CN112553306A - 基于毛细管电泳片段分析和一代测序结合的融合基因核酸检测方法 - Google Patents

基于毛细管电泳片段分析和一代测序结合的融合基因核酸检测方法 Download PDF

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CN112553306A CN202011585310.6A CN202011585310A CN112553306A CN 112553306 A CN112553306 A CN 112553306A CN 202011585310 A CN202011585310 A CN 202011585310A CN 112553306 A CN112553306 A CN 112553306A
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Abstract

本发明公开了基于毛细管电泳片段分析和一代测序结合的融合基因核酸检测方法。本发明提供了一种检测多个融合基因的试剂盒，包括多对扩增引物对；每对所述扩增引物由引物A和引物B组成；所述引物A从5'端起依次由用于结合测序引物的接头序列A和与所述融合基因的靶序列特异结合的特异序列A；所述引物B从5'端起依次由用于调整扩增产物长度的接头序列B和与所述融合基因的靶序列特异结合的特异序列B；所述引物A的5’端修饰荧光基团。本发明通过将毛细管电泳片段分析和一代测序相结合，实现了基于融合基因核酸的多重检测和序列的同步获取，使得在进行基于片段分析的多重检测的同时，对于阳性融合基因进行一代测序获取其具体序列。

Description

基于毛细管电泳片段分析和一代测序结合的融合基因核酸检 测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及基于毛细管电泳片段分析和一代测序结合的融合基因核酸检测方法。
背景技术
由染色体变异形成的融合基因通常在肿瘤的发生和进展中发挥着关键的驱动作用，越来越多的研究表明，对于融合基因的检测和鉴定对于肿瘤的诊断、治疗、预后评估和后续的微小病变残留病监测均有重要的意义。当前对融合基因检测的方法通常有荧光原位杂交技术(FISH)、实时荧光PCR法和下一代高通量测序法等，但这几种方法都有各自的缺陷或弊端。FISH技术具有操作复杂、人力成本高和通量低的特点；实时荧光PCR法无法获得具体序列、通量有限的特点；下一代高通量测序法具有准确度偏低、成本较高和需要专业生物信息分析人员等特点。
毛细管电泳是一种高效的生物大分子分离技术，结合荧光标记引物和自动检测系统，可以高效的自动化检测核酸等生物大分子片段，可以用来区分不同长度或荧光标记的核酸。而一代测序法是以Sanger测序法为基本原理的核酸序列检测技术。单独使用毛细管片段分析只能获得片段大小，但不能得到具体序列信息；而一代测序法可以获得序列，但通常只针对单一核酸片段靶标，且操作步骤较繁琐。
在融合基因检测中，既需要较高的通量也需要对有必要的融合基因阳性样本进行序列分析。因此，研究高通量检测融合基因具有重要的意义。
发明内容
本发明一个目的是提供一种检测多个融合基因的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括多对扩增引物对；
每对所述扩增引物对特异扩增1个所述融合基因的靶序列；
每对所述扩增引物由引物A和引物B组成；
所述引物A从5'端起依次由用于结合测序引物的接头序列A和与所述融合基因的靶序列特异结合的特异序列A；
所述引物B从5'端起依次由用于调整扩增产物长度的接头序列B和与所述融合基因的靶序列特异结合的特异序列B；
所述引物A的5’端修饰荧光基团；
所述靶序列为包含融合基因中各基因连接位点的序列，即含有融合基因的连接位点的大小为100-300bp的序列，连接位点为融合基因中几个基因相邻的位点；
上述试剂盒中，所述荧光基团为FAM、HEX、VIC、TAMRA、ROX或Texred；在本发明的实施方案中，所述5’端引物荧光基团分别为FAM、HEX、TAMRA和ROX基团。
或，所述多对扩增引物对中的接头序列A均相同，其设计原则和方法为本领域所公知，例如避免引物二聚体、发夹结构等。
