CN102732625A - 奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及奶牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）的检测方法，特别涉及一种奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序（Pyrosequcing）检测方法。主要是根据Genbank已发表的BLAD CD18序列，设计针对SNP位点的特异性PCR引物和测序引物，上游引物CD18F1：5‘-GTTGCGTTCAATGTGACCTTC-3’，下游引物CD18R2：5‘-GGTCATCCACCATGGAGTAGG-3’且5’端用生物素标记，测序引物S2：5‘-TCCGGAGGGCCAAGG-3’。本发明提供的奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法具有方便、快速、敏感、稳定、特异、可靠的特点，适合BLAD CD18基因的常规检测和规模化检测。

Description

奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法

技术领域

本发明涉及奶牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）的检测方法，特别涉及一种奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序（Pyrosequcing）检测方法。

背景技术

奶牛白细胞黏附缺陷症（bovine leukocyte adhesion deficiency，BLAD）是一种发生于发生于荷斯坦（Holstein）奶牛的隐性遗传性免疫缺陷疾病，由常染色体上CD18基因单碱基突变(A→G)引起，病因为CDl8基因表达缺陷，隐性基因纯合时引起临床发病，主要以严重的重复性感染，脓液形成减少，伤口愈合迟缓和白细胞增多为特征。近30年来，我国从美国、加拿大及澳大利亚等进口大量的活牛，其中大部分为荷斯坦牛，由于BLAD有害基因多以杂合的状态存在，携带者并不发病，加之对此病没有足够的认识和重视，不可避免地引入大量潜在的BLAD携带者，而携带者表现正常，很难发现，一旦被发现时，其已经在畜群中进行了长时期的传播，给我国养牛业和乳制品行业的发展带来了重大的经济损失。BLAD遗传缺陷的发现已引起了各国奶牛育种协会和育种工作者的重视，美国、日本、丹麦、荷兰等国已相应建立了种公牛遗传缺陷基因的分子检测方法和育种计划，将BLAD造成的损失降低。我国拥有700万头以上的荷斯坦奶牛，由于缺乏简便有效的BLAD隐性有害基因的检测方法，无法开展常规检测和大规模的普查统计，因此对我国牛群中BLAD的发病和携带情况尚不十分清楚，也就更谈不上从牛群中净化BLAD。

在对BLAD CD18基因的分析中，现有方法主要有PCR-SSCP，PCR-RELP和RT-PCR等。PCR-RFLP即聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(polymerasechain react ion-restriction fragment length polymorphism)，因为DNA的多态性，不同的等位基因使DNA的限制性内切酶位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，有些位点能切开，有些不能，使酶切后产生的片段数目和每个片段的长度不同，用琼脂糖凝胶电泳判断酶切位点是否有效，从而区别不同基因位点。王洪梅等（王洪梅，李建斌，许尚忠等。中国荷斯坦牛白细胞黏附缺陷症检测方法的研究进展[J].生物技术通报。2007，3:155-158）对济南市11个奶牛场356头奶牛及53头Holstein种公牛进行了BLAD的PCR-RFLP检测（Kehrli MEJr,Schmalstieg FC,Anderson DC,Van der Maaten MJ,Hughes BJ,AckermannMR,Wilhelmsen CL,Brown GB,Stevens MG，Whetstone CA.Molecular definition ofthe bovine granulocytopathy syndrome:identification of deficiency of theMac-1(CD11b/CD18)glycoprotein[J].Am J Vet Res,1990,51(11):1826-1836.），Taq

Ⅰ酶切后，根据RFLP图谱分为2个基因型，正常基因纯合子切成2条片段，杂合子切成3条片段。共检出3头母牛携带者，占母牛群的0.84%，在Holstein种公牛中没有发现隐性突变基因的携带者。Mukho等（Mukhopadhyaya P N,Mehta HH,Rathod R N.A method for the simulation of normal,carrier and affected controlsfor PCR-RFLP screening of a genetic disease in dairy cattle[J].Mol CellProbes,2000,14(6):381-384.）用PCR-RFLP法对CD18基因进行检测，检出结果与上述一致。应用PCR-RFLP技术，优点是价格便宜，技术简便，适用于少量样品的已知SNP（Single Nucleotide Polymorphisms，单核苷酸多态性）判断。缺点是费时费力，试验速度慢，灵敏性差，仅能检测有酶切位点的片段。

