WO2020218499A1 - 胎児ＲｈＤ血液型検出用のキット及びその利用 - Google Patents

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WO2020218499A1
WO2020218499A1 PCT/JP2020/017672 JP2020017672W WO2020218499A1 WO 2020218499 A1 WO2020218499 A1 WO 2020218499A1 JP 2020017672 W JP2020017672 W JP 2020017672W WO 2020218499 A1 WO2020218499 A1 WO 2020218499A1
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rhd
chr1
pcr primer
gene
region
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健一郎 秦
健 ▲高▼橋
一彦 中林
王介 右田
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国立研究開発法人国立成育医療研究センター
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells

Definitions

  • the present invention relates to the detection of fetal RhD blood type, and more particularly to the kit for detecting fetal RhD blood type and its use.
  • Non-Patent Document 1 Most of the hemolytic diseases of the newborn are very serious diseases caused by RhD blood group allogeneic immunity and may lead to fetal death.
  • the disease occurs when a RhD-negative pregnant woman conceives a RhD-positive fetus (RhD-incompatible pregnancy). During pregnancy, a small amount of fetal-derived red blood cells flow into the maternal blood (mother-infant blood transfusion). Due to this phenomenon, the mother is sensitized to the RhD antigen, and an anti-D antibody is produced in the mother. The anti-D antibody produced in the mother passes through the placenta and causes an antigen-antibody reaction with the RhD antigen of the fetus, causing hemolysis of erythrocytes. Fetal symptoms range from mild anemia to fetal death and can develop from the pregnancy of the first child of a RhD-incompatible pregnancy (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Documents 3 to 5 since anti-D human immunoglobulin is a human-derived preparation, there is a potential risk of infectious diseases. In addition, the medical cost generated by the administration of anti-D human immunoglobulin is high, as reported as $ 5247 per case (Non-Patent Document 6).
  • Non-Patent Document 25 a protocol for prenatal diagnosis of fetal RhD blood group and administration of anti-D human immunoglobulin only when the fetus is RhD positive is effective for reducing medical costs. Is. Furthermore, if the fetal RhD blood type can be accurately determined, it is not necessary to perform an invasive amniocentesis test for evaluating fetal anemia and frequent fetal middle cerebral artery measurements (Non-Patent Documents 12 and 13). ..
  • Non-Patent Document 7 Cell-free DNA is DNA that exists in plasma and is a DNA fragment of about 160 bp released into blood from apoptotic cells.
  • the fetal-derived cell-free DNA present in the maternal plasma of pregnancy is derived from apoptotic villous cells and is even shorter, about 140 bp (Non-Patent Document 23).
  • a small amount of cell-free DNA in blood has been used for fetal autosomal aneuploidy diagnosis, sex diagnosis, fetal RhD blood group prenatal diagnosis, and the like (Non-Patent Documents 8 to 11).
  • RhD-negative blood types include RhD-negative and D-elute (DEL) (Non-Patent Document 20).
  • RhD-negative or DEL is caused by homozygosity or compound heterozygotes of RhD loss-of-function alleles.
  • Currently, more than 100 types of loss-of-function alleles are known (Non-Patent Document 21), but it is known that the frequency of alleles differs between races.
  • Non-Patent Document 22 99.6% of the 3526 Japanese population in which no aggregation was observed by ordinary serologic tests had a genotype of RHD * 01N.01 (deletion type: all). Deletion mutation), RHD * 01EL.01 (point mutation type: point mutation), and RHD * 01N.04 (RHD-RHCE hybrid type: recombination mutation). And about 12% of them are caused by other than homozygosity of RHD * 01 N.01. RHD * 01EL.01 and RHD * 01N.04 are non-deletion mutant alleles. In addition, the frequency of these genotypes is almost the same in other East Asian countries (Non-Patent Documents: 27 and 28).
  • the RHD gene and the RHCH gene involved in the human RHD type have sequence structures similar to each other, and each gene contains many repetitive sequences and the like. Therefore, it can be very difficult to design suitable PCR primers to detect mutations other than total deletion mutations in the RHD gene.
  • an object of the present invention is a novel fetal RhD blood group detection kit capable of detecting a fetal RhD blood group regardless of the genotype of the mother. And to provide a detection method.
  • RhD-positive RHD * 01 Wild type
  • RHD * 01 N.01 deletion type: total deletion mutation
  • point mutation type point mutation
  • RHD * 01 N.04 RHD-RHCE hybrid type: recombinant mutation
  • the present invention is a kit for fetal RhD blood group detection, which comprises at least one PCR primer set selected from the following 1) and 2); 1) PCR primer set capable of amplifying the region on exon 9 of the RHD gene containing the base corresponding to chr1: 25648453 2) Amplifying the region on exon 9 of the RHCE gene containing the base corresponding to chr1: 25696958 PCR primer set.
  • the present invention is a method for detecting a fetal RhD blood type, which comprises an amplification step of amplifying a gene fragment contained in maternal blood obtained from a maternal body by using the above kit.
  • A is a diagram showing a base at a specific position on a gene
  • B is a diagram schematically showing a difference between alleles. It is a figure which shows the result of the Example of this invention. It is a figure which shows the result of the Example of this invention. It is a figure which shows the result of the Example of this invention. It is a figure which shows the result of the Example of this invention. It is a figure which shows the result of the Example of this invention. It is a figure which shows the result of the Example of this invention.
  • the fetal RhD blood group detection kit can detect a fetal RhD blood group by amplifying a desired DNA fragment by a polymerase chain reaction (PCR). It is a kit.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the kit for detecting the fetal RhD blood group includes a PCR primer set capable of amplifying a specific region on exon 9 of the RHD gene and a PCR primer capable of amplifying a specific region on exon 9 of the RHCE gene. Includes at least one PCR primer set selected from the set.
  • the primer set in this embodiment can amplify a fetal-derived DNA fragment contained in maternal blood. Further, it is preferable that the primer set in the present embodiment can specifically amplify DNA fragments derived from a plurality of gene regions. Further, it is preferable that the primer set in the present embodiment can simultaneously and specifically amplify DNA fragments derived from a plurality of gene regions.
  • pluripotent gene regions means, for example, in the case of amplifying a DNA fragment in maternal blood, at least one region selected from a maternal gene and a fetal gene, and a plurality of regions in the maternal gene. Includes a gene region and multiple gene regions in a fetal gene.
  • the PCR primer set capable of amplifying a specific region of the RHD gene comprises a region on exon 9 of the RHD gene containing a base corresponding to chr1: 25648453. , Amplifies.
  • chr1: 25648453 is defined based on GRCh37 / hg19 and means "position 25648453 on chromosome 1.”
  • chr1: ⁇ is defined in the same manner.
  • the "base corresponding to chr1: 25648453” refers to the base corresponding to chr1: 25648453 among the regions having high sequence identity with respect to the region containing chr1: 25648453.
  • the base at position chr1: 25648453 does not always match the base corresponding to chr1: 25648453.
  • the base corresponding to the Y-th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: X is specified by homology analysis to correspond to the Y-th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: X.
  • the homology analysis method include a method by Pairwise Sequence Alignment such as Needleman-Wunsch method and Smith-Waterman method, and a method by Multiple Sequence Alignment such as Clustal W method.
  • a person skilled in the art can understand the "corresponding base” in the base sequence to be analyzed by using the base sequence shown in SEQ ID NO: X as a reference sequence based on these methods.
  • Examples of the base sequence to be analyzed include variants of the above reference sequence. The analysis may be performed with the default settings, or the parameters may be changed from the defaults as necessary.
  • the "reference sequence variant” may have a sequence identity of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 96% or more, and 98% or more. Is more preferable. Moreover, the sequence identity is 100% or less, and in one example, it is less than 100%.
  • base corresponding to is defined in the same manner.
  • the "region on exon 9 of the RHD gene containing a base corresponding to chr1: 25648453” is a region on exon 9 of the RHD gene and includes the above-mentioned "base corresponding to chr1: 25648453". Refers to an area.
  • the region on exon 9 of the RHD gene refers to a region derived from the RHD gene in addition to the region within the RHD gene.
  • the "region derived from the RHD gene” also includes, for example, a region translocated from the RHD locus to another locus.
  • the description regarding "the region of ... containing the base corresponding to” is defined in the same manner.
  • At least one of the base corresponding to chr1: 25648419 and the base corresponding to chr1: 25648515 Is preferably contained, and more preferably both bases are contained.
  • the region on the exon 9 of the RHD gene amplified by the primer set A is preferably 81 bp or more and 214 bp or less, and more preferably 81 bp or more and 148 bp or less.
  • the region is the 148 bp base sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the region is the 81 bp base sequence set forth in SEQ ID NOs: 8 and 18.
  • the region is the 114 bp base sequence set forth in SEQ ID NOs: 9 and 19.
  • the PCR primer set capable of amplifying a specific region of the RHCE gene comprises a region on exon 9 of the RHCE gene containing a base corresponding to chr1: 25696598. , Amplifies.
  • the region on exon 9 of the RHCE gene amplified by primer set B contains at least one of the bases corresponding to chr1: 25697015 and the bases corresponding to chr1: 25696896, in addition to the base corresponding to chr1: 25696598. It is preferable that both bases are contained, and it is more preferable that both bases are contained.
  • the region on the exon 9 of the RHCE gene amplified by the primer set B is preferably 81 bp or more and 214 bp or less, and more preferably 81 bp or more and 148 bp or less.
  • the region is the 148 bp base sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • the region is the base sequence of 81 bp shown in SEQ ID NO: 11.
  • the region is the 114 bp base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • Primer sets A and B each independently have a primer having a base sequence containing 15 or more consecutive bases in the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 (hereinafter, each of which is the first PCR). It is preferable that the primer to the fourth PCR primer) is combined.
  • the base sequences of the first PCR primer to the fourth PCR primer each independently preferably contain 18 or more consecutive bases in the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4, and preferably contain 19 or more or 20 or more bases. More preferably, it further preferably contains 21 or more bases. In one example, the base sequences of the first PCR primer to the fourth PCR primer contain all of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4, respectively.
  • the primer sets A and B are PCR primer sets each independently composed of a first PCR primer or a second PCR primer and a third PCR primer or a fourth PCR primer.
  • primer sets A and B are independently a PCR primer set consisting of a first PCR primer and a fourth PCR primer, or a PCR primer set consisting of a second PCR primer and a third PCR primer. Is preferable.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 corresponds to the base sequence shown in Primer name RHD / RHCE_Exon9_KN_F1 in Table S1 shown in the examples.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 corresponds to the base sequence shown in Primer name RHD / RHCE_Exon9_KN_F2 in Table S1.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 corresponds to the base sequence shown in Primer name RHD / RHCE_Exon9_KN_R1 in Table S1.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 corresponds to the base sequence shown in Primer name RHD / RHCE_Exon9_KN_R2 in Table S1.
  • each of the first PCR primer to the fourth PCR primer is an oligonucleotide of 50 bases or less independently.
  • the first PCR primer, the second PCR primer, and the third PCR primer are each independently more preferably 40 bases or less, further preferably 30 bases or less.
  • the third PCR primer is more preferably 45 bases or less, and even more preferably 35 bases or less.
  • the primer sets A and B are PCR primer sets having the same base sequence. That is, it is preferable that the primer set in the present embodiment can amplify any region of the above-mentioned RHD gene region and the above-mentioned RHCE gene specific region on exon 9. Further, it is preferable that the primer set in the present embodiment can simultaneously amplify the region.
  • Primer sets 1, 3 and 4 (# 1, # 3 and # 4) in Table S1 are examples of PCR primer sets having the same base sequence and capable of simultaneously amplifying the above-mentioned RHD gene region and RHCE gene region. ..
  • the primer set 1 can simultaneously amplify the region represented by SEQ ID NO: 7 in the RHD gene and the region represented by SEQ ID NO: 10 in the RHCE gene.
  • the primer set 3 can simultaneously amplify the region represented by SEQ ID NOs: 8 and 18 in the RHD gene and the region represented by SEQ ID NO: 11 in the RHCE gene.
  • the primer set 4 can simultaneously amplify the region represented by SEQ ID NOs: 9 and 19 in the RHD gene and the region represented by SEQ ID NO: 12 in the RHCE gene.
  • the primer set included in the kit according to this embodiment preferably has a short amplification region from the viewpoint of increasing the detection rate of cell-free DNA.
  • primer set 3 is most preferred.
  • the kit according to this embodiment preferably further contains a PCR primer set (hereinafter, "primer set C") for determining the presence or absence of a deletion of the RHD gene.
  • primer set C a PCR primer set for determining the presence or absence of a deletion of the RHD gene.
  • the kit according to the present embodiment can determine not only the fetal RhD blood type but also the fetal and maternal human RHD type.
  • primer set D for determining the presence or absence of a point mutation on exon 9 of the RHD gene may be included.
  • the primer sets C and D in the present embodiment can also amplify at least one of the maternal DNA fragment and the fetal DNA fragment contained in the maternal blood. Further, also for the primer sets C and D in the present embodiment, it is more preferable that the DNA fragments derived from a plurality of gene regions can be amplified, and it is further preferable that the DNA fragments can be amplified at the same time.
