CN102943114A - 重型血友病a致病基因突变检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术与生物医药领域，具体涉及检测重型血友病A致病基因内含子22和内含子1倒位突变的试剂盒。本发明的技术方案为提供一种重型血友病A致病基因突变检测试剂盒，包括Inv22PCR反应液和Inv1PCR反应液，所述Inv22PCR反应液包括检测重型血友病A致病基因内含子22基因倒位的引物3条，所述Inv1PCR反应液包括检测重型血友病A致病基因内含子22基因倒位的引物3条。本发明提高了Inv22长片断扩增稳定性、检测灵敏度、PCR产物量和电泳检测丰度，并进一步通过添加Taq DNA聚合酶抑制剂解决试剂保存时间、温度耐受等问题，提高本发明的临床应用的稳定性。

Description

重型血友病A致病基因突变检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术与生物医药领域，具体涉及检测重型血友病A致病基因内含子22和内含子1倒位突变的试剂盒。 

背景技术

血友病A（hemophilia A，HA）又称甲型血友病，是最为常见的X连锁隐性遗传性出血性疾病，其主要病因是由于凝血因子VIII（FVIII）基因突变而引起的FVIII含量不足或功能缺陷。HA患者常自发性或外伤性出血不止，出血可发生在任何部位，但以关节出血最为多见。反复多次关节出血可导致患者致残，甚至危及生命。临床上根据患者血浆FVIII促凝活性及症状严重程度将HA分为重型、中型和轻型，其中50%为重型。 

我国HA的发病率在男性人群中约为1/5000。血友病根据所缺乏凝血因子的不同分为血友病A和血友病B（hemophilia B，HB），HA约占全部血友病的80%-85%，HB则约占15%-20%且在临床上通常为中型和轻型。HA的人群患病率无种族和地区差异，可能与较高的基因自发突变率相关。由于是X连锁隐性遗传，女性HA患者及其罕见。 

FVIII基因全长186kb，位于X染色体长臂远端（Xq28），含有26个外显子和25个内含子，编码2351个氨基酸。随着人们对HA分子基础的认识不断深入，该病基因诊断的技术也得到了很大发展。截止2012年已经报道基因突变1400多种，主要是点突变、插入、缺失和倒位，其中内含子22倒位（Inversion 22，Inv22）突变约占全部重型血友病A的45%。1996年，Brinke等在一对同卵双生的重型HA双胞胎患者中第一次发现了FVIII基因第1号内含子倒位（Inversion1，Inv1）突变，在大样本重型HA患者中进行了该倒位的筛查，发现第1号内含子倒位是重型HA中仅次于第22号内含子倒位的突变热点。约50%的重型HA患者是由于内含子22倒位和内含子1倒位突变造成，这是近年来HA发病机制中重要的进展。 

目前血友病规范化诊断已建立了包括临床诊断、家系调查、实验检测等系列技术平台。实验检测分为基因诊断和非基因间接诊断。目前市场上所有的血友病诊断产品均采用非基因间接诊断，包括活化部分凝血活酶时间（APTT）、血浆凝血酶原时间（PT）、血浆FVIII：C以及FVIII抗原检测等。这些产品可以对HA进行确诊，但无法确定HA患者的基因突变类型更无法检出携带者。因此，开发可以方便、准确诊断HA的基因分型产品，有效应用于产前诊断，对避免重型血友病胎儿出生，减低HA发病率具有重要意义。 

Single tube PCR assay for detection of chromosomal mutations：application tothe inversion hotspot in the factor VIII gene including optional use of subcyclingPCR，该专利由Qiang Liu和Steven S Sommer发明，于2002年公开，专利号为US6355422B1。提出利用长距离PCR（Long Distance PCR，LD-PCR）法检测血友病A内含子22倒位突变。优势：一管PCR法，直接分型检测血友病A患者、携带者和野生型；缺限：成本高昂、耗时长、仅能检测内含子22倒位，检测系统不稳定，试剂需现用现配，无法作为临床检测产品应用。 

由上海佰真生物技术有限公司申请，2011年公开，专利公开号为CN102230002A的中国发明：“血友病致病基因检测试剂盒及应用”公开的技术方案主要针对FVIII和FIX因子外显子区设计PCR和测序引物。优势：同时检测血友病A与血友病B致病基因，覆盖全长序列；缺陷：测序反应耗时长、成本高昂，70%-80%血友病A的FVIII基因突变呈高度异质性，突变形式复杂，测序结果难以分析。 

