JP4502642B2 - ヌクレオシドアナログに対する感受性の変化を有するウイルス変種およびその使用 - Google Patents
ヌクレオシドアナログに対する感受性の変化を有するウイルス変種およびその使用 Download PDFInfo
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Description
発明の分野
本発明は、一般的には、特定の薬剤に対する感受性の低下、および／または免疫学的試薬との相互作用の減少を示すウイルス変種に関する。より詳細には、本発明は、ヌクレオシドアナログに対する完全または部分的な耐性、および／または抗体への感受性の低下を含むウイルス表面の成分に対するこれらの抗体との相互作用の減少を示すB型肝炎ウイルス（HBV）変種に関する。本発明はさらに、このようなウイルス変種を検出するためのアッセイ法を意図し、これらのアッセイ法は、抗ウイルス治療養生法をモニタリングすること、ならびにウイルス薬剤および特にHBV変種を指向する新規なまたは修飾したワクチンを開発することにおいて有用である。本発明はまた、ウイルスの感染、複製、および／または放出を阻害することができる薬剤についてスクリーニングするためのウイルス変種の使用を意図する。
本発明は、一般的には、特定の薬剤に対する感受性の低下、および／または免疫学的試薬との相互作用の減少を示すウイルス変種に関する。より詳細には、本発明は、ヌクレオシドアナログに対する完全または部分的な耐性、および／または抗体への感受性の低下を含むウイルス表面の成分に対するこれらの抗体との相互作用の減少を示すB型肝炎ウイルス（HBV）変種に関する。本発明はさらに、このようなウイルス変種を検出するためのアッセイ法を意図し、これらのアッセイ法は、抗ウイルス治療養生法をモニタリングすること、ならびにウイルス薬剤および特にHBV変種を指向する新規なまたは修飾したワクチンを開発することにおいて有用である。本発明はまた、ウイルスの感染、複製、および／または放出を阻害することができる薬剤についてスクリーニングするためのウイルス変種の使用を意図する。
先行技術の説明
本明細書において本発明者らによって引用される刊行物の参考文献の詳細は、本明細書の末尾に集められている。
本明細書において本発明者らによって引用される刊行物の参考文献の詳細は、本明細書の末尾に集められている。
本明細書中のいかなる先行技術に対する言及も、先行技術がいずれかの国において共通の一般的知識の一部を形成するという認知または任意の形態の示唆ではなく、かつそのように取られるべきではない。
アミノ酸配列における特定の変異は、本明細書中では「Xaa1nXaa2」として表され、ここで、Xaa1は変異の前の元のアミノ酸残基であり、nは残基の数であり、かつXaa2は変異アミノ酸である。略号「Xaa」は3文字コードまたは1文字コード（すなわち、「X」）であり得る。B型肝炎ウイルスDNAポリメラーゼのアミノ酸残基は、モチーフTyr Met Asp Asp（YMDD）のメチオニン残基で番号付けられ、残基番号204である（Stuyverら、Hepatology 33: 751-757, 2001）。B型ウイルス表面抗原のアミノ酸残基は、Norderら（J. Gen Virol. 74: 341-1348, 1993）に従う番号である。
ヌクレオシドアナログという用語は、ヌクレオチドアナログおよびヌクレオシドアナログの両方に対する言及において使用される。
B型肝炎ウイルス（HBV）は消耗性疾患状態を引き起こし得、急性肝不全を引き起こし得る。HBVはRNA中間体を介して自己複製し、その複製ストラテジーにおいて逆転写を利用するDNAウイルスである(SummersおよびMason、Cell 29: 403-415, 1982）。HBVゲノムは、表面、コア、ポリメラーゼ、およびXの遺伝子をコードする重複するオープンリーディングフレームを有する部分的に二本鎖DNA構造を有する複雑な性質である。HBVゲノムの複雑な性質は図1に表される。ポリメラーゼは4つの機能的領域、末端タンパク質（TP）、スペーサー、逆転写酵素（rt）、およびリボヌクレアーゼ（RNAse）からなる。
HBVのポリメラーゼ遺伝子はエンベロープ遺伝子と重複し、ポリメラーゼの触媒ドメインにおける変異は、エンベロープタンパク質のアミノ酸配列に影響を与える可能性があり、かつ逆もまた同様である。特に、「a」決定基として公知のHBVの中和ドメインについての遺伝子配列（これは、HBsAgの中に見い出され、かつアミノ酸99および169の間に位置する）は、実際にウイルスポリメラーゼタンパク質の主要な触媒領域ならびに特にAドメインおよびBドメインと重複する。
HBV DNAポリメラーゼの存在により、ヌクレオシドアナログが有効な抗ウイルス剤として作用し得るという提案をもたらした。現在試験されているヌクレオシドアナログの例は、ペンシクロビル（penciclovir）またはその経口型（FAM）（Vere Hodge、Antiviral Chem Chemother 4: 67-84, 1993; Boydら、Antiviral Chem Chemother. 32: 358-363, 1987; Krugerら、Hepatology 22: 219A, 1994; Mainら、J. Viral Hepatitis 3: 211-215, 1996）、ラミブジン（lamivudine）（(-)-β-2'-デオキシ-3'-チアシチジン）（3TCまたはLMV）（Severiniら、Antimicrobial Agents Chemother 39: 1430-1435, 1995; Dienstagら、New England J Med 333: 1657-1661, 1995）である。臨床試験にすでに進行している新規ヌクレオシドアナログには、ピリアミジンであるエントリシタビン（Emtricitabine）、（(-)-β-L-2'-3'-ジデオキシ-5-フルオロ-3'-チアシチジン；FTC）、3TCの5-フルオロ誘導体、およびクレブジン（Clevudine）（1-(2-フルオロ-5-メチル-β-L-アラビノ-フラノシル)ウラシル；L-FMAU）、チミジンアナログが含まれる。3TCのように、これらは不自然な「L-」配座を有するチミジン誘導体である。いくつかのプリン誘導体もまた、臨床試験に進行している；それらには、炭素環式デオキシグアノシンアナログであるエンテカビル（Entecavir）（BMS-200、475；ETV）、ジオキソラングアニン（(-)-β-D-2-アミノプリンジオキソラン；DXG）の経口プロドラッグであるジアミノプリンジオキソラン（DAPD）、および非環式デオキシアデノシン一リン酸ヌクレオシドアナログのアデフォビル（Adefovir）（9-[ホスホリル-メトキシエチル]-アデニン；PMEA）の経口プロドラッグであるアデフォビルジピボキシルが含まれる。
これらの薬剤はHBV DNA合成を阻害する際に高度に有効であるのに対して、HBVの耐性変異体が長期的な抗ウイルス化学療法の間に出現する可能性が存在する。長期的なLMV治療を受けている患者において、鍵となる耐性変異体はrtM204I/V +/- rtL180Mにおけるポリメラーゼ中のrtドメインにおいて選択される。ポリメラーゼ変異のために使用される命名法は、Stuyverら、2001、前出によって提案されたものに従っている。LMVのみが長期的HBV感染に対する使用のために認可されている。ラミブジンは、HBV複製の特に強力な阻害物質であり、ウイルスDNA合成を阻害することにより、同所肝移植（OLT）後の慢性的に感染した患者の血清中のHBV DNA力価を減少させる。LMV単独療法は、長期間においてHBV複製を制御することはできないようである。これは、HBVのLMV耐性株の出現が単独療法の間にほぼ不可避であると思われ、かつ一般的には単独療法はウイルスの排除自体を生じるには不十分であるからである。
ETVはまた、HBV複製の強力な阻害物質である。ETVは、ヘパドナウイルスおよびヘルペスウイルスに対して活性を有する、経口的に利用可能なシクロペンチルデオキシグアノシンアナログである。前臨床研究により、ETVが、酵素アッセイ法および細胞に基づくアッセイ法においてHBVの高度に強力な阻害物質であることが示されている（Innaimoら、Antimicrobiol Agent Chem 44: 1441-1448, 1997; Sieferら、Antimicrobiol Agent Chem 28; 3200-3208, 1998; Yamanakaら、Antimicrobiol Agent Chem 43: 190-193, 1999）。ETVはまた、慢性的に感染したウッドチャックにおけるWHVに対して効力を示した（Colonnoら、JID 184: 1236-45 2001; Genovesiら、Antimicrobiol Agent Chem 42: 3209-3217, 1998）。4週間の用量増加試験は、ETVが十分に耐性であり、試験された最大用量（1mg/日）でウイルス血症において2.5 log10の平均減少を生じた。LMV耐性変異は、インビトロでETVに交差耐性を付与することが報告されたが、エンテカビルはより高い用量でのウイルス複製の阻害が可能であった；これらのデータは、ETVがL-ヌクレオシドではないことを考慮すると幾分か驚くべきことである。ETVは、LMV耐性HBV変異を有する患者を治療するために首尾よく使用されてきた。特異的なETV耐性変異は記載されていない。
ヌクレオシドアナログ療法は、単独療法または組み合わせ療法として投与されてもよく、ここで、2つまたはそれ以上のヌクレオシドアナログが投与されてもよい。ヌクレオシドアナログは、他の抗ウイルス剤（例えば、インターフェロンまたはB型肝炎免疫グロブリン（HBIG））と組み合わせて投与されてもよい。
HBVのヌクレオシド-および／または抗体-耐性変種を同定する必要性が存在する。その迅速な同定により、追求されている治療プロトコールの改変をもたらし得る。
発明の概要
表1に定義された略号が本明細書において使用される。
（表１）略号
表1に定義された略号が本明細書において使用される。
（表１）略号
本明細書を通して、文脈により他の意味を必要としない限り、用語「含む（comprise）」またはその変化形（例えば、「含む（comprises）」または「含むこと（comprising）」）は、言及された要素もしくは整数、または成分もしくは要素の群を含むことを意味するが、任意の他の要素もしくは整数、または成分もしくは要素の群を除外することを意味しないことが理解される。
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列識別番号（配列番号：）によって言及される。配列番号：は、配列識別子＜400＞1、＜400＞2などの数字に対応する。配列表は特許請求の範囲の後に提供される。
ヌクレオチドおよびアミノ酸変異の位置は遺伝子型B、C、またはFから、命名法を使用して同定された。ここで、DNAポリメラーゼのYMDDモチーフにおけるメチオニン残基は550位と指定された（豪州特許第734831号を参照されたい）。本明細書において与えられるヌクレオチドおよびアミノ酸の位置は、YMDDにおけるメチオニン残基が204位であり、かつrtM204と言われる（rtは「逆転写酵素」の略号である）新規な命名法に基づく。
本発明に従って、HBV耐性変種はLMVおよびETVの両方で治療された慢性B型肝炎を有する患者（患者A）およびLMVを含む多数のヌクレオシド薬剤で以前に治療され、ETVで治療された肝移植患者（患者B）において同定された。組み合わせ療法において、本発明に従って、LMVおよびETA治療後に、これらのヌクレオシドアナログに対するHBVの感受性を低下させるHBV DNAポリメラーゼ遺伝子の変異を有する、HBVの耐性変種が同定された。表面抗原における対応する変異もまた発生する。これらのHBV変種の同定は、LMV耐性および／またはETV耐性、およびまたは他のヌクレオシドアナログ治療養生法に対する耐性をモニタリングするため、ならびに代替的な治療薬剤として有用な薬剤をスクリーニングするためのアッセイ法の開発のために重要である。患者Aから単離されたHBVにおいて鍵となる機能性ドメイン、すなわち、rtI169T+rtV173L+rtL180M+rtM204Vにおいて検出された変異は、機能的アッセイ法においてETVに対する感受性を低下させたことが実証される。
このようなHBV変種の検出は、HBV感染を治療するのに適切な薬剤の選択を含む、治療プロトコールの管理において、特に重要である。本発明のこの局面の方法は、ヌクレオシドアナログの存在下で患者においてHBV負荷の増大の発生をモニタリングすることに部分的に基づく。従って、次に臨床医は、現存の治療プロトコールを改変するか、または適切な治療プロトコールを選択することができる。
それゆえに、本発明の1つの局面は、少なくとも1つのアミノ酸付加、置換、および／または欠失がDNAポリメラーゼに生じ、かつETVおよび／またはLMVならびに任意で他のヌクレオシドアナログへの感受性の低下を示す、DNAポリメラーゼをコードする遺伝子におけるヌクレオチド変異を含む、単離されたHBV変種に向けられる。好ましくは、このDNAポリメラーゼは、ETVまたはおよびETVへの感受性の低下を示す。変種HBVは、HBV DNAポリメラーゼのFドメインおよびA〜Eドメインの1つまたは複数によって規定される領域におけるそのゲノム中の、重複しているオープンリーディングフレームにおける変異を含む。
本発明はさらに、DNAまたは対応するmRNAをHBVから単離すること、およびHBV DNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列における変異（この変異は、HBV DNAポリメラーゼのFドメインおよびA〜Eドメイン、またはそれに近接する領域の任意の1つまたは複数において少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失、および／または付加を生じ、ETVおよび／またはLMVに対する耐性または、低下した感受性を伴う）をスクリーニングすることによって、ETVおよび／またはLMVまたは任意で他のヌクレオシドアナログへの感受性の低下を示すHBVの潜在能力を決定するための方法を意図する。このような変異の存在は、上記エンテカビルおよび／またはLMVへの耐性の可能性を示す。好ましくは、HBV変種は、ETV、またはETVおよびLMVの両方に対する感受性の低下を示す。
本発明はまた、ETVおよび／またはLMVおよび任意で他のヌクレオシドアナログに対して耐性である変種HBV、あるいは変種HBVもしくはその組換え体もしくはその誘導体由来のHBV表面抗原、またはその化学的等価物、ならびに1つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈剤を含む組成物を提供する。本発明のなお別の局面は、B型肝炎ウイルス感染の治療および／または予防のための医薬の製造における、上述の組成物の使用、またはDNAポリメラーゼをコードする遺伝子においてヌクレオチド変異（この変異は、DNAポリメラーゼに対して少なくとも1つのアミノ酸付加、置換、および／または欠失を生じ、ETVおよび／またはLMVおよび任意で他のヌクレオシドアナログに対して感受性の低下を生じる）を含む変種HBVの使用を提供する。
本発明はまた、HBVからDNAまたは対応するmRNAを単離すること、およびDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列における変異をスクリーニングすることによって、HBV株がヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示すか否かを決定するための方法を意図し、ここでスペーサー領域およびrt領域における以下の変異（spacerL97I、spacerK115R、spacerH116L、spacerL128F、spacerS137G、spacerR139G、spacerF142S、rtY54H、rtL91I、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtI169T、rtM250V、rtV173L、rtL180M、rtM204V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS202I、rtH248N、rtY252L、もしくはそれらの組み合わせ、または等価な1つもしくは複数の他の変異）の存在により、ETVおよび／またはLMVならびに任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す変種であることがを示される。
