JPH05501946A - 可変数タンデム反復座のｄｎａプローブを使用する遺伝的同定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 可変数タンデム反復座のＤＮＡプローブを使用する遺伝的同定発明の分野 本発明はヒト核酸多型性を同定するための方法および組成物に関する。本発明の １の応用は、個体の多型性の性質を比較することによって個体の類似程度を決定 することである。本質的には、個体における多型性の性質はその個体の目印また は追跡子として働く。特別の応用は親子鑑別、法医学における使用、病気の診断 および接合性識別または続いての移植におけるごときキメリズム（ａｈ　ｉｍｅ ｒ　ｉｓｍ）／モザイクイズム（ｍｏｓａｉｃｉｓｍ）の決定を含む。

発明の背景 集団変異は組替えおよび突然変異のごときプロセスによって起こる。変異は生物 、細胞および細胞成分のレベルで見い出すことができる。生物学的貫刺性は変異 不在の対生存障害を好む。例えば、類縁核酸配列の拡散はそれらの配列がコード 付けするポリペプチドの変異性を意味しない。

殊に、蛋白または核酸に関する変異性の状態は多型性として公知である。最近に なるまで、多型性の研究は細胞膜蛋白、血清−由来蛋白または細胞内蛋白に焦点 を当ててきた。応用としては、例えばＡＢＯまたはＨＬＡ血液型のタイプ分け、 およびイソ酵素分析（レウォンティンおよびツウビイ（Ｌｅｗｏｎｔｉｎ　＆　 Ｈｕｂｂｙ）、ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）（１９６６）　５４．５ ９５）が含まれる。それらの方法は、例えば抗原決定基または分子電荷を変化さ せるアミノ酸の変化に頼っている。しかしながら、蛋白多型性は「サイレント」 かも知れない。何故ならば、アミノ酸置換はそれらの方法によって認識される変 化を引き起こさないからである。それは、もし該置換が蛋白の三次または四次構 造で通常には予測されない部位で起こるならば、生起するであろう。

それらの限界は核酸における多型性の観察を阻害してきた。原核生物ゲノムは３ つのクラスの配列−ユニークな、中程度に反復したおよび高度に反復した配列− よりなる。一般に、３つのクラスはゲノム全体に分散している。それらの配列の 多くは機能が未知であり、必要なＲＮＡまたは蛋白をコード付けしていないかも 知れない。蛋白をコード付けすることが公知である配列のうちほとんどのものは 、コーディング染色体部分および非コーディング染色体部分の複合配列である。

核酸の変異は、例えば、コドンの縮重のため、または選択圧を欠くために偽遺伝 子、高頻度反復配列または構造遺伝子の非コーディング領域におけるごとき高度 の多型性が可能となる領域で起こり得る。

核酸の多型性は制限部位内の単一の塩基変化として検出可能である。ワイマンお よびホワイト（Ｗｙｍａｎ　ａｎｄ　ＷｈｉｔｅＸプロシーディングズ・オプ・ ナショナル・アカデミ−・オブ・サンエンシズ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）ＵＳＡ　（１９８０）、７７．６７５４ ）は、多型性がＤＮＡ再配列に由来するヒトのゲノム中の座を見い出した。その 結果、多型性の原因となる機構がその座における反復配列の数を変化させている ことが決定された。多型性がコピー数の差異による他の部位がαグロビン遺伝子 （ヒッグズら（Ｈｉｇｇｓ　ａｔ、　ａｌ、　）、ヌクレイツク・アシッズ・リ サーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　Ｘ　１９８１　）伝子（ブラウ トフットら（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ　ａｔ、　ａ、１．）、セル（Ｃｅｌｌ）　（ １９８２）３上、５５３；グツドポーンら（Ｇｏｏｄｂｏｕｒｎ　ｅｔ、　ａｌ 、）（ブロンーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サンエンシ ズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ−）　Ｕ　５Ａ（１９８３）　 ８０．５０２２）、ｃ　−Ｈａ−ｒａｓ　−１座（カボンら（Ｃａｐｏｎ　ｅｔ 、　ａｌ、）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）（１，９８３）３０２，３３）お よびミオグロビン遺伝子（ウェラーら（Ｗｅｌｌｅｒ　ｅｔ、　ａｔ、）　イー ーエムΦビー骨オー・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、　）（１９８４）３，４３９） の近くで見い出されている。

グラスベルブ（ＧｌａｓｓｂｅｒｇＸＧ　Ｂ　２１３５７７４　Ａ）はワイマン およびホワイト（Ｗｙｍａｎ　＆　Ｗｈｉｔｅ）、前掲、およびカボンら（Ｃａ ｐｏｎ　ａｔ。

ａｌ、）、前掲、によって開発されたクローンで検出されるＤＮＡ長多型性の分 析による個体の遺伝的同定法を開示している。ワイマンおよびホワイトのクロー ンに関しては、反復単位は、交差反応性の確度を増加させる３ｂｐであり、検出 されるゲノミック断片のサイズは１４ｋｂまたはそれ以上である。大きな断片の サイズ差はしばしばアガロースゲル電気泳動で解像するのが困難である。該カポ ンのクローンで検出される断片のサイズは小さいが、その座には少数の対立遺伝 子があり、対立遺伝子の第３の各々は２６８のランダム個体の集団に１％未満で 存在する。（同定目的のための座の価値は対立遺伝子の数および集団の各対立遺 伝子の頻度に直接に関係する。）ジエフレイズ（ＪｅｆｆｒｅｙｓＸＧ　Ｂ　２ １６６４４５　Ａ）は、多くの多属性領域は彼がコア配列と呼んだ共通の配列を 有することを見い出した。彼はコアまたは準コア配列のフン力タマーを組み立て 、次いでそれをクローン化した。ゲノミックＤＮＡのプローブとして使用する場 合、それらのクローンは複数の断片にハイブリダイズする。それらのクローンに 伴う難点は複雑なハイブリダイゼーションパターンの解釈である。

高度多型性座を検出するクローンの有用性は、癌の研究（セインら（Ｔｈｅｉｎ 　ｅｔ、　ａｌ、）、７”リティッシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｂｒ 、　Ｊ、　ＣａｎｃｅｒＸｌ　９８７）５５．３５３）において；法医学（ギル ら（Ｇｉｌ’ｌ　ｅｔ、　ａｌ、）、エレクトロ７オレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐ ｈｏｒｅｓｉｓＸ　１０３；ジウスティら（Ｇｉｕｓｔｉ　ｅｔ、　ａｌ、）、 ジャーナル・オブ・７オレンンツク・サンエンシズ（Ｊ、　Ｆｏｒ、　Ｓｃｉ、 ）３１．４０９）において；接合性決定（モトムラら（ＩＪｏｔｏｍｕｒａ　ｅ ｔ、　ａｌ、）、ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・ヒユーマン・ジエネティッ クス（Ｊｐｎ、　Ｊ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ。

Ｘｉ　９８７）３２．　９；ジョーンズら（Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ、、　ａｌ、）、 ニーロビーアン・ジャーナル・オブ・ヘマトロジ−（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｈａｅｍ ａｔｏｌ、　）　（１ワレスら（Ｗａｌｌａｃｅ　ｅｔ、　ａｌ、）、コールド ・スプリング・ハーバ−・ンンボ・ファント・パイオル・（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂ、　Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ。

ンら（Ｍａｒｔｏｎ　ｅｔ、　ａｔ、）、ベテリナリ・レコード（Ｖｅｔ、　Ｒ ｅｃ、　ＸＩ　９究（つＬ　ットンら（Ｗｅｔｔｏｎ　ｅｔ、　ａｌ、、ネイチ ャー（ＮａｔｕｒｅＸ　ｌ　９８７　）３２７Ｘ１４９）において：連鎖の研究 （ボンダーら（Ｐｏｎｄｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、）、ヘンリー・フォード・ホスピ タル・メト・ジャーナル（Ｈｅｎｒｙ　ＦｏｒｄＨｏｓｐ、　Ｍｅｄ、　Ｊ、　 ＸＩ　９８７）３５．　ｌ　６１；”スラーら（Ｍａｔｔｈｅｖ　ｅｔ。

ａｌ、）　、ジャーナル・オブ・メディカル・ジエ不ティックス（Ｊ、　Ｍａｄ 。

Ｇｅｎｅｔ、　Ｘ　１９８７　）２土、５２４）において；および親子鑑定（ジ エフレイズら（Ｊｅｆｆｒｅｙｓ　ｅｔ、　ａｌ、）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒ ｅ）　（１９８５）る論文によって証明されている。

ドニスーケラーら（Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ　ａｔ、　ａｌ、）（Ｅ　Ｐ　Ｏ ２２１６３３）はＲＦＬＰを分析することによる遺伝子型のタイプ分けに有用な 方法および組成物を開示している。特許請求されているクローンはユニークな配 列インサートを担持し、非連鎖座にハイブリダイズスル。該クローンは２つのカ テゴリー二分類される。第１のものは、制限部位内の塩基変化を明らかにするク ローンよりなり、第２のものは少なくとも３種の酵素で断片長の差異を生じるク ローンよりなる。

前記技術は欠点を有する。一般に、該クローンは試料当たり多重の断片にハイブ リダイズする。それは解釈を複雑なものとする。いくつかのクローンは高度には 複対立性でないまたは多くの対立遺伝子が稀である座から生起したものであった 。それによりそれらの有用性が減じられる。該クローンのうちいくつかは、大き くなる傾向があって探単的なフィルターハイブリダイゼーションを用いての解像 が困難であるゲノミック断片にハイブリダイズする。それは、ゲノミックＤＮＡ に最小の分解を要求する。さらに、アッセイ条件は偏性交差反応性を最小化する のに特異的でなくてはならない。結局、各研究所は使用すべきクローンの小セッ トを有する。いずれの１のクローンも特異的な場合においては情報を与えない。

さらに、デノボ突然変異による変異性を規則付けるためには、１以上の座を分析 することが重要である。分析される後の座は第１の座に連鎖していないのが好ま しい。理想的には、分析するすべての座は異なる染色体上に存在する。かくして 、先行技術の改良は複対立性でヘテロ接合性の座を検出しかつマツピングされる 大多数のクローンよりなる単−座クローンのセットであろう。

修飾物がジエ７レイズ（ＪｅｆｆｒｅｙｓＸＧ　Ｂ　２１８８３２３　Ａ）によ って開示されており、彼はゲルからバンドを切り出し、クローン化し、そのイン サートをプローブとして使用した。そのクローンは単一の複対立性座にハイブリ ダイスし、解釈し易いプロットを生じる。また、ジエフレイズ（Ｊｅｆｆｒｅｙ ｓ）は「コア」配列を担持する組換体についてサイズ−制限ライブラリーをスク リーニングしている。５の陽性プラークからのインサートは高緊縮下でユニーク 座にハイブリダイズし、容易に解釈できるプロットを生じた。それにもかかわら ず、認識されたゲノミック断片はしばしば大きく、解像およびＤＮＡ品質に関す る問題点を生じる。

ナカムラら（Ｎａｋａｌ！１ｕｒａ　ｅｔ、　ａｌ、）（サンエンス（Ｓｃｉｅ ｎｃｅＸ　１９８７　）２３５．１６１６）は、単−座においてタンデム反復を 含有する遺伝子配列を可変数のタンデム反復（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ 　ｏｆ　ｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔＸＶ　Ｎ　Ｔ　Ｒ）座と命名した。彼等はＶ ＮＴＲ配列を担持する組換体についてのコスミッドラリブラリーのスクリーニン グを行うためにオリゴヌクレオチドを用いた。それらがヒト・ゲノムにおけるＶ ＮＴＲ座にハイブリダイズするか否かを測定し、もしそうだとしたら、それらの 座におけるヘテロ接合性の程度を評価するために陽性クローンをプローブとして 用いた。

発明の要約 本発明はヒト・ゲノムにおける多型性座を検出するための方法および組成物に関 する。本発明は、ＶＮＴＲ座から生起したまたはそれを包含する配列を担持する 核酸クローンを得る方法を教示する。

該クローンをスクリーニングして高度にヘテロ接合性である遺伝子配列を検出す る。さらに、該クローンを選択してゲノム全体に分散したユニークなＶＮＴＲ座 を検出する。

ＶＮＴＲクローンはそれらのゲノムにおける１またはそれ以上の座に担持された 対立遺伝子に基づいて個体を識別できる。かくして、ＶＮＴＲクローンは親子鑑 別、法医学の応用、接合性の決定、近親交配度、家系分析、遺伝子マツピングま たは生物、器官、組織、細胞、細胞下成分、その部分またはその分解生成物の同 定を必要とするいずれの他の応用にも用いることができる。

多数のＶＮＴＲクローンをキャラクタライゼーションに付したが、それを後記す る。ＶＮＴＲクローンセットの利点は情報的クローンの数、マツプ位置に関する クローンのキャラクタライゼーションおよびヘテロ接合仕度であり、一般に、検 出されるゲノミツク断片は低分子量である。小サイズの対立遺伝子は解析を容易 とし、フィルターハイブリダイゼーション無くしての同定を可能とし、それらの 適用における確固たる地位を確実とする。

図面の簡単な記載 第１図は一対のオートラジオダラムよりなる。フィルムは６種の非類縁個体のラ ンダムスクリーニングを示す。コスミツドをプローブとして用いた。

第２図はスクリーニングの結果を示す系図と共にオートラジオダラムよりなる。

第３図は検出された座が複対立性か否かを分析した結果を示す一対のオートラジ オダラムよりなる。

第４図はｐＪｃＺ３．１およびＨｉｎｆｌ−消化ＤＮＡを用しする親子鑑別試験 の結果を示すオートラジオダラムである。

第５図はｐＪｃＺ１６．１およびＨｉｎｆＩ−消化ＤＮＡを用ｌ／％る親子鑑別 試験の結果を示すオートラジオダラムである。

第６図はｐＹＮＨ２４およびＡｌｕ　Ｉ−消化ＤＮＡを用いる親子鑑別試験の結 果を示すオートラジオダラムである。

第７図はヒト染色体１４のイデオグラム（ｉｄｅｏｇｒａｍ）および連鎖地図よ りなる。

第８図はヒト染色体１７のイデオグラムおよび連鎖地図よりなる。

発明の詳細な説 明細書および請求の範囲で用いるすべての用語は当業者に公知である。しかしな がら、かかる語句に与えられる範囲を包含する明細書および請求の範囲の明確で 矛盾のない理解を提供するために、以下に定義を掲げる： ついての指称。

ＤｐＳｑ　＋ＤおよびＳが単一の（ｓｉｎｇｌｅ）コピーＤＮＡ配列を表すとき 、ｐは当該ＤＮＡマツプがマツプされる（由来する）染色体の番号／文字であり 、ｑは対立するものを示す。この記号は遺伝子座の同一性を示す。かくして、Ｘ ＹＺとして公知のＸ一連鎖遺伝子座がＸ染色体上にマツプされた第１の単一コピ ーＤＮＡ配列である場合、ＤＸＳＩはＸＹＺと同意語である。

ライブラリーまたはバンク：複数の組換体クローン。該クローンは、全体として クローン化するには大きすぎる生物、細胞、染色体または核酸に由来する外来性 核酸の一部を担持し、総合すると、外来性核酸の該一部は銃計的には断片が得ら れた出発物質と同等であると考えられる。

マツピング：ゲノム内の核酸配列を染色体、その領域に対して、あるいは染色体 よりなる核酸内に位置決めすること。通常の技術および遺伝子マツピングの手段 は連鎖分析、検定交雑、体細胞ハイブリッド、組換体近交株および配列決定法を 含む。

核酸断片：ヌクレオチドを包めることができるが、一般にオリゴヌクレオチドよ りも長いヌクレオチドポリマー。本明細書中で用いるごとく、核酸断片はクロー ン、クローンのＶＮＴＲ−含有断片、該ＶＮＴＲ−含有断片に対し実質的な配列 相同性を有する核酸および当該クローンによって特異化される単−座にハイブリ ダイズできる核酸も含むことを意図するる オリゴまたはオリゴヌクレオチド：数ヌクレオチド塩基のポリマ多型性座または 遺伝子：同種コピーが同一でない二倍体ゲノムにおいて位置決めされた核酸配列 。

ｐＸＹＺ　：　ｘＹＺ座にハイブリダイズするプラスミドクローンｊこついての 指称。

実質的な配列相同性：ヌクレオチドの配列間の実質的な機能／まｊ；は構造の同 等性。実質的な配列相同性を有する配列間の機能および／または構造の差異はド ミミニ（ｄｅ　ｍｉｎｉｍｉｓ）である。

ＶＮＴＲ座または領域または配列または遺伝子ニ一般に縦列に組織された単位の 多コピーよりなる核酸トラクト（ｔｒａｃｔ）。該単位は長さが３塩基対から４ ０塩基対までまたはそれ以上であり得、該トラクトはタンデム反復またはフラン キングタンデム反復のクラスター間に散在したユニーク配列を含有し得る。

ｘｙｚ　：座の同一性を示す記号であり、遺伝子記号としても公知である。この 例においては、該遺伝子の名称はｘＹＺである。

本発明は、ヒトにおいて多型性座を検出するための方法および組成物に関する。

個体に担持された座の性質はＶＮＴＲクローンをその個体のゲノミックＤＮＡと 反応させることによって明らかにされる。その反応は、通常、膜支持体上のバン ドのパターンによって表される。かくして、パターンは個体に特徴的であり、個 体のパターンを比較して該個体が共通の起源を有するか否かを決定できる。

