CN103642920A - 一种检测rage家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法及试剂盒 - Google Patents

一种检测rage家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测人糖基终末化产物受体（RAGE）家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法及试剂盒，所述方法具体为：根据被证实的RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点，设计特异性扩增引物和测序引物，其中，所述特异性扩增引物中的一条用生物素标记；以待测标本的DNA为模板，用特异性扩增引物进行PCR反应，得PCR扩增物；将所得PCR扩增物采用碱变性分开成单链，取其中生物素标记单链PCR扩增产物纯化后，与所述测序引物进行杂交反应，并分析结果；本发明所选取的RAGE靶序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测RAGE标签单核甘酸多态性基因型，能够满足临床检验实际工作的需要，利于RAGE基因检测预测疾病的发生、发展风险。

Description

一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及适用于双重PCR结合双重焦磷酸测序技术检测RAGE家族基因标签SNP位点的试剂盒及方法。
背景技术
糖基化终产物受体（RAGE）是一个细胞表面分子的免疫球蛋白超家族的有多重配体的成员。自1992年被成功分离以后，越来越多的研究表面RAGE在血管疾病的发病机制中起着重要作用。RAGE不仅在大血管病变的发生过程中起放大血管炎症，加速动脉粥样硬化的作用，还作为一个开关调控着参与血管病变的各种信号的传递过程。不同的生化因素及信号通路产生的信号分子最终都必须通过活化RAGE通路才能参与到糖尿病血管病变过程中去。近几年，RAGE在脓毒症发病机制中的作用也日益受到重视。动物实验发现，盲肠结扎穿孔所致的脓毒症模型中，RAGE-/-小鼠的存活率显著高于野生型小鼠。即使在致脓毒症模型24小时后注射RAGE的单克隆抗体，仍然可以显著降低小鼠的死亡率。Bopp C等也发现脓毒症患者血浆sRAGE水平显著升高，且与患者临床结局密切相关。这些研究结果提示，RAGE是脓毒症发病环节中的重要分子。
单核甘酸多态性（SNP）是指染色体上单个核苷酸变异引起的群体中DNA序列多态性，具有密度高、遗传稳定、易于自动化分析等特点，被认为是继限制性片段长度多态性、微卫星多态性之后的第三代遗传标记，可用于基因定位、多态性分析等方面，是研究疾病遗传易感性、疾病诊断、药物筛选等的常用指标。目前已发展了20余种SNP检测方法，如直接测序法、探针杂交法、飞行质谱分析法、限制性片段长度多态性分析法等，但因这些方法的费用、准确性和适用规模等方面的缺点，局限了基因多态性与疾病发生、发展和预后的遗传关联研究。而焦磷酸测序技术是新一代基于酶级联反应的DNA序列分析技术，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将DNA单链上的每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。该技术具有其独特的优势，无需电泳、DNA片段无需荧光标记；具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量、灵敏度高等特点，符合临床大样本检测要求。
发明内容
本发明的目的之一在于提供RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的检测方法，其能够简捷、直观、准确的对RAGE标签单核苷酸多态性基因型进行检测和判读结果。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法，具体包括以下步骤：1）特异性引物的设计，即根据被证实的RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点，设计特异性扩增引物和测序引物，其中，所述特异性扩增引物中的一条用生物素标记；2）PCR扩增，即以待测标本的DNA为模板，用步骤1）所述的特异性扩增引物进行PCR扩增，得PCR扩增物；3）焦磷酸测序，即将步骤2）所得PCR扩增物采用碱变性使其分开成单链，取其中被生物素标记的单链PCR扩增产物纯化后，与步骤1）所述测序引物进行杂交反应，并分析结果以判断所述待测标本的RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点靶单核甘酸是否具备多态性。本技术方案的创新点主要在首次采用采用焦磷酸测序法检测RAGE家族基因的单核甘酸多态性。
进一步，所述的一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法，步骤1）中，所述的RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点包括：rs1800625和rs2070600位点。上述位点是通过如下方法获得的：利用HapMap（http://www.hapmap.org）SNP数据库（HapMap Data Rel28Phase II+III,Aug10,on NCBI B36assembly,dbSNP b126）下载RAGE基因及其上下游3kb范围内中国北京汉族人群（CHB）SNP数据：1）检索框输入基因名查看各基因在HapMap定位，并上下游各延伸3kb；2）“Reports&Analysis”的选项中选择：DownloadSNP genotype data；3）“config”中选择中国北京汉族人群(Chinese Han Beijing，CHB)，获取中国北京汉族人群RAGE家族各基因及其延伸区域内所有SNP位点。