  • the primer set C in the present embodiment can amplify a region on the upstream Rhesus box gene containing a base corresponding to chr1: 25592628 located on the upstream side of the RHD gene. ..
  • the primer set C in the present embodiment can also amplify a region on the downstream Rhesus box gene containing a base corresponding to chr1: 25662955, which is located on the downstream side of the RHD gene.
  • the primer set C can simultaneously amplify the region on the upstream Rhesus box gene and the region on the downstream Rhesus box gene described above.
  • the region on the upstream Rhesus box gene amplified by the primer set C is preferably 81 bp or more and 214 bp or less.
  • An example of the region is the 105 bp base sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • the region on the downstream Rhesus box gene amplified by the primer set C is preferably 81 bp or more and 214 bp or less.
  • An example of the region is the 105 bp base sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • Primer set C is a primer having a base sequence containing 15 or more consecutive bases in the base sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 (hereinafter, the fifth PCR primer and the sixth PCR, respectively). It is preferably a combination of primers).
  • the base sequences of the fifth PCR primer and the sixth PCR primer preferably independently contain 17 or more or 18 or more consecutive bases in the base sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively, and contain 19 or more bases. It is more preferable to include it.
  • the base sequence shown by SEQ ID NO: 5 corresponds to the base sequence shown by Primer name Rhbox_KN-F1 in Table S1.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 corresponds to the base sequence shown in Primer name Rhbox_KN-R1 in Table S1.
  • the fifth PCR primer and the sixth PCR primer are independently oligonucleotides of 50 bases or less.
  • the fifth PCR primer is more preferably 40 bases or less, and even more preferably 30 bases or less.
  • the sixth PCR primer is preferably 45 bases or less, more preferably 35 bases or less.
  • Primer set D in this embodiment can amplify a region on exon 9 of the RHD gene containing a base corresponding to chr1: 25648453 in which the base is A. is there.
  • An example of a region on exon 9 of the RHD gene amplified by primer set D is the base sequence of 214 bp shown in SEQ ID NO: 15.
  • primer set D in the present embodiment can also amplify the region on exon 9 of the RHCE gene containing the base corresponding to chr1: 25696598.
  • An example of a region on exon 9 of the RHCE gene amplified by primer set D is the base sequence of 214 bp shown in SEQ ID NO: 20.
  • Primer set D is a primer having a base sequence containing 15 or more consecutive bases in the base sequences shown by SEQ ID NOs: 16 and 17 (hereinafter, the seventh PCR primer and the eighth PCR, respectively). It is preferably a combination of primers).
  • the base sequences of the seventh PCR primer and the eighth PCR primer independently preferably contain 17 or more consecutive bases in the base sequences shown in SEQ ID NOs: 16 and 17, and preferably contain 19 or more bases. More preferred.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 corresponds to the base sequence shown in Primer name RHD / RHCE_exon_9_KN_F3 in Table S1.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 corresponds to the base sequence shown in Primer name RHD / RHCE_exon_9_KN_R3 in Table S1.
  • the seventh PCR primer and the eighth PCR primer are independently oligonucleotides of 50 bases or less.
  • the kit for fetal RhD blood type detection further prepares 1) various reagents and instruments used for PCR (polymerase, PCR buffer, each dNTP, pipette, etc.), and 2) a sample containing DNA to be used for PCR, if necessary.
  • various reagents and instruments test tubes, buffers, etc.
  • 3) Various reagents and instruments for analyzing PCR amplified fragments (electrophoretic gel materials, pipettes, etc.), 4) Instructions for use of detection kits, etc. It may have at least one.
  • the kit for detecting the fetal RhD blood group according to the present invention can be used for fetuses, infants, and adults. When used on the mother's body, the fetal RhD blood type between the mother and the fetus can be detected. In addition, the kit for detecting fetal RhD blood group according to the present invention can also target populations having various genotypes, including East Asian races. The kit for detecting human RHD type according to the present invention can detect fetal RhD blood type from maternal blood of a serologically RhD-negative mother regardless of the genotype of the mother.
  • the kit for detecting fetal RhD blood group according to the present invention can comprehensively target not only Caucasian races but also East Asian races that could not be qualitatively determined in the past.
  • East Asian races include, for example, Japanese, Korean, Chinese, and Taiwanese.
  • kit for detecting fetal RhD blood type may be able to detect not only fetal RhD blood type but also maternal and fetal human RHD type.
  • the method for detecting fetal RhD blood group involves an amplification step of amplifying a gene fragment contained in maternal blood obtained from a serologically RhD-negative maternal body. Including.
  • the method for detecting the fetal RhD blood type is described in the following steps: (A) Preparation step of preparing a sample containing maternal and fetal DNA from maternal blood, By (b) an amplification step of performing a polymerase chain reaction on the sample using the PCR primer set included in the kit, and (c) determining a specific base in each amplification fragment obtained in the amplification step. , It is preferable to include a RhD blood group detection step of detecting a fetal RhD blood group.
  • the fetal RhD blood type can be detected from the maternal blood of the serologically RhD-negative mother regardless of the genotype of the mother.
  • each step will be described.
  • the method for detecting the fetal RhD blood type further includes the following steps; (D) It is preferable to include an RHD type detection step of detecting a human RHD type between a mother and a fetus by examining the ratio of amplified fragments. Thereby, not only the fetal RhD blood type but also the maternal and fetal human RHD type can be detected.
  • each step will be described.
  • the preparation step is a step of preparing a sample containing DNA from a mother body to be inspected. Specifically, genomic DNA and cell-free DNA are extracted from maternal blood.
  • the genomic DNA and cell-free DNA may be extracted according to a conventional method.
  • the amplification step is a step of performing a PCR reaction on the above sample using the PCR primer set provided in the kit according to the present invention.
  • the PCR primer set according to the present invention can amplify the gene region used for detecting the fetal RhD blood group.
  • the PCR reaction can be carried out according to a conventional method using a PCR amplification device.
  • an amplified fragment amplified from the gene region existing in the sample can be obtained.
  • Conditions 1) to 6) have a synergistic effect when combined with each other.
  • a preferable example of the concentration of each primer set in the PCR reaction solution is 0.5 ⁇ M.
  • the final concentration of genomic DNA contained in the PCR reaction solution is preferably in the range of 0.05 ng / uL or more and 0.5 ng / uL or less.
  • the number of PCR cycles is preferably about 30 to 35 times, more preferably about 30 times.
  • the GC content of each primer is preferably in the range of, for example, 50% to 70%, and more preferably in the range of 50% to 65%.
  • the Tm value of each primer is preferably 50 ° C. to 65 ° C., more preferably 50 ° C. to 60 ° C. 6)
  • the annealing temperature is preferably 60 ° C. to 64 ° C., more preferably about 60 ° C.
  • RhD blood group detection step detects the fetal RhD blood group by determining a specific base in the PCR amplification fragment (amplicon) obtained in the amplification step using each primer set. It is a process.
  • next-generation sequencer In the detection process, it is preferable to use a next-generation sequencer.
  • the next-generation sequencer By using the next-generation sequencer, a trace amount of fetal-derived DNA amplification fragment contained in maternal blood can be detected, and a base in a plurality of amplification fragments having high sequence identity can be determined. Furthermore, when using a next-generation sequencer, it is possible to easily examine not only the fetal RhD blood type but also the ratio of amplified fragments for detecting the human RHD type.
  • next-generation sequencer is not particularly limited, and examples thereof include HiSeq2000 (Illumina), Genome Analyzer IIx (Illumina), and Genome Sequencer-FLX (Roche).
  • sequencing by a next-generation sequencer involves immobilizing nucleic acids, for example, on a flow cell or microarray.
  • bridge amplification can occur in flow cells in which nucleic acids are immobilized, or in microarrays in which nucleic acids are immobilized.
  • sequencing by a next-generation sequencer is achieved using "sequencing by synthesis (SBS)" technology.
  • SBS sequencing by synthesis
  • the SBS technique refers to a technique for sequencing the nucleic acid by synthesizing a complementary strand of the nucleic acid of interest.
  • “deep sequencing” may be adopted as a next-generation sequencing technique for performing sequence determination.
  • “Deep sequencing” refers to a method of sequencing multiple nucleic acids in parallel (references: Bentley et al., Nature 2008, 456: 53-59).
  • nucleic acids eg, DNA fragments
  • reaction platforms eg, flow cells and microarrays
  • the attached nucleic acid is amplified in situ and can be used as a template for synthetic sequencing (eg SBS) with detectable labels (eg, fluorescent reversible terminator deoxyribonucleotides).
  • Representative reversible terminator deoxyribonucleotides may include 3'-O-azidomethyl-2'-deoxynucleoside triphosphates, respectively, of adenine, cytosine, guanine and thymine, each via a linker to each other. It may be further labeled with a recognizable and removable fluorophore. Sequencing can be performed by the single read method or the paired end method.
  • allele RHD * 01 (RhD-positive type: wild type), RHD * 01N.01 (deletion type: total deletion mutation), and RHD * 01EL.01 (point mutation type:) (Point mutation) and RHD * 01 N. 04 (RHD-RHCE hybrid type: recombinant mutation) differ in the base at a specific position in the amplified fragment. Therefore, by determining a specific base in the amplified fragment, it is possible to determine whether the fetus has the RHD * 01 allele, that is, the fetal RhD blood group.
  • chr1: 25648453 is located in the region on exon 9 of the RHD gene, and chr1: 25696958 is located in the region on exon 9 of the RHCE gene.
  • the base of chr1: 25648453 is G or A, and the base of chr1: 25696958 is G.
  • the base to be determined may be a complementary base.
  • G may have an RHD * 01 allele. However, G may be detected even if the fetus does not have the RHD * 01 allele. This is because the exon 9 of the RHD gene and the exon 9 of the RHCE gene have high sequence identity, and therefore, G of chr1: 25696958 may correspond to the base corresponding to chr1: 25648453.
  • the present invention it is possible to perform fetal RhD blood group prenatal diagnosis even for a RhD-negative pregnant woman due to a non-deletion allele. Further, according to one embodiment of the present invention, it is considered that it can be widely used for East Asian races including Japanese (see Table S5). Therefore, it is possible to reduce the risk of pregnant women due to infectious diseases and unnecessary tests, and further reduce medical expenses.
  • the human RHD type detection step is a step of examining the ratio of amplified fragments.
  • the ratio of the width fragments can be obtained by comparing the number of reads at the time of amplification using, for example, software designated by the next-generation sequencer.
  • the human RHD type between the mother and the fetus cannot be discriminated. There is. Therefore, it is further preferable to determine the base corresponding to chr1: 25592628. chr1: 25592628 exists in the region of upstream Rh box, and the base is G. The base corresponding to chr1: 25592628 is not detected in the RHD * 01N.01 allele.
  • chr1: 25696896 vi) Base corresponding to chr1: 25697015 vi) Base corresponding to chr1: 25662955 chr1: 25696896 and chr1: 25697015 are present in the region on exon 9 of the RHCE gene.
  • the base of chr1: 25696896 is G and the base of chr1: 25697015 is T.
  • chr1: 25662955 is present in the region of the Downstream Rh box and the base is A.
  • RhD-negative pregnant woman When it is detected that a RhD-negative pregnant woman is pregnant with a RhD-positive fetus, neonatal hemolytic disease can be prevented by administering anti-D human immunoglobulin to the pregnant woman. It may be preferable that the RhD-negative pregnant women to whom the anti-D human immunoglobulin is administered are limited to RhD-negative pregnant women who have given birth to a RhD-positive fetus. Administration of anti-D human immunoglobulin to RhD-negative pregnant women may be preferred at 28 weeks gestation and after delivery.
  • a kit for fetal RhD blood group detection containing at least one PCR primer set selected from the following 1) and 2); 1) PCR primer set capable of amplifying the region on exon 9 of the RHD gene containing the base corresponding to chr1: 25648453 2) Amplifying the region on exon 9 of the RHCE gene containing the base corresponding to chr1: 25696958 PCR primer set.
  • the above region on exon 9 of the RHD gene contains at least one of the bases corresponding to chr1: 25648419 and the bases corresponding to chr1: 25648515, in addition to the base corresponding to chr1: 25648453.
  • the above region on exon 9 of the RHCE gene contains at least one of the bases corresponding to chr1: 25697015 and the bases corresponding to chr1: 25696896, in addition to the base corresponding to chr1: 25696598.
  • the PCR primer sets of 1) and 2) above are independently the first PCR primer containing 15 or more consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a second PCR primer containing 15 or more consecutive bases in a third PCR primer containing 15 or more consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, or a continuous PCR primer in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the kit according to any one of (A) to (D), which is the following oligonucleotide.
  • the PCR primer sets 1) and 2) are independently composed of the first PCR primer and the fourth PCR primer, or the second PCR primer and the third PCR primer set.
  • kits according to any one of (A) to (G), further comprising the PCR primer set of 3) below; 3) A PCR primer set for determining the presence or absence of a deletion of the RHD gene.
  • the PCR primer set of 3) above is a PCR primer set capable of amplifying a region on the upstream Rhesus box gene containing a base corresponding to chr1: 25592628, which is located on the upstream side of the RHD gene.