或，所述接头序列A结合一代测序反应的测序引物；在本发明的实施方案中，所述相同接头均结合通用测序引物M13F或M13R。
或，所述接头序列B为简单不易形成二聚体或发夹结构的序列，来区分不同扩增的长度，例如多聚A或C等。在本发明的实施方案中，所述不同长度接头序列B为不同长度的多聚A。
上述试剂盒中，每对所述扩增引物中的荧光基团相同或不同；
每对所述扩增引物对的荧光基团种类与毛细管电泳仪的检测通道个数相匹配，例如当检测通道为5个时，则标记荧光基团种类可以为1-4个，其中第5个通道用于电泳时的内标标记使用。
上述试剂盒中，若每对所述扩增引物中的引物A的荧光基团相同，则每对所述扩增引物中的接头序列B不同；
若每对扩增引物中的引物A的荧光基团不同，则每对所述扩增引物中的接头序列B相同或不同。
上述试剂盒中，所述试剂盒还包括如下A)、B)和C)：
A)所述测序引物；
B)毛细管电泳片段化检测试剂及设备；
C)测序检测试剂和设备。
上述试剂盒在如下至少一种中的应用也是本发明保护的范围:
1)检测融合基因；
2)检测待测样本中是否含有融合基因；
3)检测待测样本中融合基因的连接序列；
4)检测待测样本中融合基因的连接序列是否有突变；
5)制备检测融合基因产品；
6)制备检测待测样本中是否含有融合基因产品；
7)制备检测待测样本中融合基因的连接序列产品；
8)制备检测待测样本中融合基因的连接序列是否有突变产品。
本发明还有一个目的是提供如下方法。
本发明提供一种检测待测样本是否含有融合基因的方法，为非疾病诊断治疗目的，包括如下步骤：
1)设计上述第一个目的中的多对扩增引物对；
2)用所述多对扩增引物对对待测样本进行多重PCR扩增，得到扩增产物；
3)毛细管电泳片段化检测所述扩增产物；
若在某个扩增引物对的荧光基团对应的颜色通道内出现预期大小目标片段，则表示该待测样本含有或候选含有该引物对对应的融合基因，将该待测样本记作毛细管电泳片段化阳性样本；
若在某个扩增引物对的荧光基团对应的颜色通道内未出现预期大小目标片段，则表示该待测样本中不含有或候选不含有该引物对对应的融合基因。
上述方法还包括如下步骤4)：
将所述毛细管电泳片段化阳性样本对应的多重PCR扩增的扩增产物进行测序，根据测序结果进一步确定待测样本是否含有融合基因；所述测序采用的测序引物为上述测序引物。
本发明还提供了一种检测待测样本中融合基因的连接序列是否有突变的方法，为非疾病诊断治疗目的，包括如下步骤：
1)设计上述第一个目的中的所述多对扩增引物对；
2)用所述多对扩增引物对对待测样本进行多重PCR扩增，得到扩增产物；
3)毛细管电泳片段化检测所述扩增产物；
若在某个扩增引物对的荧光基团对应的颜色通道内出现预期大小目标片段，则表示该待测样本中含有该引物对对应的融合基因，将该待测样本记作毛细管电泳片段化阳性样本；
若在某个扩增引物对的荧光基团对应的颜色通道内未出现预期大小目标片段，则表示该待测样本中不含有该引物对对应的融合基因；
4)将所述毛细管电泳片段化阳性样本对应的多重PCR扩增的扩增产物进行测序，根据测序结果判断待测样本含有的融合基因的连接序列是否突变；
所述测序采用的测序引物为上述测序引物。
本发明中扩增的模板为待测样本的核酸，若为DNA直接扩增，若为RNA，则反转录得到cDNA后扩增，对于RNA核酸样本的逆转录体系为本领域所公知。
本发明中，多重PCR扩增技术为本领域所公知，包含Mg2+离子、dNTP、DNA聚合酶等。
本发明中，毛细管电泳参数，按照毛细管电泳仪的说明要求进行。
本发明中，测序的反应，按照该一代测序试剂的说明进行，其中测序引物结合本发明扩增引物对中的接头序列A。
本发明通过将毛细管电泳片段分析和一代测序相结合，实现了基于融合基因核酸的多重检测和序列的同步获取，使得在进行基于片段分析的多重检测的同时，对于阳性融合基因进行一代测序获取其具体序列。
在本发明的实施方案中，所述检测多个融合基因是指用于检测多重核酸，例如检测2-120种核酸类型。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明建立了在多重PCR扩增的基础上，通过毛细管电泳片段分析与一代测序相结合，实现了核酸多重检测的同时，可以确定所检测核酸的具体序列，即能在鉴别相应的融合基因的同时获得融合基因结合区域的碱基序列，来确定融合基因的具体融合方式和是否有新的碱基引入和是否有突变。这样将不同荧光标记的不同长度的片段分析的多样性区分和一代测序的序列能力获取充分结合，且互相不干扰，从而在保证检测多重性的前提下，可以对检测区域的核酸碱基序列进行查看和确认，来确认融合基因的具体连接位置和连接区域是否有突变。
