JP4633523B2

JP4633523B2 - Ｈｂｖの遺伝子型分類のためのプローブセット、分類方法及びキット

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Publication number: JP4633523B2
Application number: JP2005108725A
Authority: JP
Inventors: 徹江頭; 敏和山口; 健一田所; 努影山
Original assignee: BML Inc
Current assignee: BML Inc
Priority date: 2005-04-05
Filing date: 2005-04-05
Publication date: 2011-02-16
Anticipated expiration: 2025-04-05
Also published as: JP2006280340A

Description

本発明は、ＨＢＶの遺伝子型分類のためのプローブセット、分類方法及びキットに関するものである。

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、全長が約３．２KbpのＤＮＡウイルスである。現在、世界的に、およそ３億５０００万の人が、ＨＢＶに感染していると推定されている。そのうち大多数の感染者は、アジア及びアフリカに住む人々である。

ＨＢＶには、全遺伝子配列における８％以上の相違によって、７つの遺伝子型（genotype）が区別されており、それらはＡ〜Ｇまでのアルファベットに分類されている。これらの各ＨＢＶ遺伝子型は、異なった地理的分布を備えている。すなわち、遺伝子型Ａは、北西ヨーロッパ、北アメリカ、及びアフリカにおいて多数派である一方、遺伝子型Ｂと遺伝子型Ｃとは、アジアにおいて一般的なタイプである。遺伝子型Ｄは、地中海の国々において最も広範囲に拡がった一般的なタイプである。また、遺伝子型Ｇは、東アフリカに限定的なタイプであり、遺伝子型Ｆは、新世界に局地的なタイプである。このうち、最近になって加えられた遺伝子型Ｅについては、いまだ疫学については記述されていない。

日本におけるＨＢＶ遺伝子型の地域分布を見ると、北海道、四国、九州および本州の西日本では遺伝子型Ｃが９０％以上を占め、東日本から東北地方にかけて遺伝子型Ｂの比率が高くなる傾向にあること、また、逆に沖縄では、九州で僅かしか存在しない遺伝子型Ｂが６０％も占めていることが報告されている（非特許文献１）。

さらにアジアの近隣諸国に広く分布する遺伝子型Ｂと日本の遺伝子型Ｂの全塩基配列を比較したところ、２つのサブタイプ（日本型：Ｂｊ／アジア型：Ｂａ）に分別され（非特許文献２）、それらの間に臨床像の違いがあることが明らかにされている。このようなサブタイプは世界で最も感染者の多い遺伝子型Ａにおいても、アジア・アフリカ型：Ａａ／ヨーロッパ・米国型：Ａｅに分けられることが報告されている（非特許文献３）。

ＨＢＶ遺伝子型は、宿主における病気の兆候について影響を与え得ると考えられている。ヨーロッパにおいては、遺伝子型Ｄに比べて遺伝子型Ａは、よりいっそう慢性の肝臓病を発症しやすい。また、アジアにおいては、遺伝子型Ｂに比べて遺伝子型Ｃは、病気を誘発する能力が高いとされている。

したがって、Ａ型及びＢ型のそれぞれ２つのサブタイプを含む、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型の分類方法及びそのためのキットの開発が待たれていた。

このようなＨＢＶ遺伝子型分類のための方法が、特許文献１に記載されている。しかし、この方法は、ＨＢＶ遺伝子のｐｒｅＳ１領域をＰＣＲ増幅し、この増幅産物とＡ〜Ｇの各遺伝子型に特異的なプローブとを接触させ、特異的なハイブリダイゼーションの有無を検出するものであり、１つの遺伝子型の判定に１つのウェルを必要とする。また、Ａ型及びＢ型の２つのサブタイプを検出することはできない。

また、特許文献２には、制限長断片多形法を用いるＨＢＶの遺伝子型Ｂの２つのサブタイプＢａ及びＢｊを検出するための方法が記載されている。しかし、この方法は、制限長断片多形（ＲＦＬＰ）法を用いるため電気泳動のために多くの器具試薬を必要とし、結果を得るのに長時間を必要とする。また、ＲＦＬＰ法では、複数の遺伝子型のウイルスが混在する状態での判定は困難であり、遺伝子型を誤って判定する可能性もある。

