JPH03130100A - Ｖｎｔｒ遺伝子座に対するｄｎａプローブ - Google Patents
Ｖｎｔｒ遺伝子座に対するｄｎａプローブInfo
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-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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-
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- C12Q2600/172—Haplotypes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は一般に、ヒ） ＶＮＴＲ遺伝子座０４Ｓ１３９
に対して特異的なりＮＡプローブの使用に関する。本発
明は法医学的ＤＮＡタイプ分け、親子関係の試験、ゲノ
ム地図の作成、及び疾患の素因の決定において利用され
る。
に対して特異的なりＮＡプローブの使用に関する。本発
明は法医学的ＤＮＡタイプ分け、親子関係の試験、ゲノ
ム地図の作成、及び疾患の素因の決定において利用され
る。
血液及び精液のタイプ分けのための伝統的な蛋白法は蛋
白質における対立遺伝子的相違に基いてューヨーク、１
９８２）。血液において試験されている酵素及び抗原変
形体（ｖａｒｉａｎｔ） にはアデニレートデアミナー
ゼ、アデニレートキナーゼ、エステラーゼＤ１グリオキ
シラーゼ■、ヘモグロビン、ペプチダーゼＡ１ホスホグ
ルコムターゼ、並ヒニＧｍ抗原、Ｌｅｗｉｓ抗原及びＲ
ｈ抗原が含まれる。
白質における対立遺伝子的相違に基いてューヨーク、１
９８２）。血液において試験されている酵素及び抗原変
形体（ｖａｒｉａｎｔ） にはアデニレートデアミナー
ゼ、アデニレートキナーゼ、エステラーゼＤ１グリオキ
シラーゼ■、ヘモグロビン、ペプチダーゼＡ１ホスホグ
ルコムターゼ、並ヒニＧｍ抗原、Ｌｅｗｉｓ抗原及びＲ
ｈ抗原が含まれる。
父系試験においては、ＨＬＡ抗原のタイプ分けが一般に
使用される（Ｔｅｒａｓａｋｉ、 Ｊ、 Ｆａｍｉｌｙ
Ｌａｗ １６：５４３、１９７７−１９７８）。精
液中の蛋白質の分析は次の系：ＡＢＯ血液群、ホスホグ
ルコムターゼ、グリオキシレート、ペプチダーゼＡ１及
びＬｅｗｉｓ抗原の特徴付けを含む。これらの伝統的方
法は、組合わせて使用する場合、生物学的サンプルの源
として一般的集団の９９％までを排除することができる
が、生物学的サンプルの源として又は第一級の関係者と
して特定の個体の明白な同定を可能にしないワシントン
Ｄ、 Ｃ，，１９８３）。蛋白質タイプ分けにおける潜
在的問題点は、サンプルの経時（ａｇｉｎｇ） に伴う
電気泳動移動度の変化、並びに証拠サンプル中の他の物
質（例えば羊毛）に基く交叉反応性及び人為的結果の可
能性を含む。
使用される（Ｔｅｒａｓａｋｉ、 Ｊ、 Ｆａｍｉｌｙ
Ｌａｗ １６：５４３、１９７７−１９７８）。精
液中の蛋白質の分析は次の系：ＡＢＯ血液群、ホスホグ
ルコムターゼ、グリオキシレート、ペプチダーゼＡ１及
びＬｅｗｉｓ抗原の特徴付けを含む。これらの伝統的方
法は、組合わせて使用する場合、生物学的サンプルの源
として一般的集団の９９％までを排除することができる
が、生物学的サンプルの源として又は第一級の関係者と
して特定の個体の明白な同定を可能にしないワシントン
Ｄ、 Ｃ，，１９８３）。蛋白質タイプ分けにおける潜
在的問題点は、サンプルの経時（ａｇｉｎｇ） に伴う
電気泳動移動度の変化、並びに証拠サンプル中の他の物
質（例えば羊毛）に基く交叉反応性及び人為的結果の可
能性を含む。
ヒトＤＮＡの多形（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ ｉｃ）領域も
また、ヒトの生−法医学証拠検体の同定のため及び第−
級及びより高次の生物学的家族関係の両方の確立におい
て使用される。多形性ＤＮＡ領域の試験の技法はｒＤＮ
Ａフィンガープリント法」、ｒＤＮＡプロフィール法」
又はｒＤＮＡＤＮＡタイプ」と称され、そして明らかに
これらの分野において選択される方法となっている。適
切なプローブを用いるＤ Ｎ Ａのタイプ分けは、ヒト
全体集団内で複製されることが期待されない遺伝子型の
同定を可能にする。
また、ヒトの生−法医学証拠検体の同定のため及び第−
級及びより高次の生物学的家族関係の両方の確立におい
て使用される。多形性ＤＮＡ領域の試験の技法はｒＤＮ
Ａフィンガープリント法」、ｒＤＮＡプロフィール法」
又はｒＤＮＡＤＮＡタイプ」と称され、そして明らかに
これらの分野において選択される方法となっている。適
切なプローブを用いるＤ Ｎ Ａのタイプ分けは、ヒト
全体集団内で複製されることが期待されない遺伝子型の
同定を可能にする。
ＤＮＡタイプ分けは、可変数のタンデム反復（ｖａｒｉ
ａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔａｎｄｅｍ ｒｅ
ｐｅａｔ） （ＶＮＴＲ）から構成される核ＤＮＡの遺
伝子開領域（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｒｅｇｉｏｎｓ）の
検出に基いている。ＶＮＴＲはまた、「高度可変ミニサ
テライト制限断片長多形Ｊ （ｈｙｐｅｒ−ｖａｒｉａ
ｂｌｅ ｍ１ｎｉｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃ
ｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍ
ｏｒｐｈｉｓｍ）としても知られている。これらの遺伝
子座は多数の異る染色体上に見出され、このことが所与
のＶＮＴＲ対立遺伝子の出現を他のほとんどのものから
統計的に独立なものとしている。
ａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔａｎｄｅｍ ｒｅ
ｐｅａｔ） （ＶＮＴＲ）から構成される核ＤＮＡの遺
伝子開領域（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｒｅｇｉｏｎｓ）の
検出に基いている。ＶＮＴＲはまた、「高度可変ミニサ
テライト制限断片長多形Ｊ （ｈｙｐｅｒ−ｖａｒｉａ
ｂｌｅ ｍ１ｎｉｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃ
ｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍ
ｏｒｐｈｉｓｍ）としても知られている。これらの遺伝
子座は多数の異る染色体上に見出され、このことが所与
のＶＮＴＲ対立遺伝子の出現を他のほとんどのものから
統計的に独立なものとしている。
ＶＮＴＲ遺伝子座の多くにおいて見出され得る多数の（
７０〜８０まで又はそれ以上）の対立遺伝子は、高レベ
ルの（８８％より大）へテロ接合度と相俟って、ＶＮＴ
Ｒを同定目的のために有用なものとしている特徴である
（Ｎａｋａｍｕｒａら、５ｃｉｅｎｃｅ ２３５ ：
１６１６１６２２、１９８７）。
７０〜８０まで又はそれ以上）の対立遺伝子は、高レベ
ルの（８８％より大）へテロ接合度と相俟って、ＶＮＴ
Ｒを同定目的のために有用なものとしている特徴である
（Ｎａｋａｍｕｒａら、５ｃｉｅｎｃｅ ２３５ ：
１６１６１６２２、１９８７）。
例えば、ＪａｆｆｒｅｙｓらはＤＮＡフィンガープリン
ト法のための３種類のＶＮＴＲ−特異的プロブの使用を
記載している（Ｎａｔｕｒｅ ３１６：７６−８０．１
９８５）。
ト法のための３種類のＶＮＴＲ−特異的プロブの使用を
記載している（Ｎａｔｕｒｅ ３１６：７６−８０．１
９８５）。
Ｊｅｆｆｒｅｙｓらの研究におけるプローブは１人当り
１５より多くのハイブリダイズするバンドを検出した。
１５より多くのハイブリダイズするバンドを検出した。
ハイブリダイゼーションパターンは複雑であるが、この
研究は、英国に入国しようとする男性が確かにある（女
性）市民の息子であることを英国移民局に納得させる結
果を導いた（Ｊｅｆｆｒｅｙｓ ら、Ｎａｔｕｒｅ３１
７ ：８１８−８１９．１９８５）。
研究は、英国に入国しようとする男性が確かにある（女
性）市民の息子であることを英国移民局に納得させる結
果を導いた（Ｊｅｆｆｒｅｙｓ ら、Ｎａｔｕｒｅ３１
７ ：８１８−８１９．１９８５）。
Ｄ Ｎ Ａ−プリント（商標）系（Ｌｉｆｅｃｏｄｅｓ
Ｃｏ、。
Ｃｏ、。
Ｅｌｍｓｆｏｒｄ、ニューヨーク）と共に４種類の異る
ＶＮＴＲ遺伝子座を認識するプローブと共に用いるＤＮ
Ａフィンガープリント法もまた９９％より高い確率をも
って父系のｌのために用いられている２、Ｓｐｒｉｎｇ
ｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、 ニューヨーク、１９８７）
。
ＶＮＴＲ遺伝子座を認識するプローブと共に用いるＤＮ
Ａフィンガープリント法もまた９９％より高い確率をも
って父系のｌのために用いられている２、Ｓｐｒｉｎｇ
ｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、 ニューヨーク、１９８７）
。
ＤＮＡフィンガープリント法の法医学的用途もまた記載
されている。Ｇ１１ｌら（Ｎａｔｕｒｅ ３１ｇ ：
５７７−５７９．１９８５＞は、膣綿棒、４年前の乾燥
した血痕、及び布上の精液痕のごとき検体からフィンガ
ープリントのために適当なりＮＡを好結果に単離した。
されている。Ｇ１１ｌら（Ｎａｔｕｒｅ ３１ｇ ：
５７７−５７９．１９８５＞は、膣綿棒、４年前の乾燥
した血痕、及び布上の精液痕のごとき検体からフィンガ
ープリントのために適当なりＮＡを好結果に単離した。
１０６分の１より高レベルで個体を識別することができ
るＤＮＡ−プリント（商標）系についての他の報告にお
いては、プローブを用いて、殺人に用いられたらしい自
動車上のヒトの組織がその自動車の登録された所有者の
両親の子孫からのものであることが確定され、この組織
が無関係の個体に由来する機会は１６０．０００分の１
であった（Ｂａｉｒｄら、〔発明の解決しようとする課
題〕 ＤＮＡ２４７分は法は蛋白質タイプ分は法に比べて明ら
かな利点を有し、この利点には証拠サンプル中の他の物
質による干渉が少ないこと、及び乾燥したサンプル中で
蛋白質に比べてＤＮＡの方が安定性が高いことが含まれ
る（Ａｄａｍｓ、 Ｄ、 Ｅ、、 Ｃｒ ｉｍｅＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｄｉｇｅｓｔ １５：１０６−１
０８，１９８８）。ＤＮＡ２４７分は法はまた、複数の
逐次的ハイブリダイゼーションのために同じＤＮＡゲル
又はプロットを再使用することを可能にする。しかしな
がら、プローブの感度の欠如のため、この様なプローブ
の商業的利用のための真の可能性はまだ実現していない
。
るＤＮＡ−プリント（商標）系についての他の報告にお
いては、プローブを用いて、殺人に用いられたらしい自
動車上のヒトの組織がその自動車の登録された所有者の
両親の子孫からのものであることが確定され、この組織
が無関係の個体に由来する機会は１６０．０００分の１
であった（Ｂａｉｒｄら、〔発明の解決しようとする課
題〕 ＤＮＡ２４７分は法は蛋白質タイプ分は法に比べて明ら
かな利点を有し、この利点には証拠サンプル中の他の物
質による干渉が少ないこと、及び乾燥したサンプル中で
蛋白質に比べてＤＮＡの方が安定性が高いことが含まれ
る（Ａｄａｍｓ、 Ｄ、 Ｅ、、 Ｃｒ ｉｍｅＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｄｉｇｅｓｔ １５：１０６−１
０８，１９８８）。ＤＮＡ２４７分は法はまた、複数の
逐次的ハイブリダイゼーションのために同じＤＮＡゲル
又はプロットを再使用することを可能にする。しかしな
がら、プローブの感度の欠如のため、この様なプローブ
の商業的利用のための真の可能性はまだ実現していない
。
本発明は、高度に多形性の領域であるヒトＶＮＴＲ遺伝
子座を認識するＤＮＡプローブの新規な群を提供する。
子座を認識するＤＮＡプローブの新規な群を提供する。
これらのプローブは上に略記した欠点を克服し、他方に
おいて他の関連する利点を提供する。
おいて他の関連する利点を提供する。
要約すれば、本発明は、Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座の対立遺
伝子からのＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることが
できるＤ Ｎ Ａプローブ、及び法医学研究において、
父系又は他の生物学的関連性の問題において、遺伝子地
図の作成において、又は遺伝的疾患の素因の決定におい
て前記ＤＮＡプローブを使用する方法を提供する。さら
に、本発明のＤＮＡプローブ及び方法は、古典的な指紋
同定法に代るものとして又はそれを補うものとして使用
することができる。
伝子からのＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることが
できるＤ Ｎ Ａプローブ、及び法医学研究において、
父系又は他の生物学的関連性の問題において、遺伝子地
図の作成において、又は遺伝的疾患の素因の決定におい
て前記ＤＮＡプローブを使用する方法を提供する。さら
に、本発明のＤＮＡプローブ及び方法は、古典的な指紋
同定法に代るものとして又はそれを補うものとして使用
することができる。
本発明の１つの観点においては生物学的関連性の存在を
決定するための方法が提供され、この方法は（ａ）その
生物学的関連性に疑問が持たれる個体から採取された生
物学的サンプルからのＤＮＡ及び推定上の生物学的関連
者から採取された生物学的サンプルからのＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼにより平行して消化し、（ｂ）この
制限エンドヌクレアーゼ消化されたＤＮＡ断片をサイズ
分画し； （Ｃ）これらのＤＮＡ断片を、Ｄ４Ｓ１３９
遺伝子座の対立遺伝子からのＤＮＡに特異的にハイブリ
ダイズすることができるラベルされたＤＮＡプローブと
ハイブリダイズせしめ； （ｄ）ハイブリダイズしてい
ないラベルされたプローブを分離し； （ｅ）結合した
ラベルされたプローブを検出し；そして（ｆ）前記個体
及び前記生物学的関連者のハイブリダイゼーションパタ
ーンの同一性又は部分的同一性を分析する：段階を含ん
で成る。
決定するための方法が提供され、この方法は（ａ）その
生物学的関連性に疑問が持たれる個体から採取された生
物学的サンプルからのＤＮＡ及び推定上の生物学的関連
者から採取された生物学的サンプルからのＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼにより平行して消化し、（ｂ）この
制限エンドヌクレアーゼ消化されたＤＮＡ断片をサイズ
分画し； （Ｃ）これらのＤＮＡ断片を、Ｄ４Ｓ１３９
遺伝子座の対立遺伝子からのＤＮＡに特異的にハイブリ
ダイズすることができるラベルされたＤＮＡプローブと
ハイブリダイズせしめ； （ｄ）ハイブリダイズしてい
ないラベルされたプローブを分離し； （ｅ）結合した
ラベルされたプローブを検出し；そして（ｆ）前記個体
及び前記生物学的関連者のハイブリダイゼーションパタ
ーンの同一性又は部分的同一性を分析する：段階を含ん
で成る。
本発明の他の観点においては、生−法医学検体のｐ （
ｓｏｕｒｃｅ）の同定のための方法が記載される。
ｓｏｕｒｃｅ）の同定のための方法が記載される。
この方法は一般に、（ａ）生−法医学検体からのＤＮＡ
及び該生−法医学検体の推定上の源から採取された生物
学的サンプルからのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼに
より平行して消化し； （ｂ）この制限エンドヌクレア
ーゼ消化されたＤＮＡ断片をサイズ分画し： （Ｃ〉こ
れらのＤ Ｎ Ａ断片を、Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座の対立
遺伝子からのＤ Ｎ Ａに特異的にハイブリダイズする
ことができるラベルされたＤＮＡプロブとハイブリダイ
ズせしめ； （ｄ）ハイブリダイズしなかったラベルさ
れたプローブを分離し； （ｅ〉結合したラベルされた
プローブを検出し：そして（ｆ）前記推定上の源が前記
生−法医学検体の実際の源であるか否かを決定する；段
階を含んで成る。
及び該生−法医学検体の推定上の源から採取された生物
学的サンプルからのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼに
より平行して消化し； （ｂ）この制限エンドヌクレア
ーゼ消化されたＤＮＡ断片をサイズ分画し： （Ｃ〉こ