PCR-SSCP即聚合酶链式反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single stranded conformation polymorphism)，是一种基于单链DNA构象差别的检测方法。将DNA片段进行PCR扩增后，在变性剂或低离子浓度的作用下，使之成为单链DNA分子，单个碱基的改变使空间构象也发生改变，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将构象上有差异的分子区分开。李艳华等（李艳华，张胜利等。利用单链构象多态性检测牛白细胞黏附缺陷症方法的建立[J].中国兽医学报，2007,29(12):1471-1474）对125头荷斯坦种公牛的血液样品进行了SSCP分析，结果发现了H1、H2、H3及H4四种单倍型，单倍型H1、H2、H3的个体是正常牛，H4是BLAD携带，即有害基因携带者（李艳华，韩广文，张胜利等。牛白细胞黏附缺陷症(BLAD)的检测与单倍型分析[J].畜牧兽医学报，2008,39(9):1285-1288），在125份牛血液样品中，单倍型为H4的检出1份，检测出携带率是0.8%。并进行测序验证，测序结果表明，SSCP基因分型结果正确，且准确率达99%以上。PCR-SSCP可以检测所有的点突变，在具体操作时要得到清晰一致的结果，需要对各种条件进行控制。

马金柱等（马金柱，宋佰芬等。黑龙江省某牛场种公牛牛白细胞粘附缺陷病（BLAD）的调查[J].黑龙江八一农垦大学学报，2011,23(5):35-37）用RT-PCR方法检测了106头荷斯坦奶牛，结果发现1头BLAD携带者，其余为健康牛。扩增的基因片段为575bp，用限制性内切酶酶切后，根据电泳酶切片段来进行诊断。BLAD病牛产生199、376bp 2个片段，健康牛产生106、199和270bp 3个片段，BLAD携带牛产生106、199、270和376bp 4个片段。Tajima等用此法也进行了检测，健康牛产生3个片段，BLAD牛产生2个片段，而BLAD携带牛出现4个片段。Tajima等用另外1对引物扩增了大约600bp的片段，使用Taq

Ⅰ处理后健康牛产生100、200、300bp3个片段，BLAD牛产生200、400bp2个片段，而BLAD携带牛则出现100、200、300、400bp 4个片段。Tammen等（TammenI,Klippert H,Kuczka A,Treviranus A,Pohlenz J,Stober M,Simon D,Harlizius B.Animproved DNA test for bovine leukocyte adhesion deficiency[J].Res VetSci,1996,60(3):218-221）和Kriegesmann等也都分别对该试验进行了改进，使扩增片段延长，酶切后也易于区分各个电泳带。

钟诚等采用Northern印迹分析法对BLAD CD18基因进行检测，结果表明，正常牛的转录与患病牛犊的的转录，无论在印迹斑点大小和水平上，都无显著差异。

CN 102002527A公开了一种用于检测牛CD18基因D128G突变的引物和特异性的Taqman MGB探针，利用这些引物和探针，采用实时荧光定量PCR技术，能够快速灵敏地检测待测牛CD18基因D128G突变位点基因型，从而准确筛查BLAD遗传缺陷携带者。

CN 100419088C公开了一种筛选CD18基因正常的优良种牛的方法及其专用引物。其引物是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对。该方法是以待测牛的基因组DNA为模板，在由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列所组成的引物对的引导下进行PCR扩增，检测扩增片段自5’端第32位碱基为A、G还是N，扩增片段自5’端第32位碱基为A的种牛为CD 18基因正常的优良种牛；所述N为A和G的杂合体。