さらに、ＨＢＶは、ＤＮＡウイルスであるにもかかわらず、その複製過程で変異を生じやすく多様性に富み、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている全長配列は、数百種類に及び、標準とすべき配列も知られていない。そのため、ＨＢＶの遺伝子型を漏れなく分類することは、極めて困難であった。
特開２００２−３５５０９８号公報特開２００３−１８０３５７号公報 Orito, E et al.: Geographic distribution of hepatitis B virus (HBV) genotype in patients with chronic HBV infection in Japan. Hepatology 34:590-594, 2001. Sugachi, F. et al.: Two subtypes of genotype B (Ba and Bj) of heatitis B virus in Japan. Clin Infect Dis 38; 1222-1228, 2004. Sugachi, F et al.:Epidemiological and sequence differences between two subtypes (Ae and a) of hepatitis B virus genotype A. J.Gen viol 85:811-820,2004.

本発明は、ＨＢＶの遺伝子型分類のためのプローブセット、分類方法及びキットを提供する。

本発明者らは、報告されている遺伝子配列を解析し、コア領域及びＳ領域に注目し、鋭意研究をした結果、臨床的に有用なプライマーのセットを見出し、本発明を完成したものである。したがって、本発明は、下記に関する。

１．下記の塩基配列の組：
配列番号１７〜２７及び配列番号２８〜２９、
配列番号３０〜４２及び配列番号４３〜５２、
配列番号５３〜６１及び配列番号６２〜６７、
配列番号６８〜７５及び配列番号７６〜７８、
配列番号７９〜８８及び配列番号８９〜９６、
配列番号９７〜１０３及び配列番号１０４〜１０５、
配列番号１０６〜１２２及び配列番号１２３〜１２８、
配列番号１２９〜１４１及び配列番号１４２〜１４３、
配列番号１４４〜１５２及び配列番号１５３〜１５７、
配列番号１５８〜１６２及び配列番号１６３〜１６４、
配列番号１６５〜１７１及び配列番号１７２、及び
配列番号１７３〜１７９及び配列番号１８０〜１８３
で示されるオリゴヌクレオチドからなるプローブのセット。
２．上記１に記載のプローブのセットを含む、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型を同定するためのキット。
３．下記工程：
ＨＢＶウイルスのＤＮＡを増幅する工程、及び
得られた増幅産物を上記１に記載のプローブのセットと接触させる工程
からなる、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型を分類するための方法。

本発明によれば、短時間の簡易かつ簡便な操作で、ＨＢＶの遺伝子型を日本人の主要なＨＢＶ遺伝子型である遺伝子型Ｂおよび遺伝子型Ｃに加え、欧米で主要な遺伝子型Ａおよび遺伝子型Ｄに分類し、さらに遺伝子型Ｂと遺伝子型Ａについてはそれぞれ遺伝子型Ｂａ及びＢｊ、遺伝子型Ａａ及びＡｅのサブタイプに分類することができる。また、本発明の方法は、複数の遺伝子型のウイルスが混在する混合型についても適用することができる。

本発明のキットは、インベーダー法を用いるＨＢＶの遺伝子型の分類のために設計されたものである。

インベーダー法は、ゲノム上に存在する１塩基多型（Single nucleotide polymorphism: SNP）や遺伝子変異などの特定の配列を同定することができる方法である（Lance Forsら、２０００年、Pharmacogenomics、第１巻、２１９〜２２９頁）。この方法は、他のＳＮＰタイピング法に必須なＰＣＲ等のＤＮＡ増幅を必ずしも必要としないことから注目されている。インベーダー法は、インベーダーオリゴがターゲットＤＮＡとシグナルプローブとの間の２本鎖に少なくとも１塩基の浸入（インベージョン）を起こして部分的な３塩基の重複構造を形成すると、構造特異的な５’−エンドヌクレアーゼがシグナルプローブの５’側を切断することを利用している。したがって、一つの遺伝子型の検出のためには、少なくとも１つのインベーダーオリゴとシグナルプローブとの組が必要となる。

本発明で用いるプローブは、公知のＨＢＶの遺伝子配列及びその遺伝子型に基づく比較検討により全体としては高度に保存されているものの各遺伝子型による差異が認められる部分である、コア領域の７箇所（配列番号２〜８）、またＳ領域の５箇所（配列番号１１〜１５）から選択することができる。

そして、インベーダー法による切断点として、コア領域の位置１９７８、１９８４、２０２０、２０５６、２０５９、２１６０及び２３４５の塩基、及びＳ領域の位置２８８７、２９０１、２９５０、２９８０及び３００８の塩基を用いることができる。

