JP4568879B2 - 土壌診断用バイオセンサおよびこれを用いた土壌診断法 - Google Patents
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Description
putida、Escherichia coli、Gluconobactor suboxidants、Paracoccus denitrificans、パン酵母、好熱性細菌などが用いられ、その内、好ましくはPseudomonas fluorescence
biovar V、Pseudomonas fluorescence TN5、Pseudomonas putida 10G、Trichosporon cutaneum、パン酵母などを用いることができる。
厚さ188μmの透明なポリエチレンチレフタレートを図5 I)に示されるように、35mm×18mmの本体および16mm×7.0mmの支持部15となるように打ち抜き、底部絶縁性基板1を作製した。この底部絶縁性基板上に、同図 II)に示されるように厚さ1mmで10mm×12mmの下部反応スペース8を有する、底部絶縁性基板と同一外形の下部スペーサー2をアクリル系接着剤(日東製品 No.5000N)を用いて接着した。下部スペーサー上には、厚さ25μmの接着剤層が設けられ、上部絶縁性基板5をさらに接着した。この上部絶縁性基板は、底部絶縁性基板と同じ厚さの同素材を用い、同図 III)に示されるように、40mm×18mmの本体、21mm×7mmの支持部および10mm×12mmの下部反応スペースを形成したものであり、この下側表面上には、7.5mm×2mmの電極4 2本が、8mm×3mmの基板上に3mmの間隔を空けてくし状に、また支持部においては、21mm×2.6mmの2本の電極を0.6mmの間隔を空けて、厚さ10μmのカーボンインクをスクリーン印刷法により形成した。上部絶縁性基板上には、同図 IV)に示されるような下部スペーサーと同一素材で同一形状の上部スペーサー7 3枚を接着剤を用いて貼り合わせた。このようにして作製されたバイオセンサの反応槽内容積は、約560mm3であった。
実施例1で作製したバイオセンサの反応槽に4mMフェリシアン化カリウムおよび4mMフェロシアン化カリウムを含む緩衝液(pH7.0 PBS溶液; phosphate buffer saline) 500μl(メディエータ混合液)を導入し、900mVの印加電圧を加え、3秒後に得られる電流値を電気化学測定器(北斗電工製品SHV-100)を用いてクロノアンペロメトリー法により測定した。メディエータ混合溶液を反応槽に添加した直後に行なった測定を1回目、その後、30秒間静置した状態での測定を2回目、さらにその後、30秒間静置した状態での測定を3回目、3回測定後、メディエータ混合溶液をマイクロピペットで十分に撹拌した後の測定を4回目とした。これらの操作を1工程とし、合計30回の繰り返し測定を試みた。得られた結果は、図6に示される。測定前に撹拌をしなかった2回目及び3回目のセンサ応答値は撹拌した場合に比べ明らかに低い値を示したことから、測定液を添加後、測定開始直前に反応槽内の溶液を充分撹拌する必要性が示された。
実施例2において、メディエータ混合溶液として、フェリシアン化カリウムとフェロシアン化カリウムのモル濃度が1:1である所定濃度の測定試料液を用いて、メディエータ混合溶液添加後30秒後における、メディエータに対するバイオセンサの応答についての検討を行った。なお、測定前には反応槽内の溶液の攪拌を充分に行った。得られた結果は図7に示される。
実施例2において、バイオセンサの反応槽に、Pseudomonas putida G10(FERM P-16457)を培養した後洗浄して滅菌済みのpH7.0 PBS溶液でOD580 = 132となるように調製した菌液100μl、pH7.0 PBS溶液で調製した0.4 Mフェリシアン化カリウム溶液50μlおよびpH7.0 PBS溶液150μlを反応槽に導入し、メディエータ混合溶液添加後0.5、5.5、15.5、30.5分後における、メディエータに対するバイオセンサの応答についての検討を行った。なお、測定前には反応槽内の溶液の攪拌を充分に行った。
実施例4において、反応・測定温度とセンサ応答値との関係を調べた。得られた結果は、図9に示される。この結果より、測定温度が15℃以下ではP. putida G10の代謝活性が著しく低下する傾向にあることが示された。
