CN1934248B - Hbv变异体的检测和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明一般涉及的是对特定物质表现出降低敏感性的病毒变异体和/或表现出与免疫药物相互作用下降的病毒变异体。更特别地，本发明涉及的是对核苷或核苷酸类似物表现出完全或者部分抗性和/或与针对病毒表面组分的抗体相互作用降低的乙型肝炎病毒(HBV)变异体，包括对这些抗体的敏感性降低的乙型肝炎病毒变异体。本发明还涉及的是发现这些病毒变异体的检测，它们在针对病毒物质特别是HBV变异体的抗病毒治疗方案的监测和新型或者修饰疫苗的开发方面是有用的。本发明还涉及使用病毒变异体筛选和/或开发，或者设计能够抑制病毒的感染、复制和/或释放的物质。

Description

HBV变异体的检测和应用
发明背景
发明领域
本发明一般涉及的是对特定物质表现出降低敏感性的病毒变异体和/或表现出与免疫试剂相互作用下降的病毒变异体。更特别地，本发明涉及的是对核苷或核苷酸类似物表现出完全或者部分抗性的乙型肝炎病毒(HBV)变异体和/或与针对病毒表面组分的抗体相互作用降低的乙型肝炎病毒变异体，包括对这些抗体的敏感性降低的乙型肝炎病毒变异体。本发明还涉及发现这些病毒变异体的检测，它们在抗病毒治疗方案的监测和针对病毒物质特别是HBV变异体的新型或者修饰疫苗的开发方面是有用的。本发明还涉及病毒变异体筛选和/或开发、或者设计能够抑制病毒的感染、复制和/或释放的物质的用途。
现有技术描述
本说明中参考的出版物的文献详情收集在说明书的末尾。
在本说明中对任何现有技术的参考不是，也不应当被理解为对该现有技术在任何国家构成常规的一般知识的承认或者任何形式的暗示。
乙型肝炎病毒(HBV)可以导致使人衰弱无力的疾病状况，并且导致急性肝脏衰竭。HBV是通过RNA中间体复制的DNA病毒，在其复制策略中利用了逆转录(Summers和Mason，Cell 29：403-415，1982)。HBV基因组具有复杂的性质，具有部分双链DNA结构和编码表面、核心、聚合酶和X基因的重叠的开放阅读框。图1中表示了HBV基因组的复杂性质。聚合酶由四个功能区域组成：末端蛋白(TP)、间隔物、逆转录酶(rt)和核糖核酸酶(RNAse)。
HBV的聚合酶基因与衣壳基因重叠，在聚合酶基因催化结构域中的突变也可以影响衣壳蛋白的核苷酸以及推导出来的氨基酸序列，反之亦然。特别地，在HBsAg内部的，位于氨基酸99和169之间的，被称为’a′决定簇的HBV中和结构域的基因序列，实际上与病毒聚合酶蛋白的主要催化区域特别是结构域A和B重叠。
HBV DNA聚合酶的存在引出了核苷或者核苷酸类似物可以作为有效的抗病毒物质的主张。目前正在进行测试的核苷或者核苷酸类似物的实例是喷昔洛韦(penciclovir)及其口服形式(FCV)[Vere Hodge，Antiviral Chem Chemother 4：67-84，1993；Boyd等人，AntiviralChem Chemother.32：358-363，1987；Kruger等人，Hepatology22.219A，1994；Main等人，J.Viral Hepatitis 3：211-215，1996]，拉米夫定(Lamivudine)[(-)-β-2′-脱氧-3′-硫代胞苷]；(3TC或者LMV)[Severini等人，Antimicrobial Agents Chemother.39：430-435，1995；Dienstag等人，New England J Med 333：1657-1661，1995]。已经进入临床试验的新型核苷或核苷酸类似物包括了嘧啶恩曲他滨(Emtricitabine)，((-)-β-L-2′-3′-双脱氧-5-氟-3′-硫代胞苷；FTC)，它是3TC的5-氟代衍生物，以及克拉夫定(Clevudine)(1-(2-氟-5-甲基-β-L-呋喃型阿拉伯糖基)尿嘧啶；L-FMAU)，一种胸腺嘧啶的类似物。如3TC一样，这些是具有非天然的“L”构型的嘧啶衍生物。有几种嘌呤衍生物也已经进入了临床试验；它们包括恩替卡韦(Entecavir)(BMS-200，475；ETV)，一种碳环形脱氧鸟嘌呤核苷类似物，二氨基嘌呤二氧戊烷(DAPD)，它是二氧戊烷鸟嘌呤((-)-β-D-2-氨基嘌呤二氧戊环；DXG))的一种口服前体药，以及阿德福韦酯(Adefovir dipivoxil)，它是无环脱氧腺嘌呤核苷单磷酸核苷或者核苷酸类似物阿德福韦(9-[膦酰基-甲氧基乙基]-腺嘌呤；PMEA)的一种口服前体药。处于临床前和临床研究中的其它药物包括FLG[Medivir]，ACH-126，443(L-d4C)[ArchillionPharmaceuticals]]，ICN2001-3(ICN)和Racivir(RCV)[Pharmassett]。尽管这些物质可以高效抑制HBV的DNA合成，但是在长时间的抗病毒化疗中可能出现HBV的抗性突变体。在接受长期LMV治疗的患者中，在聚合酶内部rt结构域选出主要抗性突变位于rtM204I/V+/-rtL180M，以及其它突变。用于聚合酶突变的命名法根据的是Stuyver等人，2001，见前。LMV是核苷或核苷酸类似物，已经被批准用于慢性HBV感染。LMV是HBV复制特别有效的抑制剂，它通过抑制病毒DNA合成降低了原位肝脏移植(OLT)后慢性感染患者血清中HBV DNA的滴度。LMV的单纯治疗看起来不可能长期控制HBV的复制。这是因为抗LMV的HBV毒株的出现在单纯治疗中看起来是不可避免的。
阿德福韦酯(ADV：以前称为bis-pom PMEA)是无环脱氧腺嘌呤核苷单磷酸类似物阿德福韦(以前称为PMEA)(图2)的口服前体药。ADV也是HBV复制的有效抑制剂，最近获得FDA的批准用于慢性HBV感染。阿德福韦酯与该类型中的其它物质不同之处在于它是核苷酸(相对于核苷)类似物，这样就绕过了药物激活过程中的第一个磷酸化反应。这个步骤通常是限速的。阿德福韦酯表现出针对野生型HBV和抗拉米夫定HBV毒株的临床活性，现在正在进行三期临床试验(Gilson等人，J Viral Hepat 6：387-395，1999；Perrillo等人，Hepatology32：129-134，2000；Peters等人，Transplantation 68：1912-1914，1999；Benhamou等人，Lancet 358：718-723，2001)。在二期研究中每天30mg剂量的阿德福韦酯在12周后病毒血中产生了平均41og10的下降(Heathcote等人，Hepatology 28：A620，1998)。
ADV是取代的无环核苷膦酸酯。这类化合物还包括泰诺福韦延胡索酸酯(也被称为泰诺福韦DF，或者泰诺福韦，或者(TFV)或者9-R-(2-膦酰甲氧基丙基)腺嘌呤(PMPA)，由Gilead sciernces推向市场，名称为Viread)。TFV具有抗HBV和HIV的抗病毒活性(Ying等人，J Viral Hepat.7(2)：161-165，2000；Ying等人，J.ViralHepat.7(1)：79-83，2000；Suo等人，J Biol Chem.273(42)：27250-27258.1998)。
FTC具有抗HBV和HIV的活性(Frick等人，AntimicrobAgents Chemother 37.：2285-2292，1993)。
核苷或者核苷酸类似物疗法可以以单纯疗法或者组合疗法进行给药，其中可以给服两个或者更多核苷或核苷酸类似物。核苷或者核苷酸类似物还可以与其它抗病毒物质例如干扰素或者乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)组合给药。
需要对抗核苷/核苷酸类似物或者抗体的HBV毒株之出现进行监测，并且开发诊断实验方案以检测这些抗性病毒，和/或使用这些变异体毒株筛选和/或开发或设计具有特殊性质的物质，这些物质的性质使它们可以用作抗病毒物质。这些抗性毒株的缺陷形式或者来自它们的抗原性组分、以及针对病毒表面组分的抗体也被认为在治疗性疫苗组合物的开发中有用。
发明概述
在贯穿本说明中，除非有上下文的需要，词语“包括”或者其变体例如“包含”或者“含有”，被理解为表示包括了所示的元件或者整体或者元件或个体组，但不排除包括任何其它的元件或者个体或者元件或个体组。
使用序列标识符编号(SEQ ID NO：)提及核苷酸和氨基酸序列。SEQID NOs：按照编号对应序列标识符<400>1(SEQ ID NO：1)，<400>2(SEQ ID NO：2)等等。在表1中总结了序列标识符。在权利要求之后给出了序列表。
氨基酸序列中的特定突变在这里表示为″Xaa1nXaa2″，其中Xaa1是突变前原来的氨基酸残基，n是残基编号，Xaa2是突变的氨基酸。缩写″Xaa″可以是三字母或者单字母(即″X″)符号。″Xaa1nXaa2″之前的“rt”表示“逆转录酶”。“s″表示的是衣壳基因。令基元Tyr MetAsp Asp(YMDD)中的甲硫氨酸残基编号为204号，对HBV DNA聚合酶的氨基酸残基编号(Stuyver等人，Hepatology 33.751-757，2001)。乙肝病毒表面抗原的氨基酸残基编号根据Norder等人(J.Gen.Virol.74：341-1348，1993)。使用单字母和三字母缩写确定氨基酸残基，这些总结于表2中。
根据本发明，在使用ADV治疗的慢性HBV感染的患者(患者A到L)中鉴定对HBV变异体的选择。患者E是ADV的非应答者。在ADV和LMV组合治疗或者TFV和LMV组合治疗(例如患者M)或者TFV和FTC组合治疗或者TFV单独治疗过程中鉴定其它HBV变异体，它们在HBV DNA聚合酶基因中具有突变，降低了HBV对核苷或者核苷酸类似物的敏感性。因此考虑了对下列各项有抗性或者表现出降低敏感性的HBV的rt变异体：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合。在表面抗原中也出现相应的突变。鉴定这些HBV突变体对于开发监测对ADV，LMV，FTC和/或TFV的抗性和/或对其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合的抗性的检测方法，以及对于筛选其它可用作治疗性物质的物质是重要的。
这里提及“抗HBV的物质”包括抑制或者干扰病毒复制、维持、感染、组装或者释放的核苷和核苷酸类似物以及免疫药剂(例如抗HBV表面组分的抗体)和化学的、蛋白的以及核酸物质。
对这种HBV变异体的检测在包括用于治疗HBV感染的物质的选择的治疗性实验方案管理中特别重要。本发明这个方面的方法的预测部分地依据监测具有增加HBV负荷的受试对象，在核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合存在下的病情发展。然后医生能够调整现有的治疗方案或者据此选择适当的治疗方法。
因此，本发明的一方面涉及的是分离的乙型肝炎病毒(HBV)变异体，其中所述变异体包含编码DNA聚合酶的基因中的核苷酸突变，导致所述DNA聚合酶至少一个氨基酸的添加、替换和/或缺失，且其中所述变异体对选自由下面各项组成的清单中的一个或者多个核苷或核苷酸类似物表现出降低的敏感性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV，以及其它核苷或核苷酸类似物，和/或抗HBV物质。该变异体HBV在其基因组中由HBV DNA聚合酶F和G结构域以及A到E结构域中的一个或者多个所确定的区域中之重叠阅读框中包含突变。
本发明的另一个方面提供了分离的HBV变异体，它包含S基因中的核苷酸突变，导致表面抗原至少一个氨基酸的添加、替换和/或缺失，并且变异体对选自由下面各项组成的清单中的一个或者多个核苷或核苷酸类似物表现出降低的敏感性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV，以及其它核苷或核苷酸类似物，和/或抗HBV物质。
在rt区有用的突变体包括，在一个实施方案中rtT38K，rtR55H和rtA181V；在另一个实施方案中包括rtS/T78S，rtV80L，rtN/S118N，rtN/K139K，rtE142V，rtA/T181A  rtI204M，rtQ/P/S/Stop215S，rtE/K218E，rtN/H238H和rtY245H；在另一个实施方案中包括rtN238T；在另一个实施方案中包括rtI122V和rtA181T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtA/V200V，rtM204V，rtV214A，rtH237H/P，rtV253G；在另一个实施方案中包括rtT128N和rtN236T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtM204V，rtQ215S；在另一个实施方案中包括rtT128S，rtL180M，rtM204V和rtQ215S；在另一个实施方案中包括rtI80L，rtI204M，rtN238T；在另一个实施方案中包括rtN238T/A；在另一个实施方案中包括rtI187V；在另一个实施方案中包括rtN123N/I，rtS135Y，rtV214A/V和rtQ215Q/P/Stop/S，或者其组合或者等价突变。
其它涉及的HBV突变体具有以下突变：rtT38K(在DNA聚合酶的F结构域中)，rtR55H(位于F和A结构域之间)，rtS/T78S，rtV80L(这些位于A结构域内)，rtN/S118N，rtI122V，rtN123N/I，rtS135Y，rtN/K139K，rtE142V(位于A和B结构域之间)，rtA181V，rtA181T(这些位于B结构域内)，；rtI187V(位于B和C结构域之间)，rtA/V200V(位于C结构域内)，rtV214A，rtV214A/V以及rtQ215Q/P/Stop/S，rtQ/P/S/Stop215S，rtQ215S，rt E/K218E(位于C和D结构域之间)，rtN236T，rtH237H/P，rtN/H238H，rtN238T，rtN238T/A(这些位于D结构域内)，rtY245H(位于D和E结构域之间)，以及rtV253G(位于E结构域内)，或者其组合或者等价突变。
