CN114507724B - 一种检测人类红细胞Rh血型基因分型的引物组、试剂盒及应用 - Google Patents

一种检测人类红细胞Rh血型基因分型的引物组、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测人类红细胞Rh血型基因分型的引物组、试剂盒及应用，所述引物组的序列表如SEQ ID No.1‑9、SEQ ID No.10‑12或/和SEQ ID No.13‑15、SEQ ID No.16‑18或/和SEQ ID No.19‑21、SEQ ID No.22‑24或/和SEQ ID No.25‑27、SEQ ID No.28‑30、SEQID No.31‑33或/和SEQ ID No.34‑36、SEQ ID No.37‑72所示。引物经过了优化设计，具有相似的退火温度，能够实现所有引物在相同的PCR扩增条件下同时扩增，每个PCR反应体系的体积只有1.15μL，DNA模板只需5～10ng，大大增加了检测效率和反应灵敏度；应用该引物组进行检测，具有速度快、成本低、灵敏性高及易于实现多位点联合检测等优点。

Description

一种检测人类红细胞Rh血型基因分型的引物组、试剂盒及 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测人类红细胞Rh血型基因分型的引物组、试剂盒及应用。
背景技术
1939年，Levine与Stetson报告一例溶血反应：一孕妇发生死胎，产后输其丈夫的血，ABO相同血型，输血后发生急性溶血反应，并从其血中分离出抗其夫红细胞的抗体，此为人类发现的第一例Rh抗体。1940年，Landsteiner和Wiener发表了动物抗血清对人类红细胞的分型结果，被认为是第一篇有关Rh血型系统的报道。截止到目前由国际输血协会(ISBT)认可的红细胞血型系统共有43种。Rh血型系统是其中最复杂的血型系统，在输血医学中其重要性仅次于ABO血型系统，ABO和D抗原相配的输血原则为国际公认输血策略，Rh血型系统在输血医学、亲子鉴定、人类学研究、法医物证检验等层面也具有重要作用。至今已发现Rh血型系统的抗原60多个，但涉及临床问题的主要有5个抗原，即D、C、c、E、e及其相应的特异性抗体。5个抗原中以RhD抗原性最强，Rh抗原显示剂量效应，从遗传层面来说，同质结合子比异质结合子为强。有研究表明，C抗原存在时，D表达会减弱，这种现象被叫做“Ceppellini效应”。
人类RH基因位于1号染色体短臂上，即1p34—36.9。决定Rh抗原的基因有两组：RHD基因1992年被克隆出，主要编码D抗原，RHCE基因1990年被克隆出，主要编码C、c、E、e抗原，RHD和RHCE基因同源性高达96％以上，均可编码416个氨基酸，RHD和RHCE基因均有10个外显子，RHD基因第8、10外显子的编码序列与RHCE基因的相对应序列相同，RHD基因第3、4、5、6、7和第9外显子序列与RHCE基因有区别，此外两个基因在内含子中也存在一些碱基的差异。RHD基因全长约为57295bp，RHCE基因全长约为57831bp，两个RH基因紧密连锁，中间隔差约30kp，含有一个独立的小膜蛋白1基因(SMP1基因)，两个RH基因的3‘末端面对面，即尾对尾排列(5’RhD3’-3’RhCE5’)。RHD基因两端存在两个具有98.6％同源性的区域，即Rhesus盒子，其中位于RHD基因起始密码子5’端约4900bp处的Rhesus盒子称为upstream Rhesusbox，长约9142bp；位于RHD基因终止密码子3’端104bp处的Rhesus盒子称为downstreamRhesus box，长约9145bp，downstream Rhesus box位于RHD基因和SMP1基因中间。遗传学研究显示，基因的单个核苷酸的突变、插入和缺失都有可能引起阅读框架的移码突变，从而形成新的等位基因，而RHD基因和RHCE基因因为紧密连锁、反向排列且同源性极高，所以更利于发卡环的形成，更利于发生基因重排，因此经过交换重组形成了多种两个基因融合重组的等位基因。经过20多年的Rh基因座遗传多样性研究，Rhesus数据库中已经记录了超过500个RHD等位基因和150多个RHCE等位基因。
经研究发现，不同种族人群D抗原分布频率不同：85％欧洲人D抗原阳性，95％非洲人D抗原阳性，99.6％-99.9％中国人D抗原阳性。在D抗原阴性中最常见的分子机制是缺乏整个RHD基因，形成杂交的Rh盒子，即两端的Rhesus盒子基因部分缺失后融合形成一个单一的杂合的Rhesus盒子，称为hybrid Rhesus box，长约9147bp，这也是RHD基因全缺失的一大特征。此外，D抗原由许多抗原表位组成，具有高度构象性，不只是有简单的线性氨基酸残基组成。已有报道超过275种RHD等位基因编码的蛋白存在氨基酸的改变。这些等位基因可以造成许多D抗原表达的变异，在临床输血中可能遇到不同形式的D抗原变异红细胞，有些等位基因可以造成D抗原阴性表型。D变异型常被分成4种：弱D、部分D(包括category D)、Del和非功能性RHD等。中国人D变异型具有多态性：弱D表型中以弱D15型为主，即845G>A；部分D变异型以DVI Type 3为主，即RHD-CE(3-6)-D，Del表型中以RHD(K409K)型为主，即1227G>A。非功能性RHD变异主要以RHD-RHCe(2-9)-RHD为主。因多种D变异型在临床血清学检测中易被鉴定为RhD阴性，而有些错误鉴定往往是致命性的，比如DVI Type 3的女性产生的抗-D会导致致命的溶血性疾病。
RHCE基因在一种蛋白质上同时编码C/c和E/e抗原。C和c抗原相差4个氨基酸，但主要区别在于发生在第2个细胞外环上的第103号位点上，C抗原第103号位氨基酸是丝氨酸，c抗原第103号位氨基酸是脯氨酸；E和e抗原相差1个氨基酸，区别在于发生在第4个细胞外环上的第226号位点上，E抗原第226号位氨基酸是脯氨酸，e抗原第226号位氨基酸是丙氨酸。
人类Rh血型检测方法主要有两种：一是血清学方法，二是基因分型方法。目前常规检测方法是传统的血清学方法，可以检测D、C、c、E、e五种抗原，但该方法易受抗原活性、抗原多态性、抗体特异性、自身抗体、不规则抗体、微生物、疾病等因素影响，使得表型鉴定不准确，且在异常表达和遗传学分析时受到无法克服的局限性。随着分子生物学技术的发展，Rh血型基因分型的方法也越来越多，目前最主要的方法有限制性片段长度多态性PCR法(PCR-RFLP)、单链构象多态性PCR(PCR-SSCP)、特异序列引物PCR法(PCR-SSP)、实时荧光定量PCR法(RT-PCR)、测序法等。PCR-SSP方法需要进行多管扩增，多条带电泳，还存在判读易混淆所导致分型错误的分险。PCR-SBT分型方法最大的缺陷是操作过程非常繁琐，工作量大，难以实现高通量操作。Rh基因不同区域的扩增有不同的扩增条件，不仅需要的样本量大，同时增加了试剂耗材的消耗，且需要占用更多的仪器设备资源。
