JP2003500067A5

JP2003500067A5 -

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Publication number: JP2003500067A5
Application number: JP2000620127A
Authority: JP
Filing date: 2000-05-19
Publication date: 2010-06-24

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】
リューマチ性関節炎に対しての、患者の遺伝的体質を分析する方法であって、前記患者由来のＨＬＡ-ＤＲ遺伝子座の核酸の少なくとも１の多形領域の増幅に由来した少なくとも１のタイプのアンプリコンを含む液体試料を、以下より選択されるプローブの存在下に置く工程を含む方法：
-対立遺伝子のＤＲＢ１ ^* ｇｒ０４グループにハイブリダイズすることができる、少なくとも１の特異的な低分解能タイピングプローブ；
-リューマチ性関節炎に対する遺伝的感受性に関連し、ＤＲＢ１ ^* ０１０１、ＤＲＢ１ ^* ｇｒ０４０１、ＤＲＢ１ ^* ｇｒ０４０４、ＤＲＢ１ ^* ｇｒ０４０５、ＤＲＢ１ ^* ｇｒ０４０８、及びＤＲＢ１ ^* ｇｒ１４０２の対立遺伝子とハイブリダイズすることができる、少なくとも１の特異的な高分解能サブタイピングプローブ；
-リューマチ性関節炎に対する遺伝的抵抗性に関連し、ＤＲＢ１ ^* ｇｒ０４０２、ＤＲＢ１ ^* ０４０３、ＤＲＢ１ ^* ｇｒ０４０６、及びＤＲＢ１ ^* ｇｒ０４０７の対立遺伝子とハイブリダイズすることができる、少なくとも１の特異的な高分解能サブタイピングプローブ；
ここで、当該高分解能サブタイピングプローブは、リューマチ性関節炎に対しての感受性に関連した対立遺伝子、及び／又はリューマチ性関節炎に対しての抵抗性に関連した対立遺伝子を、ハイブリダイズするか否かで区別することを可能にする。
【請求項２】
ＤＲＢ１ ^* ０１グループの対立遺伝子、及びＤＲＢ１ ^* １０対立遺伝子にハイブリダイズすることができる、少なくとも１の低分解能タイピングプローブがさらに使用されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＲＢ１^*ｇｒ０４グループの対立遺伝子群のうちの単一の対立遺伝子が検出された場合に、別の対立遺伝子の存在を検出するための、請求項１又は２に記載の方法であって、ＤＲＢ１ ^* ０２、ＤＲＢ１ ^* ０３、ＤＲＢ１ ^* ０７、ＤＲＢ１ ^* ０８、ＤＲＢ１ ^* ０９、ＤＲＢ１ ^* １１、ＤＲＢ１ ^* １２、ＤＲＢ１ ^* １３、及びＤＲＢ１ ^* １４の対立遺伝子にハイブリダイズすることが可能な、少なくとも１のプローブがさらに使用されることを特徴とする方法。
【請求項４】
-ＤＲＢ１^*ｇｒ０４についてのタイピング用の、配列番号３のプローブ；
-リューマチ性関節炎に対する遺伝的感受性に関連した以下の２つの高分解能サブタイピングプローブ：
ＤＲＢ１^*０４０１用の、配列番号４のプローブ、及び
ＤＲＢ１^*０１０１、ＤＲＢ１^*ｇｒ０４０４、ＤＲＢ１^*ｇｒ０４０５、ＤＲＢ１^* ｇｒ０４０８、及びＤＲＢ１^*１４０２用の、配列番号７のプローブ、並びに
-リューマチ性関節炎に対する遺伝的抵抗性に関連した以下の２つの高分解能プローブ：
ＤＲＢ１^*ｇｒ０４０２用の、配列番号５のプローブ、及び
ＤＲＢ１^*ｇｒ０４０３、ＤＲＢ１^*ｇｒ０４０６、及びＤＲＢ１^*ｇｒ０４０７用の、配列番号６のプローブ、
を使用することを特徴とする請求項１乃至３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＤＲＢ１^*ｇｒ０４０５に特異的であり、リューマチ性関節炎に対する遺伝的感受性に関連した、配列番号８の高分解能プローブをさらに使用することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
以下の二つのプローブ：
-ＤＲＢ１^*０１グループの対立遺伝子用の、配列番号１１のプローブ、及び
-ＤＲＢ１^*１０対立遺伝子用の、配列番号１５のプローブ
をタイピング用に使用することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ＤＲＢ１^*ｇｒ０４グループの対立遺伝子のうちの単一の対立遺伝子が検出された場合に、別の対立遺伝子の存在を検出するための、請求項３に記載の方法であって、以下の４つのタイピング用プローブ：
-ＤＲＢ１^*０２用の、配列番号１３のプローブ；
-ＤＲＢ１^*０７及びＤＲＢ１^*０９用の、配列番号１４のプローブ；
-ＤＲＢ１^*０８及びＤＲＢ１^*１２用の、配列番号１６のプローブ；及び
-ＤＲＢ１^*０３、ＤＲＢ１^*１１、ＤＲＢ１^*１３、及びＤＲＢ１^*１４用の、配列番号１２のプローブ；
を使用することを特徴とする方法。
【請求項８】
リューマチ性関節炎に対する遺伝的感受性についての対立遺伝子に特異的な、低分解能プローブまたは高分解能プローブのそれぞれが、ＱＫＲＡＡ、ＱＲＲＡＡ、又はＲＲＲＡＡの特徴的モチーフのうちの一つを含むことを特徴とする請求項１乃至７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＤＲＢ１遺伝子群とハイブリダイズすることができる、少なくとも１の対照プローブを使用して、ＤＲＢ１遺伝子群の全ての検出を可能にすることを特徴とする請求項１乃至８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