れらのＤ Ｎ Ａ断片を、Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座の対立
遺伝子からのＤ Ｎ Ａに特異的にハイブリダイズする
ことができるラベルされたＤＮＡプロブとハイブリダイ
ズせしめ； （ｄ）ハイブリダイズしなかったラベルさ
れたプローブを分離し； （ｅ〉結合したラベルされた
プローブを検出し：そして（ｆ）前記推定上の源が前記
生−法医学検体の実際の源であるか否かを決定する；段
階を含んで成る。
本発明の他の観点においては、生物学的サンブルの源の
ハロタイプの同定のための方法が開示される。この方法
は一般に、（ａ）生物学的サンプルからのＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼによりｍ化Ｌ； （ｂ）この制限
エンドヌクレアーゼ消化されたＤＮＡ断片をサイズ分画
し； （Ｃ）これらのＤＮＡ断片を、Ｄ４Ｓ１３９遺伝
子座の対立遺伝子からのＤＮＡに特異的にハイブリダイ
ズすることができるラベルされたプローブとハイブリダ
イズせしめ： （ｄ）ハイブリダイズしていないラベル
されたプローブを分離し； （ｅ）結合したラベルされ
たプローブを検出し；そして（ｆ）前記生物学的サンプ
ル中のＤＮＡの０４Ｓ１３９遺伝子座におけるハブロタ
イブを決定する；段階を含んで成る。本発明のこの態様
はまた、特定の０４Ｓ１３９パブロタイブが遺伝性疾患
の素因に関連している場合に有用である。
ハロタイプの同定のための方法が開示される。この方法
は一般に、（ａ）生物学的サンプルからのＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼによりｍ化Ｌ； （ｂ）この制限
エンドヌクレアーゼ消化されたＤＮＡ断片をサイズ分画
し； （Ｃ）これらのＤＮＡ断片を、Ｄ４Ｓ１３９遺伝
子座の対立遺伝子からのＤＮＡに特異的にハイブリダイ
ズすることができるラベルされたプローブとハイブリダ
イズせしめ： （ｄ）ハイブリダイズしていないラベル
されたプローブを分離し； （ｅ）結合したラベルされ
たプローブを検出し；そして（ｆ）前記生物学的サンプ
ル中のＤＮＡの０４Ｓ１３９遺伝子座におけるハブロタ
イブを決定する；段階を含んで成る。本発明のこの態様
はまた、特定の０４Ｓ１３９パブロタイブが遺伝性疾患
の素因に関連している場合に有用である。
上に略記した方法において、Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座に特
異的にハイブリダイズすることができるＤＮＡプローブ
はヒトのゲノムクローンに由来することができ、あるい
はＤＮＡプローブはオリゴヌクレオチドプローブである
ことができる。本発明の１つの態様において、ＤＮＡプ
ローブは、配列５ ’ −ＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴ［’
ＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧ −３’ から或ル２１ｂｐ
オリゴヌクレオチドである。他の態様においては、プロ
ーブは、配列５’ −ＲＲＲＡＹＡＫＧＡＲＡＧＡＲＣ
ＹＧＡＧＧＧＡＣＡＹＲＧＳＲＨＲＧ−３’を有するオ
リゴヌクレオチドから成るか又はこれを含んで成り、又
はその１４ｂｐ以上の断片であり、ここでＡはアデニン
であり、Ｇはグアニンであり、Ｃはシトシンであり、Ｒ
はアデニン又はグアニンであり、Ｙはシトシン又はチミ
ジンであり、Ｓはシトシン又はグアニンであり、モして
Ｋはグアニン又はチミジンである。
異的にハイブリダイズすることができるＤＮＡプローブ
はヒトのゲノムクローンに由来することができ、あるい
はＤＮＡプローブはオリゴヌクレオチドプローブである
ことができる。本発明の１つの態様において、ＤＮＡプ
ローブは、配列５ ’ −ＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴ［’
ＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧ −３’ から或ル２１ｂｐ
オリゴヌクレオチドである。他の態様においては、プロ
ーブは、配列５’ −ＲＲＲＡＹＡＫＧＡＲＡＧＡＲＣ
ＹＧＡＧＧＧＡＣＡＹＲＧＳＲＨＲＧ−３’を有するオ
リゴヌクレオチドから成るか又はこれを含んで成り、又
はその１４ｂｐ以上の断片であり、ここでＡはアデニン
であり、Ｇはグアニンであり、Ｃはシトシンであり、Ｒ
はアデニン又はグアニンであり、Ｙはシトシン又はチミ
ジンであり、Ｓはシトシン又はグアニンであり、モして
Ｋはグアニン又はチミジンである。
ＤＮＡプローブはまた前記オリゴヌクレオチド又はその
断片の相補体であってもよい。好ましい態様において、
ＤＮＡプローブはＤ４Ｓ１３９遺伝子座からノヒトＤＮ
Ａの４，０ｋｂｐＦｒ片である。
断片の相補体であってもよい。好ましい態様において、
ＤＮＡプローブはＤ４Ｓ１３９遺伝子座からノヒトＤＮ
Ａの４，０ｋｂｐＦｒ片である。
本発明のこれらの及び他の観点は以後の具体的な記載及
び添付された図面から明らかになるであろう。
び添付された図面から明らかになるであろう。
前記のごとく、本発明は、ヒトＶＮＴＲ遺伝子座０４５
１３９を特異的に記載するＤ Ｎ Ａプローブの使用に
向けられる。Ｄ４Ｓ１３９−特異的プローブの使用は他
の利用可能なＶＮＴＲプローブに卓越する多くの利点を
有する。Ｄ４Ｓ１３９プローブは、中程度〜高ストリン
ジエンシーの条件下で使用される場合に単一遺伝子座プ
ローブとして機能するので、そのハイブリダイゼーショ
ンバンドパターンは複数の遺伝子座を認識する他のプロ
ーブにより観察されるパターンよりも、単純である。そ
の結果、本発明のプローブを用いて混合サンプルを分析
することができる。この様な混合サンプルは混合した血
痕又は強姦事件からの膣由来のサンプルの場合があろう
。
１３９を特異的に記載するＤ Ｎ Ａプローブの使用に
向けられる。Ｄ４Ｓ１３９−特異的プローブの使用は他
の利用可能なＶＮＴＲプローブに卓越する多くの利点を
有する。Ｄ４Ｓ１３９プローブは、中程度〜高ストリン
ジエンシーの条件下で使用される場合に単一遺伝子座プ
ローブとして機能するので、そのハイブリダイゼーショ
ンバンドパターンは複数の遺伝子座を認識する他のプロ
ーブにより観察されるパターンよりも、単純である。そ
の結果、本発明のプローブを用いて混合サンプルを分析
することができる。この様な混合サンプルは混合した血
痕又は強姦事件からの膣由来のサンプルの場合があろう
。
Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座に対するプローブを使用を通して
、熟練者は実験的困難、例えば不完全な制限エンドヌク
レアーゼ消化又はＤＮＡサンプルの部分的分解を容易に
認識しそれに順応することができる。
、熟練者は実験的困難、例えば不完全な制限エンドヌク
レアーゼ消化又はＤＮＡサンプルの部分的分解を容易に
認識しそれに順応することができる。
単一遺伝子座系Ｄ４Ｓ１３９系の他の利点は好ましい高
ストリンジエンシー条件下でのハイブリダイゼーション
のそれであり、サンプル中に夾雑物として存在するかも
しれず又は証拠サンプルと混合されるかも知れない他の
種からのＤＮＡとの交叉ハイブリダイゼーションが少な
いことである。
ストリンジエンシー条件下でのハイブリダイゼーション
のそれであり、サンプル中に夾雑物として存在するかも
しれず又は証拠サンプルと混合されるかも知れない他の
種からのＤＮＡとの交叉ハイブリダイゼーションが少な
いことである。
Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座は、３．０００より大きいＬＯＤ
スコアーを有する、最もテロメア性の（ｔｅｌｏｍｅｒ
ｉｃ）既知マーカーＬ２３１から１５〜２０ｃ！Ｊ （
センチモルガン）の、４ｑのテレメア（ｔｅｌｏｍｅｒ
ｅ）の近傍のヒト染色体４の長いアーム上にある。Ｄ４
Ｓ１３９遺伝子座は既知の染色体４マーカーを用いる連
鎖分析（Ｉ ｉｎｋａｇｅａｎａｌｙｓｌｓ） によ
りヒト染色体４にマツプされた。
スコアーを有する、最もテロメア性の（ｔｅｌｏｍｅｒ
ｉｃ）既知マーカーＬ２３１から１５〜２０ｃ！Ｊ （
センチモルガン）の、４ｑのテレメア（ｔｅｌｏｍｅｒ
ｅ）の近傍のヒト染色体４の長いアーム上にある。Ｄ４
Ｓ１３９遺伝子座は既知の染色体４マーカーを用いる連
鎖分析（Ｉ ｉｎｋａｇｅａｎａｌｙｓｌｓ） によ
りヒト染色体４にマツプされた。
この遺伝子座は高ストリンジエンシー（０，ｌＸ５ＳＣ
、１％ＳＯＳ、 ６５℃）の条件下でオリゴヌクレ、ｔ
チ）’ Ｈ３０又ハ４．５ ｋｂｐ （７）Ｄ４Ｓ１
３９７’０−フッごとき代表的プローブと特異的にハイ
ブリダイズすることができる。Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座に
おける実際の反復ＤＮＡ配列に連らなって追加のフラン
キングＤＮＡが存在する。Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座の対立
遺伝子の同定に有用でありそして本発明において期得さ
れるプロブはタンデムに反復するＤＮＡ配列に又はこれ
らの反復配列に接するＤＮＡに由来することができる。
、１％ＳＯＳ、 ６５℃）の条件下でオリゴヌクレ、ｔ
チ）’ Ｈ３０又ハ４．５ ｋｂｐ （７）Ｄ４Ｓ１
３９７’０−フッごとき代表的プローブと特異的にハイ
ブリダイズすることができる。Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座に
おける実際の反復ＤＮＡ配列に連らなって追加のフラン
キングＤＮＡが存在する。Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座の対立
遺伝子の同定に有用でありそして本発明において期得さ
れるプロブはタンデムに反復するＤＮＡ配列に又はこれ
らの反復配列に接するＤＮＡに由来することができる。
反１ＤＮＡ配列に接するＤＮＡの実際の範囲は、当業界
に自明のごと＜ 、Ｄ４Ｓ１３９対立遺伝子を定義する
ために用いらさる制限酵素に依存する。
に自明のごと＜ 、Ｄ４Ｓ１３９対立遺伝子を定義する
ために用いらさる制限酵素に依存する。
本発明の方法において有用なプローブであるオリゴヌク
レオチドＨ３０は、配列５’ −ＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴ
ＣＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧ −３’ を含む２１ｂｐのオ
リゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは該
配列を担持するプラスミド、例えば３０ｐｌ （Ｓｃｈ
ｒｏｅｄｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ ２３８ ニア９１
−７９３．１９８７）から切り出すことができ、又は当
業界においてよく知られている方法に従って化学的に合
成することができる。
レオチドＨ３０は、配列５’ −ＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴ
ＣＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧ −３’ を含む２１ｂｐのオ
リゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは該
配列を担持するプラスミド、例えば３０ｐｌ （Ｓｃｈ
ｒｏｅｄｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ ２３８ ニア９１
−７９３．１９８７）から切り出すことができ、又は当
業界においてよく知られている方法に従って化学的に合
成することができる。
前記のごとく、本発明の他の代表的なプローブである４
、０ｋｂｐのＤ４Ｓ１３９プローブは高ストリンジエン
シー（０，Ｉ Ｘ５ＳＣ、１％ＳＯ３，６５℃）の条件
下で単一遺伝子座プローブとして機能する。４．０ｋｂ
ｐのＤ４Ｓ１３９プローブは、ＤＮＡ源としてセルライ
ンＣＲＩを用いてλファージＥ １．ｆ Ｂ Ｌ中に構
築されたヒトゲノムライブラリーからのＳ ａｕ３Ａ断
片として単離された。
、０ｋｂｐのＤ４Ｓ１３９プローブは高ストリンジエン
シー（０，Ｉ Ｘ５ＳＣ、１％ＳＯ３，６５℃）の条件
下で単一遺伝子座プローブとして機能する。４．０ｋｂ
ｐのＤ４Ｓ１３９プローブは、ＤＮＡ源としてセルライ
ンＣＲＩを用いてλファージＥ １．ｆ Ｂ Ｌ中に構
築されたヒトゲノムライブラリーからのＳ ａｕ３Ａ断
片として単離された。
本発明の他の代表的なプローブを第７図に示す。
この８４ｂｐプローブは、３２ｂｐ反復ユニットの共通
（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列と、当業界においてよく知
られている種々の方法のいずれかによる該８４ｂｐプロ
ーブの酵素的ラベル化のためのブライマーとして機能す
る２０ｂｐの付加配列とから構成されている。
（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列と、当業界においてよく知
られている種々の方法のいずれかによる該８４ｂｐプロ
ーブの酵素的ラベル化のためのブライマーとして機能す
る２０ｂｐの付加配列とから構成されている。
上記の代表的プローブに加えて、本発明において提供さ
れる教示が与えられれば本発明において使用するための
他のプローブを生じさせることができることは当業者に
とって明らかであろう。要約すれば、０４Ｓ１３９−特
異的プローブを、制限エンドヌクレアーゼ消化されサイ
ズ分画されたヒトＤＮＡにハイブリダイズさせてＤ４Ｓ
１３９対立遺伝子を担持する断片のサイズを同定するこ
とができる。
れる教示が与えられれば本発明において使用するための
他のプローブを生じさせることができることは当業者に
とって明らかであろう。要約すれば、０４Ｓ１３９−特
異的プローブを、制限エンドヌクレアーゼ消化されサイ
ズ分画されたヒトＤＮＡにハイブリダイズさせてＤ４Ｓ
１３９対立遺伝子を担持する断片のサイズを同定するこ
とができる。
次に適切にサイズ分画されたＤＮＡを調製して適当なベ
クターに連結する。Ｄ４Ｓ１３９対立遺伝子のクローニ
ングにおいてサイズ分画の段階が好ましいが必須ではな
いことが当業界において理解されよう。上に記載したプ
ローブのごときＤ４Ｓ１３９−特異的プローブを用いて
クローンをスクリーニングし、そして陽性クローンをさ
らに特徴付ける。この方法は、上記の４．０ｋｂｐの０
４Ｓ１３９断片を生じさせる対立遺伝子とは異る対立遺
伝子から追加のＤ４Ｓ１３９−特異的プローブを生じさ
せることを可能にする。
クターに連結する。Ｄ４Ｓ１３９対立遺伝子のクローニ
ングにおいてサイズ分画の段階が好ましいが必須ではな
いことが当業界において理解されよう。上に記載したプ
ローブのごときＤ４Ｓ１３９−特異的プローブを用いて
クローンをスクリーニングし、そして陽性クローンをさ
らに特徴付ける。この方法は、上記の４．０ｋｂｐの０
４Ｓ１３９断片を生じさせる対立遺伝子とは異る対立遺
伝子から追加のＤ４Ｓ１３９−特異的プローブを生じさ
せることを可能にする。
Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座に関連する高度な多形性が、上記
のオリゴヌクレオチドＨ３０プローブを用いての、制限
酵素Ｔａｑ Ｉにより消化されたヒトケノムＤＮＡへの
ストリンジェントなハイブリダイゼーションを通して示
される。１５人の無関連の個体からのＴａｑＩ−消化さ
れたＤＮＡについてのオリゴヌクレオチドＨ３Ｏ−特異
的ハイブリダイゼーションのパターンを示す第４図は、
Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座の少なくとも２０の対立遺伝子の
存在を示し、Ｄ４Ｓ１３９−関連バンドは約５ ｋｂｐ
〜約２３ｋｂｐのサイズ範囲にわたり、平均サイズは約
９ ｋｂｐである。一般に、ＤＮＡ単離体当り２個のバ
ンドが観察された。従って、一般集団から無作為に選択
された個体はＤ４Ｓ１３９遺伝子座について高度にヘテ
ロ接合性であり、そしてＤ４Ｓ１３９−ハイブリダイズ
バンドのサイズに大きな多様性が存在する。従って、本
発明のＤ４Ｓ１３９−特異的プローブは個体の同定のた
めのＤＮＡタイ１分は法の使用を可能にする。他の代表
的プローブである４、０ｋｂｐのＤ４Ｓ１３９断片を用
いて類似の結果が得られた。Ｔａｑ Ｉの使用に加えて
、ＤＮＡサンプルを他の制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ旦
□ｄｌｌＩ、ＢｇｌＩＩ、旦ａｍＨ１，ヱ因Ｉ、Ａ月■