在TAGster软件包目录下打开程序运行窗口。按照构建bin和挑选标签SNP标准（最小等位基因频率≥0.05且SNP间连锁关系r2≥0.8）设置参数，运行命令“fconvert”、“TAGster”，即可出现研究区域的bin图和对应bin的标签SNP。利用NCBI下载各基因启动子（基因上游3kb）区域SNP位点的序列。将野生型和突变型的序列分别提交到转录因子预测数据库TFSEARCH（http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html），得到可能与之结合的核转录因子，并比较SNP位点对转录因子结合的影响。综合SNP间连锁强度和生物信息学分析最终确定检测的RAGE基因的rs1800625和rs2070600位点2个标签SNP位点。
所述rs1800625位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，测序引物如SEQ ID NO：3所示；所述rs2070600位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，测序引物如SEQ ID NO：6所示。
详见下表：
Figure BDA0000432604920000031
上表中F表示上游引物，R表示下游引物，bio-表示5’端生物素修饰。
进一步，所述的一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法，所述步骤2）中，所述PCR扩增为双重PCR扩增，即所述rs1800625位点和所述rs2070600位点组合进行双重PCR扩增。
进一步，所述的一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法，所述步骤3）中，所述焦磷酸测序为双重焦磷酸测序，即对所述rs1800625位点和所述rs2070600位点双重PCR扩增后的扩增产物组合进行双重焦磷酸测序。
本发明的目的之二在于提供一种试剂盒，能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测RAGE标签单核苷酸多态性基因型，能够满足临床检验实际工作的需要，利于RAGE基因检测预测疾病的发生、发展风险。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
用于检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的试剂盒，所述试剂盒包括RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的特异性扩增引物，RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的焦磷酸测序引物，以及PCR反应液、PCR产物筛选液、焦磷酸测序反应液。
进一步，所述的用于检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的试剂盒，所述特异性扩增引物如SEQ ID NO:1-2所示，和/或如SEQ ID NO:4-5所示。
进一步，所述的用于检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的试剂盒，所述测序引物如SEQ ID NO:3所示，和/或如SEQ ID NO:6所示。
进一步，所述的用于检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的试剂盒，所述试剂盒还包括标记所述特异性扩增引物的生物素。
本发明的有益效果在于：（1）本发明建立双重PCR-双重焦磷酸测序技术检测RAGE基因的标签SNP位点的方法，PCR引物二重组合扩增目的片段，电泳结果显示二重组合下的两条目的DNA条带均等明亮、单一，说明本发明提供的二重组合PCR扩增引物效率高，两对引物扩增效率相当。（2）从对样本RAGE基因标签单核苷酸多态性基因多态性焦磷酸测序结果（附图1）可以看出，采用本发明的试剂盒及方法，能够简捷、直观、准确的对RAGE标签单核苷酸多态性基因型进行检测和判读。
综上，本发明建立的双重PCR-双重焦磷酸测序技术检测RAGE基因的标签SNP位点的方法，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测RAGE标签单核苷酸多态性基因型，能够满足临床检验实际工作的需要，利于RAGE基因检测预测疾病的发生、发展风险。
附图说明
图1为对运用双重PCR对rs1800625T/C和rs2070600G/A位点的检测样本进行基因型分析结果图。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1候选基因标签单核甘酸多态性位点的筛选
利用HapMap（http://www.hapmap.org）SNP数据库（HapMap Data Rel 28Phase II+III,Aug10,on NCBI B36assembly,dbSNP b126）下载RAGE基因及其上下游3kb范围内中国北京汉族人群（CHB）SNP数据：1）检索框输入基因名查看各基因在HapMap定位，并上下游各延伸3kb；2）“Reports&Analysis”的选项中选择：Download SNP genotype data；3）“config”中选择中国北京汉族人群(Chinese Han Beijing，CHB)，获取中国北京汉族人群SOCS家族各基因及其延伸区域内所有SNP位点。
在TAGster软件包目录下打开程序运行窗口。按照构建bin和挑选标签SNP标准（最小等位基因频率≥0.05且SNP间连锁关系r2≥0.8）设置参数，运行命令“fconvert”、“TAGster”，即可出现研究区域的bin图和对应bin的标签SNP。