目前，血友病A基因检测方法主要有： 

LD-PCR法：长距离PCR，一般指扩增片断超过5kb的PCR方法，但反应体系无法满足稳定性和低成本要求。 

Southern blot技术检测HA内含子22倒位，将待测的基因组DNA经限制性核酸内切酶消化后，琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，凝胶经碱处理使DNA变性，再将其从凝胶中印迹到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，以放射性或非放射性标记的DNA探针与固相支持体上的DNA杂交，根据探针的标记特性用相应方法显示杂交条带，对待测DNA进行分析。操作复杂、灵敏度低，已很少使用。 

反向PCR法检测HA内含子22倒位，利用限制性内切酶Bcl Ⅰ消化基因组后突变体片段存在差异，通过酶切产物进行自连，再利用PCR扩增，电泳分析。该方法耗时长达48h以上、操作复杂、对技术要求高，不适合开发产品。 

直接测序（DS）：通过DNA测序仪对FVIII全基因直接进行测序，找出基因突变的确切位置。但由于FVIII全基因片段很长，测序工作量大，时间长，限制了其在HA诊断上的广泛应用。 

单链构象多态性（SSCP）：通过PCR-单链构象多态性分析法检测小片段PCR产物＜200bp，可筛查出点突变等的70%-95%。但当PCR产物片段＞400bp时检出率不足50%，要保证检出率而使用小片段检测大大限制了此法在HA诊断上的应用。 

变性梯度凝胶电泳（DGGE）：利用野生型和突变型基因DNA在变性梯度凝胶过程中迁移率不同来检测基因突变，当检测片段＜600bp时检出率可达95%。DGGE比SSCP可靠、精准、且检测片段较长。 

变性高效液相色谱（DHPLC）：通过分离柱进行突变DNA片段的分离和分析，对FVIII基因突变的检出率达96%。此法快速高效，易于自动化，被检片段可达1500bp，但费用昂贵，与SSCP、DGGE法一样需经测序才能确定突变的具体位置。 

综上，现有技术中LD-PCR法由于反应体系无法满足稳定性和低成本要求，仅能检测内含子22倒位突变而无法开展广泛临床应用；测序法无法将结果分析与临床诊断进行有效结合；反向PCR法操作繁琐；SSCP仅适合检测点突变，DGGE和DHPLC操作繁琐、费用高昂、需测序确定突变的具体位置。 

发明内容

本发明的目的是运用LD-PCR法快速灵敏地检测HA患者的FVIII基因内含子22和内含子1倒位，可检出50%的重型HA患者。 

本发明的技术方案为提供一种重型血友病A致病基因突变检测试剂盒，所述试剂盒包括Inv22PCR反应液和Inv1PCR反应液； 

1)所述Inv22PCR反应液包括检测重型血友病A致病基因内含子22基因倒 位的引物3条，分别为： 

引物A22：SEQ ID NO：1； 

引物B22：SEQ ID NO：2； 

引物C22：SEQ ID NO：3； 

2）所述Inv1PCR反应液包括检测重型血友病A致病基因内含子22基因倒位的引物3条，分别为： 

引物1F：SEQ ID NO：4； 

引物1R：SEQ ID NO：5； 

引物2F：SEQ ID NO：6。 

优选的，上述重型血友病A致病基因突变检测试剂盒中所述Inv22PCR反应液还包括Taq DNA聚合酶抑制剂，所述Inv1PCR反应液还包括Taq DNA聚合酶抑制剂。 

优选的，上述重型血友病A致病基因突变检测试剂盒中所述Taq DNA聚合酶抑制剂为Taq-Antibody。 

优选的，上述重型血友病A致病基因突变检测试剂盒中所述试剂盒还包括Inv22阳性参考品、Inv1阳性参考品和阴性参考品，所述Inv22阳性参考品为Inv22杂合子混合质粒，所述Inv1阳性参考品为Inv1杂合子混合质粒，所述阴性参考品为去离子水。 