  • the PCR primer set of 3) above is an oligonucleotide of 50 bases or less, and is a first PCR primer containing 15 or more consecutive bases in the base sequence shown by SEQ ID NO: 5 and 50 bases or less.
  • (L) A method for detecting a fetal RhD blood type, which comprises an amplification step of amplifying a gene fragment contained in maternal blood obtained from a maternal body using the kit according to any one of (L) (A) to (K).
  • Pregnant female subjects (“pregnant female subjects”) received genetic counseling by a clinical geneticist prior to blood sampling. In addition, all pregnant women submitted written informed consent.
  • EDTA-2K tube manufactured by Terumo
  • the separated plasma, buffy coat and erythrocyte fractions were immediately frozen at ⁇ 20 ° C. and stored as is until DNA extraction.
  • 5 ml of neonatal umbilical cord blood was collected in a DTA-2K tube.
  • Umbilical cord blood of the newborn was collected immediately after delivery of the pregnant female subject.
  • Genomic DNA was extracted from JRCS blood samples, pia mater samples in maternal blood of pregnant women, and cord blood samples.
  • QIAsymphony QIAGEN was used to extract genomic DNA from blood samples. Extraction of cell-free DNA was performed from 800 ⁇ L of plasma using MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit (QIAGEN).
  • the base sequence of RHD and the base sequence of RHCE have 96% sequence identity. Further, the nucleotide sequence of the upstream Rh box located upstream of the RHD and the nucleotide sequence of the downstream Rh box located downstream of the RHD have 98.6% sequence identity. When amplifying multiple sequences with high sequence similarity by PCR, amplification of a specific region is often hindered.
  • the present inventors have designed a primer set that perfectly matches the two homologs and can amplify both regions at the same time. As will be described later with reference to FIGS. 2 and 3, the function of this primer has been verified from the result of determining the sequence of the amplicon amplified from the RHD / RHCE locus by the next-generation sequencer.
  • the target regions and sequences of the newly designed primer set are shown in Table S1 (Table S1) as primer sets 1, 3, 4 and 6 (# 1, # 3, # 4 and # 6).
  • a PCR primer set was designed for the purpose of amplifying a DNA fragment in which a point mutation occurs in the exon 9 region of the RHD gene containing a base corresponding to chr1: 25648453.
  • the target region and sequence of this primer set are shown in Table S1 as primer set 5 (# 5).
  • RhD-negative genotypes are common in Japanese; RHD * 01N.01 / RHD * 01N.01 RHD * 01.04 / RHD * 01N.01 RHD * 01EL.01 / RHD * 01N.01.
  • the genotype was identified as one of the above three by amplifying the region containing the following four gene regions using the PCR method; upstream Rh box downstream Rh box RHD RHCE.
  • the PCR reaction was performed using Ex Taq Hot Start Version (TaKaRa) as a DNA polymerase.
  • TaKaRa Ex Taq Hot Start Version
  • 50 ng of the previously extracted genomic DNA was used as a synthetic scale of 20 ⁇ L.
  • the PCR primer set the PCR primer sets 5 and 7 to 11 shown in Table S1 were used. The sample was 5 ng or more, and the primer concentration was 10 ⁇ M.
  • the reaction conditions are as follows. That is, first, the initial denaturation reaction is carried out at 98 ° C. for 20 seconds, followed by a denaturation reaction at 98 ° C. for 10 seconds, an annealing reaction at 60 ° C. or 64 ° C. for 30 seconds, and an extension reaction at 72 ° C. for 30 seconds. 35 cycles were repeated in order, and finally the extension reaction was carried out at 72 ° C. for 2 minutes.
  • the device used was ProFlex (Applied Biosystems).
  • Genotypes of 100 serologically RhD-negative samples were identified using existing primers.
  • Hybrid Rh box The presence or absence of Hybrid Rh box was confirmed for the genomic DAN extracted from each sample.
  • the primer set 11 shown in Table S1 was used to amplify the region containing the Hybrid Rh box.
  • the region containing the Hybrid Rh box was amplified in all 100 samples.
  • RHD / RHCE gene refers to the RHD gene and the RHCE gene.
  • both exons 7 and 9 of the RHD gene are present. I checked if it was.
  • the primer sets 7 and 9 shown in Table S1 were used to amplify the region containing exon 7 of the RHD gene and the region containing exon 9 of the RHD gene, respectively.
  • the genotype of the sample in which only the exon 9 of the RHD gene was amplified was identified as RHD * 01.04 / RHD * 01N.01.
  • the genotype of 4 of the 100 samples was identified as RHD * 01.04 / RHD * 01N.01.
  • ExTaq Hot Start Version (TaKaRa) was used as the DNA polymerase.
  • the primer set the primer sets 1, 3, 4 and 6 shown in Table S1 were used.
  • the sample was 5 ng or more, and the primer concentration was 10 ⁇ M.
  • Sample amplification was performed under the following conditions. That is, the initial denaturation reaction was carried out at 98 ° C. for 20 seconds, and then as an amplification reaction, the reactions at 98 ° C. for 10 seconds, 62 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds were repeated for 35 cycles in order, and finally 72 ° C. I went there for 2 minutes.
  • BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ABI) was used as the sequencing kit, and BigDyeXTerminator Purification Kit (ABI) was used as the purification kit.
  • the device used was a 3130xl Genetic Analyzer (ABI).
  • the newly designed primer sets 1, 3, 4 and 6 all simultaneously amplified two gene regions having high sequence similarity to each other.
  • FIG. 2 shows a part of the sequences determined in the region containing upstream Rh box and the region containing downstream Rh box for each genotype.
  • FIG. 3 shows a part of the sequences determined in the region containing RHD and the region containing RHCE for each genotype.
  • Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (NEB) was used as the polymerase.
  • the primer set the primer sets 1 and 3 to 6 shown in Table S1 were used separately. The sample was 1 ng and the primer concentration was 10 ⁇ M.
  • Sample amplification was performed under the following conditions. That is, the initial denaturation reaction was carried out at 98 ° C. for 30 seconds, and then the reaction at 98 ° C. for 10 seconds, 62 ° C. for 3 seconds, and 72 ° C. for 5 seconds was repeated for 30 cycles in order.
  • the product was purified using Agencourt AM PureXP (Beckman Coulter).
  • NEB Next Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina was used as a library preparation reagent, and PCR amplification was performed for 6 cycles according to the manufacturer's protocol to prepare a library.
  • the genome sequence in each library was determined on the MiSeq platform (illumina) using MiSeq Reagent Kit v2 Nano (illumina). Sequencing was performed in paired-end mode (151 bp each).
  • each fragment was derived from the upstream Rh box region or the downstream Rh box region.
  • mapping results among the mapped reads, reads containing bases having a mapping score (MAPQ) of 20 or less and a quality score of 25 or less were removed.
  • MAPQ mapping score
  • the mapping result with the low-scoring leads removed was output as an image using the Integrated Genomics Viewer (IGV, http://software.broadinstitute.org/software/igv/).
  • Figures 4 and 5 show a combination of the mapping result and the amplicon type at the corresponding position for each library.
  • the number and ratio of amplicon derived from each of the RHD gene and the RHCE gene were determined.
  • the number and ratio of amplicon derived from each of the upstream Rh box area and the downstream Rh box area were also calculated.
  • the RHD gene-derived amplicon was distinguished by wild type (wt in the table) and mutant type (mut in the table).
  • RhD-negative genotypes in the Japanese population 4 major RhD-positive genotypes in the Japanese population (including allele RHD * 01) and 3 major RhD-negative genotypes in the Japanese population (not including allele RHD * 01)
  • the frequency was calculated. Specifically, the frequency of RhD-negative genotypes in the Japanese population is known to be 0.5%, and previous studies (Ogasawara K, Suzuki Y, Sasaki K, Osabe T, Isa K, Calculated according to Hardy-Weinberg equilibrium based on Tsuneyama H, et al. Molecular basis for D-Japanese: identification of novel DEL and D-alleles. Vox Sang. 2015; 109 (4): 359-65.). The results are shown in Table 1.
  • a sample was prepared.
  • A assumes the DNA of a pregnant woman who is serologically RhD negative, and the genotypes are RHD * 01N.01 / RHD * 01N.01, RHD * 01.04 / RHD * 01N.01 and RHD * 01EL.01 / RHD. * 01 Selected from N.01.
  • B was selected from serological RhD-positive or serological RhD-negative genotypes, assuming fetal DNA. Specifically, it was selected from RHD * 01 / RHD * 01, RHD * 01N.01 / RHD * 01N.01, RHD * 01.04 / RHD * 01N.01 and RHD * 01EL.01 / RHD * 01N.01. It should be noted that, if the mother is a serological RhD negative, for the genotype of the fetus, but not be a RHD * 01 / RHD * 01, in which the DNA of the RHD * 01N / RHD * 01N.01 was not available at the time of test , Used as a substitute.
  • Amplification of the simulated sample was performed under the following conditions. That is, the initial denaturation reaction was carried out at 98 ° C. for 30 seconds, and then the reaction at 98 ° C. for 10 seconds, 62 ° C. for 3 seconds, and 72 ° C. for 5 seconds was repeated for 30 cycles in order.
  • the product was purified using Agencourt AM PureXP (Beckman Coulter).
  • the genome sequence of each simulated sample was determined on the MiSeq platform (illumina) using MiSeq Reagent Kit v2 Nano (illumina). Sequencing was performed in paired-end mode (151 bp each). Each base shown in "4. Mapping of gene region and confirmation of number of reads" was obtained.
  • Amplification of the cell-free DNA sample was performed in the same manner as in preliminary test 1.
  • the RHD genotypes of pregnant female subjects and their fetuses were determined based on the number and ratio of each amplicon and the Expected ratio in Table S2.
  • the number and ratio of amplicon derived from each gene region were determined by the same method as shown in "Preliminary Test 1".
  • the results when the primer sets 1 and 6 are used are shown in Table 4 (Table 4) and Table S3 (Table S3).
  • the fetal genotype was RhD-positive in 6 and RhD-negative in 2. If the RHD-negative genotype of a pregnant female subject is heterozygous (RHD * 01.N04 / RHD * 01N.01 or RHD * 01EL.01 / RHD * 01N.01), there are two possible fetal RHD genotypes. (Subjects 1, 4 and 7 in Table S3). However, from Tables 4 and S3, the proportion of RHD genotype wild-type amplicon in cell-free DNA was in the range of 1.3% to 3.1%, indicating that the fetal phenotype was It could be determined to be RhD positive.
  • each RHD genotype was determined separately using leukocyte DNA of a pregnant woman subject and umbilical cord blood of a newborn baby. Genotyping was performed using the same method as shown in "Preliminary Test 1", amplifying the sample and then based on the number and proportion of amplicon derived from each gene region. The results when the primer sets 1 and 6 are used are shown in Table S3. In addition, the serological RhD type was confirmed by collecting peripheral blood of a newborn baby and examining whether or not the blood aggregated using a monoclonal antibody against the D antigen.
  • Table S4 The results are shown in Table S4.
  • the primer with a primer size of 81 bp corresponds to the primer set 3
  • the primer with a primer size of 114 bp corresponds to the primer set 4.
  • the primer having a primer size of 148 bp corresponds to the primer set 1
  • the primer having a primer size of 214 bp corresponds to the primer set 5.
  • the detection rate of cell-free DNA was highest when the primer set 3 that amplifies the shorter range was used.