在S基因中的有用突变包括，在一个实施方案中包括sQ30K.sE44G，sA47T，sI126T，sA159V和sL173F，在另一个实施方案中包括sF55S，sC/Stop69C，sC/Y76Y，sI/V110I，sN/T131N，sN134Y，sStop/W172W，sStop/W196W，sS/R207R；在另一个实施方案中包括sV14A，sL95W，sV96G，和sI208T/I；以及在另一个实施方案中包括sT47A和sW172stop，以及在另一个实施方案中包括PreS2 T6S，sT47A，sP62L，sL/F192F，sI195M，以及在另一个实施方案中包括sS53L，以及在另一个实施方案中包括sP120T，以及在另一个实施方案中包括sN40S，sS207R，以及在另一个实施方案中包括sQ101R，sI195M，sS207R，以及在另一个实施方案中包括sL95W和sL196W，以及在另一个实施方案中包括sV14A，在另一个实施方案中包括sL42R，sQ102Q/R，sT115T/S，sS207S/R，sL215R和sL216Stop，或者其组合或者等价突变。
本发明还涉及了确定HBV对下列各项表现出降低敏感性的潜力的方法：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合，该方法通过从HBV中分离DNA或者相应的mRNA，然后筛选编码HBV DNA聚合酶的核苷酸序列中的突变，所述突变导致在DNA聚合酶的结构域F和G以及结构域A到E或者与它们相邻的区域中的任何一个或者多个中，至少一个氨基酸替换、缺失和/或添加，且突变与对下列各项的抗性或者降低的敏感性有关：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合。
这种突变的存在表明了对下列各项有抗性的可能性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合。
本发明还提供了组合物，其包含对下列各项有抗性的HBV变异体：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合，或者来自HBV变异体的HBV表面抗原或者其重组或衍生形式，或者其化学等价物，以及一种或者更多药物上可以接受的载体和/或稀释剂。
本发明的另一个方面提供了对上面提到的组合物或者HBV变异体的用途，用于制备治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染的药物，所述HBV变异体在编码DNA聚合酶的基因中包含核苷酸突变，导致DNA聚合酶至少一个氨基酸添加、替换和/或缺失以及对下列各项敏感性的降低：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合。
本发明还涉及了确定HBV毒株是否表现出对核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质敏感性降低的方法，该方法通过从HBV中分离DNA或者相应的mRNA，然后筛选编码DNA聚合酶的核苷酸序列中的突变，其中在rt区域中以下一个或多个突变存在--在一个实施方案中，rtT38K，rtR55H和rtA181V；在另一个实施方案中包括rtS/T78S，rtV80L，rtN/S118N，rtN/K139K，rtE142V，rtA/T181A rtI204M，rtQ/P/S/Stop215S，rtE/K218E，rtN/H238H和rtY245H；在另一个实施方案中包括rtN238T；在另一个实施方案中包括rtI122V和rtA181T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtA/V200V，rtM204V，rtV214A，rtH237H/P，rtV253G；在另一个实施方案中包括rtT128N和rtN236T；在另一个实施方案中包括tL180M，rtM204V，rtQ215S；在另一个实施方案中包括rtT128S，rtL180M，rtM204V和rtQ215S；在另一个实施方案中包括rtI80L，rtI204M，rtN238T；在另一个实施方案中包括rtN238T/A；在另一个实施方案中包括rtI187V；在另一个实施方案中包括rtN123N/I，rtS135Y，rtV214A/V和rtQ215Q/P/Stop/S，或者其组合或者等价突变--指示了变异体表现出对下列各项降低的敏感性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合。
进一步的方法学包括筛选编码衣壳基因的核苷酸序列中的突变，其中在s基因中存在以下突变--在一个实施方案中包括sQ30K.sE44G，sA47T，sI126T，sA159V和sL173F，在另一个实施方案中包括sF55S，sC/Stop69C，sC/Y76Y，sI/V110I，sN/T131N，sN134Y，sStop/W172W，sStop/W196W，sS/R207R；在另一个实施方案中包括sV14A，sL95W，sV96G，和sI208T/I；以及在另一个实施方案中包括sT47A和sW172stop，以及在另一个实施方案中包括PreS2 T6S，sT47A，sP62L，sL/F192F，sI195M，以及在另一个实施方案中包括sS53L，以及在另一个实施方案中包括sP120T，以及在另一个实施方案中包括sN40S，sS207R，以及在另一个实施方案中包括sQ101R，sI195M，sS207R，以及在另一个实施方案中包括sL95W和sL196W，以及在另一个实施方案中包括sV14A，在另一个实施方案中包括sL42R，sQ102Q/R，sT115T/S，sS207S/R，sL215R和sL216Stop，或者其组合或者等价突变--指示了变异体表现出对下列各项降低的敏感性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合。
优选地，变异体是分离形式的，这样它们经过了至少一次从天然存在的体液中的纯化步骤。或者变异体可以保持为分离的体液形式或者以DNA形式。本发明还涉及包含来自变异体HBV的基因组或者部分基因组的感染性分子克隆。在细胞中、细胞裂解物中、培养的上清液体或者体液中对HBV或者其组分的检测可以通过任何方便的方式进行，包括任何基于核酸的检测方法例如通过核酸杂交技术或者通过一个或者多个聚合酶链式反应(PCRs)。术语“体液”包括任何来自血液、淋巴、组织或者器官系统的液体，包括血清、全血、活体组织和活体组织液体、器官外植体和器官悬液例如肝脏悬液。
本发明的另一方面涉及的是HBV变异体，它包含的表面抗原与来自参考或者野生型HBV的表面抗原相比其氨基酸序列具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中针对参考或者野生型的表面抗原产生的抗体对HBV变异体显示了改变的免疫组态(profile)。一个改变的方面包括中和HBV的能力降低。更特殊的是，变异体HBV的表面抗原与处理前的HBV相比，表现出改变的免疫组态，其中变异体HBV通过HBV DNA聚合酶的核苷或者核苷酸类似物或者其它的抗HBV物质选择。本发明这个方面的HBV变异体与处理前的HBV相比，还可以包含包含单一或者多个核苷酸替换、添加和/或缺失的核苷酸序列。
本发明还涉及检测表现出改变的免疫组态的变异体HBV的方法，所述方法包括从与核苷或核苷酸类似物或者类似物的组合接触的受试对象中分离HBV，上述类似物选自由下列各项组成的清单：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV，然后将所述HBV与表面抗原组的一个或者多个抗体接触，并筛选结合亲和性或者结合谱的任何改变。
在相关的发明中，本发明提供了检测表现出改变的免疫组态的变异体HBV的方法，所述方法包括从与核苷或核苷酸类似物或者类似物的组合接触的受试对象中分离血清样品，上述类似物选自由下列各项组成的清单：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV，然后将所述血清与HBV表面抗原或其抗体结合片段的组接触，并筛选结合亲和性或者结合谱的任何改变。
本发明延及对应于HBV变异体的分离的HBsAg或者其重组形式或者其衍生物或化学等价物。一般地，该HBsAg或者其重组或衍生形式或者其化学等价物与来自参考HBV的HBsAg相比，包含的氨基酸序列具有单一或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中针对参考HBV的抗体对携带所述变异体HBsAg的HBV表现出改变的免疫组态。在一个实施方案中，改变的免疫组态包括中和变异体HBV能力的降低。
本发明的另一个方面涉及了检测对HBV显示抑制活性的物质的方法，通过制备包含复制活性有效量的HBV基因组的基因构建体(包含于质粒载体中)，然后使用所述构建体转染所述细胞，使用待测物质在转染前、转染中和/或转染后与细胞接触，在足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或类病毒颗粒的条件下培养细胞一段时间(如果对所述物质有抗性的话)；以及使用病毒或病毒组分检测的方法确定在细胞、细胞裂解物或培养物上清液体中病毒是否在所述物质存在下已经复制、表达遗传物质和/或组装和/或被释放。在优选的实施方案中，杆状病毒载体中的质粒载体以及方法包括，通过制备包含复制活性有效量的HBV基因组的基因构建体(包含或者融合在一定量的杆状病毒基因组中)，其能够有效感染细胞，然后使用所述构建体转染所述细胞，使用待测物质在转染前、转染中和/或转染后与细胞接触，在足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或类病毒颗粒的条件下培养细胞一段时间(如果对所述物质有抗性的话)；以及使用病毒或病毒组分检测的方法确定在细胞、细胞裂解物或培养物上清液体中病毒是否在所述物质存在下已经复制、表达遗传物质和/或组装和/或被释放。
与这些方法相关，质粒载体可以包括编码部分或者全部其它病毒载体的基因，例如杆状病毒载体或腺病毒载体(参见Ren和Nassal，J.Virol.75(3)：1104-1116，2001)。
在另一个实施方案中，该方法包含制备包含复制活性有效量的感染性拷贝的HBV基因组之连续细胞系，使所述感染性HBV基因组稳定整合在所述连续细胞系(例如但是不止限于2.2.15或AD细胞系)中，然后使待测物质与细胞接触，在足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或类病毒颗粒的条件下培养细胞一段时间(如果对所述物质有抗性的话)；然后使用病毒或病毒组分检测的方法确定在细胞、细胞裂解物或培养物上清液体中病毒是否在所述物质存在下已经复制、表达遗传物质和/或组装和/或被释放。
在另一个实施方案中，本发明还涉及在体外聚合酶检测中，检测显示对HBV聚合酶有抑制活性的物质的方法。可以使用已有的检测(Gaillard等人，Antimicrob Agents Chemother.46(4)：1005-1013，2002；Xiong等人，Hepatology.28(6)：1669-73，1998)检查HBV聚合酶的活性。HBV聚合酶可以是野生型或参考HBV的聚合酶或者突变体HBV的聚合酶。
对病毒变异体的鉴定使得包含特定重组病毒组分(例如编码L，M，S蛋白的聚合酶或衣壳基因PreS1，PreS2，S)的疫苗生产以及包含缺陷HBV变异体的治疗性疫苗的生产成为可能。可以利用合理的药物设计，鉴定或者制备能够与编码L，M，S蛋白的聚合酶或衣壳基因PreSl，PreS2，S或者HBV其它组分相互作用的治疗性分子。这些药物还可能具有诊断潜力。此外，缺陷的HBV变异体还可以用作治疗性组合物，对相同、类似或者同源的病毒产生免疫应答。或者可以使用针对HBV变异体或者其表面组分产生的抗体用于受治疗者的被动免疫，抵御HBV变异体或者类似或同源病毒产生的感染。而且，本发明涉及物质例如核苷或核苷酸类似物，RNAi或siRNA分子(都是来自DNA或者是合成的)，反义或有义寡聚核苷酸，化学或蛋白的分子，它们具有下调HBV组分的能力，以及抑制复制、维持、感染、组装或释放的能力。
在表3中总结了整个说明书中使用的缩写。
在表1中总结了整个说明书中使用的序列标识符。
表1序列标识的总结
    序列ID NO：     描述
    1     分子式I
    2     分子式II
    3     OS1引物
    4     TTA3引物
    5     JM引物
    6     TTA4引物
    7     OS2引物
    8     有义引物
    9     反义引物
    10     内部区域引物
    11     内部区域引物
    12     PC1正向引物
    13     PC2反向引物
    14     HBV-特异的分子信标引物
表2  单字母和三字母氨基酸缩写
    氨基酸     三字母缩写     单字母符号
    丙氨酸     Ala     A
    精氨酸     Arg     R
    天冬酰胺     Asn     N
    天冬氨酸     Asp     D
    半胱氨酸     Cys     C
    谷氨酰胺     Gln     Q
    谷氨酸     Glu     E
    甘氨酸     Gly     G
    组氨酸     His     H
异亮氨酸 Ile I
    亮氨酸     Leu     L
    赖氨酸     Lys     K
    甲硫氨酸     Met     M
    苯丙氨酸     Phe     F
    脯氨酸     Pro     P
    丝氨酸     Ser     S
    苏氨酸     Thr     T
    色氨酸     Trp     W
    酪氨酸     Tyr     Y
    缬氨酸     Val     V
    任何氨基酸     Xaa     X
表3  缩写
缩写 描述
3TC (LMV)(-)-β-2′-脱氧-3′-硫代胞苷
ADV 阿德福韦酯
DAPD 二氨基嘌呤二氧戊烷
DXG 二氧戊烷鸟嘌呤
ETV 恩替卡韦
FAM 泛昔洛韦
FCV 泛昔洛韦
FTC 恩曲他滨
HBIG 乙型肝炎病毒免疫球蛋白
HBsAg 乙型肝炎病毒表面抗原
HBV 乙型肝炎病毒
LMV 拉米夫定
PMEA 9-[膦酰基-甲氧基乙基]-腺嘌呤；阿德福韦
PMPA 9-R-(2-膦酰甲氧基丙基)腺嘌呤
RNase 核糖核酸酶
rt(在″Xaa1nXaa2″之前的″rt″意思是逆转录酶) 逆转录酶
s(例如在突变sF14V中使用的) 衣壳基因
TFV 泰诺福韦延胡索酸酯
YMDD Tyr Met Asp Asp-在聚合酶蛋白中的基元；其中的Met残基指定为逆转录酶204号残基
附图简述
图1是示意图，显示了部分双链的DNA HBV基因组显示编码表面(S)、核心(C)、聚合酶(P)和X基因的重叠的开放阅读框。
图2表示ADV的化学结构。
图3表示确定HBV变异体数值的计算机系统。