优选的，上述重型血友病A致病基因突变检测试剂盒中，所述的Inv22PCR反应液各组分含量为： 

2×GC buffer：25μL； 

10mM dATP、dCTP、dTTP的等体积混合液：2.0μL； 

10mM dGTP：1.5μL； 

10μM引物A22：1.25μL； 

10μM引物B22：0.625μL； 

10μM引物C22：0.625μL； 

5U/μL LA taq DNA聚合酶：1.0μL； 

5U/μL Taq-Antibody：1.0μL； 

去离子水：11.5μL； 

所述的Inv1PCR反应液各组分含量为： 

10×PCR buffer：2.5μL； 

2.5mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP的等体积混合液：4μL； 

10μM引物1F：0.5μL； 

10μM引物1R：0.5μL； 

10μM引物2F：0.5μL； 

5U/μL Hotstar Taq酶：1.0μL； 

5U/μL Taq-Antibody：0.5μL； 

去离子水：13.5μL。 

本发明有益效果为：按照基因倒位原理，在FVIII基因内含子22和内含子1同源序列两端分别设计特异性引物，基因重组后，引物对发生交叉扩增，从而获得不同长度的扩增片段。本发明采用多重LD-PCR法开发高特异性的HA基因诊断产品。其优点如下：第一，解决Inv22长片断扩增稳定性、检测灵敏度、PCR产物量和电泳检测丰度的问题，提高对高GC片断的扩增效率、筛选dNTP浓度增强扩增特异性、筛选电泳条件提高检测PCR产物条带亮度；第二，通过添加Taq DNA聚合酶抑制剂解决试剂保存时间、温度耐受等问题，提高本发明的临床应用的稳定性。 

附图说明

图1为本发明Inv22PCR产物电泳图；其中1：Inv22杂合突变，携带者；2：Inv22纯合突变，HA患者；3：wild type；4：Inv22阳性参考品；5：阴性参考品； 

图2为本发明Inv1PCR产物电泳图；其中1：Inv1杂合突变，携带者；2：wild type；3：Inv1纯合突变，HA患者；4：Inv1阳性参考品；5：阴性参考品；6：Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，200bp，100bp)。 

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。 

现有技术中LD-PCR法由于反应体系无法满足稳定性和低成本要求、仅能检测内含子22倒位突变而无法开展广泛临床应用；本发明利用LD-PCR技术，同时检测重型血友病A内含子22和内含子1倒位突变，这两类突变覆盖50%的重型血友病A患者。通过添加保护剂，解决试剂稳定性问题；优化反应体系，降低试剂成本，使产品真正应用于临床，填补国内外血友病基因诊断产品空白。 

在FVIII基因内含子22中有两个基因FVIIIA和FVIIIB，而X染色体远端另有两个与FVIIIA同源的基因。FVIIIA可与两个同源基因之一发生同源重组，从而使FVIIIA基因内含子22倒位至基因外远端。内含子1倒位分子机制与Inv22相似：在FVIII基因的1号内含子内int1h21序列和基因外远端int1h22序列同源性高达99.9%。Int1h21和int1h22发生基因重组后可形成两个嵌合的mRNA，FVIII基因转录被终止并与信号肽分离，导致FVIII蛋白合成与分泌失败。 

按照基因倒位原理，在FVIII基因内含子22和内含子1同源序列两端分别设计特异性引物，基因重组后，引物对发生交叉扩增，从而获得不同长度的扩增片段。据此，采用多重LD-PCR法开发高特异性的HA基因诊断产品。本发明从两个角度进行开发，第一，解决Inv22长片断扩增稳定性、检测灵敏度、PCR产物量和电泳检测丰度，提高对高GC片断的扩增效率、增强扩增特异性并提高电泳检测分辨率；第二，为解决临床应用产品的稳定性，通过添加Taq DNA聚合酶抑制剂解决试剂保存时间、温度耐受等问题。 

抑制剂在保存液状态抑制PCR反应液内Taq DNA聚合酶活性，在PCR反应开始后失活抑制剂，并恢复Taq DNA聚合酶活性，从而提高了Taq DNA聚合酶对环境温度耐受性。本发明选择的Taq DNA聚合酶抑制剂为Taq-Antibody（Ap），它是一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体，通过与Taq DNA聚合酶结合抑制酶活性，有效抑制引物二聚体的形成和非特异性扩增，同时增强了酶的温度耐受能力。 