本発明の範囲内にあるＶＮＴＲクローンはヒト・ゲノム全体に散在したユニーク 座を検出する。該座は生型性であり、変異性は第一にタンデム反復のコピー数の 差異によって生起する。それらの座はＶＮＲＴ座（ナカムラら（Ｎａｋａｍｕｒ ａ　ｅｔ−ａｌ、）、前掲）と呼ばれる。

本発明は、ＶＮＴＲ座から試薬量のクローンを同定産生ずる方法を教示する。本 発明の精神に従って産生されたクローンの価値は、直接、その座に収容される対 立遺伝子の数および各対立遺伝子の頻度と共に増加する。理想的には、各対立遺 伝子が集団において同一頻度で存在する複対立系列が望まれるであろう。その目 標はなかなか達成されない。かなりの程度の解析を達成するには、いくつかの、 好ましくは非連鎖座からの情報を組み合わせる別法がある。遺伝子マツピング、 組換体ＤＮＡおよび集団遺伝学の簡単な考察はボートスティンら（Ｂｏｔｓｔｅ ｉｎ　ｅｔ、　ａｌ、）、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒユーマン・ジェ不 ティックス（Ａｍ、　Ｊ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、）　（１９８０）、■え、 ３１４）中に見い出すことができる。

本発明のＶＮＴＲクローンを得るために利用される技術は当該分野でよく知られ ている。適当な技術はマニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ。

ａｌ、）によるモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｒ ｎｇ）（１９８２）およびメソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎＥｎｚｙｍｏ　Ｉｏｇｙ）の６５，６８．ユ００、上１上および１５２巻 に記載されている。また、本発明において用いられた手順のより詳しい記載はワ イマンおよびホワイト（Ｗｙｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ）、前掲、リフトおよ びホワイト（Ｌｉｔｔ　ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ）　（プロシーディングズ・オプ・ す厘ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ（１９８５）８２，６２０６）およびナカムラら（Ｎａ ｋａｍｕｒａ　ｅｔ。

ａｌ、）、前掲、中に見い出すことができる。

当該分野で公知のごとく、オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションはは っきりした配列および検定条件を必要とする。単一ヌクレオチドの変化またはハ イブリダイゼーションの程度または洗浄は、ユニーク配列についてのゲノミック 消化物をプローブするためにオリゴを用いた場合のごとき対合の適合度および安 定性を変化させ得る。他方、特に本発明の精神において、ライブラリーをスクリ ーニングするためにオリゴを用いた場合、目標は理想的な数の陽性クローンを得 ることにある。かくして、相同性の要件は低減化され、すなわちオリゴは１また はそれ以上のヌクレオチドにおいて変化し得、緊縮は低化されて誤対合デュプレ ックスを保持する。ＶＮＴＲクローンは、ＶＮＴＲ座で見い出された公知のコン センサス配列の後に配置されたオリゴヌクレオチドでゲノミックライブラリーを スクリーニングすることによって得られる。用いたオリゴのいくつかの配列を第 １表に示す。

第１表 名称　配列　温度（℃） Ｈ＊　Ｗ木本 ゼータ−グロビン′″　ＴＧＧＧＧＣＡＣＡＧＧＮＴＧＴＧＡＧ　４２　４ｇ（ １８ｍａｒ） インシュリン＋　ＡＣＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＧ　３０　３７（１４ｍｅｒ） ミオグロビン−１”　ＧＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＡＧ　３７　４４（１６ｍ ｓｒ） ミオグロビン−２′″　ＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧ　３７　４２（１４ｍｅ ｒ） ＨＢ　Ｖ　−１”　ＧＧＡＧＴＴＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧ　３７　４４（１６ｍｅ ｒ） ＨＢ　Ｖ　−２”　ＧＧＡＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＧＧＧＧ　５０　６０（ ２０ｍｅｒ） ＨＢ　Ｖ　−３”　ＧＧＴＧＡＡＧＣＡＮＡＧＧＴＧ　３７　４２（１５ｍｅｒ ） ＨＢＶ〜４　”　ＧＡＧＡＧＧＧＧＴＧＴＡＧＡＧ　３７　４２（１５ｍｅｒ） ＨＢＶ〜５　”　ＧＧＴＧＴＡＧＡＧＡＧＧＧＧＴ　３７　４２（１５ｍｅｒ） Ｙ　Ｎ　Ｚ　２２　ＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＧＴＧＣ３７４２（１５ｍｅｒ） ＊　Ｈはハイブリダイゼーションの温度である。

＊＊　Ｗは洗浄の温度である。

＋　同定された遺伝子に連鎖したＶＮＴＲ座＋＋　Ｂ型肝炎ウィルスのＸ−遺伝 子領域に関連最初に、ヒト・ゲノミックファージライブラリーをミオグロビン１ １６ｍｅｒでスクリーニングした。オリゴヌクレオチドおよびゲノミック配列間 の相同性が比較的低い場合、低緊縮条件をハイブリダイゼーション用に選択して ハイブリッドを検出する。ゲノム当量当り約５０の陽性クローン（２５００００ クローン）を得た。しかしながら、非類縁個体からのＤＮＡの制限消化物をプロ ーブするのに用いる場合、ＶＮＴＲＮＴＲ全型性かとしたものはなかった。反復 したＤＮＡ配列を有する７アージはｒｅｃＡ＋宿主中で十分には増殖しないので 、ｒｅｃＡ＋菌中で組み立てられたライブラリーはＶＮＴＲ配列を含有する多く のファージを喪失してしまった可能性があるように見えた。

ｒｅｃＡ−菌中で増殖するヒト・コスミッドライブラリーのスクリーニングはよ り生産的であった。ファージスクリーニングについてと同一の条件を用いたが、 ７アーグライブラリーからの３倍のゲノム当量当り陽性クローンがコスミッドラ リブラリーから得られた（第２表）。第１表に記載したオリゴヌクレオチド中の 配列にいくらかの類似性があるごとく、■のオリゴヌクレオチドで同定されたコ スミッドクローンのほとんどはもう１つのオリゴヌクレオチドで同定されたもの と異なることに注意するのは重要である。４％未満のコスミッドクローンが１を 越えるオリゴヌクレオチドとノーイブリダイズした。

第２表 スクリーニング　＋　試験した　部位４オリゴ　クローン　本　クローン　ネ＊ 　ＶＮＴＲ＊＊＊　％：多生型：：ゼータグ口ビン　１８０　５７　１２　２１ 　２０（ｆ３）インシュリン　２２０．　２０　４　２０　．８（１）ミオグロ ビン−１１５０６５８１２１９（８）ミオグロビン−２−１８１８８，４４８（ ２：）ＨＢＶ−１２００，７５、！３　１７　３８（１３）ＨＢＶ−２４０１５ ２，１３１０（３）ＨＢＶ−１５，Ｃ＋　２６　６　２３　６（２）ＨＢＶ−２ １５０５８１５２６４０（１９）８よび３ ＹＮＺ２２　．３８　３８　９　１土　２５（ｌｌ）合計　１０４６　３７２　 ７７　２１１７４　（６５）本　スクリーニングしたのは名プローブについて１ ゲノミ・ンク当量（７５０００コロニー）ないし２ゲノミツク当量である。

７５０００コロニー当りの陽性クローンの数を示す。

木本　ヒト・ゲノミツクＤＮＡのパネルにノ＼イブリダズしたクローン数。

木木本　ＶＮＴＲ座にハイブリダイズしたクローン数。

木本木本　平均値 ；　試験したニスミツド中のＶＮＴＲクローンの割合ｌ：２またはそれ以上の制 限酵素と共に部位多型性を示したコスミッド数を括弧に入れて示す。

ＶＮＴＲクローンのいくつかは、標準的な方法、一般にサンガーら（Ｓａｎｇｅ ｒ　ｅｔ、　ａｌ、）　（プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ− ・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　（ １９８０）７４．５４６３）のジデオキシ技術を用いて配列を決定した。幾分可 変のコンセンサス配列が同定された。その配列は、ＧＧＧＮＮＧＴＧＧＧＧであ り、または広い意味ではＧＮＮＮＧＴＧＧＧまたはＧＮＮＧＴＧＧＧのほとんど 不変の配列が当てはまる。一般則の例外はコンセンサス配列がＡＴ−豊富のモチ ーフを有する２のＶＮＴＲ座である。それらの座は第３表に掲げたごとくアポリ ボ蛋白Ｂおよびコラーゲンタイプ■に連鎖している。

第３表 ＶＮＴＲ座のコンセンサス配列の比較 座／連鎖座　配列 ゼータ−グロビン　ＧＧＴＴＧＴＧＡＧＴＧＧＧＧＣＡＣＡＹ　Ｎ　Ｚ　２　Ｇ ＡＧＧＣＴＣＡＴＧＧＧＧＣＡＣＡＹ　Ｎ　Ｚ　ｌ　３２　ＴＧＣＡＧＧＣＴＧ ＴＧＧＧＴＧＴＧＡＴＧＣ；ＧＴＧＡインシュリン　ＡＣＡＧＧＧＧＴＧＴＧに ＧＧＹ　Ｎ　ｒ　ｌ　ＯＣＴＧＧＧＧＧＴＧＴにＣ，ＧＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＧ ＧＣ丁ＧＴＣＡＧＡＴＧＣＴＣＡＣＴ　ＨＨ５９ＣＴＧＣ，ＧＧＡＧＣＣＴＧＧ ＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＹ　Ｎ　Ｈ２４ＣＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＧＡＡ ＧＴＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＴＴコンセンサス　ＧＧＧＮＮＧＴＧＧＧＧまた はＧＮＮＮＧＴＧＧＧまたはＧＮＮＧＴにＧＧハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ） −ｒａｓ（１）　ＧＧＧＧＧＡＧＴＧＴＧＧＣＧＴ（Ｃ：ＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡ Ａｐ　３　、４　Ｂ　ＨＩ　（２）　ＡＡＣＡＧＴ（、ＣＧＴＧＧＧＣＣＡＣＧ ＴＧＡＧＣＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣα−グロビン（３）　ＡＡＣＡＧＣＧＡＣＡ ＣＧＧＧＧＧＧＤ　ｌ　４　Ｓ　Ｉ　ＮＣＧ アポリポ蛋自Ｂ　（４）　ＴＴＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＴＡコラーゲンＣＡＡＴＡ ＴＡＧＡＴＡＡＴＡＴＡＴＡＣＣＴＡＴＡＴＡＴＴＡＴＴＡＴＡタイプ■（５） ■、カポンら（Ｃａｐｏｎ　ｅｔ、　ａｌ、）　、前掲２、シルバ（Ｓｉｌｖａ ）　、個人的通信３、ジャーマンら（Ｊａｒｍａｎ　ｅｔ、　ａｌ、）　、イー ・エム・ピー−オー中ジャー＋ル（ＥＭＢＯＪ、）（１９８６）５，１８５７４ 、ノットら（Ｋｎｏｔｔ　ｅｔ、　ａｌ、）　、ヌクレイツク・アシッズ・リサ ーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　（１９８６）土工、９２１５５、 ストーカ−ら（Ｓｔｏｋｅｒ　ａｔ、　ａｌ、）　％同書（１９８５）１３、ス クリーニングデータにより、変異性は、幾分、反復数の差異から生起することが 確認された。例えば、Ｄ１７５３０座（ＹＮＺ２２）における３つの対立遺伝子 について一部の配列が得られた。反復単位は７０ｂｐである。６Ａ対立遺伝子は ４コピーの反復を含有し、３Ａ対立遺伝子は３コピーの反復を、Ｄ７対立遺伝子 は２コピーの反復を含有していた。３つの対立遺伝子のすべての反復単位は同一 の７０ｂｐ単位を有していた。

しかし、反復単位の同一性は必ずしも絶対的なものではある必要はない。ＤＩ３ ８０座（ＭＣＴ１１８）の対立遺伝子が配列決定され、ＩＯコピーのタンデム反 復単位が見い出された。該１０の単位は以下の通りである： １）　ＣＣＣＡＡＧＧ−ＡＡＧＡＣＡＧＡ２）　ＣＣＡＣＡＧＧＣＡＡＧＧＡＧ ＧＡ３）　ＣＣＡＣＣＧ（１，ＡＡＡＧＧＡＡＧＡ４）　ＣＣＡＣＣＧＧＡＡＡ ＧＧＡＡＧＡ５）　ＣＣＡＣＣＧＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡ６）　ＣＣＡＣＡＧＧＣ ＡＡＧＧＡＧＧＡ７）　ＣＣＡＣＣＧＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡ８）　ＣＣＡＣＣＧ ＧＣＡＡＧＧＡＧＧＡ９）　ＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＡｌ　０）ＣＣＡ ＣＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＡその場合、反復単位は正確には再生されず、別の次 元の変異性が課される。変化は第１単位の塩基の欠失および転位または塩基転換 である。

ＶＮＴＲクローンの関連性のため、コンセンサス配列の後に配置されるオリゴヌ クレオチドを用いてＶＮＴＲクローンが得られるようである。かくして、コンセ ンサスまたは準コンセンサス配列を含有する１４またはそれ以上の塩基対のオリ ゴであって、残りの塩基がランダムに選択されるが好ましくはグアニンまたはチ ミジンまたはシトシンであるものを用いてＶＮＴＲクローンについてのライブラ リーをスクリーニングできる。オリゴヌクレオチドとコンセンサス間の配列相同 性の程度は５０％またはそれ以下であり得、ライブラリ−からＶＮＴＲクローン を得ることは変わらない。ｌの実験において、別のＴおよびＧ残基のオリゴヌク レオチドはＶ　Ｎ　Ｔ、　Ｒクローンを引き抜き、その１つがｐＭｃＴｌ１８で ある。

ＶＮＴＲ座はゲノム全体に分散しているので、後把するごとくゲノミックＤＮＡ のパネルについてのプローブとしてクローンを選択しそれを用いることによって 、ＶＮＴＲクローンをライブラリーからランダムに得ることができる。しかしな がら、それは益が少なく、退屈でコスト高な仕事となりかねない。別法はゲノム の一部だけからのＤＮＡを含有するライブラリー、例えば染色体−特異的ライブ ラリーを用いることである。その場合、該ゲノムの標的部分を調査すると、該ラ イブラリーは含有するクロン−がより少ない。（後記する）体細胞ハイブリッド または単離した染色体がライブラリー組立用のヒトＤＮＡの適当な源である。ハ イブリッド細胞系のヒト染色体がｌＯおよびＹだけである体細胞ハイブリッドＤ ＮＡを含有するライブラリーからそのようにしてｃＴＢＱ７を得た。そのコスミ ソドクローンをランダムに選択し、非類縁個体からのゲノミ７りＤＮＡのパネル のプローブとして用いて、該クローンが染色体ｌＯまたはＹいずれ上の生型仕度 にハイブリダイズするかを決定した。

候補コスミッドクローンを非類縁ヒト・ケノミックＤＮＡのパネルについてのプ ローブとして用いた。この手順は必ず必要だというのではないのだが、高緊縮下 で単一の多を性座にハイブリダイズしたクローンを継代クローン化した。継代ク ローニングにはインサートの断片化が実質的に伴い、由来するコスミッドクロー ンと同一のハイブリダイゼーションパターンを生じた断片または断片類が見い出 された。一般に、整えた断片をプラスミドに継代クローン化した。

クローンによって認識されたＶＮＴＲ座におけるヘテロ接合性の程度を決定する ため、非類縁ヒトからの大多数のＤＮＡを分析した。

その分析により、ヘテロ接合性の測定のみならず対立遺伝子の数、対立遺伝子サ イズ（対立遺伝子サイズはバンドサイズから推定される）および対立遺伝子頻度 についてのデータが得られる。ＤＮＡをいくつかの制限酵素で消化して最多数の 対立遺伝子および最小サイズの対立遺伝子を生じる酵素を決定した。

より長い核酸断片をユニーク配列についてのプローブとして用いる場合、配列相 同性要件が変化する。なぜならば、断片の長さおよびＧ／Ｃ対の相対含量がハイ ブリダイゼーション速度、かくして、対合の適合度に寄与するからである（例え ば、ウェトムールおよびデイビノドソン（Ｗｅｔｍｕｒ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄｓ ｏｎ）　、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　 Ｂｉｏｌ、）　（１９６８）　３上、３４９参照）。故に、遺伝子配列の進化論 的概観を行う場合、遺伝的浮動による配列の拡散に調和するようにハイブリダイ ゼーション条件を修正すべきであろう（それにもかかわらず、配列の機能および コード付けされるポリペプチドは保存される）。他方、特定の座における配列を 同定しようと望む場合、ハイブリダイジング成分の高相補度性がデュプレックス を維持するのに必要なようにハイブリダイゼーション条件を修正する。ＶＮＴＲ 領域では、必要な配列相同性を決定するのにさらに考慮が必要である。コピー数 の変動はへテロ接合性にはかなり寄与するが、しばしば座におけるすべての反復 単位は同一でない。かくして、配列がわずかに異なる核酸断片はそれにもかかわ らず同一の座にハイブリダイズする。ここに、配列相同性はユニークＶＮＴＲ座 にハイブリダイズする核酸断片によって定義される。と言うのは、事実、本発明 のポイントはＶＮＴＲ座とその検出だからである。