图4表示对来自ADV治疗过程中患者A的顺序样品中编码聚合酶基因催化区域的HBV核苷酸序列的比较。
图5表示对来自ADV治疗过程中患者A的顺序样品中聚合酶基因催化区域推导氨基酸序列的比较。
图6表示对来自ADV治疗过程中患者A的顺序样品中衣壳基因的推导氨基酸序列的比较。
图7表示对来自ADV和LMV治疗过程中患者B的顺序样品中编码聚合酶基因催化区域的HBV核苷酸序列的比较。
图8表示对来自ADV和LMV治疗过程中患者B的顺序样品中聚合酶基因催化区域推导氨基酸序列的比较。
图9表示对来自ADV和LMV治疗过程中患者B的顺序样品中衣壳基因的推导氨基酸序列的比较。
图10表示来自ADV治疗过程中患者C的样品中编码聚合酶基因催化区域的HBV核苷酸序列。
图11表示来自ADV治疗过程中患者C的样品中聚合酶基因催化区域的推导氨基酸序列。
图12表示来自ADV治疗过程中患者C的样品中衣壳基因的推导氨基酸序列。
图13表示来自ADV治疗过程中患者D的样品中编码聚合酶基因催化区域的HBV核苷酸序列。
图14表示来自ADV治疗过程中患者D的顺序样品中聚合酶基因催化区域的推导氨基酸序列。
图15表示对来自ADV过程中患者D的顺序样品中衣壳基因的推导氨基酸序列的比较。
图16表示来自ADV治疗过程中患者E的样品中编码聚合酶基因催化区域的HBV核苷酸序列。
图17表示来自ADV治疗过程中患者E的样品中聚合酶基因催化区域的推导氨基酸序列。
图18表示来自ADV过程中患者E的样品中衣壳基因的推导氨基酸序列。
图19表示来自ADV治疗过程中患者F的样品中编码聚合酶基因催化区域的HBV核苷酸序列。
图20表示来自ADV治疗过程中患者F的样品中聚合酶基因催化区域的推导氨基酸序列。
图21表示来自ADV过程中患者F的样品中衣壳基因的推导氨基酸序列。
图22表示来自ADV治疗过程中患者G的样品中编码聚合酶基因催化区域的HBV核苷酸序列。
图23表示来自ADV治疗过程中患者G的样品中聚合酶基因催化区域的推导氨基酸序列。
图24表示来自ADV过程中患者G的样品中衣壳基因的推导氨基酸序列。
图25表示来自ADV治疗过程中患者H的样品中编码聚合酶基因催化区域的HBV核苷酸序列。
图26表示来自ADV治疗过程中患者H的样品中聚合酶基因催化区域的推导氨基酸序列。
图27表示来自ADV过程中患者H的样品中衣壳基因的推导氨基酸序列。
图28表示来自ADV治疗过程中患者I的样品中编码聚合酶基因催化区域的HBV核苷酸序列。
图29表示来自ADV治疗过程中患者I的样品中聚合酶基因催化区域的推导氨基酸序列。
图30表示来自ADV过程中患者I的样品中衣壳基因的推导氨基酸序列。
图31表示来自ADV治疗过程中患者J的样品中编码聚合酶基因催化区域的HBV核苷酸序列。
图32表示来自ADV治疗过程中患者J的样品中聚合酶基因催化区域的推导氨基酸序列。
图33表示来自ADV过程中患者J的样品中衣壳基因的推导氨基酸序列。
图34表示来自ADV治疗过程中患者K的样品中编码聚合酶基因催化区域的HBV核苷酸序列。
图35表示来自ADV治疗过程中患者K的样品中聚合酶基因催化区域的推导氨基酸序列。
图36表示来自ADV过程中患者K的样品中衣壳基因的推导氨基酸序列。
图37表示来自ADV治疗过程中患者L的样品中编码聚合酶基因催化区域的HBV核苷酸序列。
图38表示来自ADV治疗过程中患者L的样品中聚合酶基因催化区域的推导氨基酸序列。
图39表示来自ADV过程中患者L的样品中衣壳基因的推导氨基酸序列。
图40表示来自TFV治疗过程中患者M的样品中编码聚合酶基因催化区域的HBV核苷酸序列。
图41表示来自TFV治疗过程中患者M的样品中聚合酶基因催化区域的推导氨基酸序列。
图42表示来自TFV过程中患者M的样品中衣壳基因的推导氨基酸序列。
图43表示来自TFV治疗过程中患者M的另一个样品中编码聚合酶基因催化区域的HBV核苷酸序列。
图44表示来自TFV治疗过程中患者M的另一个样品中聚合酶基因催化区域的推导氨基酸序列。
图45表示来自TFV过程中患者M的样品中衣壳基因的推导氨基酸序列。
发明详述
本发明部分依据的是在使用ADV或LMV或者更特殊的是ADV和LMV或者TFV和LMV，或者选择地其它核苷类似物或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质(例如TFV或FTC)治疗患者之后，鉴定和分离对核苷或核苷酸类似物有抗性的HBV变异体。特别地，ADV或者ADV和LMV治疗的患者产生了对下列各项的敏感性减少或者下降的HBV变异体：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV。关于对ADV和/或LMV和/或FTC和/或TFV的敏感性，在这里提及“减少的”或者“下降的”，包括对核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质的完全或者基本上完全的抗性以及部分抗性，并且包括在核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质存在下高于野生型的复制速率或者复制效率。一方面，这可以通过在治疗中病毒载量的增加进行测定，或者在治疗中与治疗前的HBV DNA水平相比HBV DNA病毒载量没有显著降低(即对治疗没有反应)。
因此，本发明的一方面涉及的是分离的乙型肝炎病毒(HBV)变异体，其中所述变异体包含编码DNA聚合酶的基因中的核苷酸突变，所述突变导致所述DNA聚合酶至少一个氨基酸的添加、替换和/或缺失，且其中所述变异体对选自由下面各项组成的清单中的一个或者多个核苷或核苷酸类似物表现出降低的敏感性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV，以及其它核苷或核苷酸类似物，和/或抗HBV物质。
本发明的另一方面提供了确定HBV对核苷或核苷酸类似物表现出降低敏感性的潜力的方法，核苷或核苷酸类似物选自ADV，LMV，TFV和FTC或者其组合或者选择地其它核苷或核苷酸类似物，所述方法包括从所述HBV中分离DNA或者对应的mRNA，然后筛选编码HBV DNA聚合酶的核苷酸序列中的突变，突变导致在结构域F以及结构域A到E或者与它们相邻的区域一个或者多个中的至少一个氨基酸替换、缺失和/或添加，且突变与对ADV，LMV，TFV和/或FTC中的一个或者多个的抗性或者敏感性降低有关，其中这种突变的存在指示了对所述ADV，LMV，TFV和/或FTC中的一个或者多个具有抗性的可能性。
在详细描述本发明之前，应当理解除非有说明，本发明不限于特异的组成配方、制备方法、剂量方案等等，因为这些可能有所不同。还应当理解这里使用的术语的目的只是用于描述特殊的实施方案而不是要进行限制。
应当注意，如本说明中所使用的，除非在上下文中有明确的说明，单数形式″一个″，″一种″和″该″包括了复数方面。因此，例如提及“一个核苷或核苷酸类似物”包括了单个类似物以及两个或者更多的类似物；提及“一种HBV变异体”包括提及了两个或者更多HBV变异体。
在描述本发明和提出权利要求时，根据下面提出的定义使用以下的术语。
术语“类似物”、“化合物”、“活性物质”、“药理活性物质”、“药物”、“活性”和“药”在这里互相交换使用，指的是诱导所需效果，例如抑制病毒复制、感染、维持、组装和/或酶(如HBV DNA聚合酶)的功能的化学化合物。该术语还包括了这里特别提到的那些活性物质在药物上可以接受的以及药理活性的成分，包括但是不止限于，盐类、酯类、胺类、前体药、活性代谢物、类似物等等。在使用术语“类似物”、“化合物”、“活性物质”、“药理活性物质”、“药物”、“活性”和“药”时，应当理解这包括活性物质本身以及药物上可以接受的和药理活性的盐类、酯类、胺类、前体药、活性代谢物、类似物等等。
因此本发明涉及在抑制HBV复制、感染、维持、组装和/或酶(如HBV DNA聚合酶)的功能中有用的化合物。提及“类似物”、“化合物”、“活性物质”、“药理活性物质”、“药物”、“活性”和“药”例如ADV，LMV，FTC和/或TFV时包括两种或者更多活性物质的组合，如ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV。“组合”还包括两部分或者更多例如多部分的抗HBV治疗性组合物，其中的物质分别提供、分别给药或者分发或者在分发药物之前混和。
如这里所使用的，术语物质的“有效量”和“治疗有效量”指的是充足量的物质，以提供所需的抑制HBV复制、感染、维持、组装和/或酶(如HBV DNA聚合酶)的功能的治疗或者生理效果。而且，物质的“抑制HBV的有效量”或者“缓解症状的有效量”是充足量的该物质，以直接或间接抑制HBV复制、感染、维持、组装和/或酶(如HBVDNA聚合酶)的功能。不合意的效果，例如副作用有时与所需的治疗效果一同表现出来；因此医疗从业人员在确定什么是正确的“有效量”时在潜在的益处与潜在的风险之间进行权衡。所需的确切量随受试对象的不同而有所不同，这取决于受试对象的物种、年龄和一般情况，给药的方式等等。因此可能不能明确确切的“有效量”。但是，本领域普通技术人员可以仅仅使用常规的实验方法确定在任何独立情况下的正确的“有效量”。
“药物上可以接受的”载体、赋形剂或者稀释剂指的是由非生物或者其它不合意的材料，即可以与所选择的活性物质一同给服给受试对象，而不会导致任何或者显著的不良反应，组成的药物载体。载体可以包括赋形剂以及其它添加剂例如稀释剂、去污剂、着色剂、润湿或者乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等等。
类似地，如这里提供的，化合物的“药物上可以接受的”盐、酯、胺、前体药或者衍生物是盐类、酯类、胺类、前体药或者衍生物不是生物的或者其它不合意的。
如这里所使用的术语“治疗”和“治疗”，指的是严重性和/或症状频率的降低，症状和/或其根本原因的去除，症状出现和/或它们的根本原因的预防，以及与HBV感染有关的损伤的改善或治愈。因此，例如“治疗”患者包括阻止HBV感染，以及通过抑制HBV复制、感染、维持、组装和/或酶(如HBV DNA聚合酶)的功能，对临床上有HBV症状的个体的治疗。因此，例如，对于具有HBV感染的或者倾向出现HBV感染的患者进行“治疗”的本发明方法包括HBV感染的预防以及治疗HBV感染或者其症状。在任何情况下，本发明涉及了HBV感染的治疗或预防。
如这里所使用的，“患者”指的是可以从本发明的配方和方法中受益的动物，优选是哺乳动物，更为优选是灵长类包括低等灵长类，更为优选的是人。患者，不论它是人或者非人的动物，都可以被称为个体、受试对象、动物、宿主或者接受者。本发明的化合物和方法在人用药物、兽用药物以及一般地，驯养或者野生动物的饲养管理中有应用。为简便起见，“动物”包括了禽类的物种例如家禽鸟类、鸟舍鸟类或者猎禽。在非人动物中的情况不一定是天然存在的HBV感染，且可以诱导类似HBV的感染。
如上面表明的，优选的动物是人，非人的灵长类动物例如绒，狒狒，红猩猩，低等灵长类例如tupia，家畜动物、实验室试验动物、伴侣动物或者捕获的野生动物。人是最优选的靶标。但是也可以使用非人的动物模型。
实验室试验动物的实例包括小鼠、大鼠、家兔、豚鼠和仓鼠。家兔和啮齿动物如大鼠和小鼠，是与灵长类和低等灵长类一样的方便的检测系统或者动物模型。家畜动物包括绵羊、奶牛、猪、山羊、马和驴。还涉及了非人动物例如鸟类、斑马鱼、两栖类(包括甘蔗蟾蜍)以及果蝇种例如黑腹果蝇(Drosophilla melanogaster)。除了活的动物模型之外，检测系统还可以包含组织培养系统。
“抗HBV物质”包括核苷或核苷酸类似物、蛋白质、化学化合物、RNA或DNA或RNAi或siRNA寡聚核苷酸(来自DNA的或者合成的)。
优选地，降低的敏感性针对的是ADV。或者，降低的敏感性针对的是ADV。或者，降低的敏感性针对的是LMV。或者，降低的敏感性针对的是TFV。或者，降低的敏感性针对的是FTC。或者，降低的敏感性针对的是ADV和LMV。或者，降低的敏感性针对的是ADV和TFV。或者，降低的敏感性针对的是LMV和TFV。或者，降低的敏感性针对的是ADV和FTC。或者，降低的敏感性针对的是FTC和TFV。或者，降低的敏感性针对的是FTC和LMV。或者，降低的敏感性针对的是ADV和LMV和TFV。或者，降低的敏感性针对的是或者ADV和TFV和FTC。或者，降低的敏感性针对的是LMV和TFV和FTC。或者，降低的敏感性针对的是LMV和TFV和FTC。或者，降低的敏感性针对的是ADV和LMV和FTC。或者，降低的敏感性针对的是ADV和FTC和TFV和LMV。
在这里提及“抗HBV物质”包括了抑制或者干扰病毒复制、维持、感染、组装或者释放的核苷和核苷酸类似物以及免疫药剂(例如针对HBV表面组分的抗体)以及化学、蛋白和核酸物质。在这里提及“核酸”包括了有义或反义分子、RNA或DNA、寡聚核苷酸和RNAi和siRNA分子以及含有其的复合体。
除了在编码DNA聚合酶的基因中的突变，由于HBV基因组的重叠性质(图1)，在编码S基因(编码表面抗原HBsAg)的基因中也可能出现相应突变，导致与免疫药剂(如抗体和对HBsAg的免疫细胞)的相互作用下降。与针对病毒表面组分的免疫药剂相互作用的降低一般包括识别或者大体识别病毒表面组分的免疫记忆的丧失。因此本发明涉及到对下列各项表现出降低敏感性的HBV变异体：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV，或者显示与针对HBsAg的免疫药剂相互作用降低的变异体，其中在ADV和/或LMV组合或者顺序处理之后进行变异体的选择。术语“顺序”在这里指的是ADV之后是LMV和/或TFV，和/或FTC，LMV之后是ADV和/或TFV，和/或FTC，或者ADV和/或，LMV和/或TFV，和/或FTC每一种的多重顺序给药。
因此病毒变异体可以只携带在DNA聚合酶基因中的突变或者在DNA聚合酶基因和S基因两者中的突变。术语“突变”应当在就其最广义的背景进行理解，包括了多重突变。
本发明涉及到HBV DNA聚合酶的任何结构域特别是F和G区域以及A到E结构域的突变，前提是所述突变导致对ADV和/或LMV和/或TFV或者其组合的敏感性降低。
在本说明书中，特别提及了由区域A到E确定的DNA聚合酶的保守区域。在澳大利亚专利No.734831中，式II中给出的氨基酸确定了区域A到E。
优选地，突变导致HBV DNA聚合酶结构域F和G以及结构域A到E或者与它们相邻的区域任何一个或者多个中的氨基酸序列的改变。
本发明的另一个方面提供的HBV变异体在其基因组的重叠开放阅读框中包含突变，其中所述突变位于一个或者多个HBV DNA聚合酶的F和G结构域以及A到E结构域确定的区域中，且其中所述突变对下列各项显示降低的敏感性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质。
