DE69825783T2

DE69825783T2 - Mittel zur qualitativen und quantitativen analyse mikrobiologischer populationen in einer probe

Info

Publication number: DE69825783T2
Application number: DE69825783T
Authority: DE
Inventors: Emmanuelle Guillot; Vincent Urbain; Jacques Manem; Bruce E. Rittmann; A. David STAHL; Jodi Flax; Micha[L Wagner
Original assignee: Suez Lyonnaise des Eaux; Northwestern University
Current assignee: Suez Lyonnaise des Eaux; Northwestern University
Priority date: 1997-10-08
Filing date: 1998-10-02
Publication date: 2005-08-25
Anticipated expiration: 2018-10-03
Also published as: EP1042502A1; AU732150B2; US6808879B1; DE69825783D1; CA2305573A1; AU1029499A; EP1042502B1; WO1999018234A3; DE1042502T1; ES2152913T1; FR2769323A1; ES2152913T3; FR2769323B1; WO1999018234A2; JP2001519168A

Description

Die Erfindung kann allgemein als ein Mittel zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Mikrobenpopulationen, die in einer Probe potenziell vorhanden sind, beschrieben werden. Sie ist insbesondere auf ein Mittel zur qualitativen und quantitativen Bestimmung unter Verwendung von Oligonucleotid-Sonden mit RNA als Target gerichtet.
Die Bestimmung potenziell vorhandener Mikrobenpopulationen ist für viele Arten von festen und fluiden Proben erforderlich. Einige wichtige Beispiele sind solche Proben, die von einer natürlichen oder biologischen Umgebung wie natürlichem Wasser oder heißen Quellen erhalten werden, Proben, die Mensch oder Tier entnommen worden sind, wie Blut-, Urin-, Vaginal- und Darmfloraproben und Proben von einer städtischen, landwirtschaftlichen und industriellen Umgebung wie Lebensmittel, Brauchwasser, industrielle Abflüsse, kommunales Abwasser, Industrieschlamm, Fermentationsmedien, Aerosole, Filter oder Luft von Klimaanlagen.
Für die qualitative und quantitative Bestimmung potenziell in einer Probe vorhandener Mikrobenpopulationen sind bereits verschiedene Laborverfahren entwickelt worden.
Ein übliches Verfahren beinhaltet das Zählen der Mikroorganismen, die sich vermehrt haben, nachdem die Probe (oder ein Extrakt davon) auf verschiedenen ausgewählten Nährmedien unter Standardbedingungen kultiviert worden ist. Dieses Verfahren ist einfach, birgt jedoch hohe Risiken von Fehlern und Artefakten (geringe Spezifität der morphologischen Kriterien, Unmöglichkeit, lebensfähige, aber nicht kultivierbare Mikroorganismen nachzuweisen, Unmöglichkeit, langsam sich vermehrende Mikroorganismen nachzuweisen und Erfordernis, die Lebensfähigkeit der Bakterien zwischen Sammlung und Zählung zu erhalten). Darüber hinaus benö tigt dieses Verfahren im Allgemeinen mehr als 24 Stunden, um Ergebnisse zu bringen.
Ein zweites Verfahren, an welchem die Messung der Aktivität von einem oder mehreren Enzymen beteiligt ist, ermöglicht eine schnelle Quantifizierung von Populationen lebender Mikroorganismen (kultivierbare Mikroorganismen und/oder Mikroorganismen in einer lebensfähigen, aber nicht kultivierbaren Form). Dieses Verfahren kann insbesondere zur Überwachung einer Gruppe von Populationen angewendet werden, erreicht jedoch kein sehr hohes Maß an Spezifität oder Sensitivität.
Ein drittes Verfahren, in welchem immunologische Sonden verwendet werden, erfordert oft eine Züchtungsstufe und somit mehr als 24 Stunden, um Ergebnisse zu bringen. Darüber hinaus mangelt es ihm häufig sowohl an Sensitivität als auch Spezifität (aufgrund von Kreuzreaktionen kann eine Fehlidentifizierung vorkommen).
Die modernsten Verfahren beruhen auf der Verwendung spezifischer DNA-Sanden, die im Allgemeinen markiert sind, um nach Hybridisierung mit ihren Targets eine Detektion zu erlauben. Dabei sind zwei Hauptkategorien von Oligonucleotid-Sonden entwickelt worden: diejenigen mit DNA und diejenigen mit RNA (ribosomale RNA oder Messenger-RNA) als Target.
Sonden mit DNA als Target haben, obwohl sie potenziell hochspezifisch sind, aufgrund der wenigen Kopien der Target-DNA-Gene in jeder Mikrobenzelle den Nachteil einer geringen Sensitivität. Obwohl durch die Anwendung der PCR (Polymerasekettenreaktion) zur Amplifizierung der Target-DNA-Sequenzen vor der Detektion die mangelnde Sensitivität der DNA-Sonden kompensiert werden kann, haben sie mehrere Nachteile: So kann beispielsweise das Vorhandensein von Inhibitoren zu falsch-negativen Reaktionen führen, während eine Übertragung oder eine ähnliche Kontaminierung zu falsch-positiven Reaktionen führen kann. Im Gegensatz dazu hat die Verwendung von Sonden mit RNA als Target solche Nachteile nicht. Insbesondere erfordert aufgrund der großen Anzahl von rRNA-Kopien, die natürlicherweise in einem Mikroorganismus vorkommen (aktiv sich vermehrende Zellen kön nen 10⁴ Ribosomen enthalten, wovon jedes ein potenzielles Sonden-Target ist), die Verwendung von Sonden mit rRNA als Target nicht die Amplifizierung, wodurch die damit einhergehenden Einschränkungen und Artefakte behoben werden. Dabei besteht der Vorteil von rRNA als Target darin, dass etwa 85 bis 90 Prozent aller RNA in einer typischen Zelle rRNA ist.