在本申请之前申请人已经申请了专利号为CN201911420155.X，名称为一种检测人类红细胞ABO血型基因分型的引物组、试剂盒及应用，用于检测人类红细胞ABO血型基因分型。在此基础上，为了实现人类红细胞Rh血型基因分型，研发一种简单、便捷、快速、高通量的精准分型、易于判读的Rh血型基因分型产品。
发明内容
本发明为了实现能够快速、低成本、高灵敏度、高通量的精准分型、同时多位点联合检测地对人类血液进行Rh血型进行基因分型，提供了一种一种检测人类红细胞Rh血型基因分型的引物组、试剂盒及应用。
本发明针对Rh血型系统查阅大量相关文献及积累的实验数据，确定了所检测的中国人群中9种常见的RHD基因型，及常见的9种常见的C、c、E、e抗原组合。并根据要检测的基因信息确定了相应的组引物，分别用来检测upstream Rhesus box 5’端基因，downstreamRhesus box 5’端基因，upstream Rhesus box 3’端基因，downstream Rhesus box 3’端基因，RHD基因和RHCE基因中的第一外显子，第三外显子信息，第四外显子，第五外显子，第六外显子，第七外显子，第八外显子，第九外显子，第十外显子，RHD基因中的270位点，711位点，845位点，1227位点，RHCE基因中的48位点，第二内含子109片段插入，203位点，307位点，676位点等相关遗传信息。设计了相应的引物组，用于同时检测人类红细胞Rh血型系统的遗传基因信息。
本发明第一个目的在于提供一种检测人类红细胞Rh血型基因分型的引物组，采用的技术方案为：所述引物组的序列表如SEQ ID No.1-9、SEQ ID No.10-12或/和SEQ IDNo.13-15、SEQ ID No.16-18或/和SEQ ID No.19-21、SEQ ID No.22-24或/和SEQ IDNo.25-27、SEQ ID No.28-30、SEQ ID No.31-33或/和SEQ ID No.34-36、SEQ ID No.37-72所示。
本发明所涉及的引物在设计时经过了一系列优化过程：1)为了确保所有引物特异性，在引物设计时以及引物设计后对引物进行分析，与基因组序列比对，保证设计的引物只和目标序列完全匹配，在基因组上没有相似扩增产物；2)为了实现所有引物在相同条件下扩增，引物设计时综合考虑引物长度、GC含量、引物二级结构和引物之间互补性等因素，使引物在扩增时具有相似的退火温度(Tm值)和扩增效率；3)经过评估有一半的引物设计为正常的序列，无过多的GC含量或过少的GC含量，引物设计困难较低；另外一半左右位点有较多的GC含量，AT含量或引物设计处有较多的二级结构，这些位点需要经过详细的分析后才能进行引物设计和确认，针对这些位点通过多次尝试和优化，才获得效果良好的引物组。
进一步地，所述引物组及其对应的检测位点分别为：
第一组引物如序列表SEQ ID No.1-3所示，用于检测upstream Rhesus box 5’端基因和/或downstream Rhesus box 5’端基因的信息；
第二组引物如序列表SEQ ID No.4-6所示，用于检测upstream Rhesus box3’端基因和/或downstream Rhesus box 3’端基因的信息；
第三组引物如序列表SEQ ID No.7-9所示，用于检测RHD基因和/或RHCE基因中的第一外显子信息；
第四组引物如序列表SEQ ID N o.10-12所示或第五组引物如序列表SEQ IDNo.13-15所示，用于检测RHD基因和/或RHCE基因中的第三外显子信息；
第六组引物如序列表SEQ ID No.16-18所示或第七组引物如序列表SEQ IDNo.19-21所示，用于检测RHD基因和/或RHCE基因中的第四外显子信息；
第八组引物如序列表SEQ ID No.22-24所示或第九组引物如序列表SEQ IDNo.25-27所示，用于检测RHD基因和/或RHCE基因中的第五外显子信息；
第十组引物如序列表SEQ ID No.28-30所示，用于检测RHD基因和RHCE基因中的第六外显子信息；
第十一组引物如序列表SEQ ID No.31-33所示或第十二组引物如序列表SEQ IDNo.34-36所示，用于检测RHD基因和/或RHCE基因中的第七外显子信息；
第十三组引物如序列表SEQ ID No.37-39所示，用于检测RHD基因和/或RHCE基因中的第八外显子信息；
第十四组引物如序列表SEQ ID No.40-42所示，用于检测RHD基因和/或RHCE基因中的第九外显子信息；
第十五组引物如序列表SEQ ID No.43-45所示，用于检测RHD基因和/或RHCE基因中的第十外显子信息；
第十六组引物如序列表SEQ ID No.46-48所示，用于检测RHD基因中的270(rs1248638537)位点遗传信息；
第十七组引物如序列表SEQ ID No.49-51所示，用于检测RHD基因中的711(rs765311512)位点遗传信息；
第十八组引物如序列表SEQ ID No.52-54所示，用于检测RHD基因中的845(rs142484009)位点遗传信息；
第十九组引物如序列表SEQ ID No.55-57所示，用于检测RHD基因中的1227(rs549616139)位点遗传信息；
第二十组引物如序列表SEQ ID No.58-60所示，用于检测RHCE基因中的第二内含子109片段插入的遗传信息；
第二十一组引物如序列表SEQ ID No.61-63所示，用于检测RHCE基因中的第二外显子203位点遗传信息；
第二十二组引物如序列表SEQ ID No.64-66所示，用于检测RHCE基因中的第二外显子307位点遗传信息；
第二十三组引物如序列表SEQ ID No.67-69所示，用于检测RHCE基因中的第五外显子676位点遗传信息；
第二十四组引物如序列表SEQ ID No.70-72所示，用于检测RHCE基因中的第一外显子48位点遗传信息。
进一步地，每组所述引物组由两条基于基因序列差异而设计的引物和一条共用配对引物组成。
进一步地，第一组引物中检测upstream Rhesus box 5’端基因信息的引物对为序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.3，检测downstream Rhesus box 5’端基因信息的的引物对为序列表SEQ ID No.2和SEQ ID No.3；