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Abstract

母体の遺伝子型に拘わらず、胎児ＲｈＤ血液型を検出することができる、新規の胎児ＲｈＤ血液型検出キット、及び検出方法を提供すること。以下の１）及び２）から選択される少なくとも一つのＰＣＲプライマーセットを含む、胎児ＲｈＤ血液型検出用のキット；１）chr1:25648453に相当する塩基を含むＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の領域を、増幅可能なＰＣＲプライマーセット、２）chr1:25696958に相当する塩基を含むＲＨＣＥ遺伝子のエクソン９上の領域を、増幅可能なＰＣＲプライマーセット。

Description

胎児ＲｈＤ血液型検出用のキット及びその利用
　本発明は、胎児ＲｈＤ血液型の検出に関し、より詳細には、胎児ＲｈＤ血液型検出用のキット及びその利用に関する。
　新生児溶血性疾患の多くは、ＲｈＤ血液型同種免疫によって生じ、胎児死亡に至る可能性がある非常に重篤な疾患である（非特許文献１）。この疾患は、ＲｈＤ陰性の妊婦がＲｈＤ陽性の胎児を妊娠することで生じる（ＲｈＤ不適合妊娠）。妊娠中、母体血液中には少量の胎児由来赤血球が流入する（母児間輸血）。この現象により母体がＲｈＤ抗原に対する感作を受け、母体内に抗Ｄ抗体が産生される。母体内で産生された抗Ｄ抗体は胎盤を通過し、胎児のＲｈＤ抗原と抗原抗体反応を起こし、赤血球の溶血を起こす。胎児の症状は軽度の貧血から胎児死亡にいたるまで幅広く、ＲｈＤ不適合妊娠の第一子の妊娠から発症しうる（非特許文献２）。
　ＲｈＤ血液型同種免疫を予防するため、血清学的にＲｈＤ陰性と判定された妊婦は、胎児のＲｈＤ血液型によらず、妊娠２８週及び分娩後に抗Ｄヒト免疫グロブリンを投与することが推奨されている（非特許文献３～５）。しかし、抗Ｄヒト免疫グロブリンはヒト由来製剤であるため、潜在的に感染症を生じる危険性がある。また、抗Ｄヒト免疫グロブリン投与によって生じる医療費は、１症例につき＄5247と報告されるように、高額である（非特許文献６）。
　最近のレビュー（非特許文献２５）によれば、胎児ＲｈＤ血液型出生前診断を行い、胎児がＲｈＤ陽性の場合にのみ、抗Ｄヒト免疫グロブリン投与を行うというプロトコールが医療費削減のために有効である。さらに、胎児のＲｈＤ血液型を正確に判定できれば、胎児貧血を評価するための侵襲的な羊水検査、及び、頻回な胎児中大脳動脈測定など（非特許文献１２及び１３）を行う必要がなくなる。
　１９９７年にDenis Loらにより、母体血液中に胎児由来cell-free DNAが存在することが報告された（非特許文献７）。cell-free DNAは血漿中に存在するＤＮＡであり、アポトーシスした細胞から血液中に放出された約160bpのＤＮＡ断片である。妊娠母体血漿中に存在する胎児由来cell-free DNAは、アポトーシスした絨毛細胞に由来し、約140bpとさらに短いＤＮＡである（非特許文献２３）。血中の微量なcell-free DNAは、胎児の常染色体の異数性の診断、性別診断及び胎児ＲｈＤ血液型出生前診断等に用いられてきた（非特許文献８～１１）。過去の大多数の胎児ＲｈＤ血液型出生前診断は、まず、母体の遺伝子型判定を行う。続いて、ＲＨＤ遺伝子の全欠失変異を持つ母体に対して、母体血漿中における胎児由来ＲＨＤ遺伝子（ＲＨＤ遺伝子Exon）の有無による定性的な方法によって、胎児ＲｈＤ血液型判定を行っている（非特許文献１１、１４～１６及び２４）。これらの臨床研究では、感度９７～９９％、特異度９７～９９％と報告されている。
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　しかし、従来の研究は白人集団を対象になされてきたものである。白人集団においては、血清学的にＲｈＤ陰性の場合の遺伝子型は、９９％以上がＲＨＤ遺伝子の全欠失変異のホモ接合である（非特許文献１７～１９及び２６）。そのため、母体が他の遺伝型、すなわち、ＲＨＤ遺伝子の非欠失変異アレルを有している場合は、定性的な判定を行うことは困難である。
　ＲｈＤ陰性血液型にはRhD-negativeとD-elute（ＤＥＬ）とが含まれる（非特許文献２０）。RhD-negativeもしくはＤＥＬは、ＲｈＤ機能喪失アレルのホモ接合又はコンパウンドヘテロ接合によって生じる。現在、１００種類以上の機能喪失アレルが知られているが（非特許文献２１）、人種間でアレル頻度が異なることが知られている。
　非特許文献２２によれば、通常の血清学的検査で凝集が見られなかった3526人の日本人集団のうちの９９．６％は、遺伝子型が、RHD*01N.01(deletion type：全欠失変異)と、RHD*01EL.01(point mutation type：点変異)と、RHD*01N.04(RHD-RHCE hybrid type：組換え変異)とのアレルの組み合わせである。そして、そのうちの約１２％がRHD*01N.01のホモ接合以外によって生じている。RHD*01EL.01、及びRHD*01N.04は非欠失変異アレルである。また、これらの遺伝子型の頻度は、他の東アジア諸国でもほぼ同一である（非特許文献：２７及び２８）。
　従来のＲｈＤ陰性母体に対する、胎児ＲｈＤ血液型出生前診断は、白人人種、すなわちＲＨＤ遺伝子の全欠失変異が圧倒的多数を占める集団を対象としている。そのため、非欠失変異アレルの割合が多い東アジア及びアフリカなどの人種（非特許文献２２及び２７～２９）には応用することが困難である。
　さらにＲＨＤ遺伝子に特有な問題として、ヒトＲＨＤ型に関与するＲＨＤ遺伝子とＲＨＣＨ遺伝子とは互いに類似した配列構造を有する上に、いずれの遺伝子も反復配列等を多く含んでいる。そのため、ＲＨＤ遺伝子の全欠失変異以外の変異を検出するための適切なＰＣＲプライマーを設計することは非常に困難な場合がある。
　そこで、本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、母体の遺伝子型に拘わらず、胎児ＲｈＤ血液型を検出することができる、新規の胎児ＲｈＤ血液型検出キット、及び検出方法を提供することにある。
　発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、RhD-positiveであるRHD*01（Wild type）と、RHD*01N.01(deletion type：全欠失変異)、RHD*01EL.01(point mutation type：点変異)及びRHD*01N.04(RHD-RHCE hybrid type：組換え変異)とを判別するために必要な遺伝子マーカーを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、以下の１）及び２）から選択される少なくとも一つのＰＣＲプライマーセットを含む、胎児ＲｈＤ血液型検出用のキットである；
　１）chr1:25648453に相当する塩基を含むＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の領域を、増幅可能なＰＣＲプライマーセット
　２）chr1:25696958に相当する塩基を含むＲＨＣＥ遺伝子のエクソン９上の領域を、増幅可能なＰＣＲプライマーセット。
　また、本発明は、上記のキットを用いて、母体から取得された母体血中に含まれる遺伝子断片を増幅する増幅工程を含む、胎児ＲｈＤ血液型の検出方法である。
　本発明の一態様によれば、母体の遺伝子型に拘わらず、胎児ＲｈＤ血液型を検出することができる、新規の胎児ＲｈＤ血液型検出キット、及び検出方法を提供することができる。
Ａは、遺伝子上の特定の位置の塩基を示す図であり、Ｂは、各アレルの違いを模式的に示す図である。 本発明の実施例の結果を示す図である。 本発明の実施例の結果を示す図である。 本発明の実施例の結果を示す図である。 本発明の実施例の結果を示す図である。 本発明の実施例の結果を示す図である。
　１．胎児ＲｈＤ血液型検出用のキット
　本実施形態に係る胎児ＲｈＤ血液型検出用のキットは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって所望のＤＮＡ断片を増幅することで、胎児ＲｈＤ血液型を検出することが可能なキットである。
　（ＰＣＲプライマーセット）
　本実施形態に係る胎児ＲｈＤ血液型検出用のキットは、ＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の特定の領域を増幅可能なＰＣＲプライマーセット、及びＲＨＣＥ遺伝子のエクソン９上の特定の領域を増幅可能なＰＣＲプライマーセットから選択される、少なくとも一つのＰＣＲプライマーセットを含む。
　・ＰＣＲプライマーセットが増幅する領域
　本実施形態におけるプライマーセットは、母体血中に含まれる胎児由来ＤＮＡ断片を増幅できることが好ましい。また、本実施形態におけるプライマーセットは、複数の遺伝子領域に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅できることが好ましい。さらに、本実施形態におけるプライマーセットは、複数の遺伝子領域に由来するＤＮＡ断片を同時に、特異的に増幅できることが好ましい。
　ここでいう「複数の遺伝子領域」とは、例えば母体血中のＤＮＡ断片を増幅する場合において、母体の遺伝子と胎児の遺伝子とから、それぞれ少なくとも１つずつ選択した領域、母体の遺伝子における複数の遺伝子領域、及び胎児の遺伝子における複数の遺伝子領域を含む。
　本発明の一実施形態における、ＲＨＤ遺伝子の特定の領域を増幅可能なＰＣＲプライマーセット（以下、「プライマーセットＡ」）は、chr1:25648453に相当する塩基を含むＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の領域を、増幅可能である。
　ここで、「chr1:25648453」とは、GRCh37/hg19に基づいて定義され、「第１染色体の第25648453番目の位置」を意味する。以下、「chr1:～」の記載は同様に定義される。
　「chr1:25648453に相当する塩基」とは、chr1:25648453位を含む領域に対して高い配列同一性を有する領域のうちの、chr1:25648453位に対応する塩基を指す。chr1:25648453位の塩基と、chr1:25648453に相当する塩基とは必ずしも一致しない。
　より具体的には、例えば、「配列番号Ｘに記載の塩基配列のＹ番目の塩基に相当する塩基」とは、ホモロジー解析により、配列番号Ｘに記載の塩基配列のＹ番目に相当すると特定される塩基を指す。なお、ホモロジー解析の方法としては、例えば、Needleman-Wunsch法、Smith-Waterman法等のPairwise Sequence Alignmentによる方法、及びClustalW法等のMultiple Sequence Alignmentによる方法が挙げられる。当業者であれば、これら方法に基づき、配列番号Ｘに記載の塩基配列を基準配列として用いて、解析対象の塩基配列中における「相当する塩基」を理解することができる。解析対象の塩基配列は、例えば、上記基準配列の変異体が挙げられる。解析は、デフォルトの設定で行ってもよく、適宜、必要に応じてパラメータをデフォルトから変更して行ってもよい。
　なお、「基準配列の変異体」とは、一例において、配列同一性が９０％以上であればよいが、９５％以上であることが好ましく、９６％以上であることがより好ましく、９８％以上であることがさらに好ましい。また、配列同一性は、１００％以下であり、一例において１００％未満である。以下、「～に相当する塩基」は、同様に定義される。
　「chr1:25648453に相当する塩基を含むＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の領域」とは、ＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の領域であって、上記した「chr1:25648453に相当する塩基」が含まれている領域を指す。なお、ＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の領域には、ＲＨＤ遺伝子内の領域の他に、ＲＨＤ遺伝子に由来する領域を指す。「ＲＨＤ遺伝子に由来する領域」には、例えば、ＲＨＤ遺伝子座から別の遺伝子座へ転座した領域も含まれる。以下、「～に相当する塩基を含む～の領域」に関する記載は、同様に定義される。
　また、プライマーセットＡが増幅するＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の領域は、chr1:25648453に相当する塩基に加えて、chr1:25648419に相当する塩基及びchr1:25648515に相当する塩基のうち少なくとも一方の塩基を含んでいることが好ましく、両方の塩基を含んでいることがより好ましい。
　プライマーセットＡが増幅するＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の領域は、８１ｂｐ以上２１４ｂｐ以下であることが好ましく、８１ｂｐ以上１４８ｂｐ以下であることがさらに好ましい。
　該領域の例を３つ挙げる。１つ目の例として、該領域は、配列番号７で示す１４８ｂｐの塩基配列である。２つ目の例として、該領域は、配列番号８及び１８で示す８１ｂｐの塩基配列である。３つ目の例として、該領域は、配列番号９及び１９で示す１１４ｂｐの塩基配列である。
　本発明の一実施形態における、ＲＨＣＥ遺伝子の特定の領域を増幅可能なＰＣＲプライマーセット（以下、「プライマーセットＢ」）は、chr1:25696958に相当する塩基を含むＲＨＣＥ遺伝子のエクソン９上の領域を、増幅可能である。
　プライマーセットＢが増幅するＲＨＣＥ遺伝子のエクソン９上の領域は、chr1:25696958に相当する塩基に加えて、chr1:25697015に相当する塩基及びchr1:25696896に相当する塩基のうち少なくとも一方の塩基を含んでいることが好ましく、両方の塩基を含んでいることがより好ましい。