本発明の方法はまた、DNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列における変異をスクリーニングすることによって実施されてもよく、rt領域のBドメインまたはCドメインにおける以下の変異（rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtT184G、rtS202I、およびrtM204V、もしくはその組み合わせ、または等価な1つもしくは複数の他の変異）の存在により、ETVおよび／またはLMVおよび任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示唆する変種であることが示される。
変異rtV173L、rtL180M、およびrtM204Vは、豪州特許第734831号（より初期の命名法システムを使用している）における変異V519L、L526M、M550V、およびM550Vにそれぞれ一致することに注意されたい。
なおさらなる方法論は、エンベロープ遺伝子をコードするヌクレオチド配列における変異をスクリーニング工程を含み、ここで、PreS1、PreS2、およびS遺伝子における以下の変異（重複する逆転写酵素領域の変化を括弧に示す）（PreS1N114D、PreS1 T115S、PreS2 F22L、PreS2 V39A、PreS2 P52L、sL89V、sT118A、sF161L（=rtI169T）、sE164D（=rtV173L）、sI195M（=rtM204V）、sI208T、PreS1 E86Q、PreS1 N91K、PreS2 P41H、sQ30K、sP120T、sL176V、sV194F、もしくはその組み合わせ、または等価な1つもしくは複数の他の変異）の存在により、ETVおよび／またはLMVならびに任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す変種であることが示される。
好ましくは、変種は、それらが天然に存在する体液から離れる少なくとも1つの精製工程を経たような、単離された形態にある。または、変種は、単離された体液で維持され得るかまたはDNA形態であり得る。本発明はまた、変種HBV由来のゲノムまたはその一部を含む感染性分子クローンを意図する。細胞、細胞溶解物、培養上清液、および体液中におけるHBVまたはその成分の検出は、核酸に基づく任意の検出手段を含む任意の便利な手段、例えば、核酸ハイブリダイゼーション技術または複数のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるものであってよい。用語「体液」には、血液系、リンパ系、組織系、または器官系に由来する任意の液体（血清、全血、生検、および生検液、組織移植物、および組織懸濁物（例えば肝懸濁物）を含む）が含まれる。本発明はさらに、核酸に基づく検出手段の異なるアッセイ様式の使用を包含し、これには、とりわけ、制限断片長多型（RFLP）、増幅断片長多型（AFLP）、一本鎖多型（SSCP）、増幅およびミスマッチ検出（AMD）、分散反復配列ポリメラーゼ連鎖反応（IRS-PCR）、逆ポリメラーゼ連鎖反応（iPCR）、および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）が含まれる。逆ハイブリダイゼーションは、特定のヌクレオチドまたはヌクレオシド配列を同定する際に特に有用である技術である。検出の他の形態には、ノーザンブロット、サザンブロット、PCR配列決定、抗体手法（例えば、ELISA、ウェスタンブロット、および免疫組織化学）が含まれる。特に有用なアッセイ法には、固定化オリゴヌクレオチドまたは固定化オリゴペプチド媒介検出系のために必要とされる試薬および成分が含まれる。
本発明の別の局面は、基準HBVまたは野生型HBVからの表面抗原と比較して、単数または複数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含む変種HBVに向けられ、ここで、基準表面抗原または野生型表面抗原に対して生成された抗体は、上記HBV変種と比較して変化した免疫学的プロフィールを示す。1つの変化したプロフィールには、HBVを中和するための能力の減少が含まれる。より詳細には、HBV DNAポリメラーゼのヌクレオシドアナログによって選択された変種HBVの表面抗原は、処理前のHBVと比較して変化した免疫学的プロフィールを示す。本発明のこの局面の変種HBVはまた、処理前のHBVと比較して単数または複数のヌクレオチドの置換、付加、および／または欠失を含むヌクレオチド配列を含み得る。
本発明は、変種HBVに対応する、単離されたHBsAgもしくはその組換え型または誘導体またはその化学的等価物に拡張される。一般的に、HBsAgまたはその組換え型または誘導体型またはその化学的等価物は、基準HBV由来のHBsAgと比較して単数または複数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失もしくは切断を有するアミノ酸配列を含み、ここで、基準HBVを指向する抗体は上記変種HBsAgを有するHBVに対して変化した免疫学的プロフィールを示す。1つの態様において、変化した免疫学的プロフィールは、変種HBVを中和する能力の減少を含む。
本発明は、複数の変異を有し、かつ、1つまたは複数のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下または減少、B型肝炎e抗原のレベルおよび／または機能的活性の減少、または野生型HBVと比較した免疫学的相互作用の減少、抑制、さもなくば障害から選択される、2つまたはそれ以上の特性を示す、HBVの変種の同定および単離に部分的に基づく。従って、これらの変異のパターンを有するHBV変種の同定は、とりわけ、HBV変種を検出するためのアッセイ法、ならびにこれらの変種および／または他のHBV単離物による感染を治療および／または予防する際に有用である薬剤をスクリーニングするためのアッセイ法の開発のため、ならびにHBV感染を管理するための代替的治療養生法の開発のために重要である。
従って、本発明の1つの局面は、（a）1つまたは複数のヌクレオシドアナログに対する耐性、（b）B型肝炎e抗原のレベルおよび／または機能的活性の減少、あるいは（c）減少したか、抑制されたか、さもなくば損なわれた免疫学的相互作用から選択される、少なくとも2つの特性と相関する複数のヌクレオチド変異を含む、単離されたHBV変異体に関する。
本発明の別の局面は、（a）1つまたは複数のヌクレオシドアナログに対する耐性、（b）B型肝炎e抗原のレベルおよび／または機能的活性の減少、ならびに（c）減少したか、抑制されたか、さもなくば損なわれた免疫学的相互作用と相関する、複数のヌクレオチド変異を含む、単離されたHBV変種を意図する。
本発明のなお別の局面は、（a）上記DNAポリメラーゼに少なくとも1つのアミノ酸付加、置換、および／または欠失を生じる、DNAポリメラーゼをコードする遺伝子におけるヌクレオチド変異（上記変種は、ETVおよび／またはLMVおよび任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す）、（b）B型肝炎e抗原をコードする遺伝子、または上記遺伝子の転写制御エレメントにおけるヌクレオチド変異（上記変異は、上記B型肝炎e抗原のレベルおよび／または機能的活性の減少を生じる）、あるいは（c）その免疫学的相互作用を減少、抑制、さもなくば損なう、上記ポリペプチドに対する少なくとも1つのアミノ酸付加、置換、および／または欠失を生じる、B型肝炎ポリペプチドをコードする遺伝子におけるヌクレオチド変異、の2つまたはそれ以上から選択される複数のヌクレオチド変異を含む、単離されたHBV変種を提供する。
本発明の別の局面は、HBVに対する阻害活性を示す薬剤を検出するための方法を意図する。この方法は、プラスミドベクター中に含まれるHBVからのゲノムの複製可能な有効量を含む遺伝子構築物を生成し、次いで、上記細胞に上記構築物をトランスフェクトする工程、トランスフェクションの前、その間、および／または後に被験薬剤を上記細胞に接触させる工程、上記薬剤に耐性である場合、HBVが遺伝子配列を複製、発現し、かつ／またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立て、かつ／もしくは放出するのに十分な時間および条件下で、上記細胞を培養する工程；ならびに、細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルスまたはウイルス成分検出手段に供して、上記薬剤の存在下で、ウイルスが遺伝子物質を複製、発現したか否か、および／またはウイルスが組み立てられ、かつ／もしくは放出されたか否かを決定する工程による。好ましい態様において、バキュロウイルスベクター中のプラスミドベクターおよび上記方法は、細胞を感染させるに有効な量のバキュロウイルスゲノムに含まれるか、または融合されたHBVからのゲノムの複製可能な有効量を含む遺伝子構築物を生成し、次いで、上記細胞に上記構築物を感染させる工程、感染の前、その間、および／または後に被験薬剤を上記細胞に接触させる工程、上記薬剤に耐性である場合、HBVが遺伝子配列を複製、発現し、かつ／またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立て、かつ／もしくは放出するのに十分な時間および条件下で、上記細胞を培養する工程；ならびに、次いで、細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルスまたはウイルス成分検出手段に供して、上記薬剤の存在下で、ウイルスが遺伝子物質を複製、発現したか否か、および／またはウイルスが組み立てられ、かつ／もしくは放出されたか否かを決定する工程を含む。
代替の態様において、本発明は、感染性HBVゲノムが連続した細胞株（例えば、2.2.15またはADであるがこれらに限定されない）に安定して組み込まれるように、複製可能な有効量でHBVのゲノムの感染性コピーを含む連続した細胞株を生成する工程、細胞を被験薬剤と接触させる工程、上記薬剤に耐性である場合、HBVが遺伝子配列を複製、発現し、かつ／またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立て、かつ／もしくは放出するのに十分な時間および条件下で、上記細胞を培養する工程、ならびに、次いで、細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルスまたはウイルス成分検出手段に供して、上記薬剤の存在下で、ウイルスが遺伝子物質を複製、発現したか否か、および／またはウイルスが組み立てられ、かつ／もしくは放出されたか否かを決定する工程を含む。
代替の態様において、本発明はまた、インビトロポリメラーゼアッセイ法においてHBVポリメラーゼに対する阻害活性を示す薬剤を検出するための方法を意図する。HBVポリメラーゼ活性は、確立されたアッセイ法を使用して試験され得る（Gaillardら、Antimicrob Agents Chemother. 46(4)1005-1013, 2002; Xiongら、Hepatology. 28(6)1669-73, 1998）。HBVポリメラーゼは、野生型もしくは基準HBVポリメラーゼ、または変異型HBVポリメラーゼであり得る。
これらの方法と関連して、プラスミドベクターは、バキュロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターのような他のウイルスベクターの一部またはすべてをコードする遺伝子を含み得る（RenおよびNassal, J. Virol. 75(3): 1104-1116, 2001を参照されたい）。
ウイルス変種の同定は、ポリメラーゼまたはL、M、Sタンパク質をコードするエンベロープ遺伝子であるPreS1、PreS2、Sのような特定の組換えウイルス成分を含むワクチン、ならびに欠損HBV変種を含む治療ワクチンを含む、ワクチンの産生を可能にする。合理的薬物設計はまた、ポリメラーゼまたはL、M、Sタンパク質をコードするエンベロープ遺伝子であるPreS1、PreS2、S、あるいはHBVの他の成分と相互作用し得る治療的分子を同定または生成するために利用され得る。このような薬物はまた、治療的な潜在能力を有し得る。
本明細書を通して使用される配列識別子の概要は表2に提供される。
（表２）配列識別子の要約
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、ETVもしくはLMV、またはETVおよびLMV、ならびに任意で他のヌクレオシドアナログを用いた患者の治療後に、HBVのヌクレオシドアナログ耐性変種を同定および単離することに部分的に基づく。特に、ETV、またはETVおよびLMVで治療した患者は、ETVおよび／またはLMVに対する感受性の低下または減少を示すHBVの変種を生じた。ETVおよび／またはLMVに対する感受性に関連した「低下した」または「減少した」と言うことへの本明細書中における言及は、ヌクレオシドアナログに対する完全または実質的な耐性ならびに部分的な耐性を含み、かつ包含し、かつ、ヌクレオシドアナログの存在下における野生型より高い複製速度または複製効率（収量表現型）を含む。1つの局面において、これは、処理前レベルと同様かまたはより高いレベルにまでウイルス負荷を増加することによって便利に測定される。
本発明は、ETVもしくはLMV、またはETVおよびLMV、ならびに任意で他のヌクレオシドアナログを用いた患者の治療後に、HBVのヌクレオシドアナログ耐性変種を同定および単離することに部分的に基づく。特に、ETV、またはETVおよびLMVで治療した患者は、ETVおよび／またはLMVに対する感受性の低下または減少を示すHBVの変種を生じた。ETVおよび／またはLMVに対する感受性に関連した「低下した」または「減少した」と言うことへの本明細書中における言及は、ヌクレオシドアナログに対する完全または実質的な耐性ならびに部分的な耐性を含み、かつ包含し、かつ、ヌクレオシドアナログの存在下における野生型より高い複製速度または複製効率（収量表現型）を含む。1つの局面において、これは、処理前レベルと同様かまたはより高いレベルにまでウイルス負荷を増加することによって便利に測定される。
従って、本発明の1つの局面は、単離されたHBV変種に向けられ、ここで、上記変種は、DNAポリメラーゼに対する少なくとも1つのアミノ酸付加、置換、および／または欠失を生じる、DNAポリメラーゼをコードする遺伝子中のヌクレオチド変異を含み、かつ上記変種は、ETVおよび／またはLMVならびに任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す。
好ましくは、感受性の低下は、ETV、またはETVおよびLMVの両方に関する。
DNAポリメラーゼをコードする遺伝子における変異に加えて、HBVゲノムの重複する性質（図1）により、対応する変異が、表面抗原（HBsAg）をコードする遺伝子にも存在し得、これにより、HBsAgに対する抗体および免疫細胞のような免疫学的試薬の相互作用の減少をもたらす。ウイルス表面成分に対する免疫学的試薬の相互作用の減少には、一般的に、ウイルス表面成分を認識または実質的に認識するための免疫学的記憶の非存在が含まれる。それゆえに、本発明は、ETVおよび／またはLMVに対する感受性の低下、およびHBsAgに対する免疫学的試薬の相互作用の減少を示すHBV変種に拡張され、ここで、その変種は、以下のETVおよび／またはLMVの組み合わせ治療または連続的治療のために選択される。この点に関して用語「連続的」とは、ETVに続いてLMV、もしくはLMVに続いてETV、またはETVおよびLMVもしくLMVおよびETVの各々の複数の連続的投与を意味する。
それゆえに、ウイルス変種は、DNAポリメラーゼにおいてのみ、またはDNAポリメラーゼおよびHBsAgの両方において変異を有し得る。用語「変異」は、その最も広い文脈において読まれるべきであり、複数の変異を含む。
本発明は、上記変異がLMVおよび／またはETVに対して感度の減少をもたらすという条件で、1つの変異、およびHBV DNAポリメラーゼの任意のドメイン、および特に領域FおよびA〜Eまで拡張される。HBV DNAポリメラーゼの領域Fは、以下の式I（配列番号：1）に示されるアミノ酸配列によって定義される：
式I
式中、
B1はLまたはRまたはIであり；
B2はEまたはDであり；
B3はTまたはDまたはAまたはNまたはYであり；
B4はEまたはDであり；
B5はEまたはKまたはQであり；
B6はHまたはRまたはNであり；
B7はIまたはTであり；
B8はAまたはSであり；
B9はTまたはRであり；
B10はAまたはTまたはSであり；
B11はRまたはTであり；
B12はVまたはGであり；
B13はSまたはIまたはTまたはNまたはVであり；
B14はTまたはSまたはHまたはYであり；
B15はRまたはHまたはKまたはQであり；
B16はQまたはPであり；
かつ、S＊はアミノ酸74位に指定される。
式I
B1はLまたはRまたはIであり；
B2はEまたはDであり；
B3はTまたはDまたはAまたはNまたはYであり；
B4はEまたはDであり；