第二组引物中检测upstream Rhesus box3’端基因信息的引物对为序列表SEQ IDNo.4和SEQ ID No.6，检测downstream Rhesus box3’端基因信息的引物对为序列表SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6；
第三组引物中检测RHD基因中的第一外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.7和SEQ ID No.9，检测RHCE基因中第一外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.8和SEQ IDNo.9；
第四组引物中检测RHD基因中的第三外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.10和SEQ ID No.12，检测RHCE基因中第三外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.11和SEQID No.12；
第五组引物中检测RHD基因中的第三外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.13和SEQ ID No.15，检测RHCE基因中第三外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.14和SEQID No.15；
第六组引物中检测RHD基因中的第四外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.16和SEQ ID No.18，检测RHCE基因中第四外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.17和SEQID No.18；
第七组引物中检测RHD基因中的第四外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.19和SEQ ID No.21，检测RHCE基因中第四外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.20和SEQID No.21；
第八组引物中检测RHD基因中的第五外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.22和SEQ ID No.24，检测RHCE基因中第五外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.23和SEQID No.24；
第九组引物中检测RHD基因中的第五外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.25和SEQ ID No.27，检测RHCE基因中第五外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.26和SEQID No.27；
第十组引物中检测RHD基因中的第六外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.28和SEQ ID No.30，检测RHCE基因中第六外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.29和SEQID No.30；
第十一组引物中检测RHD基因中的第七外显子信息的引物对为序列表SEQ IDNo.31和SEQ ID No.33，检测RHCE基因中第七外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.32和SEQ ID No.33；
第十二组引物中检测RHD基因中的第七外显子信息的引物对为序列表SEQ IDNo.34和SEQ ID No.36，检测RHCE基因中第七外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.35和SEQ ID No.36；
第十三组引物中检测RHD基因中的第八外显子信息的引物对为序列表SEQ IDNo.37和SEQ ID No.39，检测RHCE基因中第八外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.38和SEQ ID No.39；
第十四组引物中检测RHD基因中第九外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.40和SEQ ID No.42，检测RHCE基因中第九外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.41和SEQID No.42；
第十五组引物中检测RHD基因中的第十外显子信息的引物对为序列表SEQ IDNo.43和SEQ ID No.45，检测RHCE基因中第十外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.44和SEQ ID No.45；
第十六组引物中检测RHD基因中的270G的引物对为序列表SEQ ID No.46和SEQ IDNo.48，检测RHD基因中的270A的引物对为序列表SEQ ID No.47和SEQ ID No.48；
第十七组引物中检测RHD基因中的711C的引物对为序列表SEQ ID No.49和SEQ IDNo.51，检测RHD基因中的711delC的引物对为序列表SEQ ID No.50和SEQ ID No.51；
第十八组引物中检测RHD基因中的845G的引物对为序列表SEQ ID No.52和SEQ IDNo.54，检测RHD基因中的845A的引物对为序列表SEQ ID No.53和SEQ ID No.54；
第十九组引物中检测RHD基因中的1227G的引物对为序列表SEQ ID No.55和SEQID No.57，检测RHD基因中的1227A的引物对为序列表SEQ ID No.56和SEQ ID No.57；
第二十组引物中检测RHCE基因中的第二内含子109片段未插入的引物对为序列表SEQ ID No.58和SEQ ID No.60，检测RHCE基因中的第二内含子109片段插入的引物对为序列表SEQ ID No.59和SEQ ID No.60；
第二十一组引物中检测RHCE基因中的第二外显子203G的引物对为序列表SEQ IDNo.61和SEQ ID No.63，检测RHCE基因中的第二外显子203A的引物对为序列表SEQ IDNo.62和SEQ ID No.63；
第二十二组引物中检测RHCE基因中的第二外显子307C的引物对为序列表SEQ IDNo.64和SEQ ID No.66，检测RHCE基因中的第二外显子307T的引物对为序列表SEQ IDNo.65和SEQ ID No.66；
