CN1065094A

CN1065094A - 人血红蛋白(珠蛋白)α1，基因和α2基因的检测技术

Info

Publication number: CN1065094A
Application number: CN 92108379
Authority: CN
Inventors: 毛裕民; 杨树青; 王先敏
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 1992-04-14
Filing date: 1992-04-14
Publication date: 1992-10-07
Anticipated expiration: 2007-04-14
Also published as: CN1062018C

Abstract

一种遗传检测方法，利用DNA聚合酶链反应 (PCR)技术，对人血红蛋白(珠蛋白)α₁基因和α₂基因缺失进行基因分型检测。本发明设计了三对排列顺序明确的扩增引物αp₁和αp₃，αp₁和αp₂，βp₁和 βp₂，它们分别扩增Hbα₁基因278bp、Hbα₂基因片段 603bp、Hbβ基因片段400bp；用扩增反应配套的实验技术即扩增反应的试剂体系及其反应程序进行扩增反应，产物用电泳方法检测，可以准确判断受检的人血红蛋白(珠蛋白)α₁基因和α₂基因缺失α基因的个数。

Description

本发明属遗传检测领域，是用DNA聚合酶链反应（PCR）方法对人血红蛋白（珠蛋白）α₁基因和α₂基因检测的技术。

编码血红蛋白（珠蛋白）的α₁基因或α₂基因的缺失会引起α-地中海贫血症（简称地贫）。它在我国是一种常见病，发病率为2.64%，广西的一些地区竟高达14.95%以上，目前尚无有效的根治方法，重症患者需常年输血，不仅本人十分痛苦，对家庭和社会也带来沉重的负担。

α-地贫除少数是由α-基因的点突变引起外，多数是由α-基因的缺失所引起的。α-基因族有2个序列极为相似的α₁和α₂基因，二者之间只有7个核苷酸序列上的差异，它们在功能上是相同的，都编码α-珠蛋白分子，这二个基因的缺失或部分缺失，都会减少α-珠蛋白的合成。在正常人基因组中存在2个α₁等位基因和2个α₂等位基因。一般缺失一个α基因的患者表现为α-地贫2，贫血症状很轻或看不出症状;缺失2个α基因的患者表现为α-地贫1，贫血症状较重;缺失3个α基因的患者表现为HbH病，贫血症状严重，需常年输血;缺4个α基因的胎儿表现为Bart′s水肿，不能成活。

目前应用红细胞形态观察、血红蛋白电泳分析对人血红蛋白（珠蛋白）α₁基因和α₂基因的缺失进行分型检测，也可用限制性内切酶和α基因探针杂交等方法对α基因缺失情况进行研究，这些方法或则操作技术复杂，或则难于掌握客观标准。1987年以来，普遍采用设计在α基因族ψα₁（α₁假基因）基因内的一对引物对人血红蛋白（珠蛋白）α₁基因或α₂基因的缺失进行PCR（多聚酶链式反应Polymerase chain Reaction）扩增，如果α基因族包括α₁和α₂基因在内的大片段缺失时，可获得正确的检测结果;如果缺失仅为α₁和α₂基因或者是α₁或α₂基因而不包括ψα₁时，则获得假阴性结果;如果缺失的仅为ψα₁基因而α₁和α₂基因或者α₁或α₂基因并不缺失，则获得假阳性结果。所以这种PCR检测方法具有很大的局限性，况且中国的α-地贫患者多为α₁和α₂基因或者是α₁或α₂基因缺失，应用此法易于导致检测错误。

本发明的目的是建立一种操作简单、方法简便、检测标准明确无误的人血红蛋白（珠蛋白）α₁基因和α₂基因的PCR基因分型检测技术。

本发明用PCR扩增技术，主要有引物合成、基因扩增、显示检测主要步骤。发明设计了五种核苷酸引物，它们是：

αp₁：5′d（CGG CTC TGC CCA GGT TAA GG）

αp₂：5′d（CCT TGG TCT GAG ACA GGT AAA CA）

αp₃：5′d（AGT GGG GCC GAG GGC CCA G）

βp₁：5′d（AAG GAG ACC AAT AGA AAC TGG GC）

βp₂：5′d（TCT CCC CTT CCT ATG ACA TGA AC）

其中αp₁和αp₂引物扩增Hbα₁基因片断278bP，αp₁和αp₂扩增Hbα₂基因片段603bp，βp₁和βp₂扩增Hbβ基因片段400bP。五种引物分别形成三对，扩增的片段具有明显的特征。

引物αp₁、αp₂、αp₁、βp₁、βp₂按上述的核苷酸排列顺序，可以用化学方法合成。278bp、603bp、400bp的DNA片段可以用电泳法检测。如用普通的琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段后用溴乙锭染色，在紫外光照射下的红色荧光来检测。