　プライマーセットＢが増幅するＲＨＣＥ遺伝子のエクソン９上の領域は、８１ｂｐ以上２１４ｂｐ以下であることが好ましく、８１ｂｐ以上１４８ｂｐ以下であることがさらに好ましい。
　該領域の例を３つ挙げる。１つ目の例として、該領域は配列番号１０で示す１４８ｂｐの塩基配列である。２つ目の例として、該領域は、配列番号１１で示す８１ｂｐの塩基配列である。３つ目の例として、該領域は、配列番号１２で示す１１４ｂｐの塩基配列である。
　・ＰＣＲプライマーセットの塩基配列
　プライマーセットＡ及びＢは、それぞれ独立に、配列番号１～４で示す塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む塩基配列を有するプライマー（以下、それぞれ、第一のＰＣＲプライマー～第四のＰＣＲプライマー）を組合せたものであることが好ましい。
　第一のＰＣＲプライマー～第四のＰＣＲプライマーの塩基配列は、それぞれ独立に、配列番号１～４示す塩基配列において連続する１８以上の塩基を含むことが好ましく、１９以上又は２０以上の塩基を含むことがより好ましく、２１以上の塩基を含むことがさらに好ましい。一例では、第一のＰＣＲプライマー～第四のＰＣＲプライマーの塩基配列は、それぞれ順に、配列番号１～４示す塩基配列の全てを含む。
　プライマーセットＡ及びＢは、それぞれ独立に、第一のＰＣＲプライマー又は第二のＰＣＲプライマーと、第三のＰＣＲプライマー又は第四のＰＣＲプライマーとからなるＰＣＲプライマーセットであることが好ましい。
　また、プライマーセットＡ及びＢは、それぞれ独立に、第一のＰＣＲプライマーと第四のＰＣＲプライマーとからなるＰＣＲプライマーセット、又は、第二のＰＣＲプライマーと第三のＰＣＲプライマーとからなるＰＣＲプライマーセットであることが好ましい。
　なお、配列番号１で示す塩基配列は、実施例に示した表Ｓ１中のPrimer name RHD/RHCE_Exon9_KN_F1で示す塩基配列に相当する。また、配列番号２で示す塩基配列は、表Ｓ１中のPrimer name RHD/RHCE_Exon9_KN_F2で示す塩基配列に相当する。配列番号３で示す塩基配列は、表Ｓ１中のPrimer name RHD/RHCE_Exon9_KN_R1で示す塩基配列に相当する。配列番号４で示す塩基配列は、表Ｓ１のPrimer name RHD/RHCE_Exon9_KN_R2で示す塩基配列に相当する。
　第一のＰＣＲプライマー～第四のＰＣＲプライマーは、それぞれ独立に、５０塩基以下のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。一例では、第一のＰＣＲプライマー、第二のＰＣＲプライマー及び第三のＰＣＲプライマーは、それぞれ独立に、４０塩基以下であることがより好ましく、３０塩基以下であることがさらに好ましい。一例では、第三のＰＣＲプライマーは、４５塩基以下であることがより好ましく、３５塩基以下であることがさらに好ましい。
　プライマーセットＡ及びＢは、塩基配列が同一のＰＣＲプライマーセットであることが好ましい。すなわち、本実施形態におけるプライマーセットは、上述したＲＨＤ遺伝子の領域、及び上述したＲＨＣＥ遺伝子のエクソン９上の特定の領域のいずれの領域も増幅できることが好ましい。さらに、本実施形態におけるプライマーセットは、該領域を同時に増幅できることが好ましい。
　塩基配列が同一かつ、上述したＲＨＤ遺伝子の領域及びＲＨＣＥ遺伝子の領域を同時に増幅できるＰＣＲプライマーセットとして、表Ｓ１中のプライマーセット１、３及び４（＃１、＃３及び＃４）が挙げられる。
　例えば、プライマーセット１は、ＲＨＤ遺伝子における配列番号７で示す領域、及び、ＲＨＣＥ遺伝子における配列番号１０で示す領域を同時に増幅することができる。プライマーセット３は、ＲＨＤ遺伝子における配列番号８及び１８で示す領域と、ＲＨＣＥ遺伝子における配列番号１１で示す領域とを同時に増幅することができる。プライマーセット４は、ＲＨＤ遺伝子における配列番号９及び１９で示す領域と、ＲＨＣＥ遺伝子における配列番号１２で示す領域とを同時に増幅することができる。
　本実施形態に係るキットに含まれるプライマーセットは、cell-free DNAの検出率を高める観点から、増幅する領域が短いことが好ましい。上に挙げた表Ｓ１中のプライマーセットの例では、プライマーセット３が最も好ましい。
　（その他のＰＣＲプライマーセット）
　本実施形態に係るキットは、ＲＨＤ遺伝子の欠失の有無を判定するためのＰＣＲプライマーセット（以下、「プライマーセットＣ」）をさらに含むことが好ましい。本実施形態に係るキットは、プライマーセットＣを含むことにより、胎児ＲｈＤ血液型だけでなく、胎児及び母体のヒトＲＨＤ型までも判定することができる。
　また、ＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の点変異の有無を判定するためのＰＣＲプライマーセット（以下、「プライマーセットＤ」）を含んでいてもよい。
　本実施形態におけるプライマーセットＣ及びＤも、母体血中に含まれる母体由来ＤＮＡ断片及び胎児由来ＤＮＡ断片のうち少なくとも一方を増幅できることが好ましい。また、本実施形態におけるプライマーセットＣ及びＤについても、複数の遺伝子領域に由来するＤＮＡ断片を増幅できることがより好ましく、該ＤＮＡ断片を同時に増幅できることがさらに好ましい。
　・ＰＣＲプライマーセットＣが増幅する領域
　本実施形態におけるプライマーセットＣは、ＲＨＤ遺伝子の上流側に位置する、chr1:25592628に相当する塩基を含む上流側Rhesus box遺伝子上の領域を、増幅できることが好ましい。
　また、本実施形態におけるプライマーセットＣは、ＲＨＤ遺伝子の下流側に位置する、chr1:25662955に相当する塩基を含む下流側Rhesus box遺伝子上の領域も、増幅できることが好ましい。
　プライマーセットＣは、上述の上流側Rhesus box遺伝子上の領域、及び、下流側Rhesus box遺伝子上の領域を同時に増幅できることが好ましい。
　プライマーセットＣが増幅する上流側Rhesus box遺伝子上の領域は、８１ｂｐ以上２１４ｂｐ以下であることが好ましい。該領域の例として、配列番号１３で示す１０５ｂｐの塩基配列が挙げられる。
　また、プライマーセットＣが増幅する下流側Rhesus box遺伝子上の領域は、８１ｂｐ以上２１４ｂｐ以下であることが好ましい。該領域の例として、配列番号１４で示す１０５ｂｐの塩基配列が挙げられる。
　・ＰＣＲプライマーセットＣの塩基配列
　プライマーセットＣは、配列番号５及び６で示す塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む塩基配列を有するプライマー（以下それぞれ、第五のＰＣＲプライマー及び第六のＰＣＲプライマー）の組合せであることが好ましい。第五のＰＣＲプライマー及び第六のＰＣＲプライマーの塩基配列は、それぞれ独立に、配列番号５及び６で示す塩基配列において連続する１７以上又は１８以上の塩基を含むことが好ましく、１９以上の塩基を含むことがより好ましい。
　なお、配列番号５で示す塩基配列は、表Ｓ１中のPrimer name Rhbox_KN-F1で示す塩基配列に相当する。また、配列番号６で示す塩基配列は、表Ｓ１中のPrimer name Rhbox_KN-R1で示す塩基配列に相当する。
　第五のＰＣＲプライマー及び第六のＰＣＲプライマーは、それぞれ独立に、５０塩基以下のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。一例では、第五のＰＣＲプライマーは、４０塩基以下であることがより好ましく、３０塩基以下であることがさらに好ましい。一例では、第六のＰＣＲプライマーは、４５塩基以下であることが好ましく、３５塩基以下であることがさらに好ましい。
　・ＰＣＲプライマーセットＤが増幅する領域
　本実施形態におけるプライマーセットＤは、chr1:25648453に相当する塩基を含むＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の領域のうち、該塩基がＡである領域を、増幅可能である。プライマーセットＤが増幅するＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の領域の例として、配列番号１５で示す２１４ｂｐの塩基配列が挙げられる。
　また、本実施形態におけるプライマーセットＤは、chr1:25696958に相当する塩基を含むＲＨＣＥ遺伝子のエクソン９上の領域も、増幅可能である。プライマーセットＤが増幅するＲＨＣＥ遺伝子のエクソン９上の領域の例として、配列番号２０で示す２１４ｂｐの塩基配列が挙げられる。
　・ＰＣＲプライマーセットＤの塩基配列
　プライマーセットＤは、配列番号１６及び１７で示す塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む塩基配列を有するプライマー（以下それぞれ、第七のＰＣＲプライマー及び第八のＰＣＲプライマー）の組合せであることが好ましい。第七のＰＣＲプライマー及び第八のＰＣＲプライマーの塩基配列は、それぞれ独立に、配列番号１６及び１７で示す塩基配列において連続する１７以上の塩基を含むことが好ましく、１９以上の塩基を含むことがより好ましい。
　なお、配列番号１６で示す塩基配列は、表Ｓ１中のPrimer name RHD/RHCE_exon_9_KN_F3で示す塩基配列に相当する。また、配列番号１７で示す塩基配列は、表Ｓ１中のPrimer name RHD/RHCE_exon_9_KN_R3で示す塩基配列に相当する。
　第七のＰＣＲプライマー及び第八のＰＣＲプライマーは、それぞれ独立に、５０塩基以下のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
　（キットに含まれうるその他の構成物）
　胎児ＲｈＤ血液型検出用のキットはさらに、必要に応じて、１）ＰＣＲに用いる各種試薬及び器具（ポリメラーゼ、ＰＣＲバッファー、各ｄＮＴＰ、ピペット等）、２）ＰＣＲに供するＤＮＡを含有する試料を調製するための各種試薬及び器具（試験管、バッファー等）、３）ＰＣＲ増幅断片を解析するための各種試薬及び器具（電気泳動ゲル材料、ピペット等）、４）検出キットの使用説明書、等の少なくとも１つを備えていてもよい。
　本発明に係る胎児ＲｈＤ血液型検出用のキットは、胎児、乳幼児、及び成人に用いることができる。母体に用いる場合には、母体と胎児との胎児ＲｈＤ血液型を検出することができる。また、本発明に係る胎児ＲｈＤ血液型検出用のキットは、東アジア人種を含む、様々な遺伝子型を有する集団をも対象とすることができる。本発明に係るヒトＲＨＤ型検出用のキットは、母体の遺伝子型に拘わらず、血清学的ＲｈＤ陰性の母体の母体血から、胎児ＲｈＤ血液型を検出することができる。
　例えば、本発明に係る胎児ＲｈＤ血液型検出用のキットは、白人人種に加えて、従来では定性的な判定ができない場合があった東アジア人種をも網羅的に対象とすることができる。東アジア人種としては、例えば、日本人、韓国人、中国人、及び台湾人などが挙げられる。
　さらに、本発明に係る胎児ＲｈＤ血液型検出用のキットは、胎児ＲｈＤ血液型だけでなく、母体及び胎児のヒトＲＨＤ型までも検出することができる場合がある。
　２．胎児ＲｈＤ血液型の検出及び治療
　本発明の一実施形態に係る胎児ＲｈＤ血液型の検出方法は、血清学的ＲｈＤ陰性の母体から取得された母体血中に含まれる遺伝子断片を増幅する増幅工程を含む。
　より詳細には、本実施形態に係る胎児ＲｈＤ血液型の検出方法は、以下の工程：
　（ａ）母体及び胎児のＤＮＡを含有するサンプルを母体血から調製する調製工程、
　（ｂ）上記サンプルに対して、キットが含むＰＣＲプライマーセットを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行う増幅工程、及び
　（ｃ）上記増幅工程で得られる各増幅断片中の特定の塩基を決定することによって、胎児ＲｈＤ血液型を検出するＲｈＤ血液型検出工程を含むことが好ましい。
　これによって、母体の遺伝子型に拘わらず、血清学的ＲｈＤ陰性の母体の母体血から、胎児ＲｈＤ血液型を検出することができる。以下、各工程を説明する。
　本実施形態に係る胎児ＲｈＤ血液型の検出方法は、さらに、以下の工程；
　（ｄ）増幅断片の比率を調べることによって、母体と胎児とのヒトＲＨＤ型を検出するＲＨＤ型検出工程を含むことが好ましい。これによって、胎児ＲｈＤ血液型だけでなく、母体及び胎児のヒトＲＨＤ型をも検出することができる。以下、各工程を説明する。
　（ａ）調製工程
　調製工程は、検査対象となる母体からＤＮＡを含有する試料を調製する工程である。具体的には、母体の血液からゲノムＤＮＡ及びcell-free DNAを抽出する。
　なお、ゲノムＤＮＡ及びcell-free DNAの抽出は、常法に従って行えばよい。
　（ｂ）増幅工程
　増幅工程は、上記試料に対して、本発明に係るキットが備えるＰＣＲプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行う工程である。本発明に係るＰＣＲプライマーセットは、胎児ＲｈＤ血液型の検出に用いる遺伝子領域を増幅することができる。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ増幅装置を用い、常法に従って行うことができる。
　これにより、胎児ＲｈＤ血液型の検出に用いる遺伝子領域のうち、サンプル中に存在する遺伝子領域から増幅された増幅断片が得られる。
　特に限定されないが、ＰＣＲ反応の条件例を以下に示す。なお、条件１）～６）は互いに組み合わせる事で相乗効果を奏する。
１）　ＰＣＲ反応液中の各プライマーセットの濃度の好ましい一例は０．５μＭである。２）　ＰＣＲ反応液に含まれるゲノムＤＮＡの最終濃度は、０．０５ｎｇ／ｕＬ以上０．５ｎｇ／ｕＬ以下の範囲内が好ましい。
３）　ＰＣＲサイクル数は、３０回～３５回程度が好ましく、３０回程度がさらに好ましい。
４）　各プライマーのＧＣ含量は、例えば、５０％～７０％の範囲とするのが好ましく、５０％～６５％の範囲とすることがより好ましい。
５）　各プライマーのＴｍ値は、５０℃～６５℃とすることが好ましく、５０℃～６０℃とすることがより好ましい。