下表1为本发明与现有技术对比表：
表1为本发明与现有技术对比表
Figure BDA0002864084890000041
附图说明
图1是2例KMT2A-AFF1融合基因阳性的临床样本的检测结果，A是样本1的片段分析结果，B是样本2的片段分析结果，C是样本1的一代测序结果，D是样本2的一代测序结果。
图2是2例BCR-ABL1融合基因阳性的临床样本的检测结果，A是样本1的片段分析结果，B是样本2的片段分析结果，C是样本1的一代测序结果，D是样本2的一代测序结果。
图3是2例CBFB-MYH11融合基因阳性的临床样本的检测结果，A是样本1的片段分析结果，B是样本2的片段分析结果，C是样本1的一代测序结果，D是样本2的一代测序结果。
图4是2例TCF3-PBX1融合基因阳性的临床样本的检测结果，A是样本1的片段分析结果，B是样本2的片段分析结果，C是样本1的一代测序结果，D是样本2的一代测序结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面是结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1、基于毛细管电泳片段分析和一代测序结合的融合基因核酸检测方法一、多重扩增引物的设计
根据多个目标融合基因的连接序列(含有融合基因的连接位点的大小为100-300bp的序列)作为目标片段，分别设置多重核酸检测的多对扩增引物对，每对扩增引物对特异扩增1个目标融合基因：
每对扩增引物由引物A和引物B组成，其中：
引物A从5'端起依次由用于结合测序引物的接头序列A和与目标片段特异结合的特异序列A，且引物A的5’端进行荧光修饰。其中，荧光修饰的基团可以例如下FAM、HEX、VIC、TAMRA、ROX、Texred等。接头序列A可用于结合一代测序反应的测序引物，其设计原则和方法为本领域所公知，例如避免引物二聚体、发夹结构等。接头序列A可结合的测序引物为M13F或M13R。
引物B从5'端起依次由用于调整扩增产物长度的接头序列B和与目标片段特异结合的特异序列B；
所述与目标片段特异结合的序列A和所述与目标片段特异结合的特异序列B用于扩增目标融合基因的连接序列。
所述每对扩增引物中的引物A的荧光修饰基团相同或不同，且所述每对扩增引物对的标记荧光基团种类与后期检测所用毛细管电泳仪的检测通道个数相匹配；例如当检测通道为5个时，则标记荧光基团种类可以为1-4个，其中第5个通道用于电泳时的内标标记使用。
若每对扩增引物中的引物A的荧光修饰基团相同，则所述用于调整扩增产物长度的接头序列B不同；
若每对扩增引物中的引物A的荧光修饰基团不同，则所述用于调整扩增产物长度的接头序列B相同或不同。
所述用于调整扩增产物长度的接头序列B为简单不易形成二聚体或发夹结构的序列，来区分不同目标片段扩增产物的长度，接头序列B可以为多聚A或多聚C等。
二、多重PCR扩增
分别以多个待检测核酸样本为模板，用上述一设计的引物进行多重PCR扩增，得到扩增产物。
三、毛细管电泳片段化分析
将上述二得到的PCR产物与高度去离子甲酰胺(线性化单链)和GeneScan 500LIZSize Standard(内标，Life Technologies，货号：4322682)混合均匀并瞬时离心，于95℃变性5分钟，然后立即将变性后的产物置于2-8℃冷却5分钟。
将变性处理后的产物全部转移到96孔反应板中，用封板胶盖住，进行毛细管电泳检测。
按照毛细管电泳仪的使用操作说明，选择相应的参数，开始进行检测。
采用毛细管电泳仪配套的分析软件对结果进行分析：
若在某个扩增引物的荧光基团对应的颜色通道内出现预期大小目标片段，则表示该待测样本中含有该引物对应的融合基因(对应指设计引物的靶基因)，即待测样本为阳性。
若在某个扩增引物的荧光基团对应的颜色通道内未出现预期大小目标片段，则表示该待测样本中不含有该引物对应的融合基因。
三、一代测序