Die Hybridisierung von Sonden mit RNA als Target kann entweder nach Zell-Lyse, Extraktion und Reinigung aller Nucleinsäuren der Probe oder in situ mit ganzen Zellen, im Allgemeinen nach Fixierung (Permeabilisierung) der Membran (oder Zellwand) der in der Probe potenziell vorhandenen Mikroorganismen, erreicht werden.
Jedoch sind Zell-Lyse und die anschließende Extraktion und Aufreinigung der Nucleinsäuren, insbesondere aller RNA, schwierige und zeitraubende Vorgänge, die eine teure Apparatur, ausgebildetes Personal und strenge Versuchsbedingungen, insbesondere die Verhinderung einer Kontaminierung durch Nucleasen während dieses Vorgangs, erfordern. Dieses Verfahren impliziert weiterhin die Verwendung eines festen Trägers wie einer Nylonmembran, auf welchem die aufgereinigten Nucleinsäuren auf eine solche Weise immobilisiert werden, dass zwischen ihnen unterschieden werden kann (beispielsweise Dot-Blot und Slot-Blot). Meist imnpliziert es auch die Verwendung radioaktiv markierter Sonden, deren Handhabung eine besondere Sorgfalt erfordert. Die Zell-Lyse zur RNA-Hybridisierung ist daher weder in der Industrie noch in biologischen Laboratorien für Routinebestimmungen geeignet.
Durch eine In-situ-Hybridisierung in ganzen Zellen entfällt die Notwendigkeit einer vorhergehenden Extraktion der Target-Nucleinsäuren durch eine Zell-Lyse mit allen damit verbundenen Nachteilen. Das FISH-(Fluorescent In Situ Hybridization-)Verfahren, in welchem mit einem fluoreszierenden Stoff markierte rRNA-Sonden verwendet werden, ist ein bereits vorhandenes In-situ-Verfahren. Diese Art eines Verfahrens, in welchem im Allgemeinen eine Fluoreszenz-Mikroskopie durchgeführt wird, bietet eine schnelle und sensitive qualitative Be stimmung vieler Probentypen. Heutzutage können Sonden mit rRNA als Target, die so in situ mit ihrem Target in ganzen Zellen hybridisiert worden sind, direkt in der Probe (Fließzytometrie und Mikroskopie) quantifiziert werden, obwohl dieses Verfahren nicht völlig zufrieden stellend ist, da eine direkte Quantifizierung in der Probe teuer und zeitraubend ist, ausgebildetes Personal erfordert und eine genaue Quantifizierung hybridisierter Sonden nicht erlaubt, wenn die Probe komplex und uneinheitlich ist (beispielsweise Flocken oder Aggregate, die von Fadenbakterien in Klärschlamm gebildet werden, und Proben, die natürlicherweise fluoreszierende Mikroorganismen enthalten). Im Ergebnis ist dieses Verfahren der In-situ-Hybridisierung in ganzen Zellen unter Verwendung von mit einem fluoreszierenden Stoff markierten Oligonucleotid-Sonden bisher ein im Wesentlichen qualitatives Verfahren geblieben, das keine zuverlässigen quantitativen Ergebnisse liefert.
Um das Bedürfnis nach einer industriellen Anwendbarkeit auf Proben zu befriedigen, die komplex und/oder uneinheitlich sein können, wird erfindungsgemäß ein Mittel zur sowohl qualitativen als auch quantitativen Bestimmung der in einer biologischen Probe potenziell vorhandenen Mikrobenpopulationen bereitgestellt, durch welches die Nachteile des Standes der Technik behoben werden.
Der erfindungsgemäße Gegenstand besteht daher in einem Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Mikrobenpopulation/en, die in einer Probe potenziell vorhanden ist/sind, dadurch gekennzeichnet, dass es das

– In-Berührung-Bringen der in der Probe potenziell vorhandenen Mikroorganismen mit mindestens einer anschließend als spezifische Sonde bezeichneten Oligonucleotid-Sonde mit RNA als Target, die in der Lage ist, eine gewünschte Mikrobenpopulation unter Bedingungen, die für eine In-situ-Hybridisierung in ganzen Zellen vorteilhaft sind, nachzuweisen,
– Extrahieren durch Abtrennung von ihrem Target und Eluieren dieser Sonden, die hybridisiert worden sind, aus den Zellen und
– Detektieren der extrahierten Sonden und Messen ihrer Menge oder ihrer jeweiligen Mengen