ＶＮＴＲクローンはヒト・ゲノム地図に対して固定できる。連鎖分析および体細 胞ハイブリッドの使用を含み、いくつかの利用できるマツピング技術がある。多 くのＶＮＴＲクローンが連鎖分析によってマツプされ、すなわち大きな家系にお けるマーカーの遺伝を決定し、問題のマーカーの存在／不存在のパターンまたは サイズを同家系で従前に研究されている座のものと比較した。連鎖評価の能力は 個体家系内で実験した試料サイズおよび座の数とともに増加する。

もしパターンが完全に一致すると、係留（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）遺伝子とマーカ ーの密接な連鎖あるいは係留遺伝子とマーカーの同一性が推定できる。もしパタ ーンの一致が変動すると、部分的な連鎖マツプ距離が決定できる。１以上の係留 遺伝子を使用するのが好ましい。分離、連鎖分析およびそれらの処理の統計的基 礎の総説については、カバリース７オルツアおよびボドマー（Ｃａｖａｌｌｉ− ５ｆｏｒｚａ　＆　Ｂｏｄｍｅｒ）、ザ・ジェネティックス・オプ・ヒユーマン ・ポビュレーシ３ン（Ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｏｐｕ ｌａｔｉｏｎｓ）　（１９７１）参照。

体細胞ハイブリッドは遺伝子の染色体または染色体領域に対する迅速な位置決め に有用である。ワイスおよびグリーン（１＃ｅｉｓｓ　＆Ｇｒｅｅｎ）　、プロ シーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ　（１９６７）５８．１１ ０４゜異核共存体は、選択可能なマーカーを担持する染色体領域を除き、染色体 をランダムに分離する。かくして、各々が１またはそれ以上のヒト染色体を担持 する細胞系のパネルを維持することができる。パネルは、いずれの１の染色体で のシンテニーも決定可能なように配置する。該パネルは遺伝子の発現または遺伝 子の存在についてスクリーニングし、特定の遺伝子の組合せが確認される。体細 胞ハイブリッドを用いてＴＨＨ５９を染色体１７にマツプした。続いて、ＴＨＨ ５９およびＴＫＩの連鎖が家族実験で見い出された。加えて、ヒト染色体断片ま たは転座を担持するノ・イブリッド細胞系を得ることが可能である。もしそれら の再配置が同定されると、染色体領域に対する連鎖が可能である。染色体位置決 めについての同様の技術はフロー−ソーティラド（ｆ　ｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ） 染色体から得られたＤＮＡのパネルを用いることである。デベンら（Ｄｅａｖｅ ｎａｔ、　ａｌ−）　ｓコールド・スプリング・ハーバ−・シンプ・ファント・ パイオル（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ、　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　 Ｂｉｏｌ、）　（１９８６）家族実験はマツピングおよびクローン同定に特に価 値がある。拡大多世代家族の成員から株化した細胞系はＶＮＴＲＩ！！における 対立遺伝子に関するマツピングおよび参照試薬として役に立つ。かくして、大き な家系の選択された成員のうちの座における特異的対立遺伝子の遺伝は、その座 についてのクローン、そのクローンの誘導体、または該座における配列にハイブ リダイズする実質的配列相同性を有するクローンを識別する診断手段である。か かる細胞系はカムデン（Ｃａｍｄｅｎ）　、ニュージャージ州のヒユーマン・ジ ェ不ティック・ミュー’ｌ’、ｙトー４：ルーレポジタリー（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅ ｎｅｔｉｃ　Ｍｕｔａｎｔ　Ｃｅ１ｌＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）　、あるいはフラ ンス国、パリのＣＥＰＨから入手可能である。例えば、ファミリー（ｆａｍｉ　 Ｉｙ）　９８２　、ユタ・ベディグリー（ｔｌｔａｈ　Ｐｅｄｉｇｒｅｅ）　Ｋ 　１３３１は三世代家族を表し、細胞系は母方および父方祖父母、両親および９ 人の子供を含む１５人から株化した。継代クローン、クローンの新しい調製物ま たはもう１つの研究所に送られたクローンが特異性を維持することを確認するた めに、それをファミリー（ｆａｍｉｌｙ）９８２の細胞系ＤＮＡについてのプロ ーブとして用い、得られた断片パターンを、該家族成員自体から得られたＤＮＡ をもとのクローンで分析した場合に見い出されたマスターパターンと比較した。

本出願の日までで、本明細書中に詳細を示した目的に対して適当な４５のクロー ンが見い出された。クローンについての情報を第４表に掲げ、第５〜３４表にさ らに詳しく掲げた。第５〜３４表において、クローンがハイブリダイズする座の 名称を表の標題における括弧内に示す。例えば、第５表において、ｐＹＮＨ２４ は染色体２で見い出されるＤ２５４４座にハイブリダイズする。換言すると、ｐ ＹＮＨ２４のインサートはヒト染色体２のＤ２５４４座におけるゲノミックＤＮ Ａから由来した。代表的なＶＮＲＴクローンを有するイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌ ｉ）の試料はアメリカン・タイプ・カルチャー−コレクション（Ａｍｅｒｉｃａ ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ１１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　、メリーランド州、 ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉ１２ａ）　、パークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌａ ｗｎ　Ｄｒｉｖｅ）　ｌ　２３０１に寄託した。寄託は出願完成の目的のためで あり、本発明の範囲を寄託物質に限定する意図ではない。と言うのは、実施例に よってさらに説明される記載により、本発明の実施は十分に可能だからである。

培養物に対する機会は権限を与えられている特許および商標局長室によって決定 される者に対し出願の間に可能である。公衆に対する該培養物の入手可能性につ いてのすべての制限は本出願に対し特許が付与されると最終的に除去され、該培 養物は該特許の存続期間中は永久に入手可能である。万一いずれかの培養物が入 手不可能あるいは死滅したならば、再び寄託されるはずである。

第４表 クローン　ｌ素　財立這伝子　ＡＴＣＣ寄託日番号　（Ｂ／月／年） ｐＹＮＨ２４Ｈａｅｊ　３１　、　、　５７５７０　１−４−８１−４−８７ｐ ｃ　Ｈａｓｌ　＞２０　．５９３７２　１４−４−８８ｐＹＮＺ２２　Ｈｉｎｆ 　ｌ　＞１０　５７５７４　ｌ−４−８７ｃＥＦＤ６４　Ｈｉｎｆｌ　＞１０　 ５７６５０　１ｌ−６−８７ｐＪｃ２３．１　）１ｉｎｆ　Ｉ　７　５７６５６ 　１ｌ−６−８７ｃＹＮＡ１３　Ｍｓｐｌ　＞１０　５９３６４　１４−４１４ −４−８８ｐＣＲｓａｌ　＞１０　５９６８２　１３−１２１３−１２−８８ｐ ＥＫ　Ａｌｕｌ　８　５７５５４　ｌ−４−８７ｐＪｃＺ１６．２　Ｈｉｎｆｌ 　＞１０　５７６５８　１ｌ−６−８７ｐＪＣＺ６７　Ｒｓａｌ　＞１０　５９ ３６２　１４ｉ−８ｌ４１−８８ｐ　Ｈａｅｌ　＞　１０　５９３６６　１４− ４−１４−４−８８ｐ　Ｈａｅｌ　）２０　５７５７８　１−４１−４−８７ｐ ＣＴａｑｌ　＞１０　５９３６８．　１４−４１４−４−８８ｐＣＰｓｔｌ　＞ １０　５９３７０　１４−４−１４−４−８８ｐｃ　Ｐｖｕｌ　＞１０　５９６ ８０　１３−１２−８８ｃＥＦＤ５２　Ｐｖｕｌ　＞１０　５９３７ｊ１４−４ −８８ｐＥＦＤ１３９　Ｐｓｔｌ　＞１０　５９６８８　１３−２１３−２２− ８８ｐＲＰｖｕｌ　＞ｔｏ　５７５６４　、１−４−１−４−８７ｐ　１８　Ｈ ｉｎｆ　Ｉ　１７　５９６８８　１３−１２−８８ｐＥＦＤ１２６．３　Ｈｉｎ ｆｌ　６　５７６２４　１１−６１１−６−８７ｃＣＰｓｔｌ　＞７　５．９６ ９０　、　１３−１２−１３−１２−８８ｐ　Ｈｉｎｆｌ　７　５９６８６　１ ３−１２−８８ｃＹＮＡ４　、Ｍｓｐｌ、　、＞７　５９６７２　１３−１２１ ３−１２−８８ｐ　Ｈｉｎｆｌ　６　５９６７４　１３−１２１３−１２−８８ ｐ　Ｐｓｔｌ　、　８　、５９２７８　２９（−８８ｃＴＢＱ７　Ｔａｑｌ　８ 　．５９６７６、　１３（２−８８ｃＫＫＡ３９　Ｒｓａｌ　７　５９６７８　 １３−１２−８８ｐＹＮＺ２１　、　Ｍｓｐｌ　、　８　５９６８４　１３−１ ２−８８ｐＴＨＨ３３Ｒｓａｌ　＞１０　５９６７０　１３−１２−８８ｐＴＨ Ｈ５９Ｐｖｕｌ　６　５７５５６　１−４−８７１−４−８７ＣＭｓｐｌ　＞１ ．０　５９６９２　１３−１１３−１２−８８ｃ　６７８８１　２−２２−２− ８９ｃ］４　６７８８１　２−２−８２−２−８９ｃ　６７８８１　２−２−８ ２−２−８９ｃ　６７８８］　２−２−８２−２−８９ｃ　６７８８１　２−２ −８９２−２−８９ｃ　６７８８１　２−２−８９２−２−８９ｃ　６７８８１ 　２−２−８９２−２−８９ｃ　６７８８１　２−２−８９２−２−８９ｃ　６ ７８８１　２−２−８９２−２−８９ｃ　６７８８１　２−２−８９２−２−８ ９ｃ　６７８８１　２−２−８９２−２−８９ｃ　６７８８１　２−２−８９２ −２−８９ｃ　６７８８１　２−２−８９２−２−８９ｃ　６７８８１　２−２ −８９第５表 源／記載：ＨＢＶ−２オリゴヌクレオチドによって単離したｃＹＮＨ２４からの ２．０ｋｂＭｓｐＩ断片をｐＵｃ１８のＡｃｃＩ部位に継代クローン化した。

生型性：　Ｍ　ｓ　ｐ　Ｉは１．０〜５．Ｏｋｂ間のバンドで〉３０の対立遺伝 子ＶＮＴＲＮＴＲ金型性する。Ｔａｑｌ、Ｂｇｌｌ［、ｐｖｕＩ［、ＰｓｔＩお よびＢａｍＨＩもまた該生型性を検出する。Ｒｓａｌに関しては生型性的でない 。

頻度：　Ｍ　ｓ　ｐ　Ｉで、９７％へテロ接合性が１２０の非類縁白色人種で観 察された。

染色体位置決め：その領域にまたがることが公知の座（Ａ　Ｐ　ＯＢ。

Ｄ２Ｓ６）での多数点連鎖分析によってＹＮＨ２４は染色体２に帰属された。

メンデル性遺伝：Ｍｓｐｌ　ＲＦＬＰの共優性分離が４４の三世代家族で１！察 された。

他の注釈：ＲＦＬＰは通常のハイブリダイゼーションおよび洗浄緊縮下で観察さ れた。Ｊ）ＹＮＨ２４はＥｃｏＲＩおよびＨ４ｎｄｌ［［についての単一の部位 を含有し；ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩに２重消化により２．７および２．１　ｋ 　ｂの２種の断片を生じ；Ｂｇｌｎ消化により３．６ｋｂおよび１．ｌｋｂ断片 を生じ；ＰｖｕＩ［により、２．３．１．７および０．８ｋｂの３種の断片が生 じる。

対立遺伝子　鼠！ Ｈａｅｍ　Ｏ，５〜６．Ｏｋｂ　ｌ　Ｏ，００５２０，００５ ３０，０１４ ４０，００５ ５０，００９ ６０，０４５ ７０，０４１ ｓ　ｏ、ｏ　５　ｇ ９　０．０５９ １０　０．０６８ １３　０．００５ １４　０．０５９ １５　０．０４５ １６　０．０２７ １７　０．０７３ １８　０．０５０ １９　０．０９１ ２０　０．０４５ ２１　０．０３２ ２２　０．０５５ ２３　０．０５５ ２４　０．０２３ ２５　０．００９ ２６　０．０１４ ２８　０．０１８ ２９　Ｑ、０Ｉ４ ３０　０．００９ □ 第６表 源／記載：ｐＵＣ１８のＡｃｃＩ部位に挿入されたミオグロビン−２オリゴヌク レオチドによって単離した２、２ｋｂＭｓｐｉ断片。

多塵性：ＨａｅＩ［［は〉２０の対立遺伝子多塵性を検出する。

頻度：Ｈｉｎｆ　Ｉで、８４％へテロ接合性が１２０の白色人種で観察された。

染色体位置決め：染色体１４に帰属された。

メンデル性遺伝：共優性分離が６０の三世代家族で観察された。

対立遺伝子　鼠策 Ｈｉｎｆｌ　１．５−９．５ｋｂ　ｌ　Ｏ，０１３５０，０１３ ６’０．０１３ ９　０．０３１ １０　０．００４５ １１　０．０３１ １２　０．０１３ １３　０．０２２ １４　０．０１８ １５　０．０２２ １６　０．０４５ １７　０．０４０ １８　０．０３１ １９　０．００４５ ２０　０．０５８ ２１　０．０３６ ２２　０．０６７ ２３　０．０３６ ２４　０．０６３ ２５　、０．０９９ ２６　０．０７６ ２７　−０．０５８ ２８　０．０７６ ２９　０．０１３ ３０　０．００９ ３１　０．０３１ 第７表 源／記ｌ：ゼーターグロビンオリゴヌクレオチドによって単離したｃＹＮＨ２２ からの２．７ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片をｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位に継代クロ ーン化した。

多塵性：　Ｍ　ｓ　ｐ　Ｉは０．５および１．３　ｋ　ｂ間のバンドで１０以上 の対立遺伝子ＶＮＴＲＮＴＲ全型性するａＴａｑＬＲｓａｌ。

ＢａｍＨｌ、Ｐｓ　ｔ　ＩおよびＨＩｎｄＤＩもまた多塵性を検出する。

ＢｇｌｌｒおよびＥｃｏＲＩは最適には多を性を解像しない。

頻度：Ｈｉｎｆ　Ｉで、８６％へテロ接合性が１２０の非類縁白色人種で観察さ れた。

染色体位置決め：その領域にまたがることが公知の座（Ｄ　１７　Ｓ１１ＭＹＨ ２、Ｄ１７Ｚ１）での多数点連鎖分析によって座は染色体１７ｐに帰属された。

メンデル性遺伝：共優性分離が３０の三世代家族で観察された。

他の注釈：ＲＦＬＰは通常のハイブリダイゼーシヨンおよび洗浄条件下で観察さ れた。ｐＹＮＺ２２はＨｉｎｄｌｌＩ、ＥｃｏＲｌｌｉよび５ａｌＩについてユ ニーク部位を含有する。ＰｓｔＩは４．３ｋｂおよび２．７ｋｂ断片を遊離する 。コスミッドライブラリーの独立したスクリーニングにより、ｃＪｃＺ１６．２ が同定され、これは引き続いてｐＹＮＺ２２と実質的な配列相同性を有すること が示Ｈｉｎｆｒ　Ｏ，５−２，０ｋｂ　ｌ　０．００５２　０．００９ ３　０．０４５ ４　０．０５０ ５　０．０４１ ６　０．０５０ ７　０．０７２ ８　０．０３２ ９　０．０１８ １０　０．０１８ １１　０．０１４ １２　０．０９９ １３　０．２５２ １４　０．１６２ １５　０．０９４ １６　０．０３６ 第８表 染色体３上のＶＮＴＲクローンｃＥＦＤ６４（Ｄ３Ｓ４２およびＤ３Ｓ４６） 源／記載：ＨＢＶ−３オリゴヌクレオチドによってｃＥＦＤ６４を単離した。

生型性：ＡＩｕｌは０．５および２．５ｋｂ間のバンドで９の対立遺伝子ＶＮＴ ＲＮＴＲ全型性するａ　Ｒｓａｌ、、ＨａｅＩ［［、Ｐｓｔｌ、ＥｃｏＲＩ、Ｂ ａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩ［［およびＰｖｕｌ［もまた生型性を同定する。Ｂｇｌｌ ｌについては冬型性的でない。

頻度：Ｒｓａｌで、８５％へテロ接合性が８０の非類縁白色人種で観察された。

染色体位置決め：以前その染色体にマツプされたＡＰＯＤでの連鎖分析によって ＥＦＤＡ６４は染色体３に帰属された。

メンデル性遺伝：Ｒｓａｌ　ＲＦＬＰの共優性分離が４０の三世代家族で観察さ れた。

他の注釈：ＲＦＬＰは通常のハイブリダイゼーシミンおよび洗浄条件下で観察さ れた。ｃＥＦＤ６４の２種のＴａｑｌインサート断片をｐＵｃ１８に継代クロー ン化した。それらはｐＥＦＤ６４．１（Ｄ３Ｓ４２、ＡＴＣＣ＃５９３５４．１ ４／４／８８）およびｐＥＦＤ６４．２　（Ｄ３５４６、ＡＴＣＣ＃５７６５Ｑ 、１１／６／８７）と指称する。共にＶＮＴＲ座にハイブリダイズする。

