CN117625808A - 一种用于检测rhd基因合子型的引物组及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测RHD基因合子型的引物组及试剂盒，属于生物医学临床分子检测领域。本发明的用于检测RHD基因合子型的引物组，包括三对特异性PCR扩增引物：第一组，Dsrh引物组：Dsrh引物组的上游引物和下游引物位于RHD基因下游盒中，用于扩增完整的下游Rh盒子。第二组，Hyrh引物组：Hyrh引物组的上游引物位于RHD基因上游盒中，下游引物位于RHD基因下游盒中，用于扩增融合Rh盒子。第三组，引物组4cde：引物组4cde在RHD和RHCE4号内含子区域都有，RHD和RHCE的4号内含子区域都能扩增出。本发明的引物均根据各自在同源区侧翼的多态性位点设计。本发明实验操作简便、快速，并且具有较高的特异性和准确率。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测RHD基因合子型的引物组及试剂盒，属于生物医学临床分子检测领域。
背景技术
人类Rh血型系统(Rh血型系统中基因以RH表示，抗原以Rh表示)是临床最重要的血型系统之一，也是人类红细胞血型系统中最复杂最富有多态性的一个系统，该系统抗原抗体不相容能引起溶血性输血反应、新生儿溶血病和自身免疫性溶血性贫血。RHD基因与2个高度同源、长度大约为9000bp的DNA片段侧接，其上游区及下游区为Rh盒子。在RHD缺失的单倍型中，2个Rh盒子融合形成单一杂合Rh盒子，上、下游Rh盒子方向相同，与RHD基因一致,这两个Rhesus盒序列同源性高达98.6％。杂交Rhesus盒包含RHD基因上游Rh盒的5′端和下游Rh盒的3′端,上、下游盒间的RHD基因完全缺失。Rh抗原是由位于1号染色体短臂上的两个同源及紧密连锁的基因所编码，即RhD和RhCE基因，每个基因都是由10个外显子组成，两者最显著的区别是内含子4，RhD的内含子4少了约600bp，RhD和RhCE基因分别长57295bp和57831bp。
早期主要根据Rh表型、RHD基因的半定量、RHD相邻基因的有无等推算RHD基因的杂合性。Rh盒发现后，先后有作者报道了PCR-RFLP方法、突变阻滞检测系统(ARMS)和实时PCR技术、PCR-SSP技术等测定RHD基因合子型。RHD基因合子型对于预防新生儿溶血病和预测胎儿RHD表型具有重要意义。
另外申请号为200410032010.X的中国专利申请，发明名称为个体RHD基因合子型测定的PCR引物及试剂盒及测定方法，公开了用于RHD基因合子型测定的PCR引物组，采用的是序列特异性引物-聚合酶链式反应技术(PCR-SSP)，用于扩增杂交Rhesus盒和RHD基因1号外显子，根据扩增结果来判断Rh盒子是否发生融合，该发明可以检测Rh盒子是否融合，但不能区分完整RHD单倍体还是部分被RHCE替换情况下的完整Rh盒子。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种用于检测RHD基因合子型的引物组及试剂盒。
本发明采用序列特异性引物-聚合酶链式反应技术(PCR-SSP)，设计两对特异性引物对Rh盒子进行聚合酶链式(Polymerase Chain Reaction,PCR)反应，然后利用琼脂糖凝胶电泳法对PCR反应结果进行检测分析，以判断Rh盒子是否发生融合，这两对引物中每条引物都设计在Rh盒子上游或者下游基因中，提高检测准确度。由于RHD和RHCE交换重组产生的RHD-CE-D杂交基团会导致抗原表型改变，另外增加了引物组4cde对RHD/RHCE基因4号内含子扩增，用来确认RHD基因4号内含子区域是否有被RHCE替换。这三对特异性引物组合使用能够提高检测精确度，并进一步完善Rh盒子检测，对于预防新生儿溶血病和预测胎儿RHD表型具有重要意义。
本发明解决技术问题的技术方案如下：
在本发明的第一方面，提供了一种用于检测RHD基因合子型的引物组，所述的引物组包括三对特异性PCR扩增引物，
第一组，Dsrh(Downstream Rhesus box，下游Rh盒子简写)引物组：Dsrh引物组的上游引物和下游引物位于RHD基因下游盒中，用于扩增完整的下游Rh盒子。
第二组，Hyrh(Hybrid Rhesus box，Rh融合盒子简写)引物组：Hyrh引物组的上游引物位于RHD基因上游盒中，下游引物位于RHD基因下游盒中，用于扩增融合Rh盒子。
第三组，引物组4cde(RHD和RHCE基因4号内含子简写)：引物组4cde在RHD和RHCE4号内含子区域都有，RHD和RHCE的4号内含子区域都能扩增出，在RHD的4号内含子区域扩增出0.6kb大小片段，在RHCE的4号内含子区域扩增出1.2kb大小片段。
三对特异性PCR扩增引物的核苷酸序列如下表所示：
在本发明的第二方面，提供了含有如第一方面所述的用于检测RHD基因合子型的引物组的试剂盒。
优选地，所述的试剂盒中还包括PCR反应试剂。