Erfindungsgemäß wird somit vorteilhafterweise die Extraktion dieser Sonden ohne Zerstörung der Zellen ermöglicht.
Dabei bedeutet die hier benutzte Bezeichnung "Mikrobenpopulation" (oder "Mikrobenbereich") die Gruppe von Mikroorganismen, die eine gegebene Sonde in der Lage ist, durch Erkennung einer in jedem Mitglied dieser Gruppe vorhandenen RNA-Target-Sequenz zu erkennen. Dieser Ansatz beruht auf Oligonucleotid-Hybridisierungssonden, die komplementär zu RNA-Sequenzen sind, die diagnostisch für ausgewählte phylogenetische Gruppen sind, die in einem variierenden Grad einer Target-Region entsprechen, die typisch für eine Art von Mikroorganismen oder eine ganze Gruppe von Mikroorganismen ist. Dabei ist jede Sonde, welche diese Stufe des In-Berührung-Bringens ermöglicht, für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet. Die Wahl der spezifischen Sonde/n ist direkt mit der für diese Probe gewünschten Bestimmung verknüpft. So können Sonden beispielsweise aus Oligonucleotid-Sequenzen bestehen, die zwischen den Reichen (Eukaryonten, Eubakterien und Archaebakterien) und zwischen nah verwandten Organismen (der Gruppe aus Ammoniak-oxidierenden β-Proteobakterien, der Gattung Nitrobacter oder Acinetobacter oder der Spezies Fibrobacter intestinalis und der Spezies Escherichia coli) unterscheiden können. Sonden mit feinerer phylogenetischer Auflösung können abgeleitet werden, indem die vorhandenen Sammlungen von RNA-Sequenzen verwendet werden. Viele Beispiele solcher Sonden mit RNA als Target sind im Stand der Technik wie Patenten oder Patentanmeldungen und wissenschaftlichen Veröffentlichungen, beispielsweise Los Reyes et al., Appli. Environ. Microbiol., 63, Nr. 3, 1107–1117 (1997), Mobarry et al., Appli. Environ. Microbiol., 62, Nr. 6, 2156–2162 (1996), Wagner et al., Appli. Environ. Microbiol., 60, Nr. 3, 792–800 (1994) und Kane et al., Appli. Environ. Microbiol., 59, Nr. 3, 682–686, beschrieben. Weitere Beispiele für solche Sonden können vom Fachmann entworfen werden. Vorteilhafte Sonden sind solche mit ribosomaler RNA (rRNA) als Target. Beispiele für solche vorteilhafte Sonden umfassen Nb1000 (SEQ ID Nr. 1) und Nso 1225 (SEQ ID Nr. 2).
Das erfindungsgemäße Verfahren liefert besonders genaue quantitative Ergebnisse, wenn die Anzahl der Zellen in der Probe gleich oder größer als etwa 10³ oder 10⁴ Zellen pro ml ist. Falls gewünscht, kann die Mikroorganismenkonzentration einer flüssigen Probe durch Filtration oder ein anderes Verfahren vor Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhöht werden.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die Mikroorganismen, die potenziell in der Probe vorhanden sind, auch mit mindestens einer Sonde in Berührung gebracht, die anschließend als "universelle Sonde" bezeichnet wird und dazu dient, die Ergebnisse zu normieren, die mit Sonden erhalten werden, die auf spezifische phylogenetische Mikroorganismengruppen abzielen ("spezifische Sonden"). Der Anteil einer spezifischen Sonde in der Probe kann dann als Anteil an der Menge dieser universellen Sonde angegeben werden. Eine solche universelle Sonde kann somit die Angabe von beispielsweise der spezifischen Target-rRNA als Prozentsatz aller rRNA ermöglichen. Beispiele für solche "universelle Sonden" umfassen Sonden, die für einen beliebigen Mikroorganismus spezifisch sind, oder Sonden, die für Bakterien oder Eukaryonten spezifisch sind. Solche "universellen Sonden" sind aus dem Stand der Technik bekannt, wobei eine beliebige davon verwendet werden kann, sofern sie diese Stufe des In-Berührung-Bringens ermöglicht und die gewünschte Normierung der "spezifischen Sonde" erlaubt. Eine solche "universelle Sonde" wird im erfindungsgemäßen Verfahren ähnlich wie eine "spezifische Sonde" verwendet, weshalb eine Sonde mit rRNA als Target vorteilhaft ist.
Es kann vorteilhaft sein, die Mikroorganismen, die potenziell in der Probe vorhanden sind, daraus, insbesondere durch Zentrifugieren, zu extrahieren, bevor eine Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt wird. Ein Grund dafür, auf diese Weise zu verfahren, besteht darin, das Hintergrundrauschen zu entfernen, das eine Probe mit komplexer Zusammensetzung erzeugen kann. Ein weiterer Grund kann sein, die in einer festen, gasförmigen oder viskosen Probe potenziell vorhandenen Mikroorganismen in Lösung zu bringen.
