞的技术是众所周知的(参见Jakoby和Pastan主编，1979,《细胞培养-酶学方法》，Cell Culture.Meth.Enzymol.,第58卷，Academic Press,Inc.,Harcourt Brace Jovanovich,N.Y.)。常用的哺乳动物宿主细胞系的实例是VERO和HeLa细胞、CHO细胞、以及WI38、BHK和COS细胞系，但可以使用细胞系，例如被设计用来提供较高地表达、需要的糖基化模式或其他特点的细胞。正如上面讨论的那样，用于转化酵母细胞的技术，例如聚乙二醇转化、原生质体转化和基因枪，在本领域中也是已知的(参见Gietz和Woods，Meth.Enzymol.350:87-96,2002)。

用重组DNA转化宿主细胞可以通过本领域的技术人员熟知的常规技术来完成。当宿主是原核细胞例如但不限于大肠杆菌时，可以通过在指数生长期后收获细胞、然后使用本领域中熟知的步骤通过CaCl₂方法处理细胞来制备能够摄入DNA的感受态细胞。或者，可以使用MgCl₂或RbCl。如果需要的话，转化也可以在形成宿主细胞的原生质体后进行，或通过电穿孔进行。

当宿主是真核细胞时，可以使用的转染DNA的方法例如磷酸钙共沉淀、常规的机械方法例如微注射、电穿孔、插入包装在脂质体中的质粒或病毒载体。真核细胞也可以用编码Mtb多肽的多核苷酸序列和编码选择性表现型的第二外源DNA分子（例如单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因）进行共转化。另一种方法是使用真核病毒载体，例如猴病毒40(SV40)或牛乳头状瘤病毒，来短暂感染或转化真核细胞并表达蛋白(参见例如Gluzman主编的《真核病毒载体》，Eukaryotic Viral Vectors,Cold SpringHarbor Laboratory,1982)。

在本文提供的具体实施方案中，一个或多个公开的Mtb多核苷酸（或其片段）可被连接至基质或固体支持物上，例如平板或阵列。在一个实例中，所述平板或阵列包含SEQ ID NO:19-36或其片段的至少1个（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17个或全部），或基本上由其组成或有其组成。在一些实例中，所述平板或阵列还包含一个或多个控制多核苷酸。选择合适基质和构建平板或阵列的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，美国专利No.5,554,501;5,985,567;5,981,185;和6,013,789;以及PCT公布WO 85/01051和WO89/10977;其全部以引用方式纳入本文)。

IV.用于检测Mtb感染的方法

A.T细胞检测

本文公开了用于检测受试者中分枝杆菌感染的方法。在几个实施方案中，所述分枝杆菌感染可以基于生物样本中T细胞的存在情况进行检测，其中所述T细胞特异性地与本文公开的Mtb多肽(例如SEQID NO:1-18)发生反应。

在几个实施方案中，含有T细胞的生物样本取自目标受试者。适合的生物样本包括但不限于血液样本、外周血单核细胞、痰液、唾液、脑脊液或分离的T细胞(例如CD8⁺T细胞和/或CD4⁺T细胞)样本、淋巴结组织、肺组织和其他组织样本。在一个实例中，所述样本与本文中公开的分枝杆菌多肽、编码Mtb多肽的多核苷酸或者表达与MHC结合的Mtb多肽或其片段的APC共同孵育。并检测是否存在所述T细胞的特异性活化。

能够在所述检测方法中识别所述多肽的所述CD8⁺T细胞和/或CD4⁺T细胞通常已在体内对目标Mtb多肽预敏化。在几个实施方案中，这些抗原刺激过的T细胞一般以每10⁶至10³个外周血单核细胞(PBMC)中1个的频率已经暴露于抗原的宿主的外周血中。

在一个实例中，所述样本是分离的T细胞。例如，T细胞可以通过常规技术(例如通过外周血淋巴细胞的Ficoll/Hypaque密度梯度离心，或通过荧光活化的细胞分拣)从目标受试者中分离。在一个实施方案中，所述测定中所用的T细胞是未处理的或稀释的样本的形式，或者是新鲜分离的T细胞(例如直接离体（ex vivo）使用的新鲜分离的单核细胞(MC)或PBMC的形式），使得它们在用于所述方法之前不进行培养。但是，也可以在使用前培养所述T细胞，例如在存在一种或多种所述肽以及一般还有外源的促进生长的细胞因子的情况下。在培养期间，所述肽通常存在于细胞例如APC的表面上。T细胞的预培养可以导致所用方法的灵敏度增加。因此，所述T细胞可以转变成细胞系，例如短期细胞系。

在几个实施方案中，将所述T细胞与结合MHC的Mtb多肽或其片段在37°C下体外孵育2到9天，例如约4天。在几个实例中，包括与MHC结合的所述Mtb多肽或其片段(其浓度为例如约5μg/ml到约25μg/ml，例如约5μg/ml、约10μg/ml、约15μg/ml或约20μg/ml)。在几个实例中，可以将T细胞样本的另一等份在不存在Mtb多肽的情况下孵育，用作对照。

在一个实施方案中，将MC从所述样本中分离。所述MC包括T细胞和APC。因此，在所述方法中存在于分离的MC中的APC可以将所述肽呈递到所述T细胞。在另一个实施方案中，只有T细胞，例如只有CD8⁺T细胞、只有CD4⁺T细胞或只有CD3⁺T细胞，可以从所述样本中纯化。

所述方法中使用的所述APC可以是表面具有I类MHC分子的任何细胞。它可以是也可以不是特化的抗原呈递细胞，例如B细胞、树突状细胞或巨噬细胞。所述方法中使用的所述APC可以来自与所述T细胞相同的宿主。一般来说，所述APC能够将肽呈递到T细胞。所述APC可以是新鲜分离的离体（ex vivo）细胞或经培养的细胞，例如来自细胞系的细胞。

可以将来自目标受试者样本的T细胞用于对所有Mtb多肽(或所述Mtb多肽的池或具体的Mtb多肽)的测定中（意欲测试相关组），或者将所述T细胞分开并分别用于各自含有一种或多种所述多肽的不同测定中。在一个实施方案中，使用了氨基酸序列如SEQ ID NO:1-18所示的一个或多个多肽、或可结合MHC的一种或多种这些多肽的片段。两种或多种本文公开的任意Mtb多肽可以与识别这些多肽的T细胞同时、分别或先后使用。也可以使用本文公开的任意Mtb多肽的其他组合。

在一个实施方案中，在不含T细胞的条件下将所述一种或多种多肽提供至呈递细胞。然后，将所述细胞提供至从所述受试者分离的T细胞，通常在使得所述肽呈递至其表面上后。

所述肽与细胞接触的持续时间依据用于确定所述肽的识别的方法而不同。通常，向每个测定中加入10⁵到10⁷，例如5×10⁵到10⁶个PBMC。当肽被直接加入所述测定中时，它的浓度通常为10^-1μg/ml到10³μg/ml，例如约0.5μg/ml到约50μg/ml或约1μg/ml到约10μg/ml。所述T细胞与肽共同孵育的时间长度可以从约4小时到约24小时，例如从约6小时到约16小时，或约12小时。