対立遺伝子　旌艮 ＨｉｎｆＩ　１．０−５．５ｋｂ　１　０．００４４　０．００４ ５　０．２１１ ６　０．０３９ ７　０．００９ ８　０．００９ ９　０．００４ １０　０．４０５ １２　０．００４ １３　０．００４ １４　０．００４ １５　０．００４ １６　０．００４ １７　０．０９５ 第９表 源／記載：ゼーターグロビンオリゴヌクレオチドによって単離されたｃ　ＪＣＺ ３からの４．５ｋｂＰｓ’ｔｒ断片をｐＵｃＩ８のＰｓｔ１部位に継代クローン 化した。

生型性：ＨｉｎｆＩは１．４−４−Ｏｋｂ間のバンドで〉　１０の対立遺伝子Ｖ ＮＴＲＮＴＲ金型性する。Ｍｓｐｌ、Ｔａｑｌ、ＲｓａＩ、ＢｇｌｌＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｐｓ　ｔ　ＩおよびＰｖｕ　ｎもまた生型性を同定する。

頻度：Ｈｉｎｆｌで、８４％へテロ接合性が１２０の非類縁白色人種で観察され た。

染色体位置決め：その領域にまたがることが公知の座（ＬＤＬＲ。

ＡＰＯＣ２）での多数点連鎖分析によってＪＣ２３，１は染色体１９に帰属され た。

メンデル性遺伝：ＨｉｎｆＩ　ＲＦＬＰの共優性分離が５４の三世代家族で観察 された。

他の注釈：ＲＦＬＰは通常のハイブリダイゼーションおよび洗浄緊縮下で観察さ れた。

対立遺伝子　龍 Ｈｉｎｆｌ　１．５−４．５ｋｂ　１　０．００５９　０．２９２ １２　０．０５３ １３　０．０３１ １４　０．０５０ １５　０．０８４ 第１０表 源／記載：ヒト・ゲノミックコスミッドライブラリーからのＹＮＨ２４−類縁オ リゴヌクレオチド（ＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＧＮＮＮＴＡＣＡ）によってｃＹＮＡ １３を単離しｔ；。

多形性；Ｍｓｐｌは２．０ｋｂおよび７．Ｏｋｂ間のバンドで２０以上の対立遺 伝子多型性を同定する。Ｒｓａｌ、Ｔａｑｌ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩおよびＰｖ ｕｌ［もまた生型性を検出する。

頻度二〇７％へテロ接合性が１０６の非類縁白色人種で観察されｔ；。

染色体位置決め：その領域にまたがることが公知の座（ＮＲＡＳ。

ＰＧＭＩ、ＲＨ）での多数点連鎖分析によって座は染色体１ｑに帰属された。

メンデル性遺伝：共優性分離が５３の三世代家族で証明された。

他の注釈：ＲＦＬＰは全ヒトＤＮＡでの競合ハイブリダイゼーションの後観察さ れた。ＢａｍＨＩでのｃＹＮＡ１３の消化により、■８．０．５．０および４． １ｋｂの断片が生じる。

対立遺伝子　組 ＡｌｕＩ　１．５〜１３．ｏｋｂ　ｌ　Ｏ，０２９２０，１００ ３０，１５０ ４０，１６３ ５０，１５８ ６０，１１０ ７０，０６７ ８０，０４８ ９０，０５２ １００，０２９ １１０，０２４ １２０，００５ １３０，０１９ １４０，０１４ １５０，００５ １６０，００５ １７０，０１４ ２８０，０［）９ 第１１表 １１！／記腋：ミオグ口ビン−２オリゴヌクレオチドによって単離されたｃＣＭ Ｍ８６からの４．３ｋｂＭｓｐｌ断片をｐＵｃ１８のＡｃｃＩ部位に継代クロー ン化した。

生型性：Ｈ１ｎｆ　Ｉは１．Ｏｋｂおよび３．５ｋｂ間のバンドで１０以上の対 立遺伝子多型性を同定する。ＨａｅＤＩ、Ｔ　ａ　ｑ　Ｉ　５Ｍ５ｔ１．Ｒｓａ Ｉ、およびＢｇｌｆｆもまた生型性を検出する。

ＰｓｔＩについては生型性的でない。

頻度＝９１％へテロ接合性が６０４の非類縁白色人種で観察された。

染色体位置決め：その領域にまたがることが公知の座（Ｄ１７Ｓ１、ＭＹＨ２、 Ｄ１７Ｚ１）での多数点連鎖分析によって座は染色体１７に帰属された。

メンデル性遺伝：共優性分離が５０の三世代家族で観察された。

他の注釈：　ＲＦＬＰは通常のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で観察 された。コスミッドＣＭＭ７３の継代クローンはｐＣＭＭ８６との実質的な配列 相同性を有することが示された。ライブラリーにおける貫刺性の例。

第１２表 源／記載：ｃＥＫＭＤＡ２の３．５ｋｂ　ＲｓａＩ断片をｐＵＣ１８のＨｉｎｃ Ｉ［部位に継代クローン化した。

多形性：Ｈｉｎｆｒは０．８１．５ｋｂ間のバンドで〉　１０の対立遺伝子多型 性を同定する。Ｔａｑｌ、Ｒｓａ　Ｉ、ＢｇｌＩ［、Ｐｓｔｌ、ＥｃｏＲＩ、Ｂ ａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩ［ｒおよびＰｖｕＩＩもまた生型性を検出する。

頻度：８９％へテロ接合性が１０２の非類縁白色人種で観察された。

染色体位置決め：ＨＢＺＰ１での連鎖によって染色体１６に帰属された。

メンデル性遺伝：共優性分離が５０の三世代家族で観察された。

ｍｌの注釈：ＲＦＬＰは通常のアッセイ条件下で観察された。

ｐＥＫＭＤＡ２１はＡｃｃＴ部位を含有せず；ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｎｌに ついてのユニーク部位を含有し；ＢａｍＨＩ消化により３．４ｋｂおよび２．９ ｋｂ断片を生じ；およびＰｓｔｌにより３゜４ｋｂおよび１．Ｏｋｂ断片が生じ る。

対立遺伝子　龍 Ａｌｕｌ　０．５−２５ｋｂ　１　．００５１２　．１９４ １３　．００５ 第１３表 源／記載：ゼーターグロビンオリゴヌククレオチドによって同定したｃＪＣＺ６ ７がらの３．４ｋｂ　Ｍｓ　ｔ　Ｉ断片をｐＵｃ１８のＡｃｃ１部位にクローン 化した 冬型性：Ｒｓａｌは３．０および６．Ｏｋｂ間のバンドで１０以上の対立遺伝子 を同定する。Ｍｓｐｌ、ＰｓｔｌＳＥｃｏＲＩｓＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩ［、Ｐｖ ｕＩ［およびＴａｑｌもまた多を性を検出する。

頻度：　Ｍ　ｓ　ｐ　Ｉで、８３％へテロ接合性が５７の非類縁白色人種で観察 された。

染色体位置決め：その領域にまたがることが公知の座（ＣＯＬＩＡ２、ＴＣＲＧ ）での多数点連鎖分析によってＪＣＺ６７は染色体７に帰属された。それは７ｑ 上でＹＮＢ３．ｌに対して〜３０ｃｍ遠位である。

メンデル性遺伝：Ｒｓａｌ多を性についての共優性分離が２９の三世代家族で観 察された。

他の注釈：　Ｒ，Ｆ　Ｌ　Ｐは通常のハイブリダイゼーションおよび洗浄第１４ 表 染色体１３上のＶＮＴＲクローンｃＭＨ２４７（Ｄ１３Ｓ５２）源／記載：ＹＮ Ｚ２２オリゴヌクレオチドによってコスミッドを単離した。

多を性：Ｍｓ　ｔ　Ｉは１．５−３．Ｏｋｂ間のバンドで〉　ｌＯの対立遺伝子 ＶＮＴＲＮＴＲ金型性する。Ｔａｑ　Ｉ、Ｈａｅｌｌｌ、Ｒｓａｌ。

Ｐｖｕ　ｎ、ＥｃｏＲｌ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌＩ［もまた冬型性を検出 する。

頻度：Ｍｓｐｌで、８３％へテロ接合性が５７の非類縁白色人種で観察された。

染色体位置決め：その領域にまたがることが公知の座（Ｄ　１３　ｓ６、Ｄ１３ Ｓｌ、ＥＳＤ、Ｄｉ　３ｓ４）での多数点連鎖分析によってＭＨ２４７は遠位染 色体１３ｑに帰属された。それは１３ｑ上でｐ９Ａ７に対して〜３０ｃｍ遠位で ある。

メンデル性遺伝：共優性分離が５０の三世代家族で観察された。

他の注釈：　ＲＦＬＰは全ヒトＤＮＡでのハイブリダイゼーション下で観察され た。以下の酵素：ＨｉｎｄＩ［Ｉ−５，９ｋｂ　（ダブレット）、　４．４ｋｂ 、３．５ｋｂ、０．９ｋｂ；ＥｃｏＲＩ−８，２ｋｂ。

６．６ｋｂ、４．６ｋｂ、３．１ｋｂ　、およびＴａｑｉ−３，８ｋｂ。

２．０ｋｂ、１．８ｋｂ、１．５ｋｂ、１．２ｋｂでのｃＭＨｚ４７の第１５表 源／記載：ミオグロビンーｌオリゴを用いて単離したｃＭＬＪ１４からの２．４ ｋｂ　Ｍｓｐｌ断片をｐＵｃ１８のＡｃｃ１部位に継代クローン化した。

多を性：Ｒｓａｒは２−１３ｋｂ間のバンドで〉２０の対立遺伝子多型性を同定 する。ＭｓｐＩ、Ａｌｕｆ、Ｈａｅｎ［、ＢｇｌＩ［、Ｔａｑｌ、ＢａｍＨＩＳ ＥｃｏＲＩ、Ｈ４ｎｄＩ［［、ＰｖｕＩＩおよびＰｓｔＩもまた生型性を検出す る。

頻度：Ｒｓａｌで、９５％へテロ接合性が１２０の非類縁白色人種間で観察され た。

染色体位置決め：その領域にまｔ：がることが公知の座（ＰＩ、Ｄ１４ｓ１．Ｍ Ｈ２９、ＧＭ、Ｉ　ＧＨＣ）　テｔｙ＞多数点ｊｌｌｌ１分析ｉ：：　Ｊ：　ッ てＭＬＪ１４は染色体１４に帰属された。

メンデル性遺伝：生型性の共優性分離が５４の三世代家族で観察された。

他の注釈：　ＲＦＬＰは全ヒトＤＮＡでのハイブリダイゼーシミン下で観察され た。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌでのｐＭＬＪの消化により、各酵素のユニ ーク部位に合致する２、７ｋｂおよび２．４ｋｂ断片が生じる。

対立遺伝子　班艮 Ａｌｕｌ　１．０＝６．５ｋｂ　ｌ　Ｏ，０３１２０，００５ ３０，０２０ ４０，０４６ ５０，０１０ ６０，０２６ ７０，０３１ ８０，０１０ ９０，０２０ ｔｏ　０．０１０ 第１６表 源／記載：ミオグロビンーｌオリゴによって単離したｃＣＭＭ６からの４−Ｏｋ ｂＰｓｔＩ断片をｐＵｃ１８のＰｓｔＩ部位に継代クローン化した。

多属性：Ｔａｑｌは２．３および６．Ｏｋｂ間のバンドで１０以上の対立遺伝子 ＶＮＴＲＮＴＲ金型性する。ＭＳＩ）Ｉ、Ｒｓａｌ、ＰｖｕｌＩおよびＰ’ｓｔ ｒもまた同一の多属性を示す。Ｂｇｌｆｆについては生型性的でない。

頻度：Ｔａｑ　Ｉで、９０％へテロ接合性が７８の非類縁白色人種で観察された 。

染色体位置決め：その染色体上にあることが公知の座（Ｄ２０Ｓ１）での連鎖分 析によって座は染色体２０に帰属された。

メンデル性遺伝：共優性分離が４４の三世代家族で観察された。

他の注釈：　ＲＦＬＰはハイブリダイゼーションおよび洗浄の通常の条件下で観 察された。

第１７表 染色体１４上のＶＮＴＲクローンｐＣＭＭ６６　（ＤＩ４Ｓ２２）源／記＊：ミ オグロビンー２オリゴによって単離したｃＣＭＭ６６からの４．８ｋｂ　Ｔａｑ ｌ断片をｐＵｃ１８のＡｃｃＩ部位に継代クローン化した。

多属性：Ｐａｔｌは４，０および６．Ｏｋｂ間の可変バンドで〉　ｌＯの対立遺 伝子ＶＮＴＲＮＴＲ金型性する。Ｒｓａｌもまた多属性を示す。Ｍ　ｓ　ｐ　Ｉ またはＴａｑｌについては多塑性的でない。

頻度：Ｐｓｔｌで、６７の非類縁白色人種における座のへテロ接合性が観察され た。

染色体位置決め：その領域にまたがることが公知の座（Ｄ１４Ｓ１、ＧＭＳＰ　 Ｉ）での多数点連鎖分析によってＣＭＭ６６は染色体１４ｑに帰属された。

メンデル性遺伝：Ｐｓｔｌ　ＲＦＬＰの共優性分離が３４の三世代家族で観察さ れた。

他の注釈：　ＲＦＬＰは全ヒトＤＮＡでのハイブリダイゼーションで観察された 。　・ 第１８表 源／記載：インシュリンオリゴヌクレオチドによって単離し、ｐＵｃ１８に継代 クローン化した。

生型性：Ｐｖｕｌｌは２．５およびＪｋｂ間のバンドで１０以上の対立遺伝子多 型性を明らかにする。

頻度２座は８３％のへテロ接合性を示す。

染色体位置決め：連鎖分析によってＣＭＩ３２７は染色体１７にマツプされた。

ＣＭＩ３２７はＨｔＫ９、ＴＨＨ５９およびＡＣ２５６に連鎖を示した。

他の注釈：ＲＦＬＰは通常の条件下で観察された。

第１９表 源／記載：ＨＢＶ−４オリゴヌクレオチドによってコトミッドを単離した。

多を性：Ｐｖｕｎは５．０−１０．Ｏｋｂ間のバンドで＞１０の対立遺伝子ＶＮ ＴＲＮＴＲ金型性する。Ｍｓｐｌ、ＨａｅｌＩ［、ＡｌｕＩＳＴａｑＩ、Ｒｓａ ｌ、ＢｇｌｌｌおよびＰｓｔｌもまた生型性を検出する。

頻度：ＰｓｔＩで、９０％へテロ接合性が９６の非類縁白色人種で観察された。

染色体位置決め：その領域にまたがることが公知の座（Ｄ１７Ｚ１、ＴＫＩ、Ｔ ＨＨ５９）での多数点連鎖分析によってＥＦＤ５２は染色体１７ｑに帰属された 。

メンデル性遺伝：共優性分離が４８家族で証明された。

他の注釈：ハイブリダイゼーションに先立ち過剰のヒトＤＮＡでｃＥＦＤ５２を 予め結合させた。そうでなければ、ＲＦＬＰはノ１イ第２０表 源／記載：ＨＢＶ−３オリゴヌクレオチドによって得た１５ｋｂＰｖｕｌＩ断片 をｐＵｃ１８のＨ４ｎｃ１１部位に継代クローン化した。

生型性：ＰｖｕｆｆはＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩのごとく８の対立遺伝子多型性 を明らかにする。ＰｓｔＩで、バンドは５〜８ｋｂの範囲である。

頻度：座へテロ接合性は８５％である。

染色体位置決め：　Ｈ３Ａ２２に対する連鎖分析によってＥＦＤＩ３９をマツピ ングした。

第２１表 源／記載：ｃＲＭＵｌからのＢａｍ、ＨＩ−３ａｃＩ断片をｐＵｃ１８のＢａｍ ＨＩ−５ａｃｌ二重消化により、より大きな断片Ｉこ継代クローン化した。

生型性：Ｐｖｕｌ［は０．７　ｋ　ｂおよび１．３ｋｂ間のバンドで〉ｌＯの対 立遺伝子多型性を同定する。Ｔａｑ　Ｉはほとんど同様に働き、〉６の対立遺伝 子を２．２および２．７　ｋ　ｂ間に生じる。Ｍｓｐ■、ＲｌａＩ、ＢａｍＨＩ もまた生型性を検出する。ＰｓｔｌおよびＨ４ｎｄＩ［Ｉは生型性を適当には解 像しない。

頻度：Ｔａｑｒで、８５％へテロ接合性が９６の非類縁白色人種で観察された。

染色体位置決め：その領域にまたがることが公知の座（Ｄ１７Ｚ１、ＴＫ　ｌ５ ＴＨＨ５９）での多数点連鎖分析によって座は遠位染色体１７ｑに帰属された。

メンデル性遺伝：共優性分離が４８の三世代家族で観察された。

他の注釈：　ＲＦＬＰは通常のハイ・プリダイゼーション緊縮下で観第２２表 源／記載：オリゴヌクレオチド（ＧＴＧＴＧＴＧＴｆ；、ＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧ Ｔ）で単離したｃＭｃＴｌ１８からの３．１ｋｂ　ＰｓｔＩ断片をｐＵｃ１８の ＰｓｔＩ部位に継代クローン化した。