为了避免高通量带来的假阳性，进一步确定是否含有目标融合基因。
将上述二检测为阳性待测样本对应的扩增产物用小牛肠碱性磷酸酶和核酸外切酶酶切(去除dNTP和引物)，得到酶切产物。
1)融合基因阳性扩增产物的纯化
分别取上述二检测为阳性待测样本对应的多重PCR扩增产物3μL、小牛肠碱性磷酸酶(采购自NEB公司，货号为：M0525)0.2μL和核酸外切酶(采购自NEB公司，货号为：M0293)0.5μL，混合均匀后瞬时离心。然后置于PCR仪中进行酶解纯化，纯化程序为：37℃酶解60分钟，80℃酶变性15分钟。
2)测序反应
将步骤1)中的酶解纯化产物用纯化水稀释5倍后用于测序反应。
取1.2μL的BigDye Terminator 3.1Ready Reaction Mix(Life Technologies)、0.6μL的BigDye Terminator v1.1&v3.1 5X Sequencing Buffer(Life Technologies)、2μL的M13F或M13R测序引物(1μM)和2.2μL的稀释后的酶切产物，混匀后瞬时离心。
测序反应程序为：1.预变性，96℃，1分钟；2. 96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸2分钟，共35个循环；3.终延伸：60℃，2分钟；4.仪器冷却：25℃，1分钟。
得到测序反应产物。
3)测序反应产物纯化
在测序反应产物中加入16μL醋酸钠-乙醇混合物(3M醋酸钠:无水乙醇＝1:15)，涡旋振荡15s，避光静置15min，12000rpm 4℃离心30min，吸弃上层液体。在每管内加入70μL-20℃±5℃预冷的70％乙醇，涡旋振荡15s，12000rpm 4℃离心15min，彻底吸弃上层液体。让乙醇在室温挥发干净，加入12μL高度去离子甲酰胺溶解DNA，得到纯化后的测序产物。
将纯化后的测序产物按照基因分析仪的操作说明书进行运行和测序分析，
若待测样本中含有某个融合基因连接区域的序列(目标片段)，则待测样本含有该融合基因，且可以从序列判断该融合基因连接区域是否有突变；
若待测样本中不含有某个融合基因连接区域的序列，则待测样本不含有该融合基因。
实施例2、基于毛细管电泳片段分析和一代测序结合的融合基因核酸检测方法的应用
一、多重扩增引物的设计
针对白血病中常见的4种融合基因KMT2A-AFF1、BCR-ABL1、CBFB-MYH11和TCF3-PBX1分别设计扩增引物对。
选取各个融合基因的连接序列(含有融合基因的连接位点的大小为200bp的序列之内)作为目标片段，分别设置多重核酸检测的多对扩增引物对(表1所示)，每对扩增引物对特异扩增1个目标融合基因：
其中KMT2A-AFF1的上游引物用FAM标记(对应颜色为蓝色)，BCR-ABL1的下游引物用HEX标记(对应颜色为绿色)，CBFB-MYH11的上游引物用TAMRA标记(对应颜色为黑色)，TCF3-PBX1的上游引物用ROX标记(对应颜色为红色)；4种引物对中的接头序列A(下划线所示)均可以结合测序引物M13F，并在下游引物添加多聚A来调节扩增子的长度。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
引物序列见表2。
表2为引物序列
Figure BDA0002864084890000081
上表中，从上到下依次为序列1-序列8；下划线为用于结合测序引物的接头序列A，4对引物的均相同；加粗黑色的AA为用于调整扩增产物长度的接头序列B。
其中，KMT2A的转录本号为NM_001197104.2，AFF1的转录本号为NM_001166693.3，BCR基因的转录本号为NM_004327.4，ABL1的转录本号为NM_007313.2，CBFB基因的转录本号为NM_022845.3，MYH11的转录本号为NM_001040113.2，TCF3的转录本号为NM_003200.5，PBX1的转录本号为NM_002585.4。
KMT2A-AFF1的核苷酸序列为将KMT2A的NM_001197104.2转录本序列第10外显子和AFF1的NM_001166693.3转录本序列第4外显子紧密相邻，KMT2A的转录本序列第10外显子的最后一个碱基与AFF1的转录本序列第4外显子第一个碱基相邻。