T细胞对所述肽的特异性识别的确定可以通过测量所述肽对所述T细胞的结合进行。通常，与所述肽结合的T细胞可以基于这种结合被分拣，例如使用荧光活化的细胞分拣(FACS)技术。如果用所述肽分拣的细胞的频率高于对照值，就认为检测到识别所述肽的T细胞的存在。

T细胞是否识别所述肽的确定还可以通过检测当所述肽存在时所述T细胞状态的改变或通过确定所述T细胞是否结合所述肽来进行。所述状态的改变一般是在所述T细胞受体与所述肽结合后所述T细胞的抗原特异性功能活性引起的。一般来说，当与T细胞受体结合时，所述肽结合到I类MHC分子，其可以存在于PBMC或APC的表面上。

可以通过本领域技术人员已知的任何方式检测T细胞活化。在一个实例中，CD8⁺T细胞活化是通过评估细胞溶解活性来检测的。在其他实例中，CD8⁺T细胞活化和/或CD4⁺T细胞活化是通过增殖来检测的。在几个实例中，与未感染受试者相比至少两倍的增殖水平和/或至少高20%的细胞溶解活性水平，表明目标受试者中存在分枝杆菌感染。

检测到的T细胞状态的改变还可以是所述T细胞分泌物质例如细胞因子例如γ干扰素(IFN-γ)、IL-2或TNF-α的起始或增加。在一个实例中，所述物质可以通过允许其结合特异性结合试剂然后检测所述特异性结合试剂/物质复合体的存在情况来进行检测。所述特异性结合试剂通常是抗体，例如结合所述物质例如所述细胞因子的多克隆或单克隆抗体。针对细胞因子的抗体是市售的，或者可以使用常规技术来制造。

通常，所述特异性结合试剂例如抗体是固定化在固相支持物上的。当使所述细胞因子结合以后，可以任选地对所述固相支持物清洗以除去非特异性结合到所述抗体的物质。所述抗体/细胞因子复合体可以通过将与复合体结合的第二结合试剂例如可检测标记物（直接地或间接地）标记的抗体进行检测。一般来说，所述第二试剂在与所述第一试剂结合位点不同的位点结合所述物质。

在几个实例中，可以通过被可检测标记物直接或间接标记的第三试剂检测所述第二结合试剂。例如，所述第二试剂可以包括生物素，其可由含有链亲和素和标记物例如酶标记物、放射活性标记物或荧光标记物的第三试剂检测。

在一个实施方案中，所述检测体系是ELISPOT测定，例如PCT公开No.WO 98/23960中所述的测定法，其以引用的方式纳入本文。在一个实例中，从T细胞分泌的IFN-γ结合于固定化在固相支持物上的第一IFN-γ特异性抗体。然后，使用可检测标记物标记的第二IFN-γ特异性抗体检测所述结合的IFN-γ。示例性的标记抗体有市售，例如从MABTECH^TM(斯德哥尔摩，瑞典)。示例性的ELISPOT测定在下述实施例部分描述。

所述T细胞状态的改变还可以是T细胞对物质的摄取增加，例如对胸腺嘧啶的摄取增加。所述状态的改变还可以通过T细胞大小增加、或T细胞增殖、或T细胞上的细胞表面标记物变化来测量。

本文还提供了用于检测特异性结合本文公开的Mtb多肽的CD8表达细胞(CD8⁺)的试剂。这些试剂是四聚体I类MHC/免疫原性TARP多肽复合体。这些四聚体复合体包括Mtb多肽，例如可特异性结合I类MHC的长度为9到20个氨基酸的多肽。

四聚体I类MHC/肽复合体可以使用本领域公知的方法(Altmannet al.,Science 274:94,1996,其以引用的方式纳入本文)合成。在一个具体的非限制性实例中，纯化的HLA重链多肽和β2-微球蛋白(β2m)可以借助原核表达体系合成。所用表达体系的一个具体的、非限制性的实例是pET体系(R&D Systems,Minneapolis,MN)。通过缺失跨膜和胞质尾区并在COOH-末端添加含有生物素蛋白连接酶(Bir-A)的酶法生物素化位点的序列，对重链进行修饰。然后将重链多肽、β2m和肽重新折叠。所述重新折叠的产物可以通过本领域已知的任何方法分离，然后用Bir-A生物素化。然后，通过将生物素化的产物与链亲和素接触，产生四聚体。

在一个实施方案中，所述链亲和素是被标记的。适合的标记物包括但不限于酶、磁性珠、胶态磁性珠、半抗原、荧光染料、金属化合物、放射性化合物或药物。可以与链亲和素缀合的酶包括但不限于碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶和β-半乳糖苷酶。所述可以与链亲和素结合的荧光染料包括但不限于荧光素异硫氰酸酯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、藻红蛋白、别藻蓝蛋白和德克萨斯红。对于可以与链亲和素结合的其他荧光染料，参见Haugland,Molecular Probes:Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals(1992-1994)。可以与链亲和素缀合的金属化合物包括但不限于铁蛋白、胶体金以及特别是胶体超顺磁珠。可以与链亲和素缀合的半抗原包括但不限于生物素、洋地黄毒甙、噁唑酮和硝基酚。可以与链亲和素缀合的放射性化合物在本领域是已知的，包括但不限于锝99m(⁹⁹Tc)、¹²⁵I和包含任何放射性核素（包括但不限于¹⁴C、³H和³⁵S）的氨基酸。一般来说，在本文公开的方法中使用荧光染料标记的链亲和素。

在一个实施方案中，产生了包含可特异性识别Mtb多肽的T细胞的细胞悬液，并使所述细胞在悬液中与所述四聚体反应。在一个实施方案中，这些试剂用于标记细胞，然后通过荧光活化的细胞分拣(FACS)进行分析。用于FACS的机器采用了多个颜色通道、低角度以及钝角光散射检测通道和阻抗通道以及其他更精密的检测水平来分离或分拣细胞。可以使用任何FACS技术，只要它不损害对目标细胞的检测。(对于FACS的示例性方法，参见美国专利No.5,061,620，其以引用的方式纳入本文)。

B.皮试

在另一方面，本发明提供了通过皮试使用一种或多种上述多肽诊断分枝杆菌感染（特别是结核病）的方法。“皮试”是指给药到皮肤中例如皮内注射一种或多种上述多肽后测量迟发型超敏(DTH)反应（例如硬结、肿胀、发红或皮炎）的直接在患者身上进行的任何测定。这种注射可以使用足以使所述一种或多种多肽与患者真皮细胞接触的任何适合装置实现，例如结核菌素注射器或1ml注射器。在几个实例中，所述反应是在注射后至少48小时测量的，例如注射后约48小时和约72小时之间。

DTH反应是细胞介导的免疫应答，其在以前已暴露于测试抗原(Mtb多肽、结合MHC的其片段或其融合蛋白)的受试者中更强。所述应答可以视觉测量，例如使用尺子。在几个实例中，直径超过约0.5cm，例如直径超过约1.0cm，的应答是阳性应答，指示分枝杆菌感染。