CN 101899511A公开了一种应用AS-PCR检测牛白细胞黏附缺陷的方法，其通过制备一种用于牛黏附缺陷检测方法的特异性PCR引物，所述引物包括：CD18基因扩增引物：突变型扩增引物长度为500bp；引物1：5’AAGATGACGAGGAGCAGAA 3’，引物2：5’GTCCATCAGGTAGTACAGGC 3’；野生型扩增产物长度为818bp；引物3：5’CAAGGGCTACCCCATCGA 3’，引物4：5’CAGGACTGCGTGGCTAAA 3’。该引物可直接应用于在体外开展牛黏附缺陷的致病基因的筛选。

上述提到的现有检测BLAD的方法，有的检测成本高，检测时间长，有的操作繁琐，检测通量低，均不适合常规检测和规模化检测，难以在实际工作中应用。我国急需建立起快速、敏感、稳定、可靠的BLAD检测方法，开展积极的BLAD致病基因筛查，从而阻断BLAD致病基因的下传。

焦磷酸测序法(pyrosequencing)是由Ronagi（Ronagi M,Uhlen M,Nylen P.Asequencing method based on real time pyrophosphate[J].Science,1998,281(5375):363-365.）等建立的一种新的DNA序列分析方法，适用于对已知短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与Sanger DNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。该技术无需凝胶电泳，无需对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色，因其快速、特异和敏感等优点被广泛应用于多个领域，具有大通量、低成本、快速、直观的特点。但是目前未见有关于用焦磷酸测序法检测BLAD的报道，本发明拟在焦磷酸测序法的基础上建立起方便且特异的BLAD检测方法。

发明内容

本发明目的在于，提供奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序（Pyrosequcing）检测方法，其具有方便、快速、敏感、稳定、特异、可靠的特点，适合BLAD CD18基因的常规检测和规模化检测，结果准确可靠，不仅能为BLAD检测试剂盒的研发奠定基础，而且可以掌握BLAD CD18基因携带和发病情况，排除隐性有害基因的携带者，避免和降低优秀种公牛传播扩散有害基因的风险，为防止和阻断BLAD致病基因的下传等作出贡献。

焦磷酸测序法是在同一反应体系中，DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶催化的酶级联化学发光反应。反应底物为5’-磷酰硫酸（APS）、荧光素（luciferin），反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测。

具体原理是在每一次测序反应中，加入一种核苷酸，若该核苷酸能与模板DNA配对，在聚合酶的作用下，掺入到引物链中，同时核苷酸中的焦磷酸基团(PPi)被释放。ATP荧光素酶在APS存在的情况下催化PPi形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出的可见光信号与ATP量成正比，峰值由pyrogram^TM反应，高度与反应中掺入的dNTP数目成正比。根据加入dNTP类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核苷酸序列。

焦磷酸测序法的反应过程主要包括以下步骤：①特异性的测序引物与单链DNA模板相结合，然后加入酶混合物(DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶)和底物混合物(APS和荧光素)。②加入一种dNTP到①的反应体系中，如果其能与DNA模板的下一个碱基配对，则通过DNA聚合酶的作用，加在测序引物的3’末端，焦磷酸(PPi)被释放，所释放出来的PPi的量与和模板结合的dNTP的量成正比。③光信号由CCD摄像机检测，并由pyrogram^TM反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的dNTP数目成正比。ATP荧光素酶在APS存在的情况下催化PPi形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，同时产生光信号。④在Apyrase的作用下，ATP和未掺入的dNTP发生降解，淬灭光信号并再生反应体系。⑤加入下一种核苷酸。

基于上述焦磷酸测序法的原理以及本发明所要达到的目的，本发明采用如下技术方案：

奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法，具体步骤如下：

（1）根据Genbank已发表的BLAD CD18序列，设计针对SNP（单核苷酸多态性）位点的特异性PCR引物和测序引物：

上游引物CD18F1：5‘-GTTGCGTTCAATGTGACCTTC-3’，

下游引物CD 18R2：5‘-GGTCATCCACCATGGAGTAGG-3’，

下游引物R2的5’端用生物素标记。

引物所限定的目的片段大小为90bp。

退火温度62℃。

测序引物S2：5‘-TCCGGAGGGCCAAGG-3’。

上述引物序列通过反复的预实验确定，由此序列扩增出的PCR产物浓度较高（5μL PCR产物电泳检测约有40-100ng），不会出现较低浓度时扩增特异性差所导致的测序图中出现干扰杂峰，最终不能分析出相应的基因型的问题。引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。