实施例1本发明试剂盒组成 

本发明试剂盒特征包括Inv22PCR反应液、Inv1PCR反应液、Inv22阳性参 考品、Inv1阳性参考品、阴性参考品。 

Inv22PCR反应包括Taq DNA聚合酶、PCR buffer、Deaza-dGTP、dNTP、引物和Taq-Antibody（Ap）； 

Inv1PCR反应液包括Taq DNA聚合酶、PCR buffer、dNTP、引物和Ap； 

Inv22阳性参考品是含有Inv22PCR扩增产物全部片断的混合质粒； 

Inv1阳性参考品是含有Inv1 PCR扩增产物全部片断的混合质粒； 

阴性参考品的成分为ddH2O； 

1、引物序列设计 

根据已报道重型血友病A的FVIII基因倒位机制和序列，对相应引物进行了大量实践的筛选，包括增加或减少引物长度，并设计系列引物覆盖特异性区域，通过正交试验最终确定检测HA内含子22基因倒位引物3条，如表1所示，分别为A22，B22和C22；检测HA内含子1基因倒位引物3条，分别为1F、1R和2F。 

表1 

2、PCR反应液 

2.1、Inv22PCR反应液成分 

所述的HA的检测试剂盒基因Inv22PCR反应液中Taq DNA聚合酶选用LATaq（TAKARA生物技术有限公司）、GXL Taq（TAKARA），使用终浓度为0.5-10IU/反应；所述的PCR Buffer为GC buffer（TAKARA），终浓度为0.2倍-2倍；所述的Deaza-dGTP终浓度为1-10mM；所述的dNTP混合液的各组分终浓度为1-30mM；所述的Ap终浓度为0.1-5IU/反应；提取的基因组模板DNA浓度为10-200ng，通过正交设计实验验证，最终确认以下表2所示反应体系为最佳。 

组分	使用量
		gDNA	5.0μL(40-100ng)
2×GC Buffer(Takara)	25μL
		dNTP（A/T/C）10mM	2.0μL
dGTP(10mM)	1.5μL
		Deaza-dGTP(10mM)	0.5μL
引物A22/B22/C22(10μM))	1.25μL/0.625μL/0.625μL
		LA taq DNA聚合酶(5U/μL)	1.0μL
Ap(5U/μL)	1.0μL
		ddH2O	11.5μL

表2 

2.2、Inv1 PCR反应液 

所述的HA检测试剂盒的Inv1基因PCR反应液中Taq DNA聚合酶选用Hotstart Taq（QIAGEN）、Taq DNA聚合酶（TAKARA、PROMEGA和TIANGEN），使用终浓度为0.5-10IU/反应；所述的PCR Buffer为各酶相应Buffer，终浓度为0.2倍-2倍；所述的dNTP混合液各组分终浓度为1-30mM；所述的Ap终浓度为0.1-5IU/反应；提取的基因组模板DNA浓度为0.5-50ng，通过正交设计实验验证，最终确认以下表3所示反应体系为最佳。 

组分	使用量
		gDNA	2μL（5-20ng）
10×PCR buffer（Qiagen）	2.5μL
		dNTP（A/T/G/C）(各2.5mM)	各1.0μL，共4.0μL
Primers 1F/1R/2F（10μM）	各0.5μL，共1.5μL
		Hotstar Taq(5U/μL，Qiagen)	1.0μL
Ap(5U/μL)	0.5μL
		ddH2O	13.5μL

表3 

2.3、PCR反应程序 

通过预变性、变性、延伸时间和温度梯度试验，优化反应条件，最终确定PCR扩增程序为：Inv22 PCR扩增程序如表4所示，Inv1 PCR扩增程序如表5所示。 

表4 

表5 

3、电泳检测 

采用0.6-0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，Inv22上样量为20μL，Inv1上样量为5μL。为获得清晰电泳条带，推荐使用电压低于3.5v/cm对Inv22 PCR产物进行电泳。 

如图1和图2所示。采用0.6-0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测，Inv22野生型仅显示12kb条带，患者显示11kb条带，携带者同时显示12kb和11kb条带；Inv1野生型显示1.9kb条带，患者显示1.3kb条带，携带者同时显示1.9kb和1.3kb条带。 