Ｈｉｎ ｆ Ｉ 、 Ｈａｅ［［、Ｒｓａ Ｉ及びＸｔ
＋ａＩにより消化した場合にもサイズの異るハイブリダ
イズバンドの簡単なパターンが存在する。
のオリゴヌクレオチドＨ３０プローブを用いての、制限
酵素Ｔａｑ Ｉにより消化されたヒトケノムＤＮＡへの
ストリンジェントなハイブリダイゼーションを通して示
される。１５人の無関連の個体からのＴａｑＩ−消化さ
れたＤＮＡについてのオリゴヌクレオチドＨ３Ｏ−特異
的ハイブリダイゼーションのパターンを示す第４図は、
Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座の少なくとも２０の対立遺伝子の
存在を示し、Ｄ４Ｓ１３９−関連バンドは約５ ｋｂｐ
〜約２３ｋｂｐのサイズ範囲にわたり、平均サイズは約
９ ｋｂｐである。一般に、ＤＮＡ単離体当り２個のバ
ンドが観察された。従って、一般集団から無作為に選択
された個体はＤ４Ｓ１３９遺伝子座について高度にヘテ
ロ接合性であり、そしてＤ４Ｓ１３９−ハイブリダイズ
バンドのサイズに大きな多様性が存在する。従って、本
発明のＤ４Ｓ１３９−特異的プローブは個体の同定のた
めのＤＮＡタイ１分は法の使用を可能にする。他の代表
的プローブである４、０ｋｂｐのＤ４Ｓ１３９断片を用
いて類似の結果が得られた。Ｔａｑ Ｉの使用に加えて
、ＤＮＡサンプルを他の制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ旦
□ｄｌｌＩ、ＢｇｌＩＩ、旦ａｍＨ１，ヱ因Ｉ、Ａ月■
Ｈｉｎ ｆ Ｉ 、 Ｈａｅ［［、Ｒｓａ Ｉ及びＸｔ
＋ａＩにより消化した場合にもサイズの異るハイブリダ
イズバンドの簡単なパターンが存在する。
多数の個体からのバンドのパターン測定する場合、デー
ターを対立遺伝子又はビン（ｂｉｎ） ｍＡ度表にまと
めることができる。次に、この集団データーを用いて一
般集団中に特定のパターンが現われる頻度について統計
的予測を行うことができる。
ターを対立遺伝子又はビン（ｂｉｎ） ｍＡ度表にまと
めることができる。次に、この集団データーを用いて一
般集団中に特定のパターンが現われる頻度について統計
的予測を行うことができる。
使用されるアガロースゲル系の分離能がしばしば、（又
は２個の３２塩基対ＤＮＡ配列反復ユニットだけ異るＤ
ＮＡ制限断片を分離するのに十分でないため、観察され
るバンドはビン（ｂｉｎ） に集まる。
は２個の３２塩基対ＤＮＡ配列反復ユニットだけ異るＤ
ＮＡ制限断片を分離するのに十分でないため、観察され
るバンドはビン（ｂｉｎ） に集まる。
この方法は、所与のＤＮＡパターンの予想される出現を
計算する場合に用いられる頻度は常にひかえ目であるこ
とを保証し、これはこのデーターが法的手続において使
用される場合に考慮すべき重要なことである。第１表は
、半自動画像分析装置を用いて色々な人種群及び種族群
から連邦検察局により得られたＤ４Ｓ１３９遺伝子座に
おける表現型のビン（ｉｏｉｎ）頻度データーを示す（
！、Ｉｏｎｓｏｎ、 Ｋ、Ｌ、。
計算する場合に用いられる頻度は常にひかえ目であるこ
とを保証し、これはこのデーターが法的手続において使
用される場合に考慮すべき重要なことである。第１表は
、半自動画像分析装置を用いて色々な人種群及び種族群
から連邦検察局により得られたＤ４Ｓ１３９遺伝子座に
おける表現型のビン（ｉｏｉｎ）頻度データーを示す（
！、Ｉｏｎｓｏｎ、 Ｋ、Ｌ、。
Ｃｒｉｍｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｄｉｇｅｓｔ
１５：１０４−１０５．１９８８）。
１５：１０４−１０５．１９８８）。
マーカーＬＣ２ＸＬはライフコード（Ｌｉｆｅｃｏｄｅ
ｓ）分子量標準を示す。ＲＥは使用された制限酵素を示
す。
ｓ）分子量標準を示す。ＲＥは使用された制限酵素を示
す。
人種（Ｒａｃｅ）は次の通りである二Ｂ＝アフリカ系ア
メリカ人、Ｃ＝白人、Ｈ−スペイン系、■−アメリカ土
着人。ＬＯ−Ｌｉｍｉｔはビンの下限を規定するＤＮＡ
Ｉｆｒ片の分子量であり、他方Ｈｉ−Ｌｉｍｉｔはビン
の上限を規定するＤＮＡ断片の分子量である。
メリカ人、Ｃ＝白人、Ｈ−スペイン系、■−アメリカ土
着人。ＬＯ−Ｌｉｍｉｔはビンの下限を規定するＤＮＡ
Ｉｆｒ片の分子量であり、他方Ｈｉ−Ｌｉｍｉｔはビン
の上限を規定するＤＮＡ断片の分子量である。
Ｃｏｕｎｔはそのビンに属するバンドの数であり、そし
てＰａ；ｎｔ Ｅｓｔ、はそのビンにおける特定の人種
−種族群からの全体に対する比率である。
てＰａ；ｎｔ Ｅｓｔ、はそのビンにおける特定の人種
−種族群からの全体に対する比率である。
データーは次の様にして使用される。まず、所与のパタ
ーンを適切なビンに帰属せしめ、そして次に検査される
べき人種／種族群にそのビン中にドンドが見出される頻
度を位置付ける。それらの２つの頻度の積が、対応する
人種／種族群においてバンドの特定の対が見出されるで
あろう最小頻度である。例えば、スペイン系個体のＤＮ
Ａパターンがビン２及び７に属するバンドを有する場合
、そのパターンが一般的スペイン系集団中に存在すると
予想される最小頻度は０．０５５ ｘＱ、 １６５ ＝
０．００９又は０．９％である。
ーンを適切なビンに帰属せしめ、そして次に検査される
べき人種／種族群にそのビン中にドンドが見出される頻
度を位置付ける。それらの２つの頻度の積が、対応する
人種／種族群においてバンドの特定の対が見出されるで
あろう最小頻度である。例えば、スペイン系個体のＤＮ
Ａパターンがビン２及び７に属するバンドを有する場合
、そのパターンが一般的スペイン系集団中に存在すると
予想される最小頻度は０．０５５ ｘＱ、 １６５ ＝
０．００９又は０．９％である。
前記のように、本発明のプローブは生−法医学検体源の
同定、生物学的関連の存在の決定、ゲノム地図の作成及
び疾患の素因の決定において使用することができる。
同定、生物学的関連の存在の決定、ゲノム地図の作成及
び疾患の素因の決定において使用することができる。
生−法医学検体の源の同定において、本発明のプローブ
は生−法医学検体に由来するＤＮＡ中の特異的Ｄ４Ｓ１
３９対立遺伝子を可視化するために使用される。要約す
れば、サンプルからのＤＮＡを好ましくはまず消化に先
立って抽出する。次に、このＤＮＡを制限酵素によって
消化し、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、
そして通常は基材、例えばナイロン又はニトロセルロー
スに移して次にハイブリダイゼーションを行う。ラベル
された０４Ｓ１３９プローブを好ましくは高ストリンジ
エンシーの条件下でハイブリダイズせしめる。検体から
調製されたＤＮＡ断片におけるＤ４Ｓ１３９−ハイブリ
ダイズバンドと既知個体からのＤＮＡ断片におけるＤ４
Ｓ１３９−ハイブリダイズバンドの一致が証拠サンプル
の究極的起源の推定的同定を与える。
は生−法医学検体に由来するＤＮＡ中の特異的Ｄ４Ｓ１
３９対立遺伝子を可視化するために使用される。要約す
れば、サンプルからのＤＮＡを好ましくはまず消化に先
立って抽出する。次に、このＤＮＡを制限酵素によって
消化し、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、
そして通常は基材、例えばナイロン又はニトロセルロー
スに移して次にハイブリダイゼーションを行う。ラベル
された０４Ｓ１３９プローブを好ましくは高ストリンジ
エンシーの条件下でハイブリダイズせしめる。検体から
調製されたＤＮＡ断片におけるＤ４Ｓ１３９−ハイブリ
ダイズバンドと既知個体からのＤＮＡ断片におけるＤ４
Ｓ１３９−ハイブリダイズバンドの一致が証拠サンプル
の究極的起源の推定的同定を与える。
ヒ）ＤＮＡを含有する生−法医学検体は犯罪の犠牲者か
ら、又は犯罪の犠牲者もしくは容疑者の家族の構成員か
ら得られるであろう。さらに、検体は犯罪又は事故の現
場、又は犯罪もしくは事項の容疑者からのサンプルであ
ることができる。生−法医学検体には血液、乾燥血液、
乾燥血痕、精液、乾燥精液、乾燥精液痕、口腔綿棒、膣
綿棒、膣液、乾燥膣液痕、又は他の体液及び体液痕、精
液物、乾燥精液物、毛、髪、毛根、及び人体からの組織
サンプルが含まれるが、これらに限らない。
ら、又は犯罪の犠牲者もしくは容疑者の家族の構成員か
ら得られるであろう。さらに、検体は犯罪又は事故の現
場、又は犯罪もしくは事項の容疑者からのサンプルであ
ることができる。生−法医学検体には血液、乾燥血液、
乾燥血痕、精液、乾燥精液、乾燥精液痕、口腔綿棒、膣
綿棒、膣液、乾燥膣液痕、又は他の体液及び体液痕、精
液物、乾燥精液物、毛、髪、毛根、及び人体からの組織
サンプルが含まれるが、これらに限らない。
検体は体操、生前、出生前、又は新生児のものであるこ
とができる。
とができる。
本発明のプローブを用いる生−法医学検体の源の同定は
、例えば、容疑者の衣類の血痕が犯罪の犠牲者に由来す
ることをｌするために、強姦の犠牲者の膣サンプル中の
ＤＮＡが特定の容疑者に由来することを証明するために
、及び犯罪の犠牲者の両親（又は他の家族もしくは血縁
者）であると信じられる者との一般的関係を示すことに
より犯罪犠牲者の同一性を確立するために有用である。
、例えば、容疑者の衣類の血痕が犯罪の犠牲者に由来す
ることをｌするために、強姦の犠牲者の膣サンプル中の
ＤＮＡが特定の容疑者に由来することを証明するために
、及び犯罪の犠牲者の両親（又は他の家族もしくは血縁
者）であると信じられる者との一般的関係を示すことに
より犯罪犠牲者の同一性を確立するために有用である。
法医学的タイプ分けにおける０４Ｓ１３９遺伝子座に対
して特異的なりＮＡプローブの有用性は第５図に示され
る。要約すれば、ＤＮＡサンプルを、（棄てられた）強
姦の証拠の綿棒から単離した。
して特異的なりＮＡプローブの有用性は第５図に示され
る。要約すれば、ＤＮＡサンプルを、（棄てられた）強
姦の証拠の綿棒から単離した。
８件の強姦事件からの綿棒（膣、直腸、口腔、皮膚及び
血液が混った膣、からの綿棒を包含する）を対照男性Ｄ
Ｎ Ａと共に分析した。ＤＮＡサンプルをＨｉｎｆｌ
で消化し、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し
、そして第５図Ａに示すように、プローブとして４．０
ｋｂｐの［１４Ｓ１３９断片とハイブリダイズさせた。
血液が混った膣、からの綿棒を包含する）を対照男性Ｄ
Ｎ Ａと共に分析した。ＤＮＡサンプルをＨｉｎｆｌ
で消化し、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し
、そして第５図Ａに示すように、プローブとして４．０
ｋｂｐの［１４Ｓ１３９断片とハイブリダイズさせた。
次に、第５図Ｂに示すように、プロットを、［］４Ｓ１
３９プローブの中間ストリッピングを伴わないでＹ染色
体特異的プローブにハイブリダイズせしめた。男性特異
的バンドの位置を矢じり印で表示する。事例２のＤ Ｎ
Ａタイ１分は証拠が示すところによれば、ＤＮＡは膣
サンプル及び直腸サンプルの両方に存在し、男性ＤＮＡ
は直腸綿棒にのみ存在した。同様に、事例８からのサン
プルは男性ＤＮＡの存在を示す。事例２ （パネルＡ）
においては、犠牲者及び攻撃者が低分子Ｄ４Ｓ１３９対
立遺伝子を共有する。次に、Ｙ染色体特異的プローブに
よりプローブすることにより男性ＤＮＡが存在したこと
が確認された。他の用途において、プロットの中間スト
リッピングの段階を伴って又は伴わないで、追加のＶＮ
ＴＲ遺伝子座に対して特異的な単一遺伝子座プローブと
の逐次的ハイブリダイゼーションを用いるもの有用であ
ろう。
３９プローブの中間ストリッピングを伴わないでＹ染色
体特異的プローブにハイブリダイズせしめた。男性特異
的バンドの位置を矢じり印で表示する。事例２のＤ Ｎ
Ａタイ１分は証拠が示すところによれば、ＤＮＡは膣
サンプル及び直腸サンプルの両方に存在し、男性ＤＮＡ
は直腸綿棒にのみ存在した。同様に、事例８からのサン
プルは男性ＤＮＡの存在を示す。事例２ （パネルＡ）
においては、犠牲者及び攻撃者が低分子Ｄ４Ｓ１３９対
立遺伝子を共有する。次に、Ｙ染色体特異的プローブに
よりプローブすることにより男性ＤＮＡが存在したこと
が確認された。他の用途において、プロットの中間スト
リッピングの段階を伴って又は伴わないで、追加のＶＮ
ＴＲ遺伝子座に対して特異的な単一遺伝子座プローブと
の逐次的ハイブリダイゼーションを用いるもの有用であ
ろう。
個体又は検体源が明瞭に同定されることが望まれる場合
、プローブの組合わせを用いるのが好ましい。
、プローブの組合わせを用いるのが好ましい。
生物学的関係又は家族関係の試験において、本発明のプ
ローブは、家族関係が確認できるように、個体及び彼又
は彼女の推定上の生物学的関係者のＤ４Ｓ１３９対立遺
伝子可視化するために使用される。
ローブは、家族関係が確認できるように、個体及び彼又
は彼女の推定上の生物学的関係者のＤ４Ｓ１３９対立遺
伝子可視化するために使用される。
要約すれば、本発明の好ましい態様において、既知の親
及び／又は推定上の親（又は他の生物学的関連者からの
ＤＮＡと平行して、その生物学的関係が疑われている個
体からの生物学的サンプル、例えば血液又は組織サンプ
ルからＤＮＡを調製する。一般に、ＤＮＡ源として末梢
血サンプルが使用される。ＤＮＡ断片を制限エンドヌク
レアーゼで消化し、アガロースゲル電気泳動によりサイ
ズ分画し、そして基材、例えばナイロン又はニトロセル
ロースに移して、ラベルされたプローブと、好ましくは
高ストレンジエンシー条件下でハイブリダイズせしめる
。Ｄ４Ｓ１３９対立遺伝子のメンデル遺伝子が存在する
ので、個体の１つのバンドは既知の親の１つのバンドと
一致するであろう。推定される親のバンドが個体の第二
のバンドと一致すれば、その推定される親が前記個体の
生物学的親であることの推定証拠が存在する。推定され
る親のＤＮＡが０４Ｓ１３９−特異的バンドを共有しな
い場合、その様な生物学的関係が存在しないことがほと
んど確定的である。
及び／又は推定上の親（又は他の生物学的関連者からの
ＤＮＡと平行して、その生物学的関係が疑われている個
体からの生物学的サンプル、例えば血液又は組織サンプ
ルからＤＮＡを調製する。一般に、ＤＮＡ源として末梢
血サンプルが使用される。ＤＮＡ断片を制限エンドヌク
レアーゼで消化し、アガロースゲル電気泳動によりサイ
ズ分画し、そして基材、例えばナイロン又はニトロセル
ロースに移して、ラベルされたプローブと、好ましくは
高ストレンジエンシー条件下でハイブリダイズせしめる
。Ｄ４Ｓ１３９対立遺伝子のメンデル遺伝子が存在する
ので、個体の１つのバンドは既知の親の１つのバンドと
一致するであろう。推定される親のバンドが個体の第二
のバンドと一致すれば、その推定される親が前記個体の
生物学的親であることの推定証拠が存在する。推定され
る親のＤＮＡが０４Ｓ１３９−特異的バンドを共有しな
い場合、その様な生物学的関係が存在しないことがほと
んど確定的である。
Ｄ４Ｓ１３９対立遺伝子のメンデル遺伝は、代表的な三
世代家族（１４２１）の家系を示す第１図、及びその家
族の構成員の０４Ｓ１３９特異的ハイブリダイゼーシヨ
ンパターンを示す第２図において示される。レーン上及
び２はそれぞれ父親又は母親（第二世代）からのＤＮＡ
を含み、そしてレーン３〜８及び１１〜１２はそれらの
子孫、すなわち第三世代からのＤＮＡを含む。第一世代
は、それぞれ父方の祖父及び祖母からのＤＮＡを含むレ
ーン９及び１０、並びに母方の祖母及び祖父からのＤＮ
Ａを含むレーン１３及び１４に示される。バンドのパタ
ーンはＤ４Ｓ１３９遺伝子座のコー優生分離（ｃｏ−ｄ
ｏｍｉｎａｎｔｒｅｇｒｅｇａｔ １ｏｎ）及びメンデ
ル遺伝を反映している。
世代家族（１４２１）の家系を示す第１図、及びその家
族の構成員の０４Ｓ１３９特異的ハイブリダイゼーシヨ
ンパターンを示す第２図において示される。レーン上及
び２はそれぞれ父親又は母親（第二世代）からのＤＮＡ
を含み、そしてレーン３〜８及び１１〜１２はそれらの
子孫、すなわち第三世代からのＤＮＡを含む。第一世代
は、それぞれ父方の祖父及び祖母からのＤＮＡを含むレ
ーン９及び１０、並びに母方の祖母及び祖父からのＤＮ
Ａを含むレーン１３及び１４に示される。バンドのパタ
ーンはＤ４Ｓ１３９遺伝子座のコー優生分離（ｃｏ−ｄ
ｏｍｉｎａｎｔｒｅｇｒｅｇａｔ １ｏｎ）及びメンデ
ル遺伝を反映している。
染色体４の１つのコピーは客観から受は継がれ、従って
子は客観からＤ４Ｓ１３９遺伝座の１つづつの対立遺伝
子を受は継ぐ。その結果、２人の推定上の生物学的関係
者の０４３１３９対立遺伝子が異る場合、Ｄ４Ｓ１３９
ＤＮＡタイプ分けを用いである子の親子関係を確認す
ることができる。前記のごと＜ 、Ｄ４Ｓ１３９−関連
プローブと組合わせて他の単一遺伝子座ＶＮＴＲプロー
ブを使用することによりより高い信頼レベルで生物学的
家族関係を推定することができる。
子は客観からＤ４Ｓ１３９遺伝座の１つづつの対立遺伝
子を受は継ぐ。その結果、２人の推定上の生物学的関係
