JP2002355098A - Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型分類方法並びにそのためのプライマー及びプローブ - Google Patents
Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型分類方法並びにそのためのプライマー及びプローブInfo
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- JP2002355098A JP2002355098A JP2001246141A JP2001246141A JP2002355098A JP 2002355098 A JP2002355098 A JP 2002355098A JP 2001246141 A JP2001246141 A JP 2001246141A JP 2001246141 A JP2001246141 A JP 2001246141A JP 2002355098 A JP2002355098 A JP 2002355098A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型を簡便な操作で
判定する方法を提供する。 【解決手段】 Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子型を判別する方
法において、ウイルス遺伝子中のPreS1遺伝子のnt2902
からnt3091領域を特定のプライマーセットを用いて増幅
し、それぞれＡからＧの遺伝子型プローブと特異的にハ
イブリダイズさせることにより、遺伝子型を分類する方
法を提供する。
判定する方法を提供する。 【解決手段】 Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子型を判別する方
法において、ウイルス遺伝子中のPreS1遺伝子のnt2902
からnt3091領域を特定のプライマーセットを用いて増幅
し、それぞれＡからＧの遺伝子型プローブと特異的にハ
イブリダイズさせることにより、遺伝子型を分類する方
法を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス
（以下、「HBV」と略する）の遺伝子型を判定するため
の方法に関する。
（以下、「HBV」と略する）の遺伝子型を判定するため
の方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】HBVは、その全塩基配列の相違差より、
Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，及びＧの７種類の遺伝子型に
分類される（Okamoto H. et al., J. Gen. Virol. 69,
2575-2583, 1988；Norder H. et al., Virology 198, 4
89-503, 1994；及びStuyver L.et al., J. Gen. Virol.
81, 67-74, 2000）。その分類方法は、血清中よりHBV
ウイルス遺伝子を抽出、精製し、全配列または一部配列
をダイデオキシ法により直接（ダイレクトシークエンス
法）もしくはサブクローニング後、塩基配列を決定し、
既知の遺伝子型配列と比較することにより遺伝子型を判
定する方法、RFLP法（Lindh M. et al., J. Virologica
l Methods 72, 163-174, 1998；及びMizokami M. et a
l., FEBS letter 450, 66-71, 1999）及びELISA法（Usu
da S. et al., J. Virological Methods 80, 97-112, 1
999）等がある。
Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，及びＧの７種類の遺伝子型に
分類される（Okamoto H. et al., J. Gen. Virol. 69,
2575-2583, 1988；Norder H. et al., Virology 198, 4
89-503, 1994；及びStuyver L.et al., J. Gen. Virol.
81, 67-74, 2000）。その分類方法は、血清中よりHBV
ウイルス遺伝子を抽出、精製し、全配列または一部配列
をダイデオキシ法により直接（ダイレクトシークエンス
法）もしくはサブクローニング後、塩基配列を決定し、
既知の遺伝子型配列と比較することにより遺伝子型を判
定する方法、RFLP法（Lindh M. et al., J. Virologica
l Methods 72, 163-174, 1998；及びMizokami M. et a
l., FEBS letter 450, 66-71, 1999）及びELISA法（Usu
da S. et al., J. Virological Methods 80, 97-112, 1
999）等がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記のような従来のHB
V遺伝子塩基配列決定法は、検体入手から判定まで数日
を要し、時間がかかる上、大変繁雑かつ熟練を要する作
業が含まれている。また、経済的負担も大きいため、多
数検体の処理には向いていない。さらに、上記のダイレ
クトシークエンス法、制限酵素を使用するRFLP法やモノ
クローナル抗体を使用するELISA法では、複数の遺伝子
型のウイルスが混在する状態では判定が難しく、遺伝子
型を誤って判定する可能性があるため欠点を有する。
V遺伝子塩基配列決定法は、検体入手から判定まで数日
を要し、時間がかかる上、大変繁雑かつ熟練を要する作
業が含まれている。また、経済的負担も大きいため、多
数検体の処理には向いていない。さらに、上記のダイレ
クトシークエンス法、制限酵素を使用するRFLP法やモノ
