CN101215605A - RAGE Gly82Ser突变体在制备胃癌筛查试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种晚期糖基化终产物受体基因(RAGE)突变体Gly82Ser在制备胃癌危险人群检测筛查试剂中的应用。本发明开拓了RAGE Gly82Ser突变体在对胃癌危险人群进行检测筛查中的应用价值，通过检测位于RAGE外显子3的突变(Gly82Ser)，以引起受检者和临床医生的高度警惕。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一种基因突变体的新应用。
背景技术
胃癌的发生是一个复杂、多阶段、多因素的过程[1，2]。与许多恶性肿瘤相似，胃癌是环境因素和宿主遗传因素交互作用的结果[3]，世界上近42％的胃癌发生在中国[1]。我们过去的流行病学研究也提供证据表明胃癌风险与基因突变相关[4-6]。
晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)是免疫球蛋白超家族的成员之一[7]。它参与许多重要的病理学反应，包括Alzheimer’s病、糖尿病、炎症和癌症[8-11]。RAGE刺激癌症生长、生存和转移[11]。此外，RAGE表达与胃癌侵袭和转移密切相关[12]。而且，有报道表明阻断RAGE可抑制胃癌细胞侵袭[12]。有报道Ser82通过细胞分裂素(丝裂原)活化蛋白激酶(MAPK)和核因子κB(NF-κB)增强配体亲和力，上调受体信号[15，16]。RAGE与晚期糖基化终产物(AGEs)、S100蛋白等相作用[10]。配体与受体RAGE的作用激活重要细胞通路，包括MAPK，Cdc42/Rac和NF-κB信号通路[11，17，18]。
RAGE的基因位于第6条常染色体短臂21.3，包括11个外显子[13]。迄今为止，一些遗传性变异已在RAGE基因鉴别[14]，相对高频率的变异之一为Gly82Ser(rs2070600，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi？rs＝2070600)[15，16]。它位于RAGE外显子3的密码子82(GGC→AGC)。这个变异致使其蛋白质配体结合域内的甘氨酸转变为丝氨酸，它是一个有功能的变异现象，与增强RAGE信号相关[16]。目前没有涉及RAGEGly82Ser突变与癌症风险关系的研究报道。也未见RAGE Gly82Ser基因突变试剂盒应用于胃癌筛查中报道。
发明内容
本发明的目的是提供上述RAGE突变体Gly82Ser在制备胃癌筛查试剂中的新用途。
技术方案：RAGE Gly82Ser基因突变试剂盒包括：一对引物(正义：5′-GTAAGCGGGGCTCCTGTTGCA-3′，反义：5′-GGCCAAG GCTGGGGTTGAAGG-3′)，Taq酶，PCR buffer，MgCl2，dNTPs，限制性内切酶Alu I，琼脂糖。
通过病例-对照研究，用PCR-RFLP方法测定RAGE Gly82Ser变异。胃癌病例和对照的基因型分布都符合Hardy-Weinberg平衡定律。病例和对照组的基因型频率有统计学差别(Pearsonχ2＝6.552，P＝0.038)。而且，病例组Ser82等位基因频率较对照组高(Pearsonχ2＝5.855，P＝0.016)。用82Gly/Gly基因型作为参照，变异基因型(82Gly/Ser和82Ser/Ser)的OR值，在校正了年龄、性别、吸烟状况、居住地、高血压和糖尿病后，为1.47(95％CI：1.05-2.06，P＝0.024)。而且，82Gly/Ser杂合子增加了41％的胃癌风险(校正OR值：1.41；95％CI：1.00-1.99)，82Ser/Ser纯合子增加了150％的胃癌风险(校正OR值：2.50；95％CI：1.01-6.17)。在此研究中，我们也分析了RAGE变异基因型与胃癌病人临床病理学特征的相互关系。我们发现变异基因型和肿瘤浸润(T4)相关(校正OR值：3.20；95％CI：1.40-7.29)。
通过上述研究，可以确定RAGE基因突变Gly82Ser与胃癌的发生关系密切，若检测RAGE基因发生突变，则可确定被检测人属于胃癌危险人群。RAGE Gly82Ser基因突变试剂盒完全可以用于对胃癌危险人群进行检测筛查中。
有益效果：本发明开拓了RAGE突变体Gly82Ser在制备胃癌危险人群检测筛查试剂中的应用价值，通过检测位于RAGE基因外显子3的突变(Gly82Ser)，以引起受检者和临床医生的高度警惕。
附图说明
图1是代表性的82Gly/Gly，82Gly/Ser和82Ser/Ser的基因型PCR图。