实施例2本发明试剂盒的使用 

1、储存条件及有效期 

储存条件：试剂盒置于-18℃以下保存 

有效期：6个月 

2、适用仪器 

PCR仪（黑马9600），ABI9700等 

3、样本要求 

本试剂盒样本来源为抗凝全血，所用抗凝剂为枸橼酸钠或EDTA，不能使用肝素抗凝。 

样本采集：抽取静脉血5mL，放入含有抗凝剂的管中，标记好样本的姓名和编号等样本信息。 

血样保存：抗凝全血在室温放置不超过24小时，2-8℃保存不超过一个月，-18℃以下冰箱保存不超过两年，-70℃冰箱可长期保存，冷冻保存时应避免反复冻融。 

血样运输：抗凝全血运输时需用冰壶或泡沫箱加冰袋密封，应保证冰袋不化冻，且在途时限不宜超过72小时。 

4、检验方法 

1.1、DNA获取 

为保证基因组DNA的提取纯度，本发明试剂盒推荐使用QIAGEN公司的全血DNA提取试剂盒。 

2、扩增试剂准备 

从试剂盒中取出核酸扩增试剂置于室温融化并振荡混匀，2000rpm离心10sec。 

设所需要的PCR反应管管数为n，n=待检样本数×2+1管阴性参考品+2管阳性参考品； 

3、加样 

向各PCR反应管中分别加入待检样本DNA、阴性参考品和阳性参考品DNA，盖紧管盖。短暂离心后置于PCR检测仪中并记录样本摆放顺序。 

Inv22 PCR扩增程序如表6所示，Inv1 PCR扩增程序如表7所示。 

表6 

表7 

电泳检测 

采用0.6-0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，Inv22上样量为20μL，Inv1上样量为5μL。为获得清晰电泳条带，推荐使用电压低于3.5v/cm对Inv22PCR产物进行电泳。 

检验结果的解释 

Inv22野生型仅显示12kb条带，患者仅显示11kb条带，携带者同时显示12kb和11kb条带；Inv1野生型仅显示1.9kb条带，患者仅显示1.3kb条带，携带者同时显示1.9kb和1.3kb条带。其他参考品显示如表8所示结果。 

表8 

实施例3本发明试剂盒与已有技术检测稳定性比较 

本发明试剂盒通过添加Taq DNA聚合酶抑制剂来解决试剂保存时间、温度耐受等问题。选用已有Liu和Sommer的Inv22专利配方作为对照，专利号为US6355422B1。该专利利用长距离PCR法检测血友病A内含子22倒位突变，配方为常规PCR反应液，包括Taq DNA聚合酶、引物、dNTP、deaza-GTP和高浓度的DMSO。 

本试验按照本发明实施例1所述试剂盒与Liu等发明专利配方，分别连续试生产三批产品对Inv22进行稳定性检测。本发明试剂盒批号为YN01、YN02和YN03，对照试剂批号为LS01，LS02和LS03。 

1、试验方法 

1.1、连续三批试生产产品稳定性试验 

将本发明实施例1所述试剂盒保存于-18℃以下，自生产之日起，每1个月进行一次检测，连续检测6个月。本发明试剂盒按照实施例1所述方法进行PCR检测，对比专利试剂按其专利配方进行检测。分别检测5份Inv22杂合子、5份Inv22纯合子，对比试剂使用相同模板，模板量为50ng/反应，每个样本设三次重复。 

1.2、加速破坏性试验 

分别选取一批保存期内正常使用产品在37℃下保存1天、3天、5天和7天，并进行PCR检测，检测方法同1.1。 

1.3、研究结果 

1.3.1、稳定性试验 

三批产品在指定条件下保存6个月的稳定性检测结果表明，本发明试剂盒在-18℃连续保存6个月，仍然可以稳定对Inv22进行检测，而对比试剂在相同条件下保存2个月时开始出现不稳定情况，Inv22杂合子基本不能扩增，3个月时完全无扩增，部分检测结果见表9。 

表9 

如表9为连续三批稳定性和破坏性试验结果，其中，“+”表示PCR正常扩增，“-”表示PCR检测无扩增 

1.3.2、加速破坏试验 

本发明试剂盒在37℃放置1天至7天均可稳定检出Inv22杂合子和纯合子，而对照试剂在3天时出现不稳定情况，5天完全无扩增，结果见表10。 

批号	1天	3天	5天	7天
					YN01	+	+	+	+
YN02	+	+	+	+
					YN03	+	+	+	+
LS 01	+	+  -  -
					LS02	+  -  -  -
LS 03	+  -  -  -