６）　アニーリング温度は、６０℃～６４℃が好ましく、６０℃程度がさらに好ましい。
　（ｃ）ＲｈＤ血液型検出工程
　ＲｈＤ血液型検出工程は、各プライマーセットを用いた増幅工程で得られるＰＣＲ増幅断片（アンプリコン）中の特定の塩基を決定することによって胎児ＲｈＤ血液型を検出する工程である。
　検出工程においては、次世代シーケンサーを用いることが好ましい。次世代シーケンサーを用いることで、母体血に含まれる微量な胎児由来ＤＮＡ増幅断片を検出でき、また、配列同一性の高い複数の増幅断片中の塩基を決定することができる。さらに、次世代シーケンサーを用いる場合、胎児ＲｈＤ血液型だけでなく、ヒトＲＨＤ型を検出するための増幅断片の比率も容易に調べることが可能である。
　次世代シーケンサーの種類は特に限定されないが、例えば、HiSeq2000（Illumina社）、Genome Analyzer IIx（Illumina社）、及び、Genome Sequencer-FLX（Roche社）等が挙げられる。
　ある実施形態では、次世代シーケンサーによる配列決定は、例えば、フローセル上、又はマイクロアレイ上に、核酸を固定化する工程を含んでいる。配列決定のプロセスにおいて、ブリッジ増幅（特にブリッジＰＣＲ）が、核酸がその上に固定化されたフローセル内、又は、核酸がその中に固定されたマイクロアレイ内で発生しうる。
　ある実施形態では、次世代シーケンサーによる配列決定は、「sequencing by synthesis (ＳＢＳ)」技術を用いて達成される。ここで、ＳＢＳ技術とは、対象となる核酸の相補鎖を合成することによって当該核酸の配列決定を行う技術を指す。
　ある実施形態では、配列決定を行うための次世代シーケンシング技術として、「ディープシーケンシング」を採用してもよい。「ディープシーケンシング」は、並行して複数の核酸を配列決定する方法を指す（参考文献：Bentleyら、Nature 2008、456：53-59）。典型的な、「ディープシーケンシング」を用いた配列決定プロトコルでは、核酸（例えば、ＤＮＡ断片）は、反応プラットホーム（例えば、フローセル及びマイクロアレイ等）の表面に取り付けられる。取り付けられた核酸は、in situで増幅され、検出可能な標識（例えば、蛍光可逆的ターミネーターデオキシリボヌクレオチド）を用いた合成的シーケンシング（例えばＳＢＳ）のためのテンプレートとして使用することができる。代表的な可逆的ターミネーターデオキシリボヌクレオチドには、アデニン、シトシン、グアニン及びチミンそれぞれの３’－Ｏ－アジドメチル－２’－デオキシヌクレオシド三リン酸が含まれ得、これらはそれぞれ、リンカーを介して、互いに認識可能でかつ取り外し可能なフルオロフォアでさらに標識されていてもよい。配列決定は、シングルリード法で行うこともでき、ペアエンド法で行うこともできる。
　図１のＡに示すように、アレルRHD*01(RhD-positive type：野生型)と、RHD*01N.01(deletion type：全欠失変異)と、RHD*01EL.01(point mutation type：点変異)と、RHD*01N. 04(RHD-RHCE hybrid type：組換え変異)とは、増幅断片中の特定の位置の塩基が異なる。そのため、増幅断片中の特定の塩基を決定することで、胎児がRHD*01のアレルを有しているかどうか、すなわち胎児ＲｈＤ血液型を決定することができる。ＲｈＤ血液型検出工程では、以下の塩基の少なくとも一方を決定することが好ましい；
　ｉ）chr1:25648453に相当する塩基
　ｉｉ）chr1:25696958に相当する塩基
　なお、chr1:25648453は、ＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の領域に、chr1:25696958は、ＲＨＣＥ遺伝子のエクソン９上の領域にそれぞれ存在する。chr1:25648453の塩基はＧ又はＡであり、chr1:25696958の塩基はＧである。決定する塩基は、相補塩基であってもよい。
　上記のｉ）又はｉｉ）としてＧが検出された場合は、胎児がRHD*01のアレルを有している可能性がある。ただし、胎児がRHD*01のアレルを有していない場合でも、Ｇが検出されることがある。ＲＨＤ遺伝子のエクソン９とＲＨＣＥ遺伝子のエクソン９とは、配列同一性が高いため、chr1:25648453に相当する塩基として、chr1:25696958のＧが該当することがあるためである。したがって、さらに、以下の塩基の少なくとも一方を決定することが好ましい；
　ｉｉｉ）chr1:25648419に相当する塩基
　ｉｖ）chr1:25648515に相当する塩基
　なお、chr1:25648419及びchr1:25648515は、いずれも、ＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の領域に存在し、塩基はＡである。
　ｉｉｉ）又はｉｖ）としてＡが検出された場合、胎児はRHD*01のアレルを有しており、ＲｈＤ陽性であると云える。
　このように、本発明の一実施形態によれば、非欠失アレルによるＲｈＤ陰性の妊婦に対しても、胎児ＲｈＤ血液型出生前診断を行うことが可能となる。また、本発明の一実施形態によれば、日本人をはじめとした東アジア人種に対しても、幅広く使用が可能と考えられる（表Ｓ５を参照）。そのため、感染症及び不要な検査などによる妊婦のリスクを低減し、さらに、医療費を削減することが可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　（ｄ）ヒトＲＨＤ型検出工程
　ヒトＲＨＤ型検出工程は、増幅断片の比率を調べる工程である。幅断片の比率は、例えば、次世代シーケンサー指定のソフトウェア等を用いて増幅時のリード数を比較することで求めることができる。
　例えば、ＲｈＤ血液型検出工程におけるｉ）及びｉｉ）の少なくとも一方とｉｉｉ）及びｉｖ）の少なくとも一方とを決定した上で増幅断片の比率を調べた場合、図１のＢと実施例に記載の表２（Table 2）及び表Ｓ２（Table S2）のAmplicons from RHD/RHCE exon 9のExpected ratioに示した理論値とに基づいて、母体と胎児とのヒトＲＨＤ型を検出することができる。
　母体と胎児とのヒトＲＨＤ型の組み合わせが、実施例において示した表３（Table 3）に示した４、６、１０及び１２である場合は、母体と胎児とのヒトＲＨＤ型を判別できないことがある。したがって、さらに、chr1:25592628に相当する塩基を決定することが好ましい。chr1:25592628は、upstream Rh boxの領域に存在し、塩基はＧである。RHD*01N. 01のアレルでは、chr1:25592628に相当する塩基は検出されない。
　また、母体のＲＨＤ遺伝子型と胎児のＲＨＤ遺伝子型との検出精度を高める観点から、以下の塩基の少なくとも一つをさらに決定することが好ましい；
　ｖ）chr1:25696896に相当する塩基
　ｖｉ）chr1:25697015に相当する塩基
　ｖｉｉ）chr1:25662955に相当する塩基
なお、chr1:25696896及びchr1:25697015はＲＨＣＥ遺伝子のエクソン９上の領域に存在する。chr1:25696896の塩基はＧであり、chr1:25697015の塩基はＴである。chr1:25662955は、Downstream Rh boxの領域に存在し、塩基はＡである。
　母体と胎児との遺伝子型の各組み合わせにおける、該当する塩基を含んでいる増幅された遺伝子断片の比率の理論値は、実施例に表３にExpected ratioとして示した通りである。なお、胎児が血清学的ＲｈＤ陽性である場合に実際に想定され得る遺伝子型（RHD*01/RHD*01N.01、RHD*01/RHD*01.04及びRHD*01/RHD*01EL.01）については示していないが、表３、図４及び図５等を参照することによって、理論値を求めることができる。母体のＲＨＤ遺伝子型と胎児のＲＨＤ遺伝子型とは、上述の理論値に基づいて検出することができる。
　ＲｈＤ陰性の妊婦が、ＲｈＤ陽性胎児を妊娠していることが検出された場合、妊婦へ抗Ｄヒト免疫グロブリンを投与することによって、新生児溶血性疾患を予防することができる。抗Ｄヒト免疫グロブリンの投与対象とするＲｈＤ陰性の妊婦は、ＲｈＤ陽性胎児の出産経験があるＲｈＤ陰性の妊婦に限定されることが好ましい場合がある。ＲｈＤ陰性の妊婦に対する抗Ｄヒト免疫グロブリンの投与は、妊娠２８週及び分娩後に行うことが好ましい場合がある。
　３．まとめ
　上述の通り、本発明は、例えば、以下のような態様を包含している。
　（Ａ）　以下の１）及び２）から選択される少なくとも一つのＰＣＲプライマーセットを含む、胎児ＲｈＤ血液型検出用のキット；
　１）chr1:25648453に相当する塩基を含むＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の領域を、増幅可能なＰＣＲプライマーセット
　２）chr1:25696958に相当する塩基を含むＲＨＣＥ遺伝子のエクソン９上の領域を、増幅可能なＰＣＲプライマーセット。
　（Ｂ）　母体血中に含まれる胎児の遺伝子を増幅するための、（Ａ）に記載のキット。
　（Ｃ）　ＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の上記領域は、chr1:25648453に相当する塩基に加えて、chr1:25648419に相当する塩基及びchr1:25648515に相当する塩基のうち少なくとも一方の塩基を含む、（Ａ）又は（Ｂ）に記載のキット。
　（Ｄ）　ＲＨＣＥ遺伝子のエクソン９上の上記領域は、chr1:25696958に相当する塩基に加えて、chr1:25697015に相当する塩基及びchr1:25696896に相当する塩基のうち少なくとも一方の塩基を含む、（Ａ）～（Ｃ）のいずれかに記載のキット。
　（Ｅ）　上記１）及び２）のＰＣＲプライマーセットが、それぞれ独立に、配列番号１で示す塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第一のＰＣＲプライマー、又は、配列番号２で示す塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第二のＰＣＲプライマーと、配列番号３で示す塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第三のＰＣＲプライマー、又は、配列番号４で示す塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第四のＰＣＲプライマーとからなるＰＣＲプライマーセットであり、第一のＰＣＲプライマー、第二のＰＣＲプライマー、第三のＰＣＲプライマー、及び第四のＰＣＲプライマーは、いずれも５０塩基以下のオリゴヌクレオチドである、（Ａ）～（Ｄ）のいずれかに記載のキット。
　（Ｆ）　上記１）及び２）のＰＣＲプライマーセットが、それぞれ独立に、上記第一のＰＣＲプライマーと第四のＰＣＲプライマーとからなるＰＣＲプライマーセット、又は、上記第二のＰＣＲプライマーと第三のＰＣＲプライマーとからなるＰＣＲプライマーセットである、（Ｅ）に記載のキット。
　（Ｇ）　上記１）及び２）のＰＣＲプライマーセットが、同一のＰＣＲプライマーセットである、（Ａ）～（Ｆ）のいずれかに記載のキット。
　（Ｈ）　以下の３）のＰＣＲプライマーセットをさらに含む、（Ａ）～（Ｇ）のいずれかに記載のキット；
　３）ＲＨＤ遺伝子の欠失の有無を判定するためのＰＣＲプライマーセット。
　（Ｉ）　上記３）のＰＣＲプライマーセットが、ＲＨＤ遺伝子の上流側に位置する、chr1:25592628に相当する塩基を含む上流側Rhesus box遺伝子上の領域を、増幅可能なＰＣＲプライマーセットである、（Ｈ）に記載のキット。
　（Ｊ）　上記３）のＰＣＲプライマーセットが、ＲＨＤ遺伝子の下流側に位置する、chr1:25662955に相当する塩基を含む下流側Rhesus box遺伝子上の領域も、増幅可能なＰＣＲプライマーセットである、（Ｉ）に記載のキット。
　（Ｋ）　上記３）のＰＣＲプライマーセットが、５０塩基以下のオリゴヌクレオチドであって、配列番号５で示す塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第一のＰＣＲプライマー、及び、５０塩基以下のオリゴヌクレオチドであって、配列番号６で示す塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第二のＰＣＲプライマーからなるＰＣＲプライマーセットである、（Ｈ）～（Ｊ）のいずれかに記載のキット。
　（Ｌ）　（Ａ）～（Ｋ）のいずれかに記載のキットを用いて、母体から取得された母体血中に含まれる遺伝子断片を増幅する増幅工程を含む、胎児ＲｈＤ血液型の検出方法。
　（Ｍ）　増幅された遺伝子断片において、以下の１）及び２）の少なくとも一方を行う、（Ｌ）に記載の検出方法；
　１）chr1:25648453に相当する塩基を決定する
　２）chr1:25696958に相当する塩基を決定する。
　（Ｎ）　さらに、以下の３）及び４）の少なくとも一方を行う、（Ｍ）に記載の検出方法；
　３）chr1:25648419に相当する塩基及びchr1:25648515に相当する塩基の少なくとも一方の塩基を決定する
　４）chr1:25696896に相当する塩基及びchr1:25697015に相当する塩基の少なくとも一方の塩基を決定する。
　（Ｏ）　さらに、増幅された遺伝子断片それぞれの比率を求める、（Ｍ）又は（Ｎ）に記載の検出方法。
　（Ｐ）　さらに、以下の５）を行う、（Ｍ）～（Ｏ）のいずれかに記載の検出方法；
　５）chr1:25592628に相当する塩基を決定する。
　（Ｑ）　さらに、以下の６）及び７）を行う、（Ｐ）に記載の検出方法；
　６）chr1:25662955に相当する塩基を決定する
　７）上記５）及び６）において、該当する上記塩基を含んでいる増幅された遺伝子断片それぞれの比率を求める。
　以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
　１．はじめに