PCR产物用AluI限制性内切酶消化，然后在2％琼脂糖凝胶电泳分析。M：DL2000marker；泳道1，3和5：82Gly/Gly纯合子；泳道2，7 and 8：82Gly/Ser杂合子；泳道4和6：82Ser/Ser纯合子。
具体实施方式
以下具体说明本发明。
1、材料和方法
(1)受试者：
这是一个病例-对照研究，包括了283位胃癌病人和283位无癌对照者。研究经南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准。病例是新近从组织学上诊断为胃癌的入院病人，连续从南京医科大学附属医院招募得来。那些有继发的、再生的肿瘤病例被除外。对照者为同时期的入院病人，没有任何癌症和遗传病史。他们年龄(5岁内)和性别匹配。所有受试者是无亲戚关系的汉族人。年龄、性别、吸烟情况、居住地、体重和个人医疗史的信息通过调查表收集得来[4-6]。以前或最近平均每天吸烟≥10支被定义为吸烟者。所有的胃癌根据国际抗癌联合会(UICC)TNM分类标准分类[19]。
(2)RAGE基因型检测：
RAGE Gly82Ser基因突变试剂盒包括：一对引物(正义：5′-GTAAGCGGGGCTCCTGTTGCA-3′，反义：5′-GGCCAAG GCTGGGGTTGAAGG-3′)，Taq酶，PCR buffer，MgCl2，dNTPs，限制性内切酶Alu I，琼脂糖。
采集受试者外周静脉血3ml，EDTA-K2抗凝，用经典酚-氯仿法抽提基因组DNA[4]。用PCR-RFLP方法测定RAGE Gly82Ser变异。PCR在20μl反应混合物中进行，包括1.625mM MgCl2，0.14mM dNTPs，1 U Taq酶(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)，2μl 10×PCR buffer(MBI Fermentas)，200ng基因组DNA和0.25μM的引物(正义：5′-GTAAGCGGGGCTCCTGTTGCA-3′，反义：5′-GGCCAAG GCTGGGGTTGAAGG-3′)。最初95℃变性5分钟之后，94℃ 30秒，62℃ 40秒，72℃ 45秒，共35个循环扩增DNA，最后72℃ 10分钟延伸。得到的397bp的PCR产物被限制性内切酶Alu I(New EnglandBioLabs，Waltham，MA，USA)5个单位在37℃消化16小时，紧接着2％琼脂糖凝胶电泳。对临床资料未知的两位研究者单独检测基因型以互相验证。随机选择大约10％的样本做重复测验，结果100％一致。
(3)统计学方法：
用Stata Version 8.0(STATA Corporation，College Station，TX)进行所有的统计分析。所有的检验都是双侧的，P＜0.05被定义为有统计学意义。不符合正态分布的数值变量，用中位数表示，且用Mann-Whitney秩和检验分析。用Pearsonχ2检验来分析分类变量分布的差别。用拟合优度检验评估RAGE基因型的Hardy-Weinberg平衡。变异与胃癌风险的相关性用OR值和95％可信区间来表示。野生基因型82Gly/Gly携带者为参照组。粗的OR值通过Woolf近似法计算得到，校正的OR值通过非限制性logistic回归来校正年龄、性别、吸烟状况、居住地、高血压和糖尿病等情况。
2、结果
(1)RAGE基因型检测
PCR产物用Alu I限制性内切酶消化，然后在2％琼脂糖凝胶电泳分析，有249bp，123bp和26bp三个片段的为82Gly/Gly纯合子，有249bp，181bp，123bp，67bp和26bp五个片段的为82Gly/Ser杂合子，有181bp，123bp，67bp和26bp四个片段的为82Ser/Ser纯合子，结果见图1。
(2)胃癌病例和对照组基本情况
胃癌病例和对照组的基本情况见表1。胃癌病例和对照的性别和年龄(5岁以内)匹配良好。两组的吸烟状况、居住地、高血压和糖尿病史相似。胃贲门癌和非贲门癌病人分别为83和200。绝大多数病例为腺癌(97.88％)。在275位可获取临床病理资料的胃癌病例中，48，31，133和63个分别为T1，T2，T3，和T4；38，129和108个分别为高，中，低分化。177个病例为淋巴结转移阳性。
表1
| 胃癌病例(n＝283) | 对照(n＝283) | P | |