本发明的另一个优选方面涉及的HBV变异体在编码HBsAg的核苷酸序列中包含突变，导致所述HBsAg中氨基酸的添加、替换和/或缺失，其中所述变异体对下列各项显示降低的敏感性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者它们的组合。
更为特殊的是，本发明提供了HBV变异体，它包含的表面抗原与来自参考或者野生型HBV的表面抗原相比具有的氨基酸序列具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中针对参考或者野生型的表面抗原产生的抗体表现出中和所述HBV变异体能力的降低，所述变异体通过使用下列各项与受试对象接触而进行选择：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者它们的组合。
术语”组合疗法“指的是ADV，LMV，FTC和/或TFV的两种组合在同一个组合物中共同给药或者在不同组合物中同时给药。术语”顺序疗法”指的是两种物质在相隔几秒钟、几分钟、几小时、几天或者几星期的时间，以任何顺序给药。顺序疗法还包括使用ADV，LMV，FTC或者TFV中的一个或另一个完成治疗过程，然后使用ADV，LMV，FTC或者TFV中另一个完成第二个或者第三个或者接下来的治疗过程。
因此，本发明的另一个方面涉及了HBV变异体，它包含的表面抗原具有的氨基酸序列与处理前的HBV相比，具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中变异体的表面抗原与处理前的HBV相比表现出改变的免疫组态，其中通过使受试对象进行ADV治疗或者使用一种或者更多其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质进行治疗，选择所述HBV变异体。
本发明的另一个方面涉及了HBV变异体，它包含的表面抗原具有的氨基酸序列与处理前的HBV相比具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中变异体的表面抗原与处理前的HBV相比表现出改变的免疫组态，其中通过使受试对象进行LMV治疗或者使用一种或者更多其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质进行治疗，选择所述HBV变异体。
本发明的另一个方面涉及了HBV变异体，它包含的表面抗原具有的氨基酸序列与处理前的HBV相比具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中变异体的表面抗原与处理前的HBV相比表现出改变的免疫组态，其中通过使受试对象进行FTC治疗或者使用一种或者更多其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质进行治疗，选择所述HBV变异体。
本发明的另一个方面涉及了HBV变异体，它包含的表面抗原具有的氨基酸序列与处理前的HBV相比具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中变异体的表面抗原与处理前的HBV相比表现出改变的免疫组态，其中通过使受试对象进行TFV治疗或者使用一种或者更多其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质进行治疗，选择所述HBV变异体。
本发明的另一个方面涉及了HBV变异体，它包含的表面抗原具有的氨基酸序列与处理前的HBV相比具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中变异体的表面抗原与处理前的HBV相比表现出改变的免疫组态，其中通过使受试对象进行ADV和LMV治疗或者使用一种或者更多其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质进行治疗，选择所述HBV变异体。
本发明的另一个方面涉及了HBV变异体，它包含的表面抗原具有的氨基酸序列与处理前的HBV相比具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中变异体的表面抗原与处理前的HBV相比表现出改变的免疫组态，其中通过使受试对象进行ADV和TFV治疗或者使用一种或者更多其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质进行治疗，选择所述HBV变异体。
本发明的另一个方面涉及了HBV变异体，它包含的表面抗原具有的氨基酸序列与处理前的HBV相比具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中变异体的表面抗原与处理前的HBV相比表现出改变的免疫组态，其中通过使受试对象进行LMV和TFV治疗或者使用一种或者更多其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质进行治疗，选择所述HBV变异体。
本发明的另一个方面涉及了HBV变异体，它包含的表面抗原具有的氨基酸序列与处理前的HBV相比具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中变异体的表面抗原与处理前的HBV相比表现出改变的免疫组态，其中通过使受试对象进行ADV和FTC治疗或者使用一种或者更多其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质进行治疗，选择所述HBV变异体。
本发明的另一个方面涉及了HBV变异体，它包含的表面抗原具有的氨基酸序列与处理前的HBV相比具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中变异体的表面抗原与处理前的HBV相比表现出改变的免疫组态，其中通过使受试对象进行TFV和FTC治疗或者使用一种或者更多其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质进行治疗，选择所述HBV变异体。
本发明的另一个方面涉及了HBV变异体，它包含的表面抗原具有的氨基酸序列与处理前的HBV相比具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中变异体的表面抗原与处理前的HBV相比表现出改变的免疫组态，其中通过使受试对象进行FTC和LMV治疗或者使用一种或者更多其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质进行治疗，选择所述HBV变异体。
本发明的另一个方面涉及了HBV变异体，它包含的表面抗原具有的氨基酸序列与处理前的HBV相比具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中变异体的表面抗原与处理前的HBV相比表现出改变的免疫组态，其中通过使受试对象进行ADV、LMV和TFV治疗或者使用一种或者更多其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质进行治疗，选择所述HBV变异体。
本发明的另一个方面涉及了HBV变异体，它包含的表面抗原具有的氨基酸序列与处理前的HBV相比具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中变异体的表面抗原与处理前的HBV相比表现出改变的免疫组态，其中通过使受试对象进行ADV，LMV和TFV治疗或者使用一种或者更多其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质进行治疗，选择所述HBV变异体。
本发明的另一个方面涉及了HBV变异体，它包含的表面抗原具有的氨基酸序列与处理前的HBV相比具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中变异体的表面抗原与处理前的HBV相比表现出改变的免疫组态，其中通过使受试对象进行ADV，LMV和FTC治疗或者使用一种或者更多其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质进行治疗，选择所述HBV变异体。
本发明的另一个方面涉及了HBV变异体，它包含的表面抗原具有的氨基酸序列与处理前的HBV相比具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中变异体的表面抗原与处理前的HBV相比表现出改变的免疫组态，其中通过使受试对象进行FTC，LMV和TFV治疗或者使用一种或者更多其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质进行治疗，选择所述HBV变异体。
本发明的另一个方面涉及了HBV变异体，它包含的表面抗原具有的氨基酸序列与处理前的HBV相比具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中变异体的表面抗原与处理前的HBV相比表现出改变的免疫组态，其中通过使受试对象进行ADV，FTC和TFV治疗或者使用一种或者更多其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质进行治疗，选择所述HBV变异体。
本发明的另一个方面涉及了HBV变异体，它包含的表面抗原具有的氨基酸序列与处理前的HBV相比具有一个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中变异体的表面抗原与处理前的HBV相比表现出改变的免疫组态，其中通过使受试对象进行ADV，LMV，FTC和TFV治疗或者使用一种或者更多其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质进行治疗，选择所述HBV变异体。
优选地，变异体是分离形式的，这样它们经过了至少一次从天然存在的体液中的纯化步骤。或者变异体可以保持分离的体液形式或者以DNA形式。本发明还涉及包含来自变异体HBV的基因组或者部分基因组的感染性的分子克隆。而且，本发明提供了来自HBV变异体的分离的组分，例如但是不止限于分离的HBsAg。因此，本发明提供了分离的HBsAg或者其重组形式或者其衍生物或化学等价物，所述HBsAg来自通过使受试对象与一种或者更多的ADV，LMV，FTC和/或TFV或者选择地一种或者更多核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质接触所选择的HBV。
更为特别的是，本发明的另一个方面涉及的是分离的HBsAg变异体或者其重组或衍生形式或者其化学等价形式，其中所述HBsAg或者其重组或衍生形式或者其化学等价形式与来自参考HBV的HBsAg相比表现出改变的免疫组态，所述HBsAg来自通过使受试对象与一种或者更多的ADV，LMV，FTC和/或TFV或者选择地一种或者更多核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质接触所选择的HBV。
更为特别的是，本发明提供了分离的变异体HBsAg或者其重组或衍生形式或者其化学等价形式，其中所述HBsAg或者其重组或衍生形式或者其化学等价形式包含的氨基酸序列，与来自参考HBV的HBsAg相比具有一个或者单个或者多个氨基酸替换、添加和/或缺失或者截短，且其中针对参考HBV的中和抗体对携带所述变异体HBsAg的HBV不显示活性或者显示降低的活性，所述HBsAg来自通过使受试对象与一种或者更多的ADV，LMV，FTC和/或TFV或者选择地一种或者更多核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质接触所选择的HBV。
在HBV DNA聚合酶中优选的突变包括来自在使用下列各项进行治疗后重新出现HBV的患者的变异体：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV。在移植步骤(例如骨髓移植(BMT)或者原位肝移植(OLT))之中、之前或者之后，或者在诊断患有肝炎的患者治疗后可能涉及核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV的物质。在变异体的选择之后，可以得到的病毒载量与治疗前的水平相似或者随着治疗升高。
位于rt区域的有用突变包括，在一个实施方案中rtT38K，rtR55H和rtA181V；在另一个实施方案中包括rtS/T78S，rtV80L，rtN/S118N，rtN/K139K，rtE142V，rtA/T181A rtI204M，rtQ/P/S/Stop215S，rtE/K218E，rtN/H238H和rtY245H；在另一个实施方案中包括rtN238T；在另一个实施方案中包括rtI122V和rtA181T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtA/V200V，rtM204V，rtV214A，rtH237H/P，rtV253G；在另一个实施方案中包括rtT128N和rtN236T；在另一个实施方案中包括tL180M，rtM204V，rtQ215S；在另一个实施方案中包括rtT128S，rtL180M，rtM204V和rtQ215S；在另一个实施方案中包括rtI80L，rtI204M，rtN238T；在另一个实施方案中包括rtN238T/A；在另一个实施方案中包括rtI187V；在另一个实施方案中包括rtN123N/I，rtS135Y，rtV214A/V和rtQ215Q/P/Stop/S，或者其组合或者等价突变。
这些HBV变异体被认为表现出对下列各项降低的敏感性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合。应当注意到氨基酸位置的命名系统是以YMDD基元中的甲硫氨酸残基(指定的密码子为rtM204)为基础的。这个编号系统与澳大利亚专利No.734831中的编码系统不同，该编号系统中位于聚合酶基因中YMDD基元的甲硫氨酸残基被指定的密码子是550号。因此，rtL180M和rtM204V分别对应了澳大利亚专利No.734831中的L526M和M550V。相应的突变也会出现在衣壳基因中例如在PreS1，PreS2和S中的一个或者多个突变。