者の０４３１３９対立遺伝子が異る場合、Ｄ４Ｓ１３９
ＤＮＡタイプ分けを用いである子の親子関係を確認す
ることができる。前記のごと＜ 、Ｄ４Ｓ１３９−関連
プローブと組合わせて他の単一遺伝子座ＶＮＴＲプロー
ブを使用することによりより高い信頼レベルで生物学的
家族関係を推定することができる。
生物学的サンプル源のハブロタイブも本明細書に記載す
る方法により決定することができる。この様なハブロタ
イブ決定の１つの用途は、特定の遺伝性疾患の遺伝がＤ
４Ｓ１３９遺伝子座の特定の対立遺伝子と関連している
場合にその遺伝性疾患の素因を有する個体を同定する場
合である。これに関して適当な生物学的サンプルには血
液、組織及び細胞が含まれる。本発明のこの態様におい
て出生前サンプル、新生児サンプル、死後サンプル及び
他のサンプルを用いることができる。
る方法により決定することができる。この様なハブロタ
イブ決定の１つの用途は、特定の遺伝性疾患の遺伝がＤ
４Ｓ１３９遺伝子座の特定の対立遺伝子と関連している
場合にその遺伝性疾患の素因を有する個体を同定する場
合である。これに関して適当な生物学的サンプルには血
液、組織及び細胞が含まれる。本発明のこの態様におい
て出生前サンプル、新生児サンプル、死後サンプル及び
他のサンプルを用いることができる。
本発明により提供されるすべての方法において、実験的
結論の信頼性レベルを高めるために本発明のプローブを
他の単一遺伝子座ＶＮＴＲプローブと組合わせて用いる
ことが好ましい。本発明の０４Ｓ１３９−関連プローブ
と組合わせて使用することが予想される他の単一遺伝子
座ＶＮＴＲプローブには、アメリカン・タイプ・カルチ
ュア・コレクション（ＡＴＣＣ＞から人手可能なｐＹＮ
Ｈ２４、ｐＣＭＬＪ１４及びｐＣ！、！！、１１０１が
含まれるが、これらに限定されない。
結論の信頼性レベルを高めるために本発明のプローブを
他の単一遺伝子座ＶＮＴＲプローブと組合わせて用いる
ことが好ましい。本発明の０４Ｓ１３９−関連プローブ
と組合わせて使用することが予想される他の単一遺伝子
座ＶＮＴＲプローブには、アメリカン・タイプ・カルチ
ュア・コレクション（ＡＴＣＣ＞から人手可能なｐＹＮ
Ｈ２４、ｐＣＭＬＪ１４及びｐＣ！、！！、１１０１が
含まれるが、これらに限定されない。
さらに、プローブＣＲＩ−ＰＡＴ−ｐＬ３３６及びＣＲ
Ｉ−ＰＡＴｐＬ３３５−１１ｉをコラボラティブ・リサ
ーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａ−ｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ）社（Ｂｅｄｆｏｒｄ、 ＭＡ）から入手することが
できる。
Ｉ−ＰＡＴｐＬ３３５−１１ｉをコラボラティブ・リサ
ーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａ−ｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ）社（Ｂｅｄｆｏｒｄ、 ＭＡ）から入手することが
できる。
本発明により提供されるすべての方法において、ＤＮＡ
単離手順を行うことなく生物学的サンプル又は生−法医
学証拠検体からのＤＮＡを分析することが好ましいであ
ろう。例えば、細胞を溶解し、そしてそこから放出され
たＤＮＡを制限酵素で消化することが当業界において知
られている。
単離手順を行うことなく生物学的サンプル又は生−法医
学証拠検体からのＤＮＡを分析することが好ましいであ
ろう。例えば、細胞を溶解し、そしてそこから放出され
たＤＮＡを制限酵素で消化することが当業界において知
られている。
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが
、これにより本発明の範囲を限定するものではない。
、これにより本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
酵素は商業的入手源から得、そして提供者の推奨に従っ
て、又は当業界においてよく知られている他の変法に従
って使用する。適当な緩衝液、試薬及び培養条件も当業
界において知られている。
て、又は当業界においてよく知られている他の変法に従
って使用する。適当な緩衝液、試薬及び培養条件も当業
界において知られている。
標準的分子生物学手法を記載した参照文献にはＴ、Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら、！、１ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ）！ａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏ５ ニー −シーヨーク、１９８７ ； Ｒ，Ｗｕ
ら編集、Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ。
ｎｉａｔｉｓら、！、１ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ）！ａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏ５ ニー −シーヨーク、１９８７ ； Ｒ，Ｗｕ
ら編集、Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ。
１００及び１０１ 、１９８３；Ｌ、 Ｇｒｏｓｓｍｍ
及びに、Ｍｏ１ｄａｖｅ ｍ集、１Ａｅｔｈ、 Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、 ５５．１９８Ｑ；Ｊ、 ！Ｊｉｌｌｅｒ編
集、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ＋ｎ ！Ｊｅｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ニューヨーク、１９７２
； Ｏｌｄ及びＰｒｉｍｒｏｓｅ、Ｐｒ１ｎｃｉｐｌ
ｅｓ ｏｆＧｅｎｅ Ｍａｎｔｐｕｌａｔｉｏｎ、Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａＰｒｅ
ｓｓ、 Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、カリホルニア； Ｒ，５ｃ
ｈｌｉｅｆ及びＰ、ＩＶｅｎｓ＋ｎｋ、Ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＭｌｅｃｕｌａｒＢｉ
ｏｌｏｇｙ、 １９８２；Ｇｌｏｖｅｒ編集、ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ＶｏＲＩ及びＩＩ、０ｘｆｏｒｄ Ｐ
ｒｅｓｓ 、オックスフォード、英国、１９８５ ；
Ｂ、 Ｈａｍｅｓ及びＳ、Ｈｉｇｇｉｎｓ、 Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄＨｙｂｒ、１ｄｉｚａｔｉｏｎ、
ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、英国；並びに
Ｓｅｔｌｏｗ及びＨｏ１ｌａｅｎｄｅｒ、 Ｇｅｎｅｔ
ｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ ！Ｊｅｔｈｏｄｓ、 Ｖｏｊｌ！、１−４゜ｐ
ｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークがあり、これら
を引用により本明細書に組み入れる。ＤＮＡの化学合或
はよく確立された方法、すなわちＣａｒｕｔｈｅｒｓ。
及びに、Ｍｏ１ｄａｖｅ ｍ集、１Ａｅｔｈ、 Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、 ５５．１９８Ｑ；Ｊ、 ！Ｊｉｌｌｅｒ編
集、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ＋ｎ ！Ｊｅｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ニューヨーク、１９７２
； Ｏｌｄ及びＰｒｉｍｒｏｓｅ、Ｐｒ１ｎｃｉｐｌ
ｅｓ ｏｆＧｅｎｅ Ｍａｎｔｐｕｌａｔｉｏｎ、Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａＰｒｅ
ｓｓ、 Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、カリホルニア； Ｒ，５ｃ
ｈｌｉｅｆ及びＰ、ＩＶｅｎｓ＋ｎｋ、Ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＭｌｅｃｕｌａｒＢｉ
ｏｌｏｇｙ、 １９８２；Ｇｌｏｖｅｒ編集、ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ＶｏＲＩ及びＩＩ、０ｘｆｏｒｄ Ｐ
ｒｅｓｓ 、オックスフォード、英国、１９８５ ；
Ｂ、 Ｈａｍｅｓ及びＳ、Ｈｉｇｇｉｎｓ、 Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄＨｙｂｒ、１ｄｉｚａｔｉｏｎ、
ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、英国；並びに
Ｓｅｔｌｏｗ及びＨｏ１ｌａｅｎｄｅｒ、 Ｇｅｎｅｔ
ｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ ！Ｊｅｔｈｏｄｓ、 Ｖｏｊｌ！、１−４゜ｐ
ｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークがあり、これら
を引用により本明細書に組み入れる。ＤＮＡの化学合或
はよく確立された方法、すなわちＣａｒｕｔｈｅｒｓ。
Ｍｏｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮ
Ａ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ。
Ａ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ。
Ｗｅｉｓｓｍａｎ編、Ｐｒａｅｇｅｒ Ｐｕｂｌ １ｓ
ｈｅｒｓ、 ニューヨーク、１９８３に記載の方法によ
り達成することができ、あるいは多くの市販の機械のい
ずれかを用いて自動化学合成を行うことができる。ここ
で使用される略号及び名称はこの分野における標準であ
ると認められ、そしてここに引用する専門誌のごとき専
門誌において一般に使用されている。
ｈｅｒｓ、 ニューヨーク、１９８３に記載の方法によ
り達成することができ、あるいは多くの市販の機械のい
ずれかを用いて自動化学合成を行うことができる。ここ
で使用される略号及び名称はこの分野における標準であ
ると認められ、そしてここに引用する専門誌のごとき専
門誌において一般に使用されている。
ＤＮＡの調製、制限エンドヌクレアーゼ消化、ＤＮＡ消
化物の電気泳動、ニトロセルロースフィルターへの移行
、及びプローブハイブリダイゼーションは特にことわら
ない限り標準的手法に従って行った。
化物の電気泳動、ニトロセルロースフィルターへの移行
、及びプローブハイブリダイゼーションは特にことわら
ない限り標準的手法に従って行った。
実施例１． Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座のゲノムクローニ
ング合成オリゴヌクレオチドＨ３０は、ＶＨ２ＣＤＮＡ
クロー ン３０１１１ （Ｈ，Ｗ、 ５ｃｈｒｏｅｄｅ
ｒら、５ｃｉｅｎｃｅ ２３８ニア９１゜１９８７）
のコドン８２ｂの第三ヌクレオチドからコドン８８
の第二ヌクレオチドまで伸びる配列に相当する。３０ｐ
ｌ ｃＤＮＡクローンはＶＨ３遺伝子ファミリーの一員
を代表する。番号付けはＥ、Ａ、 Ｋａｂａｔ ら（Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ） 、第二
列、Ｄｅｐｔ、ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａ
ｎＳｅｒｖｉｃｅｓ、Ｇｏｖｅｒｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔ
ｉｎｇ ０ｆｆｉｃｅ、ウシントンＤ、 Ｃ，１９８７
） に従う。このオリゴヌクレオチドの配列は５ ’
−ＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧ −
３’である。ハイブリダイゼーション実験において使用
するため、推奨される緩衝液中でポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いてオリゴヌクレオチドを末端ラベルする。
ング合成オリゴヌクレオチドＨ３０は、ＶＨ２ＣＤＮＡ
クロー ン３０１１１ （Ｈ，Ｗ、 ５ｃｈｒｏｅｄｅ
ｒら、５ｃｉｅｎｃｅ ２３８ニア９１゜１９８７）
のコドン８２ｂの第三ヌクレオチドからコドン８８
の第二ヌクレオチドまで伸びる配列に相当する。３０ｐ
ｌ ｃＤＮＡクローンはＶＨ３遺伝子ファミリーの一員
を代表する。番号付けはＥ、Ａ、 Ｋａｂａｔ ら（Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ） 、第二
列、Ｄｅｐｔ、ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａ
ｎＳｅｒｖｉｃｅｓ、Ｇｏｖｅｒｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔ
ｉｎｇ ０ｆｆｉｃｅ、ウシントンＤ、 Ｃ，１９８７
） に従う。このオリゴヌクレオチドの配列は５ ’
−ＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧ −
３’である。ハイブリダイゼーション実験において使用
するため、推奨される緩衝液中でポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いてオリゴヌクレオチドを末端ラベルする。
この実施例において、Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座を担持する
ヒトゲノムＤＮＡ断片の起源はセルラインＣＲ■からの
ＤＮＡである。このＤＮＡをＥｃｏＲＩにより完全消化
し、そして１０〜４０％シュークロース勾配上でサイズ
分画した。遠心分離に続き、チューブの底からＩｎｎの
画分を集め、そして個々のアリコートをアガロースゲル
電気泳動及びＨ３０オリゴヌクレオチドプローブへのハ
イブリダイゼーションにより分析した。
ヒトゲノムＤＮＡ断片の起源はセルラインＣＲ■からの
ＤＮＡである。このＤＮＡをＥｃｏＲＩにより完全消化
し、そして１０〜４０％シュークロース勾配上でサイズ
分画した。遠心分離に続き、チューブの底からＩｎｎの
画分を集め、そして個々のアリコートをアガロースゲル
電気泳動及びＨ３０オリゴヌクレオチドプローブへのハ
イブリダイゼーションにより分析した。
乾燥したアガロースゲル中のゲノムＤＮＡへのラベルさ
れたオリゴヌクレオチドプローブのハイ１９８６） に
より記載されているよう（３で行った。
れたオリゴヌクレオチドプローブのハイ１９８６） に
より記載されているよう（３で行った。
最終ストリンジエンシーはＷ、 Ｉ、 Ｗｏｏｄら（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔ ＩＡｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ ８
２：１５８５，１９８５） により記載されているよう
にしてテトラメチルアンモニウムクロリド（Ｔｉ、１Ａ
ｃｆ、アルドリッチ）を含有する溶液中で洗浄すること
により得た。要約すれば、消化されたＤＮＡ （１０〜
１５Ｎ／レーン）を１％アガロースゲル中での電気泳動
によりサイズ分画した。ゲル中のＤＮＡ分子を０．５Ｍ
ＮａＯＨ、１，５Ｍ ＮａＣｆ中で１〜１．５時間変
性した。次に、ゲルをＴｒｉｓＨＣｆｆ （ｐＨ７，０
） 、ＢＭ ＮａＣＡ中で１〜１．５時間中和し、次に
蒸留水中で１０分間洗浄した。ゲルを７０℃にて１．５
時間真空乾燥した。２分間水に浸漬することにより濾紙
裏地を除去した。濾紙を、２５０ｎ／−のｔＲＮＡを含
有する６ ＸＮＢＴ ＣＩ ＸＮＥＴ ＝０、１ Ｍ
ＮａＣＣ０，０３Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｌ （ｐＨ８，０
） 、１ｍ！、Ｉ ＥＤＴＡ ）中で５７℃にて１．５
〜３時間プレハイブリダイズせしめた。ゲルを５７℃に
て３〜４時間、６ＸＮＥＴ、５ｘデンハート、０．１％
ＳＯ３，０，０５％ＮＰＯ４，１０％硫酸デキストラン