表10 

表10为加速破坏性试验结果，其中“+”表示PCR正常扩增，“-”表示PCR 检测无扩增 

稳定和破坏性对比试验结果表明，本发明试剂盒的试剂配方提高了TaqDNA聚合酶的耐受能力，有效解决了LD-PCR扩增稳定性问题。 

本发明试剂盒中Inv1检测反应体系在添加等比例的Taq DNA聚合酶抑制剂后，也可保证6个月效期，并在37℃放置7天后保持高扩增效率。 

实施例4使用本发明试剂盒诊断临床样本中重型HA患者 

利用本试剂盒检测临床样本50例，所有样本均采用金标准测序方法进行验证，检测结果见表11：使用本发明试剂盒检测临床样本中血友病A基因突变情况，统计分析对比结果见表表12：50例临床样本中各基因型测序结果和本试剂盒检测结果符合情况统计。 

表11 

本发明试剂盒检测50例临床样本和金标准测序结果对比，准确性为100%；本发明试剂盒检测50例临床样本结果和金标准测序结果对比分析统计，见表12。 

表12 

从表12可以看到50例临床样本中，本试剂盒检测范围内的Inv22纯合突变、Inv22杂合突变、Inv1纯合突变、Inv1杂合突变以及野生型均有存在，且本试剂盒检测准确性和特异性均在100%。 

本发明试剂盒产品的性能指标： 

1、灵敏度：本品能稳定检出的Inv22基因组DNA下限为30ng/反应；Inv1基因组DNA下限为2ng/反应； 

2、准确性：本品检测FVIII基因Inv22和Inv1的准确性达100％； 

3、特异性：本品检测FVIII基因Inv22和Inv1特异性达100％； 

4、重复性：本品检测FVIII基因Inv22和Inv1重复性为100％； 

5、稳定性：本品在有效期6个月内使用完全可满足以上各指标。 

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。 

SEQUENCE LISTING 

<110>亚能生物技术（深圳）有限公司 

<120>重型血友病A致病基因突变检测试剂盒 

<160>6 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>31 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>1 

cctgcctgtc cattacactg atgacattat g                                    31 

<210>2 

<211>36 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>2 

ccctacaacc attctgcctt tcactttcag tgcaat                               36 

<210>3 

<211>33 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>3 

ccaaactata accagcacct tgaacttacc ctc                                  33 

<210>4 

<211>17 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>4 

gttgttggga atggtta                                                    17 

<210>5 

<211>19 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>5 

ctagcttgag ctccctgtg                                            19 

<210>6 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>6 

gcagggatct tgttggtaaa    。                                       20 

Claims (5)

1.重型血友病A致病基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Inv22PCR反应液和Inv1PCR反应液；

1)所述Inv22PCR反应液包括检测重型血友病A致病基因内含子22基因倒位的引物3条，分别为：

引物A22：SEQ ID NO：1；

引物B22：SEQ ID NO：2；

引物C22：SEQ ID NO：3；

2）所述Inv1PCR反应液包括检测重型血友病A致病基因内含子22基因倒位的引物3条，分别为：

引物1F：SEQ ID NO：4；

引物1R：SEQ ID NO：5；

引物2F：SEQ ID NO：6。

2.如权利要求1所述的重型血友病A致病基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述Inv22PCR反应液还包括Taq DNA聚合酶抑制剂，所述Inv1PCR反应液还包括Taq DNA聚合酶抑制剂。

3.如权利要求2所述的重型血友病A致病基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶抑制剂为Taq-Antibody。

4.如权利要求1所述的重型血友病A致病基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Inv22阳性参考品、Inv1阳性参考品和阴性参考品，所述Inv22阳性参考品为Inv22杂合子混合质粒，所述Inv1阳性参考品为Inv1杂合子混合质粒，所述阴性参考品为去离子水。

5.根据权利要求1所述的重型血友病A致病基因突变检测试剂盒，其特征在于，

所述的Inv22PCR反应液各组分含量为：

2×GC buffer：25μL；

10mM dATP、dCTP、dTTP的等体积混合液：2.0μL；

10mM dGTP：1.5μL；

10μM引物A22：1.25μL；

10μM引物B22：0.625μL；

10μM引物C22：0.625μL；

5U/μL LA taq DNA聚合酶：1.0μL；

5U/μL Taq-Antibody：1.0μL；

去离子水：11.5μL；

所述的Inv1PCR反应液各组分含量为：

10×PCR buffer：2.5μL；

2.5mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP的等体积混合液：4μL；

10μM引物1F：0.5μL；

10μM引物1R：0.5μL；

10μM引物2F：0.5μL；

5U/μL Hotstar Taq酶：1.0μL；

5U/μL Taq-Antibody：0.5μL；

去离子水：13.5μL。

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