B5はEまたはKまたはQであり；
B6はHまたはRまたはNであり；
B7はIまたはTであり；
B8はAまたはSであり；
B9はTまたはRであり；
B10はAまたはTまたはSであり；
B11はRまたはTであり；
B12はVまたはGであり；
B13はSまたはIまたはTまたはNまたはVであり；
B14はTまたはSまたはHまたはYであり；
B15はRまたはHまたはKまたはQであり；
B16はQまたはPであり；
かつ、S＊はアミノ酸74位に指定される。
本明細書において、参照は、特に、A〜Eドメインによって規定されるようなDNAポリメラーゼの保存領域に対してなされる。領域A〜Eは以下の（および豪州特許第734831号における）式II（配列番号：2）に示されるアミノ酸配列によって規定される：
式II
式中、
Xは任意のアミノ酸であり；
Z1はNまたはDであり；
Z2はIまたはPであり；
Z3はIまたはVであり；
Z4はSまたはDであり；
Z5はTまたはNであり；
Z6はRまたはNであり；
Z7はNまたはIであり；
Z8はNまたはYまたはHであり；
Z9はHまたはYであり；
Z10はGまたはRであり；
Z11はDまたはNであり；
Z12はDまたはNであり；
Z13はSまたはYであり；
Z14はNまたはQであり；
Z15はLまたはMであり；
Z16はKまたはQであり；
Z17はYまたはFであり；
Z18はRまたはWであり；
Z19はYまたはLであり；
Z20はSまたはAであり；
Z21はIまたはVであり；
Z22はIまたはLであり；
Z23はVまたはGであり；
Z24はCまたはLであり；
Z25はAまたはSであり；
Z26はVまたはMであり；
Z27はVまたはTであり；
Z28はRまたはCであり；
Z29はFまたはPであり；
Z30はLまたはVであり；
Z31はAまたはVであり；
Z32はSまたはAであり；
Z33はVまたはLまたはMであり；
Z34はKまたはRであり；
Z35はSまたはTであり；
Z36はVまたはGであり；
Z37はQまたはEであり；
Z38はLまたはSまたはRであり；
Z39はSまたはFであり；
Z40はFまたはYであり；
Z41はTまたはAであり；
Z42はAまたはSであり；
Z43はVまたはIであり；
Z44はTまたはCであり；
Z45はNまたはSであり；
Z46はFまたはVであり；
Z47はSまたはDであり；
Z48はLまたはVであり；
Z49はNまたはQであり；
Z50はVまたはIであり；かつ
M＊はアミノ酸204位であり、
かつ、最初のSはアミノ酸75位に指定される。
式II
Xは任意のアミノ酸であり；
Z1はNまたはDであり；
Z2はIまたはPであり；
Z3はIまたはVであり；
Z4はSまたはDであり；
Z5はTまたはNであり；
Z6はRまたはNであり；
Z7はNまたはIであり；
Z8はNまたはYまたはHであり；
Z9はHまたはYであり；
Z10はGまたはRであり；
Z11はDまたはNであり；
Z12はDまたはNであり；
Z13はSまたはYであり；
Z14はNまたはQであり；
Z15はLまたはMであり；
Z16はKまたはQであり；
Z17はYまたはFであり；
Z18はRまたはWであり；
Z19はYまたはLであり；
Z20はSまたはAであり；
Z21はIまたはVであり；
Z22はIまたはLであり；
Z23はVまたはGであり；
Z24はCまたはLであり；
Z25はAまたはSであり；
Z26はVまたはMであり；
Z27はVまたはTであり；
Z28はRまたはCであり；
Z29はFまたはPであり；
Z30はLまたはVであり；
Z31はAまたはVであり；
Z32はSまたはAであり；
Z33はVまたはLまたはMであり；
Z34はKまたはRであり；
Z35はSまたはTであり；
Z36はVまたはGであり；
Z37はQまたはEであり；
Z38はLまたはSまたはRであり；
Z39はSまたはFであり；
Z40はFまたはYであり；
Z41はTまたはAであり；
Z42はAまたはSであり；
Z43はVまたはIであり；
Z44はTまたはCであり；
Z45はNまたはSであり；
Z46はFまたはVであり；
Z47はSまたはDであり；
Z48はLまたはVであり；
Z49はNまたはQであり；
Z50はVまたはIであり；かつ
M＊はアミノ酸204位であり、
かつ、最初のSはアミノ酸75位に指定される。
好ましくは、変異は、HBV DNAポリメラーゼのFドメインおよびA〜Eドメイン、またはそれに近接する領域のいずれか1つまたは複数における、アミノ酸配列の変化を生じる。
本発明の別の局面は、そのゲノム中の重複するオープンリーディングフレームにおいて変異を含むHBV変種を提供し、上記変異は、HBV DNAポリメラーゼのFドメインおよびA〜Eドメインの1つまたは複数によって規定される領域にあり、そして上記変種は、ETVおよび／またはLMV、ならびに任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す。
関連する態様において、DNAポリメラーゼにおける、式I（配列番号：1）および／またはII（配列番号：2）に示されるような1つまたは複数のアミノ酸の、アミノ酸付加、置換、および／または欠失を生じる、DNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列における変異を含む、HBV変種が提供される：
式I
式中、
B1はLまたはRまたはIであり；
B2はEまたはDであり；
B3はTまたはDまたはAまたはNまたはYであり；
B4はEまたはDであり；
B5はEまたはKまたはQであり；
B6はHまたはRまたはNであり；
B7はIまたはTであり；
B8はAまたはSであり；
B9はTまたはRであり；
B10はAまたはTまたはSであり；
B11はRまたはTであり；
B12はVまたはGであり；
B13はSまたはIまたはTまたはNまたはVであり；
B14はTまたはSまたはHまたはYであり；
B15はRまたはHまたはKまたはQであり；
B16はQまたはPであり；
および、
式II
式中、
Xは任意のアミノ酸であり；
Z1はNまたはDであり；
Z2はIまたはPであり；
Z3はIまたはVであり；
Z4はSまたはDであり；
Z5はTまたはNであり；
Z6はRまたはNであり；
Z7はNまたはIであり；
Z8はNまたはYまたはHであり；
Z9はHまたはYであり；
Z10はGまたはRであり；
Z11はDまたはNであり；
Z12はDまたはNであり；
Z13はSまたはYであり；
Z14はNまたはQであり；
Z15はLまたはMであり；
Z16はKまたはQであり；
Z17はYまたはFであり；
Z18はRまたはWであり；
Z19はYまたはLであり；
Z20はSまたはAであり；
Z21はIまたはVであり；
Z22はIまたはLであり；
Z23はVまたはGであり；
Z24はCまたはLであり；
Z25はAまたはSであり；
Z26はVまたはMであり；
Z27はVまたはTであり；
Z28はRまたはCであり；
Z29はFまたはPであり；
Z30はLまたはVであり；
Z31はAまたはVであり；
Z32はSまたはAであり；
Z33はVまたはLまたはMであり；
Z34はKまたはRであり；
Z35はSまたはTであり；
Z36はVまたはGであり；
Z37はQまたはEであり；
Z38はLまたはSまたはRであり；
Z39はSまたはFであり；
Z40はFまたはYであり；
Z41はTまたはAであり；
Z42はAまたはSであり；
Z43はVまたはIであり；
Z44はTまたはCであり；
Z45はNまたはSであり；
Z46はFまたはVであり；
Z47はSまたはDであり；
Z48はLまたはVであり；
Z49はNまたはQであり；
Z50はVまたはIであり；かつ
M＊はアミノ酸204位であり；
ここで、式IにおけるS＊はアミノ酸74位に指定され、そして式IIにおける最初のSはアミノ酸75位に指定され；
そして上記変種は、ETVおよび／またはLMV、ならびに任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す。好ましくは、感受性の低下は、ETV、またはLMVおよび／またはETVの両方に対してである。
式I
B1はLまたはRまたはIであり；
B2はEまたはDであり；
B3はTまたはDまたはAまたはNまたはYであり；
B4はEまたはDであり；
B5はEまたはKまたはQであり；
B6はHまたはRまたはNであり；
B7はIまたはTであり；
B8はAまたはSであり；
B9はTまたはRであり；
B10はAまたはTまたはSであり；
B11はRまたはTであり；
B12はVまたはGであり；
B13はSまたはIまたはTまたはNまたはVであり；
B14はTまたはSまたはHまたはYであり；
B15はRまたはHまたはKまたはQであり；
B16はQまたはPであり；
および、
式II
Xは任意のアミノ酸であり；
Z1はNまたはDであり；
Z2はIまたはPであり；
Z3はIまたはVであり；
Z4はSまたはDであり；
Z5はTまたはNであり；
Z6はRまたはNであり；
Z7はNまたはIであり；
Z8はNまたはYまたはHであり；
Z9はHまたはYであり；
Z10はGまたはRであり；
Z11はDまたはNであり；
Z12はDまたはNであり；
Z13はSまたはYであり；
Z14はNまたはQであり；
Z15はLまたはMであり；
Z16はKまたはQであり；
Z17はYまたはFであり；
Z18はRまたはWであり；
Z19はYまたはLであり；
Z20はSまたはAであり；
Z21はIまたはVであり；
Z22はIまたはLであり；
Z23はVまたはGであり；
Z24はCまたはLであり；
Z25はAまたはSであり；
Z26はVまたはMであり；
Z27はVまたはTであり；
Z28はRまたはCであり；
Z29はFまたはPであり；
Z30はLまたはVであり；
Z31はAまたはVであり；
Z32はSまたはAであり；
Z33はVまたはLまたはMであり；
Z34はKまたはRであり；
Z35はSまたはTであり；
Z36はVまたはGであり；
Z37はQまたはEであり；
Z38はLまたはSまたはRであり；
Z39はSまたはFであり；
Z40はFまたはYであり；
Z41はTまたはAであり；
Z42はAまたはSであり；
Z43はVまたはIであり；
Z44はTまたはCであり；
Z45はNまたはSであり；
Z46はFまたはVであり；
Z47はSまたはDであり；
Z48はLまたはVであり；
Z49はNまたはQであり；
Z50はVまたはIであり；かつ
M＊はアミノ酸204位であり；
ここで、式IにおけるS＊はアミノ酸74位に指定され、そして式IIにおける最初のSはアミノ酸75位に指定され；
そして上記変種は、ETVおよび／またはLMV、ならびに任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す。好ましくは、感受性の低下は、ETV、またはLMVおよび／またはETVの両方に対してである。
本発明の別の好ましい局面は、式IおよびIIに示されるアミノ酸配列に対応する領域において、HBsAgにおけるアミノ酸の付加、置換、および／または欠失を生じる、HBsAgをコードするヌクレオチド配列中の変異を含むHBV変種を意図し、ここで上記変種は、ETVおよび／またはLMV、ならびに任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す。
より詳細には、本発明は、基準HBVまたは野生型HBVからの表面抗原と比較して、単数または複数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含む変種HBVを提供し、ここで、基準表面抗原または野生型表面抗原に対して生成された抗体は、上記HBV変種を中和する能力の減少を示し、上記変種は、組み合わせ治療または連続的治療において、ETVおよび／またはLMVへの被験体の露出によって選択される。
用語「組み合わせ治療」とは、ETVおよびLMVの両方が同じ組成物中で同時投与されるか、または別個の組成物中で同時に投与されることを意味する。用語「連続的治療」は、2つの薬剤が、互いに数秒、数分、数時間、数日、または数週以内で、かついずれかの順番で投与されることを意味する。連続的治療はまた、ETVまたはLMVのどちらかを用いて治療的経過を完了させ、次いで、ETVまたはLMVの他方を用いて第2の治療的経過を完了させることを含む。
従って、本発明の別の局面は、処理前のHBVと比較して、単数または複数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含むHBV変種を意図し、ここで、変種HBVの表面抗原は、処理前のHBVと比較して変化した免疫学的プロフィールを示し、かつ上記変種HBVは、HBV DNAポリメラーゼのヌクレオシドアナログによって選択され、上記変種は、組み合わせ治療または連続的治療において、ETVおよび／またはLMVに被験体を露出させることによって選択される。
関連する態様において、本発明は、処理前のHBVと比較して、単数または複数のヌクレオチドの置換、付加、および／または欠失を含むヌクレオチド配列を含むHBV変種を提供し、このHBV変種は、処理前のHBVと比較して変化した免疫学的プロフィールを示す表面抗原を有し、上記変種は、組み合わせ治療または連続的治療において、ETVおよび／またはLMVに被験体を露出させることによって選択される。
好ましくは、変種は、天然に存在する体液から離れる少なくとも1つの精製工程を経たような、単離された形態である。または、変種は、単離された体液中で維持されるか、またはDNA形態であってよい。本発明はまた、変種HBVからのゲノムまたはその一部を含む感染性分子クローンを意図する。さらに、本発明は、変種HBVから単離された成分（例えば、単離されたHBsAgであるがこれらに限定されない）を提供する。従って、本発明は、単離されたHBsAgもしくはその組換え型または誘導体またはその化学的等価物を提供し、上記HBsAgは、組み合わせ治療または連続的治療において、ETVおよび／またはLMVに被験体を露出させることによって選択される変種HBVに由来する。
より詳細には、本発明のなお別の局面は、単離された変種HBsAgもしくは組換え体またはその誘導体型またはその化学的等価物に向けられ、ここで、上記HBsAgもしくはその組換え体または誘導体型またはその化学的等価物は、基準HBV由来のHBsAgと比較して、変化した免疫学的プロフィールを示し、上記HBsAgは、組み合わせ治療または連続的治療において、ETVおよび／またはLMVに被験体を露出させることによって選択される変種HBVに由来する。
さらにより詳細には、本発明は、単離された変種HBsAgもしくは組換え体またはその誘導体型またはその化学的等価物を提供し、ここで、上記HBsAgもしくはその組換え体または誘導体型またはその化学的等価物は、基準HBV由来のHBsAgと比較して、単数または複数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失もしくは切断を有するアミノ酸配列を含み、かつ、基準HBVに対する中和抗体は、上記変種HBsAgを有するHBVに対する中和活性を示さないか、またはその活性の減少を示し、上記HBsAgは、組み合わせ治療または連続的治療において、ETVおよび／またはLMVに被験体を露出させることによって選択される変種HBVに由来する。
HBV DNAポリメラーゼにおいて好ましい変異には、ETVおよび／またはLMV治療後にHBVが再発した患者から選択される変種が含まれる。好ましくは、その治療には、組み合わせ治療または連続的治療におけるETV、またはETVおよび／またはLMVの両方を含む。ヌクレオシドアナログ治療は、移植手法（例えば、骨髄移植（BMT）またはOLT）に関連して、または肝炎を有すると診断された患者の治療後に行われ得る。変種の選択後、ウイルス負荷は、処理前レベルよりも高いレベルで得ることができる。