位置１９７８については、配列番号２の領域を認識するための、配列番号１７〜２７のシグナルプローブ、及び配列番号２８及び２９のインベーダーオリゴの組を用いることができる。

位置１９８４については、配列番号３の領域を認識するための、配列番号３０〜４２のシグナルプローブ、及び配列番号４３〜５２のインベーダーオリゴの組を用いることができる。

位置２０２０については、配列番号４の領域を認識するための、配列番号５３〜６１のシグナルプローブ、及び配列番号６２〜６７のインベーダーオリゴの組を用いることができる。

位置２０５６については、また、配列番号５の領域（相補鎖）を認識するための、配列番号６８〜７５のシグナルプローブ、及び配列番号７６〜７８のインベーダーオリゴの組を用いることができる。

位置２０５９については、配列番号６の領域を認識するための、配列番号７９〜８８のシグナルプローブ、及び配列番号８９〜９６のインベーダーオリゴの組を用いることができる。

位置２１６０については、配列番号７の領域を認識するための、配列番号９７〜１０３のシグナルプローブ、及び配列番号１０４及び１０５のインベーダーオリゴの組を用いることができる。

位置２３４５については、配列番号８の領域を認識するための、配列番号１０６〜１２２のシグナルプローブ、及び配列番号１２３〜１２８のインベーダーオリゴの組を用いることができる。

位置２８８７については、配列番号１１の領域を認識するための、配列番号１２９〜１４１のシグナルプローブ、及び配列番号１４２及び１４３のインベーダーオリゴの組を用いることができる。

位置２９０１については、配列番号１２の領域を認識するための、配列番号１４４〜１５２のシグナルプローブ、及び配列番号１５３〜１５７のインベーダーオリゴの組を用いることができる。

位置２９５０については、配列番号１３の領域を認識するための、配列番号１５８〜１６２のシグナルプローブ、及び配列番号１６３及び１６４のインベーダーオリゴの組を用いることができる。

位置２９８０については、配列番号１４の領域を認識するための、配列番号１６５〜１７１のシグナルプローブ、及び配列番号１７２のインベーダーオリゴの組を用いることができる。

位置３００８については、配列番号１５の領域を認識するための、配列番号１７３〜１７９のシグナルプローブ、及び配列番号１８０〜１８３のインベーダーオリゴの組を用いることができる。

したがって、本発明は、
配列番号１７〜２５及び配列番号２６〜２７、
配列番号２８〜４０及び配列番号４１〜５０、
配列番号５１〜５９及び配列番号６０〜６５、
配列番号６６〜７３及び配列番号７４〜７６、
配列番号７７〜８６及び配列番号８７〜９４、
配列番号１０４〜１２０及び配列番号１２１〜１２６、
配列番号１２７〜１３９及び配列番号１４０〜１４１、
配列番号１４２〜１５０及び配列番号１５１〜１５５、
配列番号１５６〜１６０及び配列番号１６１〜１６２、
配列番号１６３〜１６９及び配列番号１７０、及び
配列番号１７１〜１７７及び配列番号１７８〜１８１
で示されるオリゴヌクレオチドからなるプローブのセットに関する。

本発明の目的のためには、まず、ＨＢＶのＤＮＡを増幅しておくことが望ましい。増幅方法はＰＣＲが一般的であり、以下の記載はＰＣＲプライマーに関するが、これに限定されることなく、従来公知の任意のＤＮＡ増幅技術、たとえば、ＬＡＭＰ法を用いることもできる。

分析対象である鋳型ＨＢＶ遺伝子は、ＨＢＶ感染者からの血清、組織等より抽出、精製したものを用いることができる。ＨＢＶは比較的変異の多いウイルスであることから、プライマー設定位置は、ＨＢＶ遺伝子型間で保存性の高い部位を使用することが望ましい。また、ＰＣＲの増幅効率や特異性は、プライマー設定位置やプライマーの配列にも依存することから、ＰＣＲ増幅効率が良く、かつ特異性の高い部分にプライマーを設定する必要がある。また、増幅の際に、遺伝子型間で増幅効率に大きな差があってはその時点でセレクションがかかってしまい、ハイブリダイズによる遺伝子型判別で正しい結果が得られない可能性がある。

よって、本発明の好ましい態様においては、本発明のＰＣＲプライマーとしては、配列番号２〜８の領域については、配列番号１（フォワードプライマー）及び配列番号９（リバースプライマー）を、また、配列番号１１〜１５の領域については、配列番号１０（フォワードプライマー）及び配列番号１６（リバースプライマー）を用いることができる。