クローナル抗体を使用するELISA法では、複数の遺伝子
型のウイルスが混在する状態では判定が難しく、遺伝子
型を誤って判定する可能性があるため欠点を有する。
【０００４】そこで、本発明者等は、検体入手から判定
までが１日で終了し、シークエンサー等の特別かつ高価
な装置、及び熟練を要する技術なしに実施でき、感度及
び特異性が高く、そして混合感染の場合にも互いの遺伝
子型の存在比率がある一定の範囲内であれば両者共に検
出可能な、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型の判定方法を提
供するべく研究を行った。
までが１日で終了し、シークエンサー等の特別かつ高価
な装置、及び熟練を要する技術なしに実施でき、感度及
び特異性が高く、そして混合感染の場合にも互いの遺伝
子型の存在比率がある一定の範囲内であれば両者共に検
出可能な、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型の判定方法を提
供するべく研究を行った。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、Ｂ型肝炎
ウイルスの遺伝子型の判定方法において、HBVゲノム遺
伝子の一定領域、すなわちPreS1遺伝子のnt2902からnt3
091領域の増幅に特定のプライマーセットを用いるこ
と、ハイブリダイゼーションにおいて遺伝子型特異的プ
ローブを用いること、さらに、増幅産物が各々の型特異
的プローブにハイブリダイズするか否かを検出すること
で、短時間の簡易な操作で、遺伝子型を正確に判定する
方法を見い出し、本発明を完成するに至った。
ウイルスの遺伝子型の判定方法において、HBVゲノム遺
伝子の一定領域、すなわちPreS1遺伝子のnt2902からnt3
091領域の増幅に特定のプライマーセットを用いるこ
と、ハイブリダイゼーションにおいて遺伝子型特異的プ
ローブを用いること、さらに、増幅産物が各々の型特異
的プローブにハイブリダイズするか否かを検出すること
で、短時間の簡易な操作で、遺伝子型を正確に判定する
方法を見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
【発明の実施の形態】遺伝子領域の増幅及びプライマー
の設定 本発明の目的のためには、まず、HBVの遺伝子型間相違
率の高い遺伝子領域を増幅しておくことが望ましい。増
幅方法はPCRが一般的であり、以下の記載はPCRプライマ
ーに関するが、これに限定されない。
の設定 本発明の目的のためには、まず、HBVの遺伝子型間相違
率の高い遺伝子領域を増幅しておくことが望ましい。増
幅方法はPCRが一般的であり、以下の記載はPCRプライマ
ーに関するが、これに限定されない。
【０００７】分析対象である鋳型HBV遺伝子は、HBV感染
者からの血清、組織等より抽出、精製したものを用いる
ことができる。HBVは比較的変異の多いウイルスである
ことから、プライマー設定位置は、HBV遺伝子型間で保
存性の高い部位を使用することが望ましい。また、PCR
の増幅効率や特異性は、プライマー設定位置やプライマ
ーの配列にも依存することから、PCR増幅効率が良く、
且つ特異性の高い部分にプライマーを設定する必要があ
る。また、増幅の際に、遺伝子型間で増幅効率に大きな
差があってはその時点でセレクションがかかってしま
い、ハイブリダイズによる遺伝子型判別で正しい結果が
得られない可能性がある。
者からの血清、組織等より抽出、精製したものを用いる
ことができる。HBVは比較的変異の多いウイルスである
ことから、プライマー設定位置は、HBV遺伝子型間で保
存性の高い部位を使用することが望ましい。また、PCR
の増幅効率や特異性は、プライマー設定位置やプライマ
ーの配列にも依存することから、PCR増幅効率が良く、
且つ特異性の高い部分にプライマーを設定する必要があ
る。また、増幅の際に、遺伝子型間で増幅効率に大きな
差があってはその時点でセレクションがかかってしま
い、ハイブリダイズによる遺伝子型判別で正しい結果が
得られない可能性がある。
【０００８】よって、本発明の好ましい態様において
は、ゲノム上の領域：ヌクレオチド番号（nt）2902−29
24に相当する、配列番号１：5'-acc aat cct ctg gga t
tc ttc cc-3'、配列番号２：5'-acc aac cct ctg gga t
tc ttt cc-3'、配列番号３：5'-agc aat cct cta gga t
tc ctt cc-3'又は配列番号15：5'-ccc aat cct ctg ggc
ttc ctg cc-3'の何れかのセンスプライマー、及びゲノ
ム上の領域：nt3091−3073に相当する、配列番号４：5'
-gag cct gag ggc tcc acc c-3'又は配列番号５：5'-gt
g cyt gag ggc tcc acc c-3'（yはt，u又はc）の何れか
のアンチセンスプライマーからなるプライマーセットを
用いることが、より好ましい（図１）。
は、ゲノム上の領域：ヌクレオチド番号（nt）2902−29
24に相当する、配列番号１：5'-acc aat cct ctg gga t
tc ttc cc-3'、配列番号２：5'-acc aac cct ctg gga t
tc ttt cc-3'、配列番号３：5'-agc aat cct cta gga t
tc ctt cc-3'又は配列番号15：5'-ccc aat cct ctg ggc
ttc ctg cc-3'の何れかのセンスプライマー、及びゲノ
ム上の領域：nt3091−3073に相当する、配列番号４：5'
-gag cct gag ggc tcc acc c-3'又は配列番号５：5'-gt
g cyt gag ggc tcc acc c-3'（yはt，u又はc）の何れか
のアンチセンスプライマーからなるプライマーセットを
用いることが、より好ましい（図１）。