及び２５に／−ｔＲＮＡを含有する溶液中＞ ３ ｘｌ
ｏ６ｃｐｍ／−の濃度の約１Ｘ１０”ｃｐｍ、／ｒの比
活性に末端ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブと
ハイブリダイズさせた。
ｒｏｃ、Ｎａｔ ＩＡｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ ８
２：１５８５，１９８５） により記載されているよう
にしてテトラメチルアンモニウムクロリド（Ｔｉ、１Ａ
ｃｆ、アルドリッチ）を含有する溶液中で洗浄すること
により得た。要約すれば、消化されたＤＮＡ （１０〜
１５Ｎ／レーン）を１％アガロースゲル中での電気泳動
によりサイズ分画した。ゲル中のＤＮＡ分子を０．５Ｍ
ＮａＯＨ、１，５Ｍ ＮａＣｆ中で１〜１．５時間変
性した。次に、ゲルをＴｒｉｓＨＣｆｆ （ｐＨ７，０
） 、ＢＭ ＮａＣＡ中で１〜１．５時間中和し、次に
蒸留水中で１０分間洗浄した。ゲルを７０℃にて１．５
時間真空乾燥した。２分間水に浸漬することにより濾紙
裏地を除去した。濾紙を、２５０ｎ／−のｔＲＮＡを含
有する６ ＸＮＢＴ ＣＩ ＸＮＥＴ ＝０、１ Ｍ
ＮａＣＣ０，０３Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｌ （ｐＨ８，０
） 、１ｍ！、Ｉ ＥＤＴＡ ）中で５７℃にて１．５
〜３時間プレハイブリダイズせしめた。ゲルを５７℃に
て３〜４時間、６ＸＮＥＴ、５ｘデンハート、０．１％
ＳＯ３，０，０５％ＮＰＯ４，１０％硫酸デキストラン
及び２５に／−ｔＲＮＡを含有する溶液中＞ ３ ｘｌ
ｏ６ｃｐｍ／−の濃度の約１Ｘ１０”ｃｐｍ、／ｒの比
活性に末端ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブと
ハイブリダイズさせた。
ハイブリダイゼーションの後、ゲルを４３℃にて３回、
５ Ｘ５ＳＣＸＯ，５％ＳＯ３中で洗浄し、次に３，２
Ｍ Ｔ！ＪＡＣｊ７．０．５％ＳＯ３中で６１℃にて
２回、１回当り３０分間以上にわたり洗浄した。
５ Ｘ５ＳＣＸＯ，５％ＳＯ３中で洗浄し、次に３，２
Ｍ Ｔ！ＪＡＣｊ７．０．５％ＳＯ３中で６１℃にて
２回、１回当り３０分間以上にわたり洗浄した。
プローブにハイブリダイズしたＤＮＡを含有する画分を
プールし、モしてλファージＢ！、ｌ Ｂ Ｌ ４アー
ム（Ｓｔｒａｔｏｇｅｎｅ 、サンジエゴ、ＣＡ） に
連結した。
プールし、モしてλファージＢ！、ｌ Ｂ Ｌ ４アー
ム（Ｓｔｒａｔｏｇｅｎｅ 、サンジエゴ、ＣＡ） に
連結した。
約９５．０００個のプラークをＨ３０オリゴヌクレオチ
ドプローブによりスクリーニングし、そして２０個の陽
性クローンを低ストリンジエンシーでのＨ２Ｏのプロー
ブへのハイブリダイゼーションに基きてピックアップし
た。これらのクローンの内４個をプラーク精製し、そし
てこれらの内２クローンが高ストリンジエンシーにおい
てＨ３０オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズ
することが見出され、完全な相同性が示された。これら
の内の１個を更なる実験のために選択した。選択された
λクローンを３ａｕ３Ａにより完全消化し、そして４．
５ｋｂｐバンドをアガロースゲルから単離しそしてプラ
スミド・ブルースクリプト（ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）
（Ｓｔｒａ−ｔａｇｅｎｅ、サンジエゴ、ＣＡ）のＢａ
ｍＨＩ部位にサブクローニングした。得られたプラスミ
ドをｐＨ３０と称する。
ドプローブによりスクリーニングし、そして２０個の陽
性クローンを低ストリンジエンシーでのＨ２Ｏのプロー
ブへのハイブリダイゼーションに基きてピックアップし
た。これらのクローンの内４個をプラーク精製し、そし
てこれらの内２クローンが高ストリンジエンシーにおい
てＨ３０オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズ
することが見出され、完全な相同性が示された。これら
の内の１個を更なる実験のために選択した。選択された
λクローンを３ａｕ３Ａにより完全消化し、そして４．
５ｋｂｐバンドをアガロースゲルから単離しそしてプラ
スミド・ブルースクリプト（ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）
（Ｓｔｒａ−ｔａｇｅｎｅ、サンジエゴ、ＣＡ）のＢａ
ｍＨＩ部位にサブクローニングした。得られたプラスミ
ドをｐＨ３０と称する。
ゲノムプロットへのハイブリダイゼーションによりＤ４
Ｓ１３９遺伝子座での多形性を決定するため、制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによりｐＨ３０から０３
Ｓ１３９−関連断片を切り出し、そして精製された断片
をＦｅｉｎｂｅｒｇら（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
１３２ ：６，１９８３）により記載されたランダム
ブライマー法により３２ｐ−α−ｄＣＴＰでラベルした
。制限エンドヌクレアーセ“消化されたゲノムＤＮＡの
このプローブによるスクリーニングが、第４図に示すよ
うに、約５ ｋｂｐから約２３ｋｂｐにわたり平均が約
９ ｋｂｐである対立遺伝子２０個以上を示した。
Ｓ１３９遺伝子座での多形性を決定するため、制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによりｐＨ３０から０３
Ｓ１３９−関連断片を切り出し、そして精製された断片
をＦｅｉｎｂｅｒｇら（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
１３２ ：６，１９８３）により記載されたランダム
ブライマー法により３２ｐ−α−ｄＣＴＰでラベルした
。制限エンドヌクレアーセ“消化されたゲノムＤＮＡの
このプローブによるスクリーニングが、第４図に示すよ
うに、約５ ｋｂｐから約２３ｋｂｐにわたり平均が約
９ ｋｂｐである対立遺伝子２０個以上を示した。
実施例２． ０４Ｓ１３９の染色体地図それぞれがヒト
染色体相補体のサブセットを含む１４のマウス／ヒト雑
種体細胞系（エール大学り、 Ｐｒｏｖｔｅｃｈｅｖａ
博士から入手）のパネルをＨ３０オリゴヌクレオチドプ
ローブとハイブリダイズさせた。このプローブへのハイ
ブリダイゼーションパターンがＤ４５１３９遺伝子座を
ヒト染色体４に明らかに帰属せしめた。
染色体相補体のサブセットを含む１４のマウス／ヒト雑
種体細胞系（エール大学り、 Ｐｒｏｖｔｅｃｈｅｖａ
博士から入手）のパネルをＨ３０オリゴヌクレオチドプ
ローブとハイブリダイズさせた。このプローブへのハイ
ブリダイゼーションパターンがＤ４５１３９遺伝子座を
ヒト染色体４に明らかに帰属せしめた。
報告されている技法（Ｌａｔｈｒｏｐら、Ａｍ、 Ｊ、
ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ ３７：４ｇ２−４９
８．１９８５）を用いての既知の染色体４マーカーとの
連鎖分析が、Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座を、３．０より大き
なＬＯＤスコアーを伴って、最もテロメラ性の既知マー
カー（Ｌ２３１）から１５〜２０センチモルガンにある
１４ｑのテロメラ（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）の近傍に位置付
けた。
ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ ３７：４ｇ２−４９
８．１９８５）を用いての既知の染色体４マーカーとの
連鎖分析が、Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座を、３．０より大き
なＬＯＤスコアーを伴って、最もテロメラ性の既知マー
カー（Ｌ２３１）から１５〜２０センチモルガンにある
１４ｑのテロメラ（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）の近傍に位置付
けた。
実施′例３． ４．０ｋｂｐの０４Ｓ１３９断片の配列
決定ｐＨ３０の約４，０ｋｂｐの挿入部をｐＵＣベクタ
ー（Ｊ、 Ｖｉｅｒａ及びＪ、 Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｇ
ｅｎｅ １９：２５９．１９ｇ２） にサブクローニ
ングした。約１．５ ｋｂｐのヒトＤＮＡ挿入部を含有
するｐＨ３０の自然欠失プラスミドを該プラスミド中で
直接配列決定した。この挿入部の両末端からの配列デー
ターを、配列を得るための合成プライマー及びユニバー
サルｐＵＣプライマー１６１、１９８０） のチエイ
ンターミネーション法において、これらのブライマーを
用いた。
決定ｐＨ３０の約４，０ｋｂｐの挿入部をｐＵＣベクタ
ー（Ｊ、 Ｖｉｅｒａ及びＪ、 Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｇ
ｅｎｅ １９：２５９．１９ｇ２） にサブクローニ
ングした。約１．５ ｋｂｐのヒトＤＮＡ挿入部を含有
するｐＨ３０の自然欠失プラスミドを該プラスミド中で
直接配列決定した。この挿入部の両末端からの配列デー
ターを、配列を得るための合成プライマー及びユニバー
サルｐＵＣプライマー１６１、１９８０） のチエイ
ンターミネーション法において、これらのブライマーを
用いた。
得られた配列を編集しそして反復ＤＮＡ配列ユニットの
組成及びサイズを決定するために試験した。次に、この
データーを用いて、ハイブリダイゼーションプローブと
して使用するための合皮オリゴヌクレオチドを設計する
ために用いることができる３２ｂｐ反復の共通配列（ｃ
ｏｎｓｅｎｓｕｓ ５ｅｑｕｅｎｃｅ）を決定した。代
表的な３２ｂｐ配列を下に示す。
組成及びサイズを決定するために試験した。次に、この
データーを用いて、ハイブリダイゼーションプローブと
して使用するための合皮オリゴヌクレオチドを設計する
ために用いることができる３２ｂｐ反復の共通配列（ｃ
ｏｎｓｅｎｓｕｓ ５ｅｑｕｅｎｃｅ）を決定した。代
表的な３２ｂｐ配列を下に示す。
Ｉ ＡＡＡＡＴＡＧＧＡＧＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧ
ＧＡＣＡＣＡＧＣＡＴＧＧ２ ＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡ
ＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＧこの様
なプローブの一例は、１種類の可能な共通配列の２個の
コピーと、ＤＮＡポリメラーゼプライマー結合部位とし
て機能する追加の２０ｂｐとから成る８４ｂｐ合戊オリ
ゴヌクレオチドである（第７図）。プライマーがこの２
０ｂｐ配列にアニールするとき、ラベル系の部分を構成
する種々の修飾されたヌクレオチドトリホスフェートを
ＤＮＡプローブに導入することができる。これらの台底
ＤＮＡプローブをラベルするための他の方法はこれらを
直接に、ＤＮＡ検出系の部分を構成する酵素、例えばア
ルカリホスファターゼに接合せしめることである。
ＧＡＣＡＣＡＧＣＡＴＧＧ２ ＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡ
ＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＧこの様
なプローブの一例は、１種類の可能な共通配列の２個の
コピーと、ＤＮＡポリメラーゼプライマー結合部位とし
て機能する追加の２０ｂｐとから成る８４ｂｐ合戊オリ
ゴヌクレオチドである（第７図）。プライマーがこの２
０ｂｐ配列にアニールするとき、ラベル系の部分を構成
する種々の修飾されたヌクレオチドトリホスフェートを
ＤＮＡプローブに導入することができる。これらの台底
ＤＮＡプローブをラベルするための他の方法はこれらを
直接に、ＤＮＡ検出系の部分を構成する酵素、例えばア
ルカリホスファターゼに接合せしめることである。
実施例４．追加のＤ４Ｓ１３９−特異的プローブの生成
当業者は、以後にＡ又はＢとして略記する方法に従って
、Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座のための特異的ハイブリダイゼ
ーションプローブとして使用することができる追加のゲ
ノムＤＮＡ断片及び他の合成オリゴヌクレオチドプロー
ブを単離することができる。
当業者は、以後にＡ又はＢとして略記する方法に従って
、Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座のための特異的ハイブリダイゼ
ーションプローブとして使用することができる追加のゲ
ノムＤＮＡ断片及び他の合成オリゴヌクレオチドプロー
ブを単離することができる。
Ａ、４，０ｋｂｐの０４Ｓ１３９断片の配列を用いて、
Ｄ３Ｓ１３９遺伝子座に対して特異的なプローブとして
使用するための好ましくは約■４〜２５ヌクレオチドの
長さの他のオリゴヌクレオチド配列をいかにして選択す
るかは当業者にとって明らかである。要約すれば、ある
配列を選択し、人手可能なデーターベース中の既知配列
と比較し、そして他には存在しないと見られる配列を好
ましくはス） ＩＪタンジェントハイブリダイゼーショ
ン条件下で、Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座に対する単一遺伝子
座プローブとして機能する能力について試験する。
Ｄ３Ｓ１３９遺伝子座に対して特異的なプローブとして
使用するための好ましくは約■４〜２５ヌクレオチドの
長さの他のオリゴヌクレオチド配列をいかにして選択す
るかは当業者にとって明らかである。要約すれば、ある
配列を選択し、人手可能なデーターベース中の既知配列
と比較し、そして他には存在しないと見られる配列を好
ましくはス） ＩＪタンジェントハイブリダイゼーショ
ン条件下で、Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座に対する単一遺伝子
座プローブとして機能する能力について試験する。
Ｂ、前記のものと同じか又はそれとは異る起源からの他
のゲノムＤＮＡ断片をＤ４Ｓ１３９遺伝子座のための特
異的ハイブリダイゼーションプローブとして役立てるこ
ともできる。要約すれば、ヒトゲノムＤＮＡを調製し、
そして制限エンドヌクレアーゼにより消化する。アガロ
ースゲル電気泳動によるサイズ分離の後、サイズ分離さ
れたＤＮＡ断片を、好ましくはストリンジェントな条件
下で、ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブＨ３０
によりプローブする。このプローブに特異的にハイブリ
ダイズするバンドのサイズを記録する。追加のゲノムＤ
ＮＡを同じ制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして例
えば１０〜４０％シュークロース勾配中での超遠心分離
によりサイズ分画する。サイズ分画されたＤ Ｎ Ａの
アリコートを電気泳動しそしてＨ３０プローブにハイブ
リダイズせしめてＤ４Ｓ１３９断片が存在することを確
認する。本質的に前記したようにしてクローニング及び
スクリーニングするために陽性画分を調製する。確認さ
れた陽性クローンを精製し、そしてＤ４Ｓ１３９断片を
ハイブリダイゼーション実験において試験するためにラ
ベルする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下でＤ４Ｓ１３９遺伝子座にハイブリダイズするＤ
Ｎ Ａ断片を更なる実験のために残す。
のゲノムＤＮＡ断片をＤ４Ｓ１３９遺伝子座のための特
異的ハイブリダイゼーションプローブとして役立てるこ
ともできる。要約すれば、ヒトゲノムＤＮＡを調製し、
そして制限エンドヌクレアーゼにより消化する。アガロ
ースゲル電気泳動によるサイズ分離の後、サイズ分離さ
れたＤＮＡ断片を、好ましくはストリンジェントな条件
下で、ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブＨ３０
によりプローブする。このプローブに特異的にハイブリ
ダイズするバンドのサイズを記録する。追加のゲノムＤ
ＮＡを同じ制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして例
えば１０〜４０％シュークロース勾配中での超遠心分離
によりサイズ分画する。サイズ分画されたＤ Ｎ Ａの
アリコートを電気泳動しそしてＨ３０プローブにハイブ
リダイズせしめてＤ４Ｓ１３９断片が存在することを確
認する。本質的に前記したようにしてクローニング及び
スクリーニングするために陽性画分を調製する。確認さ