第二十三组引物中检测RHCE基因中的第五外显子676C的引物对为序列表SEQ IDNo.67和SEQ ID No.69，检测RHCE基因中的第五外显子676G的引物对为序列表SEQ IDNo.68和SEQ ID No.69；
第二十四组引物中检测检测RHCE基因中的第一外显子48G的引物对为序列表SEQID No.70和SEQ ID No.72，检测检测RHCE基因中的第一外显子48C的引物对为序列表SEQID No.71和SEQ ID No.72。
进一步地，所述SEQ ID No.1、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.16、SEQ ID No.19、SEQ ID No.22、SEQ ID No.25、SEQ ID No.28、SEQ IDNo.31、SEQ ID No.34、SEQ ID No.37、SEQ ID No.40、SEQ ID No.43、SEQ ID No.46、SEQ IDNo.49、SEQ ID No.52、SEQ ID No.55、SEQ ID No.58、SEQ ID No.61、SEQ ID No.64、SEQ IDNo.67、SEQ ID No.70携带通用标签序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；所述SEQ ID No.2、SEQID No.5、SEQ ID No.8、SEQ ID No.11、SEQ ID No.14、SEQ ID No.17、SEQ ID No.20、SEQID No.23、SEQ ID No.26、SEQ ID No.29、SEQ ID No.32、SEQ ID No.35、SEQ ID No.38、SEQID No.41、SEQ ID No.44、SEQ ID No.47、SEQ ID No.50、SEQ ID No.53、SEQ ID No.56、SEQID No.59、SEQ ID No.62、SEQ ID No.65、SEQ ID No.68、SEQ ID No.71携带通用标签序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。
本发明的第二个目的在于提供一种用于检测人类红细胞Rh血型基因分型的试剂盒及其制备方法，采用的技术方案为：所述试剂盒包含上文所述的引物组中的第一组至第三组、第四组或/和第五组、第六组或/和第七组、第八组或/和第九组、第十组、第十一组或/和第十二组、第十三组至第二十四组的引物。
进一步地，所述的试剂盒包括至少23个芯片反应池，至少2个定位点，每个所述芯片反应池中包被有一组引物组。
进一步地，每个所述芯片反应池中的引物组中三条引物积之和相等。
用于检测人类红细胞Rh血型基因分型的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
a)从第一组至第三组、第四组或/和第五组、第六组或/和第七组、第八组或/和第九组、第十组、第十一组或/和第十二组、第十三组至第二十四组引物组中选检测人类红细胞Rh血型基因分型中的引物组，将选的引物组特异引物组制定孔位表，分别将等位基因引物按照孔位表包被至芯片基板芯片反应池中，得到芯片半成品；
b)制备PCR扩增试剂；
c)配备相应数量封口膜、对照品；
d)将芯片半成品、PCR扩增试剂以及封口膜、对照品按照检测人份组装成用于检测人类红细胞Rh血型基因分型的试剂盒。
用于检测人类红细胞Rh血型基因分型试剂，包括上文所述的引物组和/或上文所述试剂盒。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
(1)与现有技术相比，本发明用于同时检测人类红细胞Rh血型系统24个遗传基因位点信息的引物组，具有相似的退火温度，能够实现所有引物在相同的PCR扩增条件下同时扩增，每个PCR反应体系的体积低至1.15μL，DNA模板只需5～10ng，增加了检测效率和反应灵敏度；应用该引物组进行检测，具有速度快、成本低、灵敏性高及易于实现多位点联合检测等优点；
(2)本发明用于检测人类红细胞Rh血型基因分型的试剂盒，不仅能实现样本在不同反应腔体的均匀分配，杜绝不同反应孔之间的交叉污染，便于软件判读，而且避免了样品浪费，大大节约实验成本，从而实现了高通量、高灵敏度和稳定高效的多基因位点联合检测，使Rh血型基因分型更加精准化。
附图说明
图1为检测指标及对应的荧光信号图；
图2为试剂盒芯片基片图；
图3为4例不同Rh血型组合样本基因芯片荧光表达图；
图4为RHD基因型：RHD*01(standard RHD)、RHCE基因型：RHCE*Ce/RHCE*cE orRHCE*ce/RHCE*CE的样本软件判读及对应芯片荧光表达示例图；
图5为RHD基因型：RHD*01(standard RHD)、RHCE基因型：RHCE*cE/RHCE*cE的样本软件判读及对应芯片荧光表达示例图；
图6为RHD基因型：RHD*01(standard RHD)、RHCE基因型：RHCE*Ce/RHCE*Ce的样本软件判读及对应芯片荧光表达示例图；
图7为RHD基因型：RHD*01(standard RHD)、RHCE基因型：RHCE*ce/RHCE*Ce的样本软件判读及对应芯片荧光表达示例图；
图8为RHD基因型：RHD*01N*03(RHD-RHCe(2-9)-RHD)complex mutation、RHCE基因型：RHCE*Ce/RHCE*Ce的样本软件判读及对应芯片荧光表达示例图；
图9为RHD基因型：RHD*01N*01(RHD deletion)Homozygous mutation、RHCE基因型：RHCE*ce/RHCE*ce的样本软件判读及对应芯片荧光表达示例图；
图10为RHD基因型：RHD*06*03(DVI Type 3)complex mutation、RHCE基因型：RHCE*ce/RHCE*Ce的样本软件判读及对应芯片荧光表达示例图；
图11为RHD基因型：RHD*01EL.01(1227G>A)complex mutation、RHCE基因型：RHCE*ce/RHCE*Ce的样本软件判读及对应芯片荧光表达示例图；
图12为RHD基因型：RHD*15(Weak D type 15)complex mutation、RHCE基因型：RHCE*ce/RHCE*cE的样本软件判读及对应芯片荧光表达示例图；
图13为RHD基因型：RHD*01N.16(711delC)complex mutation、RHCE基因型：RHCE*Ce/RHCE*cE or RHCE*ce/RHCE*CE的样本软件判读及对应芯片荧光表达示例图；