本文公开的Mtb多肽可以为用于皮试制成含有多肽和生理可接受载体的药用组合物。这些组合物通常含有一种或多种本文公开的Mtb多肽(或结合MHC的其片段或其融合蛋白)，其含量为每0.1ml体积中约1μg至约100μg，例如约10μg至约50μg。药用组合物中所用载体可以是含有适合的防腐剂例如苯酚和/或TWEEN80^TM的盐水溶液。

一般来说，在皮试中使用的多肽具有足够的大小，使其在反应持续期间保留在注射部位处。在几个实例中，长度至少为9个氨基酸的多肽是足够的。不受理论的限制，所述多肽在注射后几小时内被巨噬细胞分解，以使得可呈递到T细胞。这样的多肽可以包含一个或多个上述公开的序列和/或其他免疫原性或非免疫原性序列的重复。

因此，所述肽被T细胞识别的确定可以在体内测量。在几个实例中，将所述肽给药至所述个体，然后可以测量指示所述肽的识别的应答。在一个实施方案中，所述肽是通常以与Mantoux测试类似的方式通过皮内给药的。所述肽可表皮给药。通常，所述肽通过针头例如通过注射给药，但是也可以通过其他方法例如弹道法（ballistics）例如已经用于递送核酸的弹道技术给药。已公布的EPC申请No.EP-A-0693119描述了通常可以用于肽给药的技术。在几个实例中，给予0.001μg到1000μg，例如0.01μg到100μg或0.1μg到10μg肽。或者，可以给药能够在体内提供肽的药剂。因此，可以给药能够表达所述多肽的多核苷酸。多肽在体内从多核苷酸表达，并可以在体内测量所述肽的识别。通常情况下，给予0.001μg到1000μg，例如0.01μg到100μg或0.1μg到10μg的多核苷酸。

C.抗体的检测

本文公开了应用上述多肽诊断分枝杆菌感染（特别是结核病）的方法。在这些实施方案中，提供了单独或组合使用一种或多种上述多肽用于检测生物样本中分枝杆菌感染的方法。在几个实施方案中，使用了多种多肽。在测定中使用了所述多肽，以确定生物样本(例如但不限于全血、痰液、血清、血浆、唾液或脑脊液)中针对所述多肽的抗体相对于对照存在与否。这种抗体的存在指示以前对分枝杆菌抗原的敏化，所述敏化可以指示分枝杆菌感染，特别是结核病。

在使用多于一种多肽的实施方案中，所述多肽可以是互补的，使得一种组分多肽将检测样本中的感染，而所述感染不能被另一组分多肽检测。互补多肽一般可以通过单独使用每种多肽评估从一系列已知感染分枝杆菌的患者中得到的血清样本来进行鉴定。确定哪些样本可以被每种多肽正确鉴定为阳性以后，可以配制出能够检测大多数或全部测试样本的两种或多种多肽的结合物。使用互补多肽可以提高诊断测试的敏感性。因此，可以在测定中包括超过一种上述Mtb多肽。所述测定中可以任选地包括来自Mtb的其他多肽(未在本文中描述的那些)。

有多种测定形式可以用于检测样本中的抗体（参见，例如Harlowand Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory(1988)，其以引用方式纳入本文）。一般来说，患者中Mtb感染的存在与否可以通过如下方式确定：(a)将从患者获得的生物样本与一种或多种Mtb多肽接触；(b)检测所述样本中与所述多肽结合的抗体的存在（或不存在）；以及(c)与对照的抗体水平进行比较。所述对照可以是标准值，例如预先确定的取舍点(cut-off)值。所述对照可以是已知感染Mtb的受试者中抗体的量，或者已知未感染Mtb的受试者中特异性结合所述多肽的抗体的量。

在几个实施方案中，所述测定法包括使用固定化在固相支持物上的多肽。所述特异性结合目标多肽的抗体结合到固相支持物。然后，所结合的抗体可以用含有可检测标记物的检测试剂进行检测。适合的检测试剂包括可结合到抗体/多肽复合体的标记抗体。适合的检测试剂还包括可结合到抗体多肽复合体的第二未标记抗体以及可特异性结合第二抗体的第三抗体。适合的检测试剂还包括报告基团标记的未结合多肽（例如在半竞争性测定中）。

或者，可以使用竞争性测定，其中将报告基团标记的结合到目标多肽的抗体与所述样本孵育。孵育后，所述抗体在所述抗原与所述样本孵育后可结合到固定化的抗原。所述样本的组分对标记抗体与所述固定多肽结合的抑制程度指示所述样本与所述固定化多肽的反应性。

用于本文公开的测定法中的固相支持物可以是所述抗原可以附着的任何固体材料。例如，所述固相支持物可以是微量滴定板中的测试孔或硝酸纤维素膜或其他适合的膜。或者，所述固相支持物可以是珠子或圆盘，例如玻璃、玻璃纤维、乳胶或塑料材料如聚苯乙烯或聚氯乙烯。所述固相支持物还可以是磁性粒子或光学纤维传感器，例如在例如美国专利No.5,359,681中所公开的那些。

可以使用多种技术使所述多肽结合到所述固相支持物。所述多肽的结合可以通过非共价缔合例如吸附，或共价附着例如所述抗原与支持物上的官能团之间的直接连接或通过交联剂连接来实现。

对于通过吸附的结合，结合可以通过使一种或多种Mtb多肽(一般在缓冲液中)与所述固相支持物接触适当长度的时间来实现。所述结合的接触时间通常介于约1小时和1天之间。一般来说，结合是通过使聚苯乙烯或聚氯乙烯固相支持物与一个量的一种或多种Mtb多肽接触实现的。所述Mtb多肽的量为约10ng到约1μg，例如约100ng抗原。

所述目标Mtb多肽与固相支持物的共价附着一般可以通过使支持物与双功能试剂进行反应来实现，所述双功能试剂能够与所述支持物和多肽上的官能团例如羟基或酰胺基团反应。例如，使用苯醌或者通过使支持物上的醛基与所述多肽上的胺或活性氢缩合，可以使Mtb多肽结合到具有适合的多聚物涂层的支持物上(PierceImmunotechnology Catalog and Handbook,A12A13,1991)。

在某些实施方案中，所述测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)。该测定可以通过首先将已经固定在固相支持物上（例如微量滴定板的孔中）的多肽抗原与所述样本相接触来进行，所述接触的方式使得所述样本中存在的能与目标多肽特异性结合的抗体与固定化的多肽相结合。然后，将未结合的样本除去，并加入能够结合到固定化的抗体-多肽复合体的检测试剂。使用适合于特异性检测试剂的方法确定仍保持结合的检测试剂的量。例如，所述检测方法可以检测荧光或检测酶活性的存在。

在一些实施方案中，将所述多肽固定化在所述支持物上；通常将支持物上任何剩余的蛋白结合位点阻断。可以使用任何适合的阻断剂例如牛血清白蛋白或TWEEN 20^TM阻断未结合的蛋白结合位点。然后将所述固定化的多肽与所述样本孵育，并使所述抗体与所述抗原结合。孵育之前，可以将所述样本用适合的稀释剂例如缓冲液如磷酸盐缓冲的盐水(PBS)稀释。一般来说，适合的接触时间（孵育时间）是足以检测分枝杆菌感染的样本中的抗体的存在的时间长度。在一个具体的非限制性的实例中，所述接触时间足以达到这样的结合水平，即其至少95%达到结合的和未结合的抗体之间的平衡。达到平衡所必需的时间可以通过测定一段时间内发生的结合水平来确定。在室温下，一般来说约30分钟的孵育时间是足够的。