　本実験は、被験者の募集、サンプルの採取及び準備、及び遺伝子データ解析を含め、国立成育医療研究センターの倫理審査委員会（承認番号：1545,699）及び昭和大学の倫理委員会（承認番号：233）によって承認されている。
　２．準備
　（血液サンプルの採取とＤＮＡ抽出）
　遺伝子型を調べるために用いる全血サンプルは、「献血血液の研究開発等での使用に関する指針」に従い、日本赤十字社（Japanese Red Cross Society, JRCS）によって提供された。全血サンプルは、日本に在住している人からの献血の余剰分より提供され、血液型が血清学的ＲｈＤ陰性である１００のサンプルと、血清学的ＲｈＤ陽性である１０のサンプルが用意された。
　臍帯血及びcell-free DNA試料のための血液ドナーは、２０１４年４月から２０１８年３月までの間に国立成育医療研究センター（東京都）に通う、血清学的ＲｈＤ陰性の妊娠女性を対象に募集した。妊娠女性の被験者（以下、「妊婦被験者」）は、採血の前に、臨床遺伝学者による遺伝子カウンセリングを受けた。また、すべての妊婦被験者は、書面によるインフォームドコンセントを提出した。
　血液サンプル採取では、全血５ｍＬをＥＤＴＡ－２Ｋチューブ（テルモ製）に回収し、４℃、１４００ｇにて１０分間遠心分離した。分離した血漿、軟膜及び赤血球の画分は、すぐに－２０℃で凍結し、ＤＮＡ抽出時までそのまま保存した。また、新生児の臍帯血５ｍｌはＤＴＡ－２Ｋチューブに回収した。新生児の臍帯血は、妊婦被験者の出産直後に回収した。
　JRCSの血液サンプル、妊婦被験者の母体血中の軟膜サンプル、及び臍帯血サンプルからゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出した。血液サンプルからのゲノムＤＮＡの抽出には、QIAsymphony（QIAGEN社）を用いた。cell-free DNAの抽出は、血漿８００μＬからMag MAX Cell-Free DNA Isolation Kit（QIAGEN社）を用いて行った。
　（プライマーの準備）
　ＲＨＤの塩基配列とＲＨＣＥの塩基配列とは、９６％の配列同一性を有している。また、ＲＨＤの上流に位置するupstream Rh boxの塩基配列と、ＲＨＤの下流に位置するdownstream Rh boxの塩基配列とは、９８．６％の配列同一性を有している。配列類似性の高い複数の配列をＰＣＲによって増幅する場合、特定の領域の増幅が妨げられることがしばしばある。
　しかし、本発明者らは、２つのホモログに完全に一致し、かつ、両方の領域を同時に増幅することができるプライマーセットを設計した。図２及び図３を用いて後述するが、このプライマーの機能は、ＲＨＤ／ＲＨＣＥ遺伝子座から増幅されたアンプリコンの配列を、次世代シーケンサーによって決定した結果から検証されている。
　新規に設計したプライマーセットのターゲット領域及び配列を、プライマーセット１、３、４及び６（＃１、＃３、＃４及び＃６）として表Ｓ１（Table S1）に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　また、ＰＣＲプライマーセット７～１１として、Ogasawara K, Suzuki Y, Sasaki K, Osabe T, Isa K, Tsuneyama H, et al. Molecular basis for D- Japanese: identification of novel DEL and D- alleles. Vox Sang. 2015;109(4):359-65.に記載の既存のプライマーを用意した。
　さらに、chr1:25648453に相当する塩基を含むＲＨＤ遺伝子のエクソン９の領域に点変異が生じているＤＮＡ断片を増幅することを目的として、ＰＣＲプライマーセットを設計した。このプライマーセットのターゲット領域及び配列を、プライマーセット５（＃５）として表Ｓ１に示した。
　（血清学的ＲｈＤ陰性サンプルの遺伝子型の特定）
　これまでの包括的な研究に基づけば、日本人に多いＲｈＤ陰性の遺伝子型は、以下の３つである；
　　RHD*01N.01/RHD*01N.01
　　RHD*01.04/RHD*01N.01
　　RHD*01EL.01/RHD*01N.01。
　血清学的ＲｈＤ陰性である１００サンプルに対し、ＰＣＲ法を用いて以下の４つの遺伝子領域を含む領域を増幅することで、遺伝子型が上記３つのうちのいずれであるかを特定した；
　　upstream Rh box
　　downstream Rh box
　　ＲＨＤ
　　ＲＨＣＥ。
　・ＰＣＲ反応
　ＰＣＲ反応は、ＤＮＡポリメラーゼとしてEx Taq Hot Start Version（TaKaRa社）を用いて行った。テンプレートは、先に抽出したゲノムＤＮＡ５０ｎｇを合成スケール２０μＬとして使用した。ＰＣＲプライマーセットは、表Ｓ１に示したＰＣＲプライマーセット５及び７～１１を用いた。サンプルは５ｎｇ以上とし、プライマー濃度は１０μＭとした。
　反応条件は次の通りである。すなわち、初めに、初期変性反応を９８℃で２０秒間行い、続いて、９８℃で１０秒間の変性反応、６０℃又は６４℃で３０秒間のアニーリング反応、及び７２℃で３０秒間の伸長反応を順に３５サイクル繰り返し、最後に伸長反応を７２℃で２分間行った。機器は、ProFlex（アプライドバイオシステムズ社）を使用した。
　・遺伝子型の決定
　既存のプライマーを用いて、血清学的ＲｈＤ陰性である１００サンプルの遺伝子型をそれぞれ特定した。
　遺伝子型の特定手順を以下に示す。また、この手順を図６にまとめた。
　ｉ）Hybrid Rh boxの確認
　各サンプルから抽出したゲノムＤＡＮについて、Hybrid Rh boxの存在の有無を確認した。ＰＣＲプライマーセットは、表Ｓ１に示したプライマーセット１１を用い、Hybrid Rh boxを含む領域を増幅した。１００サンプル全てでHybrid Rh boxを含む領域が増幅された。
　ｉｉ）ＲＨＤ／ＲＨＣＥ遺伝子のエクソン８及びＲＨＤ遺伝子のエクソン１０の確認
　Hybrid Rh boxが存在するサンプルを対象に、ＲＨＤ／ＲＨＣＥ遺伝子のエクソン８とＲＨＤ遺伝子のエクソン１０とが両方存在するかどうかを確認した。ＰＣＲプライマーセットは、表Ｓ１に示したプライマーセット８及び１０を用い、それぞれ、ＲＨＤ／ＲＨＣＥ遺伝子のエクソン８を含む領域とＲＨＤ遺伝子のエクソン１０を含む領域とを増幅した。ＲＨＣＥ遺伝子のエクソン８のみが増幅されたサンプルの遺伝子型をRHD*01N.01/RHD*01N.01であると特定した。８７サンプルの遺伝子型がRHD*01N.01/RHD*01N.01であると特定された。
　なお、「ＲＨＤ／ＲＨＣＥ遺伝子」とは、ＲＨＤ遺伝子及びＲＨＣＥ遺伝子を指す。
　ｉｉｉ）ＲＨＤ遺伝子のエクソン７及び９の確認
　ＲＨＤ／ＲＨＣＥ遺伝子のエクソン８とＲＨＤ遺伝子のエクソン１０とが両方存在するサンプル（１３サンプル）を対象に、ＲＨＤ遺伝子のエクソン７と９とが両方存在するかどうかを確認した。ＰＣＲプライマーセットは、表Ｓ１に示したプライマーセット７及び９を用い、それぞれ、ＲＨＤ遺伝子のエクソン７を含む領域とＲＨＤ遺伝子のエクソン９を含む領域とを増幅した。ＲＨＤ遺伝子のエクソン９のみが増幅されたサンプルの遺伝子型を、RHD*01.04/RHD*01N.01であると特定した。１００サンプルのうち４サンプルの遺伝子型がRHD*01.04/RHD*01N.01であると特定された。
　ｉｖ）ＲＨＤ遺伝子のエクソン９における点変異の確認
　ＲＨＤ遺伝子のエクソン７と９とが両方存在するサンプル（９サンプル）を対象に、第１染色体の25648419位（ＲＨＤ遺伝子のエクソン９における1227番目）に対応する塩基がＡであるかどうかを確認した。ＰＣＲプライマーセットは、表Ｓ１に示したプライマーセット５を用い、第１染色体の25648419位に対応する塩基を含む領域を増幅した。増幅されたサンプルに対し、次世代シーケンサーを用いて点変異が起きていることを確認することによって、サンプルの遺伝子型を、RHD*01EL.01/RHD*01N.01であると特定した。９サンプルの遺伝子型がRHD*01EL.01/RHD*01N.01であると特定された。なお、次世代シーケンサーは、「４．遺伝子領域のマッピング及びリード数の確認」において用いた機器と同じ機器を用いた。
　各遺伝子型の割合は、過去の研究結果（Ogasawara K, Suzuki Y, Sasaki K, Osabe T, Isa K, Tsuneyama H, et al. Molecular basis for D- Japanese: identification of novel DEL and D- alleles. Vox Sang. 2015;109(4):359-65.）と概ね同じであった。
　３．新規プライマーの増幅領域の検証
　新規のプライマーセット１、３、４及び６が、各ターゲット領域（upstream Rh box及びdownstream Rh box、又はＲＨＤ及びＲＨＣＥ）をそれぞれ増幅できているか検証した。各プライマーが増幅した断片に対し、サンガー法を用いて配列決定を行った。サンプルとして、遺伝子型が異なる血清学的ＲｈＤ陰性サンプル３種類（合計でｎ＝１００）に加え、血清学的ＲｈＤ陽性サンプル（遺伝子型：RHD*01N/RHD*01、ｎ＝１０）も使用した。
　ＤＮＡポリメラーゼとしてEx Taq Hot Start Version（TaKaRa社）を用いた。プライマーセットは、表Ｓ１に示したプライマーセット１、３、４及び６を用いた。サンプルは５ｎｇ以上とし、プライマー濃度は１０μＭとした。
　サンプルの増幅は、次の条件で行った。すなわち、初期変性反応を９８℃で２０秒間行い、続いて、増幅反応として、９８℃で１０秒間、６２℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間の反応を順に３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で２分間行った。
　配列決定キットとして、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ABI社）を用い、精製キットとしてBigDye XTerminator Purification Kit（ABI社）を用いた。機器は、3130xl Genetic Analyzer（ABI社）を使用した。
　新規に設計したプライマーセット１、３、４及び６は、いずれも、互いに高い配列類似性を有している２つの遺伝子領域を同時に増幅していた。
　プライマーセット６を用いた場合の結果を図２に、プライマーセット１を用いた場合の結果を図３に示す。図２は、遺伝子型ごとの、upstream Rh boxを含む領域及びdownstream Rh boxを含む領域において決定された配列の一部を示す。また、図３は、遺伝子型ごとの、ＲＨＤを含む領域及びＲＨＣＥを含む領域において決定された配列の一部を示す。
　４．遺伝子領域のマッピング及びリード数の確認
　各遺伝子型について遺伝子領域のマッピングを行い、各領域のリード数を調べた。さらに、各遺伝子領域のリード数を比較して遺伝子型頻度を求めた。
　（次世代シーケンサーを用いた配列決定）
　血清学的ＲｈＤ陽性サンプル（ｎ＝１０）及び血清学的ＲｈＤ陰性サンプル３種類（合計でｎ＝１００）をそれぞれ増幅した。ポリメラーゼとしてPhusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer（NEB社）を用いた。プライマーセットは、表Ｓ１に示したプライマーセット１及び３～６を別々に用いた。サンプルは１ｎｇとし、プライマー濃度は１０μＭとした。
　サンプルの増幅は、次の条件で行った。すなわち、初期変性反応を９８℃で３０秒間行い、続いて、増幅反応として、９８℃で１０秒間、６２℃で３秒間、及び７２℃で５秒間の反応を順に３０サイクル繰り返した。Agencourt AMPure XP（Beckman Coulter社）を用いて生成物を精製した。
　増幅した各サンプルから２種類を選び、それぞれ５００ｐｇずつプールした。ライブラリー作製試薬としてNEB Next Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB社）を用い、メーカープロトコルに従ってＰＣＲ増幅を６サイクル行い、ライブラリーを作製した。各ライブラリー中のゲノム配列は、MiSeq Reagent Kit v2 Nano（illumina社）を用い、MiSeqプラットフォーム（illumina社）で決定した。配列決定は、ペアエンドモード（各１５１ｂｐ）で行った。
　プライマーセット１及び３～６を用いたときの各ライブラリー中のゲノム配列について、以下を決定した；
　ａ）chr1:25648419、chr1:25648453、及びchr1:25648515に相当する塩基
　ｂ）chr1:25697015、chr1:25696958、及びchr1:25696896に相当する塩基。
　この塩基の組合せによって、各断片がＲＨＤ遺伝子由来であるか、ＲＨＣＥ遺伝子由来であるかを決定し、アンプリコンの型を区別した。なお、chr1:25648453がＡに変異しているアンプリコンは、ＲＨＤ遺伝子由来の変異体であると判断した。
　また、プライマーセット６を用いたときの各ライブラリー中のゲノム配列について、以下を決定した；
　ｃ）chr1:25592628に相当する塩基
　ｄ）chr1:25662955に相当する塩基。
　この塩基の組合せによって、各断片がupstream Rh box領域由来であるか、downstream Rh box領域由来であるかを決定した。
　（遺伝子マッピング）
　遺伝子マッピングのためのソフトウェアとしてThe MiSeq Reporter Software version 2.3.32（illumina社）を用いた。各ライブラリーのシーケンスリードをfastqファイル形式で作成し、アダプター配列を除いた。同ソフトウェアを用いて、シーケンスリードをヒトゲノムのリファレンスシーケンス（ｈｇ１９）にマッピングした。マッピング結果は、bamファイル形式で出力した。