基因扩增的试剂体系是可以在30-100μl的反应体系中有10-50mM/L的Tris-HCl（PH＝8.1-8.5），50mM/L的KCl，0.5-3.0mM/L的MgCl₂，10-25mM/L的（NH₄）₂SO₄，明胶200ug/ml，4-8%的甲酰胺，dNTP（A·G·C·T）各200-300μM/L，1-1.5U的耐热DNA聚合酶，0.25-0.5μM/L的αp₁，0.125-0.25μM/L，的αp₂，0.125-0.25μM/L的αp₁，0.125-0.25μM/L的βp₁，0.125-0.25μM/L的βp₂。

将上述试剂，除了耐热DNA聚合酶以外，浓缩10倍，将引物按所需浓度配好，组成试剂盒，则使用更方便。

采用上述PCR反应试剂体系，则PCR扩增产物的电泳带清晰明亮，没有杂带，易于鉴别。

扩增反应时，先将反应体系混合打匀，可以高速离心30秒钟，然后在90-93℃温度下变性3-10分钟，加酶，打匀，再离心;按90-93℃ 0.5-1分钟、50-60℃ 0.5-1分钟、68-72℃ 1-2分钟作30-35个循环;再在68-72℃温度下保温数分钟，取反应产物在琼脂糖凝胶板上电泳，紫外光照射下观察电泳带。使用Hybaid或FR-300PCR扩增仪或恒温水浴扩增，采用的温度和保温时间在上述范围内适当调整。

在该扩增程序下扩增产物在电泳显示检测时泳带清晰，灵敏度高，以正常人的血红蛋白（珠蛋白）α₁基因和α₂基因进行PCR扩增的产物中，278bp、603bp、400bp三个基因片段的电泳带之间的距离相等，很易识别。配上本发明的扩增试剂体系和扩增程序，这三条电泳带清晰明亮，而且条带的亮度相近。

参照βp₁、βp₂基因片段400bp的标准，如果受检的人血红蛋白（珠蛋白）α基因为α₁基因或α₂基因缺失的杂合子，则它们α₁基因或α₂基因片段的扩增产物电泳带的亮度仅为β基因扩增产物400bp带亮度的一半以下。

如受检的人血红蛋白（珠蛋白）α基因为α₁基因和α₂基因缺失的纯合子，则仅有β基因扩增的产物400bp带，而没有αp₁和αp₃、αp₁和αp₂扩增的278bp、603bp电泳带。α基因族的两个序列相似的α₁基因和α₂基因中若缺失1个α₁基因或α₂基因，则为杂合子，缺两个等位α基因的为纯合子。

若受检的人血红蛋白（珠蛋白）α基因缺失3个α基因，则α₁基因或α₂基因片断扩增产物电泳带只有一条带，其亮度为β带亮度的一半以下;

若受检的人血红蛋白（珠蛋白）α基因缺失4个α基因，那么没有α₁基因和α₂基因片段扩增产物电泳带。

图1是显示检测的电泳图，1是αp₁和αp₂扩增的Hbα₁基因片段278bp，2是αp₁和αp₂扩增的Hbα₂基因片段603bp，3是βp₁和βp₂扩增的Hbβ基因片段400bp。图中黑度表示电泳带的亮度，行4是φX174（RF）-HaeⅢ的电泳带，行5是血红蛋白（珠蛋白）α基因无缺失的电泳带，即正常人血红蛋白（珠蛋白）α基因检测的结果，行6是缺失一个α₂基因的人血红蛋白（珠蛋白）α基因扩增后的电泳带，是α地贫2患者的检测结果，行7是缺失两个α基因（α₁和α₂）的DNA基因组扩增后的电泳带，这是α地贫1患者的检测结果，行8是缺失3个α基因的DNA基因组扩增后的电泳带，这是HbH病人的检测结果，行9是4个α基因都缺失的DNA基因组扩增后的电泳带，这是Bart′s水肿患者的检测结果。

本发明的引物顺序明确，可用DNA合成仪自动合成，在本研究领域中常规易行，引物扩增的基因明确，配上本发明的扩增试剂体系、扩增程序和电泳检测，使得显示结果清晰无疑。

本发明不仅可以分别检测α₁基因和α₂基因是否缺失，还可以对照比较正常人的内参照标准，准确地判断受检的人血红蛋白（珠蛋白）α基因缺失是属于α₁基因和α₂基因还是α₁基因或α₂基因缺失的纯合子或杂合子。可靠地对人血红蛋白（珠蛋白）α基因缺失进行分型检测，不会发生假阳性或假阴性的失误检测。