対照プローブを使用して、配列番号１：TTC GAC AGC GAC GTG GGGの検出を可能にすることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の液体試料が、前記患者由来のＨＬＡ-Ｂ遺伝子座の核酸の少なくとも１の多形領域の増幅に由来した、少なくとも１のタイプのアンプリコンをさらに含み、かつＨＬＡ-Ｂ遺伝子にハイブリダイズすることができ、且つＨＬＡ-Ｂ２７グループの対立遺伝子に特異的である、少なくとも１の低分解能プローブをさらに使用して、強直性脊髄炎に対する遺伝的感受性についての対立遺伝子をさらに検出することを特徴とする、請求項１乃至１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１の低分解能プローブが配列番号１０であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＨＬＡ-ＤＲ遺伝子にハイブリダイズすることができ、且つＤＲＢ１ ^* ０３グループの対立遺伝子に特異的な少なくとも１の低分解能プローブをさらに使用して、播種状紅斑性狼瘡、膠原病及びシェーグレン症候群に関連した遺伝的感受性をさらに検出することを特徴とする、請求項１乃至１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１の低分解能プローブが配列番号１９であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
同じ低分解能プローブ又は高分解能プローブのうちの最大で３８.９％の塩基が、少なくとも１の類縁体塩基で置換されていることを特徴とする請求項１乃至１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１の類縁体塩基がイノシンであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
特異的低分解能プローブ又は高分解能プローブのそれぞれを、互いのプローブとは独立して、マイクロタイタープレートのウェルに入れることを特徴とする請求項１乃至１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
全ての反応が、同時に実行されることを特徴とする請求項１乃至１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
興味ある多形領域についての少なくとも１の増幅を、予め行っておくことを特徴とする請求項１乃至１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＨＬＡ-ＤＲに関連した興味ある多形領域の増幅、及びＨＬＡ-Ｂに関連した興味ある多形領域の増幅を、予め同時に行っておくことを特徴とする請求項１乃至１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
多形領域について既に行ったものよりも更に高度標的化されたものである、少なくとも１の領域についての第二の増幅を行い、当該高度標的化された領域が、探索している疾患についての興味ある領域であることを特徴とし、更に得られたアンプリコンが、上記に規定されるプローブの存在下に置かれることを特徴とする、請求項１乃至２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
第一の増幅が、第二の、更に高度標的化された増幅と同時に、又はそれよりも前に実行されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＤＲＢ１^*ｇｒ０４グループの対立遺伝子に対応する配列が、配列番号２７のプライマーと配列番号２１のプライマーとを組み合わせて使用することにより増幅される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｂ２７対立遺伝子に対応する配列が、配列番号２２、配列番号２３、及び／又は配列番号２５のプライマーを、配列番号２４及び／又は配列番号２６のプライマーと組み合わせて使用することにより増幅される、請求項１０から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
以下の二つの配列：
-配列番号２０のプライマーを配列番号２１のプライマーと組み合わせて使用することによる、ＤＲグループの対立遺伝子に対応する配列；及び
-配列番号２２、配列番号２３、及び／又は配列番号２５のプライマーを、配列番号２４、及び／又は配列番号２６のプライマーと組み合わせて使用することによる、Ｂ２７対立遺伝子に対応する配列
が増幅される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
ＤＲグループの対立遺伝子に対応する配列を増幅するための、配列番号２０及び配列番号２１のプライマーの最終濃度が、Ｂ２７対立遺伝子に対応する配列を増幅するための、配列番号２４及び／又は配列番号２６と組み合わせた、配列番号２２、配列番号２３、及び／又は配列番号２５のプライマーの最終的な濃度よりも高いことを特徴とする請求項２５に記載の方法。