然后，可以用适合的缓冲液例如含0.1%TWEEN 20^TM的PBS冲洗所述固相支持物以除去未结合的样本。然后可以将检测试剂加至所述固相支持物。所述检测试剂可以是能够结合到固定化抗体-多肽复合体并可以被检测的任何化合物。在几个实施方案中，所述检测试剂含有缀合到标记物的结合剂(例如蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白、凝集素或游离抗原)。所用的标记物包括酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、底物、辅因子、抑制剂、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团和生物素。所述结合剂与标记物的缀合可以使用本领域已知的方法实现；缀合的结合剂也可以是市售的(例如来自Zymed Laboratories,San Francisco,Calif.,and Pierce,Rockford,Ill.)。

将所述检测试剂与所述固定化的抗体-多肽复合体孵育足以检测所结合的抗体的时间长度。一般来说，适合的时间长度可以从制造商的说明书或者通过分析经过一段时间后发生的结合水平来确定。然后除去未结合的检测试剂，使用标记物检测已结合的检测试剂。对于放射性标记物，可以使用闪烁计数或放射自显影方法来检测。可以使用光谱法检测用作标记物的染料、发光基团或荧光基团。生物素可以使用与不同标记物例如放射性标记物、荧光标记物或酶标记物偶联的亲和素来检测。酶标记物可以通过加入底物(一般维持一段时间)，然后对反应产物进行光谱或其他分析来检测。

为了确定所述样本中抗分枝杆菌的抗体的存在与否，通常将从结合到所述固相支持物的标记物检测到的信号与对照进行比较。在一个实施方案中，所述对照是标准值，例如将所述固定化的抗原与来自未感染患者的样本孵育时获得的信号平均值。一般来说，产生高于对照两个或三个标准差的信号的样本，被认为是分枝杆菌感染阳性的。在另一个实施方案中，所述对照值是依据Sackett et al.,ClinicalEpidemiology:A Basic Science for Clinical Medicine,Little Brownand Co.,pp.106107(1985)中所述的方法使用接受者工作曲线（Receiver Operator Curve）确定的。简言之，在该实施方案中，所述对照值从对成对的真阳性率（灵敏性）和假阳性率(100%特异性)的图确定，所述成对的真阳性率和假阳性率对应于诊断测试结果的每个可能的对照值。在图上围住最大面积的对照值是最精确的取舍点值，产生高于通过该方法确定的取舍点值信号的样本，被认为是阳性的。或者，可以移动所述取舍点值以最小化假阳性率或最小化假阴性率。一般来说，产生高于用该方法确定的取舍点值的信号的样本被认定为结核病阳性的。

在相关的实施方案中，所述测定以快速流过或测试条形式进行，其中将所述抗原固定化在膜例如但不限于硝酸纤维素膜上。在流过试验中，当样本经过所述膜时，样本中的抗体与固定化的多肽结合。当含有检测试剂的溶液流过膜时，检测试剂（例如蛋白A-胶体金）与所述抗体-多肽复合体结合。检测结合的检测试剂可以如上所述进行。

在测试条形式的一个实例中，将结合有所述多肽的膜的一端浸入含有所述样本的溶液中。所述样本沿着所述膜迁移，通过含有所述检测试剂的区域并到达固定化多肽的区域。所述多肽处的检测试剂的浓度指示样本中抗分枝杆菌抗体的存在情况。通常，该位点处检测试剂的浓度产生可以视觉读出的图案例如线。不存在这种图案表示阴性结果。一般来说，对固定化在膜上的多肽的量进行选择，以便当生物样本含有足以在酶联免疫吸附分析(ELISA)中产生阳性信号的抗体水平时，产生可视觉辨别的图案。在几个实施方案中，固定化在膜上的多肽的量的范围为约25ng到约1μg，例如约50ng到约500ng。这种测试通常使用非常小体积的患者血清或血液来进行。

D.多核苷酸的检测

诊断方法包括使用编码一种或多种上述公开的Mtb多肽的多核苷酸序列。可以通过检测生物样本中编码分枝杆菌多肽的mRNA的存在、不存在或水平来检测分枝杆菌感染。在几个实例中，使用了杂交测定，例如Northern印迹或斑点印迹测定。在其他实例中，使用了以PCR为基础的测定。

用于mRNA提取的常用方法是本领域公知的，并且公开在标准的分子生物学教科书中，包括Ausubel et al.,Current Protocols ofMolecular Biology,John Wiley and Sons(1997)。用于石蜡包埋的组织提取RNA的方法公开在例如Rupp and Locker,Lab Invest.56:A67(1987)以及De Andres et al.,BioTechniques 18:42-44(1995)中。具体来说，可以使用制造商例如的纯化试剂盒、缓冲液组合以及蛋白酶，并依据制造商的说明书来进行RNA的分离。例如，来自培养物(例如从受试者中获得的)中细胞的总RNA可以应用

RNeasy小型柱进行分离。其他市售的RNA分离试剂盒包括MASTERPURE^TM全DNA和RNA纯化试剂盒(Madison,Wis.)和石蜡块RNA分离试剂盒(Ambion,Inc.,Austin,TX)。来自组织样本的总RNA可以用RNA Stat-60(Tel-Test,Friendswood,TX)进行分离。从生物样本制备的RNA也可以例如通过氯化铯密度梯度离心法进行分离。

用于定量mRNA的方法是本领域技术人员公知的。在一个实例中，所述方法应用反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。一般来说，通过RT-PCR进行基因表达作谱的第一个步骤是将RNA模板反转录为cDNA，然后在PCR反应中对其进行对数扩增。两种最常使用的反转录酶是禽类成髓细胞瘤病毒反转录酶(AMV-RT)和莫洛尼（Moloney）鼠白血病病毒反转录酶(MMLV-RT)。依据环境和表达作谱的目标，所述反转录步骤通常使用特异性引物、随机六聚体或寡聚dT引物引发。例如，提取的RNA可以用GeneAmp RNA PCR试剂盒(Perkin Elmer，Calif.,USA)，并按照制造商的说明书进行反转录。然后，所得到的cDNA可以作为模板用于随后的PCR反应中。

虽然所述PCR步骤可以使用多种热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶，然而其通常使用Taq DNA聚合酶，其具有5'-3'核酸酶活性但是缺乏3'-5'校读内切酶活性。因此，