退火温度在62℃时，所得到的PCR产物在电泳时可以得到单一信号较强的条带，即在此退火温度下没有引物二聚体产生，还能保证得到目的产物的量最高，足够用于测序反应。

（2）初步建立奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法：

1）取BLAD CD18基因标准野生型质粒（以下简称A/A型质粒）、BLADCD18基因标准突变型质粒（以下简称G/G型质粒）、BLAD CD18野生型和突变型双基因型杂合子质粒（以下简称A/G型质粒）各1μL分别作为模板，并用无菌水代替质粒DNA模板作为阴性对照，以步骤（1）设计的特异性PCR引物为引物，分别配置50μL的PCR Mix反应体系。具体的PCR Mix反应体系为：25μL 2×PCR TaqMix、1μL上游引物CD18F1、1μL下游引物CD18R2、2μL牛血液基因组DNA、21μL ddH₂O。反应液配好后瞬时离心。PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性15s、62℃退火30s、72℃延伸30s，45-50个循环，72℃5min。

优选地，所述上游引物和下游引物的量在50μL的PCR反应体系中为5-10pmol，在此范围内可保证PCR反应充分进行且反应结束后体系中没有生物素标记的游离引物，进而保证了后续的单链纯化效率。

优选地，所述PCR反应程序为50个循环。

2）PCR反应结束后，产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测，经与标准DNAMarker条带比较，发现除阴性对照外，以三种CD18标准质粒为模板的PCR产物均为90bp大小的DNA片段，与引物所限定的目的片段大小一致，进行后续实验。

3）按照标准操作分别对以三种CD18标准质粒为模板的PCR产物进行单链的分离纯化和焦磷酸测序：

①从冰箱取出反应所需溶液，保证实验操作前所有溶液都达到室温；混匀Sepharose beads，混匀后立即将需要使用的sephare beads总量转移到一个Eppendorf管中备用，sephare beads总量以每个样品3μL计算。

②取3μL sepharose beads与47μL结合缓冲液混匀，得到50μL的混合物Ⅰ。

③将混合物Ⅰ迅速加入到步骤（3）的PCR扩增产物（50μL反应体积）中，得到混合物Ⅱ。

④常温下，将混合物Ⅱ于PCR板中振荡混匀10-15min，振荡速率1300-1400rpm，以使sepharose beads与下游引物R25’端的生物素充分结合。

⑤在PSQ板中预先加入45μL含有0.3μM测序引物的退火缓冲液。

⑥在真空准备工作台中，分别加入180ml高纯水、180ml 70%乙醇、180ml洗涤缓冲液和120ml变性缓冲液于四个样品板中；打开真空准备工作台的泵，将真空准备器于高纯水中清洗至少30s。

⑦将真空准备器移到步骤④中已经完成振荡混匀的PCR板中，抓取结合有sepharose beads的PCR产物，先后在70%乙醇、变性缓冲液和洗涤缓冲液中洗5-10s；将真空准备器放到含有测序引物的板上方，对准反应孔后再停掉面板上的抽真空开关，再将真空准备器放入PSQ Low反应板并摇动，释放结合sepharosebeads的单链PCR产物。

⑧单链PCR产物80℃放置2min，再取出冷却到室温。

⑨应用Pyromark Q96焦磷酸测序仪和SNP试剂盒，依次在试剂仓中加入酶混合物（DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶），底物混合物（底物APS和荧光素）和4种dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），进行测序反应，经SNP软件分析得到测序图。优选地，所述Pyromark Q96焦磷酸测序仪在18-28℃的条件下运行。

测序结果如图1所示，图中横轴代表碱基，纵轴代表信号值。三种标准质粒的基因型分别为A/A，G/G和A/G。测序图中，下边所标字母第一个是E，没有峰；第二个是S，有一个高度不等小峰；第三个是T，是程序特地设置的一个阴性对照峰，没有峰；后面的G，C，T，A就是后面的序列，峰高近似相等，表示序列为GCTA，和GenBank收录的序列相同，说明测序是准确的。由图中可以看出，焦磷酸测序结果信噪比高，能清晰显示出所检测片段的DNA序列，按照基因片段的序列，可迅速识别出基因型。由此建立起了BLAD焦磷酸检测方法。