利用NCBI下载各基因启动子（基因上游3kb）区域SNP位点的序列。将野生型和突变型的序列分别提交到转录因子预测数据库TFSEARCH(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)，得到可能与之结合的核转录因子，并比较SNP位点对转录因子结合的影响。
综合SNP间连锁强度和生物信息学分析最终确定检测的RAGE基因2个标签SNP位点如表1。
表1RAGE基因2个标签单核甘酸多态性位点信息
实施例2单核甘酸多态性位点PCR扩增引物及焦磷酸测序引物设计与合成
利用NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)GenBank下载各标签SNP位点及其附近约500bp基因组序列。利用焦磷酸测序仪附带软件“Assay Design”设计单核甘酸多态性位点PCR扩增引物及焦磷酸测序引物，选择评分最高的引物对。设计好的引物委托上海生物工程有限公司合成，并进行其中一条PCR引物5’端生物素修饰，设计的2个标签单核甘酸多态性位点扩增引物与测序引物详见表2。
表2RAGE基因2个标签单核甘酸多态性位点扩增引物与测序引物
Figure BDA0000432604920000062
注：bio-表示5’端生物素修饰。
实施例3全血基因组DNA制备
全血基因组DNA的制备按照如下步骤进行：
1实验前试剂材料准备与检查工作
（1）检查全血基因组DNA纯化试剂盒（以美国Promega公司生产试剂为例）、焦磷酸测序试剂保质期及确保Wash Buffer中已添加乙醇，并在瓶盖做好标记；
（2）准备异丙醇和配制75%乙醇；
（3）高压灭菌有效期内的1.5ml Eppendorf（EP）管和各种型号移液器和枪头。
2实验过程
（1）从-80冰箱取出EDTA抗凝管收集的创伤患者外周血，室温下解冻并上下颠倒数次混匀；分别移取300ul全血和900ul Cell Lysis Solution加入做好对应样本标记的1.5ml EP管，室温孵育10分钟，每隔2-3分钟颠倒混匀一次；10000g，4℃离心1分钟；取出EP管，观察白色沉淀，弃去红色上清；重复操作2-3次，直到沉淀中无红色团块；
（2）加入300ul Nuclei Lysis Solution，充分振荡混匀，用1ml或200ul移液器将沉淀完全打散，室温放置10分钟以充分裂解细胞；加入100ul ProteinPrecipitation Solution，剧烈振荡20秒可见颗粒状沉淀；12000g，4℃离心3分钟；观察上清，若不清澈，增加离心时间，若清澈用移液器缓慢吸出上清液到新的1.5ml EP管中，记录体积，加入等体积预冷异丙醇（-20℃预冷），轻轻上下颠倒数次至白色絮状DNA析出；12000g，4℃离心3分钟，可见管底白色沉淀，弃上清；加入500ul预冷75%乙醇（-20℃预冷），轻柔上下颠倒洗涤沉淀；12000g，4℃离心2分钟，弃上清；在清洁的实验台上放置新滤纸，倒扣EP管，吸干液体，风干DNA沉淀；目测沉淀大小，加入50-100ul DNA RehydrationSolution，65℃水浴放置15分钟，每隔5-6分钟取出涡旋振荡充分溶解DNA沉淀。完全溶解后用Nano-Space紫外分光光度计测定核酸浓度和纯度，核酸浓度大于20ng/ul视为合格，如浓度不足，可加入乙醇再次沉淀DNA并溶解。在管壁和管盖再次标清样本编号，保存DNA样本至-80℃冰箱备用。
实施例4双重PCR扩增反应
在试剂制备区配制50ul PCR反应体系（DNA模板除外），各组分及添加量如下表：
组分 体积 终浓度
2×PCR Mix 25ul 1×
SNP1上游引物 1ul 0.2uM
SNP1下游引物 1ul 0.2uM
SNP2上游引物 1ul 0.2uM
SNP2下游引物 1ul 0.2uM
水 20ul
在样本制备区对装有全血基因组DNA的EP管短暂离心后取出1ul（约30ng的全血基因组DNA）至反应体系中，并在PCR反应管上标记样品编号和各组合编号，PCR反应体系涡旋混匀后短暂离心。
在反应区进行PCR扩增反应，按照下述循环参数设置扩增仪：
步骤号 温度 处理时间 循环数
1 95℃ 3min
2 95℃ 15s
3 60℃ 30s
4 72℃ 20s Go to step2,for 45 cycle
5 72℃ 5min
6 4℃ Holding
设置程序后，选择反应体系50ul，点击“start”开始仪器运行。
实施例5双重焦磷酸测序反应
1焦磷酸测序单链（生物素标记单链PCR扩增产物）样品纯化
（1）纯化前试剂和仪器准备
样品纯化前，确保所有溶液达到室温，打开精密控温加热箱，调节温度达到80℃。
（2）单链样品分离纯化操作
在PSQ96板中预先加入40μl含有SNP1和SNP2各0.3μM测序引物的annealing buffer，一般情况下加入各10pM测序引物2ul；使用Vertex混匀Sepharose beads；将需要使用的Sepharoe beads总量（每样本2.5μl）转移到一个Eppendorf管中；在Sepharose bead中加入binding buffer，使得平均每个样品约有40μl的体积，将混合物混匀；将以上混合物加入PCR产物（50μl反应体积）中，每样本40μl；然后在常温下混匀10分钟，使得beads与生物素充分结合，对于较长片段，可适当延长混匀时间；在Vacuum prep workstation中，四个样品板中依次加入180ml高纯水、70％乙醇、washing buffer和120mlDenaturation buffer；打开vacuum prep workstation的泵，将vacuum prep tool在高纯水中清洗30秒；然后将vacuum prep tool移到PCR板中，抓取sepharosebeads（请在beads与PCR产物结合后三分钟内完成此操作，不要让Beads又沉到管底）；拿起PCR板，检查是否大部分beads都被吸附在了vacuum prep tool上；将vacuum prep tool放入70％乙醇中5秒；然后移到denatureation buffer中5秒；再移到washing buffer中清洗5-10秒；把吸头放在相应含有测序引物的板孔的上方，不要接触液面，关掉泵；将vacuum prep tool放入含有测序引物的PSQ96板中，摇动，释放sepharose beads（测序引物也可最后加入）；将放有样品的PSQ96板放在精密温控箱中80℃加热2分钟，取出冷却到室温，即可进行焦磷酸测序（Pyrosequencing）反应。