PCR通常使用Taq或Tth聚合酶的5'-核酸酶活性来水解结合到靶扩增子的杂交探针，但是也可以使用具有等效的5'核酸酶活性的任何酶。使用两条寡核苷酸引物来产生PCR反应的典型扩增子。设计第三寡核苷酸或探针用于检测介于两条PCR引物之间的核苷酸序列。所述探针不能被Taq DNA聚合酶延伸，被报告荧光染料和淬灭荧光染料标记。当两种染料在探针上的位置靠近在一起时，来自报告染料的任何激光诱导的发射被淬灭染料淬灭。在扩增反应过程中，Taq DNA聚合酶以模板依赖的方式切割探针。产生的探针片段溶解于溶液中，并且来自释放的报告染料的信号脱离第二荧光染料的淬灭效应。每个合成的新分子释放一个报告染料分子，并且对未淬灭的报告染料进行检测为定量解释数据提供了基础。

可以使用市售的设备进行RT-PCR，例如ABI PRISM

Sequence Detection System.TM.(Perkin-Elmer-AppliedBiosystems,Foster City,Calif.,USA)或

(Roche AppliedScience,Mannheim,Germany)。在一个实施方案中，所述5'核酸酶程序是在实时定量PCR装置，例如ABI PRISM SequenceDetection

上运行的。该系统包括热循环仪、激光器、电荷耦合装置(CCD)、照相机和计算机。该系统以96孔板形式在热循环仪上扩增样本。在扩增期间，通过光纤实时收集全部96孔的激光诱导的荧光信号，并在CCD上进行检测。该系统包括用于运行仪器和分析数据的软件。

在一些实例中，5'-核酸酶测定数据最初表示为C_t或阈值循环。如上所述，在每一个循环中记录荧光值，并且所述荧光值代表至所述扩增反应该点时扩增的产物的量。当首次记录到统计学上显著的荧光信号时，该点为阈值循环(C_t)。

为最小化错误和样本与样本之间差异的影响，可以使用内标进行RT-PCR。理想的内标在不同组织中以恒定水平表达，并且不受实验处理的影响。最常用于归一化基因表达模式的RNA是看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和β-肌动蛋白的mRNA以及18S核糖体RNA。

RT-PCR技术更新的变型是实时定量PCR，其通过双重标记的产荧光探针(即

探针)测量PCR产物积累。实时PCR是与使用每个靶序列的内部竞争物进行归一化的定量竞争性PCR和使用样本中含有的归一化基因或看家基因进行RT-PCR的定量比较PCR相兼容的(参见Heid et al.,Genome Res.6:986-994,1996)。美国专利No.5,538,848中也对定量PCR进行了描述，其以引用的方式纳入本文。美国专利No.5,716,784和美国专利No.5,723,591中描述了相关的探针和定量扩增步骤，其以引用的方式纳入本文。用于在微量滴定板中进行定量PCR的仪器可以从PE Applied Biosystems,850LincolnCentre Drive,Foster City,Calif.94404获得，商品名称为ABI

7700。

使用固定的、石蜡包埋的组织作为RNA来源，对基因表达进行定量的代表性方案的步骤包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增，它们在多种出版的杂志文章中给出(参见Godfrey et al.,J.Mol.Diagn.2:84-91,2000；Specht et al.,Am.J.Pathol.158:419-429,2001)。简言之，代表性的方法从切出约10μm厚的石蜡包埋的组织样本切片开始。然后提取RNA，并除去蛋白质和DNA。分析RNA浓度以后，如果需要可以包括RNA修复和/或扩增步骤，并用基因特异的启动子进行反转录，然后进行RT-PCR。

美国专利No.5,219,727中描述了另外的定量核酸扩增步骤，其以引用的方式纳入本文。在该方法中，通过同时扩增所述靶序列和内标核酸区段确定样本中靶序列的量。确定从每个区段扩增的DNA的量，并与标准曲线比较以确定扩增之前存在于所述样本中的靶核酸区段的量。

在该方法的一些实施方案中，也可以对“看家”基因或“内部对照”的表达进行评估。这些术语意指包括其存在可以评估细胞因子mRNA水平的任何组成型或全局表达的基因。这种评估包括确定基因转录的总组成型水平以及用于RNA回收变异的对照。

E.监测感染的发展和/或治疗的有效性

在几个实施方案中，本文公开的诊断方法用于监测分枝杆菌感染的发展。在该实施方案中，可以随着时间的推移进行上述用于诊断分枝杆菌感染的测定，并评估反应性多肽水平的变化。例如，所述测定可以在一个时间例如几个月或几周内每隔12、24、36、48、60或72小时进行，此后可按需要进行。

在一些实例中，评估了Mtb多肽或编码所述多肽的多核苷酸的存在情况。一般来说，在如下情况下这些患者中的分枝杆菌感染正在发展：其体内的多肽水平(例如使用结合剂检测的)、多核苷酸水平、抗体水平或T细胞水平随时间增加。相反地，当反应性多肽水平、多核苷酸水平、抗体水平或T细胞水平保持恒定或随时间降低时，所述分枝杆菌感染没有发展。以此种方式，可以评估具体治疗方案的有效性。

在一个实施方案中，评估了受试者中Mtb多肽或多核苷酸的存在情况。对受试者给予治疗方案。然后评估所述Mtb多肽的存在情况。与给予所述治疗方案之前所述Mtb多肽的量相比，所述Mtb多肽（或多核苷酸）量增加或没有变化表明该治疗方案无效，所述Mtb感染正在发展。与给予所述治疗方案之前所述Mtb多肽（或多核苷酸）的量相比，所述Mtb多肽（或多核苷酸）量降低表明该治疗方案有效，所述Mtb感染不再发展。

在另一个实施方案中，评估了受试者中特异性识别Mtb抗体的T细胞例如CD8⁺T细胞和/或CD4⁺T细胞的存在情况。对受试者给予治疗方案。然后评估了特异性识别所述Mtb多肽的T细胞的存在情况。与给予所述治疗方案之前特异性识别所述Mtb抗体的T细胞例如CD8⁺T细胞和/或CD4⁺T细胞的量相比，特异性识别所述Mtb抗体的T细胞例如CD8⁺T细胞和/或CD4⁺T细胞的量降低或没有变化，表明该治疗方案无效。与给予所述治疗方案之前特异性识别所述Mtb抗体的T细胞例如CD8⁺T细胞和/或CD4⁺T细胞的量相比，特异性识别所述Mtb抗体的T细胞例如CD8⁺T细胞和/或CD4⁺T细胞的量增加，表明该治疗方案有效。

需要指出的是，对于上述任何测定，为提高灵敏性，可以在给定样本中分析多个分枝杆菌标记物。显然，本公开的测定可以组合使用。因此，分枝杆菌多肽（或多核苷酸）组以及测定法组合可用于优化灵敏性和特异性。

许多已有的其他测定方案也适用于本发明的多肽。上述仅意图作为示例。

通过下述非限制性实施例对本公开进行说明。

实施例

实施例1

抗原选择

在美国俄勒冈州波特兰对包含39499个Mtb肽的肽文库筛选在Mtb感染的个体中被强烈且共同识别的抗原和/或表位。该肽文库代表389个基因，占Mtb基因组的约10%。对于每个基因产物，所述肽是有11个氨基酸重叠的15mer肽。每种肽分别合成50nmol，然后以96孔的格式合并到777个50种肽的肽池中（9个板）。所述9个板的每个板中都包含5个空白孔和1个无关肽池，SIV gag。