また、本発明は、本発明のプローブセットを含む、ＨＢＶウイルスの遺伝子型を同定するためのキットにも関する。

さらに、本発明は、ＨＢＶウイルスのＤＮＡを増幅する工程、及び得られた増幅産物を請求項１に記載のプローブのセットと接触させる工程からなる、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型を分類するための方法にも関する。

遺伝子型間のＤＮＡ配列の相違を調べるためにデータベースからＨＢＶ−ＤＮＡの完全長配列４９１例を入手した。これらの配列のアライメントを作成し、各遺伝子型では保存されているが他の型とは異なっている各遺伝子型に特異的な塩基を選び出した。

本邦で検出される遺伝子型であるＡａ、Ａｅ、Ｂａ、Ｂｊ、ＣおよびＤを判別するために、コア領域の位置１９７８、１９８４、２０２０、２０５６、２０５９、２１６０及び２３４５の塩基、及びＳ領域の位置２８８７、２９０１、２９５０、２９８０及び３００８の１２箇所の塩基を選択し、この部分を切断点としたインベーダープローブを設計した。

ＨＢＶはＤＮＡウイルスでありながら非常に変異が多く、同じ遺伝子型であっても完全に一致している配列はごくわずかであるため、一組のインベーダープローブセットで全ての株を検出することは難しい。そこで、２〜１０本のシグナルプローブと１〜１０本のインベーダーオリゴを組みあわせて反応させることにより各遺伝子型に分類された全ての株を検出できるように設計した。

インベーダー反応では標的ＤＮＡに対してシグナルプローブとインベーダーオリゴの切断点から５塩基までの配列がミスマッチしないことが重要となるため、切断点から前後５塩基については各遺伝子型にみられる全ての配列が反応するようにシグナルプローブとインベーダーオリゴを組み合わせた。

コア領域の位置１９８４を切断点として遺伝子型Ａａと遺伝子型Ａｅを判定した例を以下にあげる。遺伝子型Ａａの１９例では、ＤＮＡ位置１９８４〜２００１の塩基配列がＧＧＡＴＣＴＡＣＴＨＧＡＨＡＣＭＳＧであったが、遺伝子型Ａｅの６０例では、ＡＧＡＴＣＴＹＳＴＲＧＡＹＡＣＭＧであった。そこで、この部分にＡａ検出用の７種類（配列番号３０〜３６）とＡｅ検出用の６種類（配列番号３７〜４２）のシグナルプローブを設計し、ＤＮＡ配列１９４９〜１９８４に、１０種類のインベーダーオリゴ（配列番号４３〜５２）を設計した。

塩基配列を検出するプローブの設計には、Third Wave Technologies社（ＴＷＴ社）のプローブデザインソフト（Invader Creator）を用いた。

測定は、３８４ウェルプレートを用いて、それぞれのインベーダーオリゴ、シグナルプローブ、ＦＲＥＴプローブおよびCleavase酵素と、ＰＣＲ増幅したＤＮＡを同時に混和し、６5℃で１５〜３０分間反応させた後、蛍光プレートリーダー（CYTOFLUOR4000／Applied Biosystems）で計測した。判定基準は陰性コントロールの蛍光値に対する被験サンプルの蛍光値の割合で特異的反応の有無を判定するＦＯＺ法（Victor Lyamichev及びBruce Neri、Methods in Molecular Biology、第212巻、２００３年、229〜240頁）に準じたが、判定をより厳しく行うため閾値を２．０に設定した。

なお、従来のインベーダー法では、反応温度は６３℃であるが、本発明においては、反応温度を６５℃とすることによりＨＢＶ遺伝子型同定の特異性をさらに高めることができた。たとえば、位置１９７８では、６３℃における陰性サンプルのＦＯＺ値は１．２〜１．３５であったが、６５℃では０．８〜１．０とすることができた。

臨床分離株３３９例を用いてＤＮＡプローブ法（ＨＢＶジェノタイプ判定キット、ゲノムサイエンス研究所）との比較検討を行なった。

臨床分離株３３９例を測定した結果、ＤＮＡプローブ法ではＡ〜Ｇ型いずれのシグナルも得られなったものが１０／３３９例（２．９５％）みられたが、本発明のキットでは、この１０例について、Ａｅ型３例、Ｂａ型１例、Ｂｊ型４例、Ｃ型２例に判定することができた。その他の３２９/３３９例（９７．０５％）の遺伝子型は一致した。