| 性别(男)，n(％)年龄*(岁)体重*(kg)高血压，n(％)糖尿病，n(％)吸烟，n(％)居住地，n(％)农村城市 | 212(74.91)59(51-66)62(55-70)45(15.90)15(5.30)66(23.32)134(47.35)149(52.65) | 212(74.91)58(50-66)64.5(58-71)55(19.43)24(8.48)60(21.20)133(47.00)150(53.00) | 1.0000.8450.0200.2700.1350.5440.933 |
*中位数(25th-75th percentiles)
(3)胃癌病例和对照组RAGE基因型分布和风险评估
RAGE基因型分布和胃癌风险评估见表2。病例和对照的基因型分布都符合Hardy-Weinberg平衡定律。病例和对照组的基因型频率有统计学差别(Pearsonχ2＝6.552，P＝0.038)。而且，病例组Ser82等位基因频率较对照组高(Pearsonχ2＝5.855，P＝0.016)。用82Gly/Gly基因型作为参照，变异基因型(82Gly/Ser和82Ser/Ser)的OR值，在校正了年龄、性别、吸烟状况、居住地、高血压和糖尿病后，为1.47(95％CI：1.05-2.06，P＝0.024)。而且，82Gly/Ser杂合子增加了41％的胃癌风险(校正OR值：1.41；95％CI：1.00-1.99)，82Ser/Ser纯合子增加了150％的风险(校正OR值：2.50；95％CI：1.01-6.17)。
表2
| 基因型 | 病例n(％) | 对照*n(％) | 粗OR(95％CI) | P | 校正OR(95％CI) | P |
| 总GGGSSSGS+SSGly82 alleleSer82 allele | 283142(50.18)126(44.52)15(5.30)141(49.82)410(72.44)156(27.56) | 283170(60.07)105(37.10)8(2.83)113(39.93)445(78.62)121(21.38) | 1.001.44(1.01-2.05)2.24(0.86-6.28)1.49(1.06-2.11) | 0.0370.0680.041 | 1.001.41(1.00-1.99)2.50(1.01-6.17)1.47(1.05-2.06) | 0.0500.0480.024 |
*基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，Pearsonχ2＝3.045，P＝0.081.
校正了年龄、性别、吸烟状况、居住地、高血压和糖尿病.
GG：82Gly/Gly；GS：82Gly/Ser；SS：82Ser/Ser.
(4)变异的RAGE基因型和胃癌病人的临床病理学特征的关系
在此研究中，我们也分析了RAGE变异基因型与胃癌病人临床病理学特征的相互关系见表3。我们发现变异基因型和肿瘤浸润(T4)相关(校正OR值：3.20；95％CI：1.40-7.29)。
表3
| 肿瘤浸润程度 | GS+SS | GG | 粗OR(95％CI) | P | 校正OR(95％CI) | P |
| T1T2T3T4 | 18146440 | 30176923 | 11.37(0.50-3.79)1.55(0.75-3.24)2.90(1.24-6.80) | 0.4980.2050.007 | 11.45(0.54-3.89)1.63(0.81-3.30)3.20(1.40-7.29) | 0.4650.1710.006 |
校正了年龄、性别、吸烟状况、居住地、高血压和糖尿病.
GG：82Gly/Gly；GS：82Gly/Ser；SS：82Ser/Ser.
参考文献：
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1.一种晚期糖基化终产物受体基因突变体RAGE Gly82Ser在制备胃癌危险人群检测筛查试剂中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN103642920A (zh) * | 2013-12-09 | 2014-03-19 | 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 | 一种检测rage家族基因标签单核甘酸多态性位点的方法及试剂盒 |
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2008
- 2008-01-11 CN CN2008100190994A patent/CN101215605B/zh not_active Expired - Fee Related
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