2）PCRによる同時増幅。
本増幅は、以下の遺伝子座に関する：
-HLA-DR遺伝子座：公式の命名法にしたがって、HLA-DRB遺伝子のコドン5-94に対応するエクソン2領域を含む、
-HLA-B遺伝子座：公式の命名法にしたがって、HLA-B遺伝子のコドン25-114に対応するエクソン2領域を含む。

4）調製したアンプリコンの分析用試薬の調製。
使用した逆ハイブリダーゼーションの原理は、本出願人の特許出願WO-A-93/02213に記載され、その内容は、本発明者らの特許出願書類に含まれると考えられる。簡単に述べれば、特異的捕獲プローブは、5'末端の修飾（-NH₂官能基の存在）によってマイクロタイタープレートに集合した一連のポリスチレンのウェル上に受動的に吸収される。検出プローブは、5'末端の修飾（-NH₂官能基の存在）によってHRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）酵素に共有結合したオリゴヌクレオチドである。ハイブリダーゼーション緩衝液の組成を、以下のように改変する：
-75mM Na₂HPO₄・2H₂O、
-25mM Na₂HPO₄・H₂O、
-pH 6.8、
-500mM NaCl、
-2％ PEG 4000,
-0.65％のTween 20、
-0.1％のゼラチン、
-0.14g/lの超音波処理DNA、
-0.001％の塩酸シプロフロキサシン、および
-0.02％のブロモニトロジオキサン。

最初に、HLA-DR分析により、以下のことが示される：
-配列番号1のプローブは正であること：HLA-DR増幅およびハイブリダーゼーション試験は正確に機能した、
-配列番号3のプローブは負であること：DRB1^*gr04対立遺伝子が存在しない、
-配列番号5および配列番号12のプローブは正である：DRB1^*11または13の対立遺伝子が存在すること、および
-配列番号13のプローブは正であること：DRB1^*02対立遺伝子が存在する。

この患者においては、DRB1 ^* 03対立遺伝子が存在するために播種状紅斑性狼瘡に対する遺伝的抵抗性についての対立遺伝子が存在するように、DRB1^*gr0401対立遺伝子が存在するために、慢性関節リウマチに対する遺伝的抵抗性についての対立遺伝子が存在する。B^*27に関する対立遺伝子は存在しない。