【０００９】但し、各遺伝子型間で増幅効率に偏りが生
じなければ、上記の特定のプライマーの長さを適宜短く
して組み合わせ得ることは理解されるべきである。遺伝
子型間の増幅効率差を少なくし、増幅効率を上げるため
には、上記の各々のプライマーの増幅反応中の濃度を適
宜に調整し、また、PCR増幅反応溶液中に、ジメチルス
ルフォキシド（Dimethyl sulfoxide：DMSO）、グリセロ
ール等を添加することが好ましい。
じなければ、上記の特定のプライマーの長さを適宜短く
して組み合わせ得ることは理解されるべきである。遺伝
子型間の増幅効率差を少なくし、増幅効率を上げるため
には、上記の各々のプライマーの増幅反応中の濃度を適
宜に調整し、また、PCR増幅反応溶液中に、ジメチルス
ルフォキシド（Dimethyl sulfoxide：DMSO）、グリセロ
ール等を添加することが好ましい。
【００１０】PCR増幅産物の検出のためには、予め増幅
反応に使用するすべてのアンチセンスプライマーを標識
しておくことが好ましい。標識体は、分子量が小さく、
比較的安定であり、且つ特異的検出が可能な物質が好ま
しく、例えばビオチン、ジニトロフェニル（DNP）、ジ
ゴキシゲニン（DIG）又は蛍光物質、例えばFITC、Cy5等
であるが、これらに限定されない。
反応に使用するすべてのアンチセンスプライマーを標識
しておくことが好ましい。標識体は、分子量が小さく、
比較的安定であり、且つ特異的検出が可能な物質が好ま
しく、例えばビオチン、ジニトロフェニル（DNP）、ジ
ゴキシゲニン（DIG）又は蛍光物質、例えばFITC、Cy5等
であるが、これらに限定されない。
【００１１】増幅産物はアルカリ変性させて１本鎖とし
たのち、遺伝子型特異的な各プローブとハイブリダイズ
させる。遺伝子型特異的プローブ Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，及びＧの７種類の遺伝子型に
特異的な配列からなる７種類のプローブセットを用意す
る。
たのち、遺伝子型特異的な各プローブとハイブリダイズ
させる。遺伝子型特異的プローブ Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，及びＧの７種類の遺伝子型に
特異的な配列からなる７種類のプローブセットを用意す
る。
【００１２】本発明の目的によれば、以下の遺伝子型特
異的プローブ：配列番号６：5'-acc cca tca agg acc a
c-3'（Ａ型のnt2984−3000）、配列番号７：5'-ctg cat
tca aag cca act-3'（Ｂ型のnt2942−2959）、配列番
号８：5'-caa ccc caa caa gga tc-3'（Ｃ型のnt2982−
2998）、配列番号９：5'-caa tct caa caa gga cac ct-
3'（nt2982−3001）、配列番号10：5'-gac cac aat ccc
aac aaa g-3'（Ｅ型のnt2977−2995）、配列番号11：
5'-aag gac agt tgg cca atg g-3'（Ｆ型のnt2992−301
0）及び配列番号12：5'-aat ccc aaa aag gac cc-3'
（Ｇ型のnt2983−2999）が好ましい（図２）。
異的プローブ：配列番号６：5'-acc cca tca agg acc a
c-3'（Ａ型のnt2984−3000）、配列番号７：5'-ctg cat
tca aag cca act-3'（Ｂ型のnt2942−2959）、配列番
号８：5'-caa ccc caa caa gga tc-3'（Ｃ型のnt2982−
2998）、配列番号９：5'-caa tct caa caa gga cac ct-
3'（nt2982−3001）、配列番号10：5'-gac cac aat ccc
aac aaa g-3'（Ｅ型のnt2977−2995）、配列番号11：
5'-aag gac agt tgg cca atg g-3'（Ｆ型のnt2992−301
0）及び配列番号12：5'-aat ccc aaa aag gac cc-3'
（Ｇ型のnt2983−2999）が好ましい（図２）。
【００１３】さらに、PCR増幅を確認するために、遺伝
子型間で保存性の高い領域の配列を持つPCR増幅確認用
プローブ：配列番号13：5'-agg tag gag cgg gag cat t
cg ggc t-3'（nt3017−3041）及び配列番号14：5'-cca
atg gca aac aag gta gga gtg gga-3'（nt3004−3030）
を用いることができる（図２）。
子型間で保存性の高い領域の配列を持つPCR増幅確認用
プローブ：配列番号13：5'-agg tag gag cgg gag cat t
cg ggc t-3'（nt3017−3041）及び配列番号14：5'-cca
atg gca aac aag gta gga gtg gga-3'（nt3004−3030）
を用いることができる（図２）。
【００１４】プローブは予め遺伝子型別に担体に固相化
しておくことが好ましい。固相化するための担体として
は、マイクロウェルプレート、ビーズなどを用いること
ができるが、これらに限定されない。本法は、型判別を
するために、被検遺伝子と遺伝子型特異的プローブとの
相補性を利用するので、ハイブリダイゼーション反応時
の温度および反応緩衝液組成を最適化しなくてはならな
い。例えば、限定されないが、ハイブリダイゼーション
反応時の温度設定を37℃とし、その温度下でハイブリダ
イゼーションが可能な溶液組成設定を行うことができ
る。本発明の特定の配列を有するプライマー及びプロー
ブを用いた場合、37℃のハイブリダイゼーション温度に
おいては、0.5−0.7M 塩化ナトリウム、0.03−0.05M リ
ン酸二水素ナトリウム 、３−５mM EDTA、及び３-６M
尿素を含む緩衝液中で反応させることにより、最良の結
果が得られる。より好ましくは、0.6M 塩化ナトリウ