Entsprechend einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird diese Stufe des In-Berührung-Bringens durchgeführt, nachdem die Zellen einer Fixierungsstufe (oder Permeabilisierungsstufe), die für die Aufrechterhaltung ihrer morphologischen Integrität wesentlich ist und welche die in der Probe potenziell vorhandenen Mikroorganismen für kurze Oligonucleotid-Sonden (etwa 15 bis 25 Nucleotide) permeabel macht, unterzogen worden sind. Diese Fixierungsstufe ermöglicht es den Sonden, in die Mikrobenzellen zu gelangen, ohne deren Integrität zu beeinträchtigen, wodurch ihr/e Target/s in situ erreicht wird/werden. Wo möglich wird die Probe vor der Fixierungsstufe homogenisiert, damit die mindestens eine Sonde Zugang zu allen in der Probe potenziell vorhandenen Mikrobenpopulationen gewinnt.
Eine solche Fixierung wird vorteilhafterweise erreicht, indem die Zellen drei bis 12 Stunden lang bei 4 °C in einer weniger als 10%igen und vorzugsweise etwa 4%igen Paraformaldehydlösung inkubiert werden. Diese Fixierung ist insbesondere für Gram-negative Bakterien geeignet. Für bestimmte Gram-positive Bakterien kann die Fixierung erreicht werden, indem die Zellen in einer 100%igen Ethanollösung inkubiert werden.
Nach der Fixierung können die Zellen durch beispielsweise Zentrifugieren entfernt und bis zu ihrer Verwendung bei –20 °C in einer auf einen pH-Wert von etwa 7 gepufferten Lösung (beispielsweise PBS-Puffer), die etwa 50 % Ethanol enthält, aufbewahrt werden.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform folgt auf diese Fixierung vor der Stufe des In-Berührung-Bringens eine Entwässerungsstufe (oder Trocknungsstufe). Diese Entwässerungsstufe kann durchgeführt werden, indem die Probe mit mindestens einer Ethanollösung und vorzugsweise mit einer Reihe von Ethanollösungen mit ansteigender Konzentration in Berührung gebracht wird, bei spielsweise indem die Probe in eine 70%ige, 80%ige und anschließend 95%ige Ethanollösung gebracht wird.
Vorteilhafterweise wird die Stufe des In-Berührung-Bringens durchgeführt, indem die Probe mit mindestens einer Sonde in Gegenwart einer Lösung, die anschließend als "Hybridisierungslösung" bezeichnet wird und ein Denaturierungsmittel wie Natriumdodecylsulfat (SDS) mit einer Konzentration von 0,001 bis 0,1 %, vorzugsweise von etwa 0,01 %, Tris-HCl, mit einem pH-Wert von etwa 8 und einer Konzentration von 0,001 bis 0,1 M, vorzugsweise von etwa 0,02 M, und ein Salz wie Natriumchlorid mit einer Konzentration von 0,1 bis 1,5 M und vorzugsweise von etwa 0,9 M enthält, in Berührung gebracht wird. Ein solches In-Berührung-Bringen wird vorteilhafterweise über eine Inkubationszeit, die etwa 10 Minuten bis etwa zwei Stunden lang ist, und bei einer Hybridisierungstemperatur, die vorzugsweise die optimale Temperatur ist, durchgeführt. Dabei können für jede Oligonucleotid-Sonde die Hybridisierungsbedingungen (Temperatur, Konzentration von Salzen und Denaturierungsmitteln) optimiert werden, sodass die Spezifität der Oligonucleotid-Sonde für die entsprechenden in den Targetzellen vorgefundenen RNA-Sequenzen erhöht wird. Wird eine Vielzahl von Oligonucleotid-Sonden gleichzeitig verwendet, so können diese Hybridisierungsbedingungen derart gewählt werden, dass die optimalen Bedingungen für jede Sonde berücksichtigt werden.
Für die Extraktion der mindestens einen Sonde ist es sehr vorteilhaft, dass sie nach der Entfernung von überschüssiger und ungebundener Sonde oder von nicht spezifisch gebundenem Sondenmaterial, das in Berührung gebracht worden war, insbesondere durch Wegwaschen mit einer Lösung, die anschließend als "Waschlösung" bezeichnet wird, durchgeführt wird. Eine solche "Waschlösung" enthält vorteilhafterweise ein Denaturierungsmittel wie Natriumdodecylsulfat (SDS) mit einer Konzentration von 0,001 bis 0,1 % und vorzugsweise von etwa 0,02 %, Tris-HCl, mit einem pH-Wert von etwa 8 und einer Konzentration von 0,001 bis 0,1 M und vorzugsweise von etwa 0,02 M, und ein Salz wie Natriumchlorid mit einer Konzentration von 0,01 bis 0,9 M und vorzugsweise von etwa 0,1 M. Dabei wird die Formulierung der "Waschlösung" (beispielsweise Charakter und/oder Konzentrati on von Salz und Denaturierungsmittel) so eingestellt, dass die richtige Stringenz, d.h. die Stringenz, die für die Entfernung der nicht spezifisch gebundenen Probe erforderlich ist, erreicht wird. Durch diese Waschstufe wird die Extraktionsstufe nur mit denjenigen Sonden durchgeführt, die wirkungsvoll mit dem/den gewünschten Target/s hybridisiert worden sind.