ADV以及其它无环核苷膦酸酯的另一个可能作用方式是免疫刺激(Calio等人，Antiviral Res.23：77-89，1994)。一些突变导致了在HBV变异体中检测到的衣壳基因中的改变，它们可能与免疫逃避有关。这些改变包括在一个实施方案中包括sQ30K.sE44G，sA47T，sI126T，sA159V和sL173F，在另一个实施方案中包括sF55S，sC/Stop69C，sC/Y76Y，sI/V110I，sN/T131N，sN134Y，sStop/W172W，sStop/W196W，sS/R207R；在另一个实施方案中包括sV14A，sL95W，sV96G，和sI208T/I；以及在另一个实施方案中包括sT47A和sW172stop，以及在另一个实施方案中包括PreS2 T6S，sT47A，sP62L，sL/F192F，sI195M，以及在另一个实施方案中包括sS53L，以及在另一个实施方案中包括sP120T，以及在另一个实施方案中包括sN40S，sS207R，以及在另一个实施方案中包括sQ101R，sI195M，sS207R，以及在另一个实施方案中包括L95W和sL196W，以及在另一个实施方案中包括sV14A，在另一个实施方案中包括sL42R，sQ102Q/R，sT115T/S，sS207S/R，sL215R和sL216Stop，或者其组合或者等价突变。
本发明变异体的鉴定产生了一系列检测这些变异体的检测方法。对这些变异体的检测对鉴定抗性变异体，确定化疗的适当形式和/或监测免疫接种方案或者开发新型或者改变的疫苗制剂，可能是重要的。
本发明的另一方面涉及了确定HBV对下列各项表现出降低敏感性的潜力的方法：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合，该方法通过从所述HBV中分离DNA或者对应的mRNA，然后筛选编码HBV DNA聚合酶的核苷酸序列的突变，突变导致在导致在所述DNA聚合酶的结构域F和G以及结构域A到E或者与它们相邻的区域中的任何一个或者多个中，至少一个氨基酸替换、缺失和/或添加，且突变与对下列各项的抗性或者降低的敏感性有关：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合，其中在这种突变的存在指示了对所述--ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合的--具有抗性的可能性。
因此，本发明的另一个方面提供了确定HBV对核苷或核苷酸类似物表现出降低敏感性的潜力的方法，核苷或核苷酸类似物选自ADV，LMV，TFV和FTC或者其组合或者选择地其它核苷或核苷酸类似物，所述方法包含从所述HBV中分离DNA或者对应的mRNA，然后筛选编码HBVDNA聚合酶的核苷酸序列的突变，突变导致在所述DNA聚合酶的结构域F以及结构域A到E或者与它们相邻的区域中的任何一个或者多个中，至少一个氨基酸替换、缺失和/或添加，且突变与对ADV，LMV，TFV和/或FTC中的一个或者多个的抗性或者敏感性降低有关，其中这种突变的存在指示了对所述ADV，LMV，TFV和/或FTC中的一个或者多个具有抗性的可能性。
优选地，试验所检测的是一个或者多个以下的突变：在一个实施方案中rtT38K，rtR55H和rtA181V；在另一个实施方案中包括rtS/T78S，rtV80L，rtN/S118N，rtN/K139K，rtE142V，rtA/T181ArtI204M，rtQ/P/S/Stop215S，rtE/K218E，rtN/H238H和rtY245H；在另一个实施方案中包括rtN238T；在另一个实施方案中包括rtI122V和rtA181T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtA/V200V，rtM204V，rtV214A，rtH237H/P，rtV253G；在另一个实施方案中包括rtT128N和rtN236T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtM204V rtQ215S；在另一个实施方案中包括rtT128S rtL180M，rtM204V和rtQ215S；在另一个实施方案中包括rtI80L，rtI204M，rtN238T；在另一个实施方案中包括rtN238T/A；在另一个实施方案中包括rtI187V；在另一个实施方案中包括rtN123N/I rtS135Y，rtV214A/V和rtQ215Q/P/Stop/S，或者其组合或者一个或更多等价的其它突变，这些突变是变异体存在的证据，其中所述变异体对下列各项表现出降低的敏感性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合。
因此本发明的另一方面产生的是确定HBV毒株是否表现出对核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质敏感性降低的方法，所述方法通过从所述HBV中分离DNA或者对应的RNA，然后筛选编码DNA聚合酶和/或S基因的对应区域的核苷酸序列中的突变，其中选自下列各项的突变的存在--在一个实施方案中包括sQ30K.sE44G，sA47T，sI126T，sA159V和sL173F，在另一个实施方案中包括sF55S，sC/Stop69C，sC/Y76Y，sI/V110I，sN/T131N，sN134Y，sStop/W172W，sStop/W196W，sS/R207R；在另一个实施方案中包括sV14A，sL95W，sV96G，和sI208T/I；以及在另一个实施方案中包括sT47A和sW172stop，以及在另一个实施方案中包括sPreS2 T6S，sT47A，sP62L，sL/F192F，sI195M，以及在另一个实施方案中包括sS53L，以及在另一个实施方案中包括sP120T，以及在另一个实施方案中包括sN40S，sS207R，以及在另一个实施方案中包括sQ101R，sI195M，sS207R，以及在另一个实施方案中包括sL95W和sL196W，以及在另一个实施方案中包括sV14A，在另一个实施方案中包括sL42R，sQ102Q/R，sT115T/S，sS207S/R，sL215R和sL216Stop，在另一个实施方案中rtT38K，rtR55H和rtA181V；在另一个实施方案中包括rtS/T78S，rtV80L，rtN/S118N，rtN/K139K，rtE142V，rtA/T181A  rtI204M，rtQ/P/S/Stop215S，rtE/K218E，rtN/H238H和rtY245H；在另一个实施方案中包括rtN238T；在另一个实施方案中包括rtI122V和rtA181T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtA/V200V，rtM204V，rtV214A，rtH237H/P，rtV253G；在另一个实施方案中包括rtT128N和rtN236T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtM204V rtQ215S；在另一个实施方案中包括rtT128S rtL180M，rtM204V和rtQ215S；在另一个实施方案中包括rtI80L，rtI204M，rtN238T；在另一个实施方案中包括rtN238T/A；在另一个实施方案中包括rtI187V；在另一个实施方案中包括rtN123N/I rtS135Y，rtV214A/V和rtQ215Q/P/Stop/S，或者其组合或者一个或更多等价的其它突变--指示了对下列各项表现出降低的敏感性变异体的存在：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合。
本发明的另一方面产生的是确定HBV毒株是否表现出对核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质敏感性降低的方法，所述方法通过从HBV中分离DNA或者对应的RNA，然后筛选编码DNA聚合酶和/或S基因的对应区域的核苷酸序列中的突变，其中选自下列各项的突变的存在--在一个实施方案中包括sQ30K.sE44G，sA47T，sI126T，sA159V和sL173F，在另一个实施方案中包括sF55S，sC/Stop69C，sC/Y76Y，sI/V110I，sN/T131N，sN134Y，sStop/W172W，sStop/W196W，sS/R207R；在另一个实施方案中包括sV14A，sL95W，sV96G，和sI208T/I；以及在另一个实施方案中包括sT47A和sW172stop，以及在另一个实施方案中包括sPreS2 T6S，sT47A，sP62L，sL/F192F，sI195M，以及在另一个实施方案中包括sS53L，以及在另一个实施方案中包括sP120T，以及在另一个实施方案中包括sN40S，sS207R，以及在另一个实施方案中包括sQ101R，sI195M，sS207R，以及在另一个实施方案中包括sL95W和sL196W，以及在另一个实施方案中包括sV14A，在另一个实施方案中包括sL42R，sQ102Q/R，sT115T/S，sS207S/R，sL215R和sL216Stop，在另一个实施方案中rtT38K，rtR55H和rtA181V；在另一个实施方案中包括rtS/T78S，rtV80L，rtN/S118N，rtN/K139K，rtE142V，rtA/T181A  rtI204M，rtQ/P/S/Stop215S，rtE/K218E，rtN/H238H和rtY245H；在另一个实施方案中包括rtN238T；在另一个实施方案中包括rtI122V和rtA181T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtA/V200V，rtM204V，rtV214A，rtH237H/P，rtV253G；在另一个实施方案中包括rtT128N和rtN236T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtM204V rtQ215S；在另一个实施方案中包括rtT128S rtL180M，rtM204V和rtQ215S；在另一个实施方案中包括rtI80L，rtI204M，rtN238T；在另一个实施方案中包括rtN238T/A；在另一个实施方案中包括rtI187V；在另一个实施方案中包括rtN123N/I  rtS135Y，rtV214A/V和rtQ215Q/P/Stop/S，或者其组合或者一个或更多等价的其它突变--指示了对下列各项表现出降低的敏感性变异体的存在：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合。
在细胞、细胞裂解物、培养上清液以及体液中HBV或者其组分的检测可以通过任何方便的方法，包括任何基于核酸的检测方法，例如通过核酸杂交技术或者通过一个或多个聚合酶链式反应(PCRs)，进行检测。术语“体液”包括任何来自血液、淋巴、组织或者器官系统的液体包括血清、全血、活体组织和活体组织液体、器官外植体和器官悬液例如肝脏悬液。本发明还包括使用所述基于核酸的检测方法的不同检测形式，包括限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、单链多态性(SSCP)、扩增和错配检测(AMD)、分散重复序列聚合酶链式反应(IRS-PCR)、反向聚合酶链式反应(iPCR)以及逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)，等等。其它检测形式包括Northern印迹，Southern印迹、PCR测序、抗体步骤例如ELISA、Western印迹和免疫组化。特别有用的检测包括了固定化寡聚核苷酸或者寡肽介导的检测系统所需的药剂和组分。
一项特别有用的核酸检测系统是反向杂交技术。在该技术中，使用生物素或者其它配基标记的引物对来自HBV样品的DNA进行扩增，产生标记的扩增子。然后使用固定在固相支持物(例如硝酸纤维素膜)上的寡聚核苷酸通过杂交捕获扩增后的DNA。通过生物素或者配基鉴定特异的核酸片段。一般地，标记的引物对某个要检测的核苷酸变异是特异的。只有存在待测的变异才会出现扩增。有许多形式的反向杂交检测，所有的都包括在本发明中。
本发明涉及的另一方面提供了检测表现出改变免疫组态的HBV变异体的方法，所述方法包含从与核苷或核苷酸类似物或者类似物的组合接触的受试对象中分离HBV，上述类似物选自由下列各项组成的清单：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV，然后将所述HBV与一组一个或者多个HBV表面抗原或其抗体结合片段接触，并筛选结合亲和性或者结合谱的任何改变。
在相关的实施方案中，本发明涉及了检测表现出改变的免疫组态的变异体HBV的方法，所述方法包括从与核苷或核苷酸类似物或者类似物的组合接触的受试对象中分离血清样品，上述类似物选自由下列各项组成的清单：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV，然后将所述血清与HBV表面抗原或其抗体结合片段的组接触，并筛选结合亲和性或者结合谱的任何改变。
在细胞培养中检测HBV复制是特别有用的。
本发明的这个和其它方面特别适于微阵列分析，这样可以鉴定下调HBV基因组序列或者转录物的寡聚核苷酸包括有义和反义分子、RNAi或者siRNA分子或者DNA或RNA结合分子。还可以使用微阵列分析鉴定HBV基因组内特殊的突变，例如在HBV DNA聚合酶编码区域内或者HBsAg编码区域内的突变。
本发明的另一个方面涉及了检测对HBV显示抑制活性的物质的方法，
制备包含复制活性有效量的HBV基因组的基因构建体，包含于质粒载体中，然后使用所述构建体转染所述细胞，
使用待测物质在转染前、转染中和/或转染后与细胞接触，
在足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或类病毒颗粒的条件下培养细胞一段时间(如果对所述物质有抗性的话)；以及
使用病毒或病毒组分检测的方法确定在细胞、细胞裂解物或培养物上清液体中病毒是否在所述物质存在下已经复制、表达遗传物质和/或组装和/或被释放。
在优选的实施方案中，质粒载体可以包括编码部分或者全部其它病毒载体例如杆状病毒载体或腺病毒载体的基因(参见Ren andNassal，2001，见前)，该方法包括：
制备包含复制活性有效量的HBV基因组的基因构建体(包含或者融合在一定量的杆状病毒基因组或者腺病毒基因组中)，其能够有效感染细胞，然后使用所述构建体感染所述细胞；
使用待测物质在感染前、感染中和/或感染后与细胞接触；
在足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或类病毒颗粒的条件下培养细胞一段时间(如果对所述物质有抗性的话)；以及
使用病毒或病毒组分检测的方法确定在细胞、细胞裂解物或培养物上清液体中病毒是否在所述物质存在下已经复制、表达遗传物质和/或组装和/或被释放。