れた陽性クローンを精製し、そしてＤ４Ｓ１３９断片を
ハイブリダイゼーション実験において試験するためにラ
ベルする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下でＤ４Ｓ１３９遺伝子座にハイブリダイズするＤ
Ｎ Ａ断片を更なる実験のために残す。
実施例５．生物学的関係の試験
ある特定の個体がある子供の生物学的親であるか否かに
ついて疑問視される事例において、その個体が確かに一
方の親であるかを高度の信頼性をもって決定することが
できる。前記子供及び前記問題の個体から末梢血サンプ
ルを取る。可能であれば、既知の親からもＤＮＡを得て
これを分析するのが好ましい。１ｍｊｌ！の各血液サン
プルから高分子ｆｆｉ Ｄ Ｎ ＡをＢａ１ｒｄ ら
（Ａｍ、 Ｊ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９
：４８９−５０１．１９８６）により記載されているよ
うにして抽出する。次に、各単離されたＤＮＡサンプル
を制限エンドヌクレアーゼ、例えばＴａｑｌにより消化
し、そして標準的技法を用いてアガロースゲル電気泳動
によりサイズ分画する。Ｄ Ｎ Ａの変性の後、このＤ
ＮＡを固体支持体に移し、Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座に対し
て特異的なラベルされたプローブ、例えばオリゴヌクレ
オチドＨ３０又は４．０ｋｂｐのＤ４Ｓ１３９断片への
ハイブリダイゼーションを行う。
ついて疑問視される事例において、その個体が確かに一
方の親であるかを高度の信頼性をもって決定することが
できる。前記子供及び前記問題の個体から末梢血サンプ
ルを取る。可能であれば、既知の親からもＤＮＡを得て
これを分析するのが好ましい。１ｍｊｌ！の各血液サン
プルから高分子ｆｆｉ Ｄ Ｎ ＡをＢａ１ｒｄ ら
（Ａｍ、 Ｊ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９
：４８９−５０１．１９８６）により記載されているよ
うにして抽出する。次に、各単離されたＤＮＡサンプル
を制限エンドヌクレアーゼ、例えばＴａｑｌにより消化
し、そして標準的技法を用いてアガロースゲル電気泳動
によりサイズ分画する。Ｄ Ｎ Ａの変性の後、このＤ
ＮＡを固体支持体に移し、Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座に対し
て特異的なラベルされたプローブ、例えばオリゴヌクレ
オチドＨ３０又は４．０ｋｂｐのＤ４Ｓ１３９断片への
ハイブリダイゼーションを行う。
サイズ分画されたＤＮＡがナイロン又はニトロセルロー
スフィルターのごとき基材又は支持体に結合する場合、
４．０ｋｂｐの０４Ｓ１３９断片又は類似のサイズを有
するプローブを用いて最良の結果が得られる。前記のよ
うに、アガロースゲル中のＤＮＡ分子へのハイブリダイ
ゼーションをオリゴヌクレオチドプローブを用いて行う
のが好ましい。ハイブリダイズしたバンドが可視性され
るとき、既知の親のバンドと同時泳動する子供のＤＮＡ
中のバンドを観察し、そして子供と推定上の親との間に
一致が存在するか否かを決定する。推定上の親との間に
一致が存在すれば、該推定上の親は該子供の生物学的親
である可能性が強い。子供及び推定上の親のハイブリダ
イゼーションパターンの間に一致が存在しなければ、該
子供と該推定上の親とは経験的に無関係であるらしいと
結論することができる。親子関係の確率は、部分的には
、一般集団内の対立遺伝子の頻度の知識から決定される
。
スフィルターのごとき基材又は支持体に結合する場合、
４．０ｋｂｐの０４Ｓ１３９断片又は類似のサイズを有
するプローブを用いて最良の結果が得られる。前記のよ
うに、アガロースゲル中のＤＮＡ分子へのハイブリダイ
ゼーションをオリゴヌクレオチドプローブを用いて行う
のが好ましい。ハイブリダイズしたバンドが可視性され
るとき、既知の親のバンドと同時泳動する子供のＤＮＡ
中のバンドを観察し、そして子供と推定上の親との間に
一致が存在するか否かを決定する。推定上の親との間に
一致が存在すれば、該推定上の親は該子供の生物学的親
である可能性が強い。子供及び推定上の親のハイブリダ
イゼーションパターンの間に一致が存在しなければ、該
子供と該推定上の親とは経験的に無関係であるらしいと
結論することができる。親子関係の確率は、部分的には
、一般集団内の対立遺伝子の頻度の知識から決定される
。
これに関して、実験的結論の信頼性を高めるために、本
発明のＤ４Ｓ１３９プローブをＶＮＴＲ遺伝子座に対す
る他の単一遺伝子座プローブと組合わせて使用すること
が好ましい。
発明のＤ４Ｓ１３９プローブをＶＮＴＲ遺伝子座に対す
る他の単一遺伝子座プローブと組合わせて使用すること
が好ましい。
Ｄ４Ｓ１３９単一遺伝子座プローブを用いてのＤＮＡタ
イプ分は法の応用可能性が関係ある個体及び無関係の個
体のハイブリダイゼーション研究において証明された。
イプ分は法の応用可能性が関係ある個体及び無関係の個
体のハイブリダイゼーション研究において証明された。
要約すれば、４．２ｋｂｐのＤ４Ｓ１３９プローブをス
） ＩＪンジェント条件下で、１８の三世代家族及び６
の三世代家族に由来する二ョＩ−消化ＤＮＡにハイブリ
ダイズせしめた。代表的な三世代家族及び三世代家族の
ハイブリダイゼーションバンドパターンを第２図に示す
。
） ＩＪンジェント条件下で、１８の三世代家族及び６
の三世代家族に由来する二ョＩ−消化ＤＮＡにハイブリ
ダイズせしめた。代表的な三世代家族及び三世代家族の
ハイブリダイゼーションバンドパターンを第２図に示す
。
第３図は、３個の他の三世代家族におけるＤ４Ｓ１３９
対立遺伝子の分布を示す。第３図において、父、母及び
３人の子のパターンが３回反復されている。第３図のパ
ターン中に示される個体由来のＤＮＡサンプルを調製し
そしてＴａｑ Ｉにより消化した。アガロースゲル電気
泳動によるサイズ母面の後、ストリンジェント条件下で
の乾燥アガロースゲル中のハイブリダイゼーションを、
ハイブリダイゼーション用ラベル化プローブとしてＨ３
０オリゴヌクレオチドを用いて行った。あるいは、４．
０ｋｂｐの０４Ｓ１３９プローブを用いて、そしてサイ
ズ分画されたＤＮＡ断片を固体支持体に結合させて、ハ
イブリダイゼーションをストリンジェント条件下で行う
ことができる。他の制限エンドヌクレアーゼ消化物を用
い、そしてプローブとして４、ＱｋｂｐのＤ４Ｓ１３９
断片を用いて、類低の結果が得られた。バンドパターン
はＤ４Ｓ１３９遺伝子座のメンデル遺伝を反映する。あ
る個体のバンドパターン中の２個のバンドの各々の１個
は各組のバンドパターンからの２個のバンドの内の１つ
と同じである。
対立遺伝子の分布を示す。第３図において、父、母及び
３人の子のパターンが３回反復されている。第３図のパ
ターン中に示される個体由来のＤＮＡサンプルを調製し
そしてＴａｑ Ｉにより消化した。アガロースゲル電気
泳動によるサイズ母面の後、ストリンジェント条件下で
の乾燥アガロースゲル中のハイブリダイゼーションを、
ハイブリダイゼーション用ラベル化プローブとしてＨ３
０オリゴヌクレオチドを用いて行った。あるいは、４．
０ｋｂｐの０４Ｓ１３９プローブを用いて、そしてサイ
ズ分画されたＤＮＡ断片を固体支持体に結合させて、ハ
イブリダイゼーションをストリンジェント条件下で行う
ことができる。他の制限エンドヌクレアーゼ消化物を用
い、そしてプローブとして４、ＱｋｂｐのＤ４Ｓ１３９
断片を用いて、類低の結果が得られた。バンドパターン
はＤ４Ｓ１３９遺伝子座のメンデル遺伝を反映する。あ
る個体のバンドパターン中の２個のバンドの各々の１個
は各組のバンドパターンからの２個のバンドの内の１つ
と同じである。
これに対して、第４図は、１５人の無関係の個体からＤ
ＮＡサンプルが調製されそして分析された場合に得られ
たハイブリダイゼーションバンドパターンを示す。前記
のように、Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座の少なくとも２０の対
立遺伝子が観察され、そして２つの同一のバンドパター
ンは観察されなかった。
ＮＡサンプルが調製されそして分析された場合に得られ
たハイブリダイゼーションバンドパターンを示す。前記
のように、Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座の少なくとも２０の対
立遺伝子が観察され、そして２つの同一のバンドパター
ンは観察されなかった。
従って、２人の個体のＤＮＡ断片中に現われる同一バン
ドの観察は生物学的関連性が存在することを強く示唆す
る。
ドの観察は生物学的関連性が存在することを強く示唆す
る。
実施例６．法医学的イイプ分け
ＤＮＡは理論的には核を含有するあらゆる細胞から、及
び有核細胞を含有するあらゆる証拠検体から単離するこ
とができ、ＤＮＡタイプ分けのための候補である。生−
法医学証拠検体には、性的暴行の犠牲者から得られた膣
綿棒、乾燥精液、血痕、及び組織（好ましくは凍結した
もの）が含まれるがこれらに限定されない。他の生−法
医学証拠検体には血液、乾燥血液、精液、乾燥精液、膣
液、口腔綿棒、毛及び毛根が含まれる。対照サンプルは
新しく採取されたＢＤＴＡで凝固防止された血液を用い
ることができる。ＤＮＡタイプ分けは５ｄの血液、１バ
の精液、ｌＣｆｌ１の血痕、又は１〜５個の毛根といっ
た少量で行うことができる。これらのサンプルのほとん
どにおいてＤＮＡは非常に安定である。例えば、５年前
の精液痕及び乾燥血液から高分子量Ｄ Ｎ Ａが得られ
た。性交後１２時間以上たってから集めた膣綿棒からタ
イプ分は可能な精子ＤＮＡを得ることができる。サンプ
ルは死後、生前、出生前又は新生児からのものであるこ
とができる。
び有核細胞を含有するあらゆる証拠検体から単離するこ
とができ、ＤＮＡタイプ分けのための候補である。生−
法医学証拠検体には、性的暴行の犠牲者から得られた膣
綿棒、乾燥精液、血痕、及び組織（好ましくは凍結した
もの）が含まれるがこれらに限定されない。他の生−法
医学証拠検体には血液、乾燥血液、精液、乾燥精液、膣
液、口腔綿棒、毛及び毛根が含まれる。対照サンプルは
新しく採取されたＢＤＴＡで凝固防止された血液を用い
ることができる。ＤＮＡタイプ分けは５ｄの血液、１バ
の精液、ｌＣｆｌ１の血痕、又は１〜５個の毛根といっ
た少量で行うことができる。これらのサンプルのほとん
どにおいてＤＮＡは非常に安定である。例えば、５年前
の精液痕及び乾燥血液から高分子量Ｄ Ｎ Ａが得られ
た。性交後１２時間以上たってから集めた膣綿棒からタ
イプ分は可能な精子ＤＮＡを得ることができる。サンプ
ルは死後、生前、出生前又は新生児からのものであるこ
とができる。
検体の貯蔵はしばしば特に重要である。ＤＮＡはしばし
ば湿環境で分解するから検体サンプルは水分を含まない
ように維持されるべきであり、そして日光から保護され
るべきである。検体は乾燥剤の存在下で４℃にて貯蔵さ
れるべきであり、又は無精でない条件下で一２０℃にて
凍結されるべきである。
ば湿環境で分解するから検体サンプルは水分を含まない
ように維持されるべきであり、そして日光から保護され
るべきである。検体は乾燥剤の存在下で４℃にて貯蔵さ
れるべきであり、又は無精でない条件下で一２０℃にて
凍結されるべきである。
末梢血、膣綿棒及び膣液、乾燥血痕並び）こ精液痕から
のＤＮＡ０単離はＫａｎｔｅｒら（Ｊ、Ｆｏｒｅｎｓｉ
ｃＳｃｉｅｎｃｅｓ ３１：４０３−４０８．１９８
６）、Ｇｕｉｓｔｉら（Ｊ。
のＤＮＡ０単離はＫａｎｔｅｒら（Ｊ、Ｆｏｒｅｎｓｉ
ｃＳｃｉｅｎｃｅｓ ３１：４０３−４０８．１９８
６）、Ｇｕｉｓｔｉら（Ｊ。
３ａｉｒｄ ら（Ａｍｊ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ３９：４８９−５０１） により記載されて
いる。組織サンプルをすりつぶした後、それらからＤＮ
Ａを同様にして抽出することができる。
ｃｓ ３９：４８９−５０１） により記載されて
いる。組織サンプルをすりつぶした後、それらからＤＮ
Ａを同様にして抽出することができる。
単離されたＤＮＡサンプルを制限エンドヌクレアーゼに
より消化し、アガロースゲル電気泳動ニよりサイズ分画
し、そしてＤ４Ｓ１３９特異的プローブを用いてのハイ
ブリダイゼーションにより分析することができ、これら
は前記のようにして行うことができる。ＤＮＡがニトロ
セルロースフィルターのごとき基材に固定されている場
合、比較的大きなプローブ、例えば４，０ｋｂｐのＤ４
Ｓ１３９断片を用いるのが好ましい。前記のように、オ
リゴヌクレオチドプローブを用いる場合、乾燥アガロー
スゲル中でハイブリダイゼーションを行うのが好ましい
。
より消化し、アガロースゲル電気泳動ニよりサイズ分画
し、そしてＤ４Ｓ１３９特異的プローブを用いてのハイ
ブリダイゼーションにより分析することができ、これら
は前記のようにして行うことができる。ＤＮＡがニトロ
セルロースフィルターのごとき基材に固定されている場
合、比較的大きなプローブ、例えば４，０ｋｂｐのＤ４
Ｓ１３９断片を用いるのが好ましい。前記のように、オ
リゴヌクレオチドプローブを用いる場合、乾燥アガロー
スゲル中でハイブリダイゼーションを行うのが好ましい
。
既知の起源又は個体からのＤＮＡサンプルと平行しての
証拠検体からのＤＮＡサンプルの、Ｄ４Ｓ１３９持異的
プローブによるＤＮＡタイプ分けによる分析は、証拠検
体の起源の決定を可能にする。
証拠検体からのＤＮＡサンプルの、Ｄ４Ｓ１３９持異的
プローブによるＤＮＡタイプ分けによる分析は、証拠検
体の起源の決定を可能にする。
他の時に行われたＤＮＡタイプ分けと組合わせて、例え
ばコンピューターデーターベースを用いて、証拠検体の
ＤＮＡ５４１分けの結果を利用することができることも
理解される。
ばコンピューターデーターベースを用いて、証拠検体の
ＤＮＡ５４１分けの結果を利用することができることも
理解される。
法医学試験及び生物学的関連性試験の好ましい方法にお
いて、 ５〜１０ｄのＥＤＴＡで凝固防止処理された全血からＤ
ＮＡを調製することができ、この全血は室温にて２４時
間又は４℃にて１ケ月まで貯蔵することができる。予想
されるＤＮＡの収量は１００〜２００ｎである。
いて、 ５〜１０ｄのＥＤＴＡで凝固防止処理された全血からＤ
ＮＡを調製することができ、この全血は室温にて２４時
間又は４℃にて１ケ月まで貯蔵することができる。予想
されるＤＮＡの収量は１００〜２００ｎである。
血液の遠心分離の後、バフィーコートをプラスチック移
送ピペットにより５０−のチューブに取り出す。赤血球
溶解緩衝液（ｌＱｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
＝８．１ｍＭＥＤＴＡ−８）を４５−まで加え、そして
逆転により混合し、そして室温にて１０分間インキュベ
ートする。白血球を血清学的遠心機中でペレット化する
。上清を注去し、そしてペレットを赤血球溶解緩衝液に
再懸濁する。上清が透明になるまで、この段階を２回又
は３回繰り返す。
送ピペットにより５０−のチューブに取り出す。赤血球
溶解緩衝液（ｌＱｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
＝８．１ｍＭＥＤＴＡ−８）を４５−まで加え、そして
逆転により混合し、そして室温にて１０分間インキュベ
ートする。白血球を血清学的遠心機中でペレット化する
。上清を注去し、そしてペレットを赤血球溶解緩衝液に
再懸濁する。上清が透明になるまで、この段階を２回又
は３回繰り返す。
白血球へＬ／ −） ）を２ｍｌのＴＢ−Ｉ Ｃ１００
＋ｍ！、ｌ ＮａＣｌ 。
＋ｍ！、ｌ ＮａＣｌ 。
２５ｍ！、Ｉ ＥＤＴＡ（ｐＨ８） 、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ（ｐＨ８） ）中に渦動撹拌により再懸濁し、モし
て渦動撹拌しながら０、１ ｍｆ＋）ＴＢ−２（１０％
５Ｏ３） を加える。２０μのＴＢ−３（プロテイテ
ーゼＫ １０ｍｇ／ｍｆ）を渦動撹拌しながろ添加す
る。サンプルを５５℃にて４時ｒＪＪ〜３日間インキュ
ベートする。この時点で検体を一２０℃こて、好ましく
は無届でない条件下で貯蔵することができる。
ｉｓ（ｐＨ８） ）中に渦動撹拌により再懸濁し、モし
て渦動撹拌しながら０、１ ｍｆ＋）ＴＢ−２（１０％
５Ｏ３） を加える。２０μのＴＢ−３（プロテイテ
ーゼＫ １０ｍｇ／ｍｆ）を渦動撹拌しながろ添加す
る。サンプルを５５℃にて４時ｒＪＪ〜３日間インキュ
ベートする。この時点で検体を一２０℃こて、好ましく
は無届でない条件下で貯蔵することができる。
２回の有機抽出及び沈、殿によりＤＮＡを精製する。フ
ェノール／クロロホルム試薬（フェノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール＝２４ ：２４ ：ｉ）をチ
ューブにサンプル体積と同じ体積に加え、そしておだや