HBV DNAポリメラーゼにおける好ましい変異は、spacerL97I、spacerK115R、spacerH116L、spacerL128F、spacerS137G、spacerR139G、spacerF142S、rtY54H、rtL91I、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtI169T、rtM250V、rtV173L、rtL180M、rtM204V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS202I、rtH248N、rtY252Lの1つまたは複数、もしくはそれらの組み合わせ、または等価物を含み、1つまたは複数の他の変異により変種であることが示され、ここで、上記変種はETVおよび／またはLMV、ならびに任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す。アミノ酸の位置についての命名法システムは、コドンrtM204と命名されたYMDDモチーフにおけるメチオニン残基に基づくことに注意するべきである。この番号付けシステムは、豪州特許第734831号におけるそれとは異なっており、ここでは、ポリメラーゼ遺伝子におけるYMDDモチーフ中のメチオニン残基がコドン550と指定されている。この点に関して、rtV173L、rtL180M、およびrtM204Vは、豪州特許第734831号におけるV519L、L526M、およびM550Vにそれぞれ対応する。用語「スペーサー」は、2つの機能的領域、すなわち末端タンパク質および逆転写酵素の間に指定された領域を意味する。これは、機能的領域に対して正確なフォールディングを提供し、この領域について他の特定の機能は示されていない。対応する変異はまた、エンベロープ遺伝子、例えば、PreS1、PreS2、およびHBsAgの1つまたは複数において起こり得る。特定の変異は以下である：PreS1 N114D、PreS1 T115S、PreS2 F22L、PreS2 V39A、PreS2 P52L、sL89V、s T118A、s 161L、sE164D、sI195M、sI208T PreS1 E86Q、PreS1 N91K、PreS2 P41H、sQ30K、sP120T、sL176V、sV194F、もしくはその組み合わせ、または等価物。1つまたは複数の他の変異により変種であることが示され、ここで、上記変種は、ETVおよび／またはLMV、ならびに任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す。HBsAgをコードする遺伝子におけるsF161L、sE164D、またはsI195Mにおける変異もまた、ポリメラーゼ遺伝子におけるrtI169T、rtV173L、またはrtM204Vにおける変異をそれぞれ生じる。他の対応する変異は、rtにおいて生じ得、例えば、spacerL97I、spacerK115R、spacerH116L、spacerL128F、spacerS137G、spacerR139G、spacerF142S、rtY54H、rtL91I、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtI169T、rtM250V、rtV173L、rtL180M、rtM204V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS202I、rtH248N、rtY252L、もしくはそれらの組み合わせ、または等価物であり、1つもしくは複数の他の変異の存在により変種であることが示され、そして上記変種がETVおよび／またはLMV、および任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す。
本発明の変種の同定は、このような変種を検出するための一定の範囲のアッセイ法の生成を可能にする。このような変種の検出は、化学療法の適切な形態を決定するため、および／またはワクチン接種プロトコールをモニタリングするため、または新規なもしくは修飾したワクチン調製物を開発するために耐性変種を同定する際に重要であり得る。
本発明のなお別の局面は、HBVが、ETVおよび／またはLMV、ならびに任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す潜在能力を決定するための方法を意図し、上記方法は、上記HBVからDNAまたは対応するmRNAを単離する工程、ならびに、FドメインおよびA〜Eドメインのいずれか1つもしくは複数、またはそれに近接した上記DNAポリメラーゼの領域に少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失、および／または付加を生じ、かつETVおよび／またはLMVに対する耐性または低下した感受性と関連する、HBV DNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列における変異をスクリーニングする工程を含み、ここで、このような変異の存在により、上記ETVおよび／またはLMVに対する耐性の可能性が示される。
好ましくは、本発明のアッセイ法は、スペーサー領域およびrt領域における以下の変異：spacerL97I、spacerK115R、spacerH116L、spacerL128F、spacerS137G、spacerR139G、spacerF142S、rtY54H、rtL91I、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtI169T、rtM250V、rtV173L、rtL180M、rtM204V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS202I、rtH248N、rtY252L、もしくはそれらの組み合わせ、または等価物のうち1つもしくは複数の他の変異を検出し、1つまたは複数の変異により変種であることが示され、ここで、上記変種は、ETVおよび／またはLMV、ならびに任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す。
従って、本発明の別の局面は、HBV株がヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示すか否かを決定するための方法を作成し、上記方法は、上記HBVからDNAまたは対応するmRNAを単離する工程、およびDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列における変異をスクリーニングする工程を含み、ここで、スペーサー領域およびrt領域における以下の変異（spacerL97I、spacerK115R、spacerH116L、spacerL128F、spacerS137G、spacerR139G、spacerF142S、rtY54H、rtL91I、rtA97V、rtY124H、rtH126R、rtS135Y、rtI169T、rtM250V、rtV173L、rtL180M、rtM204V、rtA21S、rtA38E、rtF122L、rtT128N、rtQ130P、rtT184G、rtS202I、rtH248N、rtY252L、もしくはそれらの組み合わせ、または等価な1つもしくは複数の他の変異）の存在により変種であることが示され、そして上記変種は、ETVおよび／またはLMV、ならびに任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す。
逆転写酵素における好ましい変異は、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtT184G、rtS202I、およびrtM204V、もしくはそれらの組み合わせ、または等価物であり、1つもしくは複数の他の変異の存在により変種であることが示され、ここで、該変種はETVおよび／またはLMV、ならびに任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す。
従って、本発明の別の局面は、HBV株がヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示すか否かを決定するための方法を意図し、上記方法は、上記HBVからDNAまたは対応するmRNAを単離する工程、およびDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列における変異をスクリーニングする工程を含み、ここで、rt領域のBドメインまたはCドメインにおける以下の変異（rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtT184G、rtS202I、およびrtM204V、もしくはそれらの組み合わせ、または等価な1つもしくは複数の他の変異）の存在により変種であることが示され、そして上記変種はETVおよび／またはLMV、ならびに任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す。
細胞、細胞溶解物、培養上清液、および体液中におけるHBVまたはその成分の検出は、核酸に基づく任意の検出手段を含む任意の便利な手段によって、例えば、核酸ハイブリダイゼーション技術または1回もしくは複数回のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるものであり得る。用語「体液」には、血液系、リンパ系、組織系、または器官系に由来する任意の液体（血清、全血、生検、および生検液、組織移植物、および組織懸濁物（例えば肝懸濁物）を含む）が含まれる。本発明はさらに、核酸に基づく検出手段の異なるアッセイ様式の使用を包含し、これには、とりわけ、制限断片長多型（RFLP）、増幅断片長多型（AFLP）、一本鎖多型（SSCP）、増幅およびミスマッチ検出（AMD）、分散反復配列ポリメラーゼ連鎖反応（IRS-PCR）、逆ポリメラーゼ連鎖反応（iPCR）、および逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）が含まれる。検出の他の形態には、ノーザンブロット、サザンブロット、PCR配列決定、抗体手法（例えば、ELISA、ウェスタンブロット、および免疫組織化学）が含まれる。特に有用なアッセイ法には、固定化オリゴヌクレオチドまたは固定化オリゴペプチド媒介検出系のために必要とされる試薬および成分が含まれる。
1つの特に有用な核酸検出系は、逆ハイブリダイゼーション技術である。この技術において、HBV試料からのDNAは、標識されたアンプリコンを生成するために、ビオチンまたは他のリガンド標識プライマーを使用して増幅される。次いで、ニトロセルロースフィルムのような固体支持体に固定化オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションによって増幅されたDNAを捕捉するために使用される。特定の核酸断片は、ビオチンまたはリガンドを介して同定される。一般的に、標識されたプライマーは、検出される特定のヌクレオチドの異型に特異的である。増幅は、検出されるバリエーションが存在する場合にのみ起こる。逆ハイブリダイゼーションアッセイ法の多くの形態が存在し、そしてすべてが本発明に含まれる。
細胞培養物においてHBV複製を検出することは特に有用である。
本発明の別の局面は、HBVに対する阻害活性を示す薬剤を検出するための方法を意図し、この方法は、以下の工程による：
上記HBV由来の複製可能な有効量のゲノムをプラスミドベクター中に含む遺伝子構築物を生成し、次いで、細胞に上記構築物をトランスフェクトする工程；
上記細胞を、トランスフェクションの前、その間、および／または後に、被験薬剤と接触させる工程；
上記薬剤に耐性である場合、HBVが遺伝子配列を複製、発現し、かつ／またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立て、かつ／もしくは放出するのに十分な時間および条件下で、上記細胞を培養する工程；
次いで、細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルスまたはウイルス成分検出手段に供して、該薬剤の存在下で、ウイルスが遺伝子物質を複製、発現したか否か、および／またはウイルスが組み立てられ、かつ／もしくは放出されたか否かを決定する工程。
上記HBV由来の複製可能な有効量のゲノムをプラスミドベクター中に含む遺伝子構築物を生成し、次いで、細胞に上記構築物をトランスフェクトする工程；
上記細胞を、トランスフェクションの前、その間、および／または後に、被験薬剤と接触させる工程；
上記薬剤に耐性である場合、HBVが遺伝子配列を複製、発現し、かつ／またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立て、かつ／もしくは放出するのに十分な時間および条件下で、上記細胞を培養する工程；
次いで、細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルスまたはウイルス成分検出手段に供して、該薬剤の存在下で、ウイルスが遺伝子物質を複製、発現したか否か、および／またはウイルスが組み立てられ、かつ／もしくは放出されたか否かを決定する工程。
好ましい態様において、プラスミドベクターは、バキュロウイルスまたはアデノウイルスのような他のウイルスベクターの一部または全部をコードする遺伝子を含み得（RenおよびNassal、2001、前出）、かつこの方法は、以下の方法を包含する：
細胞に感染するのに有効な量のバキュロウイルスゲノムもしくはアデノウイルスゲノム中に含まれるか、またはそれに融合されたHBV由来の複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子構築物を生成し、次いで、上記細胞に上記構築物を感染させる工程；
トランスフェクションの前、その間、および／または後に、上記細胞を被験薬剤と接触させる工程；
上記薬剤に耐性である場合、HBVが遺伝子配列を複製、発現し、かつ／またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立て、かつ／もしくは放出するのに十分な時間および条件下で、上記細胞を培養する工程；
次いで、細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルスまたはウイルス成分検出手段に供して、上記薬剤の存在下で、ウイルスが遺伝子物質を複製、発現したか否か、および／またはウイルスが組み立てられ、かつ／もしくは放出されたか否かを決定する工程。
細胞に感染するのに有効な量のバキュロウイルスゲノムもしくはアデノウイルスゲノム中に含まれるか、またはそれに融合されたHBV由来の複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子構築物を生成し、次いで、上記細胞に上記構築物を感染させる工程；
トランスフェクションの前、その間、および／または後に、上記細胞を被験薬剤と接触させる工程；
上記薬剤に耐性である場合、HBVが遺伝子配列を複製、発現し、かつ／またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立て、かつ／もしくは放出するのに十分な時間および条件下で、上記細胞を培養する工程；
次いで、細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルスまたはウイルス成分検出手段に供して、上記薬剤の存在下で、ウイルスが遺伝子物質を複製、発現したか否か、および／またはウイルスが組み立てられ、かつ／もしくは放出されたか否かを決定する工程。
代替の態様において、この方法は、以下の工程を含む：
感染性HBVゲノムが安定して上記連続した細胞株（例えば、2.2.15またはADであるがこれらに限定されない）に安定して組み込まれるように、複製可能な有効量でHBVのゲノムの感染性コピーを含む連続した細胞株を生成する工程；
上記細胞を、被験薬剤と接触させる工程；
上記薬剤に耐性である場合、HBVが遺伝子配列を複製、発現し、かつ／またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立て、かつ／もしくは放出するのに十分な時間および条件下で、上記細胞を培養する工程；ならびに
次いで、細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルスまたはウイルス成分検出手段に供して、上記薬剤の存在下で、ウイルスが遺伝子物質を複製、発現したか否か、および／またはウイルスが組み立てられ、かつ／もしくは放出されたか否かを決定する工程。
感染性HBVゲノムが安定して上記連続した細胞株（例えば、2.2.15またはADであるがこれらに限定されない）に安定して組み込まれるように、複製可能な有効量でHBVのゲノムの感染性コピーを含む連続した細胞株を生成する工程；
上記細胞を、被験薬剤と接触させる工程；
上記薬剤に耐性である場合、HBVが遺伝子配列を複製、発現し、かつ／またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立て、かつ／もしくは放出するのに十分な時間および条件下で、上記細胞を培養する工程；ならびに
次いで、細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルスまたはウイルス成分検出手段に供して、上記薬剤の存在下で、ウイルスが遺伝子物質を複製、発現したか否か、および／またはウイルスが組み立てられ、かつ／もしくは放出されたか否かを決定する工程。
上記に示すように、変種はまた、HBsAg（s遺伝子）およびPreS1、PreS2エンベロープ遺伝子に対する参照を用いて検出され得る。この点に関して好ましい変異は、
PreS1 N114D、PreS1 T115S、PreS2 F22L、PreS2 V39A、PreS2 P52L、sL89V、sT118A、sF161L、sE164D、sI195M、sI208T、PreS1 E86Q、PreS1 N91K、PreS2 P41H、sQ30K、sP120T、sL176V、sV194Fの1つまたは複数を含む。