ム、0.04M リン酸二水素ナトリウム、４mM EDTA、及び
４M 尿素を含む緩衝液を用いる。
しておくことが好ましい。固相化するための担体として
は、マイクロウェルプレート、ビーズなどを用いること
ができるが、これらに限定されない。本法は、型判別を
するために、被検遺伝子と遺伝子型特異的プローブとの
相補性を利用するので、ハイブリダイゼーション反応時
の温度および反応緩衝液組成を最適化しなくてはならな
い。例えば、限定されないが、ハイブリダイゼーション
反応時の温度設定を37℃とし、その温度下でハイブリダ
イゼーションが可能な溶液組成設定を行うことができ
る。本発明の特定の配列を有するプライマー及びプロー
ブを用いた場合、37℃のハイブリダイゼーション温度に
おいては、0.5−0.7M 塩化ナトリウム、0.03−0.05M リ
ン酸二水素ナトリウム 、３−５mM EDTA、及び３-６M
尿素を含む緩衝液中で反応させることにより、最良の結
果が得られる。より好ましくは、0.6M 塩化ナトリウ
ム、0.04M リン酸二水素ナトリウム、４mM EDTA、及び
４M 尿素を含む緩衝液を用いる。
【００１５】標識体を特異的に検出する方法としては、
標識体と特異的に結合できる、酵素標識した物質（例え
ば、ビオチンであればアビジンもしくはストレプトアビ
ジン、DNP、DIGに対しては各々を認識する抗体の酵素標
識物）を使用して、その酵素活性を発色法、発光法、蛍
光法等により、吸光度計、ルミノメーター、蛍光光度計
にて検出する方法や、標識体が蛍光物質の場合、直接蛍
光標識物質を蛍光光度計にて検出する方法があるが、こ
れらに限定されない。
標識体と特異的に結合できる、酵素標識した物質（例え
ば、ビオチンであればアビジンもしくはストレプトアビ
ジン、DNP、DIGに対しては各々を認識する抗体の酵素標
識物）を使用して、その酵素活性を発色法、発光法、蛍
光法等により、吸光度計、ルミノメーター、蛍光光度計
にて検出する方法や、標識体が蛍光物質の場合、直接蛍
光標識物質を蛍光光度計にて検出する方法があるが、こ
れらに限定されない。
【００１６】標識体の検出を行った結果、標識体が検出
されたウェルでは、そのウェルに固相化されたプローブ
配列に対して、ほぼ相補的な配列を持つ遺伝子が存在し
ていたと判定される。標識体が検出されなかったウェル
では、そのウェルに固相化されたプローブとほぼ相補的
な配列を持った遺伝子が存在しない、もしくは検出感度
以下であると判定される。また複数の遺伝子型が混在し
ている場合は複数のウェルで標識体が検出されることに
なる。
されたウェルでは、そのウェルに固相化されたプローブ
配列に対して、ほぼ相補的な配列を持つ遺伝子が存在し
ていたと判定される。標識体が検出されなかったウェル
では、そのウェルに固相化されたプローブとほぼ相補的
な配列を持った遺伝子が存在しない、もしくは検出感度
以下であると判定される。また複数の遺伝子型が混在し
ている場合は複数のウェルで標識体が検出されることに
なる。
【００１７】以下に実施例を参照して本発明をより具体
的に説明するが、下記実施例は本発明の例示であり、本
発明を限定することを意図しない。
的に説明するが、下記実施例は本発明の例示であり、本
発明を限定することを意図しない。
【００１８】
【実施例】実施例１：HBV感染患者血清より抽出精製し
たHBVの遺伝子型検出 〈鋳型遺伝子の準備〉HBV感染者血清16例（検体番号１
−16）の血清100μLからHBV遺伝子を、プロティナーゼ
Ｋ、フェノール−クロロホルム法（Okamoto H．et a
l.，Virology，64，1298-1303，1990）、または（株）
ゲノムサイエンス研究所製「スマイテストEX-R&D」にて
抽出した。 〈PCR法による遺伝子増幅〉プライマーは、配列表の配
列番号１-５及び15の６種類のプライマーを用いた。生
成するPCR増幅産物を後の操作で検出できるように、予
め、配列番号４及び５のアンチセンスプライマーには、
5’末端にビオチンを標識した。ビオチンの標識は、特
公平３−114319号に記載の方法に従った。
たHBVの遺伝子型検出 〈鋳型遺伝子の準備〉HBV感染者血清16例（検体番号１
−16）の血清100μLからHBV遺伝子を、プロティナーゼ
Ｋ、フェノール−クロロホルム法（Okamoto H．et a
l.，Virology，64，1298-1303，1990）、または（株）
ゲノムサイエンス研究所製「スマイテストEX-R&D」にて
抽出した。 〈PCR法による遺伝子増幅〉プライマーは、配列表の配
列番号１-５及び15の６種類のプライマーを用いた。生
成するPCR増幅産物を後の操作で検出できるように、予
め、配列番号４及び５のアンチセンスプライマーには、
5’末端にビオチンを標識した。ビオチンの標識は、特
公平３−114319号に記載の方法に従った。
【００１９】上記プライマーを使用して下記組成の遺伝
子増幅液100μLを調製し、PCR法により遺伝子増幅を行
った。 15mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0） 20mM 塩化カリウム ３mM 塩化マグネシウム 200μM dNTP（dATP，dTTP，dCTP，及びdGTP） 0.5μM センスプライマー 0.5μM アンチセンスプライマー 25U/mL Taq Gold DNAポリメラーゼ（PEバイオシス
テムズジャパン社製） 10コピー≦ 鋳型遺伝子 上記溶液をサーマルサイクラーPJ-9600（PEバイオシス
テムズジャパン社製）にセットした。PCRの温度条件
は、95℃において10分間インキュベートの後、95℃にお
いて20秒→65℃において10秒→72℃において10秒のサイ
クルを15回、続いて90℃において20秒→60℃において10
秒→72℃において10秒のサイクルを55回繰り返して遺伝
子増幅を行った。その結果、HBVが陽性の場合は、190bp
の増幅産物が得られた。 〈増幅産物の変性〉得られた増幅産物100μLに対して0.