生型性：ＨＩｎｆｌは０．３ｋｂおよび２．５ｋｂ間のバンドで〉１０の対立遺 伝子ＶＮＲＴ多型性全型性する。ＲｓａＩ、Ｔａｑｌ。

ＭｓｐｌＳＰｖｕＩ［、Ｈａｅｎ［およびＰｓｔｌもまた多を性を検出する。

頻度：Ｈ４ｎｆｌで、９０％へテロ接合性が９０の非類縁白色人種で観察された 。

染色体位置決め：その領域にまたがることが公知の座での多数点連鎖分析によっ て座は遠位染色体１ｐに帰属された。

メンデル性遺伝：共優性分離が４５の三世代家族で観察された。

他の注釈：　ＲＦＬＰは通常のハイブリダイゼーションおよび洗浄のる件下で篩 富さね−ｆ− 第２３表 源／記載：ＨＢＶ−４オリゴヌクレオチドによって単離したｃＥＦＤ１２６から の４．２ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片をｐＵｃ１８のＡｃｃ！部位に継代クローン化し た。

多を性：ＴａｑＩはｔ−５−２，ｏｋｄ間の対立遺伝子で５の対立遺伝子ＶＮＲ Ｔ多型性全型性する。Ｂｇｌｌｌ、ＭｓｐＩ、Ｐｓｔｌ、Ｐｖｕｌ［およびＲｓ ａＩもまた多型性を検出する。

頻度：Ｔａｑ　Ｉで、７１％へテロ接合性がｉｌｌの非類縁白色人種で観察され た。

染色体位置決め：その領域にまたがることが公知の座（ＡＢＯ１ＡＢＬ％ＡＫＩ 、ＯＲＭ）　での多数点連鎖分析によってＥＦＤ１２６．３は遠位染色体に帰属 されｔ；。

メンデル性遺伝：共優性分離が５６の三世代家族で観察された。

他の注釈：ハイブリダイゼーションに先立ち、プローブを過剰のヒトＤＮＡと予 め連結させた。そうでなければ、ＲＦＬＰは通常のハイブリダイゼーションおよ び洗浄緊縮下で観察された。

第２４表 源／記載：ｃＣＭＭ７７はミオ−２オリゴヌクレオチドでスクリーニングするこ とによって得た。

多型性：Ｐｓｔｌは〉７の対立遺伝子ＶＮＴＲＮＴＲ全型性した。

Ｍｓｐｒ、ＴａｑＩ、Ｒｓａｌ、Ｈ４ｎｄｌ［ｒ、ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕ　Ｉ Ｉもまた多型性を検出する。

頻度２座のへテロ接合性は７４％である。

他の注釈：ＲＦＬＰは通常の条件下で観察された。

第２５表 源／記載：ノナマーコンセンサス配列を得るように配置したオリゴヌクレオチド を用いてｃＭｃＯＢ　ｌ　７を得た。

多を性ニアの対立遺伝子多型性がＨｉｎｆｌで観察された。

ＰｓｔＩは１．２ｋｂおよび２．ｌｋｂ間のバンドで多型性を明らかとした。

頻度：座は８９％のへテロ接合性を示す。

染色体位置決め二連鎖分析によってＭＣ０Ｂ１７は染色体１７に帰属された。該 座はＨｔＫ９、ＴＨＨ５９およびＡＣ２５６に連鎖第２６表 染色体２上のＶＮＴＲクローンｃＹＮＡ４　（Ｄ２Ｓ５０）源／記載：ヒト・ゲ ノミッタライブラリーからのＹＮＨ２４−類縁オリゴヌクレオチド（ＧＧＡＧＣ ＡＧＴＧＧＧＮＮＮＴＡＣＡ）でコスミッドを単離した。

多属性：Ｍｓｐｌは２．０および５．Ｏｋｂ間のバンドで１０以上の対立遺伝子 ＶＮＴＲＮＴＲ金型性する。ＡｌｕＩＳＨａｅＩ［［、Ｈｉｎｆ　Ｉ、Ｔａｑ　 Ｉ、ＲｓａＩ、ＢｇｌＩＩ、Ｐｖｕ　Ｉ［およびＰｓｔｌもまた多属性を同定す る。

頻度＝１２０の非類縁白色人種におけるペテロ接合性は８５％である。

染色体位置決め：その領域にまたがることが公知の座（ＣＲＹＧ。

Ｄ２Ｓ３）で多数点連鎖分析によってＹＮＡ４は染色体２ｑに帰属された。

メンデル遺伝：Ｍｓｐｌ　ＲＦＬＰの共優性分離が５３の三世代家族で観察され た。

他の注釈：全ヒトＤＮＡでの競合ハイブリダイゼーションの後、ＲＦＬＰが観察 された。

第２７表 源／記載：ＹＮＺ２２オリゴヌクレオチドで単離したｃＭＨ２ｌＯからの３．８ ｋｂＰｓｔｌ断片をｐＧＥＭ４のＰｓｔＩ部位に継代クローン化した。

多属性：Ｍｓｐｌは１．４−２．Ｏｋｂ間の対立遺伝子で５の対立遺伝子ＶＮＴ ＲＮＴＲ金型性する。ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｆ　１％ＨｉｎｄｎＩ、Ｐｓｔｌおよ びＰｖｕ　ＩＩもまた多属性を解像する。

Ｒｓａ　ＩおよびＴａｑｌは多属性を適当には解像しない。

頻度：：Ｍｓｐｌで、８３％へテロ接合性が７２の、非類縁白色人種で観察され た。

染色体位置決め：その領域にまたがることが公知の座（ＡＢＯ。

ＡＫＩ、ＡＢＬ）での多数点連鎖分析によってＭＨ２ＩＯは遠位染色体９ｑに帰 属された。

メンデル遺伝：Ｍｓｐｌ　ＶＮＴＲＮＴＲ多基性性分離が３１の三世代家族で観 察された。

多の注釈：ハイブリダイゼーションに先立ってプローブヲ過剰ノヒトＤＮＡと予 め連結させた。そうでなければ、ＲＦＬＰは通常のハイブリダイゼーションおよ び洗浄緊縮下で観察された。

第２８表 源／記載：ＹＮＺ２２オリゴヌクレオチドによって単離したｃＭＨ２Ｉ３からの ３−３ｋｂ　Ｐｖｕπ断片をｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　４のＨｉｎｃｌｒ部位に継代クロ ーン化した。

多梨性：ＰｓｔＴは１．６−２．３ｋｂ間の対立遺伝子で８の対立遺伝子ＶＮＴ ＲＮＴＲ多量性する。Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＲｓａｌおよびＴａｑｌもまた冬型性を 解像する。ＭｓｐＩは冬型性を適当には解像しない。

頻度：Ｐｓｔｌで、７８％へテロ接合性が７２の非類縁白色人種で観察された。

染色体位置決め：その領域にまたがることが公知の［！！（ＡＢＯ。

ＡＫＩ、ＡＢＬ）での多数点連鎖分析によってＭＨ２１３は染色体９ｑに帰属さ れた。

メンデル遺伝：Ｐｓｔｒ　ＶＮＴＲ多型性の共優性分離が３１の三世代家族で観 察された。

他の注釈：ハイブリダイゼーションに先立ってプローブを過剰のヒトＤＮＡと予 め連結させた。そうでなければ、通常のハイブリダ第２９表 源／記載：ヒト染色体１０およびＹを含有する体細胞ハイブリッドから得た。ハ イブリッドＤＮＡを５ａｕ３ＡＩで部分的に消化し、ｐＷＥ　ｌ　５のＢａｍＨ １部位に挿入シタ。

生型姓：　Ｍ　ｓ　ｐ　Ｉは２ｋｂおよび７ｋｂ間のバンドで〉２０の対立遺伝 子ＶＮＴＲ座を同定する。ＴａｑＩ、ＲｓａｌＳＢｇｌｌ［、ＰｓｔＩおよびＰ ｖｕ　Ｉ［もまた冬型性を検出する。

頻度：９６％へテロ接合性が６１の非類縁白色人種で観察された。

染色体位置決め：連鎖分析によって染色体１０ｐに帰属された。

メンデル遺伝：　ＲＦＬＰの共優性分離が３２の三世代家族で観察された。

他の注釈；全ヒトＤＮＡでの競合ハイブリダイゼーションの後、ＲＦＬＰが観察 された。

第３０表 源／記載：コンセンサスの後に配置されたオリゴヌクレオチド（ＧＧＧＴＧＧＧ ＧＴＧＧＧＮＮＮＮＮＧ）によってｃＫＫＡ３９をヒト・ゲノミックコスミッド ライブラリーがら単離した。

冬型性：ＭｓｐＩは２．０および４．Ｏｋｂ間のバンドで１０以上の対立遺伝子 ＶＮＴＲＮＴＲ金型性する。Ｈｉｎｆ１％Ｈａｅｎ［、ＡｌｕｌＳＴａｑｌ、Ｒ ｓａｌ、Ｐｓｔｌ、Ｐｖｕ］ＩおよびＢｇｌ■もまた多梨性を示す。

頻度２座のへテロ接合性は１２０の非類縁白色人種ににおいて８３％である。

染色体位置決め：その領域のまたがることが公知の座（ＤＩ４ＳＬ　ＧＭ、ＰＩ ）での多数点連鎖分析によってＫＫＡ３９は遠位染色体１４ｑに帰属された。

メンデル遺伝：　ＲＦＬＰＯ共優性分離が５０の三世代家族で観察された。

他の注釈：全ヒトＤＮＡプレハイブリダイゼーションおよび／嶌イブリダイゼー ション下でＲＲＦＬＰが観察された。

第３１表 源／記載：ｐＵＣ１８のＡ、　ｃ　ｃ　ｒ部位にクローン化したゼータ−グロビ ンオリゴヌクレオチドによって２．４ｋｂＭｓｐｌ断片を得た。

多基性：Ｍｓｐｌは０．８ｋｂおよび３．２　ｋ　ｂ間のバンドで〉１０の多基 性を同定する。ＴａｑＩ、ＡｌｕｌおよびＨｉｎｆｌもまた多基性を検出する。

ＲｓａＩについては冬型性的でない。

頻度＝１２０のアメリカ白色人種で７７％のへテロ接合性。

染色体位置決／）：ＹＮＺ２１は１９ｐ上でＤ１９ｓ２０およびＤ　１．９５２ １との連鎖を示す。

メンデル遺伝：共優性分離が６０の家族で観察された。

他の注釈：通常のアッセイ条件下でＲＦＬＰが観察された。ＹＮ第３２表 染色体ｌｑ上のＶＮＴＲクローンｐＴＨＨ３３（Ｄ　Ｉ　Ｓ　８１）源／記載： ＨＢＶ−２オリゴヌクレオチドで単離したｃ　ＴＨＨ３３からの５．５ｋｂ　Ｅ ｃｏＲＩ断片をｐＵｃ１８のＥｃｏＲ１部位に継代クローン化した。

多を性：ＲｓａＩは４．０ｋｂおよび６．５ｋｂ間のバンドで〉１０の対立遺伝 子ＶＮＴＲＮＴＲ多量性する。Ｔａｑ１％ＢｇｌｌＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、 ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＭｓｐｌおよびＨｉｎｄｎ［もまた多基性を検出する 。

頻度＝８５％のへテロ接合性が８２の非類縁白色人種で観察された。

染色体位置決め：その領域にまたがることが公知の座での多数点連鎖分析によっ て座は遠位染色体に帰属された。

メンデル遺伝：共優性分離が４１の三世代家族で観察された。

他の注釈：　ＲＦＬＰは通常のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で観察 された。

第３３表 源／記載：　ＨＢＶ−１オリゴヌクレオチドによって同定したｃＴＨＨ５９から の３．８ｋｂ　ＰｓｔＩ断片をｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位に継代クローン化し た。

多基性：Ｐｖｕｌｒは０．８ｋｂおよび１．８ｋｂ間のバンドで６の対立遺伝子 ＶＮＴＲＮＴＲ全型性する。Ｔｑｌもほとんど同様に３゜０−４．Ｏｋｂ間の対 立遺伝子で系を解像する。ＲｓａｌＳＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩもまた多基性を 検出する。ＢｇｌＩ［は多梨性的でない。

頻度：ｐｖｕｌ［で、７６％のへテロ接合性が１００の非類縁白色人種で観察さ れた。

染色体位置決め：座は、体細胞ハイブリッド分析によって染色体１７に、染色体 １７のその領域にあることが公知の座（ＴＫＩ）に対する多数点連鎖分析によっ て１７ｑに帰属された。

メンデル遺伝：　ＶＮＴＲ多を性の共優性分離が５０の三世代家族で観察された 。

他の注釈二通常のハイプリダイゼーシ３ン下でＲＦＬＰが観察さ第３４表 源／記載：ミオー１オリゴヌクレオチドを用いてｃＭＬＪ２０５を得た。

多基性＝ｌＯ以上の対立遺伝子多型性がＭ　ｓ　ｐ　Ｉ−消化ゲノミツクＤＮＡ で観察された。バンドは１．５ないし５．５ｋｂの範囲である。

頻度２座のへテロ接合性は８３％である。

他の注釈：通常の条件下でＲＦＬＰが観察された。

第３５表 源／記載：別のＧおよびＴ残基を含有するオリゴを用いてｃ　Ｍ　ＣＴ４、ｃＭ ｃＴ１４、ｃＭｃＴ１５、ｃＭＣＴ３２、ｃＭＣＴ９６、ｃＭｃＴ１０３、ｃＭ ｃＴ１０５、ｃＭｃＴ１１３、ｃＭｃＴ１１７、ｃＭｃＴ１２７、ｃＭＣＴｌ　 ２９、ｃＭｃＴ１３６、ｃ　Ｍ　ＣＴ１４４およびｃＭｃＴ１３４を得た。

頻度：各クローンは６座で高レベルのへテロ接合性を示した。

他の注釈：ｉｌｌ［単的な条件下でＲＦＬＰが観察された。ＭＣＴシリーズのク ローンは一般に２ｋｂ未満サイズの対立遺伝子を含有する本明細書中で用いるラ イブラリースクリーニング手順において、および一般にいずれのスクリーニング に関しても、実質的な配列相同性を有するクローンを得るのは珍しくはない。ラ イブラリーは１以上の細胞または染色体のＤＮＡから調製し、いくつかの配列は 偶然、配列自体の物理特性等のため、バンクにおいて十分にまたは過度５二表さ れ得る。（発明者らは、以前、宿主ｒｅｃＡ”宿主中に維持されたファージライ ブラリーにおける見掛は上少数のＶＮＴＲクローンおよびｒｅｃＡ−宿主に維持 されたコスミッドライブラリーにおける豊富なＶＮＴＲクローンについて言及し た。）結果は、クローンは正確な複製物であり得、少数の塩基変化に対する１つ を途いて非常に類似であり得、あるいはそれらは重複し得るということである。

単一の座に由来する実質的な配列相同性を有するクローンは、クローン相互のフ ィルターハイブリダイゼーション、配列データの比較、マツプ位置の比較、多世 代家族におけるクローン配列の共分離の発見等によって同定できる。いくつかの クローンは実質的な配列相同性を有することが判明し、事実、同一の座を同定す る。

例えば、ｐＣＭＭ７３およびｐＣＭＭ８６は共にＤ１７Ｓ７４にマツプされ、ｐ ＭＬＪ１４はｐＣＭＭｌ　０１と共分離する。

オリゴの範囲は、インシュリン、ゼータ−グロビン、またはミオグロビン近くの 、あるいはＨＢウィルスに類縁のＶＮＴＲ座のコンセンサス配列に関連する配列 に限定されないことが理解されるであろう。第一世代クローンからのコンセンサ ス配列をライブラリーからクローンをさらに得るだめのプローブとして用いるこ とができる。

例えば、ｐＹＮＨ２４のコンセンサスに基づき、オリゴでスクリーニングするこ とによってｃＹＮＡＩ３およびｃＹＮＡ４を得；ｐＮＹＺ２２のコンセンサスに 基づいてオリゴでｐＭＨ２ｌｏ％ｐＭＨｚ１３およびｐＭＨ２４７を得た。事実 、コンセンサス配列に対する実質的配列相同性を有するいずれのオリゴもライブ ラリースクリーニングに用いることができる。ｆｌｌｌのＧ８よびＴ残基よりな る２０ｍｅｒでのスクリーニングによってｐＭｃＴｌ１８を得た。ＹＮＨ２４１ ，８ｍｅｒと約５０％の相同性を有する１　８ｍｅ　ｒでのスクリーニングによ ってｃＫＫＡ３９を得た。

クローニングおよび遺伝子マツピング分野における当業者ならば、異なるクロー ンが単−座における冬型性性を検出できることをさらに理解できるであろう。例 えば、一対のＥｃｏＲ１部位がその断片の中心に直接タンデム反復１ｋｂを含有 する７ｋｂ断片を定めるならば、各側上で反復の両側に位置する３ｋｂの配列が ある。もしそれらのフランキング配列がユニークならば、各３ｋｂセグメント、 またはその部分は、ゲノミックＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した場合、同一の多を 性を検出するためのプローブとして使用できる。第３５表は本発明の特徴付けら れたクローンおよび該クローンが由来する遺伝子座を表す。表に注意した制限断 片今日までに観察された最も大きい対立遺伝子である。酵素および断片のサイズ の選択は制限的なことを意味しない。なぜならば、制＠部位は反復に関して非対 称に位置し得、あるいはより大きな断片を生じる多座の両側に部位が位置する他 の制限酵素が見い出され得るからである。