かに逆転することにより１分間混合する。血清学的遠心
機中で最大速度で１５分間遠心分離することにより相を
分離する。エツペンドルフピペット又はパスツールピペ
ットにより底部の黄色層を取り出しそして廃棄する。全
血又は組織からの大規模調製において高濃縮された場合
、Ｄ Ｎ Ａは界面に存在する場合があり、そしてこれ
がピペットに吸い込まれれば界面において混乱が生ずる
であろう。これが起った場合、サンプルを再度遠心分離
する。問題点が続けばさらに２−のＴＥをサンプルに加
え、そして抽出を反復する。
ェノール／クロロホルム試薬（フェノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール＝２４ ：２４ ：ｉ）をチ
ューブにサンプル体積と同じ体積に加え、そしておだや
かに逆転することにより１分間混合する。血清学的遠心
機中で最大速度で１５分間遠心分離することにより相を
分離する。エツペンドルフピペット又はパスツールピペ
ットにより底部の黄色層を取り出しそして廃棄する。全
血又は組織からの大規模調製において高濃縮された場合
、Ｄ Ｎ Ａは界面に存在する場合があり、そしてこれ
がピペットに吸い込まれれば界面において混乱が生ずる
であろう。これが起った場合、サンプルを再度遠心分離
する。問題点が続けばさらに２−のＴＥをサンプルに加
え、そして抽出を反復する。
同じ体積のクロロホルム試薬を加え、そしてこのサンプ
ルを混合しそして遠心分離する。有機層を除去しそして
廃棄する。１０分のｌの体積の３．３ＭＮａ０Ａｃ塩を
、逆転により十分に撹拌しながら加えた。２〜３容量の
一２０℃の９５％のアルコールを逆転により十分に撹拌
しながら添加する。サンプルを一２０℃にて３０分間置
く。サンプルを４〜５０００ ＸＧにて２０分間、又は
しまった可視ベレットが出現するまで遠心する。あるい
は、ＤＮＡをパスツールピペットの曲った先端で取り出
し、そして小遠心チューブに入れ、■−のエタノールを
添加し、そして小遠心機中でＤ Ｎ Ａをペレット化す
ることができる。上清を注意深く除去する。４５度の角
度に保持しながらペレットとは反対側のチューブの側面
に約５００ｔｄのエタノールを流すことによりペレット
を２回室温にて９５％エタノールにより洗浄する。チュ
ーブを２回回転させ、モして上清を除去する。チューブ
を逆転させながら約２時間にわたりペレットを乾燥する
。各ＤＮＡペレットを５００−の無菌ＴＥに再懸濁する
。再懸濁は４０℃にて一夜又は６５℃にて１時間行うこ
とができる。長時間貯蔵を一２０℃にて、又は凍結乾燥
して室温にて行うことができ、あるいはサンプルを４℃
にて１ケ月まで貯蔵することができる。
ルを混合しそして遠心分離する。有機層を除去しそして
廃棄する。１０分のｌの体積の３．３ＭＮａ０Ａｃ塩を
、逆転により十分に撹拌しながら加えた。２〜３容量の
一２０℃の９５％のアルコールを逆転により十分に撹拌
しながら添加する。サンプルを一２０℃にて３０分間置
く。サンプルを４〜５０００ ＸＧにて２０分間、又は
しまった可視ベレットが出現するまで遠心する。あるい
は、ＤＮＡをパスツールピペットの曲った先端で取り出
し、そして小遠心チューブに入れ、■−のエタノールを
添加し、そして小遠心機中でＤ Ｎ Ａをペレット化す
ることができる。上清を注意深く除去する。４５度の角
度に保持しながらペレットとは反対側のチューブの側面
に約５００ｔｄのエタノールを流すことによりペレット
を２回室温にて９５％エタノールにより洗浄する。チュ
ーブを２回回転させ、モして上清を除去する。チューブ
を逆転させながら約２時間にわたりペレットを乾燥する
。各ＤＮＡペレットを５００−の無菌ＴＥに再懸濁する
。再懸濁は４０℃にて一夜又は６５℃にて１時間行うこ
とができる。長時間貯蔵を一２０℃にて、又は凍結乾燥
して室温にて行うことができ、あるいはサンプルを４℃
にて１ケ月まで貯蔵することができる。
血痕及び精液痕の布又は綿棒からの溶出方法を次に記載
する。
する。
綿棒チップ又は約１ ｃｒｌの血痕もしくは精液痕を０
．５−の溶出チャンバーに入れる。３００１のＴＢ−１
（Ｌｏｏｍ！ｒｌ ＮａＣ（１、２５ｍ！、（εＤＴＡ
（ｐＨ８） 、１０ｍ！Ｊ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）］を添
加し、そして１０分間ずつ渦動撹拌しながら室温にて３
０分間インキュベートする。酸性ホスファーターゼ、Ｐ
−３０又は他の測定のために必要によりアリコートを採
取することができる。
．５−の溶出チャンバーに入れる。３００１のＴＢ−１
（Ｌｏｏｍ！ｒｌ ＮａＣ（１、２５ｍ！、（εＤＴＡ
（ｐＨ８） 、１０ｍ！Ｊ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）］を添
加し、そして１０分間ずつ渦動撹拌しながら室温にて３
０分間インキュベートする。酸性ホスファーターゼ、Ｐ
−３０又は他の測定のために必要によりアリコートを採
取することができる。
３０ｐ１のＴＢ−２（１０％５Ｏ３）を加え、そしてサ
ンプルを室温にて３０分間、１０分間ずつ渦動撹拌しな
がら再インキュベートする。溶出チャンバーを遠心チュ
ーブに入れ、そして血清学的遠心機中で遠心する。５１
１１のＴＢ−３（ＰＫ） 及びＤＴＴを３９ ｍ Ｍ
に加え、そして５５℃にて１時間〜−夜インキユベート
する。
ンプルを室温にて３０分間、１０分間ずつ渦動撹拌しな
がら再インキュベートする。溶出チャンバーを遠心チュ
ーブに入れ、そして血清学的遠心機中で遠心する。５１
１１のＴＢ−３（ＰＫ） 及びＤＴＴを３９ ｍ Ｍ
に加え、そして５５℃にて１時間〜−夜インキユベート
する。
この時間で検体を一２０℃に貯蔵することができる。
抽出法を反復する。ＤＮＡサンプル又は消化物を、ＴＡ
ＥＩ衡液及び臭化エチジウムを含有する１％アガロース
ゲル上での電気泳動によりサイズ分画する。約５０ｍ１
容のゲルを５０〜８０ＶＤＣにて２〜４時間電気泳動す
る。サイズ標準（λＨｉｎｄＩＩＩ分子量マーカー ２
５０ナノグラム）を２木の外側のレーンに置く。蛍光法
により決定された既知濃度のヒ）ＤＮＡ標準（１ｄ ＝
５０ｎｇ）を選択されたゲルレーンに置く。示唆された
付加は５０・１００及び５００ｎｇである。これらのレ
ーンと各未知レーンとの比較が未知サンプル中のＤＮＡ
濃度の良好な推定を与える。強度はＵＶ）ランスイルミ
ネーターを用いて観察される。付加の前に、５ＩＬｌの
溶出ＤＮＡ又は１〜５Ｉ！１の血液ＤＮＡを付加色素と
混合する。
ＥＩ衡液及び臭化エチジウムを含有する１％アガロース
ゲル上での電気泳動によりサイズ分画する。約５０ｍ１
容のゲルを５０〜８０ＶＤＣにて２〜４時間電気泳動す
る。サイズ標準（λＨｉｎｄＩＩＩ分子量マーカー ２
５０ナノグラム）を２木の外側のレーンに置く。蛍光法
により決定された既知濃度のヒ）ＤＮＡ標準（１ｄ ＝
５０ｎｇ）を選択されたゲルレーンに置く。示唆された
付加は５０・１００及び５００ｎｇである。これらのレ
ーンと各未知レーンとの比較が未知サンプル中のＤＮＡ
濃度の良好な推定を与える。強度はＵＶ）ランスイルミ
ネーターを用いて観察される。付加の前に、５ＩＬｌの
溶出ＤＮＡ又は１〜５Ｉ！１の血液ＤＮＡを付加色素と
混合する。
既知濃度のＤＮＡを次の方法を用いてＨａｅｌｌｌｒに
より消化する。１１００ｎ／ｕの最終Ｄ Ｎ Ａ濃度が
悪態的であり、但しより高濃度を用いることもできる。
より消化する。１１００ｎ／ｕの最終Ｄ Ｎ Ａ濃度が
悪態的であり、但しより高濃度を用いることもできる。
制限酵素は、適切な緩衝液−スベルミジン−ＤＮＡ混合
物中で消化されるべきＤＮＡｎ当り２．５Ｕで添加する
。消化混合物を十分に混合しそして所望によりすべての
溶液をチューブの底に運ぶために遠心し、そして３７℃
にて２時間インキュベートする。追加の制限酵素をＤＮ
Ａｎ当り２．５Ｕで加え、そして消化混合物を３７℃に
て２時間再インキュベートする。この時間で２．５ ｔ
ｌ （２５０ｎｇ）のサンプルを１％アガロースゲル上
で電気泳動して制限消化の完了を評価することができる
。適当な分子量マーカーはＨｉｎｄ■で消化されたｌａ
ｍｂｄｅ、及び）（ａｅ■で消化されたｐｈｉ ｘ１７
４である。さらに、各サンプルをプロッティングにより
分析して男性ＤＮＡ及び微生物汚染を決定することがで
きる。
物中で消化されるべきＤＮＡｎ当り２．５Ｕで添加する
。消化混合物を十分に混合しそして所望によりすべての
溶液をチューブの底に運ぶために遠心し、そして３７℃
にて２時間インキュベートする。追加の制限酵素をＤＮ
Ａｎ当り２．５Ｕで加え、そして消化混合物を３７℃に
て２時間再インキュベートする。この時間で２．５ ｔ
ｌ （２５０ｎｇ）のサンプルを１％アガロースゲル上
で電気泳動して制限消化の完了を評価することができる
。適当な分子量マーカーはＨｉｎｄ■で消化されたｌａ
ｍｂｄｅ、及び）（ａｅ■で消化されたｐｈｉ ｘ１７
４である。さらに、各サンプルをプロッティングにより
分析して男性ＤＮＡ及び微生物汚染を決定することがで
きる。
２５レーンゲルの適当なゲル付加パターンは、レーン１
〜３が分子量マーカーＤＮＡ；レーン４〜６がＨａｅｌ
ｌＪ−消化対照ＤＮＡ （５ｘ／レー：／）；レーン７
〜１０が分析されるべきＤＮＡサンプル（３〜６ｆｆ／
レーン）；レーン１１〜１３が分子量マーカーＤ Ｎ
Ａ ；レーン１４〜２３が分析されるべきＤＮＡサンプ
ル＜３〜６ｇ／レーン）：レーン２４〜２５が分子量マ
ーカーＤＮＡ、である。
〜３が分子量マーカーＤＮＡ；レーン４〜６がＨａｅｌ
ｌＪ−消化対照ＤＮＡ （５ｘ／レー：／）；レーン７
〜１０が分析されるべきＤＮＡサンプル（３〜６ｆｆ／
レーン）；レーン１１〜１３が分子量マーカーＤ Ｎ
Ａ ；レーン１４〜２３が分析されるべきＤＮＡサンプ
ル＜３〜６ｇ／レーン）：レーン２４〜２５が分子量マ
ーカーＤＮＡ、である。
約３５０一体積のゲルをＴＡＢ緩衝液中で２０Ｖにて３
０分間そして次に４０Ｖにて、色素フロントの１／２が
ゲルから外れるまで、約２０時間電気泳動する。照射源
としてＵＶ）ランスイルミネーターを用いてゲルを写真
に撮る。
０分間そして次に４０Ｖにて、色素フロントの１／２が
ゲルから外れるまで、約２０時間電気泳動する。照射源
としてＵＶ）ランスイルミネーターを用いてゲルを写真
に撮る。
ＤＮＡ断片をハイブリダイゼーション用基材又は膜に固
定するため下記の方法に従う。
定するため下記の方法に従う。
ガラス板を支持するためにパイレックス加熱皿中に２個
のピペットラックを置くことによりプロッティングプラ
ットホームを構成する。ガラス板上に３ ＋、！！、Ｉ
の芯を置き、そしてトランスファー溶液（０，４Ｍ Ｎ
ａ０Ｈ）により十分に湿めらせる。空気ポケットを除去
し、そしてトランスファー溶液により十分に湿らせた３
！、１！、１のシート１０枚の重層を加え、そして３
！、１！、ｌのシートをねじることなくピペットでこ
ろがすことにより空気ポケットを除去する。トランスフ
ァー溶液を加熱皿に約１／２”の深さに加える。各トラ
ンスファーの後、３ ！、１’、（の上層のシートを除
去しそして皿をプラスチックラップで覆って貯蔵する。
のピペットラックを置くことによりプロッティングプラ
ットホームを構成する。ガラス板上に３ ＋、！！、Ｉ
の芯を置き、そしてトランスファー溶液（０，４Ｍ Ｎ
ａ０Ｈ）により十分に湿めらせる。空気ポケットを除去
し、そしてトランスファー溶液により十分に湿らせた３
！、１！、１のシート１０枚の重層を加え、そして３
！、１！、ｌのシートをねじることなくピペットでこ
ろがすことにより空気ポケットを除去する。トランスフ
ァー溶液を加熱皿に約１／２”の深さに加える。各トラ
ンスファーの後、３ ！、１’、（の上層のシートを除
去しそして皿をプラスチックラップで覆って貯蔵する。
ゲルをサザン・トランスファー緩衝液（０，４ＭＮａ０
Ｈ） に１５分間〜１時間入れる。正しいサイズのプ
ロットをランドリーペン又は鉛筆で下方左側にそって標
識する。標識はオペレーターの名前、ノートの負数及び
日付を所望の他の情報と共に含む。
Ｈ） に１５分間〜１時間入れる。正しいサイズのプ
ロットをランドリーペン又は鉛筆で下方左側にそって標
識する。標識はオペレーターの名前、ノートの負数及び
日付を所望の他の情報と共に含む。
プロット膜を純水で湿めす。プロッティングプラットホ
ームをプロット溶液により十分に満たし、そしてゲルと
プラットホームとの間に空気を残すことなくゲルをプラ
ットホーム上に置（。ゲルをプロット溶液で十分に満た
し、そしてすぐにあらかじめ湿されたプロット膜を、そ
れを２つの縁において保持しそしてプロットの中間をゲ
ル上に置くことにより、ゲル上に置く。次に、プロット
をゆっくりとゲル上に下げて空気をはさみ込まないよう
にし、そしてゲル上の膜の位置を変えないようにする。
ームをプロット溶液により十分に満たし、そしてゲルと
プラットホームとの間に空気を残すことなくゲルをプラ
ットホーム上に置（。ゲルをプロット溶液で十分に満た
し、そしてすぐにあらかじめ湿されたプロット膜を、そ
れを２つの縁において保持しそしてプロットの中間をゲ
ル上に置くことにより、ゲル上に置く。次に、プロット
をゆっくりとゲル上に下げて空気をはさみ込まないよう
にし、そしてゲル上の膜の位置を変えないようにする。
膜をプロット溶液で満たし、そしてピペットを表面上で
注意深く２〜３回ころがして取り込まれた空気を十分に
除去する。膜をプロット液で満たし、そしてプロット液
中であらかじめ湿された対応するサイズの３Ｍｌ、１紙
２枚を膜上に置き、満たしそして気泡を除去する。乾燥
した３ＭＭ紙２枚をあらかじめ湿された紙上に置き、次
にペーパータオルの２″の重ねを置く。ゲルの縁をパラ
フィルムにより十分にシールしてゲルを通して以外に緩
衝液の通路がないようにする。ガラス板をペーパータオ
ルの上に置き、そして約１ ｋｇの重りを２０Ｘ２０ｃ
ＩＩ］のゲルに加える。４時間〜−夜で移行が完了する
。
注意深く２〜３回ころがして取り込まれた空気を十分に
除去する。膜をプロット液で満たし、そしてプロット液
中であらかじめ湿された対応するサイズの３Ｍｌ、１紙
２枚を膜上に置き、満たしそして気泡を除去する。乾燥
した３ＭＭ紙２枚をあらかじめ湿された紙上に置き、次
にペーパータオルの２″の重ねを置く。ゲルの縁をパラ
フィルムにより十分にシールしてゲルを通して以外に緩
衝液の通路がないようにする。ガラス板をペーパータオ
ルの上に置き、そして約１ ｋｇの重りを２０Ｘ２０ｃ
ＩＩ］のゲルに加える。４時間〜−夜で移行が完了する
。
移行の後、ペーパータオル及び３Ｍ）４上層を除去する
。２ Ｘ５ＳＣを含む加熱皿に膜を入れ、短時間渦動さ
せ、そして洗浄液を除去する。追加の数負−の洗浄液を
加え、そして存在するかもしれないすべての粉末を除去
するためにすすいだ手袋をつけた手で、ゲルと接触した
膜の表面を十分にこすった。洗浄液を除去し、新たな洗
浄液で置換し、そして膜を室温にて１５分間撹拌しなが
ら洗浄する。
。２ Ｘ５ＳＣを含む加熱皿に膜を入れ、短時間渦動さ
せ、そして洗浄液を除去する。追加の数負−の洗浄液を
加え、そして存在するかもしれないすべての粉末を除去
するためにすすいだ手袋をつけた手で、ゲルと接触した
膜の表面を十分にこすった。洗浄液を除去し、新たな洗
浄液で置換し、そして膜を室温にて１５分間撹拌しなが
ら洗浄する。
空気乾燥の後、膜を８０℃にて２時間真空下で乾燥する
。膜をプラスチックラップ中室温にて乾燥貯蔵し、そし
てすぐにプレハイブリダイゼーション溶液に入れる。
。膜をプラスチックラップ中室温にて乾燥貯蔵し、そし
てすぐにプレハイブリダイゼーション溶液に入れる。
単離された４、０ｋｂｐのヒトＤＮＡ挿入部（２０ｐｐ
ｍ）を、α−３２Ｐ （ＩＣＴＰにより市販のランダム
プライムラベルキットを用いてラベルする。反応液をＧ
−５０カラムに通すことにより取り込まれなかったラベ
ルを除去する。得られるラベルされたＤＮＡプローブを
液体シンチレーションカウンターで計数する。５００万
カウントに相当するＤ Ｎ Ａを変性しそして５ｍｌの
ハイブリダイゼーション溶液（２０％ＰＥＧ 、 Ｉ
Ｘ５ＳＣ、７％５Ｏ３）に入れ、そしてプロットを６５
℃にて一夜ハイブリダイズせしめる。次に、プロットを
１５分間３回２ ｘＳＳＣ＋ ０．１％ＳＤＳ中で洗浄
し、そして次にさらに１５分間０． Ｉ Ｘ５ＳＣ＋０
．１％上で洗浄する。次にプロットをコダソクＸＡＲ−
５フィルムに一７０℃にて一夜〜数日間露出しそして現
象する。次に、得られるオートラジオグラフをビデオデ
ンシトメーターにより分析してバンドのサイズを測定す
る。
ｍ）を、α−３２Ｐ （ＩＣＴＰにより市販のランダム
プライムラベルキットを用いてラベルする。反応液をＧ
−５０カラムに通すことにより取り込まれなかったラベ
ルを除去する。得られるラベルされたＤＮＡプローブを
液体シンチレーションカウンターで計数する。５００万
カウントに相当するＤ Ｎ Ａを変性しそして５ｍｌの
ハイブリダイゼーション溶液（２０％ＰＥＧ 、 Ｉ