（3）奶牛血液样品的提取及检测：

1）将300份荷斯坦奶牛血液样品用试剂盒方法分别提取DNA，具体方法如下：

①吸取300μL新鲜血液，加入3倍体积红细胞裂解液，颠倒混匀，放置5min，放置期间颠倒混匀几次，10000r/min离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底混匀；

②加入20μL蛋白酶K溶液，混匀；

③加入200μL缓冲液GB，剧烈颠倒混匀，70℃放置10min，溶液变清亮，简短离心；

④加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心；

⑤将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

⑥向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

⑦向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

⑧向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12000r/min离心30s，倒掉废液；

⑨将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

⑩将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱液TE，室温放置5min，12000r/min离心2min，将溶液收集到离心管中，管中为提取的牛血液基因组DNA，置于-20℃保存。

2）将提取的300份奶牛血液样品用步骤（2）建立起来的焦磷酸测序法进行检测：

①以步骤（1）设计的特异性PCR引物为引物，配置50μL的PCR Mix反应体系：25μL 2×PCR TaqMix、1μL上游引物CD18F1、1μL下游引物CD18R2、2μL牛血液基因组DNA、21μL ddH₂O。反应液配好后瞬时离心。PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性15s、62℃退火30s、72℃延伸30s，45-50个循环，72℃5min。

②PCR反应结束后，产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测，以DL2000DNAMarker为标准，结果如图2所示，图中从左向右依次为Marker、阴性对照和目的产物。从图中可以看出，扩增出的CD18序列的PCR产物大小近似90bp，与引物所限定的目的片段大小一致，并且电泳条带单一又具备一定的浓度。

③用与步骤（2）3）相同的方法对300份荷斯坦奶牛血液DNA样本分别进行单链的分离纯化和焦磷酸测序，结果发现有A/A和A/G两种基因型，分别对应正常个体和BLAD携带者。

结果如图2和图3所示，图中下边所标字母第一个是E，代表酶，没有峰；第二个是S，代表底物，有一个高度不等小峰；第三个是T，是程序特地设置的一个阴性对照峰，没有峰；后面的G，C，T，A就是后面的序列，峰高近似相等，表示序列为GCTA，和GenBank收录的序列相同，说明测序是准确的。由图中可以看出，焦磷酸测序结果信噪比高，能清晰显示出所检测片段的DNA序列，按照基因片段的序列，可迅速识别CD18基因型。

本发明通过焦磷酸测序技术，检测了300头荷斯坦奶牛BLAD CD18基因的突变情况，统计结果显示，基因型A/A的样品294个，基因型A/G的样品6个，正常个体及携带者的比例分别为98%和2%。

为了验证本发明方法的可靠性，进行了300个样本的重复性试验3次，以观察批量检测BLAD的可靠性。结果表明，在3次重复试验中，突变检出率和重复率均为100%。

从步骤（3）1）提取的300份荷斯坦奶牛血液样品DNA中取出6例A/G基因型的样品和随机挑选的24例A/A基因型的样品，共30例样品委托北京诺赛公司进行普通基因测序分析，结果如下表1所示：

表1

从表1种可以看出，BLAD CD18基因的焦磷酸测序结果与普通测序结果完全一致，符合率达到100%，说明焦磷酸测序的方法用于检测BLAD完全可行且可靠。

本发明中所用到的实验材料如下：

（1）样品：

选择自2010年左右进口奶牛全血样品300份，样品由中国检验检疫科学研究院提供，-80℃冻存。

（2）试剂及试剂盒

（3）质粒：

①BLAD CD18基因标准野生型（A/A型）质粒，

②BLAD CD18基因标准突变型（A/G型）质粒，

③BLAD CD18野生型和突变型双基因型（A/G型）杂合子质粒。

上述三种标准质粒均由本实验室自行制备，详细的制备方法见申请号为201210179092.5的中国发明专利申请。

（4）主要试剂的配制

①电泳缓冲液(50×TAE贮存液)：称取Tris 242g，冰乙酸57.1mL，加入100mL 0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0)，定容至1L，用前以蒸馏水稀释为1×工作液。