图14为RHD基因型：RHD*01N.16(711delC)and RHD*01EL.01(1227G>A)complexmutation、RHCE基因型：RHCE*CE/RHCE*Ce的样本软件判读及对应芯片荧光表达示例图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1引物设计
依据美国国立生物技术信息中心基因库(NCBI Gene Bank)公开的Rh等位基因参考序列，通过查阅大量Rh血型系统相关文献及积累的实验数据，确定了所检测的中国人群中9种常见的RHD基因型，及常见的9种常见的C、c、E、e抗原组合。并根据要检测的基因信息：upstream Rhesus box 5’端基因，downstream Rhesus box 5’端基因，upstream Rhesusbox 3’端基因，downstream Rhesus box 3’端基因，RHD基因和/或RHCE基因中的第一外显子，第三外显子，第四外显子，第五外显子，第六外显子，第七外显子，第八外显子，第九外显子，第十外显子，RHD基因中的270位点，711位点，845位点，1227位点，RHCE基因中的48位点，第二内含子109片段插入，203位点，307位点，676位点等相关遗传信息进行引物设计。
基于竞争性等位基因特异性PCR原理，对SNPs或者特定位点上DNA片段缺失插入(InDels)进行精准的双等位基因判断，设计了引物组用于同时检测人类红细胞Rh血型的对应区域的遗传基因位点的组合信息，每组引物组包含两条基于等位基因序列位点差异而设计的引物和一条共用配对引物。引物组的基因序列如SEQ ID No.1-9、SEQ ID No.10-12或/和SEQ ID No.13-15、SEQ ID No.16-18或/和SEQ ID No.19-21、SEQ ID No.22-24或/和SEQID No.25-27、SEQ ID No.28-30、SEQ ID No.31-33或/和SEQ ID No.34-36、SEQ ID No.37-72所示。
实施例2试剂盒制备
在实施例1的基础上，本实施例以同时选择24组引物组用于制备一种检测人类红细胞Rh血型基因分型的试剂盒，来进行说明本发明的试剂盒及其制备方法。试剂盒中每组引物组中三条引物积相等均为0.05μL，提前包被于芯片反应池中，样本基因组DNA 0.25μL、PCR扩增试剂0.5μL以及1*TE缓冲液0.25μL组成一个PCR反应体系，每个PCR反应体系的总体积为1.15μL，其中基因组DNA浓度为10-50ng/μL，A260/A280 OD值为1.6-2.0；PCR扩增试剂为包含携带有HEX或FAM荧光基团的通用探针、dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶和反应缓冲液的2*MasterMix。关于引物、样本基因组DNA、PCR扩增试剂及1*TE缓冲液的用量需要说明的是：一般为了便于高效率、精准的检测人类红细胞Rh血型基因型，引物的用量是确定的，扩增试剂是确定的，样本基因组DNA根据浓度来加，后用1*TE缓冲液来补足体系。
通过竞争性等位基因特异性PCR扩增，最后对PCR产物进行荧光信号检测，根据荧光信号分组即可对样本进行基因型分型。利用这些引物组能够实现多位点联合检测，可以达到低成本高效率的检测人类红细胞Rh血型基因分型的目的(详见图1)。
基于竞争性等位基因特异性PCR的原理进行SNP分型的试剂盒，其中PCR反应在微流控芯片(北京博奥晶典生物技术有限公司，产品编号G020010，说明书附图2)上完成，制备方法步骤为：
(1)从24组引物中优选了检测人类红细胞Rh血型基因分型中的23组引物，将优选的23组特异引物组制定孔位表(表1)，分别将23组等位基因引物SEQ ID No.1-69按照孔位表包被至芯片基板23个芯片反应池中，制成试剂盒中的芯片半成品。
每张芯片可检测4个样本，针对每个样本均设有1个内对照质控、1个空白对照以及1个阳性质控(即：表1中的内对照质控、空白对照以及阳性质控)。
表1芯片反应池对应检测指标
(2)将多种普通生物化学试剂(探针、酶、dNTPs等)按一定量比例进行混合并充分混匀，形成PCR扩增试剂(PCR预混液、1*TE缓冲液)。依据试剂盒检测人份对试剂半成品进行分装，PCR扩增试剂500μL/管/24人份，1×TE缓冲液900μL/管/24人份；
(3)依据试剂盒检测人份配备相应数量封口膜(1张/4人份)、对照品(人类基因组DNA 50μL/管/24人份)
(4)将制备成的上述芯片半成品、试剂半成品以及封口膜、对照品按照检测人份组装成一种用于检测人类红细胞Rh血型基因分型的试剂盒。
实施例3 Rh血型相关基因检测
基于实施例2制备的试剂盒，进行Rh血型相关基因检测：
1.采集200位无血缘关系的献血者的血液，其中100位为血清学RhD阳性，另外100位为血清学阴性。提取基因组DNA：本试剂盒适用的样品为从全血中提取的人基因组DNA。被检基因组DNA需满足浓度为10ng/μL-50ng/μL。提取后的人基因组DNA需进行浓度测定，如果浓度高于50ng/μL，需经稀释后满足上述要求方可进行后续实验；浓度低于10ng/μL需重新提取直至符合要求方可。
2.用上述所制备的专用试剂盒检测200人份23组遗传信息，按照使用操作流程进行如下操作：
2.1分装PCR扩增试剂
在试剂存储和准备区内，根据样品数目，准备相应数量的0.2mL离心管，并在管上标记样品编号。从试剂盒中取出PCR扩增试剂，室温使其充分融化(自然解冻)，涡旋振荡，使其完全混匀，瞬时离心至管底。将融化后混匀的PCR扩增试剂按30μL/管(20μL PCR扩预混液+10μL 1*TE缓冲液)分装到同一样品编号的0.2mL离心管中，然后将其转移至标本制备区。
2.2混样
在样本制备区，样本DNA在使用前需室温解冻，然后混匀并瞬时离心；向含有PCR扩增试剂的0.2mL离心管中加入待测样品DNA各10μL，每份PCR反应体系总体积为40μL，每份样品PCR扩增体系组成见表2。
表2反应体系
反应物成分 加样量(μL)
PCR扩增试剂 20
1*TE缓冲液 10
DNA模板 10
总体积(μL) 40
2.3芯片加样
在样本制备区，从试剂盒中取出芯片使其恢复至室温。在洁净工作台内打开包装，将芯片水平放置，用移液器吸取38μL上述配制好的PCR扩增体系，从芯片右侧进样孔垂直将液体打入芯片，直至液体经进样通道到达左侧出样孔，此时应立即停止加样，然后用无尘纸擦去进出样孔残留的液体，最后用封口膜封闭进出样孔。
2.4芯片离心热封
打开离心热封一体机电源，将加样后的芯片固定在机器离心仓的转子上并配平，放置时，芯片加样孔朝下，缺角在上，进行离心，待界面显示离心完毕后，即可取出芯片，如果芯片反应池中仍有气泡，可适当延长离心时间，直至气泡消失。热封时将芯片反应池朝上，芯片缺角位于左上角，插入托盘(每次可插入4张芯片)，待温度稳定后，进行热封，托盘自动进仓，待界面显示热封完毕后，托盘自动出仓后，即可取出芯片。