4Mの水酸化ナトリウム溶液100μLを加え、５分間室温で
放置することにより増幅産物のアルカリ変性を行い、２
本鎖DNAを１本鎖にした。 〈ハイブリダイゼーション〉予め、配列番号６-12の遺
伝子型特異的プローブは各々個別に、PCR増幅確認用の
配列番号13及び14のプローブ２本は混合して、それぞれ
固相したマイクロプレートウェルを準備し、各ウェルに
以下に示す組成のハイブリダイゼーション緩衝液を100
μLずつ分注する。
子増幅液100μLを調製し、PCR法により遺伝子増幅を行
った。 15mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0） 20mM 塩化カリウム ３mM 塩化マグネシウム 200μM dNTP（dATP，dTTP，dCTP，及びdGTP） 0.5μM センスプライマー 0.5μM アンチセンスプライマー 25U/mL Taq Gold DNAポリメラーゼ（PEバイオシス
テムズジャパン社製） 10コピー≦ 鋳型遺伝子 上記溶液をサーマルサイクラーPJ-9600（PEバイオシス
テムズジャパン社製）にセットした。PCRの温度条件
は、95℃において10分間インキュベートの後、95℃にお
いて20秒→65℃において10秒→72℃において10秒のサイ
クルを15回、続いて90℃において20秒→60℃において10
秒→72℃において10秒のサイクルを55回繰り返して遺伝
子増幅を行った。その結果、HBVが陽性の場合は、190bp
の増幅産物が得られた。 〈増幅産物の変性〉得られた増幅産物100μLに対して0.
4Mの水酸化ナトリウム溶液100μLを加え、５分間室温で
放置することにより増幅産物のアルカリ変性を行い、２
本鎖DNAを１本鎖にした。 〈ハイブリダイゼーション〉予め、配列番号６-12の遺
伝子型特異的プローブは各々個別に、PCR増幅確認用の
配列番号13及び14のプローブ２本は混合して、それぞれ
固相したマイクロプレートウェルを準備し、各ウェルに
以下に示す組成のハイブリダイゼーション緩衝液を100
μLずつ分注する。
【００２０】 ４× SSPE ４M 尿素 1.0％ ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレー
ト（Tween20） 0.06N 塩酸 次にアルカリ変性を行った増幅産物を20μLずつ上記ハ
イブリダイゼーション緩衝液を分注した各ウェルに添加
し、良く混合した。
ト（Tween20） 0.06N 塩酸 次にアルカリ変性を行った増幅産物を20μLずつ上記ハ
イブリダイゼーション緩衝液を分注した各ウェルに添加
し、良く混合した。
【００２１】これを37℃で30分間放置し、ハイブリダイ
ゼーションを行った。この反応によりPCR法の段階で仮
に非特異の増幅産物として増幅された遺伝子断片があっ
たとしても、目的とする増幅産物以外は選択的に除かれ
る。
ゼーションを行った。この反応によりPCR法の段階で仮
に非特異の増幅産物として増幅された遺伝子断片があっ
たとしても、目的とする増幅産物以外は選択的に除かれ
る。
【００２２】ハイブリダイゼーション反応終了後、下記
組成の洗浄溶液を使用して１ウェルあたり350μLずつ５
回洗浄を行った。 0.4％ 塩化ナトリウム 0.01％ 塩化カリウム 0.145％ リン酸一水素二ナトリウム 0.01％ リン酸二水素一カリウム 0.1％ ポリオキシエチレンソルビタンモノウラレー
ト（Tween20） 0.005％ アジ化ナトリウム 〈ストレプトアビジンービオチン複合体の形成〉次に、
ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを20mMトリス
ー塩酸緩衝液（pH7.5）に0.2 U/mlの濃度になるように
加え、各ウェルに100μLずつ加えて、37℃において30分
間反応させた。ビオチン標識されたPCR産物と固相化プ
ローブがハイブリダイズしているため、ビオチンとスト
レプトアビジンの特異反応を利用したこの反応により、
目的とする増幅産物にペルオキシダーゼが標識される。
反応終了後、前述の洗浄溶液と洗浄条件により洗浄を行
った。 〈発色反応〉洗浄後、ペルオキシダーゼの発色基質であ
る3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン溶液を各ウェルに
100μLずつ加え、室温で15分間発色させた。目的PCR増
幅産物がハイブリダイズしている配列を持つプローブが
固相してあるウェルは、青色に発色する。反応終了後、
0.2N硫酸を100μLずつ各ウェルに加えて発色反応を停止
した。この操作により、青色に発色したウェルは黄色に
変色する。最後に、各ウェルを吸光度計にて波長450nm
における吸光度を測定した。 〈結果〉吸光度値のカットオフ値は0.3とした。
組成の洗浄溶液を使用して１ウェルあたり350μLずつ５
回洗浄を行った。 0.4％ 塩化ナトリウム 0.01％ 塩化カリウム 0.145％ リン酸一水素二ナトリウム 0.01％ リン酸二水素一カリウム 0.1％ ポリオキシエチレンソルビタンモノウラレー
ト（Tween20） 0.005％ アジ化ナトリウム 〈ストレプトアビジンービオチン複合体の形成〉次に、
ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを20mMトリス
ー塩酸緩衝液（pH7.5）に0.2 U/mlの濃度になるように
加え、各ウェルに100μLずつ加えて、37℃において30分
間反応させた。ビオチン標識されたPCR産物と固相化プ
ローブがハイブリダイズしているため、ビオチンとスト
レプトアビジンの特異反応を利用したこの反応により、
目的とする増幅産物にペルオキシダーゼが標識される。
反応終了後、前述の洗浄溶液と洗浄条件により洗浄を行
った。 〈発色反応〉洗浄後、ペルオキシダーゼの発色基質であ
る3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン溶液を各ウェルに
100μLずつ加え、室温で15分間発色させた。目的PCR増
幅産物がハイブリダイズしている配列を持つプローブが
固相してあるウェルは、青色に発色する。反応終了後、
0.2N硫酸を100μLずつ各ウェルに加えて発色反応を停止
した。この操作により、青色に発色したウェルは黄色に
変色する。最後に、各ウェルを吸光度計にて波長450nm
における吸光度を測定した。 〈結果〉吸光度値のカットオフ値は0.3とした。
【００２３】
【表１】
【００２４】上記で判定した16検体のHBV遺伝子型を確
認するために、同じ検体より本測定方法におけるPCR増
幅領域を含む領域をサブクローニングし、配列決定し、
データベース（DDBJ/GeneBank）配列と共に分子系統樹
を作成した（図３及び図４）。尚、混合型と判定された
検体は、異なる配列を持つクローンが選られたため、系
統樹では検体番号のあとにその遺伝子型を小文字アルフ
ァベットにて記載した。また、系統樹の作成には、近隣
結合法にて遺伝子間距離を計算し、TreeViewPPCソフト
（Page，R．D．M.，Comput．Appl．Biosci．12，357-35
8，1996）を用いて描画した。まず、HBV遺伝子全域領域
配列より作成した系統樹（図３）より、Okamoto H. et
al., J. Gen. Virol. 69, 2575-2583, 1988；Norder H.