②SYBR Green Ⅰ染料（电泳级）工作液：取TAE电泳工作缓冲液与SYBRGreen Ⅰ染料以1:3的比例配置。

③结合缓冲液（Binding buffer，PH7.6）的配制：10mmol/L Tris-HCL 1.21g，2mol/L NaCl 117g，1mmol/L EDTA0.292g，0.1%Tween 201ml，将上述化学试剂溶于900mL超纯水，在室温下用1mol/L HCL将PH调至7.6，加入1mL 0.1%Tween 20，加超纯水定容至1000mL。

④退火缓冲液（1x Annealing buffer，PH7.6）的配制：20mmol/L Tris-醋酸2.42g，2mmol/L醋酸镁0.43g，将上述化学试剂溶于900mL超纯水，在室温下用4mol/L醋酸将PH调至7.6，加超纯水定容至1000mL。

⑤变性缓冲液（Denaturation buffer 0.2mol/L）：NaOH 8.0g，将其溶于950mL超纯水，加超纯水定容至1000mL。

⑥洗涤缓冲液（Washing buffer，PH7.6）：10mmol/L Tris-醋酸1.21g，溶于900mL超纯水，在室温下用4mol/L醋酸将PH调至7.6，加超纯水定容至1000mL。

（5）仪器

在说明书和权利要求书中使用的所有表示工艺参数、组分含量、反应条件等在所有情况下都应当被理解为加上术语“约”的修饰。因此，除非相反指出，在说明书和权利要求书中所给出的数值都可以根据本发明所希望得到的性质的不同而变化。在最低限度，并不用于将等价物原则的应用限定为权利要求的范围，每个数值都应当至少依照所报道的有效数字的值通过使用普通的舍入方法进行解释。而且，所有在此公布的范围都应当被理解为包含范围的起点和终点值，包含任意和所有包含在其中的小范围。例如，一定的范围“1-10”应当被认为包含最小值1和最大值10之间(包括在内)的任何和所有小范围；即所有以大于或等于1的最小值起始，而且以小于或等于10的最大值结束的所有小范围，例如5-10，3.2-6.6，或2.5-7.3。在此文件中所提到的所有参考文献都应当被理解为全部包括进来用于参考。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

①首次利用BLAD CD18标准质粒建立起焦磷酸测序的分析检测方法，质粒作为DNA模板，具有性质稳定、浓度精确可控、容易再生、重复性好等优点，是实验条件优化，方法学验证的最有效手段。

②首次用建立起来的焦磷酸测序方法检测荷斯坦奶牛血液样品中CD18基因的基因型情况，进而分析奶牛群中CD18基因的携带情况，检测出携带率为2%。并进行3次重复试验，结果均完全一致，重复率达到100%。

③焦磷酸测序技术且无需制胶和毛细管电泳，也无需荧光染料和同位素。本实验所用的300个牛血液样本DNA单链模板的制备所需时间较短，SNP基因型的判读也只需16min，具有更高的易操作性和准确性，可在2h内对结果进行自动化分析，明显缩短了实验时间，能够快速简便的检测BLAD CD18基因的携带情况。

④具有高通量、简单、快速、灵敏、特异的特点，可靠性高、重复性好，适合常规检测和规模化检测，为BLAD检测试剂盒的研发以及推动开展BLAD致病基因的筛查、防止和阻断BLAD致病基因的下传均奠定了良好的基础。