PreS1 N114D、PreS1 T115S、PreS2 F22L、PreS2 V39A、PreS2 P52L、sL89V、sT118A、sF161L、sE164D、sI195M、sI208T、PreS1 E86Q、PreS1 N91K、PreS2 P41H、sQ30K、sP120T、sL176V、sV194Fの1つまたは複数を含む。
従って、本発明の別の局面は、HBV株がヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示すか否かを決定するための方法を意図し、上記方法は、上記HBVからDNAまたは対応するmRNAを単離する工程、およびエンベロープ遺伝子をコードするヌクレオチド配列中の変異をスクリーニングする工程を含み、ここで、PreS1、PreS2およびHbsAgにおける変異：PreS1 N114D、PreS1 T115S、PreS2 F22L、PreS2 V39A、PreS2 P52L、sL89V、sT118A、sF161L、sE164D、sI195M、sI208T、PreS1 E86Q、PreS1 N91K、PreS2 P41H、sQ30K、sP120T、sL176V、sV194F、もしくはその組み合わせ、または等価な1つもしくは複数の他の変異の存在により変種であることが示され、ここで、上記変種は、ETVおよび／またはLMVならびに任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す。
本発明は、HBVの変種の同定および単離に部分的に基づく。この変種は、複数の変異を有し、かつ、1つまたは複数のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下または減少、B型肝炎e抗原のレベルおよび／または機能的活性の減少、または野生型HBVと比較した免疫学的相互作用の減少、抑制、さもなくば障害から選択される2つまたはそれ以上の特性を示す。従って、これらの変異のパターンを有するHBV変種の同定は、とりわけ、HBV変種を検出するためのアッセイ法、ならびにこれらの変種および／または他のHBV単離物による感染を治療および／または予防する際に有用である薬剤をスクリーニングするためのアッセイ法の開発のため、ならびにHBV感染を管理するための代替的治療養生法の開発のために重要である。
従って、本発明の1つの局面は、（a）1つまたは複数のヌクレオシドアナログに対する耐性、（b）B型肝炎e抗原のレベルおよび／または機能的活性の減少、あるいは（c）減少したか、抑制されたか、さもなくば損なわれた免疫学的相互作用から選択される少なくとも2つの特性と相関する複数のヌクレオチド変異を含む、単離されたHBV変異体に関する。
本発明の別の局面は、（a）1つまたは複数のヌクレオシドアナログに対する耐性、（b）B型肝炎e抗原のレベルおよび／または機能的活性の減少、ならびに（c）減少したか、抑制されたか、さもなくば損なわれた免疫学的相互作用と相関する複数のヌクレオチド変異を含む、単離されたHBV変種を意図する。
本発明のなお別の局面は、（a）DNAポリメラーゼに少なくとも1つのアミノ酸付加、置換、および／または欠失を生じる上記DNAポリメラーゼをコードする遺伝子におけるヌクレオチド変異（上記変種はETVおよび／またはLMVならびに任意で他のヌクレオシドアナログに対する感受性の低下を示す）、（b）B型肝炎e抗原をコードする遺伝子、または上記遺伝子の転写制御エレメントにおけるヌクレオチド変異（上記変異は、上記B型肝炎e抗原のレベルおよび／または機能的活性の減少を生じる）、あるいは（c）その免疫学的相互作用を減少、排除、さもなくば損なう上記ポリペプチドに対する少なくとも1つのアミノ酸付加、置換、および／または欠失を生じる、B型肝炎ポリペプチドをコードする遺伝子におけるヌクレオチド変異、の2つまたはそれ以上から選択される複数のヌクレオチド変異を含む、単離されたHBV変種を提供する。
DNAポリメラーゼのアミノ酸変種の検出は、式IおよびIIにおいて示されるアミノ酸配列に対する参照によって便利に達成される。示される多型は、活性な病原性HBV株について種々のデータベースにおいて示される異型を表す。HBV変種が表されるものと異なるアミノ酸を含むならば、このような単離物は変化したDNAポリメラーゼ活性を有する推定のHBV変種と見なされる。
本発明はさらに、ETVおよび／またはLMV耐性HBV変種を阻害する薬剤を意図する。このような薬剤は、ETVおよび／またはLMVおよび／または任意で他のヌクレオシドアナログによる長期的治療が臨床医によって意図される場合に、特に有用である。この薬剤は、DNAもしくはRNAまたはタンパク質性もしくは非タンパク質性の化学的分子であり得る。例えば、植物、サンゴ、および微生物からのような天然物のスクリーニングはまた、マスキング剤の有用な潜在的供給源として意図される。その薬剤は、単離された形態または薬学的組成物の形態であり得、かつヌクレオシドアナログとともに連続的にまたは同時に投与され得る。
従って、本発明の別の局面は、HBVに対する阻害活性を示し、ETVおよび／またはLMVに対する耐性または低下した感受性を示す薬剤を検出するための方法を意図し、上記方法は以下の工程を含む：
プラスミドベクター中に含まれる上記HBV由来の複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子構築物を生成し、次いで、細胞に上記構築物を感染させる工程；
トランスフェクションの前、その間、および／または後に、上記細胞を被験薬剤と接触させる工程；
上記薬剤に耐性である場合、HBVが遺伝子配列を複製、発現し、かつ／またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立て、かつ／もしくは放出するのに十分な時間および条件下で、上記細胞を培養する工程；
細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルスまたはウイルス成分検出手段に供して、上記薬剤の存在下で、ウイルスが遺伝子物質を複製、発現したか否か、および／またはウイルスが組み立てられ、かつ／もしくは放出されたか否かを決定する工程。
プラスミドベクター中に含まれる上記HBV由来の複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子構築物を生成し、次いで、細胞に上記構築物を感染させる工程；
トランスフェクションの前、その間、および／または後に、上記細胞を被験薬剤と接触させる工程；
上記薬剤に耐性である場合、HBVが遺伝子配列を複製、発現し、かつ／またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立て、かつ／もしくは放出するのに十分な時間および条件下で、上記細胞を培養する工程；
細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルスまたはウイルス成分検出手段に供して、上記薬剤の存在下で、ウイルスが遺伝子物質を複製、発現したか否か、および／またはウイルスが組み立てられ、かつ／もしくは放出されたか否かを決定する工程。
本発明のなお別の局面は、HBVに対する阻害活性を示し、ETVおよび／またはLMVに対する耐性または低下した感受性を示す薬剤を検出するための方法を提供し、上記方法は以下の工程を含む：
細胞に感染するのに有効な量のバキュロウイルスゲノム中に含まれるか、またはそれに融合された上記HBV由来の複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子構築物を生成し、次いで、上記細胞に上記構築物を感染させる工程；
感染の前、その間、および／または後に、上記細胞を被験薬剤と接触させる工程；
上記薬剤に耐性である場合、HBVが遺伝子配列を複製、発現し、かつ／またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立て、かつ／もしくは放出するのに十分な時間および条件下で、上記細胞を培養する工程；
細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルスまたはウイルス成分検出手段に供して、該薬剤の存在下で、ウイルスが遺伝子物質を複製、発現したか否か、および／またはウイルスが組み立てられ、かつ／もしくは放出されたか否かを決定する工程。
細胞に感染するのに有効な量のバキュロウイルスゲノム中に含まれるか、またはそれに融合された上記HBV由来の複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子構築物を生成し、次いで、上記細胞に上記構築物を感染させる工程；
感染の前、その間、および／または後に、上記細胞を被験薬剤と接触させる工程；
上記薬剤に耐性である場合、HBVが遺伝子配列を複製、発現し、かつ／またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立て、かつ／もしくは放出するのに十分な時間および条件下で、上記細胞を培養する工程；
細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルスまたはウイルス成分検出手段に供して、該薬剤の存在下で、ウイルスが遺伝子物質を複製、発現したか否か、および／またはウイルスが組み立てられ、かつ／もしくは放出されたか否かを決定する工程。
本発明のなお別の局面は、HBVに対する阻害活性を示し、ETVおよび／またはLMVに対する耐性または低下した感受性を示す薬剤を検出するための方法を提供し、上記方法は以下の工程を含む：
細胞に感染するのに有効な量のバキュロウイルスゲノム中に含まれるか、またはそれに融合された上記HBV由来の複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子構築物を生成し、次いで、上記細胞に上記構築物を感染させる工程；
感染の前、その間、および／または後に、上記細胞を被験薬剤と接触させる工程；
上記薬剤に耐性である場合、HBVが遺伝子配列を複製、発現し、かつ／またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立て、かつ／もしくは放出するのに十分な時間および条件下で、上記細胞を培養する工程；
細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルスまたはウイルス成分検出手段に供して、該薬剤の存在下で、ウイルスが遺伝子物質を複製、発現したか否か、および／またはウイルスが組み立てられ、かつ／もしくは放出されたか否かを決定する工程。
細胞に感染するのに有効な量のバキュロウイルスゲノム中に含まれるか、またはそれに融合された上記HBV由来の複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子構築物を生成し、次いで、上記細胞に上記構築物を感染させる工程；
感染の前、その間、および／または後に、上記細胞を被験薬剤と接触させる工程；
上記薬剤に耐性である場合、HBVが遺伝子配列を複製、発現し、かつ／またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立て、かつ／もしくは放出するのに十分な時間および条件下で、上記細胞を培養する工程；
細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルスまたはウイルス成分検出手段に供して、該薬剤の存在下で、ウイルスが遺伝子物質を複製、発現したか否か、および／またはウイルスが組み立てられ、かつ／もしくは放出されたか否かを決定する工程。
好ましくは、HBVゲノムは細胞のゲノムに安定に組み込まれる。
バキュロウイルスベクターは本発明の実施において特に有用である一方、本発明は、例えばアデノウイルスベクターであるがこれに限定されない一定の範囲の他のベクターに拡張される。
本発明はさらに、HBVゲノムのすべてもしくは一部、またはそれに由来する遺伝子もしくはその遺伝子の一部を含む遺伝子構築物を有する細胞株に拡張される。
本発明はまた、抗ウイルス剤をスクリーニングするための本発明のHBV変種の使用を提供する。これらの抗ウイルス剤はウイルスを阻害する。用語「阻害する」は、感染、複製、組立て、および／または放出、または任意の中間の段階を拮抗するか、またはさもなくば妨害することを含む。好ましい抗ウイルス剤にはヌクレオシドアナログが含まれるが、本発明は非ヌクレオシド分子にまで拡張される。
さらに、ヌクレオシドを模倣するかまたは特定のヌクレオチド配列もしくは特定のヌクレオチドと相互作用するかのいずれかである化学的分子を、同定または生成するため、合理的薬物設計もまた意図される。コンビナトリアル化学およびツーハイブリッドスクリーニングは、強力な治療的または診断的薬剤を同定するために利用され得る多数の技術のうちのいくつかである。
1つの例において、ポリメラーゼまたは表面抗原の結晶構造は、機能および／または抗原性に必要とされる分子の鍵となる領域と相互作用する可能性のある小さな化学分子を、合理的に設計するために使用される。このような薬剤は、ポリメラーゼ活性の阻害物質として有用であり得、および／または表面抗原上のエピトープを変化させ得る。
HIV由来の逆転写酵素との類似性のため、HBVポリメラーゼのいくつかのモデルが調製されてきた（Dasら、J. Virol. 75(10): 4771-4779, 2001; Bartholomeuszら、Intervirology 40(5-6): 337-342 1997; Allenら、Hepatology 27(6): 1670-1677, 1998）。HBVポリメラーゼのモデルは、耐性変異ならびに野生型ウイルスをコードするHBVに対して有効である、新規薬剤の合理的薬物設計のために使用され得る。設計される合理的薬物は、耐性に関連する変異をコードするHBVの選択において使用される薬剤のような、存在する抗ウイルス剤の改変物に基づき得る。変異をコードするHBVの遺伝子材料を発現するウイルスまたはクローンを、新規の抗ウイルス剤をスクリーニングするために用いてもよい。
上記の方法は、ETVおよび／またはLMV耐性HBVの阻害物質を同定する際に特に有用である。それゆえに、本発明は、阻害物質の組成物に拡張される。この阻害物質はまた、抗体、または、共抑制もしくはRNA干渉（RNAi）の導入のためのリボザイム、アンチセンス分子、および／もしくはセンス分子のような遺伝子分子の形態であり得る。RNAiへの言及はsiRNAへの言及を含む。
用語「組成物」は「薬学的組成物」を含む。
この阻害物質は、「活性成分」または「活性化合物」と以下で呼ばれ、かつ上記に与えられる阻害物質のリストから選択され得る。
この組成物は、HBVの抗原性成分、欠損HBV変種、または、天然物のスクリーニングを通して、もしくは合理的な薬物設計（コンビナトリアル化学を含む）を通して同定された薬剤を含み得る。
薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、任意のおよびすべての、溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。活性成分と適合しない任意の従来の媒体または薬剤の範囲を除いて、治療的組成物におけるそれらの使用が意図される。補助的な活性成分もまた、組成物に組み込まれ得る。
この薬学的組成物はまた、標的細胞にトランスフェクションされ得るベクターのような遺伝子分子を含み得る。ここで、このベクターは、アスパルチルプロテアーゼ阻害物質をコードし得る核酸分子を有する。このベクターは、例えば、ウイルスベクターであり得る。
注射可能な用途のために適切な薬学的な形態には、滅菌水溶液（水溶性である場合）および滅菌注射可能溶液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。これは、製造および保存の条件下で安定でなくてはならず、かつ微生物（例えば、細菌および真菌）の混入作用を防止しなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物性油脂を含む、溶媒または希釈媒体であり得る。適切な流動性が、例えば、界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の予防が、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合において、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の組成物における使用によってもたらされ得る。