et al.,Virology 198, 489-503, 1994；及びStuyver
L．et al.，J．Gen．Virol．81，67-74，2000の論文に
おいて遺伝子型が明らかにされている配列の含まれてい
るクラスターを各々の遺伝子型とし、データベース配列
の遺伝子型を判定した。次に、検体１−16及びデータベ
ース配列の、本測定方法におけるPCR増幅領域配列より
作成した系統樹（図４）の各々のクラスターを、図３の
それと比較した。その結果、データベース配列で遺伝子
型分類は一致しており、検体１−16すべての配列におい
て、本測定方法で判定した遺伝子型のクラスターに含ま
れることが確認された。
認するために、同じ検体より本測定方法におけるPCR増
幅領域を含む領域をサブクローニングし、配列決定し、
データベース（DDBJ/GeneBank）配列と共に分子系統樹
を作成した（図３及び図４）。尚、混合型と判定された
検体は、異なる配列を持つクローンが選られたため、系
統樹では検体番号のあとにその遺伝子型を小文字アルフ
ァベットにて記載した。また、系統樹の作成には、近隣
結合法にて遺伝子間距離を計算し、TreeViewPPCソフト
（Page，R．D．M.，Comput．Appl．Biosci．12，357-35
8，1996）を用いて描画した。まず、HBV遺伝子全域領域
配列より作成した系統樹（図３）より、Okamoto H. et
al., J. Gen. Virol. 69, 2575-2583, 1988；Norder H.
et al.,Virology 198, 489-503, 1994；及びStuyver
L．et al.，J．Gen．Virol．81，67-74，2000の論文に
おいて遺伝子型が明らかにされている配列の含まれてい
るクラスターを各々の遺伝子型とし、データベース配列
の遺伝子型を判定した。次に、検体１−16及びデータベ
ース配列の、本測定方法におけるPCR増幅領域配列より
作成した系統樹（図４）の各々のクラスターを、図３の
それと比較した。その結果、データベース配列で遺伝子
型分類は一致しており、検体１−16すべての配列におい
て、本測定方法で判定した遺伝子型のクラスターに含ま
れることが確認された。
【００２５】本発明方法の被検遺伝子に対する特異性を
評価するため、本発明でPCR増幅を行う領域を含み且
つ、Ａ−Ｆの遺伝子型に対応する配列を含む６種類の評
価用プラスミドを作製し、これを鋳型にPCR増幅を行
い、変性後、プレートに固相化したプローブにハイブリ
ダイゼーションさせ検出した。その結果、各々の遺伝子
型の配列を持つプラスミドはそれぞれの遺伝子型に対応
したプローブを固相化したウェルにのみ検出され、異な
る遺伝子型のプローブ固相ウェルには検出されなかっ
た。また、遺伝子型Ｇ型に関しても、配列番号12のＧ型
特異的プローブへの他遺伝子型の非特異的な陽性反応は
ないことを確認した。
評価するため、本発明でPCR増幅を行う領域を含み且
つ、Ａ−Ｆの遺伝子型に対応する配列を含む６種類の評
価用プラスミドを作製し、これを鋳型にPCR増幅を行
い、変性後、プレートに固相化したプローブにハイブリ
ダイゼーションさせ検出した。その結果、各々の遺伝子
型の配列を持つプラスミドはそれぞれの遺伝子型に対応
したプローブを固相化したウェルにのみ検出され、異な
る遺伝子型のプローブ固相ウェルには検出されなかっ
た。また、遺伝子型Ｇ型に関しても、配列番号12のＧ型
特異的プローブへの他遺伝子型の非特異的な陽性反応は
ないことを確認した。
【００２６】更に、各遺伝子型プラスミドに対して「1/
10または10倍」混合させて同様に検出を行った場合、
「1/10または10倍」の範囲までは、両型の検出が可能で
あった。 実施例２：HBV遺伝子型Ｇの検出 実施例１の方法により、Ｇ型陽性と判定された８検体よ
りHBV DNAを抽出し、HBV全塩基配列をサンガーのダイデ
オキシ法にて決定した。これは、データベース（DDBJ/G
eneBank）登録のＧ型配列が１配列しかないため、配列
の確認のために実施した。これにより決定された塩基配
列について、実施例１記載の系統樹作製法にて遺伝子型
を分類したところ、Ｇ型に分類された（結果省略）。こ
れら配列の、本方法における遺伝子型特異的プローブ領
域を評価したところ、保存性が高く、本方法で分類が可
能であることが確認された（図５）。また、ここで単離
したDNAのHBV nt.2814〜3147の334bpをPromega社製pGEM
T-vector に組み込んだプラスミド（検体番号17）を、
実施例１の方法で測定した結果は以下の通りで、本方法
によりＧ型も正しく判定されることが確認された。
10または10倍」混合させて同様に検出を行った場合、
「1/10または10倍」の範囲までは、両型の検出が可能で
あった。 実施例２：HBV遺伝子型Ｇの検出 実施例１の方法により、Ｇ型陽性と判定された８検体よ
りHBV DNAを抽出し、HBV全塩基配列をサンガーのダイデ
オキシ法にて決定した。これは、データベース（DDBJ/G
eneBank）登録のＧ型配列が１配列しかないため、配列
の確認のために実施した。これにより決定された塩基配
列について、実施例１記載の系統樹作製法にて遺伝子型
を分類したところ、Ｇ型に分類された（結果省略）。こ
れら配列の、本方法における遺伝子型特異的プローブ領
域を評価したところ、保存性が高く、本方法で分類が可
能であることが確認された（図５）。また、ここで単離
したDNAのHBV nt.2814〜3147の334bpをPromega社製pGEM
T-vector に組み込んだプラスミド（検体番号17）を、
実施例１の方法で測定した結果は以下の通りで、本方法
によりＧ型も正しく判定されることが確認された。
【００２７】
【表２】
【００２８】これらの結果から、本発明方法により非常
に特異性高く遺伝子型を判定できることが示される。
に特異性高く遺伝子型を判定できることが示される。
【００２９】
【発明の効果】本発明によれば、特定のプライマー及
び、プローブを用いることにより、HBVの遺伝型を簡便
且つ、正確に、また短時間で判定することができる。
び、プローブを用いることにより、HBVの遺伝型を簡便
且つ、正確に、また短時間で判定することができる。
【００３０】