（3）分离纯化完毕后清洗
不开真空泵和阀门，使用高纯水清洗vacuum prep tool，使少量未脱落的Beads洗脱下来；更换高纯水后再打开真空泵和阀门，用约250ml高纯水清洗tool；关掉真空泵和阀门，将vacuum prep tool侧放，室温晾干；清洗所有盛装试剂溶液的塑料槽，自然晾干，关闭电源，遮盖仪器设备防止灰尘。
（4）焦磷酸测序
焦磷酸测序仪提前90分钟打开预热，设定运行程序，计算本次实验的各试剂使用量并添加至对应试剂仓；把制备好的样品和试剂仓放入仪器对应位置，点击“Run”运行程序；检测完成后，关闭软件进程状态窗口，保存测序结果。
（5）焦磷酸测序结果分析
在“SNP Runs”文件夹中打开上述运行文件，选择“SNP mode”，点击“AnalyzeAll”对所有检测样本进行基因型分析。分析结果详见图1：如图1所示可以清晰判读rs1800625TT/TC/CC和rs2070600GG/GA/AA基因型。
（6）单核甘酸多态性位点检测稳定性评价
按照上述方法对部分DNA样本单核甘酸多态性位点重复检测2次，单一单核甘酸多态性位点基因分型结果符合率为100%。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Figure IDA0000432605010000011
Figure IDA0000432605010000021
Figure IDA0000432605010000031

Claims (9)

1.一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）特异性引物的设计
根据被证实的RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点，设计特异性扩增引物和测序引物，其中，所述特异性扩增引物中的一条用生物素标记；
2）PCR扩增
以待测标本的DNA为模板，用步骤1）所述的特异性扩增引物进行PCR扩增，得PCR扩增物；
3）焦磷酸测序
将步骤2）所得PCR扩增物采用碱变性使其分开成单链，取其中被生物素标记的单链PCR扩增产物纯化后，与步骤1）所述测序引物进行杂交反应，并分析结果以判断所述待测标本的RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点是否具备多态性。
2.根据权利要求1所述的一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于：步骤1）中，所述的RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点包括：rs1800625和rs2070600位点。
3.根据权利要求2所述的一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于：
所述rs1800625位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，测序引物如SEQ ID NO：3所示；所述rs2070600位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，测序引物如SEQ ID NO：6所示。
4.根据权利要求2所述的一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于：所述步骤2）中，所述PCR扩增为所述rs1800625位点和所述rs2070600位点组合进行双重PCR扩增。
5.根据权利要求4所述的一种检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于：所述步骤3）中，对所述rs1800625位点和所述rs2070600位点组合进行双重焦磷酸测序。
6.用于检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的特异性扩增引物，RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的焦磷酸测序引物，以及PCR反应液、PCR产物筛选液、焦磷酸测序反应液。
7.根据权利要求6所述的用于检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增引物如SEQ ID NO:1-2所示，和/或如SEQ ID NO:4-5所示。
8.根据权利要求6所述的用于检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的试剂盒，其特征在于，所述测序引物如SEQ ID NO:3所示，和/或如SEQ IDNO:6所示。
9.根据权利要求6所述的用于检测RAGE家族基因标签单核甘酸多态性位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标记所述特异性扩增引物的生物素。
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