第２６表 クローン　座　制限酵素　断片 サイズ（ｋｂ） ｐＹＮＨ２４Ｄ２Ｓ４４　Ｐｖｕｎ　ｌ　３ｐｃＭＭ１０１　Ｄ１４ＳＩ３　Ｈ ｉｎｆｌ　９．５ｐＹＮＺ２２　Ｄ］７Ｓ３０　Ｔａｑ　Ｉ　３．３ｃＥＦＤ６ ４　Ｄ３Ｓ４２／３４６　Ｈｉｎｆｌ　５．５ｐＪｃＺ３．ｌ　Ｄ１９Ｓ２ＯＢ ａｍＨＩ　６ｃＹＮＡＩ３　ＤＩＳ７４　Ａｌｕ　Ｉ　１３ｐＣＭＭ８６　Ｄ１ ７Ｓ７４　Ｔａｑ　Ｉ　８．５ｐＥＫＭＤＡ２１　Ｄ１６Ｓ８３　Ａｌｕｌ　２ ５ｐＪｃＺ１６．２　Ｄ１７Ｓ３０　ＴａｑＩ　３．３ｐＪｃＺ６７　Ｄ７Ｓ３ ９６　ＥｃｏＲＩ　９ｃＭＨ２４７Ｄ１３Ｓ５２　Ｔａｑ　Ｉ　４ｐＭＬＪ１４ 　Ｄ１４Ｓ１３　Ｐｓｔｌ　１６．５ｐＣＭＭ６　Ｄ２０Ｓ　１９　Ｔａｑ　Ｉ 　６ｐＣＭＭ６６　ＤＩ　４Ｓ２２　Ｐｓ　ｔ　Ｉ　６ｐｃＭＩ３２７　ＤＩ７ 　ＰｖｕＩ［４ｃＥＦＤ５２　Ｄ１７Ｓ２６　ＰｖｕＩＩ　１０ｐＥＦＤ１３９ 　Ｄ２２　ＰｓｔＩ　８ｐＲＭＵ３　ＤＩ７Ｓ２４　Ｔａｑ　Ｉ　３．８ｐＭｃ Ｔｌ１８　ＤＩＳ８０　Ｈｉｎｆｌ　２．５ｐＥＦＤ１２６．３　Ｄ９Ｓ７　Ｔ ａｑｌ　２ｃＣＭＭ７７　ＰｓｔＩ　６ ｐｃＭＯＢ１７　ＤＩ７　Ｐｖｕｆｆ　４ｃＹＮＡ４　Ｄ２Ｓ５０　Ｈａｅｎ［ ６ｐＭＨ２ｌｏ　Ｄ９Ｓｌｌ　Ｍｓｐｌ　２ｐＭＨｚ１３　Ｄ９ＳＩ３　Ｐｓ　 ｔ　Ｉ　２．３ｃＴＢＱ７’　ＤＩ　０５２８　Ｔａｑ　Ｉ　７ｃＫＫＡ３９　 Ｄ１４Ｓ２３　Ｒｓａ　Ｉ　５．５ｐＹＮＺ２１　Ｄ１９　Ｍｓｐｌ　３．２ｐ ＴＨＨ３３ＤＩＳ８１　Ｒｓａｌ　６．５ｐＴＨＨ５９Ｄ１７Ｓ４　Ｔａｑ　Ｉ 　４ｃＭＬＪ２０５　Ｍｓｐｌ　４．５ 従って、Ｄ２Ｓ４４ＶＮＴＲコンセンサス配列を担持するあるいはＤ２Ｓ４４お よびＰｖｕ］Ｉ制限部位制限部心間列を担持する核酸を包含する、ｐＹＮＨ２４ によって認識されるＤ２３４４座を担持する１３ｋｂＰｖｕＩ［断片内に含有さ れるいずれのユニーク配列もその座に対するグローブとして働き得る。すべての 配列が遍在用途があるとは限らないことは当業者に明らかであろう。かくして、 Ｄ２Ｓ４４からの１２ｋｂである１３ｋｂＰｖｕｍ断片のユニーク配列クローン は、ゲノミックＤＮＡをｐｖｕｎで消化すると、その多基性を検出できるが、そ の座における４ｋｂまたはそれ以下のサイズのＶＮＴＲ含有断片を生じるＭｓｐ ｌでゲノミックＤＮＡを消化すると、Ｄ２Ｓ４４変異体を検出しないであろう。

好都合のハイブリダイゼーション速度のため反復自体のクローンは単一コピーの フランキングプローブよりも好ましいが、増幅法と組み合わせることによって、 単一コピーフランキングプローブは反復クローンと同様に有利となり得る。好ま しい増幅法はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）である（サカイら（Ｓａｋａｉ　ｅ ｔ、　ａｌ、）、サンエンス（ＳｃｉｅｎｃｅＸ　１９８５　）　２３０．１３ ５０）、該ＰＣＲＩまｉｎ　ｖｉｔｒ。

において定義された核酸断片を増幅する。力コくシて、必要なりＮＡはより少量 となり、あるいはこの場合は、反復に／＼イブリダイズする核酸断片を用いて得 たものと同程度に確実かつ迅速に、ＰＣＲ−増幅フランキングユニーク配列から のシグナルがノ＼イブＩノダイゼーションにより得られる。略言すれば、該手順 は、７ランキング断片の塩基配列および２０００塩基対ア、＜　−ト（ａｐａｒ ｔ）までの対向鏡上の配列に相補的なオリゴヌクレオチドの合成を必要とする。

変性−ハイブリダイゼーション−合成の反復サイクルによって、オリゴヌクレオ チド過剰において増幅が起こる。増幅された核酸断片（よ第１ノゴがハイブリダ イズする配列によって範囲が定められる。ムリスおよびアプローチ（Ｍｕｌｌｉ ｓ　＆　Ｆａｌｏｏｎａ）、メト・エンズ（Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ）　（１９８７） 、上５５１３３５・ 本明細書中に記載するＶＮＴＲクローンのさらなる利点番よ、座を用いるＰＣＲ 法を、２０００ｂｐ長以下、好ましくは１ｏｏｏｂｐ長以下の対立遺伝子を生じ る選択された制限酵素と組み合わせることによって得られる。該ＰＣＲはＤＮＡ のより小さい断片の増幅に十分に役に立つ。かくして、オリゴヌクレオチドは反 復のクラスターの各側の直ぐ両側にあるユニーク配列の後に配置し、対立する差 異は明らかにされた不在ハイブリダイゼーションであり得る。座持異的オリゴお よび十分な増幅により、電気泳動分離による臭化エチジウム−染色ゲル上にバン ドが明らかとされる。適当な条件下で末法による個体の遺伝的同定がＤＮをＡ抽 出した日のうちに得られる。

該ＰＣＲはｉｎ　ｖｉｔｒｏで標的ＤＮＡを増幅することによって感受性を促進 するが、別の方法は標的部位におけるより多くの標識を濃縮することによってシ グナルを促進することである。それは、例えば、多重レポーター（ｒｅｐｏｒｔ ｅｒ）分子をクローンに付着させることによって；標的配列に対して多重標識ク ローンを用いることによって；それらのアプローチを組み合わせることによって 、すなわち、標的配列に対して多重クローン上の多重レポーター分子によって； 標的配列にハイブリダイズする一次クローンに適合化させたユニーク配列に対し て特異的な標識二次クローンを使用することによって（デウンおよびハーフセル （Ｄｕｎｎ　＆　Ｈａ、５ｓｅｌｌ）、セル（Ｃｅｌｌ）　（１９７７）上１１ ２３）；あるいはハイブリッド化クローン、特にＱββレプリカ−用鋳型として 働く組換体ＲＮＡの増幅（チューら（Ｃｈｕ　ｅｔ、　ａｌ、）、ヌクレイツク ・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、）　（１９８６）１ 土、５５９１）によって達成できる。

ブランおよびハノセル（Ｄｕｎｎ　＆　Ｈａｓｓｅｌｌ）の間接的またはサンド イッチアッセイにおいて、例えば、ＹＮＨ２４配列およびＳＶ４０配列を含有す る二機能性クローンが得られる。該クローンはゲノミックＤＮＡにハイブリダイ ズし、高標識化！３Ｖ４０クローンでの引き続いてのハイブリダイゼーションに より結合分子を可視化する。標識クローンはそれ自体基質として働き得る。事実 、この結果、各々が１またはそれ以上のレポーター分子を担持するノーイブラド 化配列のネットワークが生じる。

該Ｑβレブリカーゼ系は、指数関数的反応機構で少数の鋳型鎖から多数の生成物 Ｒ，Ｎ　Ａ断片を合成するのに、ＲＮＡ一定方向化ＲＮＡポリメラーゼ、Ｑβレ プリカーゼの多産自動触媒能に頼る。ＲＮＡの百万倍増加は普通でなくはない。

Ｑβレプリコンへ挿入された外米性配列はゲノミック標的配列へのハイブリダイ ゼーションを可能とする。次いで、該レプリコンをＲＮＡポリメラーゼ反応で増 幅し、生成物ＲＮＡを可視化する。（リザルディら（Ｌｉｚａｒｄｉ　ｅｔ、　 ａｌ、）、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｂ、）　（１９８８）　６．１１ ９７）本発明の範囲内の個体または組織試料の同定を達成するには、注目する１ またはそれ以上の座を標準的なフィルターハイブリダイゼーション技術を用いて 分析する。前記したごとく、集団で頻繁に起こる複対立遺伝子を有するＶＮＴＲ 座が好ましい。

試験手順を開始するために、組織試料を得る。該試料はいずれのタイプの組織よ りなるものでもよいことが理解されるであろう。はとんどの適用については、血 液が選択した組織となろう。これは、父子鑑別等で当てはまろう。しかしながら 、皮膚、精液、毛髪および他の体液または組織を包含する他の組織も特定の目的 に許容される。本発明の方法を用い、試験手順を行うためには約１０ｐＱ以下の 血液が必要である。ＤＮＡは生きた、死んだまたは保存されているいずれの有核 細胞から得ることもできる。

該試験手順は、本質的に、組織試料中の細胞が溶解され、溶解された細胞から得 られたＤＮＡが単離され、制限酵素で切断されることを要する。ＶＮＴＲ座にお ける変異性はタンデム反復のコピー数の差異から生起するので、部位が反復の両 側にあるいずれの制限エンドヌクレアーゼも全型性を明らかにするであろうこと は理解されるであろう。本明細書中で記載した酵素は代表的なものであり、ＶＮ ＴＲクローンに′ついて用いることができる酵素の例を制限するものではない。

好ましい具体例において、部位が反復のクラスターに非常に近い制限酵素が望ま しい。その結果、アガロースゲル上で区別が容易なより小さい制限断片となる。

次いで、該ＤＮＡをゲルに適用し、広く知られかつ一般に受け入れられている手 順を用いて電気泳動を行う。次いで、該ＤＮＡを、それが単一鎖形態で存在する ように変性する。

この時点で、広く行われ、かつ当該分野で受入られているサザンの技術（ジャー ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、）　（１９７５）　９８．５０３）に従って、該ＤＮＡを膜に移す。

別法として、前記したＰＣＲＳＱβレプリカーゼまたは他の増幅手順を利用する ことができる。

かく単離し変性したＤＮＡを前記したタイプの１またはそれ以上のＶＮＴＲクロ ーンとハイブリダイズさせる。いくつかのかかるクローンを後記にて詳細に記載 する。洗浄に続き、膜フィルターのラジオオートグラフィーのごとき技術を用い て標識した核酸断片の位置を決定する。本明細書中では放射性同位元素標識を強 調するるが、他の方法による標識も許容される。蛍光染料またはビオチニル化ヌ クレオチドでの標識も放射性標識プロローブと同様に働く。ハイブリッド化クロ ーンが位置決定可能なことだけが必要である。

ハイブリッド化デュプレックスの特定の位置はＤＮＡの個々の特性に関する情報 を提供する。これは、後記にてさらに詳しく説明する第１図ないし第６図よりな るオートラジオダラムによって理解される。多重ＶＮＴＲ座についての多重クロ ーンを使用することによって、組織試料を得た個体の非常に正確な遺伝的同定を 提供することが可能となる。かくして、結果をその個体まｔ；は可能な親または 個体の子孫と比較して、個体のみならず個体の親子関係を同定することが可能と なる。

本発明は実際上の確実性をもって親子関係を決定できる。多重ＶＶＮＴＲ座の多 重クローンを用いることができる。選択した多座は集団で高頻度で起こる複対立 遺伝子を有する。かくして、複数のクローンを使用することによって、同一デー タを生じる２の個体の可能性が実質的に零になる。

組織試料を特別の個体と結び付けることを望む場合、同技術を用いる。例えば、 本発明を用いて組織または体液の試料が犯罪現場で見い出されると、その試料を 正確に特定の個体に結び付けることができる。

同様に、骨髄移植においては、個体の癌性細胞が再生を開始したか否かを決定す るのが望ましい。かくして、細胞を取り出し、本発明の方法に従って分析する。

骨髄からの結果が患者からのものと一致するならば、癌性細胞は再出現している 可能性がある。同様に、骨髄からの結果が宿主に一致しなしならば、移植されれ た細胞のみが存在することが明らかである。

多数の他の適用も可能であり、そのうちのいくらかを前記した。

これらは、例えば、双子における一卵性対二卵性、可能な器官提供者の同定、法 医学適用、病的遺伝子の同定、およびゲノムのマツピングを包含し得る。

罠亙！ 以下の実施例は本発明の詳細な説明するものである。実施例において、マニアテ ィスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｓｔ、　ａｌ、）、前掲；メト・エンズ（Ｍｅｔｈ 　Ｅｎｚ）、前掲；ワイマンおよびホワイト（Ｗｙｍａｎ　＆　Ｗｈｉｔｅ）、 前掲；およびリットおよびホワイト（Ｌｉｔｔ　＆　Ｗｈｉｔｅ）、前掲、に記 載されているごとき標準的な手順に従った。

実施例１ インシュリン、ゼータ−グロビン、またはミオグロビンに連鎖したＶＮＴＲ座と して挙動することが公知の、あるいはＶＮＴＲ座として潜在的に挙動する十分な 配列相同性を有する遺伝子の配列に従つてオリゴヌクレオチドを合成した。標準 的な手順に従ってオリゴの末端標識を行った。

コスミッドライブラリーの１ないし２ゲノム当量（すなわち、７５０００〜１５ ００００）を平板培養し、ナイロンフィルターに移した。ハイブリダイゼーショ ン緩衝液は５ｘ　ＳＳＣ，０，０５Ｍトリス−ＨＣＱ、ｐＨ７，４、ｌｘデン／ Ｓルト溶液および０．０１ｍｇ／ｍＯ酵母ｔＲＮＡを含有していた。配列および 各オリゴについてのアッセイ条件を第１表に掲げた。

６の非類縁個体のゲノミツクＤＮＡを用いて、オリゴヌクレオチドによって確認 される３７２のコスミツドを多基性について試験した。まず、Ｍｓｐ　Ｔ、Ｔａ ｑ　Ｌ　Ｒｓａ　Ｉ、ＢａｍＨｒ、ＢｇｌＩＩ、Ｐｓ　ｔ　Ｉ、ＥｃｏＲＩ、Ｈ ｉｎｄＩＩ［、ｐｖｕＩＩ、Ｈ＋　ｎ　ｆ　Ｉ　５ＨａｅＩ［ｌおよびＡｌｕＩ を包含する多種類の制限エンドヌクレアーゼのいずれかで試料を消化した。目標 は、最多数の対立遺伝子、ならびに最少数の、従って最も正確に解像されるＤＮ Ａ断片を明らかにすることにあった。標準的なプロトコルに従って、制限酵素消 化、アガロースゲル電気泳動、ナイロン膜へのＤＮＡプロッティング、ＶＮＴＲ クローンの放射性同位元素標識、およびフィルターハイブリダイゼーションアッ セイを行った。第１図はオートラジオグラフの写しまたは代表凶なデータを記載 する。写真は全ニスミッドでのハイブリダイゼーションによって明らかとされた ＶＮＴＲ座の典型的なパターンを示す。

実施例２ 三世代家族でのＹＮＨ２４（Ｄ２Ｓ４４）におけるＶＮＴＲ対立遺伝子の分離を 第２図に表す。標準的な手法に従って、末梢血液から調製したＤＮＡ試料につい て行った。Ｍ　ｓ　ｐ　Ｉで制限消化を行った。各消化の３マイクログラムをレ ーン当りに負荷し、断片を分離した。通常のオートラジオグラフィーにより、ク ローンによって検出された対立遺伝子が明らかにされた。パターンは８の対立遺 伝子がその家族に存在する共優性形質の分離に合致した。

実施例２はｐＹＮＨ２４によって検出された遺伝子のメンデル遺伝を示す。対立 遺伝子、従ってそれらが収容された染色体領域は家族全体は明瞭に追跡できる。

例えば、母方祖母は対立遺伝子１および５を有するＹＮＨ２４においてへテロ接 合性である。対立遺伝子ｌは彼女の娘によって引き継がれており、娘はそれを４ 人の彼女の娘に渡していた。もしＹＮＨ２４座に強固に連鎖した支配的な病的遺 伝子があると、該病気はそれらの各個体で発現されることが理解されるであろう 。

実施例３ 実施例３は選択されたＶＮＴＲ座の対立遺伝子頻度のキャラクタライゼーション を示す。予備実験において大多数の対立遺伝子を検出したクローンを他の制限酵 素で再び試験した。非類縁個体からのＤＮＡ試料を製造業者の指示に従って切断 した。該消化したＤＮＡ試料をアガロースゲル上の電気泳動に付し、ナイロン膜 に移した。