优选地，所述的PCR反应试剂包括PCR反应液和Taq DNA聚合酶。
优选地，所述的PCR反应液包括：0.5mM脱氧核苷酸dNTP，40mM氯化镁MgCl2，80mM氯化钾KCl，60mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl，1mM四甲基氯化铵TMAC，甘油0.6％v/v，甲酚红0.02％v/v和甜菜碱5％v/v。Taq DNA聚合酶用EZ#4(伟禾公司市售产品，编号WH22004)。
在本发明的第三方面，提供了如第一方面所述的引物组或第二方面所述的试剂盒在检测RHD基因合子型上的应用。
在本发明的第四方面，提供了应用如第一方面所述的引物组或第二方面所述的试剂盒检测RHD基因合子型的方法，所述的方法为PCR扩增。
所述的扩增反应体系如下：总体积12.4μL，包括PCR反应液6μL，酶0.4μL，扩增引物混合液3μL，DNA模板3μL；所述的PCR扩增反应，其反应程序1(用于扩增Dsrh和Hyrh)为95℃2分钟；93℃10秒、66℃6分钟，30个循环；72℃5分钟，4℃直到取出；其反应程序2(用于扩增4cde)，95℃2分钟；93℃10秒、66℃45秒、71℃3分钟，30个循环；71℃5分钟，4℃直到取出，反应程序1和反应程序2同时扩增，三对引物在不同的反应管中同时扩增。
本发明包括如下技术效果：
1)本发明为一种用于检测RHD基因合子型的引物组及试剂盒。本发明的引物用于检测融合Rh盒子，RHD基因上游盒(upstreambox)、下游盒(downstream box)、杂交盒(hybridbox)和4号内含子，均根据各自在同源区侧翼的多态性位点设计。本发明实验操作简便、快速，并且具有较高的特异性和准确率。
2)与现有的200410032010.X相比，现有方法采用的是序列特异性引物-聚合酶链式反应技术(PCR-SSP)，设计两对引物扩增杂交Rhesus盒和RHD基因1号外显子，而本发明设计了Dsrh和Hyrh两对特异性引物，对下游Rh盒子和Rh融合盒子进行扩增，从而可以确定单倍体RHD是否缺失，设计的4cde特异性引物对RHD和RHCE区域4号内含子进行扩增，用来确认RHD基因4号内含子区域是否有被RHCE替换，以区分是完整RHD单倍体还是部分被RHCE替换情况下的完整Rh盒子。这三对特异性引物组合提高了检测精确度，并进一步完善Rh盒子检测，对于预防新生儿溶血病和预测胎儿RHD表型具有重要意义。
附图说明
图1是实施例1中Dsrh引物扩增后PCR产物的凝胶电泳图。其中，a样本未扩增出条带，为Rh盒子发生融合；b、c和d样本扩增出条带，为Rh盒子未发生融合。
图2是实施例1中Hyrh引物扩增后PCR产物的凝胶电泳图。其中，a、b和c样本扩增出条带，为Rh盒子发生融合；d样本未扩出条带，为Rh盒子未发生融合。
图3是实施例1中4cde引物扩增后PCR产物的凝胶电泳图。其中，a和c样本扩出一条1.2kb条带，为RHD基因4号内含子缺失；b和d样本扩增出两条带(1.2kb和0.6kb)，为RHD基因4号内含子未缺失。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰明了，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明中，涉及的主要原材料清单如下：
实施例1
1原料和设备：
1.1试剂盒组分：
1)特异性扩增引物组，包含3对根据RHD基因、上下游Rh盒子Rh融合盒子和RHCE基因4号内含子设计的引物，这三对引物分别用于扩增下游Rh盒子、Rh融合盒子、RHD和RHCE基因4号内含子，序列为SEQ ID NO：#01～#06
所述的3对特异性PCR扩增引物组核苷酸序列如下表所示：
三对引物：单独分装，每管500μL，每种引物浓度均为0.6pmol/μL。
2)PCR反应试剂
Taq DNA聚合酶：EZ#4(江苏伟禾生物公司市售产品，编号WH22004)；
PCR反应液：包括0.5mM脱氧核苷酸dNTP，40mM氯化镁MgCl2，80mM氯化钾KCl，60mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl，1mM四甲基氯化铵TMAC，甘油0.6％v/v，甲酚红0.02％v/v和甜菜碱5％v/v。
1.2样本的来源
1)血液样本采集
血液样本可以用含抗凝血剂柠檬酸钠(Sodium citrate)及乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管进行采集，以新鲜或冷冻保存未经反复冻融的全血样本作为实验样本。
2)核酸样本萃取
可由全血或白血球层等含有核细胞的样本，以沉淀法、管柱法或磁珠法进行核酸萃取，取得足量且质量合格的核酸以进行聚合酶链式反应。
3)核酸样本定量
萃取的核酸样本必须溶解于灭菌水或其它适当的溶液(如TE Buffer)之中，且浓度应介于10-40ng/μl，不可将核酸样本溶解于含有超过0.5mM螯化物如乙二胺四乙酸(EDTA)的溶液。