BCR-ABL1的核苷酸序列为将BCR的NM_004327.4转录本序列第20外显子和ABL1的NM_007313.2转录本序列第2外显子连接而成，BCR的转录本序列第20外显子的最后一个碱基与ABL1的转录本序列第2外显子第一个碱基相邻。
CBFB-MYH11的核苷酸序列为将CBFB的NM_022845.3转录本序列第5外显子和MYH11的NM_001040113.2转录本序列第29外显子紧密相邻，CBFB的转录本序列第5外显子的最后一个碱基与MYH11的的转录本序列第29外显子第一个碱基相邻。
TCF3-PBX1的核苷酸序列为将TCF3的NM_003200.5转录本序列第16外显子和PBX1的NM_002585.4转录本序列第3外显子紧密相邻，TCF3的转录本序列第16外显子的最后一个碱基与PBX1的转录本序列第3外显子第一个碱基相邻。
二、多重扩增
1、模板的制备
利用Trizol法或者RNA提取试剂盒说明书提取融合基因阳性外周血样本的RNA。对于骨髓或外周血样本在提取之前需要将红细胞裂解去除。提取后的RNA应立即进行后续操作，否则需要在-80℃±5℃条件下保存。
使用商品化的逆转录酶将获得的RNA逆转录为cDNA，以随机引物作为反转录引物，按照说明书推荐的体系和条件进行cDNA的合成。
上述样本分别为KMT2A-AFF1融合基因阳性的临床样本1、KMT2A-AFF1融合基因阳性的临床样本2、BCR-ABL1融合基因阳性的临床样本1、BCR-ABL1融合基因阳性的临床样本2、CBFB-MYH11融合基因阳性的临床样本1、CBFB-MYH11融合基因阳性的临床样本2、TCF3-PBX1融合基因阳性的临床样本1和TCF3-PBX1融合基因阳性的临床样本2、未含有这4种融合基因的临床样本作为阴性样本；患者均知情，且均已鉴定阳性。
2、多重PCR扩增
(1)体系配置：
采用Taq DNA聚合酶，25μl的反应体系，dNTP的终浓度为200nM，MgCl2的终浓度为1.5mM，表1中的8条引物的终浓度均为200nM，模板上样量为2μl，其余以纯化水补充到25μl体系，并混匀后快速离心。
(2)扩增程序设置：扩增程序包括以下几个步骤：1.预变性，95℃，10分钟；2.95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；3.终延伸：72℃，10分钟。
得到扩增产物。
三、毛细管电泳片段化分析
将上述二得到的扩增产物用纯化水稀释10倍，取1μL稀释后产物与8.5μl的高度去离子甲酰胺以及0.5μl的的GeneScan 500LIZ Size Standard(Life Technologies，货号：4322682)混合均匀并瞬时离心，于95℃变性5分钟，然后立即将变性后的产物置于2-8℃冷却5分钟。
将变性处理后的产物全部转移到96孔反应板中，用封板胶盖住，进行毛细管电泳检测。按照毛细管电泳仪的使用操作说明，选择相应的参数，开始进行检测。
若在某个扩增引物的荧光基团对应的颜色通道内出现预期大小目标片段，则表示该待测样本中含有该引物对应的融合基因，即待测样本为阳性。
若在某个扩增引物的荧光基团对应的颜色通道内未出现预期大小目标片段，则表示该待测样本中不含有该引物对应的融合基因。
三、一代测序
1)融合基因阳性扩增产物的纯化
分别取上述二检测为阳性待测样本对应的多重PCR扩增产物3μL、小牛场碱性磷酸酶(采购自NEB公司，货号为：M0525)0.2μL和核酸外切酶(采购自NEB公司，货号为：M0293)0.5μL，混合均匀后瞬时离心。然后置于PCR仪中进行酶解纯化，纯化程序为：37℃酶解60分钟，80℃酶变性15分钟。
2)、测序反应
将步骤1)中的酶解纯化产物用纯化水稀释5倍后用于测序反应。
取1.2μL的BigDye Terminator 3.1Ready Reaction Mix(Life Technologies)、0.6μL的BigDye Terminator v1.1&v3.1 5X Sequencing Buffer(Life Technologies)、2μL的M13F测序引物(1μM)和2.2μL的稀释后的酶解纯化产物，混匀后瞬时离心。测序反应程序为：1.预变性，96℃，1分钟；2.96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸2分钟，共35个循环；3.终延伸：60℃，2分钟；4.仪器冷却：25℃，1分钟。得到测序反应产物。