在另一个实施方案中，该方法包括：
制备包含复制活性有效量的HBV基因组感染性拷贝的连续细胞系，使所述感染性HBV基因组稳定整合在所述连续细胞系(例如但是不止限于2.2.15或AD细胞系)中；
使用待测物质与细胞接触；
在足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或类病毒颗粒的条件下培养细胞一段时间(如果对所述物质有抗性的话)；以及
然后使用病毒或病毒组分检测的方法确定在细胞、细胞裂解物或培养物上清液体中病毒是否在所述物质存在下已经复制、表达遗传物质和/或组装和/或被释放。
以上提到的方法在鉴定HBV变异体或者开发针对HBV变异体的物质中特别有用，上述HBV变异体如那些携带下列突变的变异体：在一个实施方案中，rtT38K，rtR55H和rtA181V；在另一个实施方案中包括rtS/T78S，rtV80L，rtN/S118N，rtN/K139K，rtE142V，rtA/T181ArtI204M，rtQ/P/S/Stop215S，rtE/K218E，rtN/H238H和rtY245H；
在另一个实施方案中包括rtN238T；在另一个实施方案中包括rtI122V和rtA181T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtA/V200V，rtM204V，rtV214A，rtH237H/P，rtV253G；在另一个实施方案中包括rtT128N和rtN236T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtM204V rtQ215S；
在另一个实施方案中包括rtT128S，rtL180M，rtM204V和rtQ215S；
在另一个实施方案中包括rt180L，rtI204M，rtN238T；在另一个实施方案中包括rtN238T/A；在另一个实施方案中包括rtI187V；在另一个实施方案中包括rtN123N/I rtS135Y，rtV214A/V和rtQ215Q/P/Stop/S，或者其组合或者等价突变；在另一个实施方案中，包括sQ30K，sE44G，sA47T，sI126T，sA159V和sL173F，在另一个实施方案中包括sF55S，sC/Stop69C，sC/Y76Y，sI/V110I，sN/T131N，sN134Y，sStop/W172W，sStop/W196W，sS/R207R；在另一个实施方案中包括sV14A，sL95W，sV96G，和sI208T/I；以及在另一个实施方案中包括sT47A和sW172stop，以及在另一个实施方案中包括sPreS2 T6S，sT47A，sP62L，sL/F192F，sI195M，以及在另一个实施方案中包括sS53L，以及在另一个实施方案中包括sP120T，以及在另一个实施方案中包括sN40S，sS207R，以及在另一个实施方案中包括sQ101R，sI195M，sS207R，以及在另一个实施方案中包括sL95W和sL196W，以及在另一个实施方案中包括sV14A，在另一个实施方案中包括sL42R，sQ102Q/R，sT115T/S，sS207S/R，sL215R和sL216Stop，或者其组合或者等价突变。
本发明的另一方面产生的是确定HBV毒株是否表现出对核苷或核苷酸类似物或者其它潜在的抗HBV物质敏感性降低的方法，所述方法包括从所述HBV中分离DNA或者对应的mRNA，然后筛选编码衣壳基因或者DNA聚合酶基因的核苷酸序列中的突变，突变选自，在一个实施方案中，rtT38K，rtR55H和rtA181V；在另一个实施方案中包括rtS/T78S，rtV80L，rtN/S118N，rtN/K139K，rtE142V，rtA/T181ArtI204M，rtQ/P/S/Stop215S，rtE/K218E，rtN/H238H和rtY245H；在另一个实施方案中包括rtN238T；在另一个实施方案中包括rtI122V和rtA181T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtA/V200V，rtM204V，rtV214A，rtH237H/P，rtV253G；在另一个实施方案中包括rtT128N和rtN236T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtM204V rtQ215S；在另一个实施方案中包括rtT128S rtL180M，rtM204V和rtQ215S；在另一个实施方案中包括rt180L，rtI204M，rtN238T；在另一个实施方案中包括rtN238T/A；在另一个实施方案中包括rtI187V；在另一个实施方案中包括rtN123N/I rtS135Y，rtV214A/V和rtQ215Q/P/Stop/S，或者其组合或者等价突变；在一个实施方案中，sQ30K.sE44G，sA47T，sI126T，sA159V和sL173F，在另一个实施方案中包括sF55S，sC/Stop69C，sC/Y76Y，sI/V110I，sN/T131N，sN134Y，sStop/W172W，sStop/W196W，sS/R207R；在另一个实施方案中包括sV14A，sL95W，sV96G，和sI208T/I；以及在另一个实施方案中包括sT47A和sW172stop，以及在另一个实施方案中包括sPreS2 T6S，sT47A，sP62L，sL/F192F，sI195M，以及在另一个实施方案中包括sS53L，以及在另一个实施方案中包括sP120T，以及在另一个实施方案中包括sN40S，sS207R，以及在另一个实施方案中包括sQ101R，sI195M，sS207R，以及在另一个实施方案中包括sL95W和sL196W，以及在另一个实施方案中包括sV14A，在另一个实施方案中包括sL42R，sQ102Q/R，sT115T/S，sS207S/R，sL215R和sL216Stop，或者其组合或者一个或更多的其它突变，突变指示了对下列各项表现出降低敏感性的变异体的存在：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；和/或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合。
对DNA聚合酶的氨基酸变异体的检测可以通过一系列氨基酸检测技术方便地完成。如果HBV变异体包含氨基酸改变，则这样的分离物被认为是具有改变了的DNA聚合酶活性的推测的HBV变异体。
本发明还涉及了抑制对下列各项有抗性的HBV变异体的物质：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；或ADV和FTC和LMV和TFV。如果临床医生考虑使用ADV，LMV，FTC和/或TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物(例如TFV)进行长期治疗，则上述这些物质是特别有用的。这些物质可以是DNA或者RNA或者蛋白或者非蛋白的化学分子。天然产物的筛选例如来自植物、珊瑚和微生物的天然产物也被认为是同组合文库或者化学文库筛选一样有用的掩蔽剂的潜在来源。这些物质可以以分离的形式或者以药物组合物或配方的形式存在，可以代替核苷或核苷酸类似物给药，或者与核苷或核苷酸类似物顺序或同时给药。此外，还涉及了合理药物设计，包括解析例如HBV DNA聚合酶的晶体或NMR结构，以及设计可以与酶的活性位点结合的物质。这个方法也可以适合于其它的HBV组分。
因此，本发明的另一个方面涉及了检测对HBV显示抑制活性的物质的方法，所述HBV对下列各项显示出抗性或者降低的敏感性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合，所述方法包括：
制备包含复制活性有效量的所述HBV基因组的基因构建体(位于质粒载体中)，然后使用所述构建体转染所述细胞；使用待测物质在转染前、转染中和/或转染后与所述细胞接触；
在足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或类病毒颗粒的条件下培养细胞一段时间(如果对所述物质有抗性的话)；以及
使用病毒或病毒组分检测的方法确定在细胞、细胞裂解物或培养物上清液体中病毒是否在所述物质存在下已经复制、表达遗传物质和/或组装和/或释放。
本发明的另一个方面提供了检测对HBV显示抑制活性的物质的方法，所述HBV对下列各项显示出抗性或者降低的敏感性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；或ADV和FTC和LMY和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合，所述方法包括：
制备包含复制活性有效量的来自所述HBV的基因组(包含或者融合在一定量的杆状病毒基因组中)的基因构建体，其能够有效感染细胞，然后使用所述构建体感染所述细胞；
使用待测物质在感染前、感染中和/或感染后与所述细胞接触；
在足以使HBV复制、表达基因序列和/或组装和/或释放病毒或类病毒颗粒的条件下培养细胞一段时间(如果对所述物质有抗性的话)；以及
使用病毒或病毒组分检测的方法确定在细胞、细胞裂解物或培养物上清液体中病毒是否在所述物质存在下已经复制、表达遗传物质和/或组装和/或被释放。
优选地，HBV基因组稳定地整合在细胞基因组内。
特别有用的细胞是2.2.15细胞(Price等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(21)：8541-8544，1989或者AD细胞(也被称为HepAD32细胞或HepAD79细胞[Ying等人，Viral Hepat.7(2)：161-165，2000].
尽管杆状载体在本发明的实施中特别有用，本发明涉及到一系列其它载体例如但是不止限于腺病毒载体。
本发明还延及携带遗传构建体的细胞系(例如2.2.15或AD细胞)，遗传构建体包含HBV基因组全部或一部分或其一个基因或其一个基因的一部分。
本发明还提供了使用目标HBV变异体筛选抗病毒物质。这些抗病毒物质抑制病毒，术语“抑制”包括拮抗或者阻止感染、复制、组装和/或释放或任何中间步骤。优选的抗病毒物质包括核苷或核苷酸类似物或抗病毒物质。但是，本发明延及非核苷酸分子。
此外，还涉及了合理的药物设计，以鉴定或制备模拟核苷的或者与特定核苷酸序列或特定核苷酸相互作用的化学分子。组合化学以及双杂交筛选是可以用于鉴定潜在治疗或诊断物质的诸多技术中的一些。
在一个实施例中，使用聚合酶或表面抗原的晶体结构或NMR结构合理设计可能与功能和/或抗原性所需的分子的关键区域发生相互作用的小化学分子。这些物质可以用于聚合酶活性的抑制剂和/或可以改变表面抗原上的表位。
由于与HIV的逆转录酶具有相似性，所以已经制备了一些HBV聚合酶的模型(Das等人，J.Virol.75(10)：4771-4779，2001；Bartholomeusz等人，Intervirology 40(5-6)：337-342 1997；Allen等人，Hepatology 27(6)：1670-1677，1998)。HBV聚合酶的模型可以用于对编码抗性突变的HBV以及野生型病毒有效的新型物质进行合理药物设计。设计的合理药物可以基于对已有的抗病毒物质，例如在筛选编码与抗性相关的突变的HBV时使用的物质，进行修饰。表达编码突变的HBV基因组物质的病毒或者克隆可以用于筛选新型抗病毒物质。
在另一个实施方案中，本发明还涉及检测在体外聚合酶检测中对HBV聚合酶表现出抑制活性的物质的方法。可以使用已有的检测测定HBV聚合酶的活性(Gaillard等人，Antimicrob Agents Chemother.46(4)：1005-1013，2002；Xiong等人，Hepatology 28(6)：1669-1673，1998)。
如上面表明的，微阵列技术也是鉴定能够与确定的HBV内部或外部组分相互作用的有用方法。例如，携带不同氨基酸变异体的HBV DNA聚合酶或者其肽片段也可以用于筛选能够与这些分子结合或者相互作用的物质。这是一种测定物质在HBV变异体之间差异结合的便利方式。也可以使用抗体阵列筛选改变的HBsAg分子。微阵列在鉴定能够与HBV组分相互作用的分子例如抗体、干扰素或者细胞因子的蛋白质组分析中也是有用的。也可以利用DNA或RNA分子的微阵列确定位于HBV基因组或者其转录产物上遗传区域的有义和反义分子。
以上的方法在鉴定对下列各项具有抗性的HBV的抑制剂时特别有用：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合。因此，本发明涉及到抑制剂的组合物。抑制剂也可以是抗体或遗传分子的形式例如核酶、用于共抑制或诱导RNAi的反义分子和/或有义分子，或者其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或已知类似物的衍生物。提及RNA i包括提及短的干扰RNA(siRNA)，所有RNA i类型的分子都可以是来自DNA的或者合成的。
术语“组合物”包括“药物组合物”或者配方。
在下面，抑制剂指的是“活性成分”或者“活性化合物”并且可以从上面给出的抑制剂的清单中选择。
组合物可以包括HBV的抗原性组分、缺陷的HBV变异体或者通过天然产物筛选或合理药物设计(包括组合化学)确定的物质。
药物上可接受的载体和/或稀释剂包括任何以及全部的溶剂、分散介质、包被层、抗病毒和抗真菌物质，等渗和吸附延迟物质等等。这些介质和物质在药物活性物质中的使用在本领域内是众所周知的。除非与活性成分不相容的任何常规介质或物质，本发明涉及了它们在治疗性组合物中的使用。也可以在组合物中掺入补充的活性成分。
药物组合物还可以包含遗传分子，例如能够转染靶标细胞的载体，其中的载体携带能够编码天冬氨酰蛋白酶抑制剂的核酸分子。该载体可以是例如病毒载体。
适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液(如果是可溶于水的)以及用于临时制备无菌注射溶液的无菌粉末。它必须在制备和储存的条件下稳定，并且必须防止任何微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或者稀释介质包含，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)、其适宜的混合物和植物油。可以例如使用表面活性剂保持适当的流动性。可以使用各种不同的抗细菌和抗真菌物质例如苯甲酸、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等，抑制微生物的作用。在许多情况下，优选地包括等渗物质例如糖或者氯化钠。可以在组合物中使用延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶，延长注射组合物的吸收。