　続いて、エラーが生じているリードを除去するため、ソフトウェアとしてsamtools version 1.6（https://sourceforge.net/projects/samtools/）を用いた。マッピング結果から、マッピングされたリードのうち、マッピングスコア（ＭＡＰＱ）が２０以下で、クオリティスコアが２５以下の塩基を含むリードを除去した。スコアの低いリードが除去されたマッピング結果は、Integrative Genomics Viewer（IGV, http://software.broadinstitute.org/software/igv/）を用いてイメージとして出力した。
　ライブラリーごとに、マッピング結果と対応する位置におけるアンプリコンの型とを組み合わせた図を図４及び図５に示す。
　（アンプリコンの数の比較）
　ライブラリーごと及びマップされた領域ごとにリード数を求め、各アンプリコンの数及び比率を調べた。ソフトウェアとしてIntegrative Genomics Viewer（IGV, http://software.broadinstitute.org/software/igv/）を用いた。
　具体的には、ＲＨＤ遺伝子とＲＨＣＥ遺伝子とのそれぞれに由来するアンプリコンの数及び比率を求めた。また、upstream Rh box領域とdownstream Rh box領域とにおいても、それぞれに由来するアンプリコンの数及び比率を求めた。なお、ＲＨＤ遺伝子由来のアンプリコンについては、野生型（表中のｗｔ）と変異型（表中のｍｕｔ）とで区別した。
　結果は、予想される比率（Expected ratio）と概ね同じであった。結果を表２（Table 2）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　（遺伝子型頻度の算出）
　日本人集団にメジャーな４種類のＲｈＤ陽性の遺伝子型（アレルRHD*01を含む）、及び日本人集団にメジャーな３種類のＲｈＤ陰性の遺伝子型（アレルRHD*01を含まない）における遺伝子型頻度を算出した。具体的には、日本人集団におけるＲｈＤ陰性の遺伝子型頻度が０．５％であると知られていること、及び、従来の研究（Ogasawara K, Suzuki Y, Sasaki K, Osabe T, Isa K, Tsuneyama H, et al. Molecular basis for D- Japanese: identification of novel DEL and D- alleles. Vox Sang. 2015;109(4):359-65.）に基づき、Hardy-Weinberg equilibriumに従って算出した。結果を表１（Table 1）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　５．cell-free DNAを用いた被験者妊婦及び胎児のＲＨＤ遺伝子型の決定
　（予備試験１）
　初めに、血清学的ＲｈＤ陰性である母体血に含まれるcell-free DNAを用いて胎児のヒトＲＨＤ型を決定することを想定した予備試験を行った。
　まず、妊娠母体血を模倣したサンプルとして、２種類の遺伝子型（Ａ及びＢとする）のゲノムＤＮＡを、Ａ：Ｂ＝１０：１のモル比（Ｂが９．１％）で混合した模擬試料を作製した。Ａは、血清学的ＲｈＤ陰性である妊婦のＤＮＡを想定し、遺伝子型は、RHD*01N.01/RHD*01N.01、RHD*01.04/RHD*01N.01及びRHD*01EL.01/RHD*01N.01から選択した。
　Ｂは、胎児のＤＮＡを想定し、血清学的ＲｈＤ陽性又は血清学的ＲｈＤ陰性の遺伝子型から選択した。具体的には、RHD*01/RHD*01、RHD*01N.01/RHD*01N.01、RHD*01.04/RHD*01N.01及びRHD*01EL.01/RHD*01N.01から選択した。なお、母親が血清学的ＲｈＤ陰性である場合、胎児の遺伝子型はRHD*01/RHD*01にはなり得ないが、試験時にRHD*01N/RHD*01N.01のＤＮＡが入手できなかったため、代わりとして用いた。
　１２種類の模擬試料を用意し、それぞれ増幅してライブラリーを作製した。ポリメラーゼとしてPhusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer（NEB社）を用いた。プライマーセットは、表Ｓ１に示したプライマーセット１及び３～６を別々に用いた。サンプルは１ｎｇとし、プライマー濃度は１０μＭとした。
　模擬試料の増幅は、次の条件で行った。すなわち、初期変性反応を９８℃で３０秒間行い、続いて、増幅反応として、９８℃で１０秒間、６２℃で３秒間、及び７２℃で５秒間の反応を順に３０サイクル繰り返した。Agencourt AMPure XP（Beckman Coulter社）を用いて生成物を精製した。
　MiSeq Reagent Kit v2 Nano（illumina社）を用い、MiSeqプラットフォーム（illumina社）で各模擬試料のゲノム配列を決定した。配列決定は、ペアエンドモード（各１５１ｂｐ）で行った。「４．遺伝子領域のマッピング及びリード数の確認」で示した各塩基をそれぞれ求めた。
　以下、「４．遺伝子領域のマッピング及びリード数の確認」に示した方法と同じ方法を用いてアンプリコンの数及び比率を求めた。それぞれの比率は、概ね予想（Expected ratio）通りであった。プライマーセット１及び６を用いた場合の結果を表３（Table 3）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　（予備試験２）
　同様の試験を、ゲノムＤＮＡの割合を変えて行った。血清学的ＲｈＤ陰性である妊婦の遺伝子型（Ａ）はRHD*01EL.01/RHD*01N.01とし、胎児の遺伝子型（Ｂ）は、RHD*01/RHD*01N.01とした。Ｂの混合比率（モル比）を２０％、１０％、５％、３％及び１％としてそれぞれ予備試験１と同様の操作を行った。全ての母体cell-free DNA試料からアレルRHD*01N.01であるアンプリコンが検出された。予想された値と実測値とにおける、アレルRHD*01N.01であるアンプリコンの割合は、３％から１２％の範囲の高い相関関係を有していた。予備試験１と同様に、各遺伝子領域に由来するアンプリコンの数及び比率を求めた。それぞれの比率は、概ね予想（Expected ratio）通りであった。プライマーセット１及び６を用いた場合の結果を表Ｓ２（Table S2）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　（妊婦被験者と胎児のヒトＲＨＤ型決定）
　血清学的ＲｈＤ陰性である８人の妊婦被験者（妊娠９週から３０週）のcell-free DNAサンプルを用いて、妊婦被験者及びその胎児のＲＨＤ遺伝子型を決定した。
　cell-free DNAサンプルの増幅は、予備試験１と同様に行った。
　妊婦被験者及びその胎児のＲＨＤ遺伝子型は、各アンプリコンの数及び比率と表Ｓ２のExpected ratioとに基づいて判断した。各遺伝子領域に由来するアンプリコンの数及び比率は、「予備試験１」に示した方法と同じ方法で求めた。プライマーセット１及び６を用いた場合の結果を表４（Table 4）及び表Ｓ３（Table S3）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　胎児の遺伝子型は、６人がＲｈＤ陽性で２人がＲｈＤ陰性であった。妊婦被験者のＲＨＤ陰性の遺伝子型がヘテロ（RHD*01.N04/RHD*01N.01又はRHD*01EL.01/RHD*01N.01）である場合、胎児のＲＨＤ遺伝子型は、２通りが考えられた（表Ｓ３中の被験者１、４及び７）。しかし、表４及び表Ｓ３から、cell-free DNA中のＲＨＤ遺伝子型野生型由来のアンプリコンの比率が１．３％から３．１％の範囲内であったことから、胎児の表現型はＲｈＤ陽性であると決定することができた。
　さらに、この結果を検証するために、妊婦被験者の白血球ＤＮＡと新生児の臍帯血とを用いて、それぞれのＲＨＤ遺伝子型を別々に決定した。遺伝子型決定は、「予備試験１」に示した方法と同じ方法を用い、サンプルを増幅してから各遺伝子領域に由来するアンプリコンの数及び比率に基づいて行った。プライマーセット１及び６を用いた場合の結果を表Ｓ３に示す。また、新生児の末梢血を採取し、Ｄ抗原に対するモノクローナル抗体を用いて血液が凝集するかどうかを調べることによって、血清学的ＲｈＤ型を確認した。
　妊婦被験者及びその胎児に対してＲＨＤ遺伝子型と血清学的ＲｈＤ型とを別々に検査した結果は、cell-free DNA中の各アンプリコンを調べることによって決定した遺伝子型及び表現型に一致していた。
　（プライマーセットとcell-free DNAの検出率）
　プライマーセット１及び３～５を用いて、cell-free DNAの検出率を比較した。サンプルとして、母体の遺伝子型がRHD*01N.01/RHD*01N.01、かつ胎児がＲｈＤ陽性である妊婦被験者のcell-free DNAを用いた（ｎ＝２）。プライマーごとに予備試験１と同様の条件でcell-free DNAサンプルの増幅を行い、各アンプリコンの数及び比率を調べた。
　結果を表Ｓ４（Table S4）に示す。表Ｓ４において、プライマーサイズ８１ｂｐのプライマーはプライマーセット３に対応し、プライマーサイズ１１４ｂｐのプライマーはプライマーセット４に対応する。また、プライマーサイズ１４８ｂｐのプライマーはプライマーセット１に対応し、プライマーサイズ２１４ｂｐのプライマーはプライマーセット５に対応する。より短い範囲を増幅するプライマーセット３を用いた場合が、cell-free DNAの検出率は最も高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009

Claims (13)

  1. 　以下の１）及び２）から選択される少なくとも一つのＰＣＲプライマーセットを含む、胎児ＲｈＤ血液型検出用のキット。
    　１）chr1:25648453に相当する塩基を含むＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の領域を、増幅可能なＰＣＲプライマーセット
    　２）chr1:25696958に相当する塩基を含むＲＨＣＥ遺伝子のエクソン９上の領域を、増幅可能なＰＣＲプライマーセット
  2. 　母体血中に含まれる胎児の遺伝子を増幅するための、請求項１に記載のキット。
  3. 　ＲＨＤ遺伝子のエクソン９上の上記領域は、chr1:25648453に相当する塩基に加えて、chr1:25648419に相当する塩基及びchr1:25648515に相当する塩基のうち少なくとも一方の塩基を含む、請求項１又は２に記載のキット。
  4. 　ＲＨＣＥ遺伝子のエクソン９上の上記領域は、chr1:25696958に相当する塩基に加えて、chr1:25697015に相当する塩基及びchr1:25696896に相当する塩基のうち少なくとも一方の塩基を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のキット。
  5. 　上記１）及び２）のＰＣＲプライマーセットが、それぞれ独立に、
    　配列番号１で示す塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第一のＰＣＲプライマー、又は、配列番号２で示す塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第二のＰＣＲプライマーと、
    　配列番号３で示す塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第三のＰＣＲプライマー、又は、配列番号４で示す塩基配列における連続する１５以上の塩基を含む第四のＰＣＲプライマーとからなるＰＣＲプライマーセットであり、
    　第一のＰＣＲプライマー、第二のＰＣＲプライマー、第三のＰＣＲプライマー、及び第四のＰＣＲプライマーは、いずれも５０塩基以下のオリゴヌクレオチドである、請求項１～４のいずれか１項に記載のキット。
  6. 　上記１）及び２）のＰＣＲプライマーセットが、同一のＰＣＲプライマーセットである、請求項１～５のいずれか１項に記載のキット。
  7. 　以下の３）のＰＣＲプライマーセットをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のキット。
    　３）ＲＨＤ遺伝子の欠失の有無を判定するためのＰＣＲプライマーセット
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載のキットを用いて、母体から取得された母体血中に含まれる遺伝子断片を増幅する増幅工程を含む、胎児ＲｈＤ血液型の検出方法。
  9. 　増幅された遺伝子断片において、以下の１）及び２）の少なくとも一方を行う、請求項８に記載の検出方法。
    　１）chr1:25648453に相当する塩基を決定する
    　２）chr1:25696958に相当する塩基を決定する
  10. 　さらに、以下の３）及び４）の少なくとも一方を行う、請求項９に記載の検出方法。
    　３）chr1:25648419に相当する塩基及びchr1:25648515に相当する塩基の少なくとも一方の塩基を決定する
    　４）chr1:25696896に相当する塩基及びchr1:25697015に相当する塩基の少なくとも一方の塩基を決定する
  11. 　さらに、増幅された遺伝子断片それぞれの比率を求める、請求項９又は１０に記載の検出方法。
  12. 　さらに、以下の５）を行う、請求項９～１１のいずれか１項に記載の検出方法。
    　５）chr1:25592628に相当する塩基を決定する
  13. 　さらに、以下の６）及び７）を行う、請求項１２に記載の検出方法。
    　６）chr1:25662955に相当する塩基を決定する
    　７）上記５）及び６）において、該当する上記塩基を含んでいる増幅された遺伝子断片それぞれの比率を求める
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