本发明技术配上用本技术制成的检测试剂盒，操作方便，检测结果明确，无论是科学研究还是α基因缺失分型检测都方便可靠。

图1是人血红蛋白（珠蛋白）α₁基因和α₂基因的PCR分型检测电泳图。

图2是HbH病先征者家系的PCR基因分型检测图。

实施例：在50ul体系中，含有10mM/L Tris-HCl（PH＝8.5），50mM/L KCl，2mM/L MgCl₂，10mM（NH₄）₂SO₄，明胶200μg/ml，甲酰胺8%，dNTP各200μM/L，0.25μM/L的αp₁，0.125μM/L的αp₂，0.125μM/L的αp₁，0.125μM/L的βp₁，0.125μM/L的βp₂，人染色体DNA约0.5μg，用30μl液蜡复盖液面。将反应体系混合打匀，高速离心30秒，恒温水浴93℃1分钟，加入DNA聚合酶1U，打匀，离心，然后恒温水浴93℃1分钟、55℃1分钟、68℃2分钟，依次进行35个循环，循环结束后再72℃保温5分钟，取20μl反应产物在1.5%琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml EB）板上电泳，紫外光下观察电泳带。

该受检者为HbH病先征者家系的PCR基因分型检测例，观察到的电泳带结果如图2。该图中第6行（先征者的父亲）中第2条电泳带即αp₁和αp₂扩增Hbα₂基因片断603bp带的亮度仅为第3条β带的亮度的一半以下，可以断定父亲是α₂基因缺失的杂合子，父亲患的是α地2症。第7行是先征者母亲的受检结果，可以看到第1和第2电泳带的亮度都为第3条β带的亮度的一半以下，可以断定母亲缺失α₁和α₂两个α基因（α₁和α₂均为杂合子），因而患α地1症。先征者本人的电泳条带见第8行，其α₂（603bp）电泳带全无，α₁（278bp）电泳带的亮度仅为β（400bp）电泳带亮度的一半以下，可断定其缺失三个α基因，患HbH症。

Claims

1、一种用DNA聚合酶链式反应对人血红蛋白(珠蛋白)α基因的扩增技术，它的内容由引物合成、基因扩增、显示检测三部分组成，其特征在于：

(1)基因扩增的核苷酸引物及其顺序为：

αP₁：5′d(CGG CTC TGC CCA GGT TAA GG)

αP₂：5′d(CCT TGG TCT GAG ACA GGT AAA CA)

αP₁：5′d(AGT GGG GCC GAG GGC CCA G)

βP₁：5′d(AAG GAG ACC AAT AGA AAC TGG GC)

βP₂：5′d(TCT CCC CTT CCT ATG ACA TGA AC)

(2)引物αP₁和αP₂扩增Hbα₁基因278bP，αP₁和αP₂扩增Hbα₂基因片段603bP，βP₁和βP₂扩增Hbβ基因片段400bP。

2、根据权利要求1所述的用DNA聚合酶链式反应对人血红蛋白（珠蛋白）α基因的扩增技术，其特征在于基因扩增试剂体系是在30-100μl反应体系中含有：

Tris-Hcl：10-50mM/L（PH＝8.1-8.5）;

KCl：50mM/L;

Mgcl₂：0.5-3.0mM/L;

（NH₄）₂SO₄：10-25mM/L;

明胶：200ug/ml;

甲酰胺：4-8%;

dNTP（A·G·C·T）：各200-300mM/L;

耐热DNA聚合酶：1-1.5U;

αp₁：0.25-0.50mM/L;

αp₂：0.125-0.25mM/L;

αp₁：0.125-0.25mM/L;

βp₁：0.125-0.25mM/L;

βp₁：0.125-0.25mM/L。

3、根据权利要求1所述的用DNA聚合酶链式反应对人血红蛋白（珠蛋白）α基因的扩增技术，其特征在于扩增反应的程序是：

（1）90-93℃变性3-10分钟，加酶打匀，离心;

（2）按90-93℃ 0.5-1分钟，50-60℃ 0.5-1分钟，68-72℃ 1-2分钟，作30-35个循环;

（3）68-72℃保温数分钟后，取反应产物在含有EB的琼脂糖凝胶板上电泳，紫外光下观察电泳带。

4、根据权利要求1所述的用DNA聚合酶链式反应对人血红蛋白（珠蛋白）α基因的扩增技术、其特征在于：

（1）若受检的人血红蛋白（珠蛋白）α基因为α₁基因或α₂基因缺失的杂合子，则其α₁基因或α₂基因片段的扩增产物电泳带的亮度仅为血红蛋白β基因电泳带的亮度一半以下;

（2）若受检的人血红蛋白（珠蛋白）α基因为α₁基因或α₂基因缺失的纯合子，则扩增产物电泳时仅有β基因带，没有α₁基因带或α₂基因带;

（3）若受检的人血红蛋白（珠蛋白）α基因中缺失3个α基因、则α₁基因或α₂基因片断扩增产物电泳带只有一条，而且其亮度只有β电泳带亮度的一半以下;

（4）若受检的人血红蛋白（珠蛋白）α基因中缺失4个α基因，则没有α₁基因或α₂基因片断扩增产物的电泳带。