第３図はＪＣＺ１６．２およびＥＦＤ５２に関するデータを表すオートラジオダ ラムを含む。該データは、それらのクローンによって同定されたＶＮＴＲ座は複 対立遺伝子を担持することを明らかに示す。従って、同定された複対立ＶＮＴＲ 座は遺伝的同定および親子鑑別で有用であり得る。

実施例４ 実施例４はＶＮＴＲ座を用い、いかにして親子関係を決定できるかを示す。最初 に、親子指標および親子の可能性を決定する。Ｘは主張された父親が子供の生物 学的父親である偶然に等しい。Ｙはランダムな個人が子供の生物学的父親である 偶然に等しい。得られた視性指標（Ｐ　ｒ　＝Ｘ／Ｙ）は主張された父親が生物 学的父親である確度の測定値である。視性のベイズの確率は通常０．５であるア プリすり確率である。かくして、数式はＰ　Ｉ　＝　１／　（１＋Ｙ／Ｘ）と読 むべく修正される。（母親は生物学的母親であると仮定した。）本実施例におい ては、本発明のＶＮＴＲクローンを用いて、母親、子供、および２人の推定父親 をスクリーニングした。特に、ｐＹＮＨ２４、ｐＹＮＨ２２、ｐｃＭＭＩｏｌ、 ｐＪｃＺ３．ｌ、８よびｐＥＫＭＤＡ２１を用いた。それらのクローンを用いて 得たデータを以下にまとめる。（ＸおよびＹ値を対立遺伝子のメンデル遺伝にに 基づいて計算する。対立遺伝子は同定用にナンバーを振り、かくして、母親はＹ ＮＨ２４座における対立遺伝子３３および８６についてヘテロ接合性であった。

） １）預　象毀上　Ｋ１Ｉ　及　Ｉ ＹＮＨ２４３３８６３３３５３５３５３３３５１，００，０３３１ＹＮＺ２２　 ４　９　４　３　３　３　３　５　１．０　０．＋６９ＣＭＭＩＯＩ　９　２８ 　９　４　４　２０　２２　２８　０．５　０．０２７ＪＣＺ３．１　１６　１ ２　１６　９　９　９　１６　１６　１．０　０．２９２ＥＫＭＤＡ２１　４　 ８　４　４　４　９　８１０　も５　岨ｙ但累積値　０．２５０　１．０１ｘ １０−＠ 父親１がかなりの確実性でもって子供の父親であると決定される。

子供の左欄の対立遺伝子は母親から遺伝したものであだ。右欄における各対立遺 伝子は子供の父親から遺伝したものであった。かくして、ＹＮＨ２４については 、子供は母親から３３を、父親から３５を受け継いだ。父親１は３５についてホ モ接合性であり、父親２はその座において２の異なる対立遺伝子を担持する。

前記した計算を適用し、視性指標はＸ／Ｙ＝２．４６ｘｌＯ’である。父性の確 率は従って９９．９９９６％である。父親２が現実の父親である確率は実質的に 零である。

従って、本発明は精密かつ正確な親性同定能を提供することは理解されるであろ う。

実施例５ ＶＮＴＲクローンを用いて強姦事件における被疑者が実際に主張された強姦者で ある得るか否かを決定した。

強姦の調べに際し、精液の試料および毛髪の試料が回収された。

後日、被疑者が逮捕された。毛髪、精液、および血液の試料を本明細書中に記載 したプロトコルに従ってスクリーニングした。クロー７１）ＭＬＪ１４、ｐＹＮ Ｈ２４、ｐｃＭＭｌｏｌ、およびｐＪＣＺ３．１を使用した。スクリーニングか らの結果を以下のチャートに、ＤＮＡクローンによって明らかにされた特定の対 立遺伝子に対応する数でもって示す。

ＭＬＪ１４　２６　７　１　２９　１２９ＹＮＨ２４１０１４２２３１２２３１ ＣＭＭＩＯＩ　１８　１１．　２４　５　２４　５ＪＣＺ３．ｌ　５　１５　１ １　１６　１１　１６前記試験の結果に基づくと、精液試料は被疑者に由来する が、毛髪はそうではないと結論できる。精液試料の各対立遺伝子は被疑者の血液 試料に一致するが、毛髪試料からの対立遺伝子は被疑者に一致しないことが解る 。従って、被疑者は事実強姦者であると決定できる。

かくして、本発明は法医学適用で用いるクローンおよび方法を提供することが理 解されるであろう。

実施例６ 癌性細胞が骨髄移植受容者の骨髄で再生したか否かを決定するのが望ましいこと である。ＶＮＴＲクローンはその点で有用である。

決定を下すために、血液試料および骨髄試料を得た。クローンｐＥＫＭＤＡ２１ 、ｃＥＦＤ６４、ｃ　ＹＮＡ　１３、およびｐＣＭＭｌｏｌを用いて２の試料の ＤＮＡをスクリーニングした。以下の結果が得られた。

叉児見　骨髄 ＥＫＭＤ２１　８　１２　１６　１２ ＥＦＤ６４．２　５　１７　．１０　５ＹＮＡ１３　５　４　２　１７ ＣＭＭＩＯＩ　２５　１１　２　２２ 結果より、骨髄において癌性細胞の有意な再生はないと結論できる。

実施例７ クローンｐＪｃＺ３．１８よびｆｌｌ［酵素Ｈｉｎｆｌを用いて、脱性試験を行 った。ＤＮＡの試料を母親、胎児および父親から得た。

脱性試験の結果を第４図に示す。左のレーンは母親のＤＮＡの分析からの結果で あり、中央のレーンは胎児の分析の結果であり、右のレーンは父親の分析の結果 である。第４図より、母親および父親からのＶＮＴＲ対立遺伝子は胎児に遺伝さ れたことが解る。

実施例８ クローンｐＪｃＺ１６．２および制限酵素ＨｉｎｆＩを用いて、脱性試験を行っ た。ＤＮＡの試料を母親、胎児および父親から得た。

脱性試験の結果を第５図に示す。左のレーンは母親のＤＮＡの分析からの結果で あり、中央のレーンは胎児の分析の結果であり、右のレーンは父親の分析の結果 である。第５図より、母親および父親双方からのＶＮＴＲ対立遺伝子は胎児に遺 伝されたことが解る。

実施例９ クローンｐＹＮＨ２４および制限酵素Ａｌｕｌを用いて、脱性試験を行った。Ｄ ＮＡの試料を母親、胎児および父親から得た。脱性試験の結果を１ｇ６図に示す ６左のレーンは母親のＤＮＡの分析からの結果であり、中央のレーンは胎児の分 析の結果であり、右のレーンは父親の分析の結果である。第６図より、母親およ び父親双方からのＶＮＴＲ対立遺伝子は胎児に遺伝されたことが解る。

実施例１０ タンデム反復を含有しないフランキングクローンは、制限断片がユニークなフラ ンキング配列および反復のクラスターを含有する場合、ＶＮＴＲ座を検出できる 。ｐｃＭＭｌｏｌおよびｐＣＭＭ６６は同一のコスミッドから由来したものであ った。ｐＭＬＪｌ４は別のコスミッドから由来したものであった。マツピングデ ータにより、３のクローンが染色体１４でンンテニツク（ｓｙｎｔｅｎｉｃ）で あり、事実、クローンは三世代家族系で共分離されたことが明らかにされた。引 き続いての制限マツピングおよびクローンの配列決定により、ｐＣＭＭｌｏｌ８ よびｐＭＬＪｌ、４の同一性が明らかにされた。それらのクローンのインサート は反復配列を担持する。しかしながら、ｐＣＭＭ６６は反復配列を担持せず、タ ンデム反復のクラスターの両側に位置する領域から生起した。ｐＣＭＭｌ　０１ およびｐＭＬＪｌ４はＭｓｐｌ−消化ゲノミツクＤＮＡにおける冬型性を検出す るるが１．ｐＣＭＭ６６は検出しない。理由はｐＣＭＭ６６によって認識される フランキング配列はより小さなＭＳｐＩ　ＶＮＴＲ−含有断片の外側にあるから である。

Ｈ３Ａ１４（ヒト染色体１４）のイデオグラムおよび性−特異的連鎖地図を第７ 図に示す。１４ｑ３２．１−ｔｅ　ｌに対する技術を組み合わせることによって １０の遺伝子をマツプした。遺伝子ＰＩおよびＭＣ０Ｃ１，２は、図に示された 以上の遺伝子を含有するらしいその領域の範囲を定める。遺伝子間の相対的距離 は遺伝子間の交差の確度に関連する。遺伝子が近くなれば、それだけそれらの遺 伝子間の交差はより少なくなる。ｐＭＬＪによって明確にされるＤ１４Ｓ２２は ＰＩから１９ｃｍおよびＣＭＭ６２から２ｃｍである。

ボトムは、家族内の変化する組み合わせにおけるそれらの遺伝子の分離分析から 決定した、最もありそうな遺伝子の順序を示すダイアダラムである。隣接遺伝子 を架橋する比は示された遺伝子順序が正しいという見込みを表す。

実施例１２ Ｈ５Ａ１７のイデオグラムおよび性−特異的連鎖地図を第８図に示す。この場合 、遺伝子座は特定の領域に制限されない代わりに、染色体の長さに沿って散在す る。かくして、１４４−Ｄ６　（２１）は１７ｐ１３にマツプされ、３．６（１ １）は動原体領域にマツプされ、ＫＫＡ３５　（１４）は１７ｑの末端小粒近く にマツプされる。

５（７）ＶＮＴＲ座−Ｄ１７Ｓ３０　（ＴＮＺ２２）　、Ｄｉ　７３７４　（Ｃ ＭＭ８６）　、Ｄ１７Ｓ４　（ＴＨＨ５９）　、Ｄｉ　７Ｓ２６　（ＥＦＤ５２ ）およびＤ　１．７２４　（ＲＭＵ３）が染色体１７にマツプされる。

実施例１３ ＤＮａｓｅｌ欠失断片のシリーズを産生し、サンガーら（Ｓａｎｇｅｒｅｔ、　 ａｔ、）、前掲、の鎖停止法によって対向鎖の配列決定を行うことによってＣＭ ＭＩＯＩ対立遺伝子の一部の塩基配列を得た。以下のものが１の断片からの一部 の配列である：ポリリンカー　−ＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＧＣＮＮＣＴＣＣＡＣ ＣＴＣＡＧＣＣＣＣＣダーラインを引き、スペースを置いた。該単位は１４また は１５の塩基を有し、いくつかの七ツマ−がさらなるジヌクレオチドを含有する ことに注意されたい。前記した断片および他の断片から帰結される相補鎖のコン センサスは５　’　−ＧＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＡ−３’　である。

実施例１４ ＥＦＤ１２８．３対立遺伝子の一部塩基配列は以下の通りである二フランキング −ＧＡＣＣＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡ　ＡＧＴＣＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＡ　ＧＡＣＣ ＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡ　ＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡ　ＧＡＣＣＡＡＧＧＧＧ ＡＡＧＡ　ＧＧＴＧＴＴＴＧＴＧＧＧＧＧＡ　ＧＡＣＣＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡ　 ＧＧＣＮＴＧＧＧＧＧＴＧＧＡ、　、　、。その座における反復は明らかな階級 類の２８−３０ｂｐ単位である。各単位はそれ自体２の単位、前記スペースによ って範囲を定めた保存された１４ｂｐ領域、およびスペースおよびアンダーライ ンで範囲を定めた発散した１４−１６ｂｐ領域である。１の単位の保存された領 域の例は：５’−ＧＡＣＣＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡである。その単位の隣接発散領 域はＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡ−３である。

！粒 本発明の範囲内に入るＶＮＴＲクローンのほとんどは特定のオリゴヌクレオチド プローブでのハイブリダイゼーションによってコスミッドライブラリーから単離 された。オリゴヌクレオチドの例はゼータ−グロビン、ミオグロビン、およびイ ンシュリン近くの、およびＢ型肝炎ウィルスに関連したＶＮＴＲ座のコンセンサ ス配列に基づくものを含む。

本発明のクローンはゲノム内の特異的座を同定する。集団で頻繁に起こる複対立 遺伝子を有する部位を同定するクローンを選択することによって、系が容易に開 発され、それにより、個体またはその一部をかなりの確実性をももって同定でき る。例えば、各対立遺伝子が約０．１の頻度を有する汎生殖個体群における５の 異なる１０対立遺伝子座を用い、特異的パターンを持つ個体の頻度は３００万に おいて１以下であることが予測される。その結果、誤った同定は起こりそうにな い。

遺伝的測定の正確な方法はいくつかの異なる状況で有用性を有する。前記したご とく、特異的遺伝的同定は父性関係を決定するのに有用である。本発明の系が適 用される他の領域は双子における一卵性対二卵性の決定、骨髄移植体のモニター 、法医学、病的遺伝子の同定および遺伝子マツピングを含む。それらの状況の各 々において、かなりの確実性をもっての同定が提供される。

本発明の方法および組成物は種々の具体例の形態に一体化でき、そのうち少数の みを前記したことは理解されるであろう。本発明はその精神または本質的特徴を 変えることなく他の特異的形態に具体化できる。記載した具体例は例示的なもの であって制限的なものではない。従って、本発明の範囲はこれれまでの記載より もむしろ添付の請求の範囲によって示される。請求の範囲と同等の意味および範 囲内にあるすべての変化は本発明の範囲内であると理解されるべさである。