【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> Genome Science Laboratories Co.，Ltd <120> Method for Classifying Genotype of Hepatitis B Viruses, and Primers and Probes for the Same <130> 011941 <160> 15 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer. <400> 1 accaatcctc tgggattctt ccc 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer. <400> 2 accaaccctc tgggattctt tcc 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Hepatitis B virus type G. <400> 3 agcaatcctc taggattcct tcc 23 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Hepatitis B virus. <400> 4 gagcctgagg gctccaccc 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed primer. <400> 5 gtgcytgagg gctccaccc 19 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Hepatitis B virus type A. <400> 6 accccatcaa ggaccac 17 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Hepatitis B virus type B. <400> 7 ctgcattcaa agccaact 18 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Hepatitis B virus type C. <400> 8 caaccccaac aaggatc 17 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed probe. <400> 9 caatctcaac aaggacacct 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Hepatitis B virus type E. <400> 10 gaccacaatc ccaacaaag 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Hepatitis B virus type F. <400> 11 aaggacagtt ggccaatgg 19 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <220> <223> Probe employing the naturally occurred sequence of Hepatitis B virus type G. <400> 12 aatcccaaaa aggaccc 17 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed probe. <400> 13 aggtaggagc gggagcattc gggct 25 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed probe. <400> 14 ccaatggcaa acaaggtagg agtggga 27 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <220> <223> Primer employing the naturally occurred sequence of Hepatitis B virus type F. <400> 15 cccaatcctc tgggcttcct gcc 23
【図１】 図１は、DDBJ/GeneBank登録の各HBV遺伝子型
のヌクレオチド番号2902−2924及び3073−3091の配列と
本発明のプライマー配列のアラインメントを示す。横線
はD00329（Ｂ型）と同一塩基を示す。
のヌクレオチド番号2902−2924及び3073−3091の配列と
本発明のプライマー配列のアラインメントを示す。横線
はD00329（Ｂ型）と同一塩基を示す。
【図２】 図２は、DDBJ/GeneBank登録の各HBV遺伝子型
のヌクレオチド番号2942−3042の配列と本発明のプロー
ブ配列のアラインメントを示す。横線はD00329（Ｂ型）
と同一塩基を示す。
のヌクレオチド番号2942−3042の配列と本発明のプロー
ブ配列のアラインメントを示す。横線はD00329（Ｂ型）
と同一塩基を示す。
【図３】 図３は、DDBJ/GeneBank登録のHBV遺伝子型全
領域配列をもとに作成した分子系統樹である。
領域配列をもとに作成した分子系統樹である。
【図４】 図４は、実施例に挙げた検体１−16より選ら
れたクローン、及びDDBJ/GeneBank登録のHBV遺伝子の、
本測定方法におけるPCR増幅領域配列をもとに作成した
分子系統樹である。
れたクローン、及びDDBJ/GeneBank登録のHBV遺伝子の、
本測定方法におけるPCR増幅領域配列をもとに作成した
分子系統樹である。
【図５】 図５は、実施例１に記載された方法によりＧ
型陽性と判定された８検体のヌクレオチド番号2942−30
42の配列と本発明のプローブ配列（配列番号12）のアラ
インメントを示す。横線はD00329（Ｂ型）と同一塩基を
示す。
型陽性と判定された８検体のヌクレオチド番号2942−30
42の配列と本発明のプローブ配列（配列番号12）のアラ
インメントを示す。横線はD00329（Ｂ型）と同一塩基を
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ 33/566 Ｃ１２Ｒ 1:93 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:93） (Ｃ１２Ｑ 1/70 Ｃ１２Ｒ 1:93） (72)発明者 加藤 秀章 愛知県名古屋市千種区鹿子17−17 鹿子殿 メゾン・ド・コトー 213 (72)発明者 折戸 悦朗 愛知県名古屋市名東区高間町246番地 (72)発明者 上田 龍三 愛知県名古屋市名東区社が丘２丁目412番 地 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB50 DA12 DA13 FB02 4B024 AA14 CA01 CA09 HA14 4B063 QA01 QA12 QA18 QA19 QQ10 QR08 QR56 QR62 QS25 QS34 QX01
Claims (3)
- 【請求項１】 以下の工程：Ｂ型肝炎ウイルスPreS1領
域の遺伝子配列の一部を標識プライマーを用いてPCR法
にて増幅し、 増幅産物を Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，及びＧの遺伝子
型特異的プローブにハイブリダイズさせ、そしてPCR産
物の標識を検出することからなる、Ｂ型肝炎ウイルスの
遺伝子型を判定する方法。 - 【請求項２】 配列番号１、２、３及び１５からなる群
から選択される少なくとも一つのセンスプライマー、及
び配列番号４及び５の何れか又は両方のアンチセンスプ
ライマーからなる、請求項１に記載のＢ型肝炎ウイルス
遺伝子型判定方法に用いられるプライマーセット。 - 【請求項３】 請求項１に記載のＢ型肝炎ウイルスの遺
伝子型判定方法に用いられる、 配列番号６の遺伝子型Ａ検出用プローブ；配列番号７の