2.5 PCR扩增
将芯片加样孔朝上置于PCR扩增仪中，按表3中的热循环程序进行PCR扩增反应。
表3.核酸扩增反应程序
3.芯片扫描
使用Rh血型基因分型检测分析软件进行扫描、信号读取及结果判读。部分判读原则见表4。原则说明：本原则所出RHD基因检测报告中基因型为ISBT name，括号内为对应的Designation；对应抗原表型有D+(D阳性)、D-(D阴性)、Weak D(弱D)、Partial D(部分D)、DEL(Del型)等多种表型；RHCE基因分型检测报告中基因单倍型为RHCE*ce、RHCE*Ce、RHCE*cE、RHCE*CE，对应抗原表型有ccee、CCee、ccEE、CCEE、Ccee、ccEe、CcEe、CcEE、CCEe等多种表型)。
根据结果判读标准，判读界面中内对照质控正常、空白对照正常以及阳性质控正常时，则芯片质控正常，表明本次检验结果有效。而判读界面中任一质控显示异常时，则判定本次样品检测结果无效，需要进行重检(图4-14)。
表4.荧光信号对应的Rh血型基因分型部分判读原则
4、检测结果及基因分型结果
根据检测分析软件进行扫描、信号读取及结果判读(如图4-14)，可知200例样本中100位为血清学RhD阳性基因分型结果见表5，100位为血清学RhD阴性基因分型结果见表6，按照判读原则中的基因分型组合目前检出21种，另外对200例样本进行血清学检测以及基因测序检测，将结果进行对比后，通过基因分型结果判读的基因表型和血清学以及基因测序结果100％相符。
表5 100例血清学RhD阳性人类血液样本基因分型结果
表6 100例血清学RhD阴性人类血液样本基因分型结果
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
<110> 河南兰德施坦纳基因科技有限公司
<120> 一种检测人类红细胞Rh血型基因分型的引物组、试剂盒及应用
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<212> DNA
<213>人工序列（Artificial Sequence）
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Aacactttgt cattttagag gt 22
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<212> DNA
<213>人工序列（Artificial Sequence）
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213>人工序列（Artificial Sequence）
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<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial Sequence）
<400>68
ggattggact tctcagcaga gc 22
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial Sequence）
<400>69
cttgtggatg ttctggccaa gtg 23
<210> 70
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial Sequence）
<400>70
cgctgcctgc ccctctgg 18
<210> 71
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial Sequence）
<400>71
cgctgcctgc ccctctgc 18
<210> 72
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial Sequence）
<400> 72
ggagaatgag agctgcttcc agtg 24

Claims (10)

1.一种检测人类红细胞Rh血型基因分型的引物组，其特征在于，所述引物组的序列表如SEQ ID No.1-9、SEQ ID No.10-12或/和SEQ ID No .13-15、SEQ ID No .16-18或/和SEQID No .19-21、SEQ ID No .22-24或/和SEQ ID No.25-27、SEQ ID No .28-30、SEQ ID No.31-33或/和SEQ ID No .34-36、SEQ ID No.37-72所示。
2.根据权利要求1所述的一种检测人类红细胞Rh血型基因分型的引物组，其特征在于，所述引物组及其对应的检测位点分别为：
第一组引物如序列表SEQ ID No.1-3所示，用于检测upstream Rhesus box 5’端基因和/或downstream Rhesus box 5’端基因的信息；
第二组引物如序列表SEQ ID No.4-6所示，用于检测upstream Rhesus box3’端基因和/或downstream Rhesus box 3’端基因的信息；
第三组引物如序列表SEQ ID No .7-9所示，用于检测RHD基因和/或RHCE基因中的第一外显子信息；
第四组引物如序列表SEQ ID N o.10-12所示或第五组引物如序列表 SEQ ID No .13-15所示，用于检测RHD基因和/或RHCE基因中的第三外显子信息；
第六组引物如序列表SEQ ID No .16-18所示或第七组引物如序列表SEQ ID No .19-21所示，用于检测RHD基因和/或RHCE基因中的第四外显子信息；
第八组引物如序列表SEQ ID No .22-24所示或第九组引物如序列表SEQ ID No.25-27所示，用于检测RHD基因和/或RHCE基因中的第五外显子信息；
第十组引物如序列表SEQ ID No .28-30所示，用于检测RHD基因和RHCE基因中的第六外显子信息；
第十一组引物如序列表SEQ ID No .31-33所示或第十二组引物如序列表SEQ ID No.34-36所示，用于检测RHD基因和/或RHCE基因中的第七外显子信息；
第十三组引物如序列表SEQ ID No.37-39所示，用于检测RHD基因和/或RHCE基因中的第八外显子信息；
第十四组引物如序列表SEQ ID No.40-42所示，用于检测RHD基因和/或RHCE基因中的第九外显子信息；