Entsprechend einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Extraktion durchgeführt, indem die potenziell vorhandenen Mikroorganismen Bedingungen ausgesetzt werden, welche die Denaturierung jeder spezifisch mit ihrer Target-Sequenz verbundenen Sonde, insbesondere in Anwesenheit eines Sonde-Target-denaturierenden Mittels wie eines, das den DNA/DNA- oder DNA/RNA-Duplex und speziell den betreffenden Sonde-Target-Duplex auftrennt, bei einer Temperatur, die höher als die Schmelztemperatur der betreffenden Sonde ist, insbesondere bei einer Temperatur von etwa 100 °C, ermöglichen. Entsprechend einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist dieses Denaturierungsmittel Formamid. Die Extraktion wird dann durchgeführt, indem die Mikroorganismen 10 Minuten lang unter Verwendung eines Inkubators mit geregelter Temperatur bei 100 °C in Formamid inkubiert werden. Danach kann der Überstand für die Quantifizierung, beispielsweise durch Zentrifugieren, gewonnen werden. Um die Detektion zu verbessern, können die extrahierten Sonden, insbesondere unter Verwendung eines Speed-Vac^®, vor der Messung der entsprechenden Menge einer jeden Sonde aufkonzentriert werden.
Die Detektion einer Target-hybridisierten Sonde und die Messung ihrer Menge ergeben so eine qualitative und quantitative Bestimmung der Gruppe aus in der Probe vorhandenen Target-Mikroorganismen. Dabei ist es vorteilhaft, Detektion und Mengenmessung der extrahierten Sonden durch Detektion und Mengenmessung einer Markierung durchzuführen, die mit jeder der in Berührung gebrachten Sonden verbunden oder in diese eingebaut ist, wie eine radioaktive (³²P, ³⁵S und ¹²⁵I), chemilumineszierende oder fluoreszierende Markierung. Die jeweiligen Mengen der Sonden werden dann durch Quantifizierung der entsprechenden Markierung gemessen. Insbesondere ist es vorteilhaft, eine fluoreszierende Markierung, speziell Fluo rescein, zu verwenden, die mittels eines Fluoreszenz-Spektralphotometers leicht quantifiziert werden kann.
Es können verschiedene Sonden, beispielsweise (eine) spezifische Sonde(n) und/oder (eine) universelle Sonde(n) in getrennten Proben oder in ein und derselben Probe angeordnet werden. In letzterem Fall ist es möglich, die jeweilige Sonde von anderen während der Detektionsstufe verwendeten Sonden zu unterscheiden, beispielsweise, indem jeder eine eigene spezifische Markierung (beispielsweise unterschiedliche Fluorochrome) gegeben wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf eine Vielfalt von Proben angewendet werden. Proben, für welche eine Bestimmung unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders interessant ist, umfassen solche, die von Fluiden wie natürlichem und industriellem Wasser, industriellen Abflüssen, kommunalem Abwasser, Industrieschlamm, Thermalschlamm, flüssigen oder gelförmigen Lebensmitteln, Fermentationsmedien, Luft, Gas und Aerosol und Proben, die von einer Belüftungs- oder Klimaanlage eines Gebäudes, Proben, die von einem essbaren Feststoff und Erde und Proben, die von einem medizinischen Gerät, von Mensch oder Tier wie Blut, Urin, Vaginal- oder Darmflora genommen worden sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren benötigt weder eine Mikrobenkultur noch Mikroskopie noch eine In-vitro-Amplifizierung (wie PCR) noch eine Zell-Lyse. Es ist reproduzierbar, einfach, schnell (kürzer als drei Stunden), preisgünstig und erfordert kein speziell ausgebildetes Personal. Es bietet den weiteren Vorteil, dass es sich leicht automatisieren lässt. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert insbesondere eine qualitative und quantitative Bestimmung des mikrobiologischen oder Hygienestatus einer Probe und demzufolge des Produkts, von welcher diese Probe entnommen worden ist. Es kann daher vorteilhafterweise mit einer Meldungsfunktion kombiniert werden, welche die Qualitäts-, Sicherheits- und/oder Hygieneüberwachung des Produkts, von welcher die Probe entnommen worden ist, insbesondere als Teil einer Produktionslinie, betrifft.
Wird ein Grenzwert oder ein festgelegter Punkt überschritten, erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren, dass der entsprechende Qualitäts-, Sicherheits- und/oder Hygienealarm ausgelöst wird. Es erlaubt auch die automatische oder Feedback-Kontrolle einer mkrobiologischen Beseitigung oder eines mikrobiologischen Anreicherungsvorgangs.
Die Erfindung betrifft auch die Anwendung dieses Verfahrens auf die In-vitro-Diagnostik von Infektionskrankheiten.
Außer den Anwendungen auf "Status- oder Zustandsbestimmung" und "Meldungen", betrifft die Erfindung insbesondere die Anwendung dieses Verfahrens auf die automatische oder Feedback-Regelung mikrobiologischer Vorgänge wie die Methanvergärung von Gülle, Behandlung organischer Abflüsse, Abwasserbehandlung wie Belebtschlammbehandlung oder die automatische oder Feedback-Regelung eines Vorgangs, der auf die Beseitigung oder Verhinderung der Vermehrung von Mikroorganismen abzielt.
Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafterweise auf den Nachweis einer Schaumbildung bei Belebtschlammverfahren und/oder die Feedback-Regelung eines Verfahrens, das auf die Beseitigung oder Verhinderung der Bildung eines solchen Schaums abzielt, angewendet werden.
Weitere erfindungsgemäße Merkmale und Vorteile werden anhand der folgenden beispielhaften Ausführungsformen näher erläutert.
Beispiel 1: Qualitative und quantitative Bestimmung einer Probe aus einem Abwasserbehandlungsreaktor
a) Fixierungsstufe
Proben aus dem Abfluss von Belebtschlammreaktoren zur Abwasserbehandlung wurden vermischt und dreimal unter Verwendung einer Phosphatpufferlösung (PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung) bei pH 7 gewaschen. Die Probe wurde dann zu drei Volumina einer 4%igen Paraformaldehydlösung gegeben und 3 bis 12 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand entfernt und die Probe erneut mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) mit pH 7 vermischt. Es wurde das gleiche Volumen an Ethanol zugegeben und die Probe bis zur Verwendung bei –20 °C aufbewahrt.
b) Entwässerungsstufe
Nach Zugabe von 1 ml 70%igem Ethanol auf den Rückstand und Resuspendierung der Zellen wurde die fixierte Probe zentrifugiert. Das Gemisch wurde 5 Minuten zentrifugiert und anschließend der Überstand entfernt. Dieser Vorgang wurde mit 80%igem Ethanol und anschließend mit 95%igem Ethanol wiederholt.
c) Hybridisierungsstufe
Mit der Hybridisierungstemperatur, die für die verwendete Sonde erforderlich ist, wurde ein Wasserbad vorbereitet (die Temperatur ist von Länge und Sequenz der Sonde abhängig). In diesem Beispiel wurden folgende Sonden verwendet:
Sonde Nb 1000, spezifisch für die Gattung Nitrobacter, mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1: 5' TGCGACCGGTCATGG 3',
Sonde Nso 1225, spezifisch für Ammoniak-oxidierende β-Proteobakterien, mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2: 5' CGCCATTGTATTACGTGTGA 3',
Sonde S Univ-1390, eine universelle Sonde für einen beliebigen Mikroorganismus, mit der Sequenz SEQ ID Nr. 3: 5' GACGGGCGGTGTGTACAA 3' und
Sonde S Bac338, spezifische für Bakterien, mit der Sequenz SEQ ID Nr. 4: 5' GCTGCCTCCCGTAGGAGT 3'.
Diese Sonden wurden synthetisiert, durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) aufgereinigt und am 5'-Ende mit Fluorescein markiert. Sie sind lieferbar von Operon Technologies of Alameda, Kalifornien (USA) oder, in Frankreich, von dem Unternehmen Genset, Paris (unter anderem).
Die aus der Entwässerungsstufe erhaltenen Zellen wurden erneut in 400 μl einer Hybridisierungslösung suspendiert, die (auf 10 ml) NaCl 5M, 1,8 ml, Tris-HCl 1M, 200 μl, SDS (Natriumdodecylsulfat) 5 μl, destilliertes Wasser, 8 ml, auf 10 ml enthielt. Nachdem jede Sonde mit einem Fluorochrom markiert worden war, wurde die erforderliche Menge einer jeden Sonde zugegeben (hier 1,5 Nanomol). Die in Berührung mit den Sonden befindlichen Zellen in der Hybridisierungslösung wurden 10 Minuten bis 2 Stunden lang bei der Hybridisierungstemperatur inkubiert. Die hybridisierten Proben wurden zentrifugiert und die Überstände entfernt.
d) Waschstufe
Nach der Hybridisierung wurden die Zellen zweimal jeweils 15 Minuten lang bei der Hybridisierungstemperatur in einer gepufferten Waschlösung gewaschen, die auf 50 ml NaCl, 5 M, 1 ml, Tris-HCl, 1 M, 9 ml, und SDS 20 %, 50 μl, enthielt. Die Formulierung der "Waschlösung" (beispielsweise Salz und Denaturierungsmittel) wurde entsprechend dem Erfordernis des Erreichens der richtigen Stringenz, d.h. der Entfernung von unspezifisch gebundener Sonde, eingestellt.
e) Extraktion der Fluoreszenz durch Elution
300 μl auf 100 °C erhitztes Formamid wurden den aus der Waschstufe erhaltenen Proben zugegeben, und der Rückstand wurde vorsichtig erneut suspendiert. Die Reagenzgläser wurden 10 Minuten lang bei 100 °C aufbewahrt, vorzugsweise unter Verwendung eines Inkubators mit geregelter Temperatur. Es wurde 10 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde gewonnen und in der Dunkelheit aufbewahrt, bis er durch Fluoreszenzspektroskopie analysiert werden konnte. Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Spektralfluorometers quantifiziert. Die in den Sonden Nb 1000 und Nso 1225 gemessenen Mengen entsprachen den relativen Mengen von Nitrobacter-Bakterien und Ammoniak-oxidierenden β-Proteobakterien, die in der Probe enthalten waren. Diese Mengen wurden mit denjenigen verglichen, die mit der universellen Sonde S Univ-1390 und der Bakteriensonde S Bac 338 gemessen worden waren.
Dies ergibt einen Prozentsatz (relativen Anteil) der in der Probe enthaltenen Mikroorganismen, die Nitrobacter bzw. Ammoniak-oxidierende β-Proteobakterien waren.
Sequenzliste
(1) Allgemeine Informationen:

(I) Anmelderin: (a) Name: Suez Lyonnaise des Eaux (b) Adresse: 72 avenue de la Liberté (c) Stadt: Nanterre Cedex (e) Staat: Frankreich (f) Postleitzahl: 92753
(II) Name der Erfindung: Mittel zur qualitativen und quantitativen Bestimmnung der potenziell in einer Probe vorhandenen Mikrobenpopulationen
(III) Anzahl der Sequenzen: 4
(IV) Computerlesbare Form: (a) Speichermedium: Diskette (b) Computer: IBM-PC-kompatibel (c) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS (d) Software: PatentIn Release Nr. 1.0, Version Nr. 1.30 (OEB)

(2) Informationen zu SEQ ID Nr. 1:

(I) Charakteristika der Sequenz: (a) Länge: 15 Basenpaare (b) Typ: Nucleotid (c) Anzahl der Stränge: einsträngig (d) Konfiguration: linear
(II) Art des Moleküls: andere Nucleinsäure
(III) Hypothetisch: ja
(IV) Antisense: keine
(VII) unmittelbare Quelle: (B) Klon: Nb1000
(XI) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID Nr. 1: TGCGACCGGT CATGG

(3) Informationen zu SEQ ID Nr. 2:

(I) Charakteristika der Sequenz: (a) Länge: 20 Basenpaare (b) Typ: Nucleotid (c) Anzahl der Stränge: einsträngig (d) Konfiguration: linear
(II) Art des Moleküls: andere Nucleinsäure
(III) Hypothetisch: ja
(IV) Antisense: keine
(VII) unmittelbare Quelle: (B) Klon: Nb1225
(XI) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID Nr. 2: 5' CGCCATTGTA TTACGTGTGA 3'

(4) Informationen zu SEQ ID Nr. 3:

(I) Charakteristika der Sequenz: (a) Länge: 18 Basenpaare (b) Typ: Nucleotid (c) Anzahl der Stränge: einsträngig (d) Konfiguration: linear
(II) Art des Moleküls: andere Nucleinsäure
(III) Hypothetisch: ja
(IV) Antisense: keine
(VII) unmittelbare Quelle: (B) Klon: S Univ-1390
(XI) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID Nr. 3: 5' GACGGGCGGTGTGTACAA 3'

(5) Informationen zu SEQ ID. Nr. 4:

(I) Charakteristika der Sequenz: (a) Länge: 18 Basenpaare (b) Typ: Nucleotid (c) Anzahl der Stränge: einsträngig (d) Konfiguration: linear
(II) Art des Moleküls: andere Nucleinsäure
(III) Hypothetisch: ja
(IV) Antisense: keine
(VII) unmittelbare Quelle: (B) Klon: S Bac338
(XI) Beschreibung der Sequenz: SEQ ID Nr. 4: 5' GCTGCCTCCCGTAGGAGT 3'