ＦＩＧ、３ｂ １３□ ＦＩｏ、　７ 国際調査報告 ＋ｍ−−ｎｅｍＡ−両−＋−ｅ−ｓ、、ＰｃＴ／ＵＳ　８９１００６００国際調 査報告 ＵＳ　８９００６００ Ｓ＾　２７１７８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）ＶＮＴＲ配列との実質的な配列相同性を有するオリゴヌクレオチドを 合成し； （ｂ）核酸ライブラリーをスクリーニングしてＶＮＴＲ配列を含有するクローン を得；次いで、 （ｃ）単一の多型性座にハイプリダイズする工程（ｂ）のクローンを同定する工 程よりなることを特徴とするＶＮＴＲ配列を含有する核酸断片の単離法。 ２．さらに、工程（ｃ）からのクローンから、多型性座にハイブリダイズする配 列を担持する核酸断片を単離し、継代クローン化することよりなる請求の範囲第 １項記載の方法。 ３．工程（ｃ）を： （ｃ１）工程（ｂ）で同定されたクローンを標的集団の個体のパネルからのＤＮ Ａのプローブとして用い；（ｃ２）工程（ｃ１）のＤＮＡパネルにおける２以上 の対立遺伝子を持つ座にハイブリダイズする工程（ｃ１）のクローンを単離する ことによって行う請求の範囲第１項または第２項記載の方法。 ４．オリゴヌクレオチドの配列がゼーターグロビン座、インシュリン座、ミオグ ロビン座、Ｂ型肝炎ウイルスのＸ−遺伝子領域および請求の範囲第１項記載の方 法によって単離したＶＮＴＲ−含有核酸断片よりなる群から選択される座に連鎖 したＶＮＴＲ座のコンセンサス配列に基づく前記請求の範囲いずれかの１つの項 に記載の方法。 ５．該オリゴヌクレオチドが少なくとも１４のヌクレオチドよりなる前記請求の 範囲のいずれか１つの項に記載の方法。 ６．さらに、断片を染色体座にマッピングすることによって、該核酸断片の単一 座へのハイブリダイゼーションを確認することよりなる前記請求の範囲いずれか １つの項に記載の方法。 ７．該オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチドの少なくとも５０％がグアニンであ って、ヌクレオチドの少なくとも３５％がチミジンまたはウリジンであるように 配置する請求の範囲第１項記載の方法。 ８．該オリゴヌクレオチドがその配列内にノナマーＧＮＮＮＧＴＧＧＧまたはオ クタマーＧＮＮＧＴＧＧＧいずれかを含有し、ここにＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣで ある請求の範囲第１項記載の方法。 ９．ＶＮＴＲ配列との実質的な配列相同性を有するオリゴヌクレオチドでゲノミ ックライプラリーをスクリーニングすることよって単離したものであって、単一 の多型性座にハイプリダイズし、該座が少なくとも５の対立遺伝子を有すること を特徴とする核酸断片。 １０．該座が少なくとも１０の対立遺伝子を有する請求の範囲第９項記載の核酸 断片。 １１．該座が少なくとも１５の対立遺伝子を有する請求の範囲第９項記載の核酸 断片。 １２．該座が少なくとも２０の対立遺伝子を有する請求の範囲第９項記載の核酸 断片。 １３．該オリゴヌクレオチドの配列がゼーターグロビン座、インシュリン座、ミ オグロビン座、Ｂ型肝炎ウイルスのＸ−遺伝子領域および請求の範囲第９項記載 のＶＮＴＲ−含有核酸断片よりなる群がら選択される座に連鎖したＶＮＴＲ座の コンセンサス配列に基づく請求の範囲第９〜第１２項いずれかの１つの項に記載 の核酸断片。 １４．該オリゴヌクレオチドを、ヌクレオチドの少なくとも５０％がグアニンで あってヌクレオチドの少なくとも３５％がチミジンまたはウリジンであるように 配置する請求の範囲第９項記載の核酸断片。 １５．該オリゴヌクレオチドがその配列内にノナマーＧＮＮＮＧＴＧＧＧまたは オクタマーＧＮＮＧＴＧＧＧいずれかを含有し、ここにＮがＡ、Ｔ、ＧまたはＣ である請求の範囲第９項記載の核酸断片。 １６．クローン、該クローンのＶＮＴＲ−含有断片、該ＶＮＴＲ−含有断片に対 する実質的な配列相同性を有する核酸断片および該クローンによって特異化され た単一座にハイブリダイズできる核酸断片よりなる群から選択され、該クローン がｐＹＮＨ２４、ｐＣＭＭ６、ｐＣＭＭ６６、ｃＣＭＭ７７、ｐＣＭＭ８６、ｐ ＭＬＪ１４、ｃＭＬＪ２０５、ｐＹＮ２２２、ｐＪＣＺ３．１、ｐＪＣＺ１６． ２、ｐＪＣＺ６７、ｐＹＮＨ２１、ｐＣＭＭ１０１、ｃＥＦＤ６４、ｃＥＦＤ５ ２、ｐＥＦＤ１３９、ｐＥＦＤ１２６．３、ｐＴＨＨ３３、ｐＴＨＨ５９、ｃＭ ＨＺ４７、ｐＭＨＺ１０、ｐＭＨＺ１３、ｃＹＮＡ１３、ｃＹＮＡ４、ｃＫＫＡ ３９、ｐＭＣＴ１１８、ｐＣＭＩ３２７、ｐＭＣＯＢ１７、ｃＭＣＴ４、ｃＭＣ Ｔ１４、ｃＭＣＴ１５、ｃＭＣＴ３２、ｃＭＣＴ９６、ｃＭＣＴ１０３、ｃＭＣ Ｔ４１０５、ｃＭＣＴ１１３、ｃＭＣＴ１１７、ｃＭＣＴ１２７、ｃＭＣＴ１２ ９、ｃＭＣＴ１３６、ｃＭＣＴ１４４およびｃＭＣＴ１６４よりなる群から選択 される請求の範囲第９項〜第１２項記載の核酸断片。 １７．該クローンがｐＹＮＨ２４、ｐＣＭＭ１０１、ｐＭＬＪ１４、ｐＣＭＭ６ ６、ｐＣＭＭ７３およびｐＣＭＭ８６よりなる群から選択される請求の範囲第１ ６記載の核酸断片。 １８．クローン、該クローンのＶＮＴＲ−含有断片、該ＶＮＴＲ該断片に対して 実質的な配列相同性を有する核酸断片および該クローンによって特異化された単 一座にハイブリダイズできる核酸断片よりなる群から選択され、ここに該クロー ンがｐＲＭＵ３、ｐＥＫＭＤＡ２１およびｃＴＢＱ７よりなる群から選択される 核酸断片。 １９．該クローンがｃＴＢＱ７である請求の範囲第１８項記載の核酸断片。 ２０．少なくとも２の核酸断片よりなり、各核酸断片がＶＮＴＲ配列との実質的 な配列相同性を有するオリゴヌクレオチドでゲノミックライブラリーをスクリー ニングすることによって単離され、該断片が単一の多型性座にハイブリダイズし 、該座が少なくとも５の対立遺伝子を有することを特徴とする個体同定用キット 。 ２１．該断片を一緒に混合した請求の範囲第２０項記載のキット。 ２２．該断片がｐＹＮＨ２４、ｐＣＭＭ６、ｐＣＭＭ６６、ｃＣＭＭ７７、ｐＣ ＭＭ８６、ｐＭＬＪ１４、ｃＭＬＪ２０５、ｐＹＮＺ２２、ｐＪＣＺ３．１、ｐ ＪＣＺ１６．２、ｐＪＣＺ６７、ｐＹＮＨ２１、ｐＣＭＭ１０１、ｃＥＦＤ６４ 、ｃＥＦＤ５２、ｐＥＦＤ１３９、ｐＥＦＤ１２６．３、ｐＴＨＨ３３、ｐＴＨ Ｈ５９、ｃＭＨＺ４７、ｐＭＨＺ１０、ｐＭＨＺ１３、ｃＹＮＡ１３、ｃＹＮＡ ４、ｃＫＫＡ３９、ｐＭＣＴ１１８、ｐＣＭ１３２７、ｐＥＫＭＤＡ２１、ｐＲ ＭＵ３、ｐＭＣＯＢ１７、ｃＴＢＱ７、ｃＭＣＴ４、ｃＭＣＴ１４、ｃＭＣＴ１ ５、ｃＭＣＴ３２、ｃＭＣＴ９６、ｃＭＣＴ１０３、ｃＭＣＴ１０５、ｃＭＣＴ １１３、ｃＭＣＴ１１７、ｃＭＣＴ１２７、ｃＭＣＴ１２９、ｃＭＣＴ１３６、 ｃＭＣＴ１４４、ｃＭＣＴ１６４、これらにハイブリダイズできる核酸断片およ びそれにより特異化された単一座にハイプリダイズできる核酸断片よりなる群か ら選択される請求の範囲第２０項または第２１項記載のキット。 ２３．（ａ）個体からＤＮＡの試料を得；次いで、（ｂ）それに請求の範囲第９ 項または１８項記載の核酸断片にハイプリダイズさせることによって該ＤＮＡを 分析する工程よりなることを特徴とする個体の同定方法。 ２４．さらに、未知の個体に由来するＤＮＡの試料を分析し、その結果を公知の 個体から得られたＤＮＡの分析結果と比較して両ＤＮＡ試料が同一個体起源であ るか否かを決定ことよりなる請求の範囲第２３項記載の個体の同定方法。 ２５．複数の核酸断片を利用する請求の範囲第２３項または第２４項記載の方法 。 ２６．該試料が血液試料および移植骨髄試料から単離したＤＮＡよりなる群から 選択される請求の範囲第２３項記載の個体の同定方法。 ２７．該試料が犯罪現場に残された血液試料および組織試料から単離したＤＮＡ よりなる群から選択される請求の範囲第２３項記載の個体の同定方法。 ２８．（ａ）組織試料を得； （ｂ）該組織試料からＤＮＡを単離し；（ｃ）単離したＤＮＡに、該ＤＮＡがＤ ＮＡ制限部位で切断されるように制限酵素を添加し； （ｄ）得られたＤＮＡ断片を分面し； （ｅ）ＤＮＡ断片が−本鎖形態で存在するようにそれらを変性し（ｆ）該ＤＮＡ 断片を標識した−本鎖核酸断片でハイプリダイズし、該断片は請求の範囲第９項 または第１８項記載の核酸断片よりなり；次いで、 （ｇ）該標識核酸断片の位置を検出する工程よりなることを特徴とする個体の遺 伝的同定方法。 ２９．該組織試料が毛髪、精液、筋肉、皮膚、または内部器官よりなる群から選 択される請求の範囲第２８項記載の個体の遺伝的同定方法。 ３０．該組織試料が血液である請求の範囲第２８項記載の個体の遺伝的同定方法 。 ３１．（ａ）ヒトＤＮＡの試料を得、該試料をその制限部位で切断し； （ｂ）得られたＤＮＡ断片を分画し； （ｃ）該ＤＮＡ断片を請求の範囲第９項または第１８項記載の標識核酸断片でハ イプリダイズし；次いで、（ｄ）プローブの位置を検出する工程よりなることを 特徴とするヒトＤＮＡ試料を用いるヒトの同定方法。 ３２．（ａ）可能な親から単離したＤＮＡの試料を得；（ｂ）可能な子供から単 離したＤＮＡの試料を得；（ｃ）該ＤＮＡを請求の範囲第９項または第１８項記 載の核酸断片でハイブリダイズすることによって各ＤＮＡ試料内の少なくとも１ の特異的ＶＮＴＲ座について分析し；次いで、（ｄ）可能な子供のＶＮＴＲ座が 可能な親から受け継いだものであるか否かを決定するために分析結果を比較する 工程よりなることを特徴とする親子関係の決定方法。 ３３．複数の核酸断片を利用する請求の範囲第３２項記載の方法。 ３４．（ａ）ヒト核酸ライブラリーのクローンを選択し；次いで、（ｂ）単一の 多型性座にハイブリダイズする工程（ａ）のクローンを同定する工程よりなるこ とを特徴とするＶＮＴＲ配列を含有する核酸断片の単離方法。 ３５．該ライブラリーが全ヒト・ゲノミックＤＮＡを担持する請求の範囲第３４ 項記載の方法。 ３６．該ライブラリーがヒト染色体を分離した体細胞ハイブリッドからのＤＮＡ を担持する請求の範囲第３４項記載の方法。 ３７．該ライブラリーがヒト染色体のＤＮＡを担持する請求の範囲第３４項記載 の方法。 ３８．クローン類ｐＹＮＨ２４、ｐＣＭＭ６、ｐＣＭＭ６６、ｃＣＭＭ７７、ｐ ＣＭＭ８６、ｐＭＬＪ１４、ｃＭＬＪ２０５、ｐＹＮＺ２２、ｐＪＣＺ３．１、 ｐＪＣＺ１６．２、ｐＪＣＺ６７、ｐＹＮＨ２１、ｐＣＭＭ１０１、ｃＥＦＤ６ ４、ｃＥＦＤ５２、ｐＥＦＤ１３９、ｐＥＦＤ１２６．３、ｐＴＨＨ３３、ｐＴ ＨＨ５９、ｃＭＨＺ４７、ｐＭＨＺ１０、ｐＭＨＺ１３、ｃＹＮＡ１３、ｃＹＮ Ａ４、ｃＫＫＡ３９、ｐＭＣＴ１１８、ｐＣＭ１３２７、ｐＥＫＭＤＡ２１、ｐ ＲＭＵ３、ｐＭＣＯＢ１７、ｃＴＢＱ７、ｃＭＣＴ４、ｃＭＣＴ１４、ｃＭＣＴ １５、ｃＭＣＴ３２、ｃＭＣＴ９６、ｃＭＣＴ１０３、ｃＭＣＴ１０５、ｃＭＣ Ｔ１１３、ｃＭＣＴ１１７、ｃＭＣＴ１２７、ｃＭＣＴ１２９、ｃＭＣＴ１３６ 、ｃＭＣＴ１４４、ｃＭＣＴ１６４、これらにハイプリダイズできる核酸断片お よびそれにより特異化された単一座にハイプリダイズできる核酸断片よりなるク ローンセット。 ３９．該クローン類がｐＹＮＨ２４、ｐＣＭＭ６、ｐＣＭＭ６６、ｃＣＭＭ７７ 、ｐＣＭＭ８６、ｐＭＬＪ１４、ｃＭＬＪ２０５、ｐＹＮＺ２２、ｐＪＣＺ３． １、ｐＪＣＺ１６．２、ｐＪＣＺ６７、ｐＹＮＨ２１、ｐＣＭＭ１０１、ｃＥＦ Ｄ６４、ｃＥＦＤ５２、ｐＥＦＤ１３９、ｐＥＦＤ１２６．３、ｐＴＨＨ３３、 ｐＴＨＨ５９、ｃＭＨＺ４７、ｐＭＨＺ１０、ｐＭＨＺ１３、ｃＹＮＡ１３、ｃ ＹＮＡ４、ｃＫＫＡ３９、ｐＭＣＴ１１８、ｐＣＭＩ３２７、ｐＥＫＭＤＡ２１ 、ｐＲＭＵ３、ｐＭＣＯＢ１７、ｃＴＢＱ７、ｃＭＣＴ４、ｃＭＣＴ１４、ｃＭ ＣＴ１５、ｃＭＣＴ３２、ｃＭＣＴ９６、ｃＭＣＴ１０３、ｃＭＣＴ１０５、ｃ ＭＣＴ１１３、ｃＭＣＴ１１７、ｃＭＣＴ１２７、ｃＭＣＴ１２９、ｃＭＣＴ１ ３６、ｃＭＣＴ１４４およびｃＭＣＴ１６４である請求の範囲第３８項記載のク ローンセット。 ４０．ｐＹＮＨ２４、ｐＣＭＭ６、ｐＣＭＭ６６、ｃＣＭＭ７７、ｐＣＭＭ８６ 、ｐＭＬＪ１４、ｃＭＬＪ２０５、ｐＹＮＺ２２、ｐＪＣＺ３．１、ｐＪＣ２１ ６．２、ｐＪＣＺ６７、ｐＹＮＨ２１、ｐＣＭＭ１０１、ｃＥＦＤ６４、ｃＥＦ Ｄ５２、ｐＥＦＤ１３９、ｐＥＦＤ１２６．３、ｐＴＨＨ３３、ｐＴＨＨ５９、 ｃＭＨＺ４７、ｐＭＨＺ１０、ｐＭＨＺ１３、ｃＹＮＡ１３、ｃＹＮＡ４、ｃＫ ＫＡ３９、ｐＭＣＴ１１８、ｐＣＭＩ３２７、ｐＥＫＭＤＡ２１、ｐＲＭＵ３、 ｐＭＣＯＢ１７、ｃＴＢＱ７、ｃＭＣＴ４、ｃＭＣＴ１４、ｃＭＣＴ１５、ｃＭ ＣＴ３２、ｃＭＣＴ９６、ｃＭＣＴ１０３、ｃＭＣＴ１０５、ｃＭＣＴ１１３、 ｃＭＣＴ１１７、ｃＭＣＴ１２７、ｃＭＣＴ１２９、ｃＭＣＴ１３６、ｃＭＣＴ １４４、ｃＭＣＴ１６４、これらにハイブリダイズできる核酸断片およびそれに より特異化された単一座にハイブリダイズできる核酸断片よりなる群から選択さ れる少なくとも２のクローンよりなるクローンセット。 ４１．該クローンが５０以上のマップ単位またはＣＭアパート（ａｐａｒｔ）で ある請求の範囲第４０項記載のクローンセット。 ４２．１以下のクローンをいずれか１つの染色体アームにマップする請求の範囲 第４０項記載のクローンセット。 ４３．１以下のクローンをいずれか１つの染色体にマップする請求の範囲第４０ 項記載のクローンセット。 ４４．ｐＹＮＨ２４、ｐＣＭＭ１０１、ｐＭＬＪ１４、ｃＴＢＱ７、ｐＣＭＭ６ ６、ｐＣＭＭ７３およびｐＣＭＭ８６よりなる請求の範囲第４０項記載のクロー ンセット。 ４５．（ａ）ＶＮＴＲ座をクローン化し；（ｂ）反復クラスターの塩基対配列お よび該ＶＮＴＲ座における反復の該クラスターのすぐ両側の領域の塩基対配列を 決定し；（ｃ）該ブランキング領域の前列または増幅を可能とする該反復の配列 に相補的なオリゴヌクレオチドを合成し；（ｄ）複数の核酸断片間に反復の該ク ラスターおよび該アランキング配列を含有する断片を生じる制限エンドヌクレア ーゼで個体のゲノミックＤＮＡを消化し； （ｅ）該ゲノミックＤＮＡとともに該オリゴヌクレオチドを用いて該増幅を行い ； （ｆ）該複数の核酸断片を電気泳動によってサイズにより分離し；次いで、 （ｇ）該断片が可視化できるように該分離された核酸断片を処理する工程よりな ることを特徴とする個体の遺伝的同定方法。 ４６．該増幅を標的ゲノミック配列の量を増加させることによって行う請求の範 囲第４５項記載の方法。 ４７．標的ゲノミック配列の該増幅をポリメラーゼ鎖反応によって行う請求の範 囲第４６項記載の方法。 ４８．該ＶＮＴＲ座がＹＮＨ２４、ＣＭＭ１０１、ＹＮＺ２２、ＥＦＤ６４、Ｊ ＣＺ３．１、ＹＮＡ１３、ＣＭＭ７３、ＥＫＭＤＡ２１、ＪＣＺ１６．２、ＪＣ Ｚ６７、ＭＨＺ４７、ＭＬＪ１４、ＣＭＭ６、ＣＭＭ６６、ＣＭＩ３２７、ＥＦ Ｄ５２、ＥＦＤ１３９、ＲＭＵ３、ＭＣＴ１１８、ＥＦＤ１２６．３、ＣＭＭ７ ７、ＭＣＯＢ１７、ＹＮＡ４、ＭＨＺ１０、ＭＨＺ１３、ＴＢＱ７、ＫＫＡ３９ 、ＹＮＺ２１、ＴＨＨ３３、ＴＨＨ５９、ＭＬＪ２０５、ＭＣＴ４、ＭＣＴ１４ 、ＭＣＴ１５、ＭＣＴ３２、ＭＣＴ９６、ＭＣＴ１０３、ＭＣＴ１０５、ＭＣＴ １１３、ＭＣＴ１１７、ＭＣＴ１２７、ＭＣＴ１２９、ＭＣＴ１３６、ＭＣＴ１ ４４およびＭＣＴ１６４よりなる群から選択される請求の範囲第４６項記載の方 法。 ４９．ゲノミックＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化により該ＶＮＴＲ座が２ ０００塩基対未満のＶＮＴＲ−含有断片を生じる請求の範囲第４５項記載の方法 。 ５０．ゲノミックＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化により該ＶＮＴＲ座が１ ０００塩基対未満のＶＮＴＲ−含有断片を生じる請求の範囲第４５項記載の方法 。 ５１．ゲノミックＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化により該ＶＮＴＲ座が５ ００塩基対未満のＶＮＴＲ−含有断片を生じる請求の範囲第４５項記載の方法。 ５２．核酸断片の該処理が臭化エチジウムヘの暴露である請求の範囲第４５項記 載の方法。 ５３．該増幅を標的ゲノミック配列においてハイプリダイズする標識レポーター 分子の量を増加させることによって行う請求の範囲第４５項記載の方法。 ５４．標識レポーター分子の該増加をＱβレプリカーゼ反応によって行う請求の 範囲第５３項記載の方法。