実施例4において、菌液量を30μl に、また0.4 M フェリシアン化カリウム溶液の添加量を17μl、50μlまたは150μl、pH7.0 PBS溶液量を総反応液量が300μlとなるように変更させたものについて、センサ応答値との関係を調べた。さらに、LB培地60μlを基質液として添加した場合についてのセンサ応答値との比較検討も併せて行った。得られた結果は、次の表1に示される。
以上より、0.4 M フェリシアン化カリウム溶液の添加量は50μl(終濃度:67mM)が最適であり、またLB培地など資化性有機物を含んだ試料液を用いた場合には、高いセンサ応答値を示すことが確認された。
実施例4において、バイオセンサの反応槽に、菌液30μl、0.4 M フェリシアン化カリウム溶液50μl、pH7.0 PBS溶液160μlおよび所定濃度のLB培地60μlを導入し、添加後0.5、5.5、15.5、30.5分後における、バイオセンサの応答についての検討を行った。得られた結果は図10に示される。この結果より、LB培地は原液から1/100倍希釈の間でセンサ応答を明確に得ることができた。以上より、資化性有機物を含んだ試料液に対するセンサ応答が得られたことから、BODセンサへの応用の可能性を示すことができた。
実施例4において、バイオセンサの反応槽に、(a) 4℃で所定時間冷蔵保存した菌液30μl、0.4 M フェリシアン化カリウム溶液50μl、pH7.0 PBS溶液160μl、およびLB培地60μl、(b) 4℃で所定時間冷蔵保存した菌液100μl、0.4 M フェリシアン化カリウム溶液50μl、pH7.0 PBS溶液90μlおよびLB培地60μlを導入した後、バイオセンサの応答についての検討を行った。得られた結果は、次の表2に示される。
以上よりいずれの菌液の添加量においても、6日目まではほぼ安定した応答を示しており、この条件下におけるP. putida G10の約一週間の保存安定性が確認された。
実施例4において、バイオセンサの反応槽に、-20℃で所定時間冷凍保存した菌液100μl、0.4 M フェリシアン化カリウム溶液50μl、pH7.0 PBS溶液150μlを導入した後、バイオセンサの応答についての検討を行った。なお、菌体の保存に際しては、菌液中に不凍剤としての15%グリセリンが用いられた。その結果、少なくとも2週間は安定したセンサ応答値を示すことが確認された。
実施例4において、バイオセンサの反応槽に、菌液として農業用土壌における拮抗微生物として知られるグラム陽性細菌であるBacillus cereus K12N株(FERM P-17147)をpH7.0 PBS溶液に懸濁してOD580 = 50に調製したものを使用し、菌液量を30μl に、また0.4 M フェリシアン化カリウム溶液の添加量を17μl、50μlまたは150μl、pH7.0 PBS溶液量を総反応液量が300μlとなるように変更させたものを導入した後、センサ応答値との関係を調べた。さらに、LB培地60μlを基質液として添加した場合についてのセンサ応答値との比較検討も併せて行った。得られた結果は、次の表3に示される。
以上より、0.4 M フェリシアン化カリウム溶液の添加量は50μl(終濃度:67mM)が最適であり、またLB培地など資化性有機物を含んだ試料液を用いた場合には、高いセンサ応答値を示すことが確認された。
実施例10において、バイオセンサの反応槽に、11,000 mg O2/L BODに相当するグルコース・グルタミン酸(GGA)溶液を60μl、菌液30μl、0.4 M フェリシアン化カリウム 50μlおよびpH7.0 PBS溶液160μlを導入した後、センサ応答値との関係を調べた。その結果、BOD法における標準液として用いられるGGA溶液を入れない場合と比較して、センサ応答値に優位な差が観察された。このことから、BODセンサへの応用の可能性が示唆された。
(a)OD580 = 50のB. cereus菌液(15%グリセリンを含む)130μlを0.2 ml用のマイクロ(エッペンドルフ)チューブに入れて所定日数-20℃で保存し、この菌液30μl、0.4M フェリシアン化カリウム50μl、pH7.0 PBS溶液160μlおよび所定濃度のLB培地60μlをバイオセンサの反応槽に導入したものおよび(b)実施例1に示した保護フィルムを用いたバイオセンサの反応槽内(センサ底部)にOD580 = 50に調製したB. cereus菌液(15%グリセリンを含む)30μl入れて所定日数-20℃で保存した後、これに0.4Mフェリシアン化カリウム50μl、pH7.0 PBS溶液160μlおよび所定濃度のLB培地60μlをさらに添加し、30.5分間反応させたものについて、実施例4と同様にバイオセンサの応答についての検討を行った。得られた結果は、菌液をマイクロチューブに入れて保存したときおよびバイオセンサに直接入れて保存したときの結果は、図11に示される。その結果、 (a)マイクロチューブで保存した場合では、前半において菌体の活性が高いが、その後徐々に低下する傾向が確認された。一方、(b)バイオセンサで保存した場合においては、はじめに菌体の活性が急激に低下した後、極めて安定したセンサ応答を少なくとも3ヵ月間は維持できることが示されており、この条件下におけるB. cereus の-20℃での保存安定性が確認された。