Claims

Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Mikrobenpopulation/en, die in einer Probe potentiell vorhanden ist/sind, dadurch gekennzeichnet, dass es das – In-Berührung-Bringen der in der Probe potentiell vorhandenen Mikroorganismen mit mindestens einer anschließend als spezifische Sonde bezeichneten Oligonucleotid-Sonde mit RNA als Target, die in der Lage ist, eine gewünschte Mikrobenpopulation unter Bedingungen, die für eine In-situ-Hybridisierung in ganzen Zellen vorteilhaft sind, nachzuweisen, – Extrahieren durch Abtrennung von ihrem Target und Eluieren dieser Sonden, die hybridisiert worden sind, aus den Zellen und – Detektieren der extrahierten Sonden und Messen ihrer Menge oder ihrer jeweiligen Mengen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine spezifische Sonde aus der aus Nb 1000 (SEQ ID Nr. 1) und Nso 1225 (SEQ ID Nr. 2) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die in der Probe potentiell vorhandenen Mikroorganismen mit einer anschließend als universelle bezeichneten weiteren Sonde in Berührung gebracht werden, die dazu dient, die Ergebnisse zu standardisieren, die mit Sonden erhalten worden sind, die spezifische phylogenetische Gruppen von Mikroorganismen nachweisen.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die universelle Sonde aus der aus S Univ-1390 (SEQ ID Nr. 3) und S Bac 338 (SEQ ID Nr. 4) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die spezifische und/oder universelle Sonde/n rRNA-Target-Sonde/n ist/sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die potentiell in der Probe vorhandenen Mikroorganismen insbesondere durch Zentrifugieren aus der Probe extrahiert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das In-Berührung-Bringen nach Fixierung der Zellen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Fixierung der Zellen durch 3- bis 12-stündiges Bebrüten dieser Zellen bei 4 °C in einer Lösung von weniger als 10 % und vorzugsweise von etwa 4 % Paraformaldehyd erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Stufe des In-Berührung-Bringens auf die Fixierungsstufe eine Entwässerungsstufe folgt.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Entwässerungsstufe durchgeführt wird, indem die Probe mit mindestens einer ethanolischen Lösung und vorzugsweise mit einer Reihe ethanolischer Lösungen mit ansteigenden Konzentrationen in Berührung gebracht wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das In-Berührung-Bringen durchgeführt wird, indem die Probe mit mindestens einer Sonde in Gegenwart einer anschließend als Hybridisierungslösung bezeichneten Lösung in Berührung gebracht wird, die insbesondere ein Denaturierungsmittel wie Natriumdodecylsulfat (SDS) mit einer Konzentration in einem Bereich von 0,001 bis 0,1 % und vorzugsweise von etwa 0,01 %, Tris-HCl, pH-Wert von etwa 8, mit einer Konzentration in einem Bereich von 0,001 bis 0,1 M und vorzugsweise von etwa 0,02 M, und ein Salz wie Natriumchlorid mit einer Konzentration in einem Bereich von 0,1 bis 1,5 M und vorzugsweise von etwa 0,9 M enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stufe des In-Berührung-Bringens einen Bebrütungszeitraum von etwa 10 Minuten bis 2 Stunden lang bei der optimalen Hybridisierungstemperatur durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion von mindestens einer Sonde nach Entfernung des überschüssigen und ungebundenen oder unspezifisch angelagerten Sondenmaterials, das in Berührung gebracht worden ist, insbesondere durch Wegwaschen mit einer anschließend als Waschlösung bezeichneten Lösung, die insbesondere ein Denaturierungsmittel wie Natriumdodecylsulfat (SDS) und ein Salz wie Natriumchlorid mit einer Konzentration enthält, die geeignet ist, die für die Entfernung der unspezifisch angelagerten Sonde erforderliche Stringenz zu erreichen, durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion, indem die potentiell vorhandenen Mikroorganismen Bedingungen ausgesetzt werden, welche die Denaturierung jeder Sonde, die mit ihrer Targetsequenz spezifisch assoziiert ist, ermöglichen, insbesondere in Gegenwart eines Mittels, das in der Lage ist, den Sonde-Target-Duplex zu denaturieren, und bei einer Temperatur, die höher als die Schmelztemperatur der betreffenden Sonde ist, insbesondere bei einer Temperatur von etwa 100 °C, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Denaturierungsmittel Formamid ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die extrahierte/n Sonde/n vor der Messung ihrer Menge oder jeweiligen Mengen, insbesondere unter Verwendung eines Speed-Vac^®, aufkonzentriert wird/werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Detektion und Messung der Menge der extrahierten Sonden durch Detektion und Messung der Menge einer Markierung, die mit jeder der in Berührung gebrachten Sonden assoziiert oder in diese eingebaut ist, wie einer radioaktiven, chemilumineszenten oder fluoreszenten Markierung, insbesondere Fluorescein, durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe von Fluids wie natürlichem Wasser, Industriewasser, industriellem Abwasser, kommunalem Abwasser, Industrieschlamm, Thermalmoor, flüssigen oder gelierten Lebensmitteln, Fermentationsmedien, Luft, Gas und Aerosolen genommen worden ist, eine Probe ist, die von der Belüftungsanlage eines Gebäudes, der Klimaanlage eines Gebäudes, einem festen Lebensmittel, Erde und einer medizinischen Apparatur genommen worden ist, oder eine Probe von Mensch bzw. Tier wie Blut, Urin, Vaginal- oder Darmtraktflora ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es gemeinsam mit einem Verfahren zum Auslösen eines Alarms im Zusammenhang mit der Qualitäts-, Sicherheits- und/oder Gesundheitsüberwachung des Produkts, von welchem die Probe genommen wurde, angewendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es zur In-vitro-Diagnose einer Infektionskrankheit angewendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es zur automatischen oder Feedback-Regelung eines mikrobiologischen Verfahrens wie der Methanvergärung von Jauche, der Behandlung organischer Abflüsse und der Abwasserbehandlung wie der Behandlung mit Belebtschlamm angewendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es zur automatischen oder Feedback-Regelung eines Verfahrens angewendet wird, das die Entfernung oder Verhinderung der Vermehrung von Mikroorganismen betrifft.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Detektion der Schaumbildung bei der Durchführung von Belebtschlammverfahren und/oder zur Feedback-Regelung eines Verfahrens, das die Entfernung oder Verhinderung dieser Schäume betrifft, angewendet wird.