第十五组引物如序列表SEQ ID No .43-45所示，用于检测RHD基因和/或RHCE基因中的第十外显子信息；
第十六组引物如序列表SEQ ID No.46-48所示，用于检测RHD基因中的270（rs1248638537）位点遗传信息；
第十七组引物如序列表SEQ ID No .49-51所示，用于检测RHD基因中的711（rs765311512）位点遗传信息；
第十八组引物如序列表 SEQ ID No .52-54所示，用于检测RHD基因中的845（rs142484009）位点遗传信息；
第十九组引物如序列表SEQ ID No .55-57所示，用于检测RHD基因中的1227（rs549616139）位点遗传信息；
第二十组引物如序列表SEQ ID No .58-60所示，用于检测RHCE基因中的第二内含子109片段插入的遗传信息；
第二十一组引物如序列表SEQ ID No.61-63所示，用于检测RHCE基因中的第二外显子203位点遗传信息；
第二十二组引物如序列表SEQ ID No .64-66所示，用于检测RHCE基因中的第二外显子307位点遗传信息；
第二十三组引物如序列表SEQ ID No .67-69所示，用于检测RHCE基因中的第五外显子676位点遗传信息；
第二十四组引物如序列表SEQ ID No .70-72所示，用于检测RHCE基因中的第一外显子48位点遗传信息。
3.根据权利要求2所述的一种检测人类红细胞Rh血型基因分型的引物组，其特征在于，每组所述引物组由两条基于基因序列差异而设计的引物和一条共用配对引物组成。
4.根据权利要求3所述的一种检测人类红细胞Rh血型基因分型的引物组，其特征在于，
第一组引物中检测upstream Rhesus box 5’端基因信息的引物对为序列表SEQ IDNo.1和SEQ ID No.3，检测downstream Rhesus box 5’端基因信息的的引物对为序列表SEQID No.2和SEQ ID No.3；
第二组引物中检测upstream Rhesus box3’端基因信息的引物对为序列表SEQ IDNo.4和SEQ ID No.6，检测downstream Rhesus box3’端基因信息的引物对为序列表SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6；
第三组引物中检测RHD基因中的第一外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.7和SEQID No.9，检测RHCE基因中第一外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.8和SEQ ID No.9；
第四组引物中检测RHD基因中的第三外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.10和SEQ ID No.12，检测RHCE基因中第三外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12；
第五组引物中检测RHD基因中的第三外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.13和SEQ ID No.15，检测RHCE基因中第三外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.14和SEQ IDNo.15；
第六组引物中检测RHD基因中的第四外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.16和SEQ ID No.18，检测RHCE基因中第四外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.17和SEQ IDNo.18；
第七组引物中检测RHD基因中的第四外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.19和SEQ ID No.21，检测RHCE基因中第四外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.20和SEQ IDNo.21；
第八组引物中检测RHD基因中的第五外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.22和SEQ ID No.24，检测RHCE基因中第五外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.23和SEQ IDNo.24；
第九组引物中检测RHD基因中的第五外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.25和SEQ ID No.27，检测RHCE基因中第五外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.26和SEQ IDNo.27；
第十组引物中检测RHD基因中的第六外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.28和SEQ ID No.30，检测RHCE基因中第六外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.29和SEQ IDNo.30；
第十一组引物中检测RHD基因中的第七外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.31和SEQ ID No.33，检测RHCE基因中第七外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.32和SEQ IDNo.33；
第十二组引物中检测RHD基因中的第七外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.34和SEQ ID No.36，检测RHCE基因中第七外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.35和SEQ IDNo.36；
第十三组引物中检测RHD基因中的第八外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.37和SEQ ID No.39，检测RHCE基因中第八外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.38和SEQ IDNo.39；