将所需量的活性化合物掺入到具有活性成分以及选择地其它根据需要的活性成分的适当溶剂中，然后通过过滤除菌或者其它适当的方式除菌，制备无菌的注射用溶液。如果是用于准备无菌注射溶液的无菌粉末，适宜的制备方法包括真空干燥以及冷冻干燥技术，它们产生活性成分以及任何其它所需的成分。
如果活性成分被适当地保护，则可以例如与惰性稀释剂或者与可以吸收的食用载体一同口服给药，或者活性成分可以包在硬的或者软.的明胶胶囊壳中，或者可以压缩为片状。对于口服治疗性给药，活性成分可以与赋形剂混和以可以吸收的片剂、口腔锭、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、封片等等。这些组合物和制剂应当含有1％重量的活性化合物。组合物和制剂的百分比当然可以有所不同，可以方便地占药物单元的大约5％到大约80％重量。在这种治疗有用的组合物中活性化合物的量使得可以获得适宜的剂量。制备根据本发明的优选组合物或者制剂，使口服剂量单位形式包含大约0.1μg和200mg之间的活性化合物。其它的剂量包括从大约1μg到大约1000mg以及从大约10μg到大约500mg。这些剂量可以是每个个体或者每千克体重的剂量。可以按小时、天、星期、月或者年给药。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以含有的组分在这里列出。可以加入粘合剂例如胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或者明胶；赋形剂例如磷酸二钙；崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；以及甜味剂例如蔗糖、乳糖或者糖精或者调味剂例如薄荷油、冬青油或者樱桃香料。如果剂量单位形式是胶囊，则除了以上的物质以外，它还可以含有液体载体。可以存在各种不同的其它物质作为包被物或者修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或者胶囊可以使用虫胶、糖或者二者均使用作为包被。糖浆或者酏剂可以含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖，作为防腐剂的甲基或者丙基苯甲酸酯，染料以及调味剂。当然在制备任何剂量单位形式时使用的任何物质应当是药物纯的，且使用的量是完全无毒的。此外，活性化合物可以掺入到缓释制剂或者配方中。
如上所述，本发明还涉及从这里描述的HBV变异体中分离的HBsAg。更特殊的是，本发明提供了HBsAg或者其重组形式或者其衍生物或化学等价形式。分离的表面组分以及，更为特殊的，分离的表面抗原或者其重组、衍生或化学等价物，在生物组合物例如疫苗配方的开发中是有用的。
本发明的另一方面提供了组合物，组合物包含对下列各项有抗性的HBV变异体：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合；或者来自所述变异体HBV的HBV表面抗原或者其重组或衍生形式或者其化学等价物；以及一种或者更多药物上可以接受的载体和/或稀释剂。这种组合物可以被当做治疗性组合物，在包括体液应答的免疫应答的产生中是有用的。一般地，HBV变异体是“缺陷的”，其自身不能在受试对象中产生持续的感染。
如上表明，可以制备针对突变体HBV物质的抗体，用于针对这些病毒感染的被动免疫或者直接免疫。可以在人或者非人的动物中制备抗体。在后一种情况下，非人的抗体可能需要在使用前去免疫化或者更具体地，人化。去免疫化可以包括，例如，从小鼠或者非人动物的抗HBV抗体上将互补决定区域(CDRs)移植到人的一致片段抗体结合(Fab)多肽上。或者，可以突变在抗体可变区内确定表位的氨基酸，这样表位不再被人的MHC II复合体识别。
至于核酶、反义或共抑制(RNAi)或siRNA或者其复合体，考虑的是抑制，这可以通过转录后基因沉默方便地实现。可以给服DNA或RNA，或者可以使用包含对HBV mRNA特异的RNAi或者其化学类似物的复合体。
所有这些分子都可以掺入到药物组合物中。
在另一个实施方案中，本发明提供了生物组合物，组合物包含了变异体HBV或者来自所述变异体HBV的HBsAg或L、M或S蛋白或者所述变异体HBV的重组或衍生形式或者其化学等价物。
一般地，如果使用HBV，它要首先被减毒。根据本发明这个方面的生物组合物一般地还包含一种或者更多药物上可以接受的载体和/或稀释剂。
生物组合物可以包含来自一种HBV变异体的HBsAg或者类似的分子，或者组合物可以是来自一系列ADV-和/或LMV-和/或，FTC-和/或TFV-抗性的HBV变异体的HbsAg或者L、M或S蛋白或者类似分子组成的鸡尾酒。当组合物包含HBV时可以有类似的包含物。
本发明还涉及缺陷的HBV变异体制备治疗性疫苗的用途，用于免疫接种个体，抵御具有特殊核苷酸序列或者编码特殊聚合酶或表面抗原或L、M或S蛋白的HBV毒株产生的感染。
适宜的疫苗候选毒株的示例是包含选自以下各项突变的HBV变异体的缺陷形式：在一个实施方案中，rtT38K，rtR55H和rtA181V；在另一个实施方案中包括rtS/T78S，rtV80L，rtN/S118N，rtN/K139K，rtE142V，rtA/T181A，rtI204M，rtQ/P/S/Stop215S，rtE/K218E，rtN/H238H和rtY245H；在另一个实施方案中包括rtN238T；在另一个实施方案中包括rtI122V和rtA181T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtA/V200V，rtM204V，rtV214A，rtH237H/P，rtV253G；在另一个实施方案中包括rtT128N和rtN236T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtM204V rtQ215S；在另一个实施方案中包括rtT128S，rtL180M，rtM204V和rtQ215S；在另一个实施方案中包括rt180L，rtI204M，rtN238T；在另一个实施方案中包括rtN238T/A；在另一个实施方案中包括rtI187V；在另一个实施方案中包括rtN123N/I，rtS135Y，rtV214A/V和rtQ215Q/P/Stop/S，或者其组合或者等价突变；在另一个实施方案中，包括sQ30K.sE44G，sA47T，sI126T，sA159V和sL173F，在另一个实施方案中包括sF55S，sC/Stop69C，sC/Y76Y，sI/V110I，sN/T131N，sN134Y，sStop/W172W，sStop/W196W，sS/R207R；在另一个实施方案中包括sV14A，sL95W，sV96G，和sI208T/I；以及在另一个实施方案中包括sT47A和sW172stop，以及在另一个实施方案中包括sPreS2 T6S，sT47A，sP62L，sL/F192F，sI195M，以及在另一个实施方案中包括sS53L，以及在另一个实施方案中包括sP120T，以及在另一个实施方案中包括sN40S，sS207R，以及在另一个实施方案中包括sQ101R，sI195M，sS207R，以及在另一个实施方案中包括sL95W和sL196W，以及在另一个实施方案中包括sV14A，在另一个实施方案中包括sL42R，sQ102Q/R，sT115T/S，sS207S/R，sL215R和sL216Stop，或者其组合或者等价突变。
在一个实施方案中，例如可以鉴定出在其聚合酶中具有特殊突变，使其对核苷酸或者核苷酸类似物具有抗性或者敏感性降低的HBV变异体。可以对该变异体进行突变使其缺陷，即减毒或者不能导致感染。然后这种缺陷的、对核苷或核苷酸类似物有抗性的病毒可以用作治疗性疫苗，抵御在其聚合酶中具有相同突变的有毒力的病毒。
本发明涉及了用于检测针对下列各项的HBV变异体的试剂盒：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；或ADV和FTC和LMV和TFV。这些试剂盒可以例如含有用于PCR或者其它核酸杂交技术的试剂或者基于免疫的检测技术的试剂。特别有用的检测包括试剂以及固定化寡聚核苷酸或者寡肽介导的检测系统所需的组分。
本发明的另一方面涉及了确定HBV对下列各项表现出降低敏感性的潜力的方法：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；或ADV和FTC和LMV和TFV和/或任选地其它核苷或核苷酸类似物或者其它抗HBV物质或者其组合，该方法通过从所述HBV中分离DNA或者对应的mRNA，然后筛选编码HBV DNA聚合酶的核苷酸序列的突变，突变导致在结构域F和G以及结构域A到E或者与它们相邻的区域中的任何一个或者多个中，至少一个氨基酸替换、缺失和/或添加，且突变与对下列各项的抗性或者降低的敏感性有关：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；或ADV和FTC和LMV和TFV，其中这种突变的存在指示了对所述--ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ADV和LMV和TFV；或者ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和FTC；或ADV和FTC和LMV和TFV--的抗性的可能性。
评价病毒变异体的潜力对于选自适当的治疗方案是重要的。这种评价在具有软件编程的计算机的帮助下得到适合地帮助，特别是为与病毒变异体相关的至少两个特性加上了输入编码，以提供对应于病毒变异体对某个化学化合物或免疫物质的抗性或者敏感性的数值。这个数值可以选自(a)对某种化合物或免疫物质表现出抗性或降低的敏感性的能力；(b)由野生型HBV改变了的DNA聚合酶；(c)由野生型HBV改变了的表面抗原；或者(d)患者的发病率或者恢复的潜力。因此，根据本发明，这些特性的数值被储存于可以机读的储存介质中，它能够处理数据，为某个病毒变异体或者包含该病毒变异体的生物样本提供数值。
因此，在另一个方面，本发明涉及的是用于评价病毒变异体或者包含该病毒变异体的生物样本在确定对受试对象适当的治疗方案时可能有用性的计算机程序产品(图3)，所述产品包括：
(1)作为输入编码得到的编码，其为与所述病毒物质或者包含所述物质的生物样本相关的至少两个特性，其中所述特性选自：(a)对某种化合物或免疫物质表现出抗性或降低的敏感性的能力；(b)由野生型HBV改变了的DNA聚合酶；(c)由野生型HBV改变了的表面抗原；或者(d)患者的发病率或者恢复的潜力；
(2)将所述输入编码相加的编码，以提供一个总和，相应于所述变异体或生物样品的数值；以及
(3)储存编码的计算机可阅读的介质。
在相关的方面，本发明涉及的是用于评价病毒变异体或者包含该病毒变异体的生物样品在受试对象中的可能有用性的计算机，其中所述计算机包含：
(1)可以机读的，包含由可以机读的数据编码的数据储存物质的数据储存介质，其中所述可以机读的数据包含与所述病毒变异体或生物样品相关的至少两个特性的输入编码；其中所述特性选自：(a)对某种化合物或免疫物质表现出抗性或降低的敏感性的能力；(b)对于野生型HBV改变了的DNA聚合酶；(c)对于野生型HBV改变了的表面抗原；或者(d)患者的患病率或者恢复的潜力；
(2)用于储存处理所述可机读数据的指令的工作内存；
(3)与所述工作内存以及所述可机读数据储存介质偶联的中央处理单元，用于处理所述可机读数据，以提供一个总和，相应于所述化合物的数值；以及
(4)与所述中央处理单元偶联的输出硬件，用于接收所述数值。
本发明涉及任何一般或特殊用途的计算机系统，它包括与内存和至少一个输入/输出装置通过电联系的处理器，例如终端。图3显示了一般适宜的计算机系统。这种系统包括，但是不止限于，个人计算机、工作站或者主机。处理器可以是一般用途的处理器或者微处理器或者特化的执行位于RAM内存中的程序。程序可以从储存装置，例如磁盘或者程序前的ROM内存中置于RAM中。在一个实施方案中RAM内存用于数据储存和程序执行。计算机系统也包括处理器和内存位于不同物理实体中通过网络进行电连接的系统。
在另一个实施方案中，程序筛选的突变选自：在一个实施方案中，rtT38K，rtR55H和rtA181V；在另一个实施方案中包括rtS/T78S，rtV80L，rtN/S118N，rtN/K139K，rtE142V，rtA/T181A，rtI204M，rtQ/P/S/Stop215S，rtE/K218E，rtN/H238H和rtY245H；在另一个实施方案中包括rtN238T；在另一个实施方案中包括rtI122V和rtA181T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtA/V200V，rtM204V，rtV214A，rtH237H/P，rtV253G；在另一个实施方案中包括rtT128N和rtN236T；在另一个实施方案中包括rtL180M，rtM204V rtQ215S；在另一个实施方案中包括rtT128S rtL180M，rtM204V和rtQ215S；在另一个实施方案中包括rtI80L，rtI204M，rtN238T；在另一个实施方案中包括rtN238T/A；在另一个实施方案中包括rtI187V；在另一个实施方案中包括rtN123N/I rtS135Y，rtV214A/V和rtQ215Q/P/Stop/S，或者其组合或者等价突变；在另一个实施方案中，包括sQ30K.sE44G，sA47T，sI126T，sA159V和sL173F，在另一个实施方案中包括sF55S，sC/Stop69C，sC/Y76Y，sI/V110I，sN/T131N，sN134Y，sStop/W172W，sStop/W196W，sS/R207R；在另一个实施方案中包括sV14A，sL95W，sV96G，和sI208T/I；以及在另一个实施方案中包括sT47A和sW172stop，以及在另一个实施方案中包括sPreS2 T6S，sT47A，sP62L，sL/F192F，sI195M，以及在另一个实施方案中包括sS53L，以及在另一个实施方案中包括sP120T，以及在另一个实施方案中包括sN40S，sS207R，以及在另一个实施方案中包括sQ101R，sI195M，sS207R，以及在另一个实施方案中包括sL95W和sL196W，以及在另一个实施方案中包括sV14A，在另一个实施方案中包括sL42R，sQ102Q/R，sT115T/S，sS207S/R，sL215R和sL216Stop，或者其组合或者等价突变。
通过以下非限制性的实施例对本发明进行进一步描述。