Ｘ５ＳＣ、７％５Ｏ３）に入れ、そしてプロットを６５
℃にて一夜ハイブリダイズせしめる。次に、プロットを
１５分間３回２ ｘＳＳＣ＋ ０．１％ＳＤＳ中で洗浄
し、そして次にさらに１５分間０． Ｉ Ｘ５ＳＣ＋０
．１％上で洗浄する。次にプロットをコダソクＸＡＲ−
５フィルムに一７０℃にて一夜〜数日間露出しそして現
象する。次に、得られるオートラジオグラフをビデオデ
ンシトメーターにより分析してバンドのサイズを測定す
る。
第１図は、１つの三世代家族の家系（１４２１）を示し
、その構成員のＤＮＡ断片が第２図に示すＤ４Ｓ１３９
４． Ｏｋｂｌｌプローブへのハイブリダイゼーション
により分析された。男性は四角で示されており、そして
女性は円で示しである。 第２図は、第１図に示す家系の家族の構成員（１４２１
）から調製されたＴａｑ Ｉ−消化されたＤＮＡへの４
．０ｋｂｐ ０）Ｄ４Ｓ１３９プローブのハイブリダイ
ゼーションのパターンを示す。レーン番号１〜１４中の
ＤＮＡサンプルは第１図における家族の構成員に付与さ
れた番号に対応する。レーン１６〜２４は二世代家族（
２８）からのＤＮＡサンプルを含む。レーン１６及び１
７は両親からのＤＮＡを含み、そしてレーン１８〜２４
は７子孫のそれぞれからのＤＮＡを含む。 第３図は、３つの二世代家族から調製されたエヨＩ−消
化ＤＮＡ断片への８３０プローブのハイブリダイゼーシ
ョンのパターンを示す。レーン１及び２はそれぞれ父及
び母からのＤＮＡを含み、そしてレーン３．４及び５は
３子孫のそれぞれからのＤＮＡを含む。レーン６〜ｌＯ
及び１１−１５は他の２家族の分析を示す。各家族のた
めに同一のローディングパターン（ｌｏａｄｉｎｇパタ
ーンが用いられる。 第４図は、１５の無関係の個体からのＴａｑ Ｉ−消化
ＤＮＡサンプルについてのＨ３０オリゴヌクレオチドプ
ローブのハイブリダイゼーションのパターンを示す。 第５図は、棄てられた性的暴行の証拠の消毒綿から得ら
れたＨｉｎｆＩ−消化されたＤＮＡへの４．０ｋｂｐの
［１４Ｓ１３９プローブのハイブリダイゼーションを示
す。ＤＮＡのマイクロダラム量が付された標準男性ＤＮ
Ａが左側の４つのレーンに付加された。１〜５の番号が
付与されたレーンのセットは消毒綿のセットから得られ
たＤＮＡを含み、各セットは特定の事件に関連する。文
字は消毒綿の解剖学的源に関し、■は膣、Ｓは皮膚、ｒ
は直腸、ｂｖは血液が付着した膣、０は口腔を意味する
。 パネルＡはプローブとして４．Ｑｋｂｐの０４Ｓ１３９
断片を用いたハイブリダイゼーションの結果を示す。 パネルＢはプロットの中間ストリッピングを伴わないＹ
染色体特異的プローブとのハイブリダイゼーションの結
果を示す。矢じり印は男性特異バンドの位置を示す。 第６図は、Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座のクローンからのＤＮ
Ａ配列データーを示す。下線を付した領域は３２ｂｐ反
復ユニットを示す。 第７図は、Ｄ４Ｓ１３９への代表的な８４ｂｐオリゴヌ
クレオチドプローブのＤ Ｎ Ａ配列を示す。スラッシ
ュにより分離された複数の塩基は混合塩基位置を示す。 図面の浄書（内容に変更なし） ！族１４２二 ＋２３４５６７８９１０ 家族２８ ＋２１３１４−１６１７ ｌ８ｔ９２０２１２２２Ｂ２
４ＦＩ東。２ ４ ア ０ ＋２ １３ １４ ５ ＦＩ［東。４ ２、う４５ら７８ ｉ−’ｍυ二二二二ｕＶＵＷ ’□−・〜 −”１胛 Ｙ染色体）”ｒ′Ｉ：？ Ｆ′ＹＩＧｏ５ ＴＣＡＣＴＴＧＡＡＣＴＡＴ ＣＡＴＣＡＧＡＣＴＡ ＡＴＡＴＧＴＡＧＣＧ Ｃ
ＴＣＡＡＡＡＡＡＡ ＾Ｇ＾Ｇ＾Ｃ＾＾＾ＣＴＴ＾＾
０＾ＧＢ。 ＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴ ＣＴＴＣＧＴＡＡＴＣＣＴＧ
ＴＣＡＴＣＡＧ ＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧ τＧＴＣＧ
ＡＡＡＴＴ５° Ａ Ａ／Ｇ Ａ Ａ Ｔ ＡＧＧＡＧ ＧＡＧＣ ＧＡＧＧ ＡＣＡＣ ０ ２゜ ２コ ＧＣＡＣ Ｇ ＡＧ ＾ ＧＡ ＣＣＧＡ ３゜ ２ ：ｓ５ ５ ５゜ ＧＧＡＣ ＣＡＧＣ ＡＧＧＣ ＴＡＯＧ ２ ＣＣＣＧ ＴＧＴ（： ン ０゜ 補正の対象 手 続 補 正 書 く方式） ％式％ 事件の表示 平底２年特許願第２９７３４号 ２゜ 発明の名称 ＶＮＴＲ遺伝子座に対するＤＮＡプローブ３゜ 補正をする者 事件との関係
、その構成員のＤＮＡ断片が第２図に示すＤ４Ｓ１３９
４． Ｏｋｂｌｌプローブへのハイブリダイゼーション
により分析された。男性は四角で示されており、そして
女性は円で示しである。 第２図は、第１図に示す家系の家族の構成員（１４２１
）から調製されたＴａｑ Ｉ−消化されたＤＮＡへの４
．０ｋｂｐ ０）Ｄ４Ｓ１３９プローブのハイブリダイ
ゼーションのパターンを示す。レーン番号１〜１４中の
ＤＮＡサンプルは第１図における家族の構成員に付与さ
れた番号に対応する。レーン１６〜２４は二世代家族（
２８）からのＤＮＡサンプルを含む。レーン１６及び１
７は両親からのＤＮＡを含み、そしてレーン１８〜２４
は７子孫のそれぞれからのＤＮＡを含む。 第３図は、３つの二世代家族から調製されたエヨＩ−消
化ＤＮＡ断片への８３０プローブのハイブリダイゼーシ
ョンのパターンを示す。レーン１及び２はそれぞれ父及
び母からのＤＮＡを含み、そしてレーン３．４及び５は
３子孫のそれぞれからのＤＮＡを含む。レーン６〜ｌＯ
及び１１−１５は他の２家族の分析を示す。各家族のた
めに同一のローディングパターン（ｌｏａｄｉｎｇパタ
ーンが用いられる。 第４図は、１５の無関係の個体からのＴａｑ Ｉ−消化
ＤＮＡサンプルについてのＨ３０オリゴヌクレオチドプ
ローブのハイブリダイゼーションのパターンを示す。 第５図は、棄てられた性的暴行の証拠の消毒綿から得ら
れたＨｉｎｆＩ−消化されたＤＮＡへの４．０ｋｂｐの
［１４Ｓ１３９プローブのハイブリダイゼーションを示
す。ＤＮＡのマイクロダラム量が付された標準男性ＤＮ
Ａが左側の４つのレーンに付加された。１〜５の番号が
付与されたレーンのセットは消毒綿のセットから得られ
たＤＮＡを含み、各セットは特定の事件に関連する。文
字は消毒綿の解剖学的源に関し、■は膣、Ｓは皮膚、ｒ
は直腸、ｂｖは血液が付着した膣、０は口腔を意味する
。 パネルＡはプローブとして４．Ｑｋｂｐの０４Ｓ１３９
断片を用いたハイブリダイゼーションの結果を示す。 パネルＢはプロットの中間ストリッピングを伴わないＹ
染色体特異的プローブとのハイブリダイゼーションの結
果を示す。矢じり印は男性特異バンドの位置を示す。 第６図は、Ｄ４Ｓ１３９遺伝子座のクローンからのＤＮ
Ａ配列データーを示す。下線を付した領域は３２ｂｐ反
復ユニットを示す。 第７図は、Ｄ４Ｓ１３９への代表的な８４ｂｐオリゴヌ
クレオチドプローブのＤ Ｎ Ａ配列を示す。スラッシ
ュにより分離された複数の塩基は混合塩基位置を示す。 図面の浄書（内容に変更なし） ！族１４２二 ＋２３４５６７８９１０ 家族２８ ＋２１３１４−１６１７ ｌ８ｔ９２０２１２２２Ｂ２
４ＦＩ東。２ ４ ア ０ ＋２ １３ １４ ５ ＦＩ［東。４ ２、う４５ら７８ ｉ−’ｍυ二二二二ｕＶＵＷ ’□−・〜 −”１胛 Ｙ染色体）”ｒ′Ｉ：？ Ｆ′ＹＩＧｏ５ ＴＣＡＣＴＴＧＡＡＣＴＡＴ ＣＡＴＣＡＧＡＣＴＡ ＡＴＡＴＧＴＡＧＣＧ Ｃ
ＴＣＡＡＡＡＡＡＡ ＾Ｇ＾Ｇ＾Ｃ＾＾＾ＣＴＴ＾＾
０＾ＧＢ。 ＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴ ＣＴＴＣＧＴＡＡＴＣＣＴＧ
ＴＣＡＴＣＡＧ ＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧ τＧＴＣＧ
ＡＡＡＴＴ５° Ａ Ａ／Ｇ Ａ Ａ Ｔ ＡＧＧＡＧ ＧＡＧＣ ＧＡＧＧ ＡＣＡＣ ０ ２゜ ２コ ＧＣＡＣ Ｇ ＡＧ ＾ ＧＡ ＣＣＧＡ ３゜ ２ ：ｓ５ ５ ５゜ ＧＧＡＣ ＣＡＧＣ ＡＧＧＣ ＴＡＯＧ ２ ＣＣＣＧ ＴＧＴ（： ン ０゜ 補正の対象 手 続 補 正 書 く方式） ％式％ 事件の表示 平底２年特許願第２９７３４号 ２゜ 発明の名称 ＶＮＴＲ遺伝子座に対するＤＮＡプローブ３゜ 補正をする者 事件との関係
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、遺伝子座Ｄ４Ｓ１３９の対立遺伝子からのＤＮＡに
特異的にハイブリダイズすることができるＤＮＡプロー
ブ。 ２、前記プローブが約４．０ｋｂｐのＤ４Ｓ１３９断片
、又はそれに由来するＤＮＡ断片もしくはＤＮＡ配列を
含んで成る、請求項１に記載のＤＮＡプローブ。 ３、前記プローブが、配列５′【遺伝子配列があります
。】３′を有するオリゴヌクレオチド、又はその１４ｂ
ｐ以上の断片を含んで成る、請求項１に記載のＤＮＡプ
ローブ。 ４、前記プローブが前記オリゴヌクレオチドの又はその
断片の相補体である、請求項３に記載のＤＮＡプローブ
。 ５、ＤＮＡがラベルされている、請求項１〜４のいずれ
か１項に記載のＤＮＡプローブ。６、前記ラベルが放射
性同位元素、蛍光物質、抗原、酵素、ビオチン、フルオ
ロクローム、生物発光物質及び化学発光物質から成る群
から選択されたものである、請求項５に記載のＤＮＡプ
ローブ。 ７、生物学的関連性の存在を決定する方法であって、 生物学的関連性が問題とされる個体から採取された生物
学的サンプルからのＤＮＡ、及び推定上の生物学的関連
者から採取された生物学的サンプルからのＤＮＡを平行
して制限エンドヌクレアーゼにより消化し； 前記制限エンドヌクレアーゼ消化されたＤＮＡ断片を分
画し； 前記ＤＮＡ断片を、請求項１〜４のいずれか１項に記載
のラベルされたＤＮＡプローブとハイブリダイズせしめ
； ハイブリダイズしなかったラベルされたプローブを分離
し；そして 前記個体の及び前記推定上の生物学的関連者のハイブリ
ダイゼーションパターンの同一性又は部分的同一性を分
析する； ことを含んで成る方法。 ８、消化の段階に先立って、前記個体の及び／又は推定
上の生物学的関連者の生物学的サンプルからＤＮＡを単
離することを含む請求項７に記載の方法。 ９、前記生物学的サンプルが血液サンプルである、請求
項７に記載の方法。 １０、生−法医学検体の源の同定方法であって、生−法
医学検体からのＤＮＡ及び該生−法医学検体の推定上の
源から採取した生物学的サンプルからのＤＮＡを制限エ
ンドヌクレアーゼにより平行して消化し； 前記制限エンドヌクレアーゼで消化されたＤＮＡ断片を
サイブ分画し； 前記ＤＮＡ断片を、請求項１〜４のいずれか１項に記載
のラベルされたＤＮＡプローブとハイブリダイズせしめ
； ハイブリダイズしなかったラベルされたプローブを分離
し； 結合したラベルされたプローブを検出し；そして 前記推定上の源が前記生−法医学検体の実際の源である
か否かを決定する； ことを含んで成る方法。 １１、前記生−法医学検体が、血液、乾燥血液、乾燥し
た血痕、乾燥した膣液痕、精液、乾燥した精液、乾燥し
た精液痕、口内綿棒、膣内綿棒、膣内液、毛根及び体組
織から成る群から選択されたものである、請求項１０に
記載の方法。 １２、消化の段階に先立って、前記生−法医学検体及び
／又は生物学的サンプルからＤＮＡを単離することを含
んで成る、請求項１０に記載の方法。 １３、生物学的サンプルの由来のハロタイプの同定方法
であって、 生物学的サンプルからのＤＮＡを制限エンドヌクレアー
ゼにより消化し； 前記制限エンドヌクレアーゼにより消化されたＤＮＡ断
片をサイブ分画し； 前記ＤＮＡ断片を、請求項１〜４のいずれか１項に記載
のラベルされたプローブとハイブリダイズせしめ； ハイブリダイズしなかったラベルされたプローブを分離
し； 結合したラベルされたプローブを検出し；そして 前記生物学的サンプル中のＤＮＡのＤ４Ｓ１３９遺伝子
連におけるハロタイプを決定する； ことを含んで成る方法。 １４、消化の段階に先立って、生物学的サンプルからＤ
ＮＡを単離することを含む、請求項７、１０又は１３に
記載の方法。 １５、前記サイズ分画の段階に続き、サイズ分画された
ＤＮＡ断片を適当な基材に固定することを含む、請求項
７、１０又は１３に記載の方法。 １６、前記基材がナイロン及びニトロセルロースから成
る群から選択されたものである、請求項１５に記載の方
法。 １７、前記制限エンドヌクレアーゼがＴａｑ I 、Ｅｃ
ｏＲ I 、ＨｉｎｄIII、Ａｌｕ I 、Ｈｉｎｆ I 、Ｈａ
ｅIII、￥Ｒｓａ￥ I 、￥Ｂａｍ￥Ｈ I 、￥Ｂｇｉ￥
II、￥Ｐｓｔ￥ I 及び￥Ｘｂａ￥ I から成る群から選
択されたものである、請求項７、１０又は１３に記載の
方法。 １８、ハイブリダイズの段階をストリンジェントな条件
下で行う、請求項７、１０又は１３に記載の方法。 １９、前記制限エンドヌクレアーゼ消化されたＤＮＡサ
ンプルを平行してサイズ分画する、請求項７、１０又は
１３に記載の方法。 ２０、前記ハイブリダイズの段階をアガロースゲル中で
行う、請求項７、１０又は１３に記載の方法。 ２１、ハイブリダイズの段階に先立って、アガロースゲ
ルを乾燥することを含む、請求項２０に記載の方法。 ２２、前記ラベルが放射性同位元素、蛍光物質、抗原、
酵素、ビオチン、フルオロクローム、生物発光物質及び
化学発光物質から成る群から選択されたものである、請
求項７、１０又は１３に記載の方法
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/310,140 US5032501A (en) | 1989-02-10 | 1989-02-10 | DNA probes to vntr loci |
| US310140 | 1989-02-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03130100A true JPH03130100A (ja) | 1991-06-03 |
Family
ID=23201166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2029734A Pending JPH03130100A (ja) | 1989-02-10 | 1990-02-13 | Ｖｎｔｒ遺伝子座に対するｄｎａプローブ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5032501A (ja) |
| EP (1) | EP0382261A3 (ja) |
| JP (1) | JPH03130100A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013079859A (ja) * | 2011-10-04 | 2013-05-02 | Shiga Prefecture | 生体試料採取キット |
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| WO2003080801A2 (en) * | 2002-03-19 | 2003-10-02 | Advanced Research & Technology Transfer | Adipose stromal stem cells for tissue and vascular modification |
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| JPH05501946A (ja) * | 1988-02-18 | 1993-04-15 | ユニバーシティ・オブ・ユタ | 可変数タンデム反復座のｄｎａプローブを使用する遺伝的同定 |
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1989
- 1989-02-10 US US07/310,140 patent/US5032501A/en not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-02-12 EP EP19900102704 patent/EP0382261A3/en not_active Ceased
- 1990-02-13 JP JP2029734A patent/JPH03130100A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013079859A (ja) * | 2011-10-04 | 2013-05-02 | Shiga Prefecture | 生体試料採取キット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5032501A (en) | 1991-07-16 |
| EP0382261A2 (en) | 1990-08-16 |
| EP0382261A3 (en) | 1992-08-05 |
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