附图说明

图1是CD18标准质粒的焦磷酸测序结果图。

图2是目的片段CD18序列PCR扩增电泳结果。

图3是牛基因组CD18基因焦磷酸测序结果(A/A基因型)。

图4是牛基因组CD18基因焦磷酸测序结果(A/G基因型)。

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的权利范围以权利要求书为准。

具体实施方式

为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：

实施例1：

用本发明所述的牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法检测荷斯坦牛血液样品，具体步骤如下：

（1）设计针对SNP位点的特异性PCR引物和测序引物：

上游引物CD18F1：5‘-GTTGCGTTCAATGTGACCTTC-3’，

下游引物CD 18R2：5‘-GGTCATCCACCATGGAGTAGG-3’，

下游引物R2的5’端用生物素标记。

测序引物S2：5‘-TCCGGAGGGCCAAGG-3’。

（2）用试剂盒方法提取荷斯坦奶牛血液样品基因组DNA，方法详见说明书中的技术方案，此处不赘述。

（3）以步骤（1）设计的特异性PCR引物为引物，配置50μL的PCR Mix反应体系：25μL 2×PCR TaqMix、1μL上游引物CD18F1、1μL下游引物CD18R2、2μL牛血液基因组DNA、21μL ddH₂O。反应液配好后瞬时离心。PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性15s、62℃退火30s、72℃延伸30s，45-50个循环，72℃5min。

（4）PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测，以DL2000DNA Marker为标准，与引物所限定的目的片段大小（90bp）一致则可进行下一步骤。

（5）对步骤（3）得到的PCR产物进行单链的分离纯化和焦磷酸测序，方法详见说明书中的技术方案，此处不赘述。Pyromark Q96焦磷酸测序仪在18-28℃的条件下运行；对300份荷斯坦奶牛血液样品重复以上操作步骤。

统计结果显示，基因型A/A的样品有294个，基因型A/G的样品有6个，样品号分别为158、181、190、207、208、248；正常个体及携带者的比例分别为98%和2%。

比较例1：

范学华等应用PCR-RELP方法，对全国14个公牛站的587头种公牛BLAD基因的携带率进行了检测，BLAD携带者检出8头，携带率为1.36%（范学华，张毅，孙东晓等。中国荷斯坦种公牛BLAD遗传缺陷的分子检测及系谱分析[J].中国奶牛，2011，8(2):1-3）。

比较例2：

曹宏伟等采用RT-PCR方法对血样进行分析，并用Taq Ⅰ内切酶对RT-PCR产物进行消化，电泳分析Taq Ⅰ限制性位点酶切片段。结果表明，1000头荷斯坦奶牛中有19头BLAD基因携带者，1头BLAD基因纯合个体；BLAD基因携带者和纯合个体所占的比率分别为1.9%和0.1%；无BLAD和携带BLAD的基因频率分别为0.99和0.0105（曹宏伟，崔玉东等。牛白细胞黏附缺陷病等位基因频率分析[J].黑龙家畜牧兽医，2009,1:69-70）。

比较例3：

王洪梅等从山东，天津随机采集了436头荷斯坦牛的血液样本，从北京，上海，河北，新疆等荷斯坦公牛站79头种公牛的冷冻精液，用PCR-RELP法进行检测，共检出杂合子3头，试验牛的携带率为1.27%，种公牛的携带率为1.55%（王洪梅。中国荷斯坦牛DUMPS、BLAD、CN三种遗传缺陷病分子生物学检测方法的建立和应用[D]。中国农业科学院学位论文，2009）。

从上述例子中可以看出，用本发明所述的牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法检测荷斯坦牛血液样品，所检测出的BLAD基因携带率为2%，与曹宏伟的研究结果（携带率1.9%）相当，由于取样的局限性、样品的来源和数量不同，与王洪梅和范学华的实验结果（携带率分别为1.36%和1.27%）稍有出入，即本发明所述的检测方法结果可靠。而且，与现有技术相比，本发明具有更高的易操作性和准确性，重复性好、可靠性高，适合常规检测和规模化检测，具有广阔的应用前景。

应该注意到并理解，在不脱离后附的权利要求所要求的本发明的精神和范围的情况下，能够对上述详细描述的本发明做出各种修改和改进。因此，要求保护的技术方案的范围不受所给出的任何特定示范教导的限制。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的方法及操作步骤，但本发明并不局限于上述方法及操作步骤，即不意味着本发明必须依赖上述步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用材料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.用于奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法的引物，其特征在于，包括针对SNP位点的特异性PCR引物和测序引物，所述特异性PCR引物的序列为：