通过IFN-γELISPOT将来自供体的CD8⁺T细胞针对所述肽文库进行筛选。如之前所述(Beckman et al.,J.Immunol.157:2795-2803,1996)进行所述IFN-γELISPOT测定。为确定响应Mtb感染或Mtb抗原的CD8⁺T细胞的体外频率，使用磁珠(Miltenyi Biotec,Auburn CA)从外周血单核细胞中选出阳性CD8⁺T细胞作为应答T细胞源，并测试它们对自体DC的应答。对每板基因组肽文库进行双份重复筛选，每次筛选总共18个ELISPOT板。使用磁珠分离通过CD8选择从冷冻保存的PBMC中制备CD8+T细胞。得到的细胞群体包含>99%的CD8+T细胞。将CD8+T细胞(250,000细胞/孔)、自体DC(20,000个细胞/孔)和IL-2(0.5ng/ml)加入至所述ELISPOT板中的肽(每种肽最终为5ug/ml)。每块板上包含5个培养基对照孔。使用AID EliSpot分析仪系统计算斑点数目。对于每块板，从该板的每个孔中减去这5个孔的平均值以在板之间归一化。然后对每块板上的每个技术重复(technical replicate)进行评分。如果所述斑点形成单位(SFU)减去所述培养基孔的平均值大于或等于10并且所述SFU大于或等于所述培养基孔的平均值的两倍，则孔被计为阳性。测试了20个供体，包括15名LTBI(6名白种人，4名非裔美国人，5名SE亚洲人)和5名具有活动TB的供体。

使用两个标准来选择所述肽池。第一，肽池必须在供体应答的上5%中。第二，所述肽池必须被三名或更多供体识别。不管这些标准的应用次序如何，通过该方法选择的肽池是相同的。如果仅一个技术重复是统计学阳性的，在所述供体筛选中孔也被认为是阳性的。但是，由于当两个技术重复都是阳性时有更大的可信度，比较以下两种情况下所述选出孔：对具有两个阳性技术重复的孔的平均斑点形成单位(SFU)加权200％，以及不对所述平均SFU加权。如果没有对所述技术重复加权，则选出32个孔，如果使用了加权则选出35个孔。但是，对所述平均SFU加权或不加权都有19个孔被选出，选择这些孔用于进一步分析(表2)。

表2.为临床验证研究选出的抗原和表位

抗原编号	Rv编号	基因名称
			1	Rv3641e(33)1	fic
2	Rv3136(46)：Rv3135(4)	PPE51：PPE50
			3	Rv0383c(30)：Rv0394c(20)	Rv0383c：Rv0394c
4	Rv1184c(20)	Rv1184c
			5	Rv3514(47)：Rv3532(3)	PE_PGRS57：PPE61
6	Rv3558(44)：Rv3539(6)	PPE64：PPE63
			7	Rv1979c(50)	Rv1979c
8	Rv1980c(28)：Rv1984c(22)	mpt64：cfp21
			9	Rv3347c(50)	PPE55
10	Rv0151c(50)	PE1
			11	Rv1997(50)	ctpF
12	Rv1997(50)	ctpF

抗原编号	Rv编号	基因名称
			13	Rc0159c(50)	PE3
14	Rv1997(5O)	ctpF
			15	Rv2711(37)：Rv1404(13)	ideR：Rv1404
16	Rv1706c(50)	PPE23
			17	Rv2041c(50)	Rv2041e
18	Rv2041c(43)：Rv2093c(7)	Rv2041c：tatC
			19	Rv1039c(50)	PPE15

1来自每个基因的肽的数目显示于括号中

实施例2

选出的抗原的筛选

将实施例1中确定的抗原在CD8 ELISPOT测定中针对来自乌干达的潜伏性和活动性的TB供体进行筛选。使用AID ELISPOT分析仪读取ELISPOT板，将结果输出至电子表格（excel）文件中。将数据输入

9.1版(SAS Institute,Inc.,Cary,NC)并分析。在中对阳性ELISPOT创建分类变量。对于对所述抗原的阳性应答，含所述抗原的孔的平均值必须比背景孔大2个标准差。如果这点成立，减去背景，然后该差值必须大于10点。类似地，如果所述抗原符合上述分类标准，则对每个抗原创建连续ELISPOT变量，该变量详述斑点形成单位的余值。结果通过活动性或潜伏性的TB分级的阳性应答的比例以及相应的斑点形成单位作图(图1A和B)。

对于验证阶段选出了5个抗原。在所述选择中考虑了数个因素，包括表明疾病特异性的那些抗原，以及具有广泛而强烈应答的抗原。这些抗原包括PPE50:51、PE3、CtpF、PPE15和EsxJ。在所述验证阶段研究了56个潜伏性的和52个活动性的TB个体。21名个体(19.2%)在预设定的取舍点(cut-off)下对所有5种抗原应答，而10名个体(9%)对其中4种抗原应答。40名个体(36%)对最多3种抗原应答，35%对选出的5种抗原中的任一种都不应答。尽管在所述筛选阶段注意到了一些疾病特异性，尤其是其应用于PPE50:51时，但是这在验证阶段不明显。

还研究了所述应答的幅度。使用泊松建模，具有潜伏性疾病的个体比具有活动疾病的个体对4种抗原(PPE50:51,cTPF,PPE15,EsXJ)具有显著更多的斑点计数，但是所述差异在临床上没有意义(图2)。

实施例3

其他抗原

使用实施例1描述的方法选择其他抗原。表3提供了所述其他抗原。

将所述其他确定抗原在CD8ELISPOT测定(如实施例1和2所描述)中针对来自乌干达的潜伏性和活动性TB供体进行筛选。结果通过相应的斑点形成单位作图(图3)。

表3.用于临床验证研究的其他抗原和表位

Rv_编号(#肽池中的肽)	基因名称
		Rv0284(17)：Rv0288(11)	Rv0284：esxH
Rv0917(31)	betP
		Rv1243c(50)	PE_PGRS23
Rv3345c(100)	PE_PGRS50
		Rv3163c(41)：Rv3194c(9)	Rv3163c：Rv3194c
Rv0977(50)	PE_PGRS16
		Rv0152c(40)：Rv0151c(10)	PE2：PE1
Rv1917c(50)	PPE34
		Rv2040c(37)：Rv2025c(13)	Rv2040c：Rv2025c
Rv2356c(50)	PPE40
		Rv3159c(50)	PPE53
Rv1172c(32)：Rv1195(18)	PE12：PE13
		Rv1348(35)：Rv1343c(15)	Rv1348：lprD
Rv3873(50)	PPE68

实施例4

肽特异的T细胞克隆的鉴定

使用肽脉冲的DC作为APC并使用有限稀释克隆方法，从具有LTBI或活动性TB的个体中分离肽特异的T细胞克隆。简要地，使用CD8抗体包被的磁珠根据制造商(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,德国)说明书，使用阳性选择从PBMC中分离CD8+T细胞。在200μl由添加有10%人血清的RPMI 1640组成的细胞培养基中，在存在2×10⁴辐射自体肽脉冲的DC、1×10⁵辐射自体PBMC和rIL-2(5ng/ml)的情况下，以多种浓度接种T细胞。使用ELISPOT并使用肽脉冲的DC作为APC源，对在10-14天表现出生长的孔评估肽特异性。对保留了肽特异性的T细胞通过FACS进一步进行αβT细胞受体表达和CD8表达的表型测试。