2種類の健全土壌試料および2種類の病害土壌試料をそれぞれ地域の異なる圃場から採取し、各土壌10gをpH7.0 PBS溶液25mlとともにプラスチック製遠沈管50ml内で30℃、125rpmで24時間振とうした後、4℃、8000rpm、5分間遠心して得られた上澄み液を土壌抽出液として調製した。これらの土壌抽出液60μl、OD580 = 50のB. cereus菌液(15%グリセリンを含む)30μl、0.4M フェリシアン化カリウム50μlおよびpH7.0 PBS溶液160μlをバイオセンサの反応槽に導入し、実施例4と同様にバイオセンサの応答についての検討を行った。なお、コントロール試験では、土壌抽出液の代わりにpH7.0 PBS溶液を添加した。
2 下部スペーサー
3 溝
4 電極
5 上部絶縁性基板
6 微生物−メディエータ混合物層
7 上部スペーサー
8 下部反応スペース
9 上部反応スペース
10 バイオセンサ
11 保護フィルム脱着可能部
12 保護フィルム非粘着部
13 試料液
14 乾燥剤
Claims (16)
- 底部絶縁性基板上に、底部絶縁性基板とともに反応槽を形成するスペースを有する下部スペーサーを介して、少なくとも作用極および対極の2電極を設けた上部絶縁性基板を、電極表面が底部絶縁性基板側に対向して下部スペーサーに設けられたスペースの一部を覆うように配し、さらに上部絶縁性基板の電極が形成されていない面上に、下部スペーサーと同一形状の上部スペーサーを設けた、作用極上および/またはその周辺部にメディエータ層または微生物−メディエータ混合物層を形成せしめてなる土壌診断用バイオセンサ。
- 上部スペーサー上に接着および剥離が可能な保護フィルムが設けられた請求項1記載の土壌診断用バイオセンサ。
- 絶縁性基板およびスペーサーにより形成される反応槽内に乾燥剤を備えた請求項2記載の土壌診断用バイオセンサ。
- メディエータ層または微生物−メディエータ混合物層の形成がこれらを含有した担体を用いて行われる請求項1乃至3のいずれかに記載の土壌診断用バイオセンサ。
- 担体がアルギン酸ゲル、カラギーナンゲル、アガロースゲル、カードランゲル、光架橋性ポリビニルアルコールまたはろ紙である請求項4記載の土壌診断用バイオセンサ。
- 使い捨てタイプである請求項1乃至5のいずれかに記載の土壌診断用バイオセンサ。
- 請求項1乃至5のいずれかに記載のバイオセンサと、
前記バイオセンサの電極における電気的な値を計測する計測部と、
前記計測部における計測値を表示する表示部と、
前記計測値を保存するメモリー部を備えたバイオセンサ装置。 - 請求項1乃至5のいずれかに記載の土壌診断用バイオセンサを用い、1種類の微生物から得られるセンサ応答を評価することを特徴とする土壌診断法。
- 請求項1乃至5のいずれかに記載の土壌診断用バイオセンサを用い、性質の異なる少なくとも2種類の微生物から得られる個別のセンサ応答を比較することを特徴とする土壌診断法。
- 微生物が土壌病害を引き起こす微生物(土壌伝染性植物病原微生物)および該微生物に対して拮抗作用を有する微生物を含む一般(土壌)微生物である請求項9記載の土壌診断法。
- 土壌伝染性植物病原微生物が細菌類、放線菌類または糸状菌類である請求項10記載の土壌診断法。
- 一般(土壌)微生物が拮抗性細菌類、拮抗性糸状菌類、一般(土壌)細菌類、一般(土壌)糸状菌類または一般(土壌)放線菌類である請求項10記載の土壌診断法。
- 試料液として土壌懸濁液または抽出液を用いる請求項8乃至12のいずれかに記載の土壌診断法。
- バイオセンサの認識素子として使用する微生物の資化物質を土壌懸濁液に加える請求項13記載の土壌診断法。
- 資化物質を少なくともメディエータおよび微生物が存在するバイオセンサの反応槽内に添加した際のセンサ応答と、その後に土壌懸濁液を追加したときのセンサ応答を比較する請求項13記載の土壌診断法。
- 資化物質がグルコース、アミノ酸、酵母エキス、麦芽エキス、ミートエキス、トリプトン、ペプトン、ビタミン、ミネラルの少なくとも1種および/または培地成分を含む請求項14または15記載の土壌診断法。
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