上游引物CD18F1：5‘-GTTGCGTTCAATGTGACCTTC-3’，

下游引物CD18R2：5‘-GGTCATCCACCATGGAGTAGG-3’，且5’端用生物素标记，

测序引物S2：5‘-TCCGGAGGGCCAAGG-3’。

2.奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法，其特征在于，利用根据权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）用试剂盒方法提取奶牛血液样本基因组DNA；

（2）以步骤（1）获得的基因组DNA为模板，以权利要求1所述的特异性PCR引物为引物，配置PCR Mix反应体系；

（3）按照标准操作对步骤（2）获得的PCR产物进行单链的分离纯化和焦磷酸测序。

4.根据权利要求2或3所述的奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法，其特征在于，所述步骤（1）的具体步骤为：

①吸取300μL新鲜血液，加入3倍体积红细胞裂解液，颠倒混匀，放置5min，放置期间颠倒混匀几次，10000r/min离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底混匀；

②加入20μL蛋白酶K溶液，混匀；

③加入200μL缓冲液GB，剧烈颠倒混匀，70℃放置10min，溶液变清亮，简短离心；

④加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心；

⑤将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

⑥向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

⑦向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

⑧向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12000r/min离心30s，倒掉废液；

⑨将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

⑩将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱液TE，室温放置5min，12000r/min离心2min，将溶液收集到离心管中，管中为提取的牛血液基因组DNA，置于-20℃保存。

5.根据权利要求2-4之一所述的奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法，其特征在于，步骤（2）所述的PCR Mix反应体系为：25μL 2×PCR TaqMix、1μL上游引物CD18F1、1μL下游引物CD18R2、2μL牛血液基因组DNA、21μLddH2O；PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性15s、62℃退火30s、72℃延伸30s，45-50个循环，72℃5min。

6.根据权利要求2-5之一所述的奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法，其特征在于，所述PCR反应程序为50个循环。

7.根据权利要求2-6之一所述的奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物的量在50μL的PCR反应体系中为5-10pmol。

8.根据权利要求2-7之一所述的奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法，其特征在于，所述步骤（3）的具体步骤为：

①从冰箱取出反应所需溶液，保证实验操作前所有溶液都达到室温；混匀Sepharose beads，混匀后立即将需要使用的sephare beads总量转移到一个Eppendorf管中备用，sephare beads总量以每个样品3μL计算；

②取3μL sepharose beads与47μL结合缓冲液混匀，得到50μL的混合物Ⅰ；

③将混合物Ⅰ迅速加入到步骤（3）的PCR扩增产物（50μL反应体积）中，得到混合物Ⅱ；

④常温下，将混合物Ⅱ于PCR板中振荡混匀10-15min，振荡速率1300-1400rpm，以使sepharose beads与下游引物R25’端的生物素充分结合；

⑤在PSQ板中预先加入45μL含有0.3μM测序引物的退火缓冲液；

⑥在真空准备工作台中，分别加入180ml高纯水、180ml 70%乙醇、180ml洗涤缓冲液和120ml变性缓冲液于四个样品板中；打开真空准备工作台的泵，将真空准备器于高纯水中清洗至少30s；

⑦将真空准备器移到步骤④中已经完成振荡混匀的PCR板中，抓取结合有sepharose beads的PCR产物，先后在70%乙醇、变性缓冲液和洗涤缓冲液中洗5-10s；将真空准备器放到含有测序引物的板上方，对准反应孔后再停掉面板上的抽真空开关，再将真空准备器放入PSQ Low反应板并摇动，释放结合sepharose beads的单链PCR产物；

⑧单链PCR产物80℃放置2min，再取出冷却到室温；

⑨应用Pyromark Q96焦磷酸测序仪和SNP试剂盒，依次在试剂仓中加入酶混合物（DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶），底物混合物（底物APS和荧光素）和4种dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），进行测序反应，经SNP软件分析得到测序图。

9.根据权利要求8所述的奶牛白细胞黏附缺陷症焦磷酸测序检测方法，其特征在于，所述步骤⑨所述的Pyromark Q96焦磷酸测序仪在18-28℃的条件下运行。

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