滅菌注射可能溶液は、活性成分および任意で他の必要とされる活性成分とともに、適切な溶媒中に必要とされる量で活性化合物を取り込むこと、続いて濾過滅菌または他の適切な滅菌手段によって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の適切な方法には、活性成分の粉末に加えて任意の付加的な所望の成分を生じる、真空乾燥および凍結乾燥技術が含まれる。
活性成分が適切に保護される場合、それは例えば、不活性希釈剤もしくは吸収可能な可食性の担体とともに経口的に投与され得るか、またはそれはハードもしくはソフトな外皮のゼラチンカプセル中に封入され得るか、またはそれは錠剤に圧縮され得る。経口治療的投与のために、活性成分は賦形剤とともに組み込まれてもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁物、シロップ、ウェファーなどの形態で使用され得る。このような組成物および調製物は重量で少なくとも1％の活性化合物を含むべきである。この組成物および調製物の割合は、当然変化してもよく、かつ、簡便に、重量の単位の約5〜約80％の間であり得る。このような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な用量が得られるような量である。本発明に従う好ましい組成物または調製物は、経口単位投与剤形が約0.1μg〜200mgの活性化合物を含むように調製される。別の用量は約1μg〜約1000mgおよび約10μg〜約500mgを含む。これらの用量は、個体あたりまたはkg体重あたりであり得る。投与は、時間ごと、日ごと、週ごと、月ごと、または年ごとであり得る。
錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなどはまた、以後に列挙されるような成分を含み得る。ガム、アカシア、トウモロコシデンプン、またはゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；およびショ糖、乳糖、またはサッカリンのような甘味料が添加され得るか、あるいはペパーミント、ウィンターグリーン油、またはチェリー香料のような香味剤が付加され得る。単位投与剤形がカプセルである場合、これは、上記のタイプの物質に加えて、液体担体を含み得る。種々の他の物質がコーティングとして存在し得るか、またはさもなくば、投与単位の物理的形態を修飾し得る。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセルは、シェラック、糖、またはその両方でコートされ得る。シロップまたはエリキシルは、活性化合物、甘味料としてのショ糖、保存料としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素および香料を含み得る。当然、任意の単位投与剤形を調製するために使用される任意の物質は、使用される量において薬学的に純粋であり、かつ実質的に非毒性であるべきである。さらに、活性化合物は徐放性調製物および処方物に組み込まれ得る。
上記に言及したように、本発明はさらに、本明細書中に記載されるHBV変種から単離されたHBsAgに拡張される。より詳細には、本発明は、HBsAgもしくはその組換え型または誘導体またはその化学的等価物を提供する。単離された表面成分および、より詳細には、単離された表面抗原もしくはその組換え体、誘導体、または化学的等価物は、ワクチン製剤のような生物学的組成物の開発において有用である。
本発明のなお別の局面は、ETVおよび／またはLMVならびに任意で他のヌクレオシドアナログに対して耐性の変種HBV、あるいは上記変種HBVもしくは組換え体またはその誘導体型またはその化学的等価物、および1つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈剤を含む組成物を提供する。
上記に示したように、抗体は、変異体HBV薬剤に対して生成され得、かつこれらのウイルスによる感染に対して受動的または直接的なワクチン接種のために使用され得る。この抗体は、ヒトまたは非ヒト動物において生成され得る。後者の場合、非ヒト抗体は、使用の前に非免疫化される必要があり得るか、またはより詳細には、ヒト化される必要がある。非免疫化には、例えば、マウスまたは非ヒト動物の抗HBV抗体の可変領域からの相補性決定部位（CDR）を、ヒトコンセンサス断片抗体結合（Fab）ポリペプチドに移植することが含まれ得る。または、抗体の可変領域中のエピトープを規定するアミノ酸が、エピトープがヒトMHCII複合体によってもはや認識されないように変異され得る。
リボザイム、アンチセンスまたは共抑制（RNAi）の抑制が関与する範囲で、これは、都合のよいことに転写後遺伝子サイレンシングを目的とする。DNAまたはRNAが投与されるか、またはHBV mRNAに特異的なRNAiを含む複合体もしくはその化学的アナログが利用され得る。
すべてのこのような分子は薬学的組成物中に取り込まれ得る。
別の態様において、本発明は、変種HBV、またはHBsAg、または上記HBV由来のL、M、もしくはSタンパク質もしくは組換え体またはその誘導体型またはその化学的等価物を含む、生物学的組成物を提供する。
一般的に、HBVが使用される場合、これは最初に弱毒化される。本発明のこの局面に従う生物学的組成物は、一般的に、1つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈剤をさらに含む。
この生物学的組成物は、1種のHBV変種からのHBsAgまたは同様の分子を含んでもよく、またはこの組成物は、一定の範囲のETVおよび／またはLMV耐性HBV変種由来のHBsAgまたはL、M、もしくはSタンパク質または、同様の分子のカクテルであってもよい。同様の包含は、組成物がHBVを含む場合に適用される。
本発明はさらに、特定のヌクレオチド配列を有するか、あるいは特定のポリメラーゼまたは表面抗原またはL、M、もしくはSタンパク質をコードする、HBV株による感染に対して個体にワクチン接種するための治療ワクチンの製造における、欠損HBV変種の使用に向けられる。
1つの態様において、例えば、ヌクレオシドアナログに対する耐性または低下した感受性を付与するポリメラーゼ中の特定の変異を有する、HBV変種が同定され得る。次いで、この変種は、それを欠損させる、すなわち、弱毒化または感染を引き起こすことができないようにするために変異され得る。次いで、このような欠損ヌクレオシドアナログ耐性ウイルスは、ポリメラーゼ中に同じ変異を有する有毒なウイルスに対する治療ワクチンとして使用され得る。
本発明は、ETVおよび／またはLMVに対して耐性である変種HBVについてのアッセイ法のためのキットに拡張される。このようなキットは、例えば、PCRもしくは他の核酸ハイブリダイゼーション技術のための試薬、または免疫学に基づく検出技術のための試薬を含む。特に有用なアッセイ法には、固定化オリゴヌクレオチドまたは固定化オリゴペプチド媒介検出系に必要とされる試薬および成分が含まれる。
本発明のなお別の局面は、HBVがETVおよび／もしくはLMVまたは任意で他のヌクレオシドアナログに対して感受性の低下を示す潜在能力を決定するための方法を意図する。上記方法は、上記HBVからDNAまたは対応するmRNAを単離する工程、ならびに、少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失、および／または付加を、DNAポリメラーゼのFドメインおよびA〜Eドメインまたはそれに近接する領域のいずれか1つまたは複数に生じ、かつETVおよび／またはLMVに対する耐性または低下した感受性を伴う、HBV DNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列における変異をスクリーニングする工程を含む。このような変異の存在により、上記ETVおよび／またはLMVに対する耐性の可能性が示される。
潜在的なウイルス変種の評価は、適切な治療プロトコールの選択のために重要である。このような評価は、ソフトウェアでプログラムされたコンピュータの補助で適切に促進される。これは、とりわけ、特定の化学的化合物または免疫学的薬剤に対するウイルス変種の耐性または感度に対応する強度値（PA）を提供するための、ウイルス変種に付随する少なくとも2つの特徴についての指標値（Ivs）を加える。Ivsは（a）特定の化合物または免疫学的薬剤に対する感受性の低下に対する耐性を示す能力；（b）野生型HBV由来の変化したDNAポリメラーゼ；（c）野生型HBV由来の変化した表面抗原；または（d）患者の罹患率または回復可能性から選択され得る。従って、本発明に従って、このような特徴についてのIvsは、特定のウイルス変種またはそれを含む生物学的試料についてのPAを提供するためにデータを処理することができる、機械読み取り可能な保存媒体に保存される。
従って、別の局面において、本発明は、被験体における適切な治療プロトコールを決定するための、ウイルス変種またはそれを含む生物学的試料の有用性の可能性を評価するためのコンピュータプログラム製品を意図し、上記製品は以下を含む：
（1）入力Ivsとして、ウイルス薬剤またはウイルス薬剤を含む生物学的試料と関連する少なくとも2つの特徴を受け取るコードであって、該特徴が以下から選択されるコード：
（a）特定の化合物または免疫学的薬剤に対する感受性の低下に対して耐性を示す能力；
（b）野生型HBV由来の変化したDNAポリメラーゼ；
（c）野生型HBV由来の変化した表面抗原；あるいは
（d）患者の罹患率または回復可能性；
（e）複製能力の変化（増加または減少）；
（2）上記Ivsを付加し、上記ウイルス変種または生物学的試料に関するPvに対応する合計値を提供するコード；ならびに
（3）コードを保存するコンピュータ読み取り可能な媒体。
（1）入力Ivsとして、ウイルス薬剤またはウイルス薬剤を含む生物学的試料と関連する少なくとも2つの特徴を受け取るコードであって、該特徴が以下から選択されるコード：
（a）特定の化合物または免疫学的薬剤に対する感受性の低下に対して耐性を示す能力；
（b）野生型HBV由来の変化したDNAポリメラーゼ；
（c）野生型HBV由来の変化した表面抗原；あるいは
（d）患者の罹患率または回復可能性；
（e）複製能力の変化（増加または減少）；
（2）上記Ivsを付加し、上記ウイルス変種または生物学的試料に関するPvに対応する合計値を提供するコード；ならびに
（3）コードを保存するコンピュータ読み取り可能な媒体。
関連する局面において、本発明は、被験体におけるウイルス変種またはウイルス変種を含む生物学的試料の有用性の可能性を評価するためのコンピュータに拡張され、上記コンピュータは以下を含む：
（1）機械読み取り可能なデータでコードされたデータ保存材料を含む機械読み取り可能なデータ保存媒体であって、上記機械読み取り可能なデータが、上記ウイルス変種または生物学的試料と関連する少なくとも2つの特徴についてのIvsを含み；上記特徴が以下から選択される、データ保存媒体：
（a）特定の化合物または免疫学的薬剤に対する感受性の低下に対して耐性を示す能力；
（b）野生型HBV由来の変化したDNAポリメラーゼ；
（c）野生型HBV由来の変化した表面抗原；または
（d）患者の罹患率または回復可能性；
（e）複製能力の変化（増加または減少）；
（2）上記機械読み取り可能なデータを処理するための命令を保存するための作業メモリ；
（3）上記機械読み取り可能なデータを処理して、上記化合物に関するPvに対応する上記Ivsの合計値を提供するために、上記作業メモリおよび該機械読み取り可能なデータ保存媒体に連結された中央演算処理装置；ならびに
（4）上記Pvを受け取るために、上記中央演算処理装置に連結された出力ハードウェア。
（1）機械読み取り可能なデータでコードされたデータ保存材料を含む機械読み取り可能なデータ保存媒体であって、上記機械読み取り可能なデータが、上記ウイルス変種または生物学的試料と関連する少なくとも2つの特徴についてのIvsを含み；上記特徴が以下から選択される、データ保存媒体：
（a）特定の化合物または免疫学的薬剤に対する感受性の低下に対して耐性を示す能力；
（b）野生型HBV由来の変化したDNAポリメラーゼ；
（c）野生型HBV由来の変化した表面抗原；または
（d）患者の罹患率または回復可能性；
（e）複製能力の変化（増加または減少）；
（2）上記機械読み取り可能なデータを処理するための命令を保存するための作業メモリ；
（3）上記機械読み取り可能なデータを処理して、上記化合物に関するPvに対応する上記Ivsの合計値を提供するために、上記作業メモリおよび該機械読み取り可能なデータ保存媒体に連結された中央演算処理装置；ならびに
（4）上記Pvを受け取るために、上記中央演算処理装置に連結された出力ハードウェア。
任意の一般的なまたは特定の目的のコンピュータシステムが本発明によって意図され、かつ、これはメモリと少なくとも1つの入力／出力装置（例えば、端末装置）の両方との電子的連絡があるプロセッサを含む。このようなシステムは、パーソナルコンピュータ、ワークステーション、またはメインフレームを含み得るがこれらに限定されない。このプロセッサは、RAMメモリに配置されたプログラムを実行する、一般的な目的のプロセッサまたはマイクロプロセッサまたは特定のプロセッサであり得る。このプログラムは、ディスクまたはあらかじめプログラムされたROMメモリのような保存デバイスからRAMに配置され得る。1つの態様におけるRAMメモリは、データ保存とプログラムの実行の両方のために使用される。このコンピュータシステムはまた、プロセッサおよびメモリが異なる物理的実体上に存在するが、これらがネットワークによって電子的に連絡しているシステムを含む。例えば、図7に示される全体の特徴を有するコンピュータシステムが、本発明の実施において有用であり得る。より詳細には、図7は、例えば、内部バスまたは外部ネットワーク、プロセッサ（101）、RAM（102）、ROM（103）、端末装置（104）、および任意で外部保存デバイス（例えば、ディスケット、CD ROM、または磁気テープ）（105）を介した互いに電子的な連絡（100）を有する、代表的なコンピュータワークステーションの模式図である。
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに記載される。
実施例1
HBVの重複するゲノム
HBVの重複するゲノムを図1に表す。DNAポリメラーゼをコードする遺伝子（P）は、ウイルスエンベロープ遺伝子Pre-S1およびPre-S2と重複し、そしてX遺伝子およびコア遺伝子（C）と部分的に重複する。HBVエンベロープは、小、中、および大HBV表面抗原を含む。大タンパク質成分は、HBV表面抗原（HBsAg）といわれ、S遺伝子配列によって取り囲まれている。Pre-S1遺伝子配列およびPre-S2遺伝子配列は他のエンベロープ成分をコードしている。
HBVの重複するゲノム
HBVの重複するゲノムを図1に表す。DNAポリメラーゼをコードする遺伝子（P）は、ウイルスエンベロープ遺伝子Pre-S1およびPre-S2と重複し、そしてX遺伝子およびコア遺伝子（C）と部分的に重複する。HBVエンベロープは、小、中、および大HBV表面抗原を含む。大タンパク質成分は、HBV表面抗原（HBsAg）といわれ、S遺伝子配列によって取り囲まれている。Pre-S1遺伝子配列およびPre-S2遺伝子配列は他のエンベロープ成分をコードしている。
実施例2
患者および治療
患者Aは慢性B型肝炎を有する44歳の男性であり、血清HBV DNAレベルの上昇（＞2000pg/ml）を0日目（1999年7月9日）に呈し、すぐにLMV治療を開始した（図2）。患者AはHBsAg陽性であり、かつ抗HBe陽性であった。LMV治療開始後、HBV DNAレベルは治療の54日間にわたって8pg/mlまで落ちた。HBV DNAレベルは199日目まで低いままであり、ここで複製の再発が存在し、その結果HBV DNAレベルが1826pg/mlに達した。241日目までに血清ALTは741IU/lで最高に達した。HBV DNAを配列決定し、LMV耐性ウイルスを検出した。次いで、患者を、382日目（2000年7月24日）に盲検化ETVおよびLMV臨床試験に登録した。HBV DNAレベルは33pg/mlまで減少したのみであり、ALTは784日目までに167IU/Lまで減少した。この患者は、非盲検化（open label）ETVおよびLMVを開始した。しかし、HBV DNAレベルおよびALTの両方は上昇し続け、そしてHBV DNAを894日目で配列決定した（図2）。
患者および治療
患者Aは慢性B型肝炎を有する44歳の男性であり、血清HBV DNAレベルの上昇（＞2000pg/ml）を0日目（1999年7月9日）に呈し、すぐにLMV治療を開始した（図2）。患者AはHBsAg陽性であり、かつ抗HBe陽性であった。LMV治療開始後、HBV DNAレベルは治療の54日間にわたって8pg/mlまで落ちた。HBV DNAレベルは199日目まで低いままであり、ここで複製の再発が存在し、その結果HBV DNAレベルが1826pg/mlに達した。241日目までに血清ALTは741IU/lで最高に達した。HBV DNAを配列決定し、LMV耐性ウイルスを検出した。次いで、患者を、382日目（2000年7月24日）に盲検化ETVおよびLMV臨床試験に登録した。HBV DNAレベルは33pg/mlまで減少したのみであり、ALTは784日目までに167IU/Lまで減少した。この患者は、非盲検化（open label）ETVおよびLMVを開始した。しかし、HBV DNAレベルおよびALTの両方は上昇し続け、そしてHBV DNAを894日目で配列決定した（図2）。