第十四组引物中检测RHD基因中第九外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.40和SEQ ID No.42，检测RHCE基因中第九外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.41和SEQ IDNo.42；
第十五组引物中检测RHD基因中的第十外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.43和SEQ ID No.45，检测RHCE基因中第十外显子信息的引物对为序列表SEQ ID No.44和SEQ IDNo.45；
第十六组引物中检测RHD基因中的270G的引物对为序列表SEQ ID No.46和SEQ IDNo.48，检测RHD基因中的270A的引物对为序列表SEQ ID No.47和SEQ ID No.48；
第十七组引物中检测RHD基因中的711 C的引物对为序列表SEQ ID No.49和SEQ IDNo.51，检测RHD基因中的711 delC的引物对为序列表SEQ ID No.50和SEQ ID No.51；
第十八组引物中检测RHD基因中的845G的引物对为序列表SEQ ID No.52和SEQ IDNo.54，检测RHD基因中的845A的引物对为序列表SEQ ID No.53和SEQ ID No.54；
第十九组引物中检测RHD基因中的1227G的引物对为序列表SEQ ID No.55和SEQ IDNo.57，检测RHD基因中的1227A的引物对为序列表SEQ ID No.56和SEQ ID No.57；
第二十组引物中检测RHCE基因中的第二内含子109片段未插入的引物对为序列表SEQID No.58和SEQ ID No.60，检测RHCE基因中的第二内含子109片段插入的引物对为序列表SEQ ID No.59和SEQ ID No.60；
第二十一组引物中检测RHCE基因中的第二外显子203G的引物对为序列表SEQ IDNo.61和SEQ ID No.63，检测RHCE基因中的第二外显子203A的引物对为序列表SEQ IDNo.62和SEQ ID No.63；
第二十二组引物中检测RHCE基因中的第二外显子307C的引物对为序列表SEQ IDNo.64和SEQ ID No.66，检测RHCE基因中的第二外显子307T的引物对为序列表SEQ IDNo.65和SEQ ID No.66；
第二十三组引物中检测RHCE基因中的第五外显子676C的引物对为序列表SEQ IDNo.67和SEQ ID No.69，检测RHCE基因中的第五外显子676G的引物对为序列表SEQ IDNo.68和SEQ ID No.69；
第二十四组引物中检测检测RHCE基因中的第一外显子48G的引物对为序列表SEQ IDNo.70和SEQ ID No.72，检测检测RHCE基因中的第一外显子48C的引物对为序列表SEQ IDNo.71和SEQ ID No.72。
5.根据权利要求1~4任一项所述的一种检测人类红细胞Rh血型基因分型的引物组，其特征在于，所述SEQ ID No.1 、SEQ ID No.4、 SEQ ID No.7、 SEQ ID No.10、 SEQ IDNo.13、 SEQ ID No.16、 SEQ ID No.19、SEQ ID No.22、SEQ ID No.25、 SEQ ID No.28、SEQ ID No.31、 SEQ ID No.34、 SEQ ID No.37、 SEQ ID No.40、SEQ ID No.43、SEQ IDNo.46、 SEQ ID No.49、 SEQ ID No.52、 SEQ ID No.55、 SEQ ID No.58、 SEQ ID No.61、SEQ ID No.64、SEQ ID No.67、SEQ ID No.70携带通用标签序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；所述SEQ ID No.2 、SEQ ID No.5、 SEQ ID No.8、 SEQ ID No.11、 SEQ ID No.14、 SEQ IDNo.17、 SEQ ID No.20、SEQ ID No.23、SEQ ID No.26、 SEQ ID No.29、 SEQ ID No.32、SEQ ID No.35、 SEQ ID No.38、 SEQ ID No.41、SEQ ID No.44、SEQ ID No.47、 SEQ IDNo.50、 SEQ ID No.53、 SEQ ID No.56、 SEQ ID No.59、 SEQ ID No.62、SEQ ID No.65、SEQ ID No.68、 SEQ ID No.71携带通用标签序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。
6.基于权利要求1-5任一项所述的一种检测人类红细胞Rh血型基因分型的引物组的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1~5任一项所述的引物组中的第一组至第三组、第四组或/和第五组、第六组或/和第七组、第八组或/和第九组、第十组、第十一组或/和第十二组、第十三组至第二十四组的引物。
7.根据权利要求6所述的一种检测人类红细胞Rh血型基因分型的引物组的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括至少23个芯片反应池和至少2个定位点；所述芯片反应池包括至少1个内对照质控、至少1个空白对照以及至少1个阳性质控，剩余的芯片反应池中包被有引物组。
8.根据权利要求7所述的一种检测人类红细胞Rh血型基因分型的引物组的试剂盒，其特征在于，每个所述芯片反应池中的引物组中三条引物积之和相等。
9.基于权利要求6-8任一项所述的检测人类红细胞Rh血型基因分型的引物组的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)从第一组至第三组、第四组或/和第五组、第六组或/和第七组、第八组或/和第九组、第十组、第十一组或/和第十二组、第十三组至第二十四组引物组中选检测人类红细胞 Rh血型基因分型中的引物组，将选的引物组特异引物组制定孔位表，分别将等位基因引物按照孔位表包被至芯片基板芯片反应池中，得到芯片半成品；
b)制备PCR 扩增试剂；
c)配备相应数量封口膜、对照品；
d)将芯片半成品、PCR 扩增试剂以及封口膜、对照品按照检测人份组装成用于检测人类红细胞 Rh 血型基因分型的试剂盒。
10.用于检测人类红细胞Rh血型基因分型试剂，其特征在于，包括权利要求1~5任一项所述的引物组和/或权利要求6~9任一项所述试剂盒。
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