遺伝子型Ｂ検出用プローブ；配列番号８の遺伝子型Ｃ検
出用プローブ；配列番号９の遺伝子型Ｄ検出用プロー
ブ；配列番号10の遺伝子型Ｅ検出用プローブ；配列番号
11の遺伝子型Ｆ検出用プローブ；及び配列番号12の遺伝
子型Ｇ検出用プローブ；からなる群から選択される、一
つのプローブ又は複数のプローブのセット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001246141A JP2002355098A (ja) | 2000-08-14 | 2001-08-14 | Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型分類方法並びにそのためのプライマー及びプローブ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000245606 | 2000-08-14 | ||
| JP2000-245606 | 2000-08-14 | ||
| JP2001246141A JP2002355098A (ja) | 2000-08-14 | 2001-08-14 | Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型分類方法並びにそのためのプライマー及びプローブ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002355098A true JP2002355098A (ja) | 2002-12-10 |
Family
ID=26597932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001246141A Pending JP2002355098A (ja) | 2000-08-14 | 2001-08-14 | Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型分類方法並びにそのためのプライマー及びプローブ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002355098A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005270031A (ja) * | 2004-03-25 | 2005-10-06 | Srl Inc | Ｂ型肝炎ウイルスのジェノタイプａのサブタイプの判別方法 |
| JP2006280340A (ja) * | 2005-04-05 | 2006-10-19 | Bml Inc | Ｈｂｖの遺伝子型分類のためのプローブセット、分類方法及びキット |
| CN100422344C (zh) * | 2004-08-27 | 2008-10-01 | 广州华银基因科技有限公司 | 乙型肝炎病毒基因分型的荧光pcr检测方法及其试剂盒 |
| WO2013162109A1 (ko) * | 2012-04-27 | 2013-10-31 | (주)바이오니아 | B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 프라이머, 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법 |
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| CN109457049A (zh) * | 2018-12-07 | 2019-03-12 | 迈克生物股份有限公司 | 一种用于乙型肝炎病毒基因分型检测的组合物、试剂盒及其方法 |
| CN112481415A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-03-12 | 迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司 | 用于检测乙型肝炎病毒的成套试剂与方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997040193A2 (en) * | 1996-04-19 | 1997-10-30 | Innogenetics N.V. | Method for typing and detecting hbv |
-
2001
- 2001-08-14 JP JP2001246141A patent/JP2002355098A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997040193A2 (en) * | 1996-04-19 | 1997-10-30 | Innogenetics N.V. | Method for typing and detecting hbv |
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| JP4689968B2 (ja) * | 2004-03-25 | 2011-06-01 | 株式会社エスアールエル | Ｂ型肝炎ウイルスのジェノタイプａのサブタイプの判別方法 |
| CN100422344C (zh) * | 2004-08-27 | 2008-10-01 | 广州华银基因科技有限公司 | 乙型肝炎病毒基因分型的荧光pcr检测方法及其试剂盒 |
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| US9567571B2 (en) * | 2011-11-28 | 2017-02-14 | Zhejiang University | Hepatitis B virus mutant, mutant amplification kit and use thereof |
| WO2013162109A1 (ko) * | 2012-04-27 | 2013-10-31 | (주)바이오니아 | B형 간염 바이러스를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 프라이머, 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법 |
| CN109457049A (zh) * | 2018-12-07 | 2019-03-12 | 迈克生物股份有限公司 | 一种用于乙型肝炎病毒基因分型检测的组合物、试剂盒及其方法 |
| CN109457049B (zh) * | 2018-12-07 | 2021-12-03 | 迈克生物股份有限公司 | 一种用于乙型肝炎病毒基因分型检测的组合物、试剂盒及其方法 |
| CN112481415A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-03-12 | 迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司 | 用于检测乙型肝炎病毒的成套试剂与方法 |
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