使用15mer Rv3136_137-151，使用已经描述的方法对所述肽产生T细胞。已经产生了抗原特异的CD8⁺T细胞克隆，确定了其最小表位。所述最小表位被定义为在肽的最低浓度下可被T细胞识别的表位。对在15-mer之内的每个9-mer、10-mer和11-mer肽在大的肽浓度范围内进行了测试，将在最低肽浓度下激发应答的肽定义为最小表位。包含Rv3136(SEQ ID NO:2)的139-149氨基酸的肽在最低浓度下可被T细胞识别(图4)，氨基酸141-49在所有测试肽的最低浓度下均激发应答。

实施例5

动物模型

在结核病研究中，小鼠和豚鼠模型被广泛用于模拟所述疾病的多个方面。

A.小鼠模型：

小鼠可以通过多种途径感染，包括静脉内、腹膜内和气管。一种途径是将传染性生物体气溶胶化用于呼吸感染。将小鼠在仓室中暴露于气溶胶(整个身体或仅仅鼻子感染)。感染剂量可以通过操纵喷雾器中Mtb的浓度或暴露的时间来改变。通过气溶胶的低剂量例如大约50个菌落形成单位(CFU)的感染，可导致肺中细菌数量缓慢而稳定地增加，一般在4周内达到峰值，这与肺中T细胞的峰值数量相一致。起始时期被认为是感染的急性阶段。感染后，细菌向纵隔淋巴结扩散。一般在2到3周之间可以检测到T细胞引发。在大约4周后，细菌的数量稳定了，产生了缓慢进展的病理性反应。该系统用于模拟活动性感染。因此上面描述的多肽或编码这些多肽的多核苷酸可以在感染前施用。然后评估Mtb多肽(或编码这些多肽的多核苷酸)防止感染的能力。或者，给小鼠施用Mtb，并监测Mtb多肽(或编码这些多肽的多核苷酸)治疗Mtb感染的能力。可以通过测量T细胞应答——例如CD8⁺或CD4⁺T细胞的数量、和/或测量细菌的数量、和/或评估病理学来监测Mtb多肽(或多核苷酸)的效力。

示例的方案提供如下(也参见Repique等，Infec.Immun.70:3318-3323,2002，以引用的方式纳入本文用于其他方案)。

1.短期小鼠模型：

按照适合的方案，用包含一种或多种Mtb多肽或编码这一种或多种多肽的多核苷酸的组合物接种C57BL/6小鼠，然后饲养4到6周。将被免疫的小鼠用有毒力的结核分枝杆菌的低剂量气溶胶(50-100CFU)感染，通过评估攻击后30天时活菌的数量来评估保护作用。

通过将器官匀浆并将连续10倍稀释液铺于7H11琼脂板上，对小鼠的肺和脾脏上进行活菌计数。平板被培养最多21天，确定每个器官的菌落形成单位数。

BCG接种的小鼠与PBS处理的小鼠相比，在它们的肺脏和脾脏中具有大约1Log₁₀的保护作用。

B.豚鼠模型

1.短期豚鼠模型

用包含一种或多种Mtb多肽或编码这一种或多种多肽的多核苷酸的组合物接种远系繁殖的Hartley豚鼠，然后饲养8-10周。将被免疫的豚鼠用有毒力的结核分枝杆菌的低剂量的气溶胶(10-30CFU)感染，通过评估攻击后30天时活菌数量来评估保护作用。

通过将器官匀浆并将连续10倍稀释液铺于7H11琼脂板上，对豚鼠的肺和脾脏进行活菌计数。平板被培养最多21天，确定每个器官的菌落形成单位数。取部分肺脏和脾脏用于组织学分析。

BCG接种的豚鼠与PBS处理的豚鼠相比，在它们的肺脏和脾脏中具有大约2-3Log₁₀的保护作用。此外，BCG接种的豚鼠与未接种的动物相比具有轮廓分明的肉芽肿。

2.长期豚鼠模型

该豚鼠模型与小鼠模型类似，但是该实验是终点开放的存活类型，可以持续长达两年。豚鼠发展出与患有活动性结核病(TB)的人类相似的“典型”肉芽肿，并且随着肺部组织坏死发展，它们与人类相似开始体重降低并死于TB。可以评估肺脏和脾脏中的菌落形成单位数。也可以进行组织学检查以确定肺部牵涉和组织破坏的程度。在暴露于低剂量的气溶胶后，豚鼠中生物体的数量在前3周进行性增加，然后到达平台期进入慢性阶段。在感染的后期，在肺中细菌的载量增加，这与恶化的病理状况有关。不治疗的话，在感染的豚鼠的肺中CD4和CD8T细胞相伴升高。

按照适合的方案，用实验疫苗（例如包含一种或多种Mtb多肽，或编码这一种或多种多肽的多核苷酸的组合物）接种远系繁殖的Hartley豚鼠，然后饲养8-10周。然后将被免疫的豚鼠用有毒力的结核分枝杆菌的低剂量的气溶胶(10-30CFU)感染。对豚鼠每周称量体重，每天监测疾病的征象(例如呼吸增加和生长迟滞)。未接种的豚鼠在攻击后20到25周死于感染，而BCG免疫接种的豚鼠在攻击后存活了50到55周。

尸检时，评估肺脏和脾脏的CFU数量和病理程度。将实验组合物的相对保护作用与BCG接种的动物进行了比较。

实施例6

检测受试者中的Mtb

本实施例描述了可以用于检测受试者中Mtb存在情况的示例性方法。但是，本领域技术人员知晓不同于这些具体方法的方法也可以用于成功检测样本中的Mtb。在一些实例中，检测Mtb可将受试者诊断为患有结核病或具有发生结核病的风险。

从受试者（例如怀疑被Mtb感染或具有被Mtb感染风险的受试者）获取临床样本，例如血液样本、外周血单核细胞、痰液、唾液或脑脊液。在一些实例中，T细胞通过常规方法从样本中分离。在其他实例中，核酸用常规方法（例如用市售试剂盒）从所述样本中分离。

在一个实例中，将来自受试者的含有T细胞的样本与公开的Mtb多肽(例如SEQ ID NO:1-18的多肽或其片段)，例如约0.5μg/ml到50μg/ml多肽接触约4到24小时。测试所述T细胞以确定所述多肽是否能够被T细胞识别，例如通过测量所述多肽与所述T细胞的结合(例如，使用FACS，检测T细胞活化或细胞因子分泌)。

在另一个实例中，使用酶免疫分析例如IFA、ELISA或免疫印迹检测受试者中所公开的Mtb多肽。能够有效检测Mtb抗体的示例性ELISA方法例如如下：1)使Mtb多肽(例如SEQ ID NO:1-18的多肽或其片段)与底物结合；2)使所述结合的多肽与来自所述受试者的液体或组织样本接触；3)使上述物质与第二抗体接触，所述第二抗体结合到能够与所结合的抗体反应的可检测部分(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)；4)使上述物质与所述酶的底物接触；5)使上述物质与着色剂接触；以及6)观察/测量颜色变化或显影。在另外的实例中，使来自所述受试者的样本与特异性结合一种或多种本公开的Mtb多肽的抗体接触。检测到所述抗体与所述样本中多肽的结合(例如使用夹心ELISA)表明来自所述受试者的样本中存在所述Mtb多肽。