4)核酸样本质量规范
核酸样本的A260/A280比值应介于1.6到2.1之间。
1.3所需实验设备
PCR仪、不同量程的移液器、小型台式离心机(含8连管水平头)、电泳仪。
2基因检测过程
2.1反应体系的配制：反应体系下表所示：
PCR反应体系
将反应管盖上盖子，短暂离心后，放入荧光定量PCR仪中。
2.2PCR反应程序：如下表所示：
其用于扩增Dsrh和Hyrh的程序为反应程序1，用于扩增4cde的程序为反应程序2，反应程序1和反应程序2同时扩增，三对引物在不同的反应管中同时扩增。
2.3电泳
按8～10volts/cm跑胶，200V，约10～20分钟。紫外透射仪上照相。
3实验结果分析
结果如图1-3所示。
如使用Dsrh扩增出条带说明是有完整的Rh盒子，如使用Hyrh扩增出条带说明是Rh盒子发生融合，如使用4cde扩增出一条带说明RHD发生缺失或者RHCE替换，如使用4cde扩增出两条带说明有完整的Rh盒子。
图1是实施例1中Dsrh引物扩增后PCR产物的凝胶电泳图，a样本未扩增出条带，为Rh盒子发生融合；b、c和d样本扩增出条带，为Rh盒子未发生融合。
图2是实施例1中Hyrh引物扩增后PCR产物的凝胶电泳图，a、b和c样本扩增出条带，为Rh盒子发生融合；d样本未扩出条带，为Rh盒子未发生融合。
图3是实施例1中4cde引物扩增后PCR产物的凝胶电泳图，a和c样本扩出一条1.2kb条带，为RHD基因4号内含子缺失；b和d样本扩增出两条带(1.2kb和0.6kb)，为RHD基因4号内含子未缺失。
a为RHD(-)/RHD(-)个体，RHD基因缺失纯合体；
b为RHD(+)/RHD(-)个体，RHD基因杂合体；
c为RHD(-)/RHD*D-CE替换-D个体，RHD基因杂合体。
d为RHD(+)/RHD(+)个体，RHD基因纯合体。
本发明试剂盒组分简单和成本低，检测方法操作简便、快速，并且具有较高的特异性和准确率，对于PCR仪器无严格要求。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种用于检测RHD基因合子型的引物组，其特征在于，包括三对特异性PCR扩增引物：
第一组，Dsrh引物组：Dsrh引物组的上游引物和下游引物位于RHD基因下游盒中，用于扩增完整的下游Rh盒子；
第二组，Hyrh引物组：Hyrh引物组的上游引物位于RHD基因上游盒中，下游引物位于RHD基因下游盒中，用于扩增融合Rh盒子；
第三组，引物组4cde：引物组4cde在RHD和RHCE4号内含子区域都有，RHD和RHCE的4号内含子区域都能扩增出，在RHD的4号内含子区域扩增出0.6kb大小片段，在RHCE的4号内含子区域扩增出1.2kb大小片段；
三对特异性PCR扩增引物的核苷酸序列如下表所示：
2.含有如权利要求1所述的用于检测RHD基因合子型的引物组的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括PCR反应试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应试剂包括PCR反应液和Taq DNA聚合酶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应液包括：0.5mM脱氧核苷酸dNTP，40mM氯化镁MgCl2，80mM氯化钾KCl，60mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl，1mM四甲基氯化铵TMAC，甘油0.6％v/v，甲酚红0.02％v/v和甜菜碱5％v/v。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的Taq DNA聚合酶用EZ#4。
7.如权利要求1所述的引物组或权利要求2-6所述的试剂盒在检测RHD基因合子型上的应用。
8.应用如权利要求1所述的引物组或如权利要求2-5所述的试剂盒检测RHD基因合子型的方法，其特征在于，所述的方法为PCR扩增。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述的PCR扩增反应体系如下：总体积12.4μL，包括PCR反应液6μL，酶0.4μL，扩增引物混合液3μL，DNA模板3μL；
所述的PCR扩增反应，其用于扩增Dsrh和Hyrh的反应程序1为95℃2分钟；93℃10秒、66℃6分钟，30个循环；72℃5分钟，4℃直到取出；其用于扩增4cde的反应程序2，95℃2分钟；93℃10秒、66℃45秒、71℃3分钟，30个循环；71℃5分钟，4℃直到取出，反应程序1和反应程序2同时扩增，三对引物在不同的反应管中同时扩增。
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