患者Bは肝移植患者である。この患者は、ガンシクロビル、ファムシクロビル（famciclovir）、LMV、およびETVを含む多数のヌクレオシドアナログで治療された。この患者は、ETVの前にLMVで治療された。この患者は現在ETV治療中である。ETV治療の間、HBV DNAレベルは5pg/ml未満にまで減少した。移植後3857日に対応する、ETV治療の532日目で、993pg/mlへのHBV DNAレベルの上昇があった。この試料からのHBV DNAは、配列決定によってさらに特徴付けられた。
実施例3
ウイルスマーカーの検出
B型肝炎表面抗原（HBsAg）、B型肝炎e抗原（HBeAg）、抗HBeおよびB型肝炎コア抗原（HBcAg）特異的IgGおよびIgMを市販の免疫アッセイ法（Abbott Laboratories, North Chicago, IL, USA）を使用して測定した。B型肝炎ウイルスDNAレベルを、製造業者の指示書（Digene Hybrid Capture II, Digene Diagnostics Inc., Beltsville, MD）に従って捕捉ハイブリダイゼーションアッセイ法を使用して測定した。製造業者は、臨床試料においてHBVウィルス血症を検出するためのカットオフは、0.7×106コピー/mlまたは2.5pg/mlであると述べた（Hendricks DAら、Am J. Clin Pathol 104: 537-46, 1995）。
ウイルスマーカーの検出
B型肝炎表面抗原（HBsAg）、B型肝炎e抗原（HBeAg）、抗HBeおよびB型肝炎コア抗原（HBcAg）特異的IgGおよびIgMを市販の免疫アッセイ法（Abbott Laboratories, North Chicago, IL, USA）を使用して測定した。B型肝炎ウイルスDNAレベルを、製造業者の指示書（Digene Hybrid Capture II, Digene Diagnostics Inc., Beltsville, MD）に従って捕捉ハイブリダイゼーションアッセイ法を使用して測定した。製造業者は、臨床試料においてHBVウィルス血症を検出するためのカットオフは、0.7×106コピー/mlまたは2.5pg/mlであると述べた（Hendricks DAら、Am J. Clin Pathol 104: 537-46, 1995）。
実施例4
HBV DNAの配列決定
HBV DNAを、Ayeら、J. Hepatol. 26: 1148-53, 1997によって以前に記載されたように6つの異なる時点（図2）で収集した100μlの血清から抽出した。オリゴヌクレオチドは、Geneworks, Adelaide, Australiaによって合成された。HBVポリメラーゼ遺伝子の増幅は、Ayeら、1997, 前出によって記載された。
HBV DNAの配列決定
HBV DNAを、Ayeら、J. Hepatol. 26: 1148-53, 1997によって以前に記載されたように6つの異なる時点（図2）で収集した100μlの血清から抽出した。オリゴヌクレオチドは、Geneworks, Adelaide, Australiaによって合成された。HBVポリメラーゼ遺伝子の増幅は、Ayeら、1997, 前出によって記載された。
特異的増幅産物を、MO BIO Laboratories Inc（La Jolla, CA）からのPCR精製カラムを使用して精製し、およびBig Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（Perkin Elmer, Cetus Netwalk, CT）を使用して直接配列決定した。PCRプライマーを、PCR産物の内部領域を配列決定するために、配列決定プライマー、
として使用した。
実施例5
HBV DNAの分析
患者A：rtL180MおよびrtM204VでのLMV耐性変異を、199日目までに配列決定することにより決定した（表3）。エンテカビルおよびLMV治療の盲検化段階の間、rtV173Lでの変異もまた検出した。rtI169TでのBドメインにおける固有の変異を、rtL180MおよびrtV173Lでの2つの他のBドメイン変異、ならびにCドメインにおけるrtM204Vでの変異とともに検出した。多数の固有の変化もまた、ポリメラーゼおよび重複するエンベロープ遺伝子において検出した（表4、図4、5、および6）。これらの固有の変化を、固有の変化を決定するために、7つの遺伝子型A-Gの各々からの参照配列、ならびに処理前の試料からのコンセンサス配列と比較した。
HBV DNAの分析
患者A：rtL180MおよびrtM204VでのLMV耐性変異を、199日目までに配列決定することにより決定した（表3）。エンテカビルおよびLMV治療の盲検化段階の間、rtV173Lでの変異もまた検出した。rtI169TでのBドメインにおける固有の変異を、rtL180MおよびrtV173Lでの2つの他のBドメイン変異、ならびにCドメインにおけるrtM204Vでの変異とともに検出した。多数の固有の変化もまた、ポリメラーゼおよび重複するエンベロープ遺伝子において検出した（表4、図4、5、および6）。これらの固有の変化を、固有の変化を決定するために、7つの遺伝子型A-Gの各々からの参照配列、ならびに処理前の試料からのコンセンサス配列と比較した。
患者B：ETV治療の532日で試料を配列決定し、かつETV治療前の試料と比較した（図8、9、および10）。いくつかのポリメラーゼ変異をこの試料中で検出し、これには、rtA21S、rtA38E、rtY54H、rtN76D、rtL91I、rtF122L、rtY124H、rtT128N、rtQ130P、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V、rtH248N、rtY252Lが含まれた。ETV治療の最初には、患者は、LMV治療中であり、かつrtL80MおよびM204Vでの変異が検出された（図8、9、および10）。LMV変異（rtL180MおよびrtM204V）を、LMV選択圧の非存在下にもかかわらずETV治療中に検出し、かつこれらの変異もまた、ETV耐性に寄与し得る。ETVでのウイルス学的な突破の時点で、LMV選択された変異、ならびに上記に列挙された変異がなお存在した。列挙されたすべての変異を、固有の変化を決定するために、7つの遺伝子型A-Gの各々からの参照配列、ならびに処理前の試料からのコンセンサス配列と比較した。
患者BはHBeAg陰性であり、この患者から単離されたHBVはG1896Aでプレコア遺伝子中に変異をコードした。これは、プレコアタンパク質中の終止コドンprecoreW28Stopを生じる。G1896Aでのプレコア変異を含んだゲノム中の他の領域における変異は、ポリメラーゼ遺伝子における変異とともに、HBVの複製の適応度、および抗ウイルス剤への感度に影響を与え得る。
実施例6
エンテカビル耐性のインビトロ分析
エンテカビルに対する耐性HBV変異体の感受性／耐性プロフィールを、組換えHBV／バキュロウイルスを使用してインビトロで試験した。耐性プロフィールを分析するための手順は、以下の実施例7〜14において概説される。
エンテカビル耐性のインビトロ分析
エンテカビルに対する耐性HBV変異体の感受性／耐性プロフィールを、組換えHBV／バキュロウイルスを使用してインビトロで試験した。耐性プロフィールを分析するための手順は、以下の実施例7〜14において概説される。
実施例7
細胞培養
Sf21昆虫細胞を、10％（v/v）熱非働化胎仔ウシ血清（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）でさらに補足した補足Grace昆虫培地中で、CO2を含む28℃の加湿インキュベーター内で維持した。HepG2細胞を、10％ v/v熱非働化胎仔ウシ血清で補足した最小必須培地（MEM-FBS）中で維持した。HepG2細胞を、加湿した37℃のインキュベーター内で、5％ v/v CO2で増殖させた。
細胞培養
Sf21昆虫細胞を、10％（v/v）熱非働化胎仔ウシ血清（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）でさらに補足した補足Grace昆虫培地中で、CO2を含む28℃の加湿インキュベーター内で維持した。HepG2細胞を、10％ v/v熱非働化胎仔ウシ血清で補足した最小必須培地（MEM-FBS）中で維持した。HepG2細胞を、加湿した37℃のインキュベーター内で、5％ v/v CO2で増殖させた。
実施例8
特異的点変異を有するHBV／バキュロウイルス移入ベクターの調製
抗ウイルス試験のために使用される組換えHBV／バキュロウイルス系は以前に記載されている（Delaneyら、Antimicrob Agents Chemother 45(6): 1705-1013,2001）。手短に述べると、組換え移入ベクターを、1.3×HBVゲノム構築物を含む断片を切除し、かつそれをバキュロウイルスベクターpBlueBac4.5（Invitrogen, Carlsbad, CA）の多重クローニング領域にクローニングすることによって作製した。点変異を、製造業者の説明書に従い、市販のキットを使用して（QuikChange, Stratagne）、部位特異的変異誘発によって作製した。HBV組換え体は、逆転写酵素変異rtI169T+rtV173L+rtL180M+rtM204Vをコードする。このプラスミドのヌクレオチド配列および部位特異的変異誘発によって生成された点変異を、製造業者の説明書に従って、ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（Perkin Elmer, Cetus Norwalk, CT）を使用する配列決定によって確認した。
特異的点変異を有するHBV／バキュロウイルス移入ベクターの調製
抗ウイルス試験のために使用される組換えHBV／バキュロウイルス系は以前に記載されている（Delaneyら、Antimicrob Agents Chemother 45(6): 1705-1013,2001）。手短に述べると、組換え移入ベクターを、1.3×HBVゲノム構築物を含む断片を切除し、かつそれをバキュロウイルスベクターpBlueBac4.5（Invitrogen, Carlsbad, CA）の多重クローニング領域にクローニングすることによって作製した。点変異を、製造業者の説明書に従い、市販のキットを使用して（QuikChange, Stratagne）、部位特異的変異誘発によって作製した。HBV組換え体は、逆転写酵素変異rtI169T+rtV173L+rtL180M+rtM204Vをコードする。このプラスミドのヌクレオチド配列および部位特異的変異誘発によって生成された点変異を、製造業者の説明書に従って、ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（Perkin Elmer, Cetus Norwalk, CT）を使用する配列決定によって確認した。
実施例9
1.3HBV構築物を含む組換えバキュロウイルスの生成
精製した組換え移入ベクターおよび直鎖状AcMNPVバキュロウイルスDNAを、Invitrogen（Carlsbad, CA）からのBacNBlueトランスフェクションキットを使用して、SF21細胞に同時にトランスフェクトし；組換えウイルスを、製造業者の説明書に従って、プラークアッセイ法によって単離した。SF21細胞の100mmディッシュを感染させることによって、一連の組換えウイルスを単離されたプラークから増幅した。ウイルスDNAを、標準的な手順を使用して、増幅したウイルスから抽出した。精製したウイルスDNAを、制限酵素を用いて消化し、次いで、1％ v/v アガロースゲル中の電気泳動によって分画した。どのウイルス単離物が完全な1.3HBV構築物を含んでいるかを決定するために、サザンブロッティングを実行した。Boehringer Mannheim Random Prime DNA Labeling Kit（Indianapolis, IN）を、[P32]-放射性標識プローブを生成するために使用した。全長二本鎖HBVゲノムを、すべての放射性標識プローブの鋳型として使用した。ウイルスDNA配列を、センスプライマー
（HBV Genebankアクセッション番号M38454によるヌクレオチド1408位〜1430位）、およびアンチセンスプライマー
（HBV Genebankアクセッション番号M38454によるヌクレオチド2817位〜2798位）を使用して、ポリメラーゼ触媒領域のPCR増幅によって確認した。以下のプライマーを、内部領域の配列決定のために利用した：
（HBV Genebankアクセッション番号M38454によるヌクレオチド2345位〜2362位）および
（HBV Genebankアクセッション番号M38454によるヌクレオチド1790位〜1810位）。
1.3HBV構築物を含む組換えバキュロウイルスの生成
精製した組換え移入ベクターおよび直鎖状AcMNPVバキュロウイルスDNAを、Invitrogen（Carlsbad, CA）からのBacNBlueトランスフェクションキットを使用して、SF21細胞に同時にトランスフェクトし；組換えウイルスを、製造業者の説明書に従って、プラークアッセイ法によって単離した。SF21細胞の100mmディッシュを感染させることによって、一連の組換えウイルスを単離されたプラークから増幅した。ウイルスDNAを、標準的な手順を使用して、増幅したウイルスから抽出した。精製したウイルスDNAを、制限酵素を用いて消化し、次いで、1％ v/v アガロースゲル中の電気泳動によって分画した。どのウイルス単離物が完全な1.3HBV構築物を含んでいるかを決定するために、サザンブロッティングを実行した。Boehringer Mannheim Random Prime DNA Labeling Kit（Indianapolis, IN）を、[P32]-放射性標識プローブを生成するために使用した。全長二本鎖HBVゲノムを、すべての放射性標識プローブの鋳型として使用した。ウイルスDNA配列を、センスプライマー
実施例10
調製用バキュロウイルス増幅および精製
バキュロウイルスを、0.5pfu／細胞の感染多重度（moi）で、対数期のSf21細胞の懸濁培養を感染させることによって増幅した。感染を、フラスコ中の細胞の大多数が目に見える感染の徴候を示すまで進行させた（4〜5日間）。ビリオンを、感染したSF21培地から、80,000×gの遠心分離、および20-60％(w/v)ショ糖勾配を通しての精製によって濃縮した。精製したウイルスを、終点希釈によってSf21細胞中で4つ組で力価測定した。ポリメラーゼ遺伝子を増幅および配列決定し、実施例9のように部位特異的変異誘発の存在を確認した。
調製用バキュロウイルス増幅および精製
バキュロウイルスを、0.5pfu／細胞の感染多重度（moi）で、対数期のSf21細胞の懸濁培養を感染させることによって増幅した。感染を、フラスコ中の細胞の大多数が目に見える感染の徴候を示すまで進行させた（4〜5日間）。ビリオンを、感染したSF21培地から、80,000×gの遠心分離、および20-60％(w/v)ショ糖勾配を通しての精製によって濃縮した。精製したウイルスを、終点希釈によってSf21細胞中で4つ組で力価測定した。ポリメラーゼ遺伝子を増幅および配列決定し、実施例9のように部位特異的変異誘発の存在を確認した。
実施例11
組換えHBV発現バキュロウイルスを用いるHepG2細胞の感染
HepG2を、約20〜40％コンフルエントで播種し、次いで、感染前に16〜24時間増殖させた。感染の日に、3つ組の細胞のプレートをトリプシン処理し、生細胞数を、トリパンブルー排除法により血球計算器で測定した。平均の細胞数を計算し、それを用いて示されたmoiで細胞を感染するのに必要な高力価のウイルスストックの量を決定した。HepG2を無血清MEMで1回洗浄し、微量の血清を取り除いた。バキュロウイルスを、血清を含まないMEMで希釈し、100mm、60mm、および35mmのディッシュを感染するためにそれぞれ1.0、0.5、および0.25mlの量を使用して適切なmoiを達成した。バキュロウイルスを、HepG2細胞に1時間、37℃で、接種物が均等に分布するように15分間毎に穏やかに振動させながら吸着させた。次いで、接種物を吸引し、HepG2細胞をリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、種々の濃度の薬剤を有するかまたは有しないMEM-FBSを加えた。
組換えHBV発現バキュロウイルスを用いるHepG2細胞の感染