在另一个实例中，RT-PCR是在一个包括反应混合物(例如缓冲液、MgCl₂、dNTP和DNA聚合酶)、样本RNA和探针以及对本文公开的一种或多种Mtb多肽特异的引物的反应物中进行。

在一些实例中，检测到来自受试者的样本中的Mtb(例如与公开的Mtb多肽特异性反应的Mtb抗体、多肽、多核苷酸或T细胞)表明所述受试者被Mtb感染或具有患结核病的风险。在另外的实例中，选择疗法用于被诊断患有Mtb感染的受试者，例如抗生素治疗。

在其他实例中，公开的Mtb多肽经皮内给药至个体，通常以与Mantoux测试类似的方式。所述肽通常通过针头例如通过注射给药，但是也可以通过其他方式例如弹道法例如已经用于递送核酸的弹道技术给药。在几个实例中，给予0.001μg到1000μg，例如0.01μg到100μg或0.1μg到10μg肽。在注射以后至少48小时，例如注射以后介于约48小时和约72小时之间，测量反应(例如迟发型超敏反应)。所述应答可以通过视觉测量，例如用尺子。在几个实例中，直径超过约0.5cm例如直径超过约1.0cm的应答是阳性应答，并且指示具有分枝杆菌感染。

很明显所述方法或组合物的具体细节可以在不背离本发明的精神的情况下被改变和修改。发明人要求所有落入下述权利要求书范围和主旨内的修改和变异。

Claims (26)

1.一种用于检测受试者中结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）的方法，其中包括

使含有T细胞的来自所述受试者的生物样本与一种或多种分枝杆菌多肽以及呈递所述一种或多种分枝杆菌多肽的抗原呈递细胞接触，其中所述一种或多种分枝杆菌多肽含有如下显示的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16显示的氨基酸序列之一；或

(b)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16显示的氨基酸序列的至少一个的至少9到20个连续的氨基酸，其中所述9到20个连续的氨基酸可特异性结合到I类主要组织相容性复合物(MHC)；并且

确定所述T细胞是否特异性识别所述分枝杆菌多肽，其中特异性识别所述分枝杆菌多肽的T细胞的存在检测受试者中的结核分枝杆菌。

2.权利要求1所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:2中的第1-15位氨基酸或SEQ ID NO:2中的第141-149位氨基酸或由其组成。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述T细胞是CD8⁺T细胞。

4.权利要求3所述的方法，其中通过测量来自所述CD8⁺T细胞的细胞因子的分泌来确定所述CD8⁺T细胞是否特异性识别所述分枝杆菌多肽。

5.权利要求4所述的方法，其中所述细胞因子是γ干扰素(IFN-γ)。

6.权利要求5所述的方法，其中使用可特异性结合IFN-γ的抗体来测量IFN-γ的分泌。

7.权利要求1或2所述的方法，其中所述生物样本是血液、分离的外周血单核细胞或分离的单核细胞。

8.权利要求1或2所述的方法，其中将所述T细胞与所述分枝杆菌多肽在体外培养。

9.权利要求1或2所述的方法，其中将所述多肽给予所述受试者。

10.含有有效量的分枝杆菌多肽的组合物用于检测受试者中结核分枝杆菌的用途，其中所述分枝杆菌多肽含有如下显示的氨基酸：

(a)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16显示的氨基酸序列之一；或

(b)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16显示的氨基酸序列的至少一个的至少9到20个连续的氨基酸，其中所述9到20个连续的氨基酸可特异性结合到I类主要组织相容性复合物(MHC)；

其中所述用途包括将所述分枝杆菌多肽给予受试者的皮肤，并检测受试者中可特异性识别所述分枝杆菌多肽的CD8⁺T细胞的存在情况。

11.权利要求10所述的用途，其中所述多肽含有SEQ ID NO:2中第1-15位氨基酸或SEQ ID NO:2中第141-149位氨基酸或由其组成。

12.权利要求10或11所述的用途，其中检测CD8⁺T细胞的存在情况包括在体内检测CD8⁺T细胞的存在情况。

13.权利要求12所述的用途，其中检测CD8⁺T细胞的存在情况包括检测迟发型超敏反应。

14.权利要求13所述的用途，其中所述分枝杆菌多肽经皮内给予所述受试者，并且其中所述迟发型超敏反应是通过测量皮肤的发红、肿胀或硬结而测量的。

15.一种检测受试者中结核分枝杆菌感染的方法，包括

检测来自所述受试者的样本中分枝杆菌多肽或编码所述多肽的多核苷酸的存在情况，其中所述分枝杆菌多肽含有SEQ ID NO:2、SEQID NO:6、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16显示的氨基酸序列之一显示的氨基酸序列。

16.权利要求15所述的方法，其中所述多肽含有SEQ ID NO:2中第1-15位氨基酸或SEQ ID NO:2中第141-149位氨基酸或由其组成。

17.权利要求15或16所述的方法，包括确定所述分枝杆菌多肽的存在情况。

18.权利要求17所述的方法，其中确定所述分枝杆菌多肽的存在情况包括使用可特异性结合所述分枝杆菌多肽的抗体。

19.权利要求15或16所述的方法，包括确定所述分枝杆菌多核苷酸的存在情况。

20.权利要求19所述的方法，其中确定所述分枝杆菌多肽的存在情况包括使用聚合酶链式反应。

21.权利要求15或16所述的方法，其中所述生物样本是血液、外周血单核细胞、痰液、肺脏活组织、淋巴结活组织、唾液、脑脊液或分离的T细胞。

22.一种检测受试者中结核分枝杆菌的方法，包括：

将有效量的分枝杆菌多肽给予至所述受试者皮肤中，其中所述分枝杆菌多肽含有如下显示的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16显示的氨基酸序列之一；或者

(b)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16显示的氨基酸序列的至少一个的至少9到20个连续的氨基酸，其中所述9到20个连续的氨基酸可特异性结合到I类主要组织相容性复合物(MHC)；并且

检测所述受试者中可特异性识别所述分枝杆菌多肽的CD8⁺T细胞的存在情况。

23.权利要求22所述的方法，其中所述多肽含有SEQ ID NO:2中的第1-15位氨基酸或SEQ ID NO:2中的第141-149位氨基酸或由其组成。

24.权利要求22或23所述的方法，其中检测CD8⁺T细胞的存在情况包括在体内检测CD8⁺T细胞的存在情况。

25.权利要求24所述的方法，其中检测CD8⁺T细胞的存在情况包括检测迟发型超敏反应。

26.权利要求25所述的方法，其中所述分枝杆菌多肽经皮内给予所述受试者，并且其中所述迟发型超敏反应是通过测量所述皮肤的发红、肿胀或硬结而测量的。

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