3)测序反应产物纯化
在测序反应产物中加入16μL醋酸钠-乙醇混合物(3M醋酸钠:无水乙醇＝1:15)，涡旋振荡15s，避光静置15min，12000rpm 4℃离心30min，吸弃上层液体。在每管内加入70μL-20℃±5℃预冷的70％乙醇，涡旋振荡15s，12000rpm 4℃离心15min，彻底吸弃上层液体。让乙醇在室温挥发干净，加入12μL高度去离子甲酰胺溶解DNA。得到纯化后的测序产物。
4)测序分析
将纯化后的测序产物按照基因分析仪的操作说明书进行运行和测序分析，
若待测样本中含有某个融合基因连接区域的序列，则待测样本含有该融合基因，且可以从序列判断该融合基因连接区域是否有突变；
若待测样本中不含有某个融合基因连接区域的序列，则待测样本不含有该融合基因。
实验结果分析：
从图1可以看到，对于KMT2A-AFF1融合基因阳性的样本，片段分析可以准确检测出该融合基因(样本1为图A中箭头所指200bp位置蓝色峰，样本2为图B中箭头所指200bp位置蓝色峰)，同时利用后续的一代测序可以进一步确定含有该融合基因，且准确检测到融合基因连接区域的序列(图C为样本1，图D为样本2)。
从图2可以看到，对于BCR-ABL1融合基因阳性的样本，片段分析可以准确检测出该融合基因(样本1为图A中箭头所指绿色峰，样本2为图B中箭头所指绿色峰)，同时利用后续的一代测序可以进一步确定含有该融合基因，且准确检测到融合基因连接区域的序列(图C为样本1，图D为样本2)。
从图3可以看到，对于CBFB-MYH11融合基因阳性的样本，片段分析可以准确检测出该融合基因(样本1为图A中箭头所指黑色峰，样本2为图B中箭头所指黑色峰)，同时利用后续的一代测序可以进一步确定含有该融合基因，且准确检测到融合基因连接区域的序列(图C为样本1，图D为样本2)。
从图4可以看到，对于TCF3-PBX1融合基因阳性的样本，片段分析可以准确检测出该融合基因(样本1为图A中箭头所指红色峰，样本2为图B中箭头所指红色峰)，同时利用后续的一代测序可以进一步确定含有该融合基因，且准确检测到融合基因连接区域的序列(图C为样本1，图D为样本2)。
阴性样本片段分析中没有目标大小片段的峰出现。
以上所述仅为本发明的具体实施方式，且本领域技术人员将会理解，但并不用以限制本发明。然而应该意识到，在不背离本发明的精神和原则的情况下可以做出许多其他的修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110>北京思尔成生物技术有限公司
<120> 基于毛细管电泳片段分析和一代测序结合的融合基因核酸检测方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtag ggtggtttgc tttctctgtg 40
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
aatgctgaga gtcctttgta ggg 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
aaatctaccg cgtgtccggt g 21
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
tgtaaaacga cggccagtgt ttgggcttca caccattcc 39
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
tgtaaaacga cggccagtaa agactggatg gtatgggctg 40
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
aaacctcggc ctcgttaagc atc 23
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
tgtaaaacga cggccagtct ggcctcaggt ttcaccg 37