实施例1 HBV的重叠基因组
图1表示了HBV的重叠基因组。编码DNA聚合酶(P)的基因与病毒衣壳基因Pre-S1和Pre-S2重叠，与X和核心(C)基因部分重叠。HBV衣壳包含小、中和大的蛋白HBV表面抗原。大的蛋白组分被称为HBV表面抗原(HBsAg)，由S基因序列编码。Pre-S1和Pre-S2基因序列编码其它衣壳组分。
实施例2进行ADV治疗的患者以及HBV DNA的分析
患者A：在ADV治疗中，通过测序检测出独特的HBV突变(表4)。这包括在rtT38K，和rtA181V的独特突变。在聚合酶rtR55H和重叠的衣壳基因中还检测到许多其它改变(表4，图4，5和6)。在HBsAg中的改变包括sQ30K，sE44G，sA47T，sI126T，sA159V和sL173F。这些独特改变与七个基因型分别为A-G的参考序列的每一个以及与来自处理前样品的一致序列进行比较，以确定独特改变。
患者B：在ADV治疗过程中的HBV突变列于表5和图7，8和9。在HBV DNA聚合酶的rt区域中的独特改变包括rtY245H。在ADV治疗过程中HBV聚合酶的其它改变包括rtS/T78S，rtV80L，rtN/S118N，rtN/K139K，rtE142V，rtA/T181A，rtI204M，rtQ/P/S/Stop215S，rtE/K218E，rtN/H238H。在ADV治疗过程中HBsAg中的改变包括sF55S，sC/Stop69C，sC/Y76Y，sI/V110I，sN/T131N，sN134Y，sStop/W172W，sStop/W196W，sS/R207R。
患者C：ADV治疗前和ADV治疗过程中的HBV突变列在表6和图10，11和12中。在ADV治疗过程中HBV DNA聚合酶的rt区域中的独特改变包括rtN238T。HBsAg中的独特改变包括sV14A，sL95W，sV96G，和sI208T/I。
患者D：ADV治疗过程中的HBV突变列在表7和图13，14和15中。HBV DNA聚合酶的独特改变包括rtI122V和rtA181T。表面抗原的独特改变包括sT47A和sW172stop。
患者E：该患者以前使用拉米夫定进行治疗，在拉米夫定治疗时选择出了独特突变rtH237H/P。该患者对ADV治疗没有反应。在ADV治疗时聚合酶中的改变包括rtL180M，rtA/V200V，rtM204V，rtV214A，rtH237H/P和rtV253G。表面抗原的独特改变包括PreS2T6S，sT47A，sP62L，sL/F192F，sI195M。注意：患者使用TFV治疗有反应。
使用ADV治疗产生的改变列在表8和图16，17和18中。
患者F：在ADV治疗中的独特改变包括rtN238T的聚合酶突变和sS53L的衣壳突变。使用ADV治疗产生的改变列在表9和图19，20和21中。
患者G：在ADV治疗中的独特突变包括rtT128N和rtN236T的聚合酶改变和sP120T的衣壳突变。使用ADV治疗产生的改变列在表10和图22，23和24中。
患者H：在ADV治疗时的聚合酶中的突变包括rtL180M，rtM204VrtQ215S。衣壳基因的改变包括sN40S，sS207R。使用ADV治疗产生的改变列在表11和图25，26和27中。
患者I：在ADV治疗时的聚合酶中的突变包括rtT128S，rtL180M，rtM204V和rtQ215S，而衣壳基因中的突变包括sQ101R，sI195M，sS207R。使用ADV治疗产生的改变列在表12和图28，29和30中。
患者J：在ADV治疗中聚合酶中的突变包括rtI80L，rtI204M，rtN238T，而衣壳中的突变包括sL95W和sL196W。使用ADV治疗产生的改变列在表13和图31，32和33中。
患者K：在ADV治疗中检测到了rtN238T/A处聚合酶的突变。在治疗中没有检测出衣壳中的改变。使用ADV治疗产生的改变列在表14和图34，35和36中。
患者L：在ADV治疗中检测到了rtI187V处聚合酶的突变。检测出衣壳基因中的突变是sV14A。使用ADV治疗产生的改变列在表15和图37，38和39中。
患者M是HIV和HBV共感染的患者，使用泰诺福韦和拉米夫定治疗作为抗逆转录病毒HIV治疗的一部分。这两种物质在HBV的治疗中也是有用的。该患者没有使用ADV治疗过。在病人进行抗病毒治疗时对三个顺序样品进行测序。在一个样品中检测到的聚合酶中的独特改变位于rtN123N/I，rtS135Y，和rtQ215Q/P/stop/S。检测到在衣壳基因中的独特改变位于sL42R，sQ102Q/R，sT115T/S。这些改变列在表16和图40，41和42中。剩下的两个样品的聚合酶和衣壳9(HBsAg)基因是相同的。在使用TFV和LMV治疗时，检测到的聚合酶中的独特改变位于rtS135Y和rtV214A/V和rtS207S/R，检测到在衣壳基因中的独特改变位于sQ102Q/R，sL215R和sL216Stop。这些改变列在表16和图43，44和45中。
以前在ADV治疗的患者中曾检测出改变rtQ215Q/P/Stop/S和rtV214A/V。因此，这些突变是重要的突变，并且可以导致产生可能的对ADV和TFV的交叉抗性。
实施例3病毒标记的检测
使用商品化可获得的免疫检测(Abbott Laboratories，NorthChicago，IL，USA)对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，乙型肝炎e抗原(HBeAg)，抗-HBe和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)特异的IgG和IgM进行了测定。
根据生产商的说明书(Digene Hybrid Capture II，DigeneDiagnostics Inc.，Beltsville，MD)，使用捕获杂交检测乙型肝炎病毒DNA的水平。对临床样本中HBV病毒血症的检测，生产商说明的阈值是0.7×106拷贝/ml或者2.5pg/ml，[Hendricks等人，Am JClin Pathol 104：537-46，1995]。还可以使用其它商品化的试剂盒例如Cobas amplification HBV monitor kit(Roche)对HBV的DNA水平进行定量。
实施例4 HBV DNA的测序
根据Aye等人，J.Hepatol.26：1148-1153，1997的描述从100μl血清中提取HBV DNA。由Geneworks，Adelaide，澳大利亚合成寡聚核苷酸。Aye等人，1997，见前，已经描述了HBV聚合酶基因的扩增。
使用来自MO BIO Laboratories Inc(La Jolla，CA)的PCR纯化层析柱对特异的扩增产物进行纯化并用Big Dye terminator循环测序仪试剂盒(PE，Cetus Norwalk，CT)。PCR引物用作测序引物，OS15′-GCCTCA TTT TGT GGG TCA CCA TA-3′(nt1408-1430)[SEQ ID NO：3]，TTA3 5′-AAA TTC GCA GTC CCC AAA-3′(nt 2128-2145)[SEQ ID NO：4]，JM 5′-TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT-3′(nt 1676-1696)[SEQID NO：5]，TTA4 5′-GAA AAT TGG TAA CAG CGG-3′(nt 2615-2632)[SEQ ID NO：6]，OS2 5′TCT CTG ACA TAC TTT CCA AT 3′(nt 2798-2817)[SEQ ID NO：7]，对PCR产物的内部区域进行测序。
实施例5阿德福韦酯(ADV)
ADV(以前称为Bis-pom PMEA))是HBV复制的有效抑制剂。图2显示了ADV的结构，其合成在Benzaria等人，J Med Chem.39：4958-4965，1996中有所描述。
本领域内的技术人员理解，除了那些特别描述的，这里描述的本发明可以进行改动和调整。应当理解本发明包括了所有这些改动和调整。本发明还包括在说明中分别或者共同提及或者指示的所有步骤、特性、组合物和化合物，以及任何两个或者更多所述步骤或特性的任何和全部组合。
表4  患者A在ADV治疗过程中HBV聚合酶和衣壳的突变
 治疗 日期  HBV病毒载量 HBV    RT突变  HBsAg突变
 ADV 22/10/02  8.77E+06 -  sT47AsT131T/I
 ADV 14/01/03  1.21E+09 -  -
 ADV 8/7/03  7.92E+07 rtT38KrtA181V  sL173F
表5  患者B在ADV治疗过程中检测到的RT和聚合酶的突变
治疗  日期     HBV RT突变     HBsAg突变
ADV  13/02/03     rtV80L-rtN118N/SrtN139N/K-rtV142ErtA181A/TrtI204MrtQ/P/S/Stop215QrtE218K/ErtN238N/H     -sC76Y/CsI110V/IsN131N/TsY134NsW172Stop/WsStop196WsR/S207S
 ADV  21/03/03     rtS78T/SrtV80L-rtN118N/SrtN139N/K-rtV142ErtA181A/T-rtI204MrtQ215Q/P/S/StoprtE218K/ErtN238N/H     sS55FsC69Stop-sC76Y/CsI110V/IsN131N/T-sY134NsW172Stop/WsStop/W196WsS207S/R
 ADV   22/07/03     rtS/T78SrtV80LrtN/S118NrtN/K139K-rtE142VrtA/T181A-rtI204MrtQ/P/S/Stop21rt5SE/K218ErtN/H238HrtY245H     sF55SsC/Stop69CsC/Y76YsI/V110IsN/T131N-sN134YsStop/W172WsStop/W196WsS/R207R
表6  患者C在ADV治疗过程中检测到的HBV聚合酶和衣壳的突变
  治疗   日期   HBV    RT突变   HBsAg突变
  ADV   18/08/03   rtN238T   sV14AsL95WsV96GsI208T/I
表7  患者D在ADV治疗过程中检测到的HBV聚合酶和衣壳的突变
  治疗   日期   HBV    RT突变   HBsAg突变
  ADV   20/08/03   rtI22VrtA181T   sT47AsW172Stop
表8  患者E在ADV治疗过程中检测到的HBV聚合酶和衣壳的突变
  治疗   日期     HBV    RT突变  HBsAg突变
  LMV   23/05/02     rtL180MrtA200V/ArtM204VrtV214ArtP237H  -sL192L/FsI195M
 ADV  17/07/03     --rtL180MrtA/V200VrtM204VrtV214ArtH237H/PrtV253G  PreS2 T6SsT47AsP62LsL/F192FsI195M
表9  患者F在ADV治疗过程中检测到的HBV聚合酶和衣壳的突变
  治疗   日期 HBV    RT突变 HBsAg突变
  ADV   16/10/03 rtN238T sS53L
表10  患者G在ADV治疗过程中检测到的HBV聚合酶和衣壳的突变
治疗  日期  HBV    RT突变 HBsAg突变
ADV  12/11/03  rtT128NrtN236T sP120T
表11  患者H在ADV治疗过程中检测到的HBV聚合酶和衣壳的突变
    治疗   日期     HBV    RT突变    HBsAg突变
    ADV   05/11/03     rtL180MrtM204VrtQ215S    sN40SsI195MsS207R
表12  患者I在ADV治疗过程中检测到的HBV聚合酶和衣壳的突变
  治疗   日期     HBV    RT突变  HBsAg突变
  ADV   05/02/03     -rtT128SrtL180MrtM204VrtQ215S-  sQ101R--sI195M-sS207R
表13  患者J在ADV治疗过程中检测到的HBV聚合酶和衣壳的突变
治疗  日期     HBV    RT突变    HBsAg突变
ADV  18/11/03     rtI80L-rtI204MrtN238T    -sL95WsL196W-
表14  患者K在ADV治疗过程中检测到的HBV聚合酶和衣壳的突变
治疗 日期  HBV    RT突变  HBsAg突变
ADV 31/03/03  rtN238T/A  No changes
表15  患者L在ADV治疗过程中检测到的HBV聚合酶和衣壳的突变
治疗 日期 HBV    RT突变  HBsAg突变
ADV 17/09/03 rtI187V  sV14A
表16  患者M在TFV和LMV治疗过程中检测到的HBV聚合酶和衣壳的突变
治疗  日期 病毒载量copie/ml  HBV    RT突变  HBsAg突变
TFV LMV  18/06/04 2.76E+06  ---rtN123N/IrtS135YrtQ215Q/P/stop/S  sL42R，sQ102Q/R，sT115T/SsS207S/R
TFV LMV  9/7/04 4.31E+07  -rtS135YrtV214A/V--  sQ102Q/R--sL215RsL216*.
TFV LMV  22/08/04 ＞1.00E+08  -rtS135YrtV214A/V--  sQ102Q/R--sL215RsL216*.
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Claims (2)

1.确定HBV变异体对阿德福韦酯(ADV)表现出降低敏感性的潜力的方法，所述方法包括从所述HBV变异体中分离DNA或者对应的mRNA，然后筛选编码HBV变异体DNA聚合酶的逆转录酶(rt)组分的核苷酸序列的突变，突变导致在氨基酸237位点处的组氨酸(H)至脯氨酸(P)的替换，即rtH237P，其中rtH237P变异体的存在或rtH237P和rtH237H病毒的混合的存在指示了对所述ADV具有抗性。
2.HBV变异体在筛选或开发或设计能够抑制HBV的感染、复制或释放的物质中的用途，其中所述HBV变异体包含DNA聚合酶中rt部分的rtH237P突变，或rtH237P和rtH237H的混合。
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