本発明の方法とＤＮＡプローブ法との結果が整合しない場合には、シークエンス解析により、ＨＢＶ−ＤＮＡ配列を確認した。配列番号２〜８の領域については、配列番号１（フォワードプライマー）及び配列番号９（リバースプライマー）を、また、配列番号１１〜１５の領域については、配列番号１０（フォワードプライマー）及び配列番号１６（リバースプライマー）を用い、公知の方法によりＰＣＲ増幅した後に、ダイレクトシークエンスあるいはクローニングシークエンス法により、ＨＢＶ−ＤＮＡ遺伝子配列を解析した。

ＤＮＡプローブ法で測定した結果、３３９例のなかにＢ型とＣ型の混合型となったものが４例（１．１８％）みられたが、本発明のキットではさらに詳細にＢｊ型とＣ型の混合型と判定することができた。

コア領域の位置１９５１、２０２８およびＳ領域の位置９３、３００８についてもプローブを設計した。しかし位置１９８４と３００８以外の位置１９５１、２０２８および９３では、シークエンス法により遺伝子型の判明している臨床分離株を測定すると遺伝子型ＡａおよびＡｅ両方のシグナルが上昇してしまうため特異的な検出を行なうことはできなかった。設計されたプローブの中で、遺伝子型ＡａおよびＡｅの判定に有用であったプローブは２/５（４０.０％）であった。

遺伝子型ＡとＣを明確に判定するために位置１６０５と位置２３４５にインベーダープローブを設計した。ＨＢＶ完全長配列では遺伝子型Ａのみが位置１６０５の塩基がＴ（チミン）であり、また、いくつかの株を除き遺伝子型Ａにのみ位置２３４５に６つの挿入塩基が存在した。遺伝子型Ａのシグナルが得られた臨床分離株について、位置１６０５及び位置２３４５を含む領域をシークエンス解析したところ、位置１６０５の塩基は、遺伝子型Ａ以外でもＴ（チミン）であることがあった。この結果、遺伝子型ＡとＣを判定するために有用なプローブの割合は１/２（５０．０％）であった。

このような現象からＨＢＶの遺伝子型判定では使用する切断点のみではなく、なるべくその前後の配列も特異的であることが望ましいと判明した。

遺伝子型ＢｊとＢａの判別には、コア領域の位置１９７８、１９９３、２０２０、２０３５、２０４４、２０５６、２０５９、２０８３、２０８９及び２１６０を切断点としてインベーダープローブを設計した。遺伝子型ＢｊとＢａの配列の違いはコア領域に多く存在しており、切断点の前後も特異的な配列である部分を選択した。

このなかで位置２０３５は反応性に優れているものの臨床分離株５２例中２例でほかの切断点との結果が相違した。また、位置１９９３、２０４４、２０８３及び２０８９に比べ、位置１９７８、２０２０、２０５６、２０５９及び２１６０は１０倍ほど測定感度が高く反応性に優れていた。

そこで、本発明のキットではＢｊとＢａの判別にはこの５箇所の切断点を含む領域をプローブとして採用し、５ヶ所の領域のうちいずれか４ヶ所に変異を含みインベーダー反応が起こらない場合であっても残りの１ヶ所で遺伝子型の判定が行えるようにプローブを選択した。遺伝子型ＡとＣを判定するために有用なプローブの割合は５/１０（５０．０％）であった。

遺伝子型ＢとＣの判別には、Ｓ領域の位置２９０１、２９５０及び２９８０を切断点としてインベーダープローブを設計した。遺伝子型ＢとＣの判定にはこの３ヶ所の領域のうちいずれか２ヶ所に変異を含みインベーダー反応が起こらない場合でも残りの１ヶ所で判定が行えるようにした。

本発明のプローブのセットを用いたインベーダー法によるＨＢＶの遺伝子型判定と市販のＨＢＶジェノタイプ判定キットを用いたＤＮＡプローブ法によるＨＢＶの遺伝子型判定との結果を下記の表に示した。