HepG2を、約20〜40％コンフルエントで播種し、次いで、感染前に16〜24時間増殖させた。感染の日に、3つ組の細胞のプレートをトリプシン処理し、生細胞数を、トリパンブルー排除法により血球計算器で測定した。平均の細胞数を計算し、それを用いて示されたmoiで細胞を感染するのに必要な高力価のウイルスストックの量を決定した。HepG2を無血清MEMで1回洗浄し、微量の血清を取り除いた。バキュロウイルスを、血清を含まないMEMで希釈し、100mm、60mm、および35mmのディッシュを感染するためにそれぞれ1.0、0.5、および0.25mlの量を使用して適切なmoiを達成した。バキュロウイルスを、HepG2細胞に1時間、37℃で、接種物が均等に分布するように15分間毎に穏やかに振動させながら吸着させた。次いで、接種物を吸引し、HepG2細胞をリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、種々の濃度の薬剤を有するかまたは有しないMEM-FBSを加えた。
実施例12
分泌されたHBV抗原の分析
B型肝炎e抗原（HBeAg）の検出を、Abbott Laboratories（Abbott Park, IL, USA）から購入したキットを使用して、放射免疫アッセイ法および微粒子酵素免疫アッセイ法によって実行した。HepG2細胞からの培地を収集し、6,000×gで遠心分離して細胞細片を除去し、清浄なチューブに移し、そして20℃で分析まで保存した。HBeAg値を、陽性対照の倍数として表現する。培地試料を、ラジオ免疫アッセイ法の結果がHBeAgの陽性対照の値より下であるように適切に希釈した。
分泌されたHBV抗原の分析
B型肝炎e抗原（HBeAg）の検出を、Abbott Laboratories（Abbott Park, IL, USA）から購入したキットを使用して、放射免疫アッセイ法および微粒子酵素免疫アッセイ法によって実行した。HepG2細胞からの培地を収集し、6,000×gで遠心分離して細胞細片を除去し、清浄なチューブに移し、そして20℃で分析まで保存した。HBeAg値を、陽性対照の倍数として表現する。培地試料を、ラジオ免疫アッセイ法の結果がHBeAgの陽性対照の値より下であるように適切に希釈した。
実施例13
細胞内複製中間体の検出
HBVコア粒子を、0.5％ w/v NP-40中に溶解したHepG2細胞の細胞質画分から単離した。細胞質抽出物を、10mmol/l McC12に調整し、そして保護されていないDNAを、500g/ml プロテイナーゼKとの1.5時間、37℃でのインキュベーションによって除去した。次いで、試料中のHBV DNAを、市販のDNA抽出キット（例えば、Qiagen（DNA extraction））を使用して、または、連続的なフェノールおよびクロロホルム抽出を使用する研究室内の方法を使用して抽出し、核酸をエタノール沈殿によって回収した。核酸を50μl/l TE（10mmol/l Tris, 1mmol/l エチレンジアミン四酢酸）中に再懸濁し、OD260によって標準化し、そして100g/ml RNase（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を用いて、1時間、37℃で消化し、その後、リアルタイムPCR、または電気泳動およびサザンブロッティングによる分析を行った。サザンブロット分析後、BioRad GS-670イメージングデンシトメーターおよびMolecular Analystソフトウェア（BioRad, Hecules California）を使用して、サザンブロットの適切な露出を分析した。デンシトメトリーデータを、Jandel ScientificからのTableCurve 2Dソフトウェアパッケージを使用して、ロジスティック用量応答曲線に適合させた。ロジスティック用量応答式を使用して、IC50およびIC90値ならびに変動係数を計算した。
細胞内複製中間体の検出
HBVコア粒子を、0.5％ w/v NP-40中に溶解したHepG2細胞の細胞質画分から単離した。細胞質抽出物を、10mmol/l McC12に調整し、そして保護されていないDNAを、500g/ml プロテイナーゼKとの1.5時間、37℃でのインキュベーションによって除去した。次いで、試料中のHBV DNAを、市販のDNA抽出キット（例えば、Qiagen（DNA extraction））を使用して、または、連続的なフェノールおよびクロロホルム抽出を使用する研究室内の方法を使用して抽出し、核酸をエタノール沈殿によって回収した。核酸を50μl/l TE（10mmol/l Tris, 1mmol/l エチレンジアミン四酢酸）中に再懸濁し、OD260によって標準化し、そして100g/ml RNase（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を用いて、1時間、37℃で消化し、その後、リアルタイムPCR、または電気泳動およびサザンブロッティングによる分析を行った。サザンブロット分析後、BioRad GS-670イメージングデンシトメーターおよびMolecular Analystソフトウェア（BioRad, Hecules California）を使用して、サザンブロットの適切な露出を分析した。デンシトメトリーデータを、Jandel ScientificからのTableCurve 2Dソフトウェアパッケージを使用して、ロジスティック用量応答曲線に適合させた。ロジスティック用量応答式を使用して、IC50およびIC90値ならびに変動係数を計算した。
実施例14
リアルタイムPCR
HBVについてのリアルタイムPCRに基づくアッセイ法のために、HBV DNAを200μlの血清から、製造業者の指示書に従って、QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN GmbH, Hildens, Germany）を使用して抽出した。216ヌクレオチド産物を増幅および検出するために、プライマーおよび分子ビーコンをHBVゲノムのプレコアドメイン内の保存核酸配列に対して設計した（図1）。増幅を、1.0 TaqmanバッファーA（Applied Biosystems, Foster City, CA）、3.0mM MgCl、0.4pmol/μLの各プライマー、正方向プライマー
、および逆方向プライマー
、0.4pmol/μLのHBV特異的分子ビーコン
（ここで、FAMは6-カルボキシフルオレセイン（蛍光体）、およびDABCYLは4-ジメチルアミノフェニルアゾ安息香酸（消光発色団）である）、ならびに1.25UのAmpli Taq Gold DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer）を含む50μl反応混液中で実行した。PCRを、ABI PRISM 7700 分光蛍光分析サーモサイクラー（Applied Biosystems）を使用して実行した。PCRプログラムは、最初のサイクル（95℃、10分間）、続いて45回の増幅サイクル（94℃15秒間、50℃30秒間、72℃30秒間）からなった。機器は、アニーリング段階の間の各反応チューブの蛍光スペクトルを検出および記録した。
リアルタイムPCR
HBVについてのリアルタイムPCRに基づくアッセイ法のために、HBV DNAを200μlの血清から、製造業者の指示書に従って、QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN GmbH, Hildens, Germany）を使用して抽出した。216ヌクレオチド産物を増幅および検出するために、プライマーおよび分子ビーコンをHBVゲノムのプレコアドメイン内の保存核酸配列に対して設計した（図1）。増幅を、1.0 TaqmanバッファーA（Applied Biosystems, Foster City, CA）、3.0mM MgCl、0.4pmol/μLの各プライマー、正方向プライマー
外部標準を、1.3kB野生型HBVプラスミド（遺伝子型D）のpBlueBacプラスミドベクター（Hershey Medical Center, Hershey, PA）へのライゲーションによって構築した。プラスミドのDNA濃度の定量は分光測定によって決定した。108コピー/ml〜100コピー/mlの範囲の、プラスミドの10倍段階希釈の二つ組を、標準曲線を生成するために各測定に含めた。各実験反応におけるコピー数を、誘導された閾値サイクル（CT）の内挿によって決定した。
実施例15
ETV治療
ETVを、薬物の凍結融解の反復を避けるために、滅菌水に再懸濁し、アリコートに分け、そして-20℃で凍結させた。ETVを含む培地を、必要に応じて、3TCの新鮮なアリコートを使用して毎日調製した。ETV治療がウイルス感染後に開始される実験において、HepG2細胞を、HBVバキュロウイルスでの感染後直ちに、示されたETVの濃度に露出させた。ETVでの前処理を利用する実験においては、細胞を、HBVバキュロウイルス感染の16時間前にETVを含む培地に加え、HBVバキュロウイルス感染をまた、ETVを含む培地中で実行し、そして感染および洗浄手順の完了後直ちにETVを含む新鮮な培地を細胞に加えた。
ETV治療
ETVを、薬物の凍結融解の反復を避けるために、滅菌水に再懸濁し、アリコートに分け、そして-20℃で凍結させた。ETVを含む培地を、必要に応じて、3TCの新鮮なアリコートを使用して毎日調製した。ETV治療がウイルス感染後に開始される実験において、HepG2細胞を、HBVバキュロウイルスでの感染後直ちに、示されたETVの濃度に露出させた。ETVでの前処理を利用する実験においては、細胞を、HBVバキュロウイルス感染の16時間前にETVを含む培地に加え、HBVバキュロウイルス感染をまた、ETVを含む培地中で実行し、そして感染および洗浄手順の完了後直ちにETVを含む新鮮な培地を細胞に加えた。
実施例16
野生型およびrtI169T+rtV173L+rtL180M+rtM204VをコードするHBV／バキュロウイルスを用いて実行された抗ウイルス試験
ETVの非存在下（0μM ETV）で増殖した野生型ウイルスに対する定量的リアルタイムPCRの結果を使用した、野生型HBVおよび4つ組の変異を含むHBVに対するETVの用量効果のグラフ分析を図11に示す。ETVは、試験されたすべてのETV濃度で定量的PCRによって検出された、HBV複製中間体の減少によって実証されるように、野生型HBV複製に対して最も明白な効果を有した。対照的に、とりわけ0.5μM ETVまでの濃度で、4つの変異を含む変異体（rtI169T+rtV173L+rtL180M+rtM204V）をコードする組換えHBVによる、ETVに対する感度が減少した。
野生型およびrtI169T+rtV173L+rtL180M+rtM204VをコードするHBV／バキュロウイルスを用いて実行された抗ウイルス試験
ETVの非存在下（0μM ETV）で増殖した野生型ウイルスに対する定量的リアルタイムPCRの結果を使用した、野生型HBVおよび4つ組の変異を含むHBVに対するETVの用量効果のグラフ分析を図11に示す。ETVは、試験されたすべてのETV濃度で定量的PCRによって検出された、HBV複製中間体の減少によって実証されるように、野生型HBV複製に対して最も明白な効果を有した。対照的に、とりわけ0.5μM ETVまでの濃度で、4つの変異を含む変異体（rtI169T+rtV173L+rtL180M+rtM204V）をコードする組換えHBVによる、ETVに対する感度が減少した。
実施例17
ETV
ETV（以前にはBMS-200475またはSQ-34676）は、HBV複製の強力な阻害物質である。ETVは、ヘパドナウイルスおよびヘルペスウイルスに対して活性をもつ、生物−経口利用可能な特性を有するシクロペンチルデオキシグアノシンアナログである。ETVの構造は図3に示され、その合成はBisacchiら（Bioorg. Med. Chem. Lit. 7: 127-132, 1997）によって記載されている。前臨床試験により、エンテカビルが、酵素および細胞に基づくアッセイ法においてHBVの高度に強力な阻害物質であることが示されている（Innaimoら、1997、前出；Sieferら、1998、前出；Yamanakaら、1999、前出）。ETVは、以前にはBMS-200475およびSQ-34676として記載された。
ETV
ETV（以前にはBMS-200475またはSQ-34676）は、HBV複製の強力な阻害物質である。ETVは、ヘパドナウイルスおよびヘルペスウイルスに対して活性をもつ、生物−経口利用可能な特性を有するシクロペンチルデオキシグアノシンアナログである。ETVの構造は図3に示され、その合成はBisacchiら（Bioorg. Med. Chem. Lit. 7: 127-132, 1997）によって記載されている。前臨床試験により、エンテカビルが、酵素および細胞に基づくアッセイ法においてHBVの高度に強力な阻害物質であることが示されている（Innaimoら、1997、前出；Sieferら、1998、前出；Yamanakaら、1999、前出）。ETVは、以前にはBMS-200475およびSQ-34676として記載された。
当業者は、本明細書中に記載した本発明は、詳細に記載したもの以外の変形および改変が可能であることを認識する。本発明は、このようなすべての変形および改変を含むことが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書中に言及されたか、または示されたすべての工程、特徴、組成物、および化合物を個別にまたは集合的に含み、かつ、上記の工程または特徴の任意の2つまたはそれ以上の任意の組み合わせまたはすべての組み合わせを含む。
（表３）LMVおよびETV治療の間にHBVウイルス負荷の増加を有する患者Aについての臨床的データ、ウイルス学的データ、およびHBV配列決定データの要約
1．ND=検出されず
2．研究の盲検化段階
3．研究の非盲検化段階
4．Stuyverら、2001、前出に従う命名法
2．研究の盲検化段階
3．研究の非盲検化段階
4．Stuyverら、2001、前出に従う命名法
（表４）ETVおよびLMVで治療された患者AにおけるHBV変異の要約
＊Stuyverら、2001、前出に従う命名法
＊＊太字の変異は基準HBV遺伝子型においては検出されなかった。太字以外の変異は基準遺伝子型に存在する以前の試料からの変化である。
＊＊太字の変異は基準HBV遺伝子型においては検出されなかった。太字以外の変異は基準遺伝子型に存在する以前の試料からの変化である。
参考文献
Claims (6)
- エンテカビル（ETV）に対する感受性の低下を示すB型肝炎ウイルス（HBV）変種についての潜在能力を決定するための方法であって、該方法が：（a）該HBVからDNAまたは対応するmRNAを単離する工程であって、該DNAまたは対応するmRNAが逆転写酵素（rt）ドメインを有するHBV DNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列である工程、ならびに、（b）該DNAポリメラーゼのrt中におけるアミノ酸置換を生じるコドンのヌクレオチド配列の変異をスクリーニングする工程を含み、該コドンがメチオニン204（rtM204)、ロイシン180（rtL180）、スレオニン184（rtT184）、メチオニン250（rtM250）およびセリン202（rtS202）からなるリストより選択され、且つ、HBV変種がETVに対して低下した感受性を、（i）rtM204、rtL180およびtrT184、（ii）rtM204、rtL180およびrtM250、（iii）rtM204、rtL180およびrtS202、並びに（iv）rtM204、rtL180、rtT184およびrtS202からなるリストより選択される変異の組み合わせと共に示し、且つ（i）〜（iv）におけるrtM204変異およびrtL180変異がそれぞれrtM204バリン（rtM204V）およびrtL180メチオニン（rtL180M）である、方法。
- rtT184変異がrtT184セリン、グリシン、イソロイシン、ロイシンもしくはプロリン（rtT184S/G/I/L/P）である、請求項1記載の方法。
- rtT184変異がrtT184システイン、アラニン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはセリン（rtT184C/A/F/M）である、請求項1記載の方法。
- rtM250変異がrtM250バリン(rtM250V)もしくはrtM250イソロイシン（rtM250I）である、請求項1記載の方法。
- 変種がさらにrtイソロイシン169スレオニン（rtI169T）変異を含む、請求項4記載の方法。
- rtS202変異がrtS202イソロイシンもしくはグリシン（rtS202I/G）またはrtS202システイン（rtS202C）である、請求項1記載の方法。
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