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
aaaaaatgtt gtccagccgc atcag 25

Claims (9)

1.一种检测多个融合基因的试剂盒，包括多对扩增引物对；
每对所述扩增引物对特异扩增1个所述融合基因的靶序列；
每对所述扩增引物由引物A和引物B组成；
所述引物A从5'端起依次由用于结合测序引物的接头序列A和与所述融合基因的靶序列特异结合的特异序列A；
所述引物B从5'端起依次由用于调整扩增产物长度的接头序列B和与所述融合基因的靶序列特异结合的特异序列B；
所述引物A的5’端修饰荧光基团；
所述靶序列为包含融合基因中各基因连接位点的序列。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述荧光基团为FAM、HEX、VIC、TAMRA、ROX或Texred；
或，所述多对扩增引物对中的接头序列A均相同；
或，所述接头序列B为多聚A或多聚C。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：
每对所述扩增引物中的荧光基团相同或不同。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：
若每对所述扩增引物中的引物A的荧光基团相同，则每对所述扩增引物中的接头序列B不同；
若每对扩增引物中的引物A的荧光基团不同，则每对所述扩增引物中的接头序列B相同或不同。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒还包括如下A)、B)和C)：
A)所述测序引物；
B)毛细管电泳片段化检测试剂及设备；
C)测序检测试剂和设备。
6.权利要求1-5中任一所述试剂盒在如下至少一种中的应用:
1)检测融合基因；
2)检测待测样本中是否含有融合基因；
3)检测待测样本中融合基因的连接序列；
4)检测待测样本中融合基因的连接序列是否有突变；
5)制备检测融合基因产品；
6)制备检测待测样本中是否含有融合基因产品；
7)制备检测待测样本中融合基因的连接序列产品；
8)制备检测待测样本中融合基因的连接序列是否有突变产品。
7.一种检测待测样本是否含有融合基因的方法，为非疾病诊断治疗目的，包括如下步骤：
1)设计权利要求1-5任一中的所述多对扩增引物对；
2)用所述多对扩增引物对对待测样本进行多重PCR扩增，得到扩增产物；
3)毛细管电泳片段化检测所述扩增产物；
若在某个扩增引物对的荧光基团对应的颜色通道内出现预期大小目标片段，则表示该待测样本含有或候选含有该引物对对应的融合基因，将该待测样本记作毛细管电泳片段化阳性样本；
若在某个扩增引物对的荧光基团对应的颜色通道内未出现预期大小目标片段，则表示该待测样本中不含有或候选不含有该引物对对应的融合基因。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下：
步骤4)将所述毛细管电泳片段化阳性样本对应的多重PCR扩增的扩增产物进行测序，根据测序结果判断待测样本是否含有融合基因；
所述测序采用的测序引物为权利要求1-5任一中的所述测序引物。
9.一种检测待测样本中融合基因的连接序列是否有突变的方法，为非疾病诊断治疗目的，包括如下步骤：
1)设计权利要求1-5任一中的所述多对扩增引物对；
2)用所述多对扩增引物对对待测样本进行多重PCR扩增，得到扩增产物；
3)毛细管电泳片段化检测所述扩增产物；
若在某个扩增引物对的荧光基团对应的颜色通道内出现预期大小目标片段，则表示该待测样本含有或候选含有该引物对对应的融合基因，将该待测样本记作毛细管电泳片段化阳性样本；
若在某个扩增引物对的荧光基团对应的颜色通道内未出现预期大小目标片段，则表示该待测样本中不含有或候选不含有该引物对对应的融合基因；
4)将所述毛细管电泳片段化阳性样本对应的多重PCR扩增的扩增产物进行测序，根据测序结果判断待测样本含有的融合基因的连接序列是否突变；
所述测序采用的测序引物为权利要求1-5任一中的所述测序引物。
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