本発明は、ＨＢＶの遺伝子型分類することにより、臨床的に有用なデータを提供することができ、ＨＢＶの診断、予防、治療等に有用である。

ＨＢＶ−ＤＮＡ各遺伝子型配列のアライメントである。プローブ設計領域（配列番号２〜８）を下線で示し、インベーダー切断点を塩基位置を表す数字で示した（コア領域の位置１９７８、１９８４、２０２０、２０５６、２０５９、２１６０及び２３４５）。ＨＢＶ−ＤＮＡ各遺伝子型配列のアライメントである。プローブ設計領域（配列番号２〜８）を下線で示し、インベーダー切断点を塩基位置を表す数字で示した（コア領域の位置１９７８、１９８４、２０２０、２０５６、２０５９、２１６０及び２３４５）。ＨＢＶ−ＤＮＡ各遺伝子型配列のアライメントである。プローブ設計領域（配列番号２〜８）を下線で示し、インベーダー切断点を塩基位置を表す数字で示した（コア領域の位置１９７８、１９８４、２０２０、２０５６、２０５９、２１６０及び２３４５）。ＨＢＶ−ＤＮＡ各遺伝子型配列のアライメントである。プローブ設計領域（配列番号２〜８）を下線で示し、インベーダー切断点を塩基位置を表す数字で示した（コア領域の位置１９７８、１９８４、２０２０、２０５６、２０５９、２１６０及び２３４５）。ＨＢＶ−ＤＮＡ各遺伝子型配列のアライメントである。プローブ設計領域（配列番号２〜８）を下線で示し、インベーダー切断点を塩基位置を表す数字で示した（コア領域の位置１９７８、１９８４、２０２０、２０５６、２０５９、２１６０及び２３４５）。ＨＢＶ−ＤＮＡ各遺伝子型配列のアライメントである。プローブ設計領域（配列番号２〜８）を下線で示し、インベーダー切断点を塩基位置を表す数字で示した（コア領域の位置１９７８、１９８４、２０２０、２０５６、２０５９、２１６０及び２３４５）。ＨＢＶ−ＤＮＡ各遺伝子型配列のアライメントである。プローブ設計領域（配列番号１１〜１５）を下線で示し、インベーダー切断点を塩基位置を表す数字で示した（Ｓ領域の位置２８８７、２９０１、２９５０、２９８０及び３００８）。ＨＢＶ−ＤＮＡ各遺伝子型配列のアライメントである。プローブ設計領域（配列番号１１〜１５）を下線で示し、インベーダー切断点を塩基位置を表す数字で示した（Ｓ領域の位置２８８７、２９０１、２９５０、２９８０及び３００８）。ＨＢＶ−ＤＮＡ各遺伝子型配列のアライメントである。プローブ設計領域（配列番号１１〜１５）を下線で示し、インベーダー切断点を塩基位置を表す数字で示した（Ｓ領域の位置２８８７、２９０１、２９５０、２９８０及び３００８）。ＨＢＶ−ＤＮＡ各遺伝子型配列のアライメントである。プローブ設計領域（配列番号１１〜１５）を下線で示し、インベーダー切断点を塩基位置を表す数字で示した（Ｓ領域の位置２８８７、２９０１、２９５０、２９８０及び３００８）。ＨＢＶ−ＤＮＡ各遺伝子型配列のアライメントである。プローブ設計領域（配列番号１１〜１５）を下線で示し、インベーダー切断点を塩基位置を表す数字で示した（Ｓ領域の位置２８８７、２９０１、２９５０、２９８０及び３００８）。

Claims

下記の塩基配列の組：
配列番号１７〜２７及び配列番号２８〜２９、
配列番号３０〜４２及び配列番号４３〜５２、
配列番号５３〜６１及び配列番号６２〜６７、
配列番号６８〜７５及び配列番号７６〜７８、
配列番号７９〜８８及び配列番号８９〜９６、
配列番号９７〜１０３及び配列番号１０４〜１０５、
配列番号１０６〜１２２及び配列番号１２３〜１２８、
配列番号１２９〜１４１及び配列番号１４２〜１４３、
配列番号１４４〜１５２及び配列番号１５３〜１５７、
配列番号１５８〜１６２及び配列番号１６３〜１６４、
配列番号１６５〜１７１及び配列番号１７２、並びに
配列番号１７３〜１７９及び配列番号１８０〜１８３
で示されるオリゴヌクレオチドからなるプローブのセット。
請求項１に記載のプローブのセットを含む、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型を同定するためのキット。
下記工程：
ＨＢＶウイルスのＤＮＡを増幅する工程、
得られた増幅産物を請求項１に記載のプローブのセットと接触させる工程、及び
Cleavase酵素によって５’側が切断されたシグナルプローブを検